CN116426496A - 一种紫花苜蓿ipt基因在调控植物耐旱性中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种紫花苜蓿IPT基因在调控植物耐旱性中的应用。本发明基于转录组学分析结果，选择紫花苜蓿中干旱响应基因IPT作为候选基因，并利用基因工程手段对其基因功能验证。根据已获得的转录组数据库，对比蒺藜苜蓿数据库，使用同源克隆的方法，获得了紫花苜蓿IPT基因的全长序列，使用Gateway系统构建了过表达载体，PCR检测结果表明，该基因成功的插入pEG104载体中，测序结果证明没有突变。利用农杆菌转化法成功转化了拟南芥，对转基因拟南芥进行了干旱胁迫处理，结果表明该基因的确能够提高植株的抗旱能力，该应用丰富了紫花苜蓿抗旱调控网络机理。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种紫花苜蓿IPT基因在调控植物耐旱性中的应用。
背景技术
异戊烯基转移酶(Isopentenyl transferases，IPT)，是细胞分裂素合成重要的限速酶，能催化异戊烯基焦磷酸和单磷酸腺苷的分解，产生作为细胞分裂素的前体的异戊烯基单磷酸腺苷。细胞分裂素在植物生长发育的各个过程中起着重要作用，如细胞分裂、分化和营养物质代谢等。作为一种植物激素，它在植物的胁迫调节机制中也发挥着重要作用。异戊烯基转移酶(IPT)是细胞分裂素生物合成的关键调节酶。目前，IPT多个基因家族成员已经在拟南芥中被克隆出来。但其在紫花苜蓿耐旱性方面的功能研究较少。
发明内容
针对现有技术中的上述不足，本发明的目的在于提供一种紫花苜蓿IPT基因在调控植物耐旱性中的应用。
为了达到上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
第一方面，提供一种紫花苜蓿IPT，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
第二方面，提供一种紫花苜蓿IPT基因，其编码紫花苜蓿IPT。
进一步地，紫花苜蓿IPT基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
第三方面，提供一种含有紫花苜蓿IPT基因的重组载体。
进一步地，重组载体为过表达紫花苜蓿IPT基因的载体。
第四方面，提供一种含有紫花苜蓿IPT基因的重组菌株或重组细胞。
第五方面，提供一种紫花苜蓿IPT基因在调控植物耐旱性中的应用。
进一步地，上述应用为过表达紫花苜蓿IPT基因在增强植物耐旱性中的应用。
进一步地，植物为拟南芥。
本发明的有益效果为：
提供了一种提高植物干旱胁迫耐性的紫花苜蓿IPT基因，并首次在拟南芥中过量表达了紫花苜蓿IPT基因，其干旱胁迫耐性显著提高。基于本发明新发现的紫花苜蓿IPT基因在增强植物耐旱性中的应用，可用于改良现有植物的耐旱性，培育和创制耐旱性高的中间材料和生产品种。
附图说明
图1为本发明实施例提供的IPT基因转录组学分析及序列比对示意图；其中，A：IPT基因在紫花苜蓿中的表达热图；B：IPT基因CWL354HQ序列和蒺藜苜蓿基因组比对结果图；C：IPT基因CDS序列和拟南芥基因组比对结果图；
图2为本发明实施例提供的IPT蛋白和10个同源蛋白氨基酸序列同源比较示意图；
图3为本发明实施例提供的IPT蛋白和10个同源蛋白氨基酸序列同源比较进化树分析示意图；
图4为本发明实施例提供的同胁迫条件下IPT基因的相对表达量分析示意图；
图5为本发明实施例提供的IPT基因PCR扩增产物示意图；
图6为本发明实施例提供的GFP-IPT在烟草表皮细胞当中的亚细胞定位情况示意图；
图7为本发明实施例提供的IPT转基因拟南芥的获得与阳性株系PCR鉴定示意图；
