MX2007002083A - Metodos para regeneracion, transformacion y produccion de plantas de abelmoschus esculentus transgenica resistente a insectos. - Google Patents

Abstract

La presente invencion provee metodos para la regeneracion de una planta entera procedente de los explantes obtenidos de las especies de Abelmoschus, preferiblemente A. Esculentus; ademas la presente invencion provee tambien metodos para transformar una planta, celulas y tejidos vegetales de okra, ya sea con el uso de la cepa recombinante de Agrobacterium o mediante el bombardeo de los explantes con particulas de tungsteno u oro revestidas con secuencias de ADN de interes; se describe tambien un metodo eficiente de aislar embriones procedentes de semillas embebidas de ocra, lo cual hace posible el uso de celulas meristematicas jovenes de punta de plumula para la regeneracion y transformacion eficientes de las plantas de ocra; ademas, se producen plantas, celulas y tejidos vegetales de ocra, transformados en cuanto a rasgos agronomos/no agronomicos mejorados y la resistencia a insectos, ya sea usando sistemas a base de marcadores o libres de marcadores.

Description

MÉTODOS PARA REGENERACIÓN, TRANSFORMACIÓN Y PRODUCCIÓN DE PLANTAS DE ABELMOSCHUS ESCULENTUS TRANSGENICA RESISTENTE A INSECTOS CAMPO TÉCNICO La presente invención proporciona métodos novedosos de regeneración de toda una planta de tejido extirpado de la planta okra y otras especies Abelmoschus. Además, la invención también proporciona métodos para la transformación de plantas, células de plantas y tejidos de especies Abelmoschus ya sea usando el método mediado por Agrobacterium o el método de bombardeo de partículas. Se generaron plantas de okra transgénicas resistentes a insectos, usando sistemas basados en marcadores o sistemas libres de marcadores.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN A. Okra La okra {Abelmoschus esculentus) es uno de los cultivos de vegetales más importante. Las frutas son consumidas en varias formas en varios países. La okra también se ha usado como una fuente de fibra y para la producción de aceite y proteínas.

La okra es susceptible a muchas pestes de insectos y enfermedades que reducen el rendimiento a lo largo de regiones de cultivo de okra. El virus mosaico de vena amarilla de la okra es una enfermedad devastadora en la India y en muchos otros países. Este cultivo es dañado ampliamente por insectos/pestes lepidópteros es decir, barrenador de retoños y frutas {Earias vitella, E. insulana) y el barrenador de fruta {Helicoverpa armígera). El mejoramiento genético mediante el cultivo convencional de plantas se daña debido a la falta de fuentes de resistencia a pestes y enfermedades en el germoplasma de la okra.

B. Cultivo de células y tejidos de plantas Cada célula de planta tiene la capacidad inherente del desarrollo independiente en todo un organismo si se provee con condiciones externas apropiadas. Dado que la demostración temprana de esta capacidad, es decir, totipotencia y diferenciación in vitro, las técnicas de cultivo de tejido de plantas se han usado ampliamente en la multiplicación clonal de plantas (Herberlandt, Sber. Akad. Wiss. Wien. (1902) 111 :69-92). La tecnología de cultivo de tejidos de plantas está haciendo contribuciones significativas a la agricultura en la propagación clonal, cultivo haploide, cultivos mutantes, plantas libres de patógenos, crioconservación de tejidos de plantas para el establecimiento de bancos de genes ¡n vitro, producción de productos secundarios e ingeniería genética de plantas (Chilton., Scientific American (1983) 248.6:36-45).

Los prospectos de éxito con la ingeniería genética de plantas han creado un interés público considerable. Esta técnica incluye la inserción de genes extraños en las células de plantas usando vectores y la regeneración de todas las plantas de las células simples transformadas usando técnicas de cultivo de tejido de plantas. A pesar de que el cultivo de tejido basado en métodos de regeneración de plantas se han estandarizados para una amplia variedad de especies de plantas, muchos cultivos han sido recalcitrantes y por lo tanto restringen el potencial de estas plantas.

C. Cultivo de tejidos de Okra El cultivo de tejidos basado en la regeneración directa de plantas de okra ha sido descrito por Mangat and Roy., Plant Science(1986) 47:57-62. Esta investigación destaca las respuestas de cultivo de tejido comparativas del hipocótilo, cotiledón, nodo cotiledonario y tejido extirpado de hojas primarias de plantón de okra desarrollado asépticamente cultivadas en 6 diferentes medios. La regeneración de la planta no se logró a partir de los tejidos extirpados de segmentos de hipocótilo y de hojas en todos los 6 medios probados. El tejido extirpado de cotiledón respondió moderadamente en la regeneración de plantas, en uno de seis medios probados. Los tejidos extirpados de nodos de cotiledón no sen regeneró en 3 de los medios, mientras que, tuvieron una baja respuesta en 1 medio y respondieron bastante alto en la regeneración de retoños en otro medio.

En la publicación anterior la frecuencia de regeneración de retoños se menciona como nula, baja, moderada y muy alta y no en cifras (%). Hace que la comparación de la frecuencia de regeneración sea difícil. En una segunda publicación, Roy y Mangat (Roy et ai, Plant Science (1989) 60:77-82) han reportado la regeneración de plantan de tejido de callo derivado de la axila cotíledonaria de Okra. La inducción del callo que resultó de todos los tejidos extirpados se cultivaron en medio S suplementado con bencil adenina (BA). El callo derivado del hipocótilo se mantuvo no organogénico mientras que, el callo derivado de la axila cotiledonaria produjo retoños. La adición de nitrato de plata en el medio dio como resultado hasta 74% de yema primordial hacia la producción de retoños. El estudio de la técnica anterior no muestra ningún método disponible para la regeneración de plantas de la plúmula del embrión.

Nuestras invenciones describen por primera vez métodos para la regeneración de plantas de alta eficiencia a partir de la plúmula de la okra . El estudio de la técnica anterior tampoco muestra ningún método disponible para la regeneración de plantas de otros tejidos extirpados probados también en nuestra investigación.

D. Transformación de plantas y Generación de Plantas Transgénicas. El desarrollo de técnicas de transferencia de genes para especies de plantas es de gran interés, importancia y valor debido a que puede usarse para la transferencia de genes benéficos de interés en las plantas. Se han utilizado una variedad de técnicas para introducir genes extraños en las células de plantas. La transformación mediada por Agrobacterium ha sido descrita por Murai et al., Science (1983) 222:476-482, Fraley eí al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA (1983) 80:4803-4807; un método de captación directa de ADN ha sido descrito por Lorz eí al., Mol. Gen. Genet., (1985) 199:178-182, Portrykus et al., Mol. Gen. Genet., (1985) 199:183-188; un método de microinyección ha sido descrito por Crossway eí al., Mol. Gen. Genet., (1986) 202:179-185; el método de microproyectil de alta velocidad ha sido descrito por Klein eí al., Nature (1987) 327:70-73 y el método de electroporación ha sido descrito por Fromm eí al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA (1985) 82:5824-5828, Fromm et al., Nature (1986) 319:791-793.

E. Electroporación mediada por Agrobacterium Uno de los métodos más comunes de introducción de genes extraños en células de plantas es a través de la transformación mediada por Agrobacterium. El Agrobacterium es un patógeno natural de las plantas y media la transformación genética como parte del proceso natural que utiliza cuando infecta una célula de planta. Durante el proceso de transformación de un segmento específico del vector el cual es conocido como T-ADN, es transferido a las células. El T-ADN del Agrobacterium puede diseñarse para contener gen(es) o secuencias de ADN de interés que pueden transformarse en las células de plantas huésped e insertarse en el genoma de plantas. La transformación mediada por Agrobacterium es atractiva debido a la facilidad del protocolo acoplado con costos de equipo mínimo. Además, las plantas transgénicas obtenidas por este método frecuentemente contienen una sola copia de integraciones de T-ADN. La transformación mediada por Agrobacterium y la regeneración subsiguientes de plantas transgénicas que portan genes insertados se describió por Murai eí al., Science (1983) 222:476-482. Fraley ef al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA (1983) 80:4803-4807. De Block eí al., The EMBO Journal (1984) 3:1681-1689 y Horsch et al., Science (1985) 227:1229-1231.

F. Método de Transformación mediado por biolística o método de bombardeo de partículas Otro método común de introducción de gen(es) en células de plantas es el uso del bombardeo de partículas, el cual también se conoce como biolística o microproyectil de alta velocidad. La base del bombardeo de partículas es la aceleración de partículas recubíertas con gen(es) de interés hacia las células, que resulta en la penetración del protoplasma por las partículas y la expresión subsiguiente de los genes introducidos. En este método se usa presión de helio para acelerar las part'ciulas recubiertas con ADN en las células.

El bombardeo de microproyectiles puede transformar diversos tejidos objetivo. El bombardeo de partículas y la regeneración subsiguiente de plantas transgénicas que portan genes insertados fue descrito por Klein eí al., Nature (1987) 327:70-73. Klein eí al., Bio/Technology (1992) 10:286-292. Casas eí al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA (1993) 90: 11212- 11216.

G. Transformación de Okra. El estudio de la técnica anterior no muestra ningún método disponible para la transformación de plantas, células y tejidos de okra. Nuestras invenciones actuales describen por primera vez métodos para la transformación transitoria y estable de plantas, células, y tejidos de okra utilizando sistemas de mediados por Agrobacterium y de transformación biolística.

H. Sistemas de Transformación Basados en Marcadores En el sistema de transformación basado por marcadores, si enlazan el gen de interés y el gen marcador elegible (por ejemplos ef gen NPT II). En el sistema de transformación mediado por Agrobacterium basado en marcadores, el T-ADN se diseña para contener el gen de interés y el gen marcador. Mientras que en el sistema de transformación biolístíca basado en marcadores el plásmido utilizado, contiene el gen de interés y el gen marcador elegible. Las plantas transgénicas generadas de los sistemas anteriores contienen el gen marcador junto con el gen de interés.

I. Sistemas de Transformación Libres de Marcador. Los sistemas de transformación libres de marcador tienen las ventajas de introducir genes de importancia agronómica, y al mismo tiempo, evitar la introducción de los genes marcadores elegibles. Se han empleado diferentes métodos para la generación de plantas transgénicas libres de marcadores. Estos métodos incluyen la co-transformación mediada por Agrobacterium, la escisión del marcador elegible vía recombinación cre/lox, el uso de elementos de transposición, co-bombardeo de los plásmidos y metabolismo alterado (Yoder et al., Bio/Technology (1994) 12:263-267). La co-transformación mediada por Agrobacterium, utilizando dos plásmidos separados en un solo Agrobacterium, es decir se usa un vector que porta el gen marcador seleccionable en un T-ADN y el otro vector que porta el gen de interés en otro T-ADN. Las plantas transgénicas generadas de este sistema de transformación son analizadas y las plantas que tienen el gen de interés pero sin el gen marcador seleccionable se selecciona en las siguientes generaciones de la progenie segregada (Komori eí al., The Plant Journal (1996) 10: 165-174).

J. Diseño de Plantas para Resistencia a Insectos J. A. Gen Bacillus Thurínoiensis (Bt) El Bacillus thutinghiensis (Bt) es una bacteria de gram positivo que produce un a variedad de proteínas de cristales insecticidas tóxicas a insectos. Estos genes Bt han sido diseñados con éxito en plantas de cultivo para obtener resistencia a las pestes de insectos específicos en varios cultivos. Por ejemplo las plantas de tomate transgénico resistente a insectos se generaron con gen Bt por Fischhoff eí al., Bio/Technology (1987) 5:807-813.

J. B. Inhibidores de Proteasa Los inhibidores de proteasa son elementos importantes de la respuesta de defensa de las plantas a la depredación de insectos. Las plantas transgénicas que expresan inhibidores de proteasa muestran resistencia mejorada a la depredación por pestes, indicando la función útil de estos inhibidores (Johnson et al. PNAS (1990) 86:9871-9875.

K. Bioensayo de Insectos Los bioensayos que utilizan pestes de insectos específicos con plantas o partes de plantas se llevan a cabo para entender la resistencia o susceptibilidad de la planta hacia la peste. La eficacia de la proteína resistente a insectos específica en plantas transgénicas es probada con pestes objetivo específicos en bioensayos de insectos. La resistencia de la planta a las pestes objetivo específicas se compara con controles de plantas no transgénicas.

