JP2004505887A - 培養された植物組織からの植物の再生のための材料および方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、植物成長に影響を与えるための組成物および方法を提供する。本発明の組成物は、1つ以上のインドール−3−酢酸(IAA)誘導体を含む。いくつかの好ましい実施形態において、本発明の組成物は、IAAの置換された誘導体を含み得る。さらに、本発明は、植物サンプルからの胚形成カルスの生成のための培地、および植物サンプルの再生のための培地を提供する。本発明はまた、培養植物サンプルおよび植物サンプルの再生のためのキットを企図する。
Description
【0001】
(発明の背景)
(発明の分野)
本発明は、農業生物工学の分野に関する。詳細には、本発明は、植物の成長に影響し、そして植物組織または形質転換された植物組織から植物を再分化させる組成物および方法を提供する。
【0002】
(関連技術)
植物成長は、種々の物理的因子または化学的因子によって影響される。物理的因子としては、利用可能な光、日長、水分および温度が挙げられる。化学的因子としては、ミネラル、硝酸塩、コファクター、栄養物質および植物成長調節因子またはホルモン(例えば、オーキシン、サイトカイニンおよびジベレリン)が挙げられる。
【0003】
インドール−3−酢酸(IAA)は、植物中で同定される天然に存在する植物成長ホルモンである。IAAは、インビボおよびインビトロにおける植物中の成長の増加を直接担うことが示されている。IAAによって影響される特徴としては、細胞伸長、節間距離(高さ)、葉の表面積および作物収量が挙げられる。IAAおよびIAAのホルモン調節活性に類似した活性を示す他の化合物が、「オーキシン」と呼ばれる植物成長因子のクラスに含まれる。
【0004】
植物においてオーキシンとして機能することが知られている化合物は、茎伸長を誘導するようにそして根の形成を促進するように作用する、例えば、天然に存在する植物成長調節因子である4−クロロインドール−3−酢酸(4−Cl−IAA)を含む。IAAが、植物の多数の器官において見出される一方で、4−Cl−IAAは、Pisum sativumの未成熟の種子および成熟した種子において存在することが示されていたが、他の器官においては示されていない(Ulvskovら(1992)188:182−189)。いくつかの合成オーキシンとしては、例えば、ナフタレン−1−酢酸(NAA)、5,6−ジクロロ−インドール−3−酢酸(5,6−Cl2−IAA)、4−クロロ−2−メチルフェノキシ酢酸(MCPA);2,4−ジクロロフェノキシ酢酸(2,4D);2,4,5−トリクロロフェノキシ酢酸(2,4,5−T);2−(4−クロロ−2−メチルフェノキシ)プロピオン酸(CMPP);4−(2,4−ジクロロフェノキシ)酪酸(2,4−DB);2,4,5−トリクロロ安息香酸(TBA);および3,5−ジクロロ−2−メトキシ安息香酸(dicamba)が挙げられる。上記の酸全てがそれらの塩およびエステルの形態(例えば、それらのナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、ジメチルアミン塩およびエタノールアミン塩、ならびにそれらの低級アルコールエステル)で活性である。これらの合成オーキシンの多数は、効果的な除草剤として一般に使用されており、そして、これらのいくつかは、処理された植物の形態形成に不利に影響することが公知である。
【0005】
サイトカイニン(例えば、6−フルフリルアミノプリン(カイネチン)および6−ベンジルアミノプリン(BAP))に基づく調製物はまた、成長刺激因子であることが公知である。しかし、サイトカイニンベースの調製物は、オーキシンと組み合わせて、最も効果的である。サイトカイニンが植物の成長周期に影響する機構は、理解されるにはほど遠いが、それらが葉の成長に影響し、そして、特定の植物において加齢を妨げることが明らかである。
【0006】
組織培養および遺伝子操作のような方法を使用する主要作物の植物を首尾良く再生することが、この分野における一般的な目的である。植物組織培養の技術は、長年活発な研究の領域であったが、過去5〜10年にわたって、トウモロコシ、コムギ、イネ、ダイズ、およびワタのような重要な農業作物についての再分化可能な植物組織培養手順を開発するために、強化された科学的努力がなされてきた。
【0007】