图8为本发明实施例提供的过表达IPT拟南芥幼苗耐旱性分析示意图；
图9为本发明实施例提供的野生型与过表达IPT拟南芥幼苗耐旱性比较示意图。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。
实施例
实验材料：基因分型材料选取抗旱性紫花苜蓿品种Dryland和敏旱性紫花苜蓿品种WL354HQ，种植于36孔的穴盘中，培养基为泥炭土基质和生土等比例混合。温室培养20天后，开始进行实验处理。干旱处理采用不浇水连续干旱法；盐处理为浇灌NaCl溶液，浓度为200mmol/L；碱处理为浇灌NaHCO3溶液，浓度为100mmol/L；ABA处理为叶面喷施，浓度为100mmol/L；H2O2处理为叶片喷施，浓度为100mmol/L。
IPT基因克隆材料为紫花苜蓿品种为Dryland；拟南芥野生型材料品种为‘哥伦比亚’。
实验仪器：
实验药品：
1.化学试剂
NaCl，NaHCO3，ABA，30％ H2O2，PEG6000，IPTG，无水乙醇等购自国药集团化学试剂有限公司。
2.培养基及试剂配制
常用菌株、载体及限制酶：感受态细胞E.coli DH5ɑCompetent Cells、克隆载体pMDrylandM19-T Vector Cloning Kit均购于宝日医生物技术有限公司，农杆菌GV3101细胞购于北京华越洋生物。
pDONR221，Pdonr104载体于实验室保存。NruI购于北京百奥莱博科技有限公司；BPclonase Ebzyme Mix和LB clonase Ebzyme Mix购于赛默飞世尔科技(中国)有限公司。
PCR引物及测序：引物采用Primer5软件进行设计，由Sangon Biotech公司合成。
1.紫花苜蓿IPT基因的表达分析
紫花苜蓿苗分别进行(1)干旱：不浇水；(2)盐：每隔一天浇灌500mL200 mmol/LNaCl；(3)ABA：每隔一天早晨9:00对紫花苜蓿喷施20mL100μmol/L ABA，对照用水代替；(4)H2O2：每隔一天早晨9:00对紫花苜蓿喷施20mL 100μmol/L H2O2，对照用水代替。取样的时间点根据其受胁迫处理后表型的变化取样。干旱处理取4个时间点，即对照，轻度胁迫，中度胁迫和重度胁迫；其他处理取3个时间点的样品即对照，轻度胁迫和重度胁迫，分别取紫花苜蓿叶片茎和根系，根清洗后擦干表面水分，叶片和茎直接采样，取样后迅速放入液氮中，-80℃保存。在IPT基因ORF区设计定量引物qIPT-F和qIPT，以actin为内参基因，进行定量分析。
2.紫花苜蓿IPT基因的克隆和序列分析
使用Expasy(http://web.expasy.org/compute_pi/)对分子量(Mw)和等电点(pI)估算。用Plant CARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)对IPT基因启动子上的顺式作用元件进行分析。用Phyre2对其氨基酸序列进行蛋白三维结构预测。通过对该基因CDS序列和蒺藜苜蓿数据库比对，设计全长基因，使用同源克隆法克隆IPT基因全长。
3.候选基因的同源性比对
使用候选基因的蛋白序列在NCBI数据库中进行同源性比对，并下载和其同源性较近的序列，用MEGA软件构建进化树；用DNAMAN对IPT蛋白和10个同源蛋白氨基酸序列同源比较。
4.原核表达载体构建，转化及表达鉴定
(1)植物培养
