CN107760708A - 通过过表达JcARF19基因来提高小桐子果实产量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种通过遗传改良的方法提高小桐子果实产量的方法，包括如下步骤：(1)构建表达小桐子ARF19基因的农杆菌转化载体，(2)利用步骤(1)构建的农杆菌转化载体转化农杆菌菌株，然后再用筛选得到的重组农杆菌菌株转化小桐子的外植体，并再生小桐子的幼苗，筛选并培育稳定过表达ARF19基因的小桐子幼苗，得到具有提高的小桐子果实产量的小桐子植株。转基因小桐子的JcARF19基因的表达水平提高，表现出早花，多分枝，增大种子和增加种子数目等性状。除了小桐子，JcARF19的异源植物表达也可以实现单株种子产量的增加。采用本发明方法，可将小桐子单株产量提高到3～5倍。

Description

通过过表达JcARF19基因来提高小桐子果实产量的方法
技术领域
本发明涉及一种对生长树木基因的表达水平进行调控的方法，具体地涉及一种通过提高作物JcARF19基因积累水平来提高小桐子或其它作物果实产量的方法。
背景技术
小桐子(Jatropha curcas)是当今国际能源界公认和首选的可再生能源植物，因为其种仁中的高含油量，并且所压榨出的油料经简易处理即为高品质的生物柴油，例如航空燃油，并且可广泛应用于各类动力机械和内燃机车。三吨小桐子种子就可生产一吨生物柴油，是国际市场上极具竞争力和战略开发意义的生物新能源品种。
在我国西南数省区(云、贵、川、两广和海南)，小桐子开垦种植无论是原始天然林还是人工种植林，都已经颇具规模，仅中石油在四川凉山州就达百万亩。而由于“产业超前，研发滞后”的现象，作为商业化、规模化的生物能源原料生产林，其亩产量太低，每亩不超过100公斤，已严重制约我国生物能源产业的健康发展。主要原因归结为生产上缺乏优良品种和高产栽培技术措施。现有小桐子全属实生苗林，离商业上的高收益水平差距还很大。大规模提高小桐子的产量，是亟待解决的产业瓶颈问题。从长远看，必须培育高产、高油和抗逆的优良品种。因此研究出能有效提高小桐子产量的方法，就显得尤为重要。
现有技术中公开了一些提高小桐子果实产量的方法，例如利用乙烯利、赤霉素分别或复配成各种组分剂量的水剂，雾化喷施于小桐子的花序和花蕾顶部，使之花芽向更多雌性花和两性花方向转化，或使之花蕾增多提升坐果率。但实践中在成片小桐子林大规模应用这些方法时，其效果并不理想。小桐子树型较高(3X9X15m)，点对点花蕾喷施药剂困难且费工费时成本太高，而且小桐子是一年多个花期多次挂果的常年花果同树植物，需重复施药，操作难度太大，人工成本高，同时用药还受气候和环境的限制太多，因此实际上尚没有一种具有应用价值可显著提高小桐子果实产量的方法。所以获得高产品种是最关键的研究目标。
发明内容
在本领域中，对于培育具有提高的小桐子果实产量的小桐子植株的方法存在需求。
为了克服上述现有技术存在的问题，本发明提供了一种通过遗传改良来提高小桐子种子大小调控基因的表达水平的办法来提高产量的方法。
本发明的技术思路是：对于小桐子的种子发育而言，胚乳细胞的大小和数目多少是决定种子大小的关键。本发明人在长期研究中发现胚乳细胞的发育过程是由若干个基因控制的，是各种植物内源激素在时间、空间上的相互作用产生的综合结果，这种综合结果受遗传因素影响并控制。本发明人有效把握住关键的控制种子大小的遗传决定因子，对小桐子植株的内源激素的感应能力进行调控，获得的转基因植物胚乳中，有效的增加了细胞大小和细胞数目，并且植物的株型也发生了改变，具有更强的分支能力和缩短了开花时间。
本发明采用的技术方案是：获得过表达JcARF19的转基因植物，包括如下步骤：
