CN109762838B

CN109762838B - 一种发根农杆菌介导的菠菜毛状根遗传转化体系

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Publication number: CN109762838B
Application number: CN201910041984.0A
Authority: CN
Inventors: 付春祥; 戴绍军; 徐悦; 曹英萍; 王玉; 李莹
Original assignee: Northeast Forestry University; Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS; Shanghai Normal University
Current assignee: Northeast Forestry University; Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS; Shanghai Normal University
Priority date: 2019-01-17
Filing date: 2019-01-17
Publication date: 2023-01-13
Anticipated expiration: 2039-01-17
Also published as: CN109762838A

Abstract

一种发根农杆菌介导的菠菜毛状根遗传转化的方法。主要包括使用发根农杆菌侵染菠菜外植体后产生毛状根，再诱导菠菜毛状根产生愈伤，通过愈伤分化，获得菠菜毛状根的再生株。此外，本发明实现了发根农杆菌的Ri质粒与携带外源基因的Ti质粒的共转化，PCR结果和荧光显微镜观察显示,发根农杆菌Ri质粒的rol B基因以及Ti质粒中GFP基因已在菠菜毛状根基因组中稳定表达。

Description

一种发根农杆菌介导的菠菜毛状根遗传转化体系

技术领域

本发明属于植物组培技术和植物转基因技术领域，具体地涉及一种诱导菠菜(Spinacia oleracea)毛状根及其培养和再生的方法。

背景技术

菠菜(Spinacia oleracea)属双子叶植物纲藜科菠菜属，是以绿叶为主要器官的一年生或二年生草本植物。菠菜为绿叶蔬菜类中最主要的一种，具有较高的营养价值。由于菠菜耐寒性好，生长周期短，1年内可多茬栽培，是四季尤其是冬淡季主要供应的蔬菜之一。

近年来随着人们对蔬菜的品质和营养价值等需求的日益提高，除了传统育种之外，分子生物学技术手段也常被用来进行蔬菜的新品种培育或进行蔬菜功能基因的挖掘和鉴定。通过根癌农杆菌(Agrobacteriumtume faciens)里Ti质粒的T-DNA为媒介，将目的基因导入植物中，获得外源基因稳定表达的转基因株系，是研究植物基因功能和遗传改良的主要技术手段之一。除了根癌农杆菌，在自然界中，发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)可通过Ri质粒的T-DNA，将诱导发根的基因位点rol基因(rol A、rol B和rolC)稳定整合到宿主植物基因组中，产生毛状根。发根农杆菌也可以同时将Ri质粒中携带发根基因座的T-DNA和Ti质粒中携带外源基因的T-DNA共同整合到植物基因组中，实现共转化。很多植物，如苜蓿(Medicago sativa)的毛状根可以再生为具有正常育性的完整植株，这样允许在整个植株水平评价外源基因的功能。因此，通过发根菌建立遗传转化体系，可以另辟蹊径，作为植物遗传转化体系的另一选择。

发根农杆菌侵染植物的效率较高，易得到毛状根系。毛状根具有生长速度快，遗传稳定等特点，常用来作为很多重要研究的模型。例如番茄(Lycopersicon esculentum)的毛状根和野生根的外部形态及内部结构非常相似，根特异性基因的表达在正常根和毛状根中也无明显差别，因此，番茄的毛状根常被用来作为研究番茄根功能基因的一个模型。另外，部分植物能够在超量吸收重金属的同时保持正常生长代谢，如藜科植物菠菜根可以吸收重金属镉。相比于正常植物，毛状根生长条件简单可控，繁殖速度快，遗传性能稳定，已经代替整个植株成为研究植物修复重金属污染的重要模型之一。

鉴于毛状根的重要性，很多植物毛状根诱导及再生系统已经被建立，包括雪莲(Saussurea involucrata)、五寸石竹(Dianthus chinensis)、北玄参(Scrophularia buergeriana)。然而，藜科植物的毛状根体系的研究较为少见，目前仅有甜菜(Beta vulgaris)的毛状根诱导成功的研究报道。本发明第一次诱导出了藜科蔬菜植物菠菜的毛状根，并建立了菠菜毛状根再生体系，在毛状根里实现了Ti质粒共转化。该系统可以用于菠菜基因功能的鉴定，并为今后菠菜的基因工程改良和分子育种提供辅助。