①紫花苜蓿：紫花苜蓿种子发芽及植株培养方法：盆栽实验在宁夏大学大学生实验基地温室进行鉴定实验。为确保研究基因类型的一致性，所有植物材料均采用扦插的方法获得基因一致的无性系后代。紫花苜蓿植株材料扦插成苗后，将植株转入含有珍珠岩和蛭石(v/v,1:1)的塑料花盆(高10cm，直径8cm)，每盆1株，每个品种18盆。盆栽植物放在室温为22℃、相对湿度在40％的温室中生长。成苗后，所有植株总共修剪两次以确保植株材料生长一致。4周后，将植株随机分为对照组和干旱胁迫组。对照组连续浇水以保持80％的土壤含水量，而干旱组不浇水。使用带有GS3传感器的ProCheck分别在上午和下午测量每个花盆的土壤含水量。当土壤含水量低于平均水平且变化幅度大于10％时，通过适量补水将土壤水分调整到平均水平。因此，所有盆栽的土壤含水量都是一致的，保持干旱组植株都在相似的干旱胁迫条件下。干旱胁迫一直持续到第四天，敏旱性品种植株出现明显的萎蔫迹象，测定生长和生理指标，取样迅速液氮冷冻并储存于-80℃冰箱，用于荧光定量实验。
②拟南芥/烟草：拟南芥和烟草种子70％乙醇消毒30s，无菌水冲洗2次，20％次氯酸钠溶液消毒10min，无菌水冲洗10次。加入水琼脂种悬浮子，移液枪点播于1/2MS固体培养基上，封口后4℃冰箱放置2d，之后光照培养箱(温度22/20℃，光周期16h光照/8h黑暗，光照强度1200μmol/m2/s)中培养。发芽后10d左右，幼苗移至含泥炭土与蛭石的花盆中，光照培养箱中继续培养。
(2)紫花苜蓿RNA的提取
使用Vazyme的Plant Total RNA Isolation Kit(RC401)提取紫花苜蓿叶片RNA，方法如下。
①将0.1g超低温冻存的紫花苜蓿组织样品迅速转移至用液氮预冷的研钵中，用研杵研磨组织，其间不断加入液氮，直至研磨成粉末状。加入已于65℃预热的500μl BufferPRL，立即剧烈涡旋震荡30-60sec，使其充分裂解，降低粘稠度并有助于提高产量。
②将裂解物在65℃水浴5min，期间颠倒1-2次以帮助裂解，12,000rpm(13,400×g)离心10min。
③转移上清至新的1.5ml RNase-free离心管中，加入0.5倍上清体积的无水乙醇，立即吹打混匀。
④将上述混合液转移至FastPure gDNA-Filter ColumnⅡ(FastPure gDNA-Filter ColumnⅡ已放入收集管中)中，12,000rpm(13,400×g)离心2min，弃滤液。
⑤将FastPure gDNA-Filter ColumnⅡ放至新的2ml Collection Tubes，加入500μl Buffer PRLPlus，12,000rpm(13,400×g)离心30sec，收集滤液。
⑥向滤液中加入0.5倍滤液体积的无水乙醇，立即吹打混匀。
⑦将上述混合液转移至FastPure RNA ColumnⅣ(FastPure RNA ColumnⅣ已放入收集管中)中，12,000rpm(13,400×g)离心2min，弃滤液。
⑧向FastPure RNA ColumnⅣ中加入700μl Buffer PRW1，室温放置1min，12,000rpm(13,400×g)离心30sec，弃滤液。
⑨向FastPure RNA ColumnⅣ中加入500μl Buffer PRW2(使用前请检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(13,400×g)离心30sec，弃滤液。
⑩重复步骤8。将FastPure RNA ColumnⅣ吸附柱放回收集管中，12,000rpm(13,400×g)离心2min，去掉FastPure RNA ColumnⅣ中残留的Buffer PRW2。将FastPure RNAColumnⅣ转移至新的1.5ml RNase-free离心管中，向吸附柱膜中央悬空滴加30-100μl的RNase-free ddH2O，室温放置2min，12,000rpm(13,400×g)离心1min。提取的RNA可直接用于下游实验或于-70℃保存。