(1)构建表达小桐子ARF19(JcARF19)基因的农杆菌转化载体，
(2)利用步骤(1)构建的农杆菌转化载体转化农杆菌菌株，然后再用筛选得到的重组农杆菌菌株转化小桐子的外植体并再生小桐子的幼苗。
具体地，本发明提供一种培育具有提高的小桐子果实产量的小桐子植株的方法，所述方法包括下述步骤：
(1)构建表达小桐子ARF19(JcARF19)基因的农杆菌转化载体，
(2)利用步骤(1)构建的农杆菌转化载体转化农杆菌菌株，然后再用筛选得到的重组农杆菌菌株转化小桐子的外植体，并再生小桐子的幼苗，筛选并培育稳定过表达ARF19基因的小桐子幼苗，得到具有提高的小桐子果实产量的小桐子植株。
在实验中，本发明人发现过表达JcARF19基因也能够增加拟南芥的生物量和种子产量。由此，本发明还提供一种培育具有增加的生物量和种子产量的拟南芥植株的方法，所述方法包括下述步骤：
(1)构建表达小桐子ARF19(JcARF19)基因的农杆菌转化载体，
(2)利用步骤(1)构建的农杆菌转化载体转化农杆菌菌株，然后再用筛选得到的重组农杆菌菌株转化野生型拟南芥植株，筛选并培育稳定过表达ARF19基因的拟南芥幼苗，得到具有增加的生物量和种子产量的拟南芥植株。
进一步地，由于不同植物的ARF19基因具有高度保守性(图6)，因此，本发明的方法同时也可适用于攀藤瓜类或者果树植物。
因此，在一方面，本发明提供一种培育具有提高的果实产量的植物的方法，所述方法包括下述步骤：
(1)构建表达小桐子ARF19(JcARF19)基因的农杆菌转化载体，
(2)利用步骤(1)构建的农杆菌转化载体转化农杆菌菌株，然后再用筛选得到的重组农杆菌菌株转化所述植物的愈伤组织或外植体，并再生所述植物的幼苗，筛选并培育稳定过表达ARF19基因的植物幼苗，得到具有提高的果实产量的植物植株，
其中所述植物为攀藤瓜类或者果树植物。
具体地，所述植物可以选自黄瓜、南瓜、西瓜、芒果、荔枝、龙眼、柑橘、苹果、板栗或葡萄等。
用于本发明的小桐子ARF19(JcARF19)基因编码SEQ ID No.3所示的氨基酸序列。
在本发明的优选的实施方案中，小桐子ARF19(JcARF19)基因的核苷酸序列如SEQID No.1所示。本领域技术人员应该理解，依据具体物种对遗传密码子应用的偏好性以及密码子的简并性，依据SEQ ID No.3所示的氨基酸序列，可以根据实际需要确定适宜的小桐子ARF19(JcARF19)基因对应的核苷酸序列。
用于构建表达小桐子ARF19(JcARF19)基因的农杆菌转化载体为以pCAMBIA1300载体(购自北京天恩泽基因科技有限公司)为骨架改造的pCAMBIA1300-2X35S载体。改造方法为一般的分子生物学方法：将2X35S启动子-多克隆位点-3HA标签-Nos终止子的序列引入到pCAMBIA1300骨架载体中(Jian Ye et al.，2014，Biotechnology for biofuels，7：91)。pCAMBIA1300-2X35S载体的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。
用于本发明的农杆菌是农杆菌菌株AGL1(购自北京博迈德生物技术有限公司)。
在本发明中，用于转化重组农杆菌的植物组织一般是愈伤组织或外植体。术语“外植体”是指植物组织培养中作为离体培养材料的器官或组织的片段，例如种子，子叶和茎段等，在实际操作中，本领域技术人员根据不同植物选择合适的外植体用于转化。
在本发明中，术语“再生”是指进一步在适当的培养基上培育转化的愈伤组织或外植体，使其长成为一株独立完整的植株。
因此，本发明提供下述技术方案：