インビトロ培養技術が、植物交配で十分に確立されている(Reinert,J.およびBajaj,Y.P.S.編(1977)Plant Cell,Tissue and Organ Culture,Berlin:Springer;Simmonds,N.W.(1979)Principles of Crop Improvement,London:Longman;Vasil,I.K.,Ahuja,M.K.およびVasil,V.(1979)「Plant tissue cultures in genetics and plant breeding」Adv.Genet.20:127−215)。第1に、何十年の間、胚培養は、困難な種間交雑を作製することに対する価値ある補助であった。第2に、より最近のものであるが、十分に確立されているのは、茎頂点培養であり、これは、迅速なクローンの操作、ウイルスフリーのクローンの開発および遺伝子供給源保存作業において用途を見出す。両方の技術は、成長点の組織的な統合性の保持に依存する。別の頻繁に使用される技術は、組織が失われるが、多くの場合で回収され得る植物組織のインビトロ培養を含む。この型の技術の例としては、カルス、細胞、およびプロトプラスト培養を含む。培養された細胞の適用は、インビトロハイブリダイゼーションであり、これは、再分化後、種間複二倍体を生じた。この技術は、従来の手段によって作製され得ない所望の複二倍体を提供し得、そして、そのいくつかの改変体による体細胞組換えの可能性を提供する。上記技術は、広範に使用される(Chaleff,R.S.(1981)Genetics of Higher Plants,Applications of Cell Culture,Cambridge;Cambridge University Press)。
【0008】
植物遺伝子操作技術は、以下の工程を可能にする:(a)特定の遺伝子の同定;(b)この遺伝子の単離およびクローニング;(c)レシピエント植物宿主細胞への遺伝子の移入;(d)レシピエント細胞中のDNAの組み込み、転写および翻訳;ならびに(e)トランスジェニック植物の増殖および使用(T.Kosuge,C.P.MeredithおよびA.Hollaender編(1983)Genetic Engneering of Plants,26:5−25;Rogersら(1988)Methods for Plant Molecular Biology,A.WeissbachおよびH.Weissbach編、Academic Press,Inc.,San Diego,Calif.)。新しく挿入された外来遺伝子は、植物の再分化の間に安定して維持され、そして代表的なメンデル形質として子孫に伝達されることが示されている(Horschら(1984)Science 223:496、およびDeBlockら(1984)EMBO 3:1681)。外来遺伝子は、それらの正常組織の特異的および発生的発現パターンを保持する。
【0009】
成功した形質転換および再分化技術が、多数の植物種について先行技術において示されており、そして、これらの方法を使用して、種々の植物種を遺伝子的に操作する。Agrobacterium tumefaciens媒介形質転換系が、多数の双子葉植物種について効率的であると証明されている。例えば、Bartonら(1983、Cell 32:1033)は、タバコ植物の形質転換および再分化を報告しており、そして、Changら(1994、Planta 5:551−558)は、Arabidopsis thalianaの安定した遺伝子形質転換を報告した。
【0010】
遺伝子移入のためのAgrobacterium方法がまた、単子葉植物(例えば、LiliaceaeおよびAmaryllidaceae科(Hooykaas−Van Slogterenら、1984,Nature 311:763−764)およびDioscorea bulbifera(サツマイモ)(Schaferら、1987,Nature 327:529−532)の植物)に適用された。さらに、Agrobacteriumベースの形質転換方法は、重要な食用作物のイネ(Oryza sativa、Hieiら、Plant Journal,6:271−282,1994を参照のこと)およびトウモロコシ(Zea mays、Ishidaら、Nature Biotechnology,14:745−750,1996を参照のこと)について開発されてきた。
【0011】