(3)反转录cDNA合成
使用Vazyme的HiScript III All-in-one RT SuperMix Perfect for qPCR(No.R333)试剂盒进行逆转录反应。方法如下：
①在Microtube中配制下列反应混合液表。反应液需要在冰上进行，配好后充分混匀。
②按下列条件进行反转录反应：50℃，15min；85℃，5s；4℃保存。
③将所得cDNA模板放置于-20℃储存。
(4)荧光定量
使用Vazyme的Taq Pro DNA Polymerase进行荧光定量。具体方法如下：
①在PCR八连排中配制下列反应混合液表。反应液需要在冰上进行，配好后充分混匀。
②实时荧光定量PCR按下列程序设定进行rt-qPCR反应：95℃10s，95℃30s，60℃30s。
③基因扩增
使用Takara的MightyAmp DNA Polymerase(No.R071A)进行目的基因扩增。PCR反应体系如下：
PCR反应条件如下：
④PCR产物回收。参照TIANGEN通用型DNA纯化回收试剂盒指导手册进行PCR产物的纯化回收。
(5)连接克隆载体
克隆所有载体为宝生物的pMD19-T Vector Clonging Kit。
10μl反应体系如下：
将混合液轻轻吸打混匀，16℃水浴条件下连接30分钟。
克隆所有载体为宝生物的pMD19-T Vector Clonging Kit。
10μl反应体系如下：
将混合液轻轻吸打混匀，16℃水浴条件下连接30分钟。
(6)大肠杆菌的转化
使用的大肠杆菌为Trans 5α，转化方法及步骤参考说明书进行。
①提前从-80℃取出Trans 5α，待其融化后，吸100μL加于10μL连接产物中，轻轻吸打使使其混合均匀，冰中放置30分钟。
②42℃加热45秒钟后，再在冰中放置1分钟。
③加入890μLSOC培养基，37℃振荡培养60分钟。
④在含有X-Gal、IPTG、Amp的L-琼脂平板培养基上培养，形成单菌落。计数白色、蓝色菌落。
⑤挑选白色菌落，使用PCR法确认载体中插入片段的长度大小。
(7)测序
将PCR鉴定出的阳性克隆用灭菌牙签从菌板上挑取出来，加到含有相关抗性的培养基中，摇菌，然后交公司完成测序。
(8)质粒的提取
采用天根的质粒小提试剂盒进行质粒的提取，相关实验方法参照TIANprepMiniPlasmid Kit试剂介绍。
(9)表达载体的构建
本实验采用pDONR221作为本实验的入门载体，pEG104载体为Gateway系统载体进行过表达载体构建。
①CK基因连接入门载体：采用天根快速质粒小提试剂盒提取测序成功的阳性菌株pMD19-CK的质粒，根据pEG104原始载体和目的基因设计合适的引物，分别以稀释100倍的克隆载体pMD19-CK为模板，进行PCR，产物胶回收后，与入门载体pDONR221进行BP连接反应，反应体系如下：
25℃反应过夜，加入0.5μL Proteinase K，37℃，10min，终止BP反应。
基因的克隆，质粒构建及过表达载体引物序列如下：
(10)植物表达载体的构建
提取pDONR221载体的质粒，以IPT全长质粒为模板，设计连有pDONR221和pDONR104载体共同序列的引物扩增IPT基因序列，构建pDONR104植物表达载体并转化农杆菌。
(11)花侵染转化拟南芥植株
①将转有质粒的农杆菌单菌落接种至3mL含相应抗生素的LB液体培养基中，28℃，培养过夜。
②将菌液转接到含有同样抗生素的LB液体培养基中，继续培养至OD值约1.0以上。
③室温，5000rpm，离心10min，将菌体用等体积的转化液(5％蔗糖+0.02％ SilwetL-77)重悬。
