FI110009B - Camelina sativan transformaatiojärjestelmä - Google Patents
Camelina sativan transformaatiojärjestelmä Download PDFInfo
- Publication number
- FI110009B FI110009B FI20002478A FI20002478A FI110009B FI 110009 B FI110009 B FI 110009B FI 20002478 A FI20002478 A FI 20002478A FI 20002478 A FI20002478 A FI 20002478A FI 110009 B FI110009 B FI 110009B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- camelina
- sativa
- plant
- transformation
- transgenic
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
- C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
- C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Processing Of Color Television Signals (AREA)
Description
110009
Camelina sutivan transformaatiojärjestelmä Keksinnön tekninen ala
Keksintö liittyy kasvibiotekniikkaan ja erityisesti menetelmään Camelina sativa-kasvin transformoimiseksi geneettisesti sekä siirtogeenisiin Camelina .rariva-kasveihin, kasvisolukkoon, -kasvisoluihin ja -solulinjoihin sekä -siemeniin.
Keksinnön taustaa
Kasvien geneettinen transformaatio mahdollistaa geenien siirtämisen niiden alkuperästä riippumatta kohteena olevaan lajiin tuottaen uusia tuotteita esim. maataloudellisiin, puutarhanhoidollisiin, ravinnollisiin ja kemiallisiin sovelluksiin. Lisäksi siirtogeenisten kasvien avulla saadaan lisätietoa keskeisestä kasvibiologiasta, geenien toiminnasta ja säätelystä. Useissa kasvilajeissa perinteinen kasvinjalostus on rajoittunutta, koska olemassa oleva geenipooli on niukka ja estää lisäjalostamisen. Tietyn ominaisuuden muunteleminen voi olla aikavievää ja jopa mahdotonta muuntelematta muita ominaisuuksia. Useimmat geneettiseen transformaatioon .; ’ liittyvät sovellukset keskittyvät parantamaan esimerkiksi taudinkestävyyttä, hyönteiskestävyyttä, ' . kestävyyttä rikkakasvimyrkyille, muunneltuja laatuominaisuuksia kuten öljy- ja * proteiinikoostumusta sekä parantamaan stressin sietokykyä ja kasvuominaisuuksia. Muissa I..' sovellutuksissa kasveja käytetään myös bioreaktoreina tuotettaessa vieraita proteiineja tai kasvien sekundäärisiä aineenvaihduntatuotteita.
• · • # . Useita vektorisysteemejä on kehitetty käytettäväksi korkeammissa kasveissa geenien siirrossa • · · , · · · ’ kasvisolukkoon esimerkiksi kasvivirusten käyttö vektoreina, suora geeninsiirto käyttäen DNA:n • palasia, joita ei ole liitetty vektoriin tai Agrobakteeri-välitteinen geeninsiirto.
·; Agrobakteeri-vähtttinen geeninsiirto on eniten käytetty menetelmä siirrettäessä geenejä kasveihin käyttäen joko Agrobacterium tumefaciensia sekä Agrobacterium rhizogenesia. Useita 2 110009
Agrobakteeri-välitteisiä kasvien transformaatiomenetelmiä ja -systeemejä on kuvattu, esim. julkaisuissa WO 84/02920, EP 289478, US 5,352,605, US 5,378,619, US 5,416,011, US 5,569, 834jaWO 00/42207.
Useita mainituista menetelmistä on erityisesti sovellettu öljykasveissa, kuten Brassicaceae, esim. Brassica rapa ssp. oleifera (Radke ym., 1992; Knutzon ym., 1992; Shiba ym., 1995) ja B. campestris (Mukhopadhyay ym., 1992; Kuvshinov ym., 1999). US-patentti 5,188,958 pitää sisällään Brassica-lajien Agrobakteeri-VAlitteisen transformaatiomenetelmän.
Useita transformaatiostrategioita, joissa hyödynnetään Agrobakteeri-ν'ύlitteistä geeninsiirtoa on kehitetty. Binaarivektori-strategia perustuu kahden plasmidin systeemiin, jossa T-DNA sijaitsee eri plasmidissa kuin muu osa Ti-plasmidista. Kointegraatio-strategiassa pieni osa T-DNA:sta on sijoitettu samaan vektoriin vieraan geenin kanssa ja tämä vektori rekombinoi Ti-plasmidin kanssa.
Siirtogeenisten kasvien tuottamisesta on tullut rutiinia monilla kasvilajeilla, mutta yhtä yleispätevää transformaatiomenetelmää erilaisille kasvilajeille ei ole olemassa, koska transformaatio- ja regeneraatiotehokkuudet vaihtelevat lajien välillä ja jopa erilaisten V: kasvinpalasten välillä. Tämän vuoksi on tarve kehittää vaihtoehtoisia transformaatiosysteemejä : *·., ja -menetelmiä erityisesti öljykasveille.
• « ·
Camelina sotiva (kitupellava tai ruistankio), yksi Euroopan tärkeimmistä öljykasveista pronssi- : ja rautakauden aikana, on ollut viljelyksessä Euroopassa jo vuosisatojen ajan. Sen siemeniä • · · : : käytettiin erityisesti lamppuöljyksi, mutta myös syötävissä tuotteissa (Kroll 1994). Camelina- kasvista saatuja öljytuotteita on käytetty myös ruokalevitteiden tuottamisen kuten on kuvattu US-patentissa 6,117,476.
Il»
Mi . Koska Camelina sotiva on pienessä mittakaavassa viljelty viljalaji, vain vähäistä jalostusta on • · · tehty lukuun ottamatta viljelyksellisten ominaisuuksien ja siementen öljyprofiilien testausta.
» · ·
Mutaatiojalostuskoe rasvahappokoostumuksen muutoksen indusoimiseksi on raportoitu 4··.\ (Buchsenschutz-Northdurft ym., 1996). Kolmesta neljään kertaisia eroja havaittiin.
3 110009
Solukkoviljelytekniikoiden sovellutukset C. sativa-kasvilla rajoittuvat kahteen lähestymistapaan.
C. saizva-kasvia on käytetty somaattisessa fuusiossa muiden Brassica-lajien kanssa (Narasimhulu ym., 1994; Hansen 1997; Sigareva ja Earle 1999). Regeneroituja interspesifisia hybridikasveja saatiin Sigarevan ja Earlen tutkimuksessa. Äskettäin, Tattersall ja Millam (1999) raportoivat Camelinan versojen regeneroitumisen kasvin lehtien toimiessa siirrännäisinä.
Keksinnön päätarkoituksena on tuottaa vaihtoehtoinen Camelina sativa-kasvin geneettinen transformaatiosysteemi, joka tarttuisi ongelmaan mahdollistaa tämän viljelykasvin nopea jalostus erilaisten lopputuotteiden tuottamiseksi, joihin kuuluvat homologiset ja heterologiset rekombinantti-DNA-tuotteet. Esimerkit homologisista rekombinanttituotteista käsittävät mm. C. Λζη'να-kasville ainutlaatuisia öljytuotteita, heterologiset tuotteet taas käsittävät vieraita proteiineja, entsyymejä, jne. Yksi keksinnön tarkoituksista on tuottaa uusi mallikasvi korvaamaan esimerkiksi Arabidopsis ja tupakka.
Keksinnön yhteenveto
Keksintö tuottaa ratkaisun mainittuihin ongelmiin tuottaen uuden menetelmän geneettisesti transformoida Camelina saiiva-kasvia. Menetelmät, tuotteet ja välineet, joita käytetään mainitussa menetelmässä kuvataan keksinnön patenttivaatimuksissa ja ne mahdollistavat ·1·.. tehokkaan, luotettavan ja kätevän transformaatiosysteemin, jolla tuotetaan ominaisuuksiltaan ·;· paranneltu C. sariva-viljelykasvi siirtogeenisen parantamisen ja rekombinantti-DNA-tekniikan avulla.
: : Piirrosten lyhyt kuvaus · Kuva 1. näyttää Camelina satzva-kasvin in vitro kasvatuksessa.
Kuva 2. näyttää Camelina sativa-kasvin lehtisiirrännäisestä regeneroituneita versoja.