食用作物の形質転換は、代替的な方法を用いて(例えば、ポリエチレングリコール(PEG)促進性DNA取り込み(Uchimiyaら(1986)Mol.Gen.Genet.204:204−207)およびエレクトロポレーション(Frommら(1986)Nature 319:791−793)(この両方は、移入標的としてプロトプラストを使用した)によって)得られた。単子葉および双子葉組織は、DNAコーティング粒子による組織のボンバードメントによって形質転換され得る(Wangら(1988)Plant Mol.Biol.11:433−439;Wu,Plant Biotechnology(1989),KungおよびAmtzen編、Butterworth Publishers,Stoneham,Mass)。再分化は、イネ(Abdullahら(1986)Bio/Technology 4:1087−1090)およびトウモロコシ(Rhodesら(1988)Bio/Technology 6:56−60および(1988)Science 240:204−207)において記載されていた。
【0012】
(発明の簡単な要旨)
本発明の主な目的は、1つ以上のインドール−3−酢酸(IAA)誘導体を含む成長影響性組成物を提供することである。本発明の組成物は、種々の植物種において、多数の成長影響性応答を誘導する際に重要な役割を果たす。適切なIAA誘導体は、1996年11月29日に出願された、表題Auxinic Analogues of Indole−3−Acetic Acidの米国特許出願番号08/758,416において記載され、これは、本明細書中に参考文献として詳細に援用される。いくつかの好ましい実施形態において、本発明の組成物は、IAAの置換された誘導体を含み得る。本発明のIAAの誘導体は、IAA分子において1つ以上の置換を含み得る。いくつかの好ましい実施形態において、IAA誘導体は、一置換のIAA分子であり得る。いくつかの好ましい実施形態において、本発明のIAA誘導体は、二置換のIAAであり得る。いくつかの好ましい実施形態において、本発明のIAA誘導体は、多重置換のIAA分子であり得る。この誘導体は、酸、エステル、アミドまたは塩の形態であり得る。いくつかの好ましい実施形態において、本発明は、IAAの2、4、5、6、または7位に置換基を有する一置換IAAを含む成長影響性組成物を意図し、ここで、置換基は、ハロゲン、アルキル基、アルコキシ基、アシル基、およびアシルアミド基または1〜10個の炭素を有するアシルオキシ基であり得る。いくつかの好ましい実施形態において、IAA誘導体は、IAAの2、4、5、6、または7位の2つに置換基を有する二置換IAA誘導体であり得、ここで、置換基は、同一であるかまたは異なり得、そしてハロゲン、アルキル基、アルコキシ基、アシル基、およびアシルアミド基または1〜10個の炭素を有するアシルオキシ基であり得る。いくつかの好ましい実施形態において、IAA誘導体は、IAAの2、4、5、6、または7位の3つ以上に置換基を有する多重置換IAA誘導体であり得、ここで、置換基は、同一であるかまたは異なり得、そしてハロゲン、アルキル基、アルコキシ基、アシル基、およびアシルアミド基または1〜10個の炭素を有するアシルオキシ基であり得る。いくつかの好ましい実施形態において、本発明の組成物は、植物成長影響性応答を達成するために十分な量で、酸、エステル、アミドまたは塩の形態で、IAA誘導体5−ブロモインドール−3−酢酸(5−BrIAA)を含み得る。本発明は、単子葉植物および双子葉植物の両方で成長に影響する5−BrIAAの使用を意図する。
【0013】
植物成長に影響を及ぼすための組成物を提供することもまた本発明の目的であり、この組成物は、植物成長に影響する応答を達成するために、1つ以上のインドール−3−酢酸(IAA)誘導体を、1つ以上のさらなる植物成長調節因子(例えば、オーキシン、サイトカイニン、ジベレリン、アブシジン酸など)との混合物で、様々な植物に対する広範な適用のための限定された割合および濃度で含む。一局面において、この組成物は、1つ以上の一置換IAA誘導体および/または1つ以上の二置換IAA誘導体および/または1つ以上の多置換IAA誘導体、あるいはそれらの混合物を含み得、かつ1つ以上のさらなる植物成長調節因子(例えば、1つ以上のオーキシン、1つ以上のサイトカイニン、1つ以上のジベレリン、1つ以上のアブシジン酸、およびそれらの混合物など)をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、この組成物は、1つ以上の一置換IAA誘導体および/または1つ以上の二置換IAA誘導体および/または1つ以上の多置換IAA誘導体を含み得、かつ(2,4−ジクロロフェノキシ)酢酸(2,4−