④提前剪去所有的果荚，选取花苞露白的拟南芥花序浸入转化液1min。
⑤将浸过的植株加湿避光培养24h。
⑥根据拟南芥生长状况，每隔7～10d侵染1次，重复2～3次。
(12)转基因植株的筛选
①将转化植株收获的种子，经75％的酒精消毒30s,15％ NaClO表面消毒12min，无菌ddH2O漂洗5次，均匀点播于加有50mg/mL草铵膦的MS固体筛选培养基上。
②4℃，低温处理3d，移至22℃生长室中，16/8h光周期培养。
③种子萌发10d后，挑取抗性苗，通常具有抗性的阳性幼苗真叶呈现深绿色并且根较长。而野生型植株难以长出真叶并且根较短。
④将出现4片真叶的幼苗转入土中，待幼苗长大后，PCR鉴定阳性植株，并分株收取T1代转基因种子。
⑤将鉴定为阳性的T1转基因种子表面消毒后，均匀点播于相同抗生素的培养基上进行筛选。
⑥在植株生长过程中，出现孟德尔遗传分离现象，选择接近于3:1性状分离比的抗性植株，分株收取T2代种子。
⑦若T2代种子在筛选培养基中全部具有抗性，则对应株系的种子是纯合体。
5.烟草叶片瞬时表达
(1)挑取带有目的质粒的农杆菌接种于10mL含有利福平和卡娜的LB培养基中，28℃，200r pm，震荡培养12-24h，至OD600值约为1.5。
(2)室温1000g离心10min，沉淀细胞，弃去上清。
(3)加入1mL烟草注射液(10mM MES+10Mm Mgcl+200Μm AS)，洗涤沉淀3次，以除去残留的抗生素。
(4)加入1mL注射液重悬菌体，测定OD600值带到1.5～2。
(5)根据所测OD值，计算稀释倍数，将含载体的农杆菌菌液1:1混合，制备成1mL烟草注射液。
(6)选取1个月苗龄的健康大而平整的烟草叶片，大拇指抵住叶片上表皮，用1mL注射器吸取注射菌液，从叶片下表皮轻轻注射，可见到菌液缓慢进入叶片。
(7)标记注射区域，将烟草植株移至植物生长室，培养2～3天后，远离注射伤口剪下菌液侵入的叶片区域，置于载玻片上，在共聚焦显微镜下检测烟草表皮细胞中的荧光信号。
6.转基因拟南芥耐旱性鉴定
(1)PEG6000模拟干旱处理。将同时期收获的野生型和转基因型拟南芥种子春化三天后接种在1/2MS培养基上，14天后接种到含有不同浓度PEG6000处理的竖直板上，生长14后进行表型观测及根长、鲜重的测定。
(2)将同时期收获的野生型和转基因型拟南芥种子春化三天后接种在1/2MS培养基上，15后接种到含相同重量的土壤有机质花盆中，10天后使用连续干旱胁迫法进行干旱胁迫处理，统计存活率，测定叶片相对含水量及鲜重。
通过转录组学分析，发现和细胞分裂素合成相关的基因在Dryland根中显著积累，如图1A所示，总共有5个细胞分裂素合成相关的差异基因，转录组数据显示，该类基因在Dryland根中的表达量均高于WL354HQ。其中TRINITY_DN1455_c0_g1_i1_3和TRINITY_DN3347_c0_g1_i1_4在紫花苜蓿叶片中无表达，说明这两个基因可能是紫花苜蓿根特有的基因。相比较TRINITY_DN916_c0_g1_i1_1在这四组比较中变化最为突出，在耐旱品种根中显著积累，因此选择该基因为提高紫花苜蓿耐旱性的候选基因。使用TRINITY_DN916_c0_g1_i1_1的CWL354HQ序列在phytozome植物基因组数据库中进行比对，其结果显示，该序列和蒺藜苜蓿的adenylate isopentenyl transferase极为相似，和拟南芥isopentenyltransferase 7序列极为相似(图1B，C)。因此，认为找到的和细胞分裂素合成相关的旱响应候选基因为isopentenyl transferase(IPT)。