1.一种培育具有提高的小桐子(Jatropha curcas)果实产量的小桐子植株的方法，所述方法包括下述步骤：
(1)构建表达小桐子ARF19基因的农杆菌转化载体，
(2)利用步骤(1)构建的农杆菌转化载体转化农杆菌菌株，然后再用筛选得到的重组农杆菌菌株转化小桐子的外植体，并再生小桐子的幼苗，筛选并培育稳定过表达ARF19基因的小桐子幼苗，得到具有提高的小桐子果实产量的小桐子植株。
2.第1项所述的方法，其中所述小桐子ARF19基因编码SEQ ID No.3所示的氨基酸序列。
3.第2项所述的方法，其中所述小桐子ARF19基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
4.第1项所述的方法，其中步骤(1)中使用pCAMBIA1300-2X35S载体构建表达小桐子ARF19基因的农杆菌转化载体。
5.一种培育具有增加的生物量和种子产量的拟南芥植株的方法，所述方法包括下述步骤：
(1)构建表达小桐子ARF19基因的农杆菌转化载体，
(2)利用步骤(1)构建的农杆菌转化载体转化农杆菌菌株，然后再用筛选得到的重组农杆菌菌株转化野生型拟南芥植株，筛选并培育稳定过表达ARF19基因的拟南芥幼苗，得到具有增加的生物量和种子产量的拟南芥植株，
其中所述小桐子ARF19基因编码SEQ ID No.3所示的氨基酸序列。
6.一种培育具有提高的果实产量的植物的方法，所述方法包括下述步骤：
(1)构建表达小桐子ARF19基因的农杆菌转化载体，
(2)利用步骤(1)构建的农杆菌转化载体转化农杆菌菌株，然后再用筛选得到的重组农杆菌菌株转化所述植物的愈伤组织或外植体，并再生所述植物的幼苗，筛选并培育稳定过表达ARF19基因的植物幼苗，得到具有提高的果实产量的植物植株，
其中所述植物为攀藤瓜类或者果树植物，并且
其中所述小桐子ARF19基因编码SEQ ID No.3所示的氨基酸序列。
7.第6项所述的方法，其中所述植物选自黄瓜、南瓜、西瓜、芒果、荔枝、龙眼、柑橘、苹果、板栗或葡萄等。
8.第5或6项所述的方法，其中所述小桐子ARF19基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
9.第5或6项所述的方法，其中步骤(1)中使用pCAMBIA1300-2X35S载体构建表达小桐子ARF19基因的农杆菌转化载体。
10.第1、5或6项所述的方法，其中步骤(1)中使用pCAMBIA1300-2X35S载体的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。
本发明的技术效果是：
1、采用本发明方法，可定向诱导提高小桐子的种子大小、开花性状和其他植物生长状态，转基因过表达JcARF19的小桐子产量提高到4倍以上，开花时间缩短3个月，分支数目提高到近4倍的量；
2、不受气候影响，不受季节限制；
3、增产效果迅速，经济效益显著，具有很好的应用前景。
附图说明
从下面结合附图的详细描述中，本发明的上述特征和优点将更明显，其中：
图1是用于本发明的植物表达载体构建的示意图。
图2显示过表达JcARF19基因增加拟南芥的生物量和种子产量。
A-C，14天的Columbia生态型拟南芥野生型植物Col-0，过表达JcARF19和JcIAA9基因拟南芥植物的生物量。T3代植物生长在16小时光照/8小时黑暗条件下的21℃恒温生长箱中。Bar：1厘米。A，野生型植物Col-0；B，JcARF19OE；C，JcIAA9OE。
D-F，野生型植物Col-0，过表达JcARF19和JcIAA9基因拟南芥种子的扫描电子显微镜观察结果。T3代植物种子用于观察。Bar：100微米。D，野生型植物Col-0种子；E，JcARF19OE植物种子；F，JcIAA9OE植物种子。
