CN109628466A

CN109628466A - 一种紫花苜蓿抗旱耐盐基因MsCKX及其应用

Info

Publication number: CN109628466A
Application number: CN201910010986.3A
Authority: CN
Inventors: 杨培志; 李淑霞; 沙亚·海拉提; 安韵如; 曹玉曼; 王鑫; 王玉柱; 呼天明
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2019-01-07
Filing date: 2019-01-07
Publication date: 2019-04-16

Abstract

本发明公开了一种紫花苜蓿抗旱耐盐基因MsCKX，其编码区核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。将该紫花苜蓿抗旱耐盐基因MsCKX利用花序侵染法转入到野生型拟南芥中，获得MsCKX转基因植株，可用于进一步验证该基因在转基因植物干旱和盐胁迫中所发挥的作用。并且实时荧光定量qRT‑PCR结果表明MsCKX基因在苜蓿中响应干旱和盐胁迫，这为快速培育抗逆性强的紫花苜蓿品种提供了选择。

Description

一种紫花苜蓿抗旱耐盐基因MsCKX及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种紫花苜蓿抗旱耐盐基因MsCKX及其应用。

背景技术

干旱和盐碱化是人类面临的世界性问题，也是制约作物和牧草产量的两个主要的环境因子。特别在我国西北干旱半干旱地区，随着水资源的日益短缺，干旱和土壤盐碱化已成为该地区的农牧业发展和生态环境的严重威胁。长期以来，灌溉是干旱半干旱地区缓解旱情、实现农业高产的主要措施之一。但同时，灌溉还会不可避免地造成土壤盐碱化，盐胁迫会使作物的产量和品质降低。据统计，全国盐碱土面积约l0亿hm²，其中，中国土地盐碱化大约占到全球盐碱土面积的1/10，且面积还在不断增加中，对农牧业生产和生态环境建设带来了严重的威胁。

紫花苜蓿(Medicago sativa L.)是一种优良的豆科牧草，在我国西北干旱半干旱地区农牧业生产和生态建设中发挥着极为重要的作用。然而，很多紫花苜蓿品种的耐盐、抗旱能力普遍不高，在盐渍或灌溉不足条件下种植难获高产。培育具有较强耐盐性和抗旱性的紫花苜蓿新品种，是提高西北干旱半干旱地区紫花苜蓿人工草地产量、节约灌溉以及利用大面积盐荒地的根本途径之一。传统的紫花苜蓿抗逆育种周期长，且容易受到种内抗逆基因资源的限制，基因工程技术的迅速发展为紫花苜蓿抗逆育种提供了一个新的手段。通过转基因技术培育耐盐、抗旱品种将是紫花苜蓿抗逆育种的一个重要的发展方向。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种紫花苜蓿抗旱耐盐基因MsCKX及其应用。

为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：

一种紫花苜蓿抗旱耐盐基因MsCKX，其特征在于，该紫花苜蓿抗旱耐盐基因MsCKX编码区的核苷酸序列如下：

根据本发明，所述的紫花苜蓿抗旱耐盐基因MsCKX编码区的氨基酸序列如下：

本发明进一步公开了该紫花苜蓿抗旱耐盐基因MsCKX的克隆方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)苜蓿幼苗cDNA合成：

提取苜蓿幼苗总RNA，反转录得到第一链cDNA；

(2)MsCKX基因全长的克隆：

以紫花苜蓿cDNA为模板，根据NCBI上蒺藜苜蓿的MtCKX基因序列进行同源比对并设计引物P1和引物P2，进行PCR扩增，回收和纯化PCR扩增产物，并测序得到中间片段；再根据测序得到的序列设计5’RACE引物P3和3’RACE引物P4，进行5’端序列和3’端序列的PCR扩增，回收和纯化PCR扩增产物，并测序；最终将中间序列，5’端序列和3’端拼接得到MsCKX基因的全长序列，并用ORF Finder找到该基因的开放阅读框ORF；其中：