通过氨基酸同源性分析发现IPT编码的氨基酸序列与蒺藜苜蓿，地三叶，鹰嘴豆，豌豆等的序列有较高的相似性(大于60％)。根据NCBI预测比对结果，IPT蛋白质在不同的物种中包含2个主要的高度保守序列，一个腺苷酸异戊烯基转移酶结构域(Adenylateisopentenyltransferase)，一个IPP转移酶结构域(IPP transferases，也被称为tRNA-异戊烯基焦磷酸转移酶)(图2)。利用MEGA7.0软件构建系统发生树分析，结果表明紫花苜蓿中的IPT和蒺藜苜蓿有较高的同源性(图3)。
为了确定IPT基因在不同生物胁迫条件下的表达模式，对紫花苜蓿幼苗进行了干旱、碱、盐和ABA处理。如图4所示，干旱胁迫条件下，耐旱苜蓿Dryland的叶片在24小时表达量有所上调，但在48小时和64小时表达量均下降，在茎中，IPT表达量均上调，但耐旱性苜蓿Dryland表达量更高，在64小时达到所有处理中表达量最高值，在根中，在24小时和64小时IPT，Dryland中表达量上调，但在48小时时有短暂的下调，而敏旱性品种WL354HQ所有的表达量均下调，且在64小时时下调的更多。总体来说，在干旱胁迫下，茎和根中有更多的IPT表达，根中耐旱性品种IPT表达量上调，而在敏旱性品种中IPT表达量总体下调，此外，Dryland比WL354HQ积累了更高的IPT表达量。经100mmol/L的NaHCO3处理后，叶片中IPT表达量均下调，和WL354HQ相比Dryland下降的更多一些；而在茎中，该基因在Dryland中上调，而在WL354HQ中下调，48小时表达量又略有上调，在根中，该基因先上调后下降，Dryland表达量高于WL354HQ。在NaCl胁迫条件下，叶片该基因表达量均下调，Dryland下降的更多一些；在茎中，IPT在Dryland中表达量上调，但在WL354HQ中下调，在根中，均下调，但是下调幅度更大一些。经100mmol/L的ABA的叶面喷施处理后，IPT在Dryland叶片中表达量下调幅度高于WL354HQ叶片,在Dryland茎中，IPT表达量上调，而在WL354HQ中先下降后上调，在根中，总体都上调，但在48小时，上调的更多。100mmol/L的H2O2处理后，和ABA胁迫结果相同，WL354HQ有更多的IPT表达。这些结果表明IPT表达对不同的生物胁迫均有响应。
通过转录组数据库，查找到IPT的一个981bp的CDS序列，使用phytozome12.1比对到和它相似的蒺藜苜蓿IPT的基因序列，通过同源重组的方法设计引物克隆到一个1099bp全长基因片段(图5)。进一步对该基因的开放阅读框预测发现，该基因的ORF区含有326bp,编码9个氨基酸。通过生物信息学软件预测该基因编码的蛋白的分子量(Mw)大小为37.27KDa，等电点为9。
为研究IPT基因的功能，通过Plant CARE在线对IPT基因启动子上的顺式作用元件进行分析。如下表所示，多种与抗逆性相关的顺式作用元件在IPT基因序列中被发现，如响应环境逆境胁迫的MYB，MBS和MYC的作用元件；赤霉素响应元件P-box；响应脱落酸诱导的ABRE响应元件；光响应元件GT1-motif和G-Box等。因此，可以推断IPT基因可能参与了植物非生物胁迫的响应进程。
为了进一步研究IPT调控耐旱的分子机制，本实施例对IPT蛋白的亚细胞定位情况进行分析。首先，将IPT构建到含有GFP报告基因的瞬时表达载体Pdonr104上，得到GFP-IPT的重组载体。转化农杆菌GV3101感受态后，再通过在本氏烟草叶片细胞当中进行瞬时表达，使用共聚焦扫描显微镜观察GFP在488nm处激发光下观察荧光信号的情况。结果如图6所示，在转GFP空载和IPT的细胞中，绿色荧光在细胞膜和细胞核中均有分布。