Objetos de la Invención Un objeto de la presente invención es proporcionar métodos para la regeneración de la planta okra y de la especie Abelmoschus.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar métodos para la transformación de la planta, células y tejidos de okra. Aún otro objetivo de la presente invención es proporcionar métodos para transformar la planta, células y tejidos de okra por el cultivo conjunto de tejidos extirpados con cepa de Agrobacteríum recombinante que comprende secuencias de ADN/ARN de interés. Aún otro objetivo de la presente invención es proporcionar métodos para transformar la planta, células y tejidos de okra mediante el bombardeo de tejidos extirpados con partículas de tungsteno o de oro recubiertas con la secuencia de ADN de interés. Además, otro objetivo de la presente invención es obtener la planta, células y tejidos de okra que portan y/o confieren el rasgo de importancia agronómica y no agronómica. Aún otro objetivo de la presente invención es obtener la planta, células y tejidos de okra que confieren la tolerancia o resistencia a enfermedades, herbicidas o insectos. Aún otro objetivo de la presente invención es obtener plantas, de okra transgénicas libres de marcadores. Aún otro objetivo de la presente invención es obtener plantas, de okra transgénicas libres de marcadores, resistentes a insectos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona métodos novedosos y eficientes de regeneración de la planta completa de la especie Abelmoschus preferentemente A. esculentus. Otro aspecto de la presente invención es proporcionar métodos de regeneración de la planta completa de la especie Abelmoschus en donde las plantas extirpadas se seleccionan de un grupo que consiste de cotiledón con peciolo, hipocótilos, embrión, embrión inmaduro, lámina de hojas, axila cotiledonaria, punta de retoños, antera, raíz, callo u otros tejidos extirpados adecuados. La invención proporciona un método de regeneración de tejidos extirpados en donde los tejidos extirpados son cultivados en un medio de regeneración (medio MS0Z2) que contiene una citocinina, preferentemente zeatina en el intervalo de 0.01 a 5 mg/l, preferentemente 2 mg/l. El tejido extirpado también puede regenerarse en otros medios conocidos en la técnica que tienen una combinación de citocininas en el intervalo de 0.01 a 20 mg/l o la recombinación de citocininas y auxina, con éste último en el intervalo de 0.01 a 5 mg. Además, los tejidos extirpados son incubados a una temperatura de 18°C a 30°C, preferentemente de 26°C y luminosidad de 250 a 5000 lux para la regeneración de múltiples yemas. La invención también prevé la multiplicación adicional de yemas de retoños en el medio como se describió líneas arriba. La invención también proporciona un método en el que las yemas de retoños multiplicadas son transferidas además a un medio sin regulador de crecimiento (medio MSO) o medio con una baja concentración de auxina en el intervalo de 0.01 a 2 mg/l para el alargamiento adicional del retoño y la inducción y crecimiento de raíces para obtener plantas jóvenes. En otro aspecto de la invención, la planta joven obtenida es fenotípicamente normal y fértil y es capaz de producir semillas en generaciones subsiguientes. En otro aspecto de la invención, la planta joven obtenida es un mutante y es fértil y capaz de producir las semillas fértiles en generaciones subsiguientes. La presente invención también proporciona métodos novedosos y eficientes para transformar la planta, células y tejidos de la especie Abelmoschus usando métodos mediados por Agrobacteríum o de bombardeo de partículas. Se seleccionan diferentes variedades o accesiones de la especie Abelmoschus esculentus para transformar la planta, células y tejidos usando métodos mediados por Agrobacterium o de bombardeo de partículas. En otro aspecto de la invención los tejidos extirpados para la transformación se seleccionan de un grupo que consiste de cotiledón con peciolo, hipocótilos, embrión, embrión inmaduro, lámina de hojas, axila cotiledonaria, punta de retoños, antera, raíz, callo u otros tejidos extirpados adecuados. Otro aspecto de la presente invención contemplar un método eficiente para aislar embriones de semillas embebidas de okra que permiten el uso de células meristemáticas jóvenes de terminal de plúmula para transformación. Otro aspecto de la presente invención es proporcionar un método para herir para aumentar la eficiencia de transformación. La herida incluye punzar o penetrar el embrión y otras plantas con un objeto afilado, una aguja o un objeto abrasivo. Adicionalmente los tejidos extirpados son cultivados en un medio que contiene una citocinina, preferentemente, en el intervalo de 0.01 a 5 mg/l, preferentemente 2 mg/l (medio de MS0Z2H10C) o una combinación de citocinina en el intervalo de 0.01 a 20 mg/l o una combinación de citocinina y auxina, ésta última en el intervalo de 0.01 a 5 mg/l conteniendo higromicina antibiótica en el intervalo de 5 mg/l a 100 mg/l, preferentemente 10 mg/l para la selección de células de plantas transformadas y tejidos y para la generación de múltiples yemas de retoños. Además las yemas de retoños transformadas y multiplicadas son transferidas en un medio de alargamiento de retoños como se describió anteriormente y después en otro medio para la inducción y crecimiento de raíces para obtener plantas completas.

Otro aspecto de la presente invención es proporcionar métodos para transformar la planta, células de plantas y tejidos de la especie Abelmoschus usando métodos mediados por Agrobacteríum o de bombardeo de partículas en donde la planta de okra transformada porta la secuencia de ADN/ARN de interés en donde la planta transformada muestra rasgos agronómicos mejorados o una combinación de rasgos que comprenden para rendimiento, resistencia a la sequía, resistencia a la tensión, valor nutricional, la inducción de la esterilidad en machos en la planta, las células y los tejidos. Otro aspecto de la presente invención es proporcionar métodos para transformar la planta, células de plantas y tejidos de la especie Abelmoschus usando métodos mediados por Agrobacterium o de bombardeo de partículas en donde la planta de okra transformada porta la secuencia de ADN/ARN de interés en donde la planta transformada muestra tolerancia o resistencia a enfermedades, herbicidas o insectos. Otro aspecto de la presente invención es proporcionar un método de generación libre de marcador, plantas transgénicas, con una secuencia de nucleótido de interés. Otro aspecto de la presente invención es proporcionar plantas okra transformadas que muestran tolerancia o resistencia a enfermedades, herbicidas o insectos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1A muestra el embrión maduro con expresión GUS. La figura 1 B muestra la axila cotiledonaria con expresión GUS. La figura 1C muestra la punta de retoño con expresión GUS. La figura 1 D muestra el callo transformado con expresión GUS. La figura 2A muestra el embrión maduro transformado que muestra actividad GUS. La figura 2B muestra el callo transformado que muestra actividad GUS. La figura 2C muestra la antera transformada que muestra actividad GUS. La figura 3A muestra múltiples yemas de retoños desarrolladas de la punta de plúmula del embrión. La figura 3B muestra retoños alargados y formación de raíces de una planta okra regenerada. La figura 3C muestra la planta de okra endurecida en invernadero mostrando la generación de frutos. La figura 4 muestra: plantón transformado de la generación T1 mostrando actividad GUS.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Una modalidad de la presente invención es proporcionar un método de regeneración de toda la planta de tejidos extirpados de la especie Abelmoschus esculentus, en donde el método comprende las etapas de: a) esterilizar superficialmente las semillas y embeber las semillas en agua b) germinar las semillas esterilizadas superficialmente de la etapa (a) en un medio de cultivo adecuado para obtener plantones, c) obtener los tejidos extirpados de la etapa (a) o de la etapa (b), d) herir las plantas de la etapa (c), e) cultivar los tejidos extirpados de la etapa (c), en un medio adecuado para obtener múltiples yemas o callos f) cultivar las yemas de retoños de la etapa (e) en un medio adecuado para alargamiento adicional de retoños e inducción de raíces para obtener plantas jóvenes g) transferir las plantas jóvenes enraizadas de la etapa (f) en tierra, para obtener plantas R0 fértiles h) hacer avanzar las plantas de la etapa (g) a generaciones subsiguientes. Adicionalmente, la invención prevé la regeneración de plantas de la especie Abelmoschus en donde la especie se selecciona de un grupo que consiste de A. caillei, A.moschatus, A. manihot, A. tuberculatus, A. ficulneus, A. crinitus, A. angulosus A. tetraphyllus. Otra modalidad de la presente invención proporciona un método de regeneración de la planta okra, en donde las semillas esterilizadas superficialmente son lavadas y embebidas durante un periodo de 0 a 48 horas, y después son colocadas en un medio MSO para germinación [el medio MSO contiene sales MS, vitaminas B5, 0.8% de agar, 3% de sucrosa y pH de 5.8]. Además, la invención proporciona el uso de varios tejidos extirpados para la regeneración de la planta de okra en donde los tejidos extirpados se seleccionan de un grupo que consiste de cotiledón con peciolo, hipocótilos, embrión, embrión inmaduro, lamina de hoja, axila cotiledonaria, punta de retoño, antera, raíz, callo u otros tejidos extirpados adecuados. Aún otra modalidad de la presente invención es proporcionar un método de regeneración de plantas de okra en donde las semillas esterilizadas superficialmente y embebidas se usan para aislar los embriones en condiciones estériles presionando con pinzas o cualquier otro medio y estos embriones son lavados en agua estéril y secados en papel filtro y después colocados en papel filtro estéril remojado. Otra modalidad de la presente invención es proporcionar un método de regeneración de planta okra en donde los tejidos extirpados son transferidos a un medio que contiene zeatina en el intervalo de 0.01 a 5 mg/l, preferentemente 2 mg/l (medio MS0Z2). Los tejidos extirpados se colocan para incubación en un cuarto de incubación de cultivo de tejidos a una temperatura de 18°C a 30°C (preferentemente 26°C) y luminosidad de 250 a 5000 lux para la regeneración de múltiples yemas de retoños. Los tejidos extirpados también pueden regenerarse usando otras composiciones de medios conocidos en la técnica tales como medios que contienen una combinación de citocinina en el intervalo de 0.01 a 20 mg/l o una combinación de citocinina y auxina, con ésta 'última en el intervalo de 0.01 a 5 mg/l. Otra modalidad de la presente invención es proporcionar un método de regeneración de planta okra en donde múltiples yemas de retoños son cortados y transferidos a un medio que contiene una citocinina preferentemente zeatina en el intervalo de 0.01 a 5 mg/l, preferentemente 2 mg/l (medio MS0Z2) o una combinación de citocininas en el intervalo de 0.01 a 20 mg/l o combinación de citocininas y auxina, con ésta última en el intervalo de 0.01 a 5 mg/l, y mantenidos en incubación para la multiplicación adicional de yemas de retoños. Otra modalidad de la presente invención es proporcionar un método de regeneración de planta okra en donde el retoño es transferido a un medio y se deja desarrollarse hasta una longitud de 0.5 cm a 7 cm, preferentemente 1.5 cm. Otra modalidad de la presente invención es proporcionar un método de regeneración de planta okra en donde, el retoño alargado es transferido a un medo sin regulador de crecimiento (medio MSO) o medio con baja concentración de auxina en el intervalo de 0.01 a 2 mg/l para alargamiento adicional del retoño y la inducción y crecimiento de raíces para obtener plantas jóvenes. Otra modalidad de la presente invención es proporcionar un método de regeneración de planta okra en donde la planta joven es transferida en tierra para crecimiento adicional. La planta joven regenerada es fenotípicamente normal y/o mutante y fértil y capaz de producir semillas fértiles en generaciones subsiguientes. Además la invención proporciona el avance de la generación de las plantas okra regeneradas. Aún otra modalidad de la presente invención es proporcionar un método para transformar la especie Abelmoschus, en donde el método comprende las etapas de: a) esterilizar superficialmente las semillas y embeber las semillas en agua b) germinar las semillas de la etapa (a) en un medio de cultivo adecuado para obtener plantones, c) obtener los tejidos extirpados de la etapa (a) o de la etapa (b), d) herir las plantas de la etapa (c), e) co-cultivar los tejidos extirpados de la etapa (d), con cepa de Agrobacteríum recombinante, f) cultivar los tejidos extirpados de la etapa (e) en un medio de cultivo de tejidos adecuado para seleccionar células de plantas y tejidos transformados, g) cultivar las células de plantas transformadas de la etapa (f) en un medio de cultivo de tejidos adecuado para obtener yemas de retoños, y h) cultivar las yemas de retoños de la etapa (g) en un medio de formación de raíz adecuado para obtener plantas transformadas enraizadas. Además, la invención proporciona la generación de plantas de la especie Abelmoschus en donde las especies se seleccionan de un grupo que consiste de A. caillei, A.moschatus, A. manihot, A. tuberculatus, A. ficulneus, A. crínitus, A. angulosus A. tetraphyllus. Otra modalidad de la presente invención es proporcionar un método en el que las semillas esterilizadas superficialmente son lavadas y embebidas en agua durante un periodo de 0 a 48 horas. Además, las semillas esterilizadas superficialmente son colocadas en medio MSO para la germinación (el medio MSO contiene sales de MS, vitaminas B5, 0.8% de agar, 3% de sucrosa y pH de 5.8). Aún otra modalidad de la presente invención es proporcionar un método para transformas la especie Abelmoschus esculentus, en donde las semillas esterilizadas superficialmente se utilizan para aislarembríones en condiciones estériles presionando con pinzas o cualquier otro medio y estos embriones son lavados en agua estéril y secados en papel filtro y colocados después en papel filtro remojado. Otra modalidad de la presente invención es proporcionar un método para transformar la especie Abelmoschus, en donde los tejidos extirpados se seleccionan de un grupo que consiste de cotiledón con peciolo, hipocótilos, embrión, embrión inmaduro, lamina de hoja, axila cotiledonaria, punta de retoño, antera, raíz, callo u otros tejidos extirpados adecuados. Otra modalidad de la presente invención es proporcionar un método en donde los embriones de varios tejidos extirpados de la especie Abelmoschus son heridas con una aguja estéril o con otro objeto agudo adecuado. Otra modalidad de la presente invención es proporcionar un método para transformar la especie Abelmoschus, en donde la cepa de Agrobacterium recombinante que porta la secuencia de ADN/ARN comprende una codificación o secuencia de gen no codificador, incluyendo o no, terminador o promotor, como un cásete de expresión o de no expresión. Además, la cepa de Agrobacterium que porta secuencias de ADN/ARN confiere rasgos agronómicos mejorados o la combinación de rasgos que comprenden para rendimiento, resistencia a la sequía, resistencia a la tensión, valor nutricional o inducción de esterilidad en machos a las plantas, células y tejidos. Otra modalidad de la presente invención es proporcionar métodos para transformar la especie Abelmoschus, en donde las secuencias de ADN/ARN confieren tolerancia o resistencia a enfermedades, herbicidas o insectos a plantas transformadas, células y tejidos. Otra modalidad de la presente invención es proporcionar un método para transformar la especie Abelmoschus, en donde las secuencias de ADN/ARN son secuencias de codificación o de no codificación.