D)、6−ベンジルアミノプリン(BAP)、アブシン酸(ABA)、ゼアチンリボシド、キネチン、(2−イソペンチル)アデニン(2iP)およびジクマンバ(dicmamba)からなる群から選択される1つ以上の化合物をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、この組成物は、一置換IAA誘導体を含み得、かつ1つ以上のオーキシン、1つ以上のサイトカイニン、1つ以上のジベレリン、1つ以上のアブシジン酸およびそれらの混合物からなる群から選択される少なくとも1つの植物成長調節化合物をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、この組成物は、5−BrIAAを含み得、かつ1つ以上のオーキシン、1つ以上のサイトカイニン、1つ以上のジベレリン、1つ以上のアブシジン酸およびそれらの混合物からなる群から選択される少なくとも1対の植物成長調節化合物をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、この組成物は、5−BrIAAを含み得、かつ2,4−D、BAP、ABA、ゼアチンリボシド、キネチン、2iPおよびジクマンバからなる群から選択される少なくとも1つの化合物をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、この組成物は、5−BrIAA、2,4−D、BAPおよびABAを含み得る。いくつかの実施形態において、この組成物は、5−BrIAA、ゼアチンリボシドおよびABAを含み得る。特定の実施形態において、本発明は、植物の成長に影響を与える、5−BrIAAおよびサイトカイニンを含む組成物で例示される。
【0014】
一局面において、本発明は、1つ以上の一置換IAA誘導体および/または1つ以上の二置換IAA誘導体および/または1つ以上の多置換IAA誘導体、あるいはそれらの混合物を、1つ以上のさらなる植物成長調節因子(例えば、1つ以上のオーキシン、1つ以上のサイトカイニン、1つ以上のジベレリン、1つ以上のアブシジン酸およびそれらの混合物など)と混合することによって形成される組成物を提供する。いくつかの実施形態において、この組成物は、1つ以上の一置換IAA誘導体および/または1つ以上の二置換IAA誘導体および/または1つ以上の多置換IAA誘導体を、2,4−D、BAP、ABA、ゼアチンリボシド、キネチン、2iPおよびジクマンバからなる群から選択される1つ以上の化合物と混合することによって形成され得る。いくつかの実施形態において、この組成物は、一置換IAAを、1つ以上のオーキシン、1つ以上のサイトカイニン、1つ以上のジベレリン、1つ以上のアブシジン酸およびそれらの混合物からなる群から選択される植物成長調節化合物と混合することによって形成され得る。いくつかの実施形態において、この組成物は、5−BrIAAを、1つ以上のオーキシン、1つ以上のサイトカイニン、1つ以上のジベレリン、1つ以上のアブシジン酸およびそれらの混合物からなる群から選択される植物成長調節化合物と混合することによって形成され得る。いくつかの実施形態においてこの組成物は、5−BrIAAを、2,4−D、BAP、ABA、ゼアチンリボシド、キネチン、2iPおよびジクマンバからなる群から選択される植物成長調節化合物と混合することによって形成され得る。いくつかの実施形態において、この組成物は、5−BrIAA、2,4−D、BAPおよびABAを混合することによって形成され得る。いくつかの実施形態において、この組成物は、5−BrIAA、ゼアチンリボシドおよびABAを混合することによって形成され得る。
【0015】
本発明のさらなる目的は、植物成長に影響を与えるための培養培地を提供することであり、この培地は、1つ以上のインドール−3−酢酸(IAA)誘導体、および植物発生または組織再生の間に植物を保持し、またはビヒクルとして働き、それにより1つ以上のインドール−3−酢酸(IAA)誘導体が適用され得る培地の成分としての1つ以上のさらなる植物成長調節因子(例えば、1つ以上のオーキシン、サイトカイニン、ジベレリンおよび/またはアブシジン酸)の混合物を含む。