: . Kuva 3. näyttää GUS-ilmentymisen C. sativa-kasvin kallussolukossa.
· 4 110009
Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus Lyhenteet ja määritelmät
Keksinnössä käytetyillä määritelmillä on merkitys, joka niillä yleisesti on perinteisessä kasvinjalostuksessa, kasvibiokemiassa ja siirtogeenisten kasvien tuottamisessa, mukaan lukien rekombinantti-DNA-teknologia sekä maa- ja puutarhatalous. Joitain määritelmiä kuitenkin käytetään hieman laajemmassa tai poikkeavassa merkityksessä. Niin ollen, epävarmuuden välttämiseksi, jota tiettyjen selitysosassa ja patenttivaatimuksissa epäselvän merkityksen omaavien määritelmien osalta mahdollisesti esiintyy, seuraavassa on tarkennettu näiden määritelmien merkityksiä.
Lyhenteet BAP 6-bentsyyliaminopuriini 2,4-D 2,4-dikloorifenoksietikkahappo ·.*. GUS B-glukuronidaasi (mBM-reportteri geeni) : *. hpt hygromysiinifosfotransferaasi .:. hyg hygromysiini • · · . ’LAA indolyyli-3-etikkahappo * · • “kan kanamysiini • · · :'' *; MS Murashige-Skoog-alusta tai agar • * · NAA a-naftaleenietikkahappo nptn neomysiinifosfotransferaasi • · * * ”: YEB Agrobakteeri-solu]en viljelemisessä käytetty alusta • · · • · · . · · *. Määritelmät ”” ”Camelina sativä' kuuluu Brassicaceae-heimoon, joka on osa Sisymbriae-heimoa. C. sativa- .s 110009 i kasvin siementen tuottotaso on verrattavissa rapsin siementen tuottotason kanssa. Hyödyllisiä C. sariva-lajikkeita ovat laj. Calina ja laj. Calinca.
”Agrobacterium tumefaciens" on yleisesti luonnossa esiintyvä maabakteeri, jolla on kyky | sisältämänsä Ti-plasmidin avulla aiheuttaa ’’aitosyöpä” -tautia useille kaksisirkkaisille i kasvilajeille. ’’Aitosyöpä” aiheutuu, kun Agrobacterium pääsee valloittamaan kasvin haavautuneen alueen.
”Agrobacterium tumefaciens-kmta” on yksi niistä kolmesta Agrobakteeri-kannasta, joita käytetään transformoitaessa Camelina sativa. LBA4404-kanta sisältää pAL4404-plasmidin, C58Cl-kanta sisältää pGV3850-plasmidin ja EHA105-kanta pTiBo542-plasmidin.
Määritelmä "Agrobakteeri-välitteinen geneettinen transformaatio” tarkoittaa tässä keksinnössä Agrobakteerin käyttämistä vektorina, joka pystyy siirtämään vieraan geenin/geenejä C. sotiva-kasvin soluihin. Ti-plasmidin T-DNA vaihdetaan vieraaseen geeniin ja vieras geeni siirretään Agrobakteeri-infektiossa osaksi kasvin kromosomaalista DNA:ta.
Määritelmä ’’siirrännäinen” tarkoittaa osia tai palasia, jotka on otettu kasvista ja tässä yhteydessä ·.·. C. sotiva-kasvista. Nämä palaset tai solukkosiirrännäiset voidaan irrottaa sirkkavarresta, sirkkalehdestä, varresta, lehdestä tai muista kasvin osista ja niitä voidaan käyttää in vitro .:. kasvatus- j a transformaatiokokeissa.
♦ * Määritelmä "in vitro siirrännäinen” tarkoittaa siirrännäistä, joka on leikattu C iariva-kasvin sirkkavarresta, sirkkalehdestä, lehdestä tai muista kasvin osista sellaisesta kasvista, joka on kasvanut steriileissä olosuhteissa kasvatusalustalla.
• · · •'": Määritelmä ’’lehden palanen” tarkoittaa lehden palasta, joka on peräisin in vitro kasvatetusta C.
• % * . jariva-kasvista. In vitro kasvatetun C. sativa-kasvin lehdet ovat kooltaan melko pieniä: 2-4 • · · • · · .···. senttimetriä pitkiä ja 0,5-1 senttimetriä leveitä. Lehden palasia leikattaessa, kapeat lehdet * « leikataan pitkin pituuttaan kahteen osaan ja isommat lehdet leikataan vielä lisäksi kahtia ’;;; keskisuonen myötäisesti.
6 110009 Määritelmä ’’voimistaja” tarkoittaa ainetta, jota vapaavalintaisesti käytetään voimistamaan Agrobakteeri-vditteistä transformaatiota, voimistaja-aineista esimerkkeinä ovat asetosyringoni j a 3,5 -dimetoksi-4-hydroksiasetofenoni.
Määritelmä ”rekombinantti-DNA-konstrukti” tarkoittaa geenikonstruktia, joka on tuotettu ligoimalla tai liittämällä yhteen DNA-palasia, jossa on liitetty yhteen toisilleen vieraita DNA-jaksoja.
Määritelmä ”Agrobacterium tumefaciens-viljdmällä ympätty” tarkoittaa C. sativa siirrännäisiä, joita on pidetty upoksissa 1-3 minuutin ajan yli yön kasvaneessa A. tumefaciens LBA4404 viljelmässä, jota on laimennettu MS-liuokseen (esim. 1/10 v/v).
Määritelmä ’’annetaan transformaation tapahtua” tarkoittaa, että siirrännäiset laitettiin Murashige-Skoog (MS) agar-alustalle, johon oli lisätty vähintään yhtä hormonia tai kasvutekijää yhteiskasvatukseen Agrobakteerin kanssa ajanjaksoksi, joka oli riittävän pitkä transformaatiolle, mieluiten kahdeksi päiväksi.
·,·. Määritelmä ’’valikoidaan C. sativa-k&svin transformoitu solukko” tarkoittaa, että transformoitu :\ solukko kasvatetaan alustalla, johon on lisätty substraattia, jonka avulla siirtogeeninen solukko, joka sisältää resistenssimarkkerin voidaan valikoida. Substraattina käytetään mieluiten : antibiootteja, kuten kanamysiiniä tai hygromysiiniä, mutta usein muita valikointisysteemejä • · kuten herbisidejä ja erityisiä hiilihydraatin lähteitä käytetään. Merkki geenien kuten esimerkiksi nptll- tai /zpt-geenien käyttö on valinnaista, koska mahdolliset haittavaikutukset, jotka liittyvät merkkigeenien käyttöön kasvien kloonausvektoreissa on yksi geneettisesti muunneltuihin : * ·. - kasveihin liitetyistä huolenaiheista.
t \ Määritelmä ’’saadaan aikaan versoja (versojen regeneraatio) transformoiduista siirrännäisistä” • » · .···. tarkoittaa tapahtumaa, jossa versoja muodostuu siirrännäisestä, joita on kasvatettu versojen • · i 1 » \ muodostumisen mahdollistavalla alustalla, mieluiten MS-alustalla, johon on lisätty versojen « » · ·;;; regeneraation mahdollistavia hormoneita tai kasvutekijöitä, mieluiten sytokiniinejä kuten 6- 110009 7 bentsyyliaminopuriinia (BAP) ja auksiinia kuten α-naftaleenietikkahappoa (NAA) ja riittävä määrä ainetta, joka pystyy estämään kontaminanttien kasvun, kuten antibioottia, mieluiten karbenisilliiniä ajaksi, joka on riittävä versojen muodostumiseksi, mieluiten noin neljäksi päiväksi. Seuraavaksi versot siirrettiin samanlaiselle kasvatusalustalle, johon on lisätty 20 mg/1 hygromysiinia.
Määritelmä ’’kasvatetaan versot isoiksi C. hariva-kasveiksi” tarkoittaa regeneroituneiden versojen kasvattamista ja juurruttamista noin 2-3 viikon ajan Vi x MS alustalla ilman hormoneja tai valinnaisesti auksiinia lisäämällä.