Otra modalidad de la presente invención es proporcionar métodos para la transformación de okra usando sistemas libres de marcadores. Además, el tejido extirpado es inoculado con la cepa de Agrobacteríum recombinante que contiene la secuencia de ADN de interés. El tejido extirpado es secado en papel filtro estéril y transferido sobre medio de co-cultivo. Pueden usarse varias combinaciones de medios para el medio de co-cultivo el cual se selecciona de un grupo que consiste de medio MSO o medio MSOAs o medio MS0Z2 o medio MS0Z2. Dichos medios MS0Z2 o MS0Z2As contiene una citocinina, preferentemente zeatina, en el intervalo de 0.01 a 5 mg/l, preferentemente 2 mg/l (medio MS0Z2). Además, el tejido extirpado después de la co-cultivación es lavado con medio MSO líquido con 500 mg/l de Cefotaxime o un antibiótico adecuado para matar Agrobacterium. Otra modalidad de la presente invención es proporcionar un método para transformar la especie Abelmoschus, en donde el tejido extirpado es secado en papel filtro estéril y puede cultivarse en varios medios conocidos en la técnica anterior como medio que contiene citocinina, preferentemente zeatina en el intervalo de 0.01 a 5 mg/l, preferentemente 2 mg/l (medio MS0Z2H10C) o una combinación de citocininas en el intervalo de 0.01 a 20 mg/l o una combinación de citocininas y auxina, con ésta última en el intervalo de 0.01 a 5 mg/l, que contiene antibiótico para la selección de células y tejidos de plantas transformadas. Además el tejido extirpado es incubado en un cuarto de incubación de cultivo de tejidos de plantas a una temperatura de 18°C a 30°C y luminosidad de 250 a 5000 lux. Los antibióticos usados en los medios para la selección de células y tejidos de plantas transformadas puede ser ya sea kanamicina en el intervalo de 25 mg/l a 200 mg/l, preferentemente 50 mg/l o higromicina en el intervalo de 5 mg/l a 100 mg/l, preferentemente 10 mg/l. Además, las células y tejidos de plantas transformadas y subcultivados en un medio que contiene una citocinina preferentemente zeatina en el intervalo de 0.01 a 5 mg/l, preferentemente 2 mg/l (medio MS0Z2H10C) o una combinación de citocininas o una combinación de citocininas en el intervalo de 0.02 a 20 mg/l o una combinación de citocininas y auxina, con ésta última en el intervalo de 0.01 a 5 mg/l, para la multiplicación adicional de yemas de retoños. Las yemas de retoños subcultivadas se transfirieron a un medio MS0H10C y se dejaron desarrollar hasta una longitud de 0.5 cm a 7 cm, preferentemente 1.5 cm. Además las yemas de retoños alargados son transferidas a un medio con baja concentración de una auxina en el intervalo de 0.01 a 2 mg/l para inducción y crecimiento de raíces. Otra modalidad de la presente invención es proporcionar métodos para transformar la especie Abelmoschus, en donde el retoño, las células de plantas o tejidos, transformados contienen secuencias de ADN/ARN de interés, que son de codificación para genes o de no codificación en donde las secuencias de ADN/ARN son transferidas a generaciones subsiguientes por técnicas de reproducción de plantas incluyendo pero sin limitarse a cruzamientos. Adicionalmente la invención proporciona el avance de la generación, en donde dichas generaciones sucesivas contienen secuencias de ADN/ARN de interés con o sin gen marcador elegible (basado en marcador o libre de marcador). Otra modalidad de la presente invención es proporcionar un método para producir plantas, células de plantas y tejidos, transformados de la especie Abelmoschus esculentus en donde dicho método comprende las etapas de: a) esterilizar superficialmente semillas y embeber las semillas en agua, b) germinar las semillas de la etapa (a) en un medio de cultivo adecuado para obtener plantones o tejidos extirpados, c) obtener los tejidos extirpados de los plantones de la etapa (a) o (b) d) bombardear los tejidos extirpados de la etapa (c) con partículas de tungsteno o de oro recubiertas con la secuencia de ADN de interés, e) cultivar los tejidos extirpados de la etapa (d) en un medio de cultivo adecuado para seleccionar las células y tejidos de plantas transformados, f) mantener las células y tejidos de plantas transformadas de la etapa (e) en un medio de cultivo adecuado para obtener yemas de retoños, g) cultivar las yemas de retoños de la etapa (f) en un medio de enraizado adecuado para el enraizado para obtener plantas transformadas. Además, la invención prevé la regeneración de plantas de la especie Abelmoschus en donde las especies se seleccionan de un grupo que consiste de A. caillei, A.moschatus, A. manihot, A. tuberculatus, A. ficulneus, A. crínitus, A. angulosus A. tetraphyllus. Otra modalidad de la presente invención es proporcionar un método en donde las semillas esterilizadas superficialmente son lavadas y embebidas en agua durante un periodo de 0 a 48 horas. Además, las semillas esterilizadas superficialmente son colocadas en medio MSO para la germinación (el medio MSO contiene sales de MS, vitaminas B5, 0.8% de agar, 3% de sucrosa y pH de 5.8). Aún otra modalidad de la presente invención es proporcionar un método para transformar la especie Abelmoschus, en donde las semillas esterilizadas superficialmente se usan para aislar los embriones en condiciones estériles presionando con pinzas o cualquier otro medio y estos embriones son lavados en agua estéril y secados en papel filtro y colocados después en papel filtro estéril. Otra modalidad de la presente invención es proporcionar un método para transformar la especie Abelmoschus, en donde las plantas extirpadas se seleccionan de un grupo que consiste de cotiledón con peciolo, hipocótilos, embrión, embrión inmaduro, lámina de hojas, axila cotiledonaria, punta de retoños, antera, raíz, callo u otros tejidos extirpados adecuados. Otra modalidad de la presente invención es proporcionar un método para transformar la especie Abelmoschus, en donde los embriones y varios otros tejidos extirpados son heridas con una aguja estéril y bombardeando adicionalmente éstos tejidos extirpados con partículas de tungsteno o de oro recubiertas con 1 a 10 µg de la secuencia de ADN de interés en donde la presión de bombardeo está en el intervalo de 28.7 a 71.8 KPa (600 a 1500 psi) (preferentemente 52.7 KPa (1100 psi)). Además, los tejidos extirpados bombardeados pueden cultivarse en varios medios conocidos en las técnicas anteriores conteniendo una citocinina, preferentemente zeatina, en el intervalo de 0.01 a 5 mg/l preferentemente 2 mg/l (medio MS0Z2H 0C) o una combinación de citocininas en el intervalo de 0.01 a 20 mg/l o una combinación de citocininas o auxina, con ésta última en el intervalo de 0.01 a 5 mg/l, conteniendo antibiótico para la selección de células y tejidos de plantas transformadas. Además el tejido extirpado es incubado en una incubación en un cuarto de incubación de cultivo de tejidos a una temperatura de 18°C a 30°C y luminosidad de 250 a 5000 lux. Los antibióticos usados en los medios para la selección de células y tejidos de plantas transformadas pueden ser ya sea kanamicína en el intervalo de 25 mg/l a 200 mg/I, preferentemente 50 mg/l o higromicina en el intervalo de 5 mg/l a 100 mg/l, preferentemente 10 mg/l.

Además las células y tejidos de plantas transformadas son sub-cultivados en un medio que contiene una citocinina preferentemente zeatina en el intervalo de 0.01 a 5 mg/l, preferentemente 2 mg/l (medio MSOZ2H10C) o una combinación de citocininas o combinación de citocininas en el intervalo de 0.01 a 20 mg/l o una combinación de citocininas y auxina, con ésta última en el intervalo de 0.01 a 5 mg/l, para la multiplicación adicional de yemas de retoños. Las yemas de retoños subcultivadas se transfirieron a un medio MSOH-ioC y se dejaron desarrollar hasta una longitud de 0.5 cm a 7 cm, preferentemente 1.5 cm. Además las yemas de retoños alargados son transferidas a un medio con baja concentración de una auxina en el intervalo de 0.01 a 2 mg/l para inducción y crecimiento de raíces. Otra modalidad de la presente invención es proporcionar métodos para transformar la especie Abelmoschus, en donde dicho retoño, las células de plantas y/o tejidos, transformados contienen secuencias de ADN/ARN de interés, que confieren rasgos agronómicos mejorados o una combinación de rasgos que comprenden rendimiento, resistencia a la sequía, resistencia a la tensión, valor nutricional, inducción de esterilidad en machos a la planta, células y tejidos o la planta transformada. Otra modalidad de la presente invención es proporcionar un método para transformar la especie Abelmoschus en donde el retoño, las células de plantas y/o tejidos contienen secuencias de ADN/ARN de interés que confieren tolerancia o resistencia a la enfermedad, herbicida o insectos a plantas, células y tejidos en donde dichas secuencias de ADN/ARN son de codificación o no codificación para genes. Además las secuencias de ADN/ARN son transferidas a generaciones subsiguientes por medio de técnicas de reproducción de plantas incluyendo pero sin limitarse a cruzamientos. Adicionalmente la invención proporciona el avance de la generación, en donde dichas generaciones sucesivas contienen secuencias de ADN/ARN de interés con o sin gen marcador elegible (basado en marcador o libre de marcador). Aún otra modalidad de la presente invención es proporcionar una planta okra transformada, células de planta y tejidos de la especie Abelmoschus usando métodos mediados por Agrobacterium o de bombardeo de partículas en donde la planta de okra transformada porta la secuencia de ADN/ARN de interés en donde la planta transformada muestra rasgos agronómicos mejorados o una combinación de rasgos que comprenden rendimiento, resistencia a la sequía, resistencia a la tensión, valor nutricional, inducción de esterilidad en machos a la planta, células y tejidos o la planta transformada. Aún otra modalidad de la presente invención es proporcionar la planta transformada, células de plantas y tejidos de la especie Abelmoschus usando métodos mediados por Agrobacterium o de bombardeo de partículas en donde la planta de okra transformada porta la secuencia de ADN/ARN de interés en donde la planta transformada muestra tolerancia o resistencia a enfermedades, herbicidas o insectos.

A. Regeneración de la Especie Abelmoschus por el método de cultivo de tejidos En estos experimentos se usaron genotipos de okra (Abelmoschus esculentus) que representan una diversidad de variedades de híbridos [incluyendo Arka, Anamika, Parbhani Kranti y líneas propietarias de Maharashtra Hybrid Seeds Company Ltd. (MHSCL)]. Las semillas se esterilizaron superficialmente preferentemente en 0.1 % (peso/volumen) de HgCl2 en agua destilada durante 2 a 60 minutos. Las semillas esterilizadas se embebieron con agua durante un periodo de 0 a 48 horas. Las semillas se germinaron para obtener plantones. Se obtuvieron varios tejidos extirpados de las semillas y plantones para la regeneración de plantas completas. Los tejidos extirpados usados para la presente invención se seleccionan de un grupo que consiste de cotiledón con peciolo, hipocótilos, embrión, embrión inmaduro, lámina de hojas, axila cotiledonaria, punta de retoños, antera, raíz, callo u otros tejidos extirpados adecuados. Estos tejidos extirpados se usam para la regeneración de toda la planta.

A. 1. Cotiledón con peciolo Las semillas mencionadas en 6.A se inocularon con medio MSO (el medio MSO contiene sales de MS, vitaminas B5, 3% de sucrosa 0.8% de agar, y pH de 5.8) y se incubaron en el cuarto de incubación de cultivo de tejidos.

Múltiples yemas de retoños y callos se desarrollaron en más de 80% de los tejidos extirpados, de los extremos cortados del peciolo de tejidos extirpados de cotiledón con peciolo. Con la transferencia adicional de las múltiples yemas de retoños se obtuvieron hasta una multiplicación de 5 veces. Estas yemas de retoños se separaron y subcultivaron en medio MSO para el alargamiento adicional de los retoños y la inducción del enraizado. En 2 a 3 semanas estos retoños se alargaron más y las raíces se desarrollaron bien. Las plantas enraizadas fueron endurecidas y establecidas en un invernadero. Los procedimientos para endurecer son similares a aquellos en la técnica anterior. Todos los tejidos de plantas cultivadas se desarrollaron normalmente hasta la madurez. La fijación de las semillas fue normal en todas las plantas. Los callos producidos de los extremos cortados del peciolo y la lámina de los cotiledones se subcultivaron en un intervalo de 2 a 4 semanas (preferentemente 3 semanas) en el medio MS0Z2. Al final de este periodo estos callos se desarrollaron hasta un mayor tamaño.

A.2. Hipocótilos Las semillas mencionadas en 4.A se inocularon en medio MSO en botellas y se incubaron bajo luz para la germinación de semillas. Los tejidos extirpados de hipocótilos se cortaron de 5 a 20 días de edad de los plantones (preferentemente 12 días de edad de los plantones). Estos tejidos extirpados se inocularon en medio MS0Z2. Se desarrollaron múltiples retoños y callos en 75 + % de los tejidos extirpados de los extremos cortados de tejidos extirpados en un periodo de 2 a 6 semanas. Al transferir adicionalmente las múltiples yemas se obtuvieron hasta una multiplicación de 5 veces. Estas yemas de retoños se separaron y se subcultivaron en medio MSO para alargamiento adicional de los retoños y enraizado. En 2 a 4 semanas estos retoños se largaron más y las raíces se desarrollaron bien. Las plantas enraizadas se endurecieron y se establecieron en un invernadero. Todos los tejidos de plantas cultivadas se desarrollaron normalmente hasta la madurez. La fijación de semillas fue normal en todas las plantas. Los callos producidos de los extremos cortados de los hipocótilos se subcultivaron en un intervalo de 2 a 4 semanas, preferentemente 3 un intervalo de 3 semanas en medio MS0Z2, En el subcultívo estos callos crecieron en tamaño.