G，野生型植物Col-0，过表达JcARF19和JcIAA9基因拟南芥(JcARF19OE#2和JcIAA9OE#1)种子的长度。数值表示±SD(n＝10)，**表示P＜0.01，*表示P＜0.05。
H，野生型植物Col-0，过表达JcARF19和JcIAA9基因拟南芥(JcARF19OE#2，#11和JcIAA9OE#1，#3)100粒种子的干重。数值表示±SD(n＝101，**表示P＜0.01，*表示P＜0.05。
图3显示过表达JcARF19基因增加小桐子的产量和种子大小。
A，野生型小桐子植物JcMD和10株T0代过表达JcARF19或JcIAA9基因小桐子植物(JcARF19OE和JcIAA9OE)的开花时间。开花时间是用植物从移植到土里到开第一朵花的天数来度量的。数值表示±SD(n＝10)，**表示P＜0.01，*表示P＜0.05，下同。
B，过表达JcARF19基因小桐子植物(JcARF19OE#1，#10和#13)叶片中JcARF19基因的相对表达水平。数值表示±SD(n＝3)。
C，野生型小桐子植物JcMD和10株T1代过表达JcARF19基因小桐子植物JcARF19OE的分枝数目的比较。数值表示±SEM。
D，野生型小桐子植物JcMD和T0代过表达JcARF19基因小桐子植物JcARF19OE一年内的单株植物的种子数目的比较。数值表示±SEM。
E，野生型小桐子植物JcMD和T0代过表达JcARF19基因小桐子植物(JcARF19OE#，#10和#13)的单个种子重量的比较。数值表示±SEM。
F，野生型小桐子植物JcMD和过表达JcARF19基因小桐子植物(JcARF19OE#1，#10和#13)的种子长度的比较。数值表示±SEM(n＝15)。
G，野生型小桐子植物JcMD和过表达JcARF19基因小桐子植物JcARF19OE#1的胚乳细胞长度的比较。数值表示±SD。
H，野生型小桐子植物JcMD和过表达JcARF19基因小桐子植物JcARF19OE#1的胚乳细胞数目的比较。数值表示±SD(n＝10)。
图4显示过表达JcARF19基因改变小桐子的产量和株型。
A，野生型小桐子植物JcMD(左侧)和T0代过表达JcARF19基因小桐子植物JcARF19OE#1(右侧)的植物形态的比较。Bar：10厘米。
B，过表达JcARF19基因小桐子植物JcARF19OE#1与野生型小桐子植物JcMD相比分枝增加。Bar：10厘米。
C，T0代过表达JcARF19基因小桐子植物JcARF19OE#1与野生型小桐子植物JcMD相比开花时间早。Bar：10厘米。
D和E，野生型小桐子植物JcMD(左侧)和过表达JcARF19基因小桐子植物(右侧)的果实大小的比较。Bar：1厘米。
F，野生型小桐子植物JcMD(左侧)和过表达JcARF19基因小桐子植物(右侧)的种子大小的比较。Bar：1厘米。
G和H，野生型小桐子植物JcMD(G)和过表达JcARF19基因小桐子植物(H)的胚乳细胞大小的比较。Bar：50微米。
图5显示过表达JcARF19基因改变细胞增殖和细胞体积相关基因的表达。
A，细胞循环和细胞数目相关基因(JcARF19，JcIAA9，JcLBD18，JcLBD29，JcEXP1，JcARGOS，JcCDK41，JcCYCD2和JcCYCD5)的相对表达水平。载体对照植物中的基因表达水平设为1，Early stage：受精后3周，Middle stage：受精后6周。
B，细胞分化和细胞骨架动态相关基因(JcRIC1，JcRIC4，JcROP2，JcROP6，JcTMK1，JcTMK2和JcTMK3)的相对表达水平。载体对照植物中的基因表达水平设为1，Early stage：受精后3周，Middle stage：受精后6周。