Määritelmä ’’soluviljelyalusta, johon on lisätty vähintään yhtä hormonia (kasvutekijää)” tarkoittaa, että sytokiniiniä tai auksiinia on lisätty kasvatusalustaan.
Määritelmä ’’hormoni on sytokiini tai auksiini” tarkoittaa että sytokiniini on 6-bentsyyliaminopuriini (BAP) tai kinetiini ja auksiini on α-naftaleenietikkahappo (NAA) tai indolyyli-3-etikkahappo (IAA). Muita mahdollisesti hyödyllisiä hormoneja ovat esimerkiksi 2,4-dikloorifenoksietikkahappo (2,4-D), 2iPjazeatiini.
Camelina hariva-kasvin siemeniä voidaan kasvattaa taimien, joista siirrännäisiä voidaan ottaa, :'. tuottamista varten. DNA-sekvenssi on homologinen tai heterologinen ylimääräinen vieras geeni tai geenin osa sellaisenaan, joka koodaa haluttua tuotetta. DNA-sekvenssit voidaan välittää ;\· DNA-konstruktien muodossa, jossa tapauksessa vieras geeni on toiminnallisesti liitetty yhteen : *' ‘: tai useampaan sekvenssiin, jotka vastaavat tietyistä tehtävistä tai pystyvät säätelemään mainittuja tehtäviä. Esimerkkejä sellaisista sekvensseistä ovat promoottorit, signaalisekvenssit, operaattorit, jne. DNA-konstruktit voivat sisältää valinnaisia sekvenssejä, jotka mahdollistavat : ’ ·. · niiden Camelina hariva-siirrännäisten valinnan, jotka sisältävät siirtogeenisen insertin.
. . ·. Määritelmä ’’arvioidaan kasvitransformaation tehokkuus” tarkoittaa tutkimusta, jossa mitataan . * · ·. siirtogeenisten tapahtumien määrää transformoiduissa siirrännäisissä.
> Määritelmä ’’homologiset tai heterologiset rekombinanttituotteet” tarkoittaa proteiineja, g 110009 aineenvaihduntatuotteita, öljyjä, hiilihydraatteja tai muita tuotteita, joita voidaan tuottaa Camelina sa/iva-kasvissa Agro&afeem-välitteisen transfoimaatiosysteemin avulla. Camelina iariva-kasvin omia DNA-sekvenssejä tai -geenejä käyttämällä tehdään homologisia rekombinantti-DNA-tuotteita, kun taas heterologisia tuotteita tuotetaan käytettäessä C. sativa kasville vieraita DNA-sekvenssej ä j a geenej ä.
Keksinnön yleinen kuvaus
Camelina sativa kuuluu Brassicaceae-heimoon, joka on osa Sisymbrieae-heimoa ja sekä kevät-että syyslajikkeita on viljelyksessä. Se on alhaisen tuotantopanoksen kasvi, joka on sopeutunut kasvamaan vähän lannoitetussa maaperässä. Pitkäaikaiset kokeet Keski-Euroopasta ovat osoittaneet, että C. sativa-käsvin siementuoton määrä on verrattavissa rapsin siementuottoon. Keski-Euroopassa saavutetaan 2,5 - 3 t/ha siemensatoja (Friedt ym., 1994). Pohjoismaissa siemensadot ovat olleet puolestaan tasolla 1500-2000 kg/ha (Alen ym., 2000). Tuhat kappaletta siemeniä painaa 0.8 - 1.8 g riippuen käytetystä lajikkeesta (Zubr, 1998).
C. sariva-kasvin siementen öljypitoisuus vaihtelee 30-40% välillä. Camelina-6ljyä kohtaan on herännyt uudestaan kiinnostus sen sisältämän korkean monityydyttymättömien rasvahappojen · (50-60%) tason vuoksi. Hyödyllisten rasvahappojen suhde on erinomainen ja öljy sisältää lisäksi omega-3 öljyjä (30-40% alfa-linoleenihappoa), jotka muistuttavat kalaöljyjä ja ovat harvinaisia ,:. öljykasveissa. C. sativa-kasvm siemenet sisältävät myös korkeita pitoisuuksia tokoferoleita (noin .·. : 600 ppm), joilla on ainutlaatuinen oksidatiivinen stabiilisuus. Öljyssä on lisäksi alhainen • » * .**. glukosinolaattipitoisuus (Zubr 1997; Matthäus ja Zubr, 2000). Eräs huono laatuominaisuus • · · kasvin ruoka- ja rehukäyttöä ajateltaessa on, että C. sativa-kasvi sisältää melko korkeita » · » pitoisuuksia epäedullista erukahappoa ja 11-eikoseenihappoa. Mainitut ongelmia aiheuttavat ; ‘. t j rasvahapot voidaan kuitenkin poistaa öljystä ja käyttää hyödyksi muihin tarkoituksiin. Toisaalta •' * ’; teolliset sovellutukset voivat tarvita tällaisia harvinaisia rasvahappoja.
• » » . · >, Brassica-lajeja on käytetty yleisinä mallikasveina kasvinjalostuksessa ja molekyylibiologiassa, • mutta koska ne ovat kuitenkin herkkiä tuholaisille kuten Meligethes auneus, vaihtoehtoinen • ’;; sukulaiskasvi mallikasviksi olisi hyödyllinen. C. sativa voisi olla tämänlainen mallikasvi, koska i 9 110009 se ei ole herkkä tuhohyönteisille. Lisäksi C. sotiva-kasvin genomi on suhteellisen pieni omaten 20 kromosomia, helpottaen sen käyttöä geneettisissä tutkimuksissa. Tyypillisesti tupakkaa ja Arabidopsista on käytetty mallikasveina ja erityisesti Arabidopsikseen verrattuna Camelina tuottaa huomattavasti enemmän kasvimateriaalia jatkotutkimuksiin. Camelina kasvaa kuitenkin hitaasti, mikä vähentää sen kilpailukykyä rikkakasveihin verrattuna. Keksintö tuottaa menetelmiä mainittujen ongelmien ratkaisemiseen esimerkiksi lisäämällä kasvin sietokykyä herbisideille ja/tai nopeuttamalla kasvin kasvua.
Alustavissa kokeissa olemme tutkineet erilaisia tekijöitä, jotka voisivat vaikuttaa C. sativa-kasvin siirrännäisten regeneraatio- ja transformaatiotehokkuuteen. Näiden kokeiden pohjalta olemme kehittäneet transformaatiomenetelmän in vitro kasvatetun C. «mva-kasvin siirrännäisille, mieluiten lehden palasille, käyttäen Agrobacterium tumefaciens-välitteistä infektiota.
Keksintö siis tuottaa Camelina sativa-kasvm transformaatiomenetelmän, jossa menetelmässä solukko, mieluiten in vitro kasvin lehden palaset irrotetaan ja asetetaan kasvatusalustalle, mieluiten MS-alustalle, johon on lisätty hormoneja ja sakkaroosia (2%). Lehden palasia kasvatetaan tällä alustalla noin 24 tuntia, ja sen jälkeen ne upotetaan MS-liuokseen, joka on •. ·. ympätty vähintään yhtä C. sariva-kas ville vierasta geeniä kantavalla A. tumefaciens tumefaciens-: ·. bakteerilla.
; Ylimääräinen neste poistetaan upotetuista palasista suodatinpaperin avulla ja siirrännäiset . ‘ . siirretään kiinteälle MS-alustalle, joka sisältää hormoneja ja valinnaisesti lisäksi asetosyringonia. Siirrännäisiä yhteiskasvatetaan Agrobakteerin kanssa kahden päivän ajan (48 tuntia), jolloin transformaatio tapahtuu. Tämän vaiheen aikana Agrobakteeri siirtää vieraan geenin Camelina :1·,· sativa-kasvin soluihin. Yhteiskasvatetut siirrännäiset pestään ja ne asetetaan MS-agarille I » ’ ‘'; kalluksen muodostumista ja versojen regeneroitumista varten. Antibioottiselektio aloitetaan 1-2 * 1 · t viikon kuluttua transformaation päättymisestä, siinä vaiheessa kun siirrännäiset alkavat ,1·, muodostaa kadusta. Selektio kestää kahdesta kuuteen viikkoon käyttäen kanamysiinia, hygromysiinia tai selektoivaa ainetta. Tällöin lehden palaset muodostavat kadusta ja siirtogeenistä versoja. Regeneroidut, siirtogeeniset versot kasvatetaan ja juurrutetaan noin 2-3 10 110009 viikon ajan '/ixMS alustalla, joka on hormoneista vapaa tai johon on lisätty auksiinia.