A.3. Embrión Maduro Las semillas mencionadas en 6.A se usaron en estos experimentos; preferentemente estas semillas se embebieron en agua estéril.

Los embriones se aislaron de estas semillas en condiciones estériles presionando para remover la semilla recubierta con pinzas o cualquier otro medio. Las semillas embebidas se prefieren con respecto a las no embebidas (sin embargo las respuestas positivas se obtuvieron de semillas embebidas y no embebidas). Los cotiledones se separaron de los embriones y estos embriones midieron de 1 a 8 mm (preferentemente 5 mm) de largo en el momento de aislar. Estos embriones aislados se lavaron en agua estéril y se secaron. Estos embriones se hieren en la punta de la plúmula. Estos embriones se transfirieron en medio MS0Z2 durante 2 a 4 semanas, preferentemente durante un periodo de 3 semanas. Se desarrollaron múltiples grupos de yemas de retoños y se subcultivaron a un intervalo de 2 a 4 semanas, preferentemente a un intervalo de 3 semanas en medio MSO. La frecuencia de la inducción de mas de retoños de los tejidos extirpados fue mayor que 90% en el medio MS0Z2. Al transferir adicionalmente las múltiples yemas de retoños se obtuvo una multiplicación de hasta 5 veces. Los retoños se transfirieron en medio MSO en botellas para el alargamiento adicional y enraizado. Después 1 a 5 semanas en el medio de enraizado los retoños se alargaron más y las raíces se desarrollaron bien. Estas plantas regeneradas (RO) se endurecieron y se establecieron e un invernadero. Todas las plantas cultivadas de tejidos crecieron normalmente hasta la madures. La fijación de las semillas fue normal en todas las plantas.

B. Transformaciones de Okra para Expresión de Transgenes Preparación de tejidos extirpados para transformación B.1 Cotiledón con peciolo La preparación de tejidos extirpados de cotiledón se menciona en A.1 B.2. Hipocótilo La preparación de tejidos extirpados de hipocótilo se menciona en A.2. B.3. Embrión Maduro La preparación de tejidos extirpados de embriones maduros se menciona en A.3. B.4. Embrión Inmaduro Se recolectaron frutos verdes (2 cm a 12 cm) y se esterilizaron superficialmente en 0.1 (peso/volumen) de HgCI2 en agua destilada (durante 1 a 60 minutos, preferentemente durante 5 minutos) y se lavaron adicionalmente en agua destilada estéril. Los embriones inmaduros se aislaron a partir de estas frutas en condiciones estériles (preferentemente usando pinzas o cualquier otro medio) y se usaron para transformación. B.5 Lámina de Hoja La lámina de hoja se aisló de plantas de Okra (preferentemente crecimiento in vitro) y se usaron para transformación.

B.6. Axila Cotiledonaria Las semillas se esterilizaron superficialmente preferentemente en 0.1 % (peso/volumen) de HgCI2 en agua destilada (durante 1 a 60 minutos, preferentemente 30 minutos). Estas semillas se lavaron muchas veces en agua destilada estéril y se inocularon en un medio (preferentemente en medio MSO en botellas) y se incubaron bajo luz para la germinación de las semillas. Las plantas, es decir, axilas de cotiledón se cortaron de los plantones (5 a 20 días, preferentemente 12 días de edad de los plantones) y se usaron para transformación B.7. Punta de Retoños Las semillas se esterilizaron superficialmente preferentemente en 0,1% (peso/volumen) de HgCI2 en agua destilada (durante 1 a 60 minutos, preferentemente 30 minutos). Estas semillas se lavaron muchas veces en agua destilada estéril y se inocularon en medio MSO en botellas y se incubaron bajo luz para la germinación de semillas. Los tejidos extirpados es decir, puntas de retoños se cortaron de los plantones (preferentemente de 12 días de edad de los plantones) y se usaron para transformación. B.8. Antera Las anteras se aislaron en condiciones estériles de yemas de flores son abrir o las flores se usaron para las transformaciones. B.9. Raíz Las raíces se cortaron de las plantas (preferentemente desarrolladas in vitro) y se usaron para transformación. B.10. Callo Los callos se desarrollaron in vitro, se usaron para transformaciones. Estas plantas, como se mencionó en las secciones anteriores 6.B.1 a 6.B.10, se usaron parta el método mediado por Agrobacterium o el método Biolístíco de transformación. Las células o tejidos de plantas transformadas o las plantas se analizaron para el ensayo de GUS transitorio o estable. Las plantas transformadas se analizaron adicionalmente usando herramientas moleculares estándar bien conocidas en la técnica anterior tales como secado Southern, estimación de número de copias, y secado Western.

C. Método de Transformación Mediado por Agrobacterium El vector pC 1301 contiene los genes GUS y hpt enlazados al promotor 35S del virus Mosaico de la Coliflor (CaMV 35 S) e introducido en la cepa Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 para producir cepa recombinante. La cepa A. tumefaciens (LBA 4404 pC 1301) recombinante se inoculó en un medio adecuado para el crecimiento de Agrobacterium. Usualmente el Agrobacterium se inoculó en 25 ml de medio estéril 2YT (pH 7) en un matraz. El medio 2YT contiene 1 % de extracto de levadura, 1.6% de triptona y 0.5% de NaCl. Los antibióticos, 10 mg/L de Rifampicina, 20 mg/l de Streptomicina, y 75 mg/l de Kanamicina, se agregaron antes de inocular las bacterias para el crecimiento selectivo de Agrobacterium recombinante con el plásmido 1301. También se usaron diferentes plásmidos conteniendo la secuencia de ADN/ARN de interés para producir cepas de Agrobacterium recombinante, por ejemplo el plásmido pC 1201 se puede usar también para producir cepas de recombinante. El extracto de levadura, triptona y NaCI se compraron de HiMedia Labs, Mumbai, India. Las bacterias se inocularon en medio 2YT en matraz y se mantuvieron en un agitador para obtener una densidad óptica (600 nm) de 0.01 a 2.5, preferentemente 1.8.

D. Inoculación de Tejidos Extirpados con Agrobacterium tumefaciens Los tejidos extirpados preparados anteriormente (descritos en B.1 a B.10 se inocularon) en suspensión de Agrobacteríum (preferentemente 15 minutos), se secaron en papel filtro estéril y posteriormente se transfirieron a cajas de Petri (preferentemente 20 embriones por caja de Petri) en medio MSOAs [el medio MSOAs contiene sales de MS (Murashige and Skoog. Physiol. Plant. (1962) 15:473-497, vitaminas B5 (Gamborg et al., Exp. Cell Res.(1968) 50:151-158) 0.8% de agar, 3% de sucrosa and pH de 5.8 (preferentemente enriquecido con 3,5-dimetoxi-4-hidroxiaceto-fenona, preferentemente en la concentración de 100 mM). Estas cajas de Petri se incubaron en un cuarto de incubación de tejidos. Después del periodo de c-cultivo (2 a 5 días, preferentemente 2 días) estos tejidos extirpados se ensayaron para determinar la expresión GUS o se transfirieron en medio MS0Z2H?0C. MS0Z2H10C contiene sales de MS, vitaminas B5, 3% de sucrosa, 0.8% de agar, pH de 5.8, citocinina, preferentemente zeatina en el intervalo de 0.5 a 5 mg/l (preferentemente de 2 mg/l de zeatina) suplementado con 5 mg/l a 100 mg/l de Higromicina B (preferentemente 10 mg/l de Higromicina B) y tomados para el ensayo de GUS estable. La actividad GUS se detectó por el ensayo histoquímico usando 5-bromo-4-cloro-3-indolil-ß-D-glocoronida como substrato (Jefferson et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA (1986) 83:8447-8451 ) y se incubaron en 100 mM de solución tampón de fosfato (pH de 7.0) conteniendo 1 mg/l de X-gluc durante toda la noche a 37°C de temperatura. X-gluc se compró de Duchefa, Haarlem, Holanda. Todos los tipos de tejidos extirpados mostraron expresión GUS. Los resultados de estos ensayos se tabularon en 6.F como el cuadro 1. Los varios tejidos extirpados que mostraron expresión GUS se muestran en las figuras 1A-1 D.

E. Método de Transformación de Bombardeo de Microproyectiles/Partículas Se usaron varios plásmidos es estos experimentos incluyendo e plásmido pC 1301 y el plásmido 'pC 1202' para transformación. Todos los experimentos se llevaron a cabo con el sistema Biolístico PDS-1000/He (Sanford, TIB (1988) 6:299-302. Sanford et al., Technique J. Methods Cell Mol. Biol. (1991 ) 3:3-16) usando partículas de tungsteno o de oro (3 mg) con diámetro de 0.1 a 3 µm. Estas partículas se lavaron previamente en etanol, estuvieron en suspensión acuosa (50 µl) se recubrieron con 5 a 10 µg de plásmido ADN. El procedimiento seguido para el recubrimiento de ADN sobre oro fue como se describe por Kikkert et al., Plant Cell Tissue and Organ Culture (1993) 33:221-226. Las partículas se dispersaron finamente con un ultrasonicador (Elma Transonic 460 Lab-Line Instruments Inc., IL, EUA) antes del bombardeo. Los tejidos extirpados se dispusieron en el centro de la caja de Petri sobre un medio de cultivo de tejidos. Se usó una presión de bombardeo en el intervalo de 43.1 a 71.8 KPa (900 a 1500 psi) (preferentemente 52.7 KPa (1100 psi)). La distancia de la placa de lanzamiento estuvo en el intervalo de 6 a 18 cm (preferentemente de 6 cm) (Las partículas de oro y de tungsteno se compraron de Bio-Rad Labs., 2000 Alfred Nobel Drive, Hercules, CA 94547 EUA). Después del bombardeo de los tejidos extirpados como se mencionó en 6 E, éstos se colocaron en medio MSO durante 2 a 5 días (preferentemente 3 días). Después de 2 a 5 días (preferentemente 3 días) estos embriones se usaron para el ensayo GUS transitorio o se transfirieron en medio MS0Z2H10 [MS0Z2H?0C contiene sales de MS, vitaminas B5, 3% de sucrosa, 0.8% de agar, pH de 5.8, citocinina, preferentemente zeatina en el intervalo de 0.05 a 5 mg/l (preferentemente 2 mg/l de zeatina) suplementado con 5 - mg/l a 100 mg/l de higromicina B (preferentemente 10 mg/l de Higromicina B) y tomado para e ensayo de GUS estable. La actividad GUS se detectó mediante el ensayo histoquímíco usando 5-bromo-4-cloro-3-indolil-ß-D-glucoronida como substrato (Jefferson et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA (1986) 83:8447-8451 ) y se incubaron en 100 mM de solución tampón de fosfato (pH 7.0) conteniendo 1 mg/l de X-gluc durante toda la noche a 37°C de temperatura. Todos los tipos de tejidos extirpados mostraron expresión GUS. Varios tejidos extirpados que mostraron expresión GUS se muestran en las siguientes figuras 2A-2C. Los resultados de estos ensayos de GUS se tabulan en el Cuadro 1 y en la siguiente sección F. Resultados de la Expresión GUS Transitoria usando Diferentes Tejidos Extirpados de Okra Se usaron varios tejidos extirpados para la transformación usando los métodos tanto de transformación mediada por Agrobacterium como Biolístico. Los tejidos extirpados se discriminaron usando ensayo GUS. Los datos se este ensayo se tabulan en el cuadro 1.

CUADRO 1 Los tipos de tejidos extirpados antes mencionados también fueron positivos en la expresión GUS estable en ensayos GUS cuando se probaron después de 1 mes. Está claro de estos experimentos que todos los tejidos extirpados usados son susceptibles a la transformación. Sin embargo es evidente que el embrión maduro es el tejido extirpado más eficiente para usar para la transformación ya sea por el método mediato por Agrobacterium o Biolístico. Los varios tipos de tejidos extirpados se llevaron hasta la generación de plantas transgénicas. Las plantas transformadas también se analizaron usando metodología molecular estándar conocida en la técnica anterior. Estas plantas avanzaron a generaciones subsiguientes y se analizaron para determinar la presencia de genes heterólogos en genoma. Éstos se ilustran en los siguientes ejemplos. Los siguientes ejemplos son para el entendimiento de la invención y no deberán considerarse como limitantes del alcance de la invención.

EJEMPLO 1 Transformación Mediada por Agrobacterium de Embriones de Okra Usando Genes GUS y hpt (Sistema Basado en Marcador/Enlazado, Co- Cultivo en Medio MSO) A. Preparación de Material de Plantas Se usaron genotipos de Okra representando una diversidad de variedades agronómicas o de híbridos [incluyendo Arka Anamika, Parbhani Kranti y líneas propietarias de Maharashtra Hybrid Seeds Company Ltd. (MHSCL)] en estos experimentos. Las semillas se esterilizaron superficialmente, preferentemente en 0.1 % (peso/volumen) de HgCI2 en agua destilada (durante 1 a 60 minutos, preferentemente 30 minutos). Estas semillas maduras se lavaron muchas veces en agua destilada estéril. Las semillas esterilizadas superficialmente se embebieron en agua estéril durante un periodo de 0 a 48 horas, preferentemente durante 16 horas.