图6不同植物ARF19蛋白氨基酸序列比对及功能结构域示意图。红色下划线表示类B3DNA结合结构域。黄色下划线表示与IAA9蛋白互作的蛋白-蛋白互作结构域。JcARF19蛋白的关键氨基酸突变位点用*标识。Gm，大豆(Glycine max)；Vv，葡萄(Vitis vinifera)；Rc，蓖麻(Ricinus communis)；Jc，小桐子(Jatropha curcas)；Ji，南洋樱(Jatrophaintegerrima)。
序列表信息
SEQ ID No.1，JcARF19的核苷酸序列(3402bp)，来源于小桐子植物
SEQ ID No.2，JcIAA9的核苷酸序列(1107bp)，来源于小桐子植物
SEQ ID No.3，JcARF19的氨基酸序列(1133aa)，来源于小桐子植物
SEQ ID No.4，JcIAA9的氨基酸序列(368aa)，来源于小桐子植物
SEQ ID No.5，pCAMBIA1300-2X35S载体序列
表1.本发明所用的引物信息
表1的引物通过人工合成获得(由赛默飞世尔科技公司合成)。
具体实施方式
下面参照具体的实施例进一步描述本发明，但是本领域技术人员应该理解，本发明并不限于这些具体的实施例。
应该理解，除非另外指明，下述实施例中所用的试剂均为市售试剂。
实施例1过表达JcARF19基因增加拟南芥的生物量和种子产量。
步骤1：构建转化植物的表达载体
首先以SEQ ID No.1为模板设计扩增引物(见表1，JcARF19-Full length-F和JcARF19-Full length-R)，利用pCAMBIA1300载体系列(购自北京天恩泽基因科技有限公司)改造的pCAMBIA1300-2X35S载体(SEQ ID No.5，改造方法：将2X35S启动子-多克隆位点-3HA标签-Nos终止子的序列引入到pCAMBIA1300骨架载体中，参见Jian Ye et al.，2014，Biotechnology for biofuels，7：91)，构建双元表达载体pCAMBIA：35S：JcARF19(JcARF19OE)。按照SEQ ID No.2为模板设计扩增引物(见表1，JcIAA9-Full length-F和JcIAA9-Full length-R)，利用改造的pCAMBIA1300-2X35S载体，构建双元表达载体pCAMBIA：35S：JcIAA9(JcIAA9OE)。如图1所示。
步骤2：转基因拟南芥的获得
分别将步骤1的两个植物双元表达载体转化农杆菌菌株AGL1(购自北京博迈德生物技术有限公司)，利用含有卡那霉素(50mg/L)和利福平(20mg/L)的LB固体平板筛选阳性克隆。依照文献(Xiuren Zhang et al.，2006，Nature Protocol)报道的拟南芥转化方法将含有不同的植物表达载体的农杆菌菌株AGL1分别转化野生型拟南芥Col-0，再对T1代种子进行转化子筛选，从而成功获得JcARF19和JcIAA9的过表达转基因植物(JcARF19OE和JcIAA9OE)。
步骤3：转基因拟南芥后代种子的大小和种子百粒干重的检测
每个品系的拟南芥种子收获后放置在干燥箱干燥，分别数5份每份100粒饱满的干燥种子，在电子天平上称重，记录重量。
过表达JcARF19的拟南芥的营养生长、种子大小和重量表现出明显的增加的表型(图2A-H)。而JcIAA9过表达的拟南芥营养生长没有明显的变化(图2A-C)。JcARF19和JcIAA9过表达转基因植物的种子大小和种子重量都比野生型对照有显著增长(图2D-H)，种子长度增加了10-15％，种子百粒干重增加了15-30％(图2G-H)。