引物P1序列为：5’-TTATTTAAGTTGGTTTCTGGAAAATATT-3’；

引物P2序列为：5’-TGAGACGTGTAGTGAGGAAGAT-3’；

5’RACE引物P3为：

5’-GATTACGCCAAGCTTTCGGTAGTGGTGCCAGACAGCAACAT-3’；

3’RACE引物P4序列为：

5’-GATTACGCCAAGCTTTCGCATGTCGAGGACGAGTCCTTTCT-3’；

(3)在ORF两端设计引物P5和P6并通过PCR扩增，将其产物进行纯化、载体连接、大肠杆菌转化，测序得到紫花苜蓿干旱耐盐基因MsCKX的编码区的核苷酸序列和氨基酸序列；其中：

引物P5序列为：5’-ATGATAGCTTACCTTGAACACTTCGTTC-3’；

引物P6序列为：5’-TTATTTAAGTTGGTTTCTGGAAAATATT-3’。

根据申请人的实验表明，将该紫花苜蓿抗旱耐盐基因MsCKX利用农杆菌介导的转基因技术，通过花序侵染法将紫花苜蓿抗旱耐盐MsCKX基因转入野生型拟南芥(Col-0)中，使其在拟南芥中表达，获得抗旱耐盐的MsCKX转基因拟南芥植株。将所得抗旱耐盐的MsCKX转基因植株移栽于蛭石中，观察植株生长状态及表型，进一步验证该紫花苜蓿抗旱耐盐基因MsCKX在植物干旱和盐中所发挥的作用。

与现有技术相比，本发明给出的紫花苜蓿抗旱耐盐基因MsCKX，带来的有益的技术效果在于：

首次从紫花苜蓿中克隆出了与抗旱耐盐性相关的紫花苜蓿抗旱耐盐基因MsCKX，获得了其完整的编码区的核苷酸序列和氨基酸序列。并通过转基因技术将其在在拟南芥中过表达获得转基因植株，用于进一步验证该基因在植物干旱和盐胁迫中所发挥的作用。

附图说明

图1为紫花苜蓿抗旱耐盐基因MsCKX中间片段扩增图；

图2为5’RACE扩增图；

图3为3’RACE扩增图；

图4为紫花苜蓿抗旱耐盐MsCKX基因编码区序列的扩增图；

图5为转基因植株的鉴定结果图；

图6为紫花苜蓿干旱耐盐基因MsCKX干旱处理结果图；

图7为紫花苜蓿干旱耐盐基因MsCKX盐处理结果图。

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。

具体实施方式

实施例1：紫花苜蓿抗旱耐盐基因MsCKX编码区序列的获得

(1)苜蓿幼苗cDNA合成：

用总RNA提取试剂盒Plant RNA Extraction Kit(TAKARA)提取苜蓿幼苗总RNA，操作步骤按提取试剂盒说明书进行。吸取2μl提取的总RNA溶液用酶标仪进行测定，以无RNase的水为空白对照，测定溶液中RNA浓度(ng/μl)。接着用cDNA反转录试剂盒PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit(TAKARA)按照操作步骤反转录为cDNA。

(2)紫花苜蓿抗旱耐盐MsCKX基因全长的克隆：

根据NCBI上蒺藜苜蓿的MtCKX基因序列进行同源比对并设计引物P1和引物P2，进行PCR扩增，扩增结果如图1所示。回收和纯化PCR扩增产物，并进行载体连接、大肠杆菌转化并测序得到中间片段。

引物P1序列为：5’-TTATTTAAGTTGGTTTCTGGAAAATATT-3’；

引物P2序列为：5’-TGAGACGTGTAGTGAGGAAGAT-3’；

再根据Clotech公司的RACE 5′/3′Kit试剂盒说明书设计5’RACE引物P3和3’RACE引物P4。按照试剂盒说明书操作步骤完成RACE过程，分别扩增获得该基因的5’端序列和3’端序列如图2和图3所示,目的条带长分别是480bp和530bp。