Los embriones se aislaron de estas semillas en condiciones estériles presionando para remover el recubrimiento de las semillas con pinzas o cualquier otro medio. Los cotiledones se separaron de los embriones, éstos embriones midieron de 1 a 8 mm (preferentemente 5 mm) de largo en el momento del aislamiento. Estos embriones aislados se lavaron muchas veces en agua estéril se secaron sobre papel filtro. Estos embriones se hirieron en la punta de la plúmula.

B. Preparación de Agrobacterium tumefaciens Transgénico: El vector pC 1301 contiene los genes GUS y hpt enlazados al promotor 35S del virus Mosaico de la Coliflor (CaMV 35S) y se introdujo en la cepa Agrobacterium tumefaciens LBA4404. Se inoculó A. tumefaciens (LBA 4404 pC 1301 ) en un medio adecuado para el crecimiento de Agrobacterium. La Agrobacteríum se inoculó normalmente en 25 ml de medio 2YT estéril (pH 7) en un frasco. El medio 2YT contiene 1 % de extracto de levadura, 1.6% de Triptona y 0.5% de NaCl. Los antibióticos, 10 mg/l de Rifampicina, 20 mg/l de Streptomicina, y 75 mg/l de Kanamicina se adicionaron antes de inocular las bacterias para el crecimiento selectivo de Agrobacterium con el plásmido 1301. El extracto de levadura, la Triptona y NaCI se compraron de HiMedia Labs, Mumbai, India. Las bacterias se inocularon en medio 2YT en un matraz y se mantuvieron en un agitador para obtener una densidad óptica (600 nm) de 0.01 a 2.5, preferentemente 1.8.

C. Inoculación de Tejidos Extirpados con Agrobacterium tumefaciens Estos embriones heridos se inocularon en suspensión de Agrobacterium (preferentemente 15 minutos), se secaron en papel filtro estéril y se transfirieron después a cajas Petri (preferentemente 20 embriones por caja Petri) en medio MSO [el medio MSO contiene sales de MS (Murashige y Skoog., Physiol. Plant. (1962) 15:473-497, vitaminas B5 (Gamborg et al., Exp. Cell Res. (1968) 50:151-158) 0.8% de agar, 3% de sucrosa y pH 5.8].

D. Regeneración de Plantas Transformadas Después del Co- Cultivo Las cajas Petri conteniendo embriones heridos se incubaron en un cuarto de incubación de cultivo de tejidos. Después del periodo de co-cultivo (2 a 5 días, preferentemente 2 días de co-cultivo) estos tejidos extirpados se lavaron en medio MSO líquido (el medio MSO líquido contiene sales de MS, vitaminas B5, 3% de sucrosa y pH de 5.8) con 500 mg/l de Cefotaxima para matar al Agrobacterium y se transfirieron en medio MS0Z2H10C contiene sales de MS, vitaminas B5, 3% de sucrosa, 0.8% de agar, pH de 5.8, citocininas, preferentemente zeatina en el intervalo de 0.05 a 5 mg/I (preferentemente 2 mg/l de zeatina) suplementado con 5 mg/I a 100 mg/l de Hígromicina B (preferentemente 10 mg/l de Higromicina B) se incubaron en cajas Petri se transfirieron a medio fresco durante un periodo de 2 a 5 semanas (preferentemente 3 semanas).

Entre la cuarta y la séptima semana en el medio MSOZ2H10C, los brotes múltiples desarrollados de la plúmula del embrión (figuras 3A-3C). Estos múltiples brotes son subcultivados en MSOH- C (MSOH-ioC contiene sales de MS, vitaminas B5, 3% de sucrosa, 0.8% de agar, pH de 5.8, suplementado con 10 mg/l de Higromicina B y 500 mg/l de Cefotaxima) en el intervalo de 2 a 4 semanas. Estos grupos de yemas de retoños se muestran en la figuras (3A-3C), se separaron cortando y subcultivando en el mismo medio durante 3 semanas para desarrollar retoños (preferentemente retoños del tamaño de 1.5 cm). Los mismos retoños se transfirieron a medio MSOH-ioC en botellas para alargamiento adicional y enraizado. Después de 1 a 5 semanas en el medio de enraizado, los retoños se alargaron más y las raíces se desarrollaron bien (figura 3B). Las plantas enraizadas se endurecieron y se establecieron en un invernadero (figura 3C). Todas estas plantas crecieron normalmente hasta la madurez. La fijación de la semilla fue normal en todas las plantas. Se inoculó un total de 180 embriones en Agrobacteríum en este experimento. Las plantas enraizadas se probaron mediante el ensayo GUS. Un total de 6 plantas fueron positivas para la expresión GUS. La Zeatina y agar se compraron de HiMedia Labs, Mumbai, India. La Higromicina B se compró de A.G. Scientific, Inc. 6450 Lusk BIvd, San Diego, EUA. La 3,5-dimetoxi-4-hidroxiaceto-fenona se compró de Sigma-Aldrich Chemie Gmbh, Riedstr. Steinheim, Alemania.

La sucrosa se compró de Siseo Research Lab. Pvt. Ltd., Mumbai, India.

E. Ensayo para la Expresión GUS La actividad GUS se detectó por el ensayo histoquímico usando 5-bromo-4-cloro-3-indol-ß-D-glucoronida como substrato (Jefferson et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA (1986) 83:8447-8451 ) se incubaron en 100 mM de solución tampón de fosfato (pH 7.0) conteniendo 1 mg/ml de X-gluc durante toda la noche a 37°C de temperatura. Estos 6 transformantes primarios (plantas de generación de T0) se establecieron en un invernadero y se propagaron y la se recolectaron semillas de la generación T-i. Plantones de generación T^ de dos días de edad se usaron para el ensayo GUS. La expresión de GUS se encontró en los plantones Ti probados como se muestra en la figura 4. El patrón de segregación para la actividad GUS en estos progenies indica que la integración del gene GUS parece confinarse a un solo locus en el genoma (Cuadro 2). Los plantones de okra de generación T-i transgénicos son positivos para la expresión GUS.

CUADRO 2 Análisis de Segregación de la Expresión del gen GUS en Plantones de Generación Ti Para descartar la posibilidad de la expresión de GUS en plantas no transgénicas, también se ensayaron muestras de estas plantas de control. La expresión GUS no se encontró en estas plantas de control no transgénicas. Este resultado confirma que las plantas que muestran actividad GUS son transgénicas como se muestra en la figura 4. Estas plantas se propagaron y además se recolectaron las semillas de la generación R-i. Los plantones de generación Ri emergieron de estas semillas. Las muestras de hojas de estas plantas no transgénicas se usaron como controles para el ensayo GUS. La actividad GUS no se encontró en los plantones no transgénicos como se esperaba.

F. Control Negativo para Transformación Los controles negativos se mantuvieron en cada experimento para asegurar que la higromicina mató el desarrollo de tejido no transgénico.

Después del aislamiento, estos embriones se hirieron como se mencionó líneas arriba sin inoculación en bacterias, los embriones se incubaron durante 2 días a la velocidad de 10 embriones por placa en medio MSOAs. Después de 2 días, estos embriones se transfirieron en MSOZ2H-?oC durante un periodo de 2 a 4 semanas. Todos estos embriones se blanquearon completamente en el medio de selección al final del quinto subcultivo. Esto indica que la concentración de higromicina (5-100 mg/l, preferentemente 10 mg/l) fue suficiente para controlar el crecimiento no transgénico de tejido en estos experimentos.

EJEMPLO 2 Transformación Mediada por Agrobacterium de Embriones Okra usando Genes GUS y hpt (Sistema Basado en Marcador, Co-Cultivo en Medio MS0Z£As) A. Preparación de Material de Plantas Se usaron en estos experimentos genotipos de okra que representan una diversidad de variedades agronómicas o híbridos [incluyendo Arka Anamika, Parbhani Kranti y líneas propietarias of Maharashtra Hybrid Seeds Company Ltd. (MHSCL)]. Las semillas se esterilizaron superficialmente, preferentemente en 0.1 % (peso/volumen) de HgCI2 en agua destilada durante 1 a 60 minutos (preferentemente 30 minutos). Estas semillas se lavaron muchas veces en agua destilada estéril y preferentemente se embebieron en agua estéril. Los embriones se aislaron de estas semillas en condiciones estériles presionando para remover el recubrimiento de las semillas con pinzas o cualquier otro medio. Las semillas embebidas se prefirieron a las no embebidas. Los cotiledones se separaron de los embriones, y éstos embriones midieron de 1 a 8 mm (preferentemente 5 mm) de largo en el momento del aislamiento. Estos embriones aislados se lavaron muchas veces en agua estéril, se secaron sobre papel filtro y se colocaron en papel filtro remojado. Estos embriones se hirieron en la punta de la plúmula.

B. Preparación de Agrobacterium tumefaciens Transgénico: El vector pC 1301 contiene los genes GUS y hpt enlazados al promotor 35S del virus Mosaico de la Coliflor (CaMV 35S) y se introdujo en la cepa Agrobacteríum tumefaciens LBA4404. Se inoculó A. tumefaciens (LBA 4404 pC 1301 ) en un medio adecuado para el crecimiento de Agrobacteríum. La Agrobacterium se inoculó normalmente en 25 ml de medio 2YT estéril (pH 7) en un frasco. El medio 2YT contiene 1 % de extracto de levadura, 1.6% de Triptona y 0.5% de NaCl. Los antibióticos, 10 mg/l de Rifampicina, 20 mg/l de Streptomicina, y 75 mg/l de Kanamicina se adicionaron antes de inocular las bacterias para el crecimiento selectivo de Agrobacteríum con el plásmido 1301.

El extracto de levadura, la Triptona y NaCI se compraron de HiMedia Labs, Mumbai, India. Las bacterias se inocularon en medio 2YT en un matraz y se mantuvieron en un agitador para obtener una densidad óptica (600 nm) de 0.01 a 2.5, preferentemente 1.8.

C. Inoculación de Tejidos Extirpados con Agrobacterium tumefaciens Estos embriones heridos se inocularon en suspensión de Agrobacterium recombinante (preferentemente 15 minutos), se secaron en papel filtro estéril y se transfirieron después a cajas Petri en medio MS0Z2 (el medio MS0Z2 contiene 0.05 a 5 mg/l de Zeatina, preferentemente 2 mg/l de Zeatina, sales de MS (Murashige y Skoog., Physiol. Plant. (1962) 15:473-497, vitaminas B5 (Gamborg et al., Exp. Cell Res. (1968) 50:151-158) 0.8% de agar, 3% de sucrosa y pH 5.8, enriquecido con preferentemente 100 mM-dimetoxi-4-hidroaceto-fenona). Después del co-cultivo (2 a 5 días, preferentemente 2 días de co-cultivo), estos tejidos extirpados se lavaron en medio MSO líquido (el medio MSO contiene sales de MS, vitaminas B5, 3% de sucrosa y pH de 5.8) con 500m mg/l de Cefotaxima para matar al Agrobacterium y se transfirieron a medio MS0Z2H10C (el medio MS0Z2H10C contiene sales de MS, vitaminas B5, 3% de sucrosa, 0.8% de agar, pH de 5.8, 0.05 a 5 mg/I de zeatina (preferentemente 2 mg/l de zeatina) suplementado con 5 mg/l de 100 mg/l de Higromicina B (preferentemente 10 mg/l de Higromicina B) y preferentemente 500 mg/l de Cefotaxima (cualquier otro antibiótico) para matar al Agrobacterium. Aproximadamente de 5 a 20 embriones en desarrollo (preferentemente 10 embriones) se incubaron por caja Petri y se transfirieron sobre medio fresco después de un periodo de 2 a 5 semanas (preferentemente 3 semanas). Al final de la cuarta y séptima semanas, preferentemente en la sexta semana en medio MS0Z2H10C, se desarrollaron múltiples yemas de retoños de la punta de plúmula del embrión. Estas múltiples yemas de retoño se subcultivaron en medio MS0H10C (MS0H10C contiene sales de MS, vitaminas B5, 3% se sucrosa, 0.8% de agar y se ajustó con el pH de 5.8 suplementado con 10 mg/l de Higromicina B y 500 mg/l de Cefotaxima) al intervalo de 3 semanas. Este grupo de yemas de retoños se separaron cortando y subcultivando en el mismo medio durante 2 a 5 semanas para desarrollar retoños (preferentemente de aproximadamente de un tamaño de 1.5 cm). Dichos retoños se transfirieron en medio MS0H10C en botellas para un alargamiento adicional y enraizado. Después de 2 a 4 semanas en el medio de enraizado, los retoños de alargaron más y las raíces se desarrollaron bien. Las plantas enraizadas se endurecieron y se establecieron en invernadero. Se inoculó un total de 300 embriones en Agrobacterium en este experimento. Las plantas enraizadas se probaron por el ensayo GUS. Un total de 6 plantas fueron positivas para expresión GUS. Todas estas 6 plantas crecieron normalmente hasta la madurez. La fijación de la semilla fue normal en todas las plantas. Los experimentos se llevaron a cabo varias veces para obtener plantas transformadas con resultados similares. La actividad GUS se detectó por el ensayo histoquímico usando 5-bromo-4-cloro-3-indolil-ß-D-glucoronide como substrato (Jefferson et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA (1986) 83:8447-8451 ). Los segmentos de plantas o los segmentos de hojas se incubaron en 100 nM de solución tampón de fosfato (pH 7.0) conteniendo 1 mg/ml C-gluc durante toda la noche a una temperatura de aproximadamente 370°C. La Zeatina y agar se compraron de HiMedia Labs, Mumbai, India. La Higromicina B se compró de A.G. Scientific, Inc. 6450 Lusk BIvd, San Diego, EUA. La 3,5-dimetoxi-4-hidroxiaceto-fenona se compró de Sigma-Aldrich Chemie Gmbh, Riedstr. Steinheim, Alemania.