发明内容

本发明的目的是提供一种诱导菠菜毛状根及其培养和再生的方法。利用本发明所述方法能够高效快捷的诱导菠菜毛状根，并且能得到菠菜毛状根再生植株。

为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现：一种波菜毛状根的诱导增殖方法，具体包括以下步骤：

1)活化发根农杆菌：将发根农杆菌从-80 ℃冰箱里取出，划线在相应抗性的农杆菌固体培养基(YEP基础培养基，16 g·L^-1琼脂)上，在28 ℃的条件下进行暗培养。2天后，农杆菌固体培养基上长出了发根农杆菌单克隆。然后将其接种到50 mL含有相应抗性的农杆菌液体培养基中(YEP基础培养基)，在28 ℃的条件下暗培养，转速为200 rpm摇菌。当菌液浓度OD₆₀₀值到达0.6到0.8之间时，离心富集菌体。用50 mL的毛状根液体培养基(SH基础培养基，15 g·L^-1蔗糖)重悬菌液至OD₆₀₀值等于0.3，并加入乙酰丁香酮至100 μmol·L^-1，作为诱导菠菜毛状根的侵染液。

2)获得30到40天菠菜组培无菌苗：萌发菠菜的无菌种子，取菠菜叶、叶柄和茎取20-35天的菠菜无菌苗，将菠菜的无菌苗叶片剪成大小约5 mm×5 mm的小段，菠菜的叶柄和茎剪成长约为5 mm小段。已经剪好的外植体放到诱导菠菜毛状根的侵染液中，振荡孵育5分钟，然后置于无菌的滤纸上晾干。晾的时间不宜过长，防止叶片萎蔫。在共培养培养基上(SH基础培养基，15 g·L^-1蔗糖，7.8 g·L-1琼脂，100 μmol·L^-1乙酰丁香酮)共培养，2天之后转移到毛状根培养培养基(SH基础培养基，15 g·L^-1蔗糖，7.8 g·L^-1琼脂，300 mg·L^-1特美汀)进行毛状根诱导。菠菜外植体产生毛状根后，进行继代培养，继代培养基同上(SH基础培养基，15 g·L^-1蔗糖，7.8 g·L^-1琼脂，300 mg·L^-1特美汀)，20-40天毛状根可以稳定增殖生长。

3)侵染菠菜外植体并共培养：取菠菜叶、叶柄和茎取20-35天的菠菜无菌苗，将菠菜的无菌苗叶片剪成大小约5 mm×5 mm的小段，菠菜的叶柄和茎剪成长约为5 mm小段。已经剪好的外植体放到诱导菠菜毛状根的侵染液中，振荡孵育5分钟，然后置于无菌的滤纸上晾干。在共培养培养基上(SH基础培养基，15 g·L^-1蔗糖，7.8 g·L^-1琼脂，100 μmol·L^-1乙酰丁香酮)共培养，2天之后转移到毛状根培养培养基(SH基础培养基，15 g·L^-1蔗糖，7.8g·L^-1琼脂，300 mg·L^-1特美汀)进行毛状根诱导。菠菜外植体产生毛状根后，进行继代培养，继代培养基同上(SH基础培养基，15 g·L^-1蔗糖，7.8 g·L^-1琼脂，300 mg·L^-1特美汀)，20-40天毛状根可以稳定增殖生长。

4)毛状根的传代培养：选取生长状态稳定的菠菜毛状根，继代在毛状根培养培养基(SH基础培养基，15 g·L^-1蔗糖，7.8 g·L^-1琼脂，300 mg·L^-1特美汀)。

5)愈伤诱导培养基及培养条件：取稳定生长的毛状根，将上面粘有的原培养基用镊子轻轻去除，然后置于愈伤诱导培养基上(SH基础培养基，30 g·L^-1蔗糖，7.8 g·L^-1琼脂，4 mg·L^-1 2,4-D，1 mg·L^-1 6-BA，300 mg·L^-1特美汀)，毛状根与培养基充分接触，20天继代1次。

6)分化培养基及培养条件：将依附于毛状根之上产生的愈伤，轻轻用镊子剥下来，继代在分化培养基(SH基础培养基，30 g·L^-1蔗糖，7.8 g·L^-1琼脂，2 mg·L^-1 6-BA，300mg L^-1特美汀)。在27 ℃下，光周期为8小时光照，16小时黑暗，培养30-40天。