为了研究紫花苜蓿IPT基因是否可以提高植物的耐旱性，构建了IPT基因的过表达载体，侵染拟南芥，使用草丁膦作为筛选剂获得转基因拟南芥株系，经PCR鉴定，共获得10株转基因拟南芥(图7)。
将获得的T1代植株继续培养到T2代，筛选得到纯合转基因植株。将IPT转基因株系和野生型拟南芥种子播种于含1/2MS的培养基，发芽7天后，将IPT转基因和野生型拟南芥幼苗转移到含0，100和200mmol/L PEG6000的1/2MS培养基，培养14天后，测定其生长状态(图8)。结果表明，在PEG6000模拟的干旱条件下，野生型拟南芥植株的生长受到严重抑制而转基因植株生长良好。在100mmol/L PEG6000处理下，野生型和转基因拟南芥根系和对照比较均略有增长，但转基因拟南芥根增长最为显著(p<0.5)；野生型拟南芥叶片部分生长受到抑制，而转基因植株叶片生长无明显差异，野生型和转基因植株生物量均下降，但干旱胁迫处理条件下，转基因植株生物量显著高于野生型(p<0.5)。在200mmol/L PEG6000处理下，野生型拟南芥生长受到严重抑制，而转基因拟南芥还能够正常生长，但出现早花现象；和对照相比，胁迫处理条件下生物量均下降，但野生型植株生物量下降最为显著；根长的变化和生物量变化一致，干旱处理条件下转基因拟南芥生物量和根长均显著高于拟南芥(p<0.5)(图8B，C)。拟南芥成苗后，在营养钵中模拟干旱胁迫，结果表明，10天干旱胁迫后，野生型植株叶片色绿显著减少，且植株的的存活率显著降低，为29％，而转基因植株叶片色绿较高，存活率为79％(图9A，B)。干旱胁迫显著降低了野生型植株的鲜重以及叶片的相对含水量(图9C，D)。综上所述转IPT基因可以提高拟南芥的的耐旱性。
本发明基于转录组学分析结果，选择紫花苜蓿中干旱响应基因IPT作为候选基因，并利用基因工程手段对其基因功能验证。根据已获得的转录组数据库，对比蒺藜苜蓿数据库，使用同源克隆的方法，获得了紫花苜蓿IPT基因的全长序列，并对基因分型做了相关研究。结果表明，该基因受多种胁迫诱导，并在IPT基因启动子区预测得到了大量的逆境胁迫、激素和光响应元件。此外，使用Gateway系统构建了过表达载体，PCR检测结果表明，该基因成功的插入pEG104载体中，测序结果证明没有突变。利用农杆菌转化法成功转化了拟南芥，对转基因拟南芥进行了干旱胁迫处理，结果表明该基因的确能够提高植株的抗旱能力，该研究丰富了紫花苜蓿抗旱调控网络机理。
于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (9)
1.一种紫花苜蓿IPT，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.一种紫花苜蓿IPT基因，其特征在于，其编码权利要求1所述的紫花苜蓿IPT。
3.根据权利要求2所述的紫花苜蓿IPT基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
4.一种含有权利要求2所述的紫花苜蓿IPT基因的重组载体。
5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为过表达紫花苜蓿IPT基因的载体。
6.一种含有权利要求2所述的紫花苜蓿IPT基因的重组菌株或重组细胞。
7.权利要求2所述的紫花苜蓿IPT基因在调控植物耐旱性中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，为过表达紫花苜蓿IPT基因在增强植物耐旱性中的应用。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的植物为拟南芥。
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