实施例2过表达JcARF19基因增加小桐子的种子产量和大小。
本实施例2与实施例1相比，步骤1相同，不同的步骤2和步骤3如下：
步骤2：组织培养、转化和再生小桐子植物：利用体外萌发的小桐子(新加坡JOils公司惠赠)的子叶为外植体进行小桐子的转化和再生，具体方法参考(Qu Jing et al.，2012，Biotechnology for biofuels)。
用于遗传转化的农杆菌的准备：分别将两个植物双元表达载体(即JcARF19OE和JcIAA9OE，实施例1中制备的)转化农杆菌菌株AGL1，利用含有卡那霉素(50mg/L)和利福平(20mg/L)的LB固体平板筛选阳性克隆。将阳性克隆的农杆菌菌株过夜培养，达到OD595＝0.7-1.0备用。
共培养：将子叶切成5mm见方备用。将目的农杆菌(调OD595＝0.25-0.35)同小片子叶在20ml液体培养基(4.4g/L MS粉(购自Duchefa公司)，10g/L葡萄糖，0.5g/L MES，pH5.2，121℃灭菌20分钟，待冷却后加入20mg/L AS，1.5mg/L 6-BA，0.1mg/L NAA)中共培养20分钟，其间不断摇匀。将共培养后的外植体放置到固体共培养培养基(4.4g/L MS粉，10mg/L柠檬酸，150mg/L谷氨酰胺，3％蔗糖，234.5mg/L MgCL2，100mg/L酶水解酪蛋白，0.5g/L MES，2.5g/L植物凝胶，pH5.2，121℃灭菌20分钟，待冷却后加入1.5mg/L 6-BA，0.05mg/L NAA，20mg/L AS)上，黑暗条件下22℃放置2-3天。然后先用双蒸水淋洗10次，再用300mg/L头孢霉素洗一次，最后用灭菌滤纸吸干。放置到愈伤诱导培养基(4.4g/L MS粉，10mg/L柠檬酸，150mg/L谷氨酰胺，3％蔗糖，234.5mg/L MgCL2，100mg/L酶水解酪蛋白，2.5g/L植物凝胶，pH5.8，121℃灭菌20分钟，待冷却后加入1.5mg/L 6-BA，0.05mg/L NAA，3mg/L潮霉素，100mg/L头孢霉素)上，25℃黑暗培养三周左右，在这种条件下，未成功转化的外植体会逐渐呈褐色。
转基因芽再生：将分化出来的愈伤组织切出，放置到含有筛选抗生素的芽再生培养基I(4.4g/L MS粉，10mg/L柠檬酸，150mg/L谷氨酰胺，3％蔗糖，234.5mg/L MgCL2，100mg/L酶水解酪蛋白，2.5g/L植物凝胶，pH5.8，121℃灭菌20分钟，待冷却后加入1.5mg/L 6-BA，0.05mg/L IBA，2mg/L adenine，3mg/L潮霉素，100mg/L头孢霉素)上，25℃光照(16小时光照/8小时黑暗)培养三周左右。然后将分化出的再生芽转移到芽再生培养基II(4.4g/L MS粉，10mg/L柠檬酸，150mg/L谷氨酰胺，3％蔗糖，234.5mg/L MgCL2，100mg/L酶水解酪蛋白，7g/L植物凝胶，pH5.8，121℃灭菌20分钟，待冷却后加入1.5mg/L 6-BA，0.05mg/L IBA，0.5mg/L GA，3mg/L潮霉素，100mg/L头孢霉素)上，25℃光照(16小时光照/8小时黑暗)培养四周左右。而未分化出芽的愈伤组织则转移到芽再生培养基III(4.4g/L MS粉，10mg/L柠檬酸，150mg/L谷氨酰胺，3％蔗糖，234.5mg/L MgCL2，100mg/L酶水解酪蛋白，2.5g/L植物凝胶，pH5.8，121℃灭菌20分钟，待冷却后加入1.5mg/L 6-BA，0.05mg/L IBA，3mg/L潮霉素，100mg/L头孢霉素)上，25℃光照(16小时光照/8小时黑暗)继续再生培养三周左右，然后再将分化的再生芽转移到芽再生培养基II上继续光照培养四周左右。