Keksintö kuvaillaan yksityiskohtaisemmin seuraavassa kokeellisessa osassa. Keksinnön laajuus ei luonnollisesti rajoitu ohessa esitettäviin menetelmiin; alan ammattimies voi helposti korvata ehdotetut materiaalit ja menetelmät vaihtoehtoisilla.
Materiaalit ja menetelmät:
Kasvimateriaali. C. sahva-kasvin siemeniä steriloitiin 1 minuutin ajan 70% etanolissa ja 10 minuutin ajan Na-hypokloriitissa (3% aktiivista Cl'), johon oli lisätty muutama pisara Tween-20:a, ja pestiin kolme kertaa steriilillä vedellä. Steriloituja siemeniä kasvatettiin Murashige-Skoog (MS; Murashige ja Skoog 1962) agar alustalla ilman sokereita. Kahdesta kolmeen viikkoon vanhan in viiro-kasvin lehtiä käytettiin transformaatiokokeissa.
Agrobakteeri-vektorit. Agrobacterium tumefaciens-kmta C58C1, joka sisältää pGV3850- plasmidin (Zambryski ym., 1983), kanta EHA105 (Hood ym., 1993), jossa on pTiBo542- plasmidi sekä LBA4404 kanta, jossa on pAL4404-plasmidi (Hoekema ym., 1983) olivat kantoja joita testattiin C. sahva-kasvin transformaatiokokeissa. UidA (GUS)-geeni, joka sisältää intronin *.·. (UidA-int) (Vancanneyt ym., 1990) kloonattiin kaikkiin yllä listattuihin vektoreihin T-DNA- : *. alueelle. Tämä geenikonstrukti, joka sisältää intronin, estää geenien ilmentymisen bakteereissa ja . j. mahdollistaa transformaation määrittämisen aikaisessa vaiheessa. Ko-integratiivinen pHTT294- · vektori, joka on olennaisesti samankaltainen kuin pHTT370 (Elomaa ym., 1993), joka sisältää • · uidA-geenin intronilla CaMV 35S -promoottorin alaisuudessa siirrettiin Agrobakteeri C58C1-kantaan. UidA-geeni poistettiin binaarisista pGPTV-HPT ja pGPTV-KAN -vektoreista (Becker ym., 1992) ja korvattiin (7/iM-geenillä, joka sisältää intronin ja liitettiin CaMV 35S -: ’ ·.: promoottoriin. Saadut vektorit transformoitiin EHA105 ja LBA4404 Agrobakteeri-kantoihin.
, ,*, Agrobakteerit kasvatettiin yön yli ravistelussa nestemäisessä YEB-alustassa (Liechtenstein ja . ’ · *. Draper 1985), johon oli lisätty sopivat antibiootit. Tämän jälkeen tuore nestemäinen YEB-alusta ympättiin yli yön kasvaneella Agrobakteerilla (1/100 v/v) (samoilla antibiooteilla kuin edellä) ja ”!.* annettiin bakteerin kasvaa ravistelussa yön yli. Agrobakteeri-viljelmää, jonka ODöoo =1 π 110009 käytettiin transformaatiossa.
Kasvatusalusta.
Murashige-Skoog (MS) kasvisolukkoviljelmäalustan komponentit:
Suolat: g/1 Vitamiinit: mg/1 NH4NO3 1.65 Tiamiini 0.1 KNO3 1.9 Pyridoksiini 0.1
MgS04x7H20 0.37 Nikotiinihappo 0.5 KH2PO4 0.17 Myo-inositoli 100
CaCb x 2H2O 0.44 Glysiini 2.0
mg/I g/I
H3BO3 6.2 Sakkaroosi 2.0
MnS04 x 4H2O 22.3 Agar 7.0
ZnS04 x 7H2O 8.6 KJ 0.83 pH 5.6 ·.·. Na2Mo04x2H20 0.25 • ♦ :·.* CuS04 x 5H20 0.025 .:. C0CI2 x 2H20 0.025 * ·
Kasvitransformaatio. In vitro kasvaneita Camelina sarfva-kasvin lehden palasia (Kuva. 1) * * k kasvatettiin MS-alustalla, jossa oli 0.7% agaria 24 tunnin ajan. Kaikkiin MS-kasvualustoihin • · · lisättiin 2% sakkaroosia ja alustoja pidettiin 25°C päivä- ja 18°C yölämpötiloissa 16 h valojaksolla. Seuraavaksi siirrännäiset upotettiin 1-3 minuutin ajaksi MS-liuokseen, joka oli ympätty yli yön kasvaneella Agrobakteerilla (esim. 1/10 v/v). Tämän jälkeen siirrännäisten » * * , /, pinnalla oleva ylimääräinen neste poistettiin suodatinpaperin avulla ja palaset siirrettiin MS-• * · ,···. agarille, johon oli lisätty sytokiniini- ja auksiinihormoneita kahden päivän ajaksi.
1 » • · » •( Yhteiskasvatuksen jälkeen, siirrännäisiä pestiin liuoksessa, johon oli lisätty claforan « · · ·;;; (cefotaxime) -antibioottia (700 mg/1) tai karbenisilliinia (700 mg/1). Siirrännäisten pinnat 110009 kuivattiin filtteripaperilla ja palaset laitettiin MS-alustalle selektiota ja versojen muodostumista varten.
Selektio ja regeneraatio. Siirrännäisten pitäminen kahden viikon ajan MS-alustalla, johon oli lisätty 0.5 - 1.5 mg/1 6-bentsyyliaminopuriinia (BAP) ja 0.1 - 0.5 mg/1 a-naftaleenietikkahappoa (NAA), havaittiin parhaaksi kalluksen ja versojen muodostumisen kannalta. Tämän alustan jälkeen kokonaiset siirrännäiset tai siirrännäisistä erilleen leikatut versot siirrettiin hormoni vapaata kasvatusalustaa sisältäville Petri-maljoille, mieluiten MS-alustalle, jossa niiden annettiin kasvaa ja aloittaa juurien muodostus. Petri-maljat suljettiin huokoisella paperiteipillä. Siirtogeeniset versot kasvatettiin normaalilla tai Vi vahvuisella MS-alustalla ilman hormoneja tai 0.1 - 0.2 mg/1 NAA-lisäyksen kanssa juurien kasvun kiihdyttämiseksi, versojen pidentämiseksi sekä mikrolisäyksen mahdollistamiseksi. Hormonien tarkat pitoisuudet vaihtelivat käytetyn lajikkeen mukaisesti. Selektio käyttäen hygromysiinia tai vaihtoehtoisesti kanamysiinia aloitettiin 1-2 viikon jälkeen Agrobakteeri-yhteiskasvatuksen loputtua. Antibioottia käytettiin pitoisuutena 15-25 mg/1. Antibioottiselektiota jatkettiin 2-6 viikon ajan, jona aikana lehden palaset muodostivat kallusta ja siirtogeenisiä versoja. Regeneroidut, siirtogeeniset versot kasvatettiin ja juurrutettiin 2-3 viikon ajan normaalilla tai Vi vahvuisella MS-alustalla ilman hormoneja.
Siirtogeenin ilmentymisen analysointi. Histologinen GUS-testi tehtiin transformoidulle kallus-.j. ja lehtisolukolle. Käytimme uidA-geeniä, jossa on introni estämässä GUS:n ilmentymistä j\· Agrobakteerissa ja joka mahdollistaa GUS-aktiivisuuden testaamisen transformaation alkuvaiheessa, jopa heti yhteiskasvatuksen jälkeen. Yleensä GUS-testi tehtiin : ‘' *; optimointikokeissa neljä päivää Agro&a£teeri-yhteiskasvatuksen loppumisen jälkeen.