5’RACE引物P3为：

5’-GATTACGCCAAGCTTTCGGTAGTGGTGCCAGACAGCAACAT-3’；

3’RACE引物P4序列为：

5’-GATTACGCCAAGCTTTCGCATGTCGAGGACGAGTCCTTTCT-3’；

将克隆得到的5’端序列和3’端序列经测序后，利用DNAMAN软件将其与中间片段进行拼接获得基因的全长序列，再通过设计ORF两端引物P5和引物P6，并利用高保真酶扩增得到该紫花苜蓿抗旱耐盐基因MsCKX的全长cDNA，将其产物进行纯化、载体连接、大肠杆菌转化并送去测序，得到紫花苜蓿抗旱耐盐基因MsCKX的编码区的核苷酸序列和氨基酸序列，其中：

引物P5序列为：5’-ATGATAGCTTACCTTGAACACTTCGTTC-3’；

引物P6序列为：5’-TTATTTAAGTTGGTTTCTGGAAAATATT-3’。

紫花苜蓿抗旱耐盐基因MsCKX编码区序列的扩增图如图4所示：目的条带的全长为1530bp。

综上，获得的紫花苜蓿抗旱耐盐基因MsCKX编码区的核苷酸序列如下：

该紫花苜蓿抗旱耐盐基因MsCKX编码区的氨基酸序列如下：

实施例2：转基因拟南芥的获得及阳性苗的鉴定

构建以35S为启动子的MsCKX过表达载体(35S:MsCKX)，利用拟南芥花序侵染的方法将紫花苜蓿抗旱耐盐基因MsCKX转入到野生型拟南芥中，获得转基因拟南芥植株(潮霉素抗性)，并通过RT-PCR检测拟南芥阳性转基因植株(图5)，收取纯合种子，用于抗逆性表型分析。

实施例3：紫花苜蓿植株在干旱处理下，分别在0，2，4和6h取样，用实时荧光定量PCR对MsCKX基因的表达量进行检测，结果如图6所示。

实施例4：紫花苜蓿植株在盐(150mM NaCl)处理下，分别在0，2，4，8和12h取样，用实时荧光定量PCR对MsCKX基因的表达量进行检测，结果如图7所示。

由于紫花苜蓿组培生长周期较长，在紫花苜蓿植株中验证该基因的功能还需一定的时间，但经上述的实验可以初步判定，该紫花苜蓿抗旱耐盐基因MsCKX在苜蓿的抗旱耐盐过程也起到一定的调节作用，对于下一步研究转基因苜蓿的抗旱耐盐性具有重要意义。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的技术方案所作的任何修改、等同替换、改进等，均应视为本发明的保护范围。