再生芽的伸长：再生芽长到2厘米以后换到芽伸长培养基(4.4g/L MS粉，10mg/L柠檬酸，150mg/L谷氨酰胺，3％蔗糖，234.5mg/L MgCL2，100mg/L酶水解酪蛋白，7g/L琼脂，pH5.8，121℃灭菌20分钟，待冷却后加入0.3mg/L 6-BA，0.5mg/L GA)上，25℃光照(16小时光照/8小时黑暗)培养两周左右。。
生根：等芽长到4-5厘米，4-5片叶子的时候可以将伸长芽移至生根培养基(4.4g/LMS粉，3％蔗糖，0.5g/L MES，100mg/L木炭，2.2g/L植物凝胶，pH5.6，121℃灭菌20分钟，待冷却后加入0.07mg/L IBA)上，25℃光照(16小时光照/8小时黑暗)培养四周左右。
生根的幼苗直接经过炼苗移到土中，不能生根的幼苗可以利用嫁接的方法快速繁殖得到T1代种子。
严格按照上述的转化操作流程，最终我们没有获得过表达JcIAA9基因的小桐子植物，这可能是由于JcIAA9基因参与生长素信号转导的关键环节，过表达该基因会严重影响小桐子的生长发育。因此，在后续实验中，我们主要验证了JcARF19基因在小桐子和其他植物(例如，攀藤瓜类或者果树植物)中过表达对果实产量的影响。
步骤3：转基因植物的初步鉴定和农艺性状的测定
在炼苗以后将植物转移到土中种植以前，利用CTAB方法提取T0代转化苗的基因组DNA，然后用对应的特异PCR引物扩增，进行转基因植物的初步鉴定，有扩增条带的植物品系才进行移栽。
待移栽的转基因植物生长状态恢复正常后，进行JcARF19基因表达量的检测。首先按SEQ ID No.1为模板设计扩增引物(见表1，JcARF19-F和JcARF19-R)，然后每一个样品取100mg，提取总RNA并对基因组DNA进行消化处理，Nanodrop定量后取2ug总RNA为模板，MMLV反转录酶合成cDNA。取2μl cDNA为模板，0.4μl 10μm的引物，10μl SYBR Green(TOYOBO)，然后用ddH2O补足至20μl。实时PCR程序为预变性95℃10min，变性95℃15s，退火58℃30s，延伸72℃30s，40个循环，补平延伸5min。所有样品都做三次技术重复。JcUbiquitin为内参基因(引物见表1，JcUBQ-F和JcUBQ-R)，进行实时PCR分析。如图3B所示，JcARF19过表达品系中的#1，#10和#13的JcARF19基因表达水平均达到或超过对照植物中的10倍以上。
过表达JcARF19的小桐子表现出稍早花的表型，开花时间缩短了三个月(图3A)。植株的分枝数目也明显增加，JcARF19过表达的分枝数为野生型对照的2.5倍，T1代收获的种子数目、种子重量、种子长度、胚乳细胞长度和细胞数目也都表现出优于对照的表型(图3C-H和图4)。
实施例3过表达JcARF19基因改变小桐子种子胚乳细胞的细胞增殖和细胞体积相关基因的表达。
检测在过表达JcARF19的小桐子种子胚乳细胞的细胞增殖和细胞体积相关基因(引物见表1)的表达情况。每一个样品100mg，每个处理至少三个生物学重复，提取总RNA并对基因组DNA进行消化处理，Nanodrop定量后取2μg总RNA为模板，MMLV反转录酶合成cDNA。取2μl cDNA为模板，0.4μl 10μm的引物，10μl SYBR Green(TOYOBO)，然后用ddH2O补足至20μl。实时PCR程序为预变性95℃10min，变性95℃15s，退火58℃30s，延伸72℃30s，40个循环，补平延伸5min。所有样品都做三次技术重复。JcUbiquitin为内参基因(引物见表1，JcUBQ-F和JcUBQ-R)，进行实时PCR分析。如图5所示，很多胚乳细胞增殖和细胞体积相关基因在胚乳发育早期或者中期的表达都大大提高了，说明JcARF19的过表达增加了胚乳细胞繁殖并使得细胞体积增大。