D. Ensayo para la Expresión GUS Las hojas cortadas de plantas enraizadas se tomaron para el ensayo GUS. En este experimento 6 plantas fueron positivas para la expresión GUS. Para descartar la posibilidad de la expresión de GUS en plantas no transgénicas, también se ensayaron muestras de estas plantas de control. La expresión GUS no se encontró en estas plantas de control no transgénicas como se esperaba.

Estos 6 transformantes primarios (plantas de generación de T0) se establecieron en un invernadero y se propagaron y la se recolectaron semillas de la generación T-i. Estas plantas avanzaron a generaciones adicionales.

E. Control Negativo para Transformación Los controles negativos se mantuvieron en cada experimento para asegurar que la higromicina mató el desarrollo de tejido no transgénico. Un total de 20 embriones se mantuvieron en control negativo. Después del aislamiento, estos embriones se hirieron como se mencionó líneas arriba sin inoculación en bacterias, los embriones se incubaron durante 2 días a la velocidad de 5 a 20, preferentemente 10 embriones por placa en medio MS0Z2. Después de 2 días, estos embriones se transfirieron en MS0Z2H?0C durante un periodo de 2 a 5 semanas. De 20 embriones, 10 produjeron múltiples yemas de retoños las cuales se subcultivaron en un intervalo de 3 semanas en MS0Z2H?0C. Pero estas yemas de retoños se blanquearon completamente al final del quinto subcultivo. Esto probó que la concentración de higromicina (5 a 100 mg/l, preferentemente 10 mg/l) fue suficiente para controlar el crecimiento no transgénico de tejido en estos experimentos.

EJEMPLO 2 Transformación Mediada por Agrobacterium de Embriones Okra usando Genes GUS y hpt (Sistema Basado en Marcador, Co-Cultivo en Medio MSOZgAs) A. Preparación de Material de Plantas Se usaron en estos experimentos genotipos de okra que representan una diversidad de variedades agronómicas o híbridos [incluyendo Arka Anamika, Parbhani Kranti y líneas propietarias of Maharashtra Hybrid Seeds Company Ltd. (MHSCL)]. Las semillas maduras se esterilizaron superficialmente, preferentemente en 0.1 % (peso/volumen) de HgCI2 en agua destilada durante 1 a 60 minutos (preferentemente 30 minutos). Estas semillas se lavaron muchas veces en agua destilada estéril (preferentemente se embebieron en agua estéril). Los embriones se aislaron de estas semillas en condiciones estériles presionando para remover el recubrimiento de las semillas con pinzas o cualquier otro medio. Las semillas embebidas se prefirieron a las no embebidas. Sin embargo también pueden usarse las semillas no embebidas. Los cotiledones se separaron de los embriones, y éstos embriones midieron de 1 a 8 mm, preferentemente 5 mm de largo en el momento del aislamiento. Estos embriones aislados se lavaron muchas veces en agua estéril, se secaron sobre papel filtro y se colocaron en papel filtro remojado. Estos embriones se hirieron en la punta de la plúmula y se usaron para el co-cultivo en suspensión de Agrobacterium.

B. Preparación de Agrobacterium tumefaciens Recombinante: Los vectores usados fueron pC 2300 que portan Cry2Ab/Cry1A(c) y el gen npt II como marcador seleccionable de planta en T-ADN de este plásmido. Uno de estos plásmidos se introdujo en la cepa de Agrobacterium tumefaciens EHA 105 y se usó para las transformaciones. La cepa de Agrobacterium recombinante que porta el gen Bt (Cry2Ab o Cry1A(c) etc.) en el plásmido se usó para la transformación de plantas okra. El antibiótico, 50 mg/l de kanamicina y 10 mg/l de cloramfenicol se agregó a al medio 2YT para el crecimiento selectivo de Agrobacterium con el plásmido conteniendo ya fuese el gen Cry2Ab o Cry1A(c). El antibiótico kanamicina (preferentemente 50 mg/l) se usó para seleccionar el tejido transgénico en MS0Z2K50C (el medio MS0Z2K50C contiene sales de MS, vitaminas B5, 3% de sucrosa, 0.8% de agar, pH de 5.8, 2 mg/l de zeatina suplementado con 25 a 200 mg/l, preferentemente 50 mg/l de kanamicina y preferentemente 500 mg/l de cefotaxima u otro antibiótico para matar al Agrobacterium). La Kanamicina se compró de Macleods Pharma., Daman, U.T., India.

C. Análisis de Plantas Transgénicas Putativas usando Doble Intercalado de Anticuerpos Elisa Las plantas transformadas se probaron para la expresión de gnes Bt, Cry1A(c) o Cry2Ab, usando el ensayo Elisa. La placa de ELISA se recubrió con anticuerpos monoclonales específicos a la proteína Cry1A(c) o Cry2Ab y estas placas se suministraron de Desigen Diagnostics, División de semillas MAHYCO Ltd., Maharashtra, India. De conformidad con el protocolo del fabricante los ensayos se llevaron a cabo de la siguiente manera. Se tomaron de 2 a 4 discos de 1 cm de diámetro de las plantas transgénicas putativas y las plantas de control. Estas muestras de hojas se extrajeron en 500 µl de solución tampón de 1X PBST. Se cargaron 50 µl de a cada receptáculo en la placa previamente recubierta. Después del cargado de muestra se agregó a cada receptáculo 150 µl de anticuerpo policlonales específicos a Cry1A(c) o Cry2Ab en la relación de dilución de 1 :20,000 en PBSTO. Esta placa se almacenó a 4°C durante toda la noche. La placa incubada durante toda la noche se lavó tres veces con PBST al día siguiente. Se agregaron a estas placas lavadas 20µl por receptáculo anticuerpo de detección marcado con fosfato alcalino a 1 :6000 de dilución en PBSTO. Esta placa se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente. Después de la incubación esta placa se lavó tres veces con PBST. Finalmente se agregaron 250 µl de solución tampón de substrato conteniendo 1 mg/ml de fosfato de paranitro fenilo por receptáculo y el desarrollo del color se registró a una longitud de onda de 450 nm usando un lector ELISA. Las muestras positivas se seleccionaron en el desarrollo del color amarillo dando un valor de OD > 0.2 (después de 30 minutos de incubación) después de substraer el valor de referencia el cual se comparó con el control negativo (no transgénico). La composición de todas las soluciones tampón usadas para ELISA se resumen en el Cuadro 3.

CUADRO 3 Detalles para las Soluciones Tampón Usadas para ELISA para Discriminar Plantas Transgénicas Putativas.

Los resultados de ELISA fueron 25 plantas Okra transgénicas positivas para Bt con las respectivas lecturas de ELISA. CUADRO 4 D. Bioensayos de Insectos Empleando Frutas Transgénicas No Transgénicas Las larvas de estos insectos (segundo estado larvario) de estas pestes de insectos, es decir, barrenador de retoños y frutas (Earias vitella, E. Insulana) y el barrenador de Fruta (Helicoverpa armígera) se criaron en el laboratorio, se liberaron por separado en frutas jóvenes de estas plantas transgénicas. Los frutos se colocaron en botellas de vidrio y se cubrieron con tela para aeración. La mortalidad larvaria si la hubo se registró después de 3 días. En frutas transgénicas todas las larvas de estos insectos como en las no transgénicas estuvieron vivas y sanas. Estos resultados indican una resistencia muy alta a las pestes objetivo en las plantas transgénicas (los datos de los bioensayos se resumen en el Cuadro 5).

CUADRO 5 Resultados de Bioensayos de Insectos usando Muestras de Frutos de Okra Las frutas de plantas transgénicas se usaron en los bioensayos de insectos como se mencionó anteriormente en el Cuadro 5. Las frutas de estas plantas fueron susceptibles para el daño de pestes de insectos. La relación de segregación Mandeliana de 3:1 , para la presencia proteína B .ausencia de proteína Bt, se observó en las progenies de un gran números de líneas transgénicas, mientras que pocas líneas no segregaron en la relación 3:1. Los resultados de segregación de 4 líneas transgénicas se tabulan en el Cuadro 6.

CUADRO 6 Análisis de Segregación del Gene Bt en Plantones de Generación Ti de Okra Transqénica de Cuatro Eventos E. Controles de Cultivo de Tejidos Las plantas no transgénicas (tejido cultivado) se propagaron y se recolectaron las semillas de la generación R1. Los plantones de la generación R1 brotaron de estas semillas. Las muestras de hojas de estas plantas no transgénicas se usaron como controles para ELISA. La actividad de la proteína Bt no se encontró en los plantones no transgénícos como se esperaba.

F. Control Negativo para la Transformación Los controles negativos se mantuvieron en cada experimento para asegurar que la kanamicina mató el desarrollo de tejido no transgénico. Después del aislamiento, estos embriones se hirieron como se mencionó anteriormente y sin inoculación en bacterias, estos embriones se incubaron durante 2 días a la proporción de 10 embriones por placa en medio MSOAs, después de 2 días, estos embriones se transfirieron en MSOZ2K5oC durante un periodo de 3 semanas en medio MS0Z2K50C. Estos tejidos extirpados se blanquearon en la primera selección en el periodo de 3 semanas. Esto probó que la concentración de kanamicina (preferentemente 50 mg/l) fue suficiente para matar los tejidos no transgénicos en estos experimentos.

EJEMPLO 4 Transformación Mediada por Agrobacterium (Cepa EHA 105) de Embriones de Okra usando Genes Cry1A(c) y NPT II para la Generación de Okra Transgénica Resistente a Insectos fSistema Basado en Marcador, Co-Cultivo en Medio MS01 A. Preparación de Material de Plantas Se usaron en estos experimentos genotipos de okra que representan una diversidad de variedades agronómicas o híbridos [incluyendo Arka Anamika, Parbhani Kranti y líneas propietarias of Maharashtra Hybrid Seeds Company Ltd. (MHSCL)]. Las semillas maduras se esterilizaron superficialmente, preferentemente en 0.1 % (peso/volumen) de HgCI2 en agua destilada durante 1 a 60 minutos (preferentemente 30 minutos). Estas semillas se lavaron muchas veces en agua destilada estéril por 0 a 48 horas, preferentemente 16 horas. Los embriones se aislaron de estas semillas en condiciones estériles presionando para remover el recubrimiento de las semillas con pinzas o cualquier otro medio. Los cotiledones se separaron de los embriones, y éstos embriones midieron de 1 a 8 mm, preferentemente 5 mm de largo en el momento del aislamiento. Estos embriones aislados se lavaron muchas veces en agua estéril, se secaron sobre papel filtro y se colocaron en papel filtro remojado. Estos embriones se hirieron en la punta de la plúmula.

B. Preparación de Agrobacterium tumefaciens Recombinante: Los vectores usados fueron pC 2300 que portan el gen Cry2Ab o Cry1A(c) y el gen npt II como marcador seleccionable de planta en T-ADN de este plásmido. Uno de estos plásmidos se introdujo en la cepa de Agrobacteríum tumefaciens EHA 105 y se usó para las transformaciones. El antibiótico, 50 mg/l de kanamicina y 10 mg/l de cloramfenicolo se agregó al medio 2YT para el crecimiento selectivo de Agrobacterium con el plásmido conteniendo el gen Cry2Ab o Cry1A(c). Se usó en las transformaciones Agrobacteríum portando cualquiera de los genes Cry2Ab o Cry1A(c).

C. Inoculación de Tejidos Extirpados con Agrobacterium tumefaciens Estos embriones heridos se inocularon en suspensión de Agrobacterium (preferentemente 15 minutos), se secaron en papel filtro estéril y se transfirieron después a cajas Petri (preferentemente 20 embriones por caja) en [medio MSO que sales de MS (Murashige y Skoog., Physiol. Plant. (1962) 15:473-497, vitaminas B5 (Gamborg et al., Exp. Cell Res. (1968) 50:151-158) 0.8% de agar, 3% de sucrosa y pH 5.8]. Después de 2 a 4 días de co-cultívo (preferentemente 2 días de co-cultívo), estos tejidos extirpados se lavaron en medio MSO líquido (el medio MSO contiene sales de MS, vitaminas B5, 3% de sucrosa y pH de 5.8) con 500 mg/l de Cefotaxima para matar al Agrobacterium y se transfirieron en el medio MSOZ2K5oC (el medio MS0Z2K50C contiene sales de MS, vitaminas B5, 3% de sucrosa, 0.8% de agar, pH de 5.8, 0.05 a 5 mg/l de zeatina (preferentemente 2 mg/I de zeatina) suplementado con kanamicina, preferentemente 50 mg/l de Kanamicina) y preferentemente 500 mg/l de Cefotaxima (cualquier otro antibiótico) para matar al Agrobacterium. De 5 a 20 embriones en desarrollo (preferentemente 10 embriones) se incubaron por caja Petri y se transfirieron sobre medio fresco después de un periodo de 2 a 5 semanas (preferentemente 3 semanas). En un periodo de 3 a 7 semanas en medio MSOZ2K5oC, se desarrollaron múltiples yemas de retoños a partir de la punta de plúmula del embrión. Estas múltiples yemas de retoño se subcultivaron en medio MS0K50C (MS0K50C contiene sales de MS, vitaminas B5, 3% se sucrosa, 0.8% de agar y se ajustó el pH a 5.8 suplementado con 50 mg/l de Kanamicina y 500 mg/l de Cefotaxima) al intervalo de 3 semanas. Este grupo de yemas de retoños se separaron cortando y subcultivando en el mismo medio durante 2 a 5 semanas para desarrollar retoños de un tamaño de 0.5 cm a 5 cm, preferentemente de 1.5 cm. Dichos retoños se transfirieron en medio MS0K50C en botellas para un alargamiento adicional y enraizado. Después de 2 a 4 semanas en el medio de enraizado, los retoños de alargaron más y las raíces se desarrollaron bien. Las plantas enraizadas se endurecieron y se establecieron en invernadero. Las plantas enraizados se probaron por ELISA. Se generaron tres plantas transgénicas de 175 tejidos extirpados usados en este experimento de transformación.