7)生根培养基及培养条件：用镊子将分化菠菜所出的芽与芽分开，继代在生根培养基上(1/2 MS基本培养基，15 g·L^-1蔗糖，7.8 g·L^-1琼脂)。在27 ℃下，光周期为8小时光照，16小时黑暗，培养10-20天菠菜生根。

8)冻融法转化农杆菌感受态：冰上融化发根农杆菌LBA9402感受态细胞，冰上融化后，加入3 mL的GFP质粒DNA，冰上静置30分钟，液氮中冷冻1 分钟。然后37 ℃水浴3 分钟加入950 μL无抗生素的YEP培养基，28 ℃，200 rpm，振荡培养3 小时。5000 rpm离心1 分钟以浓缩菌液，用100 μL YEP回溶菌体，后将回溶后的菌体涂于加50 mg·L^-1卡那霉素的固体YEP培养基上，28 ℃下培养。长出单克隆后，用PCR鉴定GFP和rol B基因，保存阳性菌落。

本发明的优点和积极效果：

本发明通过发根菌介导，通过毛状根系统导入外源基因并获得转基因植株。首先筛选得到了适合侵染菠菜的发根菌菌株LBA9402，第一次获得了菠菜的毛状根系；确定了菠菜毛状根的培养增殖培养条件，并得到了菠菜毛状根的再生植株。进一步对发根菌介导的Ti和Ri质粒的T-DNA共转化进行了研究，首次获得了GFP基因共转化的毛状根株系，为已测序菠菜品种SP75遗传转化体系的建立提供了另外一种可能性。此外，菠菜的根部可以富集重金属镉和有机氯农药(OCPs)林丹，菠菜毛状根诱导体系的建立，方便了以菠菜毛状根作为模型，研究其对这两种污染物的吸收情况。相比于整株植物寿命有限，每次实验都需重新建立模型，不具有替代性和重复性，且培养条件较为复杂等缺点，菠菜毛状根生长迅速，周期短，生产效率高，时间成本低，遗传稳定性好，是研究植物对水体污染物吸附降解的良好体系。

附图说明：

图1 不同外植体和发根农杆菌菌种对毛状根诱导效率的影响。

毛状根诱导率=生根外植体个数/侵染外植体个数×100%

图2 菠菜毛状根诱导情况。

(A) 菠菜叶柄维管束部位产生的毛状根; (B) 菠菜叶脉部位产生的毛状根; (C)菠菜茎的维管束部位产生的毛状根. 比例尺=20 μm

图3 菠菜毛状根在液体和固体两种培养基上的增殖情况。

(A) 菠菜毛状根接种后0天在固体培养基上生长情况; (B) 毛状根接种后14天在固体培养基生长情况; (C) 菠菜毛状根接种后0天在液体培养基上生长情况; (D) 毛状根接种后14天在液体培养基生长情况; (E) 菠菜毛状根毛在两种培养基中的增长倍数的变化. 增长倍数=(毛状根培养后的质量-毛状根培养前的质量)/毛状根培养前的质量; (F)毛状根在固体体培养基生长14天后情况细节图; (G) 毛状根在液体培养基生长14天后情况细节图.比例尺=2 cm ( A、B、C、D ) 比例尺=20 μm ( F、G )

图4 菠菜毛状根的再生体系。

(A) 菠菜毛状根在愈伤诱导培养基上产生愈伤; (B) 菠菜毛状根诱导的愈伤生长在分化培养基上，愈伤组织变绿并且产生不定芽; (C) 菠菜毛状根诱导的愈伤再生出植株; (D) 菠菜野生型植株.