结果表明，过表达JcARF19基因能够使胚乳细胞繁殖增加，细胞体积增大，进而影响木本植物小桐子多方面的农艺性状，包括提高小桐子的种子数目、大小和重量、缩短开花时间和增加分枝数目。
综上所述，采用本发明方法，不仅可以提高模式植物拟南芥的生物量、种子大小和数量，而且能够改良小桐子多方面农艺性状，包括提高小桐子的种子数目、大小和重量、缩短开花时间和增加分枝数目，培育出高产品种。本发明方法虽以小桐子作为培育对象，但由于不同植物的ARF19基因具有高度保守性(图6)，因此本发明方法同时也可适用于攀藤瓜类或者果树植物，例如黄瓜、南瓜、西瓜、芒果、荔枝、龙眼、柑橘、苹果、板栗和葡萄等。
应该理解，以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。

Claims (9)

1.一种培育具有提高的小桐子(Jatropha curcas)果实产量的小桐子植株的方法，所述方法包括下述步骤：
(1)构建表达小桐子ARF19基因的农杆菌转化载体，
(2)利用步骤(1)构建的农杆菌转化载体转化农杆菌菌株，然后再用筛选得到的重组农杆菌菌株转化小桐子的外植体，并再生小桐子的幼苗，筛选并培育稳定过表达ARF19基因的小桐子幼苗，得到具有提高的小桐子果实产量的小桐子植株。
2.权利要求1所述的方法，其中所述小桐子ARF19基因编码SEQ ID No.3所示的氨基酸序列。
3.权利要求2所述的方法，其中所述小桐子ARF19基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
4.权利要求1所述的方法，其中步骤(1)中使用pCAMBIA1300-2X35S载体构建表达小桐子ARF19基因的农杆菌转化载体。
5.一种培育具有增加的生物量和种子产量的拟南芥植株的方法，所述方法包括下述步骤：
(1)构建表达小桐子ARF19基因的农杆菌转化载体，
(2)利用步骤(1)构建的农杆菌转化载体转化农杆菌菌株，然后再用筛选得到的重组农杆菌菌株转化野生型拟南芥植株，筛选并培育稳定过表达ARF19基因的拟南芥幼苗，得到具有增加的生物量和种子产量的拟南芥植株，
其中所述小桐子ARF19基因编码SEQ ID No.3所示的氨基酸序列。
6.一种培育具有提高的果实产量的植物的方法，所述方法包括下述步骤：
(1)构建表达小桐子ARF19基因的农杆菌转化载体，
(2)利用步骤(1)构建的农杆菌转化载体转化农杆菌菌株，然后再用筛选得到的重组农杆菌菌株转化所述植物的愈伤组织或外植体，并再生所述植物的幼苗，筛选并培育稳定过表达ARF19基因的植物幼苗，得到具有提高的果实产量的植物植株，
其中所述植物为攀藤瓜类或者果树植物，并且
其中所述小桐子ARF19基因编码SEQ ID No.3所示的氨基酸序列。
7.权利要求6所述的方法，其中所述植物选自黄瓜、南瓜、西瓜、芒果、荔枝、龙眼、柑橘、苹果、板栗或葡萄等。
8.根据权利要求5或6所述的方法，其中所述小桐子ARF19基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示。
9.权利要求5或6所述的方法，其中步骤(1)中使用pCAMBIA1300-2X35S载体构建表达小桐子ARF19基因的农杆菌转化载体。
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