EJEMPLO 5 Transformación Mediada por Agrobacterium de Tejidos Extirpados de Cotiledones usando Genes Cry1A(c) y NPT II para la Generación de Okra Resistente a Insectos (Sistema Basado en Marcador, Cocultivo en Medio MSOZgAs) Se usaron en estos experimentos genotipos de okra que representan una diversidad de variedades agronómicas o híbridos [incluyendo Arka Anamika, Parbhani Kranti y líneas propietarias of Maharashtra Hybrid Seeds Company Ltd. (MHSCL)]. Las semillas maduras se esterilizaron superficialmente, preferentemente en 0.1% (peso/volumen) de HgCI2 en agua destilada durante 1 a 60 minutos (preferentemente 30 minutos). Estas semillas se lavaron muchas veces en agua destilada estéril. Las semillas esterilizadas superficialmente se inocularon en medio MSO en botellas y se incubaron bajo luz para la germinación de semillas. Los tejidos extirpados de cotiledón con peciolo se cortaron de los plantones (plantones de 1 a 20 días de edad, preferentemente de 12 días de edad). Estas plantas se inocularon en la cepa de Agrobacterium EHA 105 con el vector pC 2300 que porta el gen CryaA/c) y el gen npt II. Estos tejidos extirpados se inocularon en suspensión de Agrobacterium (preferentemente 15 minutos) y se transfirieron en medio MS0Z2As como se mencionó en el Ejemplo 3. Después de 2 a 4 días (preferentemente 2 días) de co-cultivo de estos tejidos extirpados se transfirieron en medio MS0Z2K50. De las terminales cortadas del peciolo de estos tejidos extirpados de cotiledón se desarrollaron múltiples yemas de retoños y callos. Las yemas de retoños producidas del peciolo de estos tejidos extirpados se separaron y subcultivaron en medio MS0K50 para alargamiento adicional de los retoños y enraizado Los retoños alargados y las raíces se desarrollaron bien en medio para enraizado durante un periodo de 2 a 4 semanas. Las plantas enraizadas se endurecieron y se establecieron en invernadero. Estas plantas se probaron por ELISA para determinar la presencia de proteína CryA(c) como en el Ejemplo 3. Las plantas fueron negativas en presencia de proteína Cry1A(c). Los callos producidos de los extremos cortados del peciolo de estas plantas se subcultivaron en un intervalo de 2 a 5 semanas en medio MS0K2KC. En el subcultivo estos callos crecieron en tamaño. Las piezas de los callos se probaron por ELISA como se mencionó en el Ejemplo 3 para determinar la presencia de proteína CryA(c). De 7 callos probados 4 fueron positivos para la presencia de proteína Cry1A(c), que probó que estos callos fueron transgénicos.

Control Negativo para Transformación Los controles negativos se mantuvieron en cada experimento para asegurar que la kanamicina mató el desarrollo de tejido no transgéníco. El cotiledón con peciolo se cortaron como se mencionó en 3.A.1 y sin inoculación en bacterias, se incubaron en medio MS0Z2Ac durante dos días en una proporción de, preferentemente 10 embriones por placa. Después de 2 días, se transfirieron en medio MS0Z2K50C por 3 semanas y se subcultivaron en un intervalo de 3 semanas en MSOZ2K5oC. Pero la mayoría de las yemas de retoños se blanquearon al final del quinto subcultivo. Esto robó que la concentración de kanamicina, preferentemente de 50 mg/l fue suficiente para controlar el crecimiento no transgénico de tejido hasta cierto grado en estos experimentos.

EJEMPLO 6 Co-Transformación de Embriones Mediada por Agrobacterium usando un plásmido (T-ADN) que porta Cry1A(c) / Cry2Ab, etc. y otro Plásmido (T-ADN) que porta Genes NPT II y GUS, para la Generación de Okra Bt Libre de Marcador (Co-cultivo en Medio MSOAs) Agrobacterium tumefaciens y los Constructos Utilizados El método usado fue co-transformación mediada por Agrobacterium, es decir una cepa simple de Agrobacterium tumefacíens que porta dos plásmidos. La cepa de Agrobacterium usada fue LBA 4404, que porta el plásmido MH 0102 ó MH 0103 y pC 2301. El plásmido MH 0102 ó MH 0103 y pC 2201 portan Cry1A(c) o Cry2Ab y genes GUS y NPT II, respectivamente. El antibiótico de 25 mg/l de kanamicina y 10 mg/l de cloramfenicol se agregó al medio 2YT para el crecimiento selectivo de la Agrobacterium LBA 4404 con los plásmidos MH 0102 ó MH 0103 y pC 2301.

Las etapas de cultivo de tejido para la recuperación de plantas transgénicas fueron como se mencionó en el Ejemplo 1.

A. Preparación del Material de Plantas Se usaron en estos experimentos genotipos de okra que representan una diversidad de variedades agronómicas o híbridos [incluyendo Arka Anamika, Parbhani Kranti y líneas propietarias of Maharashtra Hybrid Seeds Company Ltd. (MHSCL)]. La preparación del material de plantas y la inoculación de los tejidos extirpados con Agrobacterium, y las etapas de cultivo de tejido para la recuperación de plantas fueron como se mencionó en el ejemplo 3. Estas plantas transgénicas putativas se discriminaron por ensayo por ensayo GUS (para determinar la presencia del gen marcador) y ELISA (para a detección de proteína Cry1A(c) o Cry2Ab). Un total de 10 plantas fueron positivas para la expresión GUS (Cuadro 7). Las plantas transgénicas se endurecieron y establecieron en invernadero.

La actividad GUS se detectó por el ensayo histoquímico usando 5-bromo-4-cloro-3-indol-ß-D-glucoronida como substrato (Jefferson et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA (1986) 83:8447-8451 ) y se incubaron en 100 nM de solución tampón de fosfato (pH 7.0) conteniendo 1 mg/ml de X-gluc durante toda la noche a una temperatura de 37°C. El análisis de plantas transgénicas putativas usando doble intercalación de anticuerpos ELISA se realizó de acuerdo con la instrucción del fabricante como se mencionó en el Ejemplo No. 3.

CUADRO 7 Resultados de los Ensayos de ELISA (Bt) y GUS de 10 plantas transgénicas de Generación Tg Generadas de Sistema Libre de Marcador CUADRO 8 La Segregación de Marcador y Genes Bt en Plantas de Generación Ti Derivadas de a Línea Tn No. OCM1 Las plantas transgénicas libres de marcadores, es decir que portan el gen Bt [gen CryA(c) o Cry2Ab] pero no el gen marcador fueron identificadas en las siguientes generaciones de las progenies segregadas, como se indica en el Cuadro 8. Las semillas obtenidas de las plantas transgénicas y los controles apropiados se inocularon adicionalmente in vitro en medio MS basal con 50 mg/l de kanamicina (medio MS0K5O) para reconfirmar el estado libre de marcador de estas líneas. Estos plantones libres de marcador se blanquearon en un periodo de 3 semanas. También se observaron resultados similares para controles no transgénicos. Sin embargo los plantones que portan gene marcador (GUS positivo) continuaron creciendo en el medio con 50 mg/l de kanamicina. Estos resultados reconfirman el estado libre del marcador de estas líneas.

EJEMPLO 7 Método Biolístico de Transformación de Plantas Okra A. Preparación del Material de Plantas Se usaron en estos experimentos genotipos de okra {Abelmoschus esculentus) que representan una diversidad de variedades agronómicas o híbridos [incluyendo Arka Anamika, Parbhani Kranti y líneas propietarias of Maharashtra Hybrid Seeds Company Ltd. (MHSCL)]. Las semillas maduras se esterilizaron superficialmente, preferentemente en 0.1 % (peso/volumen) de HgCI2 en agua destilada (durante 1 a 60 minutos, preferentemente 30 minutos). Estas semillas se lavaron muchas veces en agua destilada estéril (preferentemente estas semillas esterilizadas superficialmente se embebieron en agua estéril). Los embriones se aislaron de estas semillas en condiciones estériles presionando para remover el recubrimiento de las semillas con pinzas o cualquier otro medio. Los cotiledones se separaron de los embriones, y éstos embriones midieron de 1 a 8 mm (preferentemente 5 mm) de largo en el momento del aislamiento. Estos embriones aislados se lavaron muchas veces en agua estéril, se secaron sobre papel filtro. Estos embriones se hirieron en la punta de la plúmula.

B. Bombardeo de partículas de Tejidos Extirpados Usando el Sistema Biolísitico Todos los experimentos se llevaron a cabo con el sistema Biolísitico PDS-1000/He (Sanford, TIB (1988) 6:299-302. Sanford et al., Technique J. Methods Cell Mol. Biol. (1991) 3:3-16) usando partículas de tungsteno o de oro (3 mg) con diámetro de 0.1 a 3 µm. Esta partículas se lavaron previamente en etanol en suspensión acuosa (50 µl), se recubrieron con 5 a 10 µg de plásmido ADN. El procedimiento seguido para recubrir ADN sobre oro se describió por Kikkert et al., Plant Cell Tissue and Organ Culture (1993) 33:221-226. Las partículas fueron finamente dispersadas con un ultrasonicador (Elma Transonic 460 Lab-Line Instruments Inc., IL, EUA) antes del bombardeo. Los tejidos extirpados se dispusieron en el centro de la placa de Petri en un medio de cultivo celular. Se usó presión de bombardeo de 43.1 a 71.8 Kpa (900 a 1500 psi) (preferentemente 52.7 Kpa (1100 psi)). La distancia desde la placa de lanzamiento estuvo en el intervalo de 6 a 18 cm (preferentemente 6 cm). Varios tejidos extirpados se usaron para el bombardeo de partículas (Las partículas de oro y de tungsteno se compraron de Bio-Rad Labs., 2000 Alfred Nobel Drive, Hercules, CA 94547 EUA). Después del bombardeo, los tejidos extirpados se colocaron en medio MSO durante 2 a 5 días (preferentemente 3 días). Después de 2 a 5 días (preferentemente 3 días) estos embriones se usaron para el ensayo GUS transitorio o se transfirieron en medio MS0Z2H?0 [MS0Z2H 0 contiene sales de MS, vitaminas B5, 3% de sucrosa, 0.8% de agar, pH de 5.8, citocinina, preferentemente Zeatina en el intervalo de 0.05 a 5 mg/l (preferentemente 2 mg/l de Zeatina) suplementad con 5 mg/l a 100 mg/l de Higromicina B (preferentemente 10 mg/l de Higromicina B) y tomados para el ensayo GUS estable.

C. Ensayo GUS de los Tejidos Extirpados Transformados La actividad GUS se detectó por el ensayo hístoquímico usando 5-bromo-4-cloro-3-indol-ß-D-glucoronida como substrato (Jefferson et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA (1986) 83:8447-8451 ) y se incubaron en 100 nM de solución tampón de fosfato (pH 7.0) conteniendo 1 mg/ml de X-gluc durante toda la noche a una temperatura de 37°C. Todos los tipos de tejidos extirpados mostraron expresión GUS.

Ventajas 1.- La presente invención prevé la regeneración de plantas de una variedad de tejidos extirpados de Okra o especies Abelmoschus. 2.- La frecuencia de regeneración de yemas de retoños de la plúmula de tejidos extirpados de embriones de Okra o de las especies Abelmoschus es de más de 80%. 3.- La presente invención también proporciona métodos para la multiplicación adicional de las yemas de retoños. 4.- La presente invención también proporciona métodos para la expresión transitoria del transgén en alta frecuencia usando transformación mediada por Agrobacterium. 5.- La presente invención también proporciona métodos para la expresión transitoria del transgén en alta frecuencia usando transformación mediada por biolística. 6.- La presente invención también proporciona por primera vez métodos para la transformación genética mediada por Agrobacterium de Okra o especies Abelmoschus. 7.- La presente invención también proporciona por primera vez métodos para la transformación genética mediada por biolística de Okra o especies Abelmoschus. 8.- La presente invención también proporciona métodos para la generación de Okra transgénica o especies Abelmoschus con secuencias de nucleótidos de interés. 9.- La presente invención también proporciona métodos para la generación de Okra transgénica o especies Abelmoschus resistentes a insectos. 10.- La presente invención también proporciona métodos para la generación de Okra transgénica o especies Abelmoschus resistentes a insectos libres de marcadores. 11. La presente invención también proporciona métodos para la generación de Okra transgénica o especies Abelmoschus libres de marcadores, con las secuencia de ADN de interés.