图5 PCR分析菠菜毛状根及其再生植株。

(A) PCR分析菠菜毛状根中rol B (上方)和Vir G (下方)基因的存在情况(1: 2kb DNA marker; 2–11: 从毛状根基因组DNA扩增的PCR产物; 12: 从发根农杆菌(LAB9402)菌落扩增的PCR产物; 13: 从非转化根(对照根)基因组DNA扩增的PCR产物; 14:去离子水扩增的PCR产物); (F) 发根农杆菌(LBA9402)诱导菠菜产生的毛状根; (G) 菠菜的野生型正常根. 比例尺=20 μm

(B) PCR分析菠菜毛状根诱导的愈伤再生出植株中rol B(上方)和Vir G (下方)基因的存在情况(1: 2 kb DNA marker; 2–4: 从毛状根诱导的愈伤再生出植株基因组DNA扩增的PCR产物; 5: 从发根农杆菌(LAB9402)菌落扩增的PCR产物; 6:菠菜野生型植株基因组DNA扩增的PCR产物; 7: 去离子水扩增的PCR产物). 比例尺=2 cm

图6 菠菜毛状根rol B基因和GFP 基因的PCR鉴定及GFP 绿色荧光检测

(A) 在自然光下观察的转基因毛状根; (B) 在蓝色激发光下观察的转基因毛状根;(C) PCR分析菠菜转基因毛状根中rol B (上)、Vir G (中)和GFP(下)基因的整合情况(1: 2 kb DNA marker; 2–11 : 从转基因毛状根基因组DNA扩增的PCR片段; 12: 从发根农杆菌LBA9402 (GFP)菌落扩增的PCR片段; 13: 从非转化根(对照根)基因组DNA扩增的片段; 14: Mili Q水扩增的PCR片段). 比例尺=20 μm

具体实施方式：

下面结合附图和实例对本发明做进一步详细说明。

本发明英文缩写的中文释义如下：

2,4-D：2,4-二氯苯氧乙酸

6-BA：6—苄氨基嘌呤。

实施例1：选择适合菠菜的发根农杆菌和诱导菠菜毛状根

1)活化发根杆菌：选取4种发根菌：LBA9402、K599、R1601和Arqual分别侵染菠菜外植体。

2)制备无菌外植体并探究不同外植体的侵染效率：分别选择1月龄菠菜无菌苗的叶片、叶柄、茎三种外植体进行侵染。

3)毛状根的诱导及转化：将菠菜的取菠菜叶、叶柄和茎取20-35天的菠菜无菌苗，将菠菜的无菌苗叶片剪成大小约5 mm×5 mm的小段，菠菜的叶柄和茎剪成长约为5 mm小段再放到侵染液中，振荡孵育5分钟后晾干。在共培养培养基上(SH基础培养基，15 g·L^-1蔗糖，7.8 g·L^-1琼脂，100 μmol·L^-1乙酰丁香酮)共培养，2天之后转移到毛状根培养培养基(SH基础培养基，15 g·L-1蔗糖，7.8 g·L-1琼脂，300 mg·L^-1特美汀)。菠菜外植体产生毛状根后，进行继代培养，继代培养基同上(SH基础培养基，15 g·L^-1蔗糖，7.8 g·L^-1琼脂，300 mg·L^-1特美汀)，20-40天毛状根可以稳定增殖生长。

LBA9402和K599的诱导率明显优于其他两种，其中LBA9402在茎中的诱导率最高，可达16%，而Arqual的诱导率极低，最高仅为3.2%，R1601没有诱导出菠菜毛状根(图1)。另外，观察菠菜叶、茎、叶柄三种外植体类型对发根菌的敏感度发现，无论何种发根菌侵染菠菜，相比于叶和叶柄，菠菜的茎对发根菌更为敏感，其毛状根诱导率最高(图1)。本发明首次筛选并且得到适合菠菜的发根农杆菌。菠菜的毛状根约在发根菌LBA9402侵染后的8-15天出现，且大多出现在维管束发达部位，如叶脉、茎或叶柄的维管束位置(图2A、B、C)。

实施例2：筛选适合菠菜毛状根的培养基

1)选取毛状根：选取生长状态稳定的相同根系的菠菜毛状根，并称取毛状根(0.5±0.05) g。

2)毛状根继代在不同条件培养基：将取好的毛状根分别继代在SH固体(SH基础培养基，15 g·L^-1蔗糖，7.8 g·L^-1琼脂，300 mg·L^-1特美汀)和SH液体培养基(SH基础培养基，15 g·L^-1蔗糖，300 mg·L^-1特美汀)。