: * *. · Siirtogeeniset kasvit, jotka osoittivat pysyvän positiivisen GUS-ilmentymisen ja kasvoivat hyvin • selektio-olosuhteissa kasvatettiin kasvihuoneessa ja testattiin Southern blot -analyysillä , .·. transformaation varmentamiseksi.
• t f • ·
Southem-analyysissä käytettiin iu<iA-geeniä, joka oli leimattu digoksigeniinillä polymeraasi-ketjureaktion (PCR) avulla Boehringer Mannheimin kehittämän menetelmän mukaisesti. Kolme 13 110009 pg GUS- positiivisen C. sanVa-kasvin DNA:ta leikattiin £coRI ja BamHl restriktioentsyymeillä. Nämä entsyymit leikkaavat irti 2 kb pituisen uidA-geenin palasen T-DNA-alueelta, joka on siirretty pGPTV-HPT tai pGPTV-KAN vektoreista C. sotiva-kasvin genomiin.
Tulokset alustavista kokeista, joissa transformaatiomenetelmää kehitetty
Alkuperäiset kasvit. Pellolla kasvaneet C. sativa-kasvit muodostavat pahasti kontaminoituneita siemeniä. Nämä siemenet ovat käytännössä kelpaamattomia käytettäväksi transformaatiossa, koska näistä siemenistä kasvatettujen in vitro kasvien siirrännäisinä toimivat lehden palaset sisältävät bakteereita, jotka estävät kasvien transformaation A. tumefaciensilla. Hyvän tuloksen saavuttamiseksi siemeniä tuottavat C. sativa-kasvit kasvatettiin kasvihuoneessa. Kasvihuoneessa kehittyneet ja kypsyneet siemenet olivat vapaita kontaminaatiosta pintasteriloinnin jälkeen. C. sativa-kasvin siemenillä on hygroskooppinen polysakkaridikerros, joka muodostaa 0.5-1 mm paksuisen esteen siemenen ympärille. Tämä kerros suojaa siementä sieni- ja bakteeri-itiöitä vastaan. Tämä C. sariva-kasvin siemenen erityinen ominaisuus vaatii tehokkaamman siemenen pintasteriloinnin kuin monilla muilla lajeilla. Sterilointikäsittelyt tehtiin Taulukon 1 mukaisesti.
C. sativa-kasvin siemenet upotettiin 70% etanoliin 1 minuutin ajaksi ja käsiteltiin sen jälkeen Na-hypokloriitti-liuoksessa, jossa oli joukossa Tween-20:a (1 tippa/100 ml liuosta).
• ♦ • t ;·. Taulukko 1. Siementen itäminen (%) ja kontaminaatio erilaisten pintasterilointikäsittelyjen jälkeen. Na-hypokloriitin konsentraatio aktiivisen Cl:n (%) muodossa on sijoitettu taulukon , \ : pystysarakkeisiin ja Na-hypokloriittikäsittelyjen pituudet on sijoitettu vaakariveille.
* * * « * • « * • * » · .*··. Aikamin.\% Na-hyp 1% Cl' 3% Cl' 6% Cl" 5 min Kontaminoitunut 100% 60% lOmin 100% 100% 30% » ·________ 20 min 100% 60% 0% * ♦ · * i * . · ·, Steriloinnin jälkeen siemenet pestiin kolmeen kertaan steriloidulla vedellä ja asetettiin MS-agarille ilman sokereita itämään. Itäminen arvioitiin kolmen päivän kuluttua steriloinnista.
i r ♦
Kymmenen minuutin käsittely 3% Na-hypokloriittiliuoksessa oli optimaalinen C. sotivan U 110009 ί j j siementen steriloimiseksi.
I Steriloituja siemeniä idätettiin ja niiden annettiin kasvaa MS-agarilla ilman sakkaroosia ja ' hormoneita. In vitro olosuhteissa kasvaneiden taimien vihreitä lehtiä käytettiin siirrännäisten I lähteenä transformaatiossa.
Kasvitransformaatio. Kolmea erilaista A. tumefaciens kantaa, nimittäin C58C1, EHA101 ja LBA4404 käytettiin transformaatiokokeissa. C58ClpGV3850 sisältää ko-integratiivisen vektorin pHTT294. EHA105 ja LBA4404 sisältävät kumpikin binaarisen vektorin pGPTV-HPT. UidA (GUS) intronin sisältävä reportterigeeni kloonattiin pGUS-int vektorista kaikkiin transformaatiokokeissa käytettyihin binaari- ja ko-integratiivisiin vektoreihin. UidA-int-geem laitettiin CaMV 35S promoottorin alaisuuteen.
Sirkkavarret, sirkkalehdet, lehden ja varren palaset testattiin reagointiin Agrobacterium tumefaciensin kanssa. Sirkkalehdet ja lehden palaset transformoituivat voimakkaimmin. Paremman regeneraatiokykynsä vuoksi lehden palasia käytettiin siirrännäisinä jatkokokeissa. In vitro kasvatetun C. sariva-kasvin lehdet ovat melko pieniä kooltaan: 2- 4 cm pituisia ja 0.5 - 1 cm leveitä. Tämän vuoksi kapeat lehden leikattiin keskeltä poikki kahdeksi siirrännäiseksi ja . . isommat lehdet leikattiin puolestaan neljään osaan transformaatiokokeita varten.
• · • » • * • ·
Eri Agrobakteeri-kmtojen transformaatiotehokkuudet mitattiin sinisten pisteiden osuutena « · kalluksessa yhden viikon kuluttua lehden palasten inokulaatiosta. (Kuva 3).
• * · * · · • t I I t f · · • « • » • » · • ♦ • * * • · · • · » > · · · » * * » • · • · t | t f » * t * » * · t » • · ! ,5 110009 » ! Taulukko 2. Eri Agrobakteeri-kantojen transformaatiotehokkuudet. Ensimmäinen pystysarake: GUS positiiviset/kaikki siirrännäiset, toinen pystysarake: voimakas transformaatio.
i ___
Agrobakteeri Siniset pisteet kaikissa Voimakkaasti Transformaatio (%) siirrännäisissä transformoituneet (voimakas) I LBA4404pGPTV-HPT 35/50 7/50 70% (14) EHA105pGPTV-HPT 24/50 48%(0) j C58pGV3850pHTT294 33/50 4/50 66% (8)
Kolmen transformaatiokokeen tulokset (Taulukko 2) osoittavat, että LBA4404- ja C58ClpGV3850-kannat ovat tehokkaita C. sativa-kasvin transformaatiossa. EHA105-kanta oli hieman tehottomampi. LBA4404-kannalla infektoiduissa siirrännäisissä oli suuria voimakkaasti värjäytyneitä pisteitä. Tämän vuoksi LBA4404 valittiin käytettäväksi seuraavissa ' transformaationkokeissa.
Versojen regeneraatio. Eri hormoneiden vaikutusta useisiin C. hariva-kasvin siirrännäisiin (sirkkavarsi, sirkkalehti, lehdet ja varren palaset) kokeiltiin alustavissa testeissä versojen riittäväksi regeneroimiseksi. 6-bentsyyliaminopuriini (BAP) ja of-naftaleenietikkahappo (NAA) ·,·, osoittautuivat voimakkaammiksi versojen regeneraation aikaansaajiksi kuin kinetiini ja i * * · indolyyli-3-etikkahappo (LAA) (tulokset eivät näkyvissä). Sirkkalehdet regeneroituivat 30-50% • · » tehokkuudella, kun taas sirkkavarret ja varren palaset eivät regeneroituneet ollenkaan. Paras
1 « I
; regeneroitumistehokkuus (100%) saatiin aikaiseksi lehden palasille (Kuva 2.) 2,4- * · dikloorifenoksietikkahappo (2,4-D), gibberelliinit ja hopeanitraattikäsittelyt eivät vaikuttaneet f i · . ‘ ’ *. versojen regeneroitumiseen. Paras regeneraatio saatiin tietyllä auksiini- ja sytokiniini-hormonien i ( · suhteella. Esimerkiksi, paras versojen regeneraatio Calena-lajikkeella saavutettiin käyttämällä 1 • \j mg/1 BAP ja 0.2 mg/1 NAA alustoja, kun Calinca-lajikkeelle optimaalinen yhdistelmä oli 0,7 » · mg/1 BAP ja 0.3 mg/1 NAA.