核苷酸或氨基酸序列表

<110>西北农林科技大学

<120>一种紫花苜蓿抗旱耐盐基因MsCKX及其应用

<160>

<210> 1

<211> 1530

<212> DNA

<213>核苷酸序列

<220>

<400>

atgatagctt accttgaaca cttcgttcat ggaaacgaca cagaatcacc accaaacgac

gacgtttcat ctctccaatc ttctttccat ttcgccccta attccatcgc tagtaaagac

tttggcggca tgaaatcctc cactcccctc gccgtactcc gcccttacac caccgccgat

gtggtaaaag ccgtaaaagc agcagcaacc accacaaatt taacagtggc ggcgcgtggt

aacggtcact ccatcaacgg ccaagccatg gcggagaaag gacttgtcct cgacatgcga

gccacggcgg aggagccttt tcaacttctc tacgtcgacg gtgttccaca cgtcgacgtt

tccggtgggg cattatggga agaagtgttg aaacgctgcg tttcgaattt taagcttgtt

ccgaggtcgt ggacggatta tcttgggttg acggtgggtg gaactttatc taacgccggt

gtcagtggtc agactttccg ttatggtcct caaacggcaa acgtaacgga attggaagtt

gttactggta aaggtgatag ttttgtttgt aatgaaaatc aaaattctga gctctttttt

gcttcacttg gtggtcttgg tcagtttggt gtcatcacta gagccagaat cgttcttcaa

caagcccctg atatggtgag gtggatgagg gtgatttact cggaatttga ggactatact

aaagatgcag agtggctggt gacactacca gaaggtgacg gttttgatta cgtggaaggg

ttcgttgtgg ctaacaatga cgacccttgt aatggttggc ccacaattcc gatgggttcg

aaccaaattt tcaacccggt ttgtcttcct tcttcagctg gaccggttct ctattgctta

gagcttgctc ttcattatcg taaaaccgct cgatcttctg aagttaatac gaaagtggat

agattgcttg gagggttgag atttgttgag ggaataaaat ttgaggatga tgtgaagtac

atggattttt tgctacgcgt aaagcgtgtg gaagaggatg ctaaagccaa aggtatatgg

gatgcacctc acccatggtt gaacatgttt gtgtccaaga ccgacattgc tgattttgat

cgtgaagtgt tcaagaaaat cctcaaacat ggggttggtg gtcccattct agtgtaccca

ctattgcgaa gcaagtggga tgatagacac tcggtagtgg tgccagacag caacattttc

tacataatag cattactccg atttattcca ccaccaccta agggaccacc tactgataaa

ttggtggcac aaaacaatgc aattattcaa ttgtgctaca acaagggatt tgatttcaag

ttatatcttc ctcactacac gtctcaggag aattggatgc gacactttgg ggataaatgg

actagatttg tccagagaaa acaaaatttt gatccattgg ctattcttgc acctgggcaa

aaaatatttt ccagaaacca acttaaataa。

<210> 2

<211> 509

<212> 序列

<213>氨基酸

<220>

<400>

Met Ile Ala Tyr Leu Glu His Phe Val His Gly Asn Asp Thr Glu Ser Pro ProAsn Asp Asp Val Ser Ser Leu Gln Ser Ser Phe His Phe Ala Pro Asn Ser Ile AlaSer Lys Asp Phe Gly Gly Met Lys Ser Ser Thr Pro Leu Ala Val Leu Arg Pro TyrThr Thr Ala Asp Val Val Lys Ala Val Lys Ala Ala Ala Thr Thr Thr Asn Leu ThrVal Ala Ala Arg Gly Asn Gly His Ser Ile Asn Gly Gln Ala Met Ala Glu Lys GlyLeu Val Leu Asp Met Arg Ala Thr Ala Glu Glu Pro Phe Gln Leu Leu Tyr Val AspGly Val Pro His Val Asp Val Ser Gly Gly Ala Leu Trp Glu Glu Val Leu Lys ArgCys Val Ser Asn Phe Lys Leu Val Pro Arg Ser Trp Thr Asp Tyr Leu Gly Leu ThrVal Gly Gly Thr Leu Ser Asn Ala Gly Val Ser Gly Gln Thr Phe Arg Tyr Gly ProGln Thr Ala Asn Val Thr Glu Leu Glu Val Val Thr Gly Lys Gly Asp Ser Phe ValCys Asn Glu Asn Gln Asn Ser Glu Leu Phe Phe Ala Ser Leu Gly Gly Leu Gly GlnPhe Gly Val Ile Thr Arg Ala Arg Ile Val Leu Gln Gln Ala Pro Asp Met Val ArgTrp Met Arg Val Ile Tyr Ser Glu Phe Glu Asp Tyr Thr Lys Asp Ala Glu Trp LeuVal Thr Leu Pro Glu Gly Asp Gly Phe Asp Tyr Val Glu Gly Phe Val Val Ala AsnAsn Asp Asp Pro Cys Asn Gly Trp Pro Thr Ile Pro Met Gly Ser Asn Gln Ile PheAsn Pro Val Cys Leu Pro Ser Ser Ala Gly Pro Val Leu Tyr Cys Leu Glu Leu AlaLeu His Tyr Arg Lys Thr Ala Arg Ser Ser Glu Val Asn Thr Lys Val Asp Arg LeuLeu Gly Gly Leu Arg Phe Val Glu Gly Ile Lys Phe Glu Asp Asp Val Lys Tyr MetAsp Phe Leu Leu Arg Val Lys Arg Val Glu Glu Asp Ala Lys Ala Lys Gly Ile TrpAsp Ala Pro His Pro Trp Leu Asn Met Phe Val Ser Lys Thr Asp Ile Ala Asp PheAsp Arg Glu Val Phe Lys Lys Ile Leu Lys His Gly Val Gly Gly Pro Ile Leu ValTyr Pro Leu Leu Arg Ser Lys Trp Asp Asp Arg His Ser Val Val Val Pro Asp SerAsn Ile Phe Tyr Ile Ile Ala Leu Leu Arg Phe Ile Pro Pro Pro Pro Lys Gly ProPro Thr Asp Lys Leu Val Ala Gln Asn Asn Ala Ile Ile Gln Leu Cys Tyr Asn LysGly Phe Asp Phe Lys Leu Tyr Leu Pro His Tyr Thr Ser Gln Glu Asn Trp Met ArgHis Phe Gly Asp Lys Trp Thr Arg Phe Val Gln Arg Lys Gln Asn Phe Asp Pro LeuAla Ile Leu Ala Pro Gly Gln Lys Ile Phe Ser Arg Asn Gln Leu Lys。

