CN103215276A - 一种紫花苜蓿抗旱耐盐基因 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种紫花苜蓿抗旱耐盐基因，其氨基酸核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。将该基因转入紫花苜蓿中，能够提高紫花苜蓿的抗旱耐盐能力，通过基因工程手段快速培育抗逆性强的紫花苜蓿品种。要得到抗逆性强的紫花苜蓿品种，还需通过以下过程：1将该基因和植物表达载体pCAMBIA1301用T4连接酶连接，构建植物表达载体；2将表达载体质粒导入农杆菌GV3101中，用叶盘法侵染烟草叶片，潮霉素筛选抗性植株；3所得植株移栽入土，观察植株生长状态和表型。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，涉及一种紫花苜蓿抗旱耐盐基因。
背景技术
紫花苜蓿(Medicago sativaL.)是世界上分布最广泛的多年生豆科牧草，目前全世界种植面积达3000多万hm2，我国属世界上栽培利用苜蓿较多的国家之一。由于其营养丰富，适口性强，栽培面积广，蛋白质含量高，因而有“牧草之王”的美称，在畜牧业生产中发挥着重要作用。近年来由于我国气候干旱日益严重，草场过分开发以及管理粗放，极大程度的限制了苜蓿的生产，因此，现阶段开展提高苜蓿抗逆性的技术研究具有重要的现实意义。但苜蓿的抗逆境遗传资源匾乏，通过常规杂交育种选育抗逆品种不易实现。近年来，越来越多的耐盐、耐旱、耐冷相关基因的克隆及植物转基因技术的不断发展，为选育耐逆苜蓿新品种提供了一种新的技术途径，利用基因工程技术来提高苜蓿抗旱、耐寒、耐盐碱能力，改良苜蓿品质，选育苜蓿新品种具有重大的生态效益、社会效益和经济效益。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术所存在的上述不足，而提供一种紫花苜蓿抗旱耐盐基因。
其技术方案为：
一种紫花苜蓿抗旱耐盐基因，其氨基酸核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。
本发明的有益效果：
与现有技术相比，将该基因转入紫花苜蓿中，能够提高紫花苜蓿的抗旱耐盐能力，通过基因工程手段快速培育抗逆性强的紫花苜蓿品种。要得到抗逆性强的紫花苜蓿品种，还需通过以下过程：1将该基因和植物表达载体pCAMBIA1301用T4连接酶连接，构建植物表达载体；2将表达载体质粒导入农杆菌GV3101中，用叶盘法侵染烟草叶片，潮霉素筛选抗性植株；3所得植株移栽入土，观察植株生长状态和表型。
附图说明
图1为5′RACE步骤概要图；
图2为3′RACE步骤概要图；
图3为紫花苜蓿抗旱耐盐基因提取方法技术路线图；
图4为5′RACE步骤实际扩增图；
图5为3′RACE步骤实际扩增图；
图6为紫花苜蓿抗旱耐盐基因提取方法实际扩增图；
图7为转基因植株的鉴定结果；
图8为本发明紫花苜蓿抗旱耐盐基因干旱处理结果图；
图9为本发明紫花苜蓿抗旱耐盐基因盐处理结果图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明的方法作进一步详细地说明。
这两种方法的结合可望获得全长cDNA基因。
5′RACE步骤概要如图1所示：第一链引物GSP1同mRNA退火；使用SuperScriptIII(invitrogen)将mRNA转录成cDNA；使用RnaseH(MBI)降解RNA；使用玻璃奶纯化cDNA；使用dCTP和TdT对纯化的cDNA加尾；使用简并的锚定引物和巢式GSP2 PCR扩增带有dC尾的cDNA；使用AUAP，UAP和巢式GSP重新扩增初步PCR产物。
3′RACE步骤概要如图2所示：3′RACE利用mRNA3′-末端天然存在的Poly(A)尾作为PCR扩增的通用引发点，首先用反转录酶和Oligo-dT接头引物对mRNAs进行反转录，使之转换为cDNA。然后用一个能与已知外显子序列区退火的基因特异引物(GSP)和定位在Poly(A)尾部的接头引物直接进行PCR，扩增特异cDNA。
紫花苜蓿抗旱耐盐基因提取方法技术路线图如图3所示，用Trizol法(Invitrogen，USA)提取紫花苜蓿叶片RNA，按cDNA Synthesis Kit(TAKERA，Japan)使用说明书反转录为cDNA。
用特异性引物P1、P2和Clonetech的SMARTTMRACE试剂盒自带引物AUAP(AbridgedUniversal Amplification Primer：GGCCACGCGTCGACTAGTAC)分别扩增该基因的3’端和5’端序列。
测序后，利用DNAman5.0拼接全长，找到开放阅读框ORF(Open reading frame，ORF)，在ORF两端分别设计全长引物P3和P4，利用高保真酶扩增该基因的全长cDNA，然后连接到PMD18-T载体上，转化DH5α，筛选阳性克隆送华大基因测序。
5′RACE实际扩增图如图4所示，目的条带长600bp。
3′RACE实际扩增图如图5所示，目的条带长1036bp。
参照图6，目的条带全长为1396bp。
转基因植株的鉴定结果如图7所示，证明该基因已经转入烟草基因组中，引物是潮霉素通用引物，扩潮霉素(HYG)上面的一段521bp的序列：(该序列的名称)
HygF cgattccggaagtgcttgac
HygR cgtctgctgctccatacaag
干旱处理(20％PEG)下，在0，2，4，8，12和24h取样，运用实时定量PCR对该基因的表达量进行检测，结果如图8所示。
盐处理(200mmolNaCl)下，在0，2，4，8，12和24h取样，运用实时定量PCR对该基因的表达量进行检测，结果如图9所示。
以上所述，仅为本发明最佳实施方式，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。
Claims (1)
1.一种紫花苜蓿抗旱耐盐基因，其特征在于，其氨基酸核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO.1所示。
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