* * · * > · I » · '·' Regeneraation kautta muodostuneilla versoilla oli taipumus muodostaa kukintoja ja juurtuminen t · * i i
oli ongelmallista. Näiden ongelmien välttämiseksi regeneroituneita versoja kasvatettiin 'AxMS
> > · ‘; alustalla, joille oli lisätty valinnaisesti auksiineja (esim. IAA 1 mg/1).
i · I · 4 · » i6 110009
Useiden tekijöiden vaikutuksia kokeiltiin versojen muodostamisen tehostamiseksi. Optimaaliset | olosuhteet saatiin seuraaville: pH (5.6 - 5.8), sakkaroosipitoisuus (2%), alustan kovettaja (0,7% | agar). Ionien NH4, NO3', K+, Ca2+ konsentraatioiden eikä glukoosin määrän muutoksilla tavallisessa MS-alustassa ollut vaikutusta. Myöskään siirrännäisten viljeleminen B5-alustalla ei | vaikuttanut versojen kasvuun.
Selektio. Agrobakteerin kasvaminen alustoilla estettiin käyttämällä claforania (cefotaxime) (500 mg/1) tai karbenisilliinia (200 mg/1).
' Hpt ja nptll geenit transformaatiovektoreissa tuottavat kasveille vastaavasti resistenssin hygromysiinille ja kanamysiinille. Havaitsimme, että valintapaine (15 - 20 mg/1 antibioottia) ! kannattaa panna toimeen 1-2 viikkoa sen jälkeen, kun Agrobakteeri on pesty pois siirrännäisistä.
Ensimmäiset regeneroituvat primordiat muodostuvat kallukseen muutamia viikkoja lehden palasten leikkauksen jälkeen, ja siirtogeenisen solukon selektio pitäisi tehdä ennen sitä.
Alustavissa kokeissa havaittiin 10-15 mg/1 antibioottia estävän siirrännäisten morfogeneesin. 10 mg/1 hygromysiiniä ei ollut riittävä pitoisuus selektoimaan siirtogeenistä solukkoa. Toisaalta 30 mg/1 tai korkeampi antibioottipitoisuus tappaa siirrännäisen ennen kuin se ehtii muodostaa versoja.
* · • * * * _ ;·, Transformanttien analysointi • · « ·.: Histologinen GUS-testi tehtiin transformoidulle kali ukselle ja lehtisol ukolle. Transformaatiossa * · 1 ’· ” käytettiin intronin sisältävää uidA-geeniä GUS:in ilmentymisen estämiseksi Agrobakteerissa. Se • · · * · '···* mahdollisti, että GUS-aktiivisuus voitiin mitata lähes heti yhteiskasvatuksen päätyttyä. GUS-• · '···' testi tehtiin yleensä viikon kuluttua yhteiskasvatuksen päättymisestä transformaatiota optimoitaessa (Kuva 3.).
* · · * · · • · • : Tulokset kokeista
Camelina sotiva Iaj. Calenan transformaatiomenetelmä Agrobacterium tumefaciens *···’ LBA4404- kannalla, joka sisältää binaariplasmidin pGPTV-HPT uidA intronin ;: * sisältävällä geenillä.
t f · „ 110009 j
Kasvihuoneella kasvaneiden Camelina sahva-kasvien siemenet upotettiin 1 minuutin ajaksi 70% etanoliin ja käsiteltiin tämän jälkeen 10 minuutin ajan Na-hypokloriittiliuoksessa (3% aktiivista | j Cl'), johon oli lisätty Tween-20:a (1 pisara/100 ml). Steriloinnin jälkeen siemenet pestiin kolme kertaa steriilillä vedellä ja asetettiin kiinteälle MS-alustalle (Murashige ja Skoog, 1962) ilman sakkaroosia itämään. Steriloidut siemenet idätettiin ja kasvatettiin 2-3 viikon ajan MS-alustalla ilman hormoneja (Kuva 1). Kasvatettujen kasvien vihreät lehdet toimivat siirrännäisten lähteenä transformaatiossa.
Agrobacterium tumefaciens-kantaa LBA4404, joka sisältää pGPTV-HPT-GUSint vektorin kasvatettiin yli yön +28°C:ssa ravistellen nestemäisessä YEB-alustassa (Liechtenstein ja Draper, 1985), johon oli lisätty 50 mg/1 kanamysiiniä ja 50 mg/1 rifampisiinia. Tämän jälkeen tuore nestemäinen YEB-alusta ympättiin yli yön kasvaneella Agrobakteerilla (1/100 v/v) käyttämällä samoja antibiootteja kuin edellä ja annettiin kasvaa ravistellen yön yli. Agrobakteeri-viljelmä, jonka OD6oo=1 käytettiin transformaatioon.
C. sativa-kasvin kapeat lehdet leikattiin keskeltä vain lehtilavan poikki, kun taas isommat lehdet j leikattiin lisäksi kahtia keskisuonen myötäisesti. Lehden palasia kasvatettiin 24 tunnin ajan 0,7% MS-agarilla, johon oli lisätty 1 mg/1 6-bentsyyhaminopuriinia (BAP) ja 0,2 mg/1 a- naftaleenietikkahappoa (NAA). Kaikkiin käytettyihin MS-alustoihin lisättiin 2% sakkaroosia ja . . in vitro kasvatuksia pidettiin 25°C (päivä) ja 18°C (yö) 16 tunnin valojaksolla Siirrännäiset • « .! upotettiin 1-3 minuutin ajaksi MS-liuokseen, joka oli ympätty (esim. 1/10 v/v) yli yön kasvatetulla A. tumefaciens-kannalla LBA4404. Siirrännäiset kuivattiin steriilin suodatinpaperin päällä ja asetettiin MS-agarille, johon oli lisätty auksiinia ja sytokiniiniä yhteiskasvatukseen Agrobakteerin kanssa 2 vrk:n ajaksi. Yhteiskasvatuksen jälkeen siirrännäiset pestiin vedellä, joka sisälsi claforania (cefotaxime) (700 mg/1) tai karbenisilliinia (700 mg/1). Siirrännäisten • · pinnat kuivattiin pesun jälkeen suodatinpaperin päällä ja ne asetettiin MS-alustalle, joka sisälsi . ·, : hormoneja (0.7 mg/1 BAP, 0.25 mg/1 NAA) ja 200 mg/1 karbenisilliinia tai claforania. 1-2 viikon ,···, kuluttua siirrännäiset vaihdettiin samanlaiselle MS-alustalle, johon oli lisätty 20 mg/1 hygromysiiniä. Kahdesta kolmeen viikkoon vanhat versot (Kuva 2) asetettiin Vz tai normaali-|1j vahvuiselle 0.7% agarilla jähmetetylle MS-alustalle, johon oli lisätty 200 mg/1 karbenisilliinia tai *;* claforania (cefotaxime), 15 mg/1 hygromysiiniä ja valinnaisesti auksiinia (IAA 0.5 - 1 mg/1) ...: juurten muodostumista ja versojen pidentymistä varten. Juurruttamisen jälkeen versot siirrettiin • · · 18 1 10009 multaan ja siirtogeenisten kasvien annettiin kasvaa kasvihuoneolosuhteissa. Siirtogeenistä kasveista testattiin uidA (GUS)-geenin ilmentyminen histologisella GUS-testillä ja siirtogeenin läsnäolo todennettiin Southem-analyysilla.