<210> 3

<211> 22

<212> 引物P1序列

<213>DNA

<220>

<400>

5’- GTTGTAAAAGCCGTTAAAGCAG-3’

<210> 4

<211> 22

<212> 引物P2序列

<213>DNA

<220>

<400>

5’- TGAGACGTGTAGTGAGGAAGAT-3’

<210> 5

<211> 41

<212> 5’RACE引物P3序列

<213>DNA

<220>

<400>

5’-GATTACGCCAAGCTTTCGGTAGTGGTGCCAGACAGCAACAT-3’

<210> 6

<211> 41

<212> 3’RACE引物P4序列

<213>DNA

<220>

<400>

5’- GATTACGCCAAGCTTTCGCATGTCGAGGACGAGTCCTTTCT-3’

<210> 7

<211> 28

<212> 引物P5序列

<213>DNA

<220>

<400>

5’-ATGATAGCTTACCTTGAACACTTCGTTC-3’

<210>8

<211> 28

<212> 引物P6序列

<213>DNA

<220>

<400>

5’-TTATTTAAGTTGGTTTCTGGAAAATATT-3’

Claims

1.一种紫花苜蓿抗旱耐盐基因MsCKX，其特征在于，该紫花苜蓿抗旱耐盐基因MsCKX编码区的核苷酸序列如下：

2.如权利要求1所述的紫花苜蓿抗旱耐盐基因MsCKX，其特征在于，所述的紫花苜蓿抗旱耐盐基因MsCKX编码区的氨基酸序列如下：

3.权利要求1或2所述的紫花苜蓿抗旱耐盐基因MsCKX的克隆方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)苜蓿幼苗cDNA合成：

提取苜蓿幼苗总RNA，反转录得到第一链cDNA；

(2)MsCKX基因全长的克隆：

以苜蓿cDNA为模板，根据NCBI上蒺藜苜蓿的MtCKX基因序列进行同源比对并设计引物P1和引物P2，进行PCR扩增，回收和纯化PCR扩增产物，并测序得到中间片段；再根据测序得到的序列设计5’RACE引物P3和3’RACE引物P4，进行5’端序列和3’端序列的PCR扩增，回收和纯化PCR扩增产物，并测序；最终将中间序列，5’端序列和3’端拼接得到MsCKX基因的全长序列，并用ORF Finder找到该基因的开放阅读框ORF；其中：

引物P1序列为：5’-TTATTTAAGTTGGTTTCTGGAAAATATT-3’；

引物P2序列为：5’-TGAGACGTGTAGTGAGGAAGAT-3’；

5’RACE引物P3序列为：

5’-GATTACGCCAAGCTTTCGGTAGTGGTGCCAGACAGCAACAT-3’；

3’RACE引物P4序列为：

5’-GATTACGCCAAGCTTTCGCATGTCGAGGACGAGTCCTTTCT-3’；

(3)在ORF两端设计引物P5和P6并通过PCR扩增，将其产物进行纯化、载体连接、大肠杆菌转化，测序得到紫花苜蓿抗旱耐盐基因MsCKX的编码区核苷酸序列和氨基酸序列；其中：

引物P5序列为：5’-ATGATAGCTTACCTTGAACACTTCGTTC-3’；

引物P6序列为：5’-TTATTTAAGTTGGTTTCTGGAAAATATT-3’。

4.权利要求1或2所述的紫花苜蓿抗旱耐盐基因MsCKX用于提高转基因拟南芥和苜蓿的抗旱抗盐性的应用。