3)拍照记录毛状根生长状态并对毛状根进行称重。

在整个培养过程持续观察发现，菠菜毛状根在液体培养基中生长缓慢(图3D)，甚至出现了褐化的现象(图3G)。而固体培养基上继代的毛状根生长旺盛(图3B)。对不同培养条件下生长的毛状根进行称重，在培养了21天后固体培养基上的毛状根鲜重的增长倍数高于液体培养基44倍(图3E)。得出结论，本发明第一次筛初步选出了适合菠菜毛状根生长发育的培养基。

实施例3：获得菠菜毛状根再生植株

1) 取稳定生长的毛状根，然后置于愈伤诱导培养基上(SH基础培养基，30 g·L^-1蔗糖，7.8 g·L^-1琼脂，4 mg·L^-1 2,4-D，1 mg·L^-1 6-BA，300 mg·L^-1特美汀)，诱导菠菜毛状根愈伤(图5A)。

2) 将毛状根产生的愈伤，继代在分化培养基(SH基础培养基，30 g·L^-1蔗糖，7.8g·L^-1琼脂，2 mg·L^-1 6-BA，300 mg L^-1特美汀)。培养2.5-3个月，相继产生芽点(图5B)。

3)将分化产生的芽点转移到生根培养基上(1/2 MS基本培养基，15 g·L-1蔗糖，7.8 g·L-1琼脂)。培养10-20天菠菜生根。

首先取菠菜的毛状根诱导成愈伤，通过愈伤再生获得其转基因植株。使用愈伤诱导培养基诱导出毛状根的愈伤(图4A)，然后将其置于分化培养基上进行再生，培养2.5-3个月，愈伤继续增殖，某些愈伤变红变绿，相继产生芽点(图4B)。由LBA9402诱导得到的13个菠菜毛状系中有3个根系得到了再生植株。将菠菜的再生芽移出到生根培养基进行生根培养，再生菠菜小苗10到20天生根(图4C)。但与正常种子萌发的植株相比，菠菜毛状根再生出的植株丛生芽增多、根系极其发达、植株更加矮小(图4C、D)。

实施例4：菠菜毛状根、再生植株和PCR检测

1)毛状根DNA提取：取新鲜的菠菜毛状根或再生植株叶片剪碎置于1.5 mL离心管中，加入2×CTAB提取液1 mL，使用小研杵捣碎后充分混匀，65 ℃水浴60分钟，在水浴期间轻轻颠倒离心管几次。水浴结束后，待液体冷却至室温加入等体积的氯仿剧烈震荡15秒，12000 rpm室温离心10分钟，取上清液转移到新的1.5 mL离心管中，然后加入等体积的异丙醇震荡混匀，于-20 ℃冰箱中沉淀30分钟，12000 rpm室温离心10分钟。然后用1 mL70％乙醇洗涤沉淀，7500 rpm离心5分钟，倒掉上清洗涤液。洗涤操作重复1次，最后自然干燥DNA，去除残余乙醇溶液。加入去离子水溶解DNA，超微量仪测定DNA浓度和比值。

2) PCR反应：青岛擎科梓熙生物技术有限公司合成rol B基因(AM422760.1)和GFP基因的PCR引物，rol B-F: 5'- AAGTGCTGAAGGAACAATC-3', rol B-R: 5'-CAAGTGAATGAACA-AGG-AAC -3'; vir G-F: 5'- CCTTGGGCGTCGTCATAC-3', vir G-R: 5'-TCGTCCTCGGTCGTT-TCC -3'; GFP-F: 5'-TGATGCCGTTCTTCT-GCTTGTC-3'; GFP-R: 5'-CAGTGCTTCAGCC-GCTACCC-3。RCR扩增rol B基因和GFP基因，PCR反应总体系为20 μL，分别加入rol B基因、vir G基因和GFP基因的上、下游引物各1 μL (终浓度20 pmol·L–1)，模板DNA2 μL (约200 ng)，2×MIX Buffer10 μL，6 μL的去离子水补齐20 μL反应总体系。PCR反应条件：95 ℃预变性5分钟；95 ℃变性30秒, 54 ℃退火30秒, 72 ℃延伸45秒, 28个循环；72 ℃延伸10分钟，然后取出PCR反应产物4 ℃恒温保存。各取10 μL rol B基因、vir G基因和GFP基因的PCR扩增产物，进行琼脂糖凝胶电泳(1.0%)并拍照，点样时5 μL 2 000 bpLadder Maker作为分子量标准。