Lähdeviitteet
Alen, ym., 2000, EU AIR3-CT94-2178. Final report. 70p Becker, ym., 1992, Plant Mol. Biol. 20: 1195-1197
Buchsenshutz-Northdurft, ym. 1996, 3rd European Symposium on Industrial Crops and Products, France
Budin, ym., 1995, JAOCS 72:309-315 Dada, ym., 1993, Plant. Sei. 94: 139-149 Deblaere, ym., 1985, Nucl. Acids Res. 13: 4777-4788 Elomaa, ym., 1993, Bio/Technology 11: 508-511 Friedt, ym.,1994, Vortr. Pflanzenzuchtung 30: 158-172 Hansen, 1997, Crucifer. News 19: 55-56 Hoekema, ym., 1983, Nature (London) 303: 179-180 Hood, 1993, Transgenic Res. 2: 208-218 Knutzon, ym., 1992, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89: 2624-2628 . . Kroll, 1994, J.Agr. & Crop Sei. 173, 17-21
Kuvshinov, ym., 1999, Plant Cell Rep. 18: 773-777 t; t Lichtenstein ja Draper, 1985, In: Glover DM (ed.) DNA Cloning - a practical approach, voi 2.
. , ; Oxford IRL, Oxford, pp 67-119 .···. Matthäus ja Zubr, 2000, Industrial Crops and Products 12: 9-18 . · 1 ♦. Mukhopadhyay, ym., 1992, Plant Cell Rep. 11: 506-551
Murashige, and Skoog, 1962, Physiol. Plant. 15: 472-493 . ·. : Narashimhulu, ym., 1994, Plant Cell Rep. 13:657-660 • · . 1 · ·. Radke, ym., 1992, Plant Cell Rep. 11: 499-505
Shiba, ym., 1995, Proc. Jpn. Acad. Ser. B 71: 81-83 *.!! Sigareva and Earle, 1999, Theor. Appi. Genet. 98:164-170 • · '' 1 Tattersall, and Millam, 1999, Plant Cell Tissue and Organ Culture 55:147-149 • · · · ·: Vancanneyt, ym., 1990, Mol. Gen. Genet. 220: 245-250 is 110009
Zambryski, ym., 1983, EMBO J. 2: 2143-2150
Zubr, 1997, Industrial Crops and Products 6:113-119Zubr, 1998, Sustainable Agriculture for Food, Energy and Industry. James & James Science Publishers Ltd, pp. 682-686 • ·
Claims (18)
1. Menetelmä Agrobakteeri-välitteiseen geneettiseen transformaatioon, tunnettu siitä, että se käsittää vaiheet, joissa a) hankitaan siirrännäisiä Camelina saiivasta; b) saatetaan Camelina sativan siirrännäiset kosketukseen Agrobakteeri-kannan viljelmän kanssa, joka sisältää ainakin yhden rekombinantti-DNA-konstruktin; c) annetaan transformaation tapahtua solukkoviljelmäalustalla, johon on valinnaisesti lisätty ainakin yhtä hormonia; d) valikoidaan Camelina sativan siirtogeeninen solukko valikoivan ainesosan sisältävällä alustalla; e) indusoidaan versojen muodostuminen (versojen regeneraatio) siirtogeenisistä siirrännäisistä solukkoviljelmäalustalla, joka sisältää ainakin yhtä hormonia; ja f) kasvatetaan versot kokonaisiksi Camelina sotiva -kasveiksi.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että Agrobakteeri-kanta on Agrobacterium tumefaciens. • · j
'.· 3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että Camelina .’ sativan siirrännäiset on ympätty A. tumefaciens-viljelmällä.
• ( · • · .···. 4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että Camelina • « · .···. sativan siirrännäiset on valittu sirkkalehdestä, sirkkavarresta, varresta, lehdestä • · · tai muista kasvin osista. » · ·
5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että versojen • · induktio käsittää hormonin tai kasvutekijän käyttämisen saaden aikaan versojen • * · ’···' regeneraation. n»
6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valinnainen , · · ·. hormoni on auksiini tai sytokiniini. 110009
7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sytokiniini on 6-bentsyyliaminopuriini (BAP).
8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että 6- bentsyyliaminopuriini (BAP) on pitoisuutena noin 0.3 -3 mg/1.
9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että auksiini on a-naftaleenietikkahappo (NAA).
10. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että a- naftaleenietikkahappo (NAA) on pitoisuutena noin 0.1 - 0.7 mg/1.
11. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että auksiini on indolyyli-3-etikkahappo (IAA).
12. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että indolyyli-3-etikkahappo (IAA) on valinnaisesti pitoisuutena alle 1.5 mg/1.
13. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valikoiva ainesosa on antibiootti.
. . 14. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että antibiootti on • · kanamysiini tai hygromysiini. • * ·
15. Siirtogeeninen kasvi, tunnettu siitä, että se on patenttivaatimuksen 1 mukaisella • · · ' · ' ’ menetelmällä saatava Camelina sativa. • · t
16. Siirtogeeninen kasvisolukko, tunnettu siitä, että se on patenttivaatimuksen 1 mukaisella menetelmällä saatava Camelina sativa.
,··*, 17. Siirtogeeniset kasvisolut ja solulinjat, tunnettu siitä, että ne ovat patenttivaatimuksen 1 mukaisella menetelmällä saatava Camelina sativa. * * · t * ·
18. Siirtogeeninen siemen, tunnettu siitä, että se on patenttivaatimuksen 1 . |. mukaisella menetelmällä saatava Camelina sativa. 22 1 10009
Priority Applications (11)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FI20002478A FI110009B (fi) | 2000-11-13 | 2000-11-13 | Camelina sativan transformaatiojärjestelmä |
| US10/416,091 US20040031076A1 (en) | 2000-11-13 | 2001-11-12 | Transformation system in camelina sativa |
| EP01982516A EP1334199B1 (en) | 2000-11-13 | 2001-11-12 | A transformation system in camelina sativa |
| CA002427117A CA2427117A1 (en) | 2000-11-13 | 2001-11-12 | A transformation system in camelina sativa |
| AT01982516T ATE516357T1 (de) | 2000-11-13 | 2001-11-12 | Transformationssystem in camelina sativa |
| AU2002214078A AU2002214078A1 (en) | 2000-11-13 | 2001-11-12 | A transformation system in camelina sativa |
| PCT/FI2001/000978 WO2002038779A1 (en) | 2000-11-13 | 2001-11-12 | A transformation system in camelina sativa |
| US12/288,791 US7910803B2 (en) | 2000-11-13 | 2008-10-23 | Transformation in Camelina sativa |
| US12/290,379 US20090151023A1 (en) | 2000-11-13 | 2008-10-30 | Transformation system for Camelina sativa |
| US13/385,329 US20120192318A1 (en) | 2000-11-13 | 2012-02-14 | Transformation system for Camelina sativa |
| US14/173,716 US20140223607A1 (en) | 2000-11-13 | 2014-02-05 | Transformation system in camelina sativa |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FI20002478 | 2000-11-13 | ||
| FI20002478A FI110009B (fi) | 2000-11-13 | 2000-11-13 | Camelina sativan transformaatiojärjestelmä |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI20002478A0 FI20002478A0 (fi) | 2000-11-13 |
| FI20002478A FI20002478A (fi) | 2002-05-14 |
| FI110009B true FI110009B (fi) | 2002-11-15 |
Family
ID=8559479
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI20002478A FI110009B (fi) | 2000-11-13 | 2000-11-13 | Camelina sativan transformaatiojärjestelmä |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (4) | US20040031076A1 (fi) |
| EP (1) | EP1334199B1 (fi) |
| AT (1) | ATE516357T1 (fi) |
| AU (1) | AU2002214078A1 (fi) |
| CA (1) | CA2427117A1 (fi) |
| FI (1) | FI110009B (fi) |
| WO (1) | WO2002038779A1 (fi) |
Families Citing this family (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EA201071114A1 (ru) * | 2008-03-21 | 2011-04-29 | Таргетед Гроут, Инк. | Способ трансформации camelina, основанный на погружении цветков |