Referencias: 1. Herberlandt, Sber. Akad. Wiss. Wien. (1902) 111 :69-92. 2. Chilton., Scientific American (1983) 248.6:36-45). 3. Mangat y Roy., Plant Science(1986) 47:57-62. 4. Roy y Mangat (Roy et al., Plant Science (1989) 60:77-82) 5. Murai et al., Science (1983) 222:476-482. 6. Fraley et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA (1983) 80:4803-4807 7. Lorz et al., Mol. Gen. Genet., (1985) 199:178-182. 8. Portrykus et al., Mol. Gen. Genet., (1985) 199:183-188; 9. Crossway et al., Mol. Gen. Genet., (1986) 202:179-185; 10. Klein et al., Nature (1987) 327:70-73 11. Fromm et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA (1985) 82:5824-5828, 12. Fromm et al., Nature (1986) 319:791-793. 13. Murai et al., Science (1983) 222:476-482. 14. Fraley et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA (1983) 80:4803- 4807. 15. De Block et al., The EMBO Journal (1984) 3:1681-1689. 16. Horsch et al., Science (1985) 227:1229-1231. 17. Klein et al., Nature (1987) 327:70-73. 18. Klein et al., Bio/Technology (1992) 10:286-292. 19. Casas et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA (1993) 90: 11212- 11216. 20. Yoder et al., Bio/Technology (1994) 12:263-267). 21. Komori et al., The Plant Journal (1996) 10: 165-174 22. Fischhoff et al., Bio/Technology (1987) 5:807-813. 23. Johnson et al., PNAS (1990) 86:9871-9875. 24. Murashige et al., Physiol. Plant. (1962) 15:473-497 25. Gamborg et al., Exp. Cell Res.(1968) 50:151-158). 26. Sanford, TIB (1988) 6:299-302. 27. Sanford et al., Technique J. Methods Cell Mol. Biol. (1991 ) 3:3-16). 28. Kikkert et al., Plant Cell Tissue and Organ Culture (1993) 33:221-226. 29. Jefferson et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA (1986) 83:8447-8451 )

Claims (55)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un método de regeneración de una planta de okra, en donde dicho método comprende: a) obtener el tejido extirpado de semillas, plantones o de toda la planta, en donde los tejidos extirpados se seleccionan de un grupo que consiste de cotiledón con peciolo, embrión, embrión inmaduro, antera, y raíz; b) cultivar los tejidos extirpados en un medio de crecimiento que contiene citocinina y auxina solos o en combinación para obtener múltiples yemas de retoños o callos; c) cultivar las yemas de retoños en un medio de enraizado para obtener plantas jóvenes enraizadas y d) transferir las plantas jóvenes enraizadas en tierra, para obtener plantas regeneradas.

2.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dichas semillas, plantones o toda la planta se seleccionan de diferentes variedades de accesiones de Abelmoschus esculentus.

3.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el embrión es herido en la punta de la plúmula.

4.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el medio de crecimiento es un medio que contiene citocinina en el intervalo de 0.01 a 5 mg/l, o un medio que contiene una combinación de citocininas en el intervalo de 0.01 a 20 mg/l o un medio que contiene una combinación de citocininas y auxina, con ésta última en el intervalo de 0.01 a 5 mg/l.

5.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la citocinina se selecciona de un grupo que consiste de zeatina, BAP, cinetina, TDZ, sulfato de adenina, base libre de Adenina sola o una combinación de los mismos.

6.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el medio de crecimiento contiene zeatina en el intervalo de 0.01 a 5 mg/l.

7.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el medio de enraizado se selecciona del grupo que consiste de medio de MS que contiene zeatina, BAP, cinetina, Adenina, NAA, 2,4-D e ÍAA sola, medio de MS que contiene Zeatina, BAP, cinetina, Adenina, NAA, 2,4-D e IAA en combinación y un medio de MS basal.

8.- El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque el medio de enraizado es un medio de MS basal.

9.- Un método para transformar una planta de okra, células de planta y tejidos, en donde dicho método comprende: a) esterilizar superficialmente las semillas, y embeber las semillas en agua; b) germinar las semillas de la etapa (a) en un medio de cultivo de tejidos para obtener plantones; c) obtener los tejidos extirpados de la etapa (b); d) co-cultivar los tejidos extirpados de la etapa (c) en un medio que contiene cepa de Agrobacterium recombinante; e) cultivar los tejidos extirpados de la etapa (d) en un medio de cultivo para seleccionar células de plantas y tejidos, trasformados; f) cultivar las células de plantas transformadas y tejidos de la etapa (e) en un medio de cultivo de tejidos adecuado para obtener yemas de retoños, y g) cultivar las yemas de retoños de la etapa (f) en un medio de enraizado para obtener plantas transformadas enraizadas.

10.- El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque dichas semillas se seleccionan de diferentes variedades de accesiones de Abelmoschus esculentus.

11. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque los tejidos extirpados utilizados se seleccionan de un grupo que consiste de cotiledón con peciolo, hipocótilos, embrión, embrión inmaduro, lamina de hojas, axila cotiledonaria, punta de retoño, antera, raíz y callo.

12.- El método de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque el embrión es herido en la punta de la plúmula.

13.- El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque el Agrobacterium recombinante comprende secuencias de ADN y de ARN de interés.

14.- El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque la secuencia de ADN o ARN comprende una secuencia de genes de codificación o de no codificación, inclusive o no, de terminador de promotor, como un cásete de expresión o de no expresión.

15.- El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque las secuencias de ADN o ARN confieren rasgos agronómicos mejorados rasgos o una combinación de rasgos que comprenden para rendimiento, resistencia a la sequía, resistencia a la tensión, valor nutricional, la inducción de esterilidad de machos en la planta, células y tejidos.

16.- El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque dichas secuencias de ADN o ARN confieren tolerancia o resistencia a enfermedades, herbicidas o insectos a plantas, células y tejidos.

17.- El método de conformidad con las reivindicaciones 15 ó 16, caracterizado además porque las secuencias de ADN o de ARN son capaces de codificar genes o de no codificar genes.

18.- El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque el medio de cultivo de tejidos se selecciona de un grupo que consiste de medio MSO, medio MSOAs, medio MS0Z2 y medio MSOZ2AS.

19.- El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque MSOZ2 contiene una citocinína, preferentemente zeatina, en el intervalo de 0.01 a 5 mg/l, preferentemente 2 mg/I o una combinación de citocininas en el intervalo de 0.01 a 20 mg/l o una combinación de citocininas y auxina, con ésta última en el intervalo de 0.01 a 5 mg/l.

20.- El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque el medio de cultivo de tejidos se selecciona de un grupo que consiste de un medio que contiene una citocinina, preferentemente zeatina, en el intervalo de 0.01 a 5 mg/l, preferentemente 2 mg/l o una combinación de citocininas en el intervalo de 0.01 a 20 mg/l o una combinación de citocininas y auxina, con ésta última en el intervalo de 0.01 a 5 mg/l; y que contiene un antibiótico o herbicidas.

21.- El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque el antibiótico es kanamicina en el intervalo de 25 g/l a 200 mg/l.

22.- El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque el antibiótico es higromicina en el intervalo de 5 g/l a 100 mg/l.

23.- El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque el medio de enraizado es medio de MS basal con o sin antibióticos o medio MS con una baja concentración de auxina en el intervalo de 0.01 a 2 mg/I con o sin antibióticos.

24. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque el retoño, células de plantas y/o tejidos de plantas, transformados contienen secuencias de ADN o ARN de las reivindicaciones 15 ó 16.

25.- El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque las secuencias de ADN o ARN son capaces de codificar genes o de no codificar genes.

26.- El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque las secuencias de ADN o ARN son transferidas a generaciones subsiguientes por técnicas de reproducción de plantas incluyendo pero sin limitarse a cruzamientos.

27.- El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado además porque las generaciones subsiguientes contienen secuencias de ADN/ARN de las reivindicaciones 15 ó 16.

28. El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado además porque las secuencias de ADN o ARN son capaces de codificar genes o de no codificar genes.

29.- El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque las secuencias de ADN o ARN son transferidas a generaciones subsiguientes por técnicas de reproducción de plantas incluyendo pero sin limitarse a cruzamientos.

30.- El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado además porque las generaciones subsiguientes contienen secuencias de ADN/ARN de las reivindicaciones 15 ó 16, con o sin gen marcador seleccionable.

31.- Un método para producir una planta de okra transformada, células de plantas y tejidos, en donde dicho método comprende: a) esterilizar superficialmente las semillas, y embeber las semillas en agua; b) germinar las semillas de la etapa (a) en un medio de cultivo de tejidos para obtener plantones o tejidos extirpados; c) obtener los tejidos extirpados de la etapa (b); d) bombardear los tejidos extirpados de la etapa (c) con partículas de tungsteno o de oro recubiertas con la secuencia de ADN de interés; e) cultivar los tejidos extirpados de la etapa (d) en un medio de cultivo para seleccionar células de plantas y tejidos, transformados; f) cultivar las células de plantas transformadas y tejidos de la etapa (e) en un medio de cultivo de tejidos adecuado para obtener yemas de retoños, y/o callos, y g) cultivar las yemas de retoños y/o callos de la etapa (f) en un medio de enraizado para obtener plantas transformadas enraizadas.

32.- El método de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizado además porque dichas semillas se seleccionan de diferentes variedades de accesiones de Abelmoschus esculentus.

33.- El método de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizado además porque los tejidos extirpados utilizados se seleccionan de un grupo que consiste de cotiledón con peciolo, hipocótilos, embrión, embrión inmaduro, lamina de hojas, axila cotiledonaria, punta de retoño, antera, raíz y callo.

34.- El método de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizado además porque el medio de cultivo de tejidos se selecciona de un grupo que consiste de un medio que contiene una citocinina, preferentemente zeatina, en el intervalo de 0.01 a 5 mg/l, preferentemente 2 mg/l un medio que contiene una combinación de citocininas en el intervalo de 0.01 a 20 mg/l o un medio que contiene una combinación de citocininas y auxina, con ésta última en el intervalo de 0.01 a 5 mg/l; y que contiene un antibiótico o herbicidas para la selección de células y tejidos transoformados.

35.- El método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado además porque el antibiótico es kanamicina en el intervalo de 25 g/l a 200 mg/l.

36.- El método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado además porque el antibiótico es higromicina en el intervalo de 5 g/l a 100 mg/l.

37.- El método de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizado además porque el medio de cultivo de tejidos se selecciona de un grupo que consiste de un medio que contiene una citocinina, preferentemente zeatina, en el intervalo de 0.01 a 5 mg/l, preferentemente 2 mg/l un medio que contiene una combinación de citocininas en el intervalo de 0.01 a 20 mg/l, un medio que contiene una combinación de citocininas y auxina, con ésta última en el intervalo de 0.01 a 5 mg/l.

38.- El método de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizado además porque el medio de enraizado es medio de MS basal con una baja concentración de auxina en el intervalo de 0.01 a 2 mg/l.

39. El método de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizado además porque el retoño, células de plantas y/o tejidos de plantas, transformados contienen secuencias de ADN o ARN de interés.

40.- El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado además porque las secuencias de ADN o ARN confieren rasgos agronómicos mejorados rasgos o una combinación de rasgos que comprenden para rendimiento, resistencia a la sequía, resistencia a la tensión, valor nutricional, la inducción de esterilidad de machos en la planta, células y tejidos.

41.- El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado además porque dichas secuencias de ADN o ARN confieren tolerancia o resistencia a enfermedades, herbicidas o insectos a plantas, células y tejidos.

42.- El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado además porque las secuencias de ADN o ARN son capaces de codificar genes o de no codificar genes.

43.- El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado además porque las secuencias de ADN o ARN son transferidas a generaciones subsiguientes por técnicas de reproducción de plantas incluyendo pero sin limitarse a cruzamientos.

44.- El método de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado además porque las generaciones subsiguientes contienen secuencias de ADN/ARN de las reivindicaciones 40 ó 41 , con o sin el gen marcador seleccionable.

45. Una Abelmoschus esculentus o planta de okra producido por el método de conformidad con la reivindicación 1.

46. Una planta de okra, células de plantas o tejidos, transformados obtenidos por el método de conformidad con la reivindicación 9.

47. Una semilla producida de la planta de conformidad con la reivindicación 46, caracterizada porque la semilla comprende el transgén.

48.- Una planta de okra transformada, células de planta o tejidos obtenidos por el método de la reivindicación 31.

49.- Una semilla producida de la planta de conformidad con la reivindicación 48, caracterizada porque la semilla comprende el transgén.

50.- La planta de okra transformada de conformidad con la reivindicación 46 ó 48, caracterizada además porque la planta tiene rasgos de importancia agronómica o no agronómica.

51.- La planta de okra transformada de conformidad con la reivindicación 46 ó 48, caracterizada además porque la planta es tolerante o resistente a insectos.

52.- La planta de okra transformada de conformidad con la reivindicación 46 ó 48, caracterizada además porque la planta es tolerante o resistente a enfermedades o herbicidas.

53.- La planta de okra transformada de conformidad con la reivindicación 46 ó 48, caracterizada además porque dicha planta tiene rasgos agronómicos mejorados o una combinación de rasgos que comprenden rendimiento, resistencia a la sequía, resistencia a la tensión abiótica, resistencia a la tensión biótica o valor nutricional.

54.- La planta de okra transformada de conformidad con la reivindicación 46 ó 48, caracterizada además porque dicha planta es macho estéril.

55.- La planta de okra transformada de conformidad con la reivindicación 46 ó 48, con o sin el gen marcador seleccionable.