通过毛状根的胶图观察得到rol B基因、vir G基因和GFP基因PCR产物大小分别为194 bp、529 bp和280 bp（图5A、B）符合预期。

实施例5：菠菜毛状根、再生植株和PCR检测

1) 使用冻融法将携带GFP的Ti质粒转入发根菌LBA9402中，侵染菠菜外植体产生毛状根（方法同实例1的1、2、3步骤）。

2) 对产生10个不同根系的毛状根系进行PCR鉴定（方法同实例4的1、2步骤），找出既含GFP又含rolB基因的共转根系。

3)荧光显微镜观察，鉴定出共转Ti质粒T-DNA和Ri质粒T-DNA的毛状根系。

为了发展菠菜毛状根的外源基因转化系统，将携带GFP的Ti质粒导入发根菌LBA9402中，侵染菠菜。对产生10个不同根系的毛状根系进行鉴定，PCR结果显示rol B和GFP基因存在于其中6个毛状根根系中(图6C)。荧光显微镜观察发现, GFP基因可以在毛状根中稳定表达，发出绿色荧光(图6A、B)。

总之，本发明建立了菠菜毛状根诱导及再生体系，可以为其他短日照植物毛状根诱导及再生体系的建立提供借鉴及宝贵经验。菠菜毛状根系可以作为研究菠菜根基因功能的模型，因此菠菜毛状根诱导及其共转体系的建立有助于快速鉴定菠菜根的基因功能。最后，菠菜做为植物修复材料，研究植物对重金属吸收和有机污染物富集降解的分子机制，菠菜毛状根系的建立可以为其提供研究材料，缩短研究周期，均衡研究材料，提高实验的可重复性和稳定性。

Claims

1.一种诱导菠菜毛状根及其培养和再生的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤如下：

(1)活化农杆菌LBA9402，当菌液浓度OD 600值到达0.6到0.8之间时，离心富集菌体，后用液体侵染液重悬菌液至OD 600值等于0.3；液体侵染液的成分及终浓度为在SH基础培养基中含有100μmol·L^-1乙酰丁香酮和15g·L^-1蔗糖；

(2)取20-35天的菠菜无菌苗的叶、叶柄和茎，将菠菜的无菌苗叶片剪成大小约5mm×5mm的小段，菠菜的叶柄和茎剪成长约为5mm小段，作为诱导菠菜毛状根的外植体；

(3)将已经剪好的外植体置于侵染液中，振荡孵育5分钟后晾干，在共培养培养基上共培养2天，然后转移到毛状根培养培养基；所述共培养培养基的成分为在SH基础培养基中含有终浓度15g·L^-1蔗糖、7.8g·L^-1琼脂和100μmol·L^-1乙酰丁香酮；毛状根培养培养基是在SH基础培养基中含有终浓度15g·L^-1蔗糖、7.8g·L^-1琼脂和300mg·L^-1特美汀；

(4)菠菜外植体产生毛状根后，20-40天毛状根能够稳定增殖生长，每14天继代一次；继代培养基为在固体SH基础培养基中含有终浓度15g·L^-1蔗糖、7.8g·L^-1琼脂和300mg·L^-1特美汀；

(5)取处于稳定生长的菠菜毛状根置于愈伤诱导培养基，20天继代1次；所述愈伤诱导培养基是在SH基础培养基中含有终浓度30g·L^-1蔗糖、7.8g·L^-1琼脂、4mg·L^-12,4-二氯苯氧乙酸、1mg·L^-16-苄氨基嘌呤和300mg·L^-1特美汀；

(6)将毛状根产生的愈伤用镊子轻剥，继代在分化培养基，在27℃下，光周期为8小时光照，16小时黑暗，培养30-40天；所述分化培养基是在SH基础培养基中含有30g·L^-1蔗糖、7.8g·L^-1琼脂、2mg·L^-16-苄氨基嘌呤和300mg·L^-1特美汀；

(7)将菠菜丛生芽分开，继代在生根培养基上；在27℃下，光周期为8小时光照，16小时黑暗，培养10-20天直至菠菜生根；所述生根培养基是在1/2MS基本培养基中含有15g·L^-1蔗糖和7.8g·L^-1琼脂。