| AU2010260518A1 (en) * | 2009-06-15 | 2011-11-03 | Agragen Llc | Herbicide resistant Camelina sativa |
| WO2011038368A1 (en) * | 2009-09-25 | 2011-03-31 | Washington State University | Genetic manipulation of the at-hook domain in plant ahl genes to modulate cell growth |
| EP2697378A4 (en) | 2011-04-11 | 2014-10-01 | Targeted Growth Inc | IDENTIFICATION AND USE OF KRP MUTANTS IN PLANTS |
| AU2013246661B2 (en) | 2012-04-12 | 2018-12-20 | Rothamsted Research Ltd | Production of omega-3 long chain polyunsaturated fatty acids |
| US9439447B2 (en) | 2012-10-23 | 2016-09-13 | Montana State University | Production of high quality durum wheat having increased amylose content |
| US9862962B2 (en) | 2013-03-14 | 2018-01-09 | EG Corp Science, Inc. | Identification and use of tomato genes controlling salt/drought tolerance and fruit sweetness |
| ES2739292T3 (es) | 2013-10-29 | 2020-01-30 | Biotech Inst Llc | Cultivo, producción, procesamiento y uso de cannabis de especialidad |
| EP2868748A1 (en) * | 2013-10-31 | 2015-05-06 | Locusia Oy | A method for protein production in doubled haploid plants |
| CN104067801B (zh) * | 2014-06-17 | 2016-04-13 | 长江大学 | 一种移栽烟草苗动态优势根区的判断方法 |
| WO2015196100A1 (en) * | 2014-06-20 | 2015-12-23 | Donald Danforth Plant Science Center | Constructs and methods for biosynthesis of galanthamine |
| US11859196B2 (en) | 2016-03-15 | 2024-01-02 | National Research Council Of Canada | Modulating drought tolerance in Brassicaceae using the Kanghan gene family |
| WO2017158514A1 (en) | 2016-03-15 | 2017-09-21 | National Research Council Of Canada | Modulating plant abiotic stress responses using the kanghan gene family |
| WO2022093977A1 (en) | 2020-10-30 | 2022-05-05 | Fortiphyte, Inc. | Pathogen resistance in plants |
| US11470796B2 (en) * | 2020-11-16 | 2022-10-18 | Sustainable Oils, Inc. | Camelina sativa variety “SO-90” |
| US11483992B2 (en) * | 2020-11-16 | 2022-11-01 | Sustainable Oils, Inc. | Camelina sativa variety “SO-70” |
| US11632924B2 (en) * | 2020-12-02 | 2023-04-25 | Sustainable Oils, Inc. | Camelina sativa variety “SO-110” |
| US11632923B2 (en) | 2020-12-02 | 2023-04-25 | Sustainable Oils, Inc. | Camelina sativa variety “SO-100” |
| WO2024052856A1 (en) | 2022-09-09 | 2024-03-14 | Friedrich Alexander Universität Erlangen-Nürnberg | Plant regulatory elements and uses thereof |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5188958A (en) | 1986-05-29 | 1993-02-23 | Calgene, Inc. | Transformation and foreign gene expression in brassica species |
| US5750871A (en) | 1986-05-29 | 1998-05-12 | Calgene, Inc. | Transformation and foreign gene expression in Brassica species |
| FI104907B (fi) * | 1997-09-18 | 2000-04-28 | Univ Helsinki Licensing | Rypsin Agrobacterium-välitteinen transformaatio |
| US6117476A (en) | 1999-01-04 | 2000-09-12 | Shaul Eger | Healthy food spreads |
| EP1287151A2 (en) * | 2000-06-07 | 2003-03-05 | North Carolina State University | Method of using dna episomes to suppress gene expression in plants |
-
2000
- 2000-11-13 FI FI20002478A patent/FI110009B/fi not_active IP Right Cessation
-
2001
- 2001-11-12 AU AU2002214078A patent/AU2002214078A1/en not_active Abandoned
- 2001-11-12 US US10/416,091 patent/US20040031076A1/en not_active Abandoned
- 2001-11-12 WO PCT/FI2001/000978 patent/WO2002038779A1/en not_active Application Discontinuation
- 2001-11-12 EP EP01982516A patent/EP1334199B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-11-12 AT AT01982516T patent/ATE516357T1/de not_active IP Right Cessation
- 2001-11-12 CA CA002427117A patent/CA2427117A1/en not_active Abandoned
-
2008
- 2008-10-23 US US12/288,791 patent/US7910803B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2012
- 2012-02-14 US US13/385,329 patent/US20120192318A1/en not_active Abandoned
-
2014
- 2014-02-05 US US14/173,716 patent/US20140223607A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2427117A1 (en) | 2002-05-16 |
| US7910803B2 (en) | 2011-03-22 |
| US20140223607A1 (en) | 2014-08-07 |
| FI20002478A0 (fi) | 2000-11-13 |
| US20120192318A1 (en) | 2012-07-26 |
| ATE516357T1 (de) | 2011-07-15 |
| AU2002214078A1 (en) | 2002-05-21 |
| WO2002038779A1 (en) | 2002-05-16 |
| EP1334199B1 (en) | 2011-07-13 |
| US20040031076A1 (en) | 2004-02-12 |
| FI20002478A (fi) | 2002-05-14 |
| EP1334199A1 (en) | 2003-08-13 |
| US20090151028A1 (en) | 2009-06-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6990653B2 (ja) | 迅速な植物形質転換のための方法および組成物 | |
| US7910803B2 (en) | Transformation in Camelina sativa | |
| US6037522A (en) | Agrobacterium-mediated transformation of monocots | |
| US8093454B2 (en) | Transgene assay using stable agrobacterium rhizogenes transformation | |
| US20090151023A1 (en) | Transformation system for Camelina sativa | |
| Dutt et al. | Effects of antioxidants on Agrobacterium-mediated transformation and accelerated production of transgenic plants of Mexican lime (Citrus aurantifolia Swingle) | |
| US20070006351A1 (en) | Method for regenerating and transforming St. Augustinegrass from embryogenic callus | |
| JPH10117776A (ja) | インディカイネの形質転換方法 | |
| EP0856060A2 (en) | METHODS FOR THE PRODUCTION OF STABLY-TRANSFORMED, FERTILE WHEAT EMPLOYING $i(AGROBACTERIUM)-MEDIATED TRANSFORMATION AND COMPOSITIONS DERIVED THEREFROM | |
| US8697445B2 (en) | Method for plant regeneration of okra | |
| CA2352488A1 (en) | Plant transformation process | |
| CA2320008C (en) | Brassica transformation via microprojectile bombardment | |
| FI104907B (fi) | Rypsin Agrobacterium-välitteinen transformaatio | |
| US20050044595A1 (en) | In planta transformation by embryo imbibition of agrobacterium | |
| Akashi et al. | High-frequency embryogenesis from cotyledons of bird's-foot trefoil (Lotus corniculatus) and its effective utilization in Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation | |
| CA2341781A1 (en) | Methods for producing genetically modified plants, plant materials and plant products produced thereby | |
| Hasnat et al. | Effect of different bacterial dilutions on transformation efficiency of hot chilli (Capsicum frutescens L.) varieties | |
| Curtis | Lettuce (Lactuca sativa L.) | |
| Chopra et al. | In vitro regeneration and sonication assisted Agrobacterium tumefaciens (SAAT) mediated transformation in Indian cultivars of lentil (Lens culinaris Medik.) | |
| JP2009523021A (ja) | 陽性選択に基づくヒマワリおよび脂肪種子の新規で効果的な形質転換法 | |
| KR20070016577A (ko) | 목표유전자의 식물세포 내로의 도입을 증가시키는 방법 | |
| EP1180927A1 (en) | Transformation of allium sp. with agrobacterium using embryogenic callus cultures | |
| Nakano et al. | Production of transgenic plants via Agrobacterium-mediated transformation in Liliaceous ornamentals | |
| Notini | Understanding hormonal and temporal factors associated with tomato (Solanum lycopersicum L. cv. Micro-Tom) acquisition of competence: key concepts for in vitro shoot regeneration | |
| JP2004505887A (ja) | 培養された植物組織からの植物の再生のための材料および方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM | Patent lapsed |