一局面において、この培地は、1つ以上の一置換IAA誘導体および/または1つ以上の二置換IAA誘導体および/または1つ以上の多置換IAA誘導体、あるいはそれらの混合物を含み得、かつ1つ以上のさらなる植物成長調節因子(例えば、1つ以上のオーキシン、1つ以上のサイトカイニン、1つ以上のジベレリン、1つ以上のアブシジン酸およびそれらの混合物など)をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、この培地は、1つ以上の一置換IAA誘導体および/または1つ以上の二置換IAA誘導体および/または1つ以上の多置換IAA誘導体を含み得、かつ2,4−D、BAP、ABA、ゼアチンリボシド、キネチン、2iPおよびジクマンバからなる群から選択される1つ以上の化合物をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、この培地は、一置換IAA誘導体を含み得、かつ1つ以上のオーキシン、1つ以上のサイトカイニン、1つ以上のジベレリン、1つ以上のアブシジン酸およびそれらの混合物からなる群から選択される少なくとも1つの植物成長調節化合物をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、この培地は、5−BrIAAを含み得、かつ1つ以上のオーキシン、1つ以上のサイトカイニン、1つ以上のジベレリン、1つ以上のアブシジン酸およびそれらの混合物からなる群から選択される少なくとも1つの植物成長調節化合物をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、この培地は、5−BrIAAを含み得、かつ2,4−D、BAP、ABA、ゼアチンリボシド、キネチン、2iPおよびジクマンバからなる群から選択される少なくとも1つの化合物をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、この培地は、5−BrIAA、2,4−D、BAPおよびABAを含み得る。いくつかの実施形態において、この培地は、5−BrIAA、ゼアチンリボシドおよびABAを含み得る。特定の実施形態において、本発明は、植物の成長に影響を与える5−BrIAAおよびサイトカイニンを含む組成物で例示される。
【0016】
本発明の目的は、植物サンプルから、カルス、好ましくは胚形成カルスを形成するための培地を提供することである。いくつかの実施形態において、このカルス形成培地は、オーキシン、サイトカイニン、ジベレリンおよびアブシジン酸からなる群から選択されるカルス誘導量の1つ以上の植物成長調節化合物を含み得る。いくつかの好ましい実施形態において、このカルス形成培地は、1つ以上の一置換IAA誘導体および/または1つ以上の二置換IAA誘導体および/または1つ以上の多置換IAA誘導体、あるいはそれらの混合物を含み、かつ1つ以上のさらなる植物成長調節因子(例えば、1つ以上のオーキシン、1つ以上のサイトカイニン、1つ以上のジベレリン、1つ以上のアブシジン酸、およびそれらの混合物など)をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、このカルス形成培地は、1つ以上の一置換IAA誘導体および/または1つ以上の二置換IAA誘導体および/または1つ以上の多置換IAA誘導体を含み得、かつ2,4−D、BAP、ABA、ゼアチンリボシド、キネチン、2iPおよびジクマンバからなる群から選択される1つ以上の化合物をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、このカルス形成培地は、5−BrIAA、および1つ以上のオーキシン、1つ以上のサイトカイニン、1つ以上のジベレリン、1つ以上のアブシジン酸およびそれらの混合物からなる群から選択される植物成長調節化合物を含む。いくつかの実施形態において、このカルス形成培地は、5−BrIAA、および2,4−D、BAP、ABA、ゼアチンリボシド、キネチン、2iPおよびジクマンバからなる群から選択される植物成長調節化合物を含む。いくつかの実施形態において、このカルス形成培地は、5−BrIAA、2,4−D、BAPおよびABAを含む。いくつかの実施形態において、この培地は、5−BrIAAを含み得る。
【0017】
本発明の目的は、植物サンプルの再生のための培地を提供することである。いくつかの実施形態において、この植物サンプルは、カルス、好ましくは、胚形成カルスであり得る。いくつかの実施形態において、この培地は、オーキシン、サイトカイニン、ジベレリンおよびアブシジン酸からなる群から選択される再生誘発量の1つ以上の植物ホルモンを含み得る。いくつかの好ましい実施形態において、この再生培地は、1つ以上の一置換IAA誘導体および/または1つ以上の二置換IAA誘導体および/または1つ以上の多置換IAA誘導体、あるいはそれらの混合物を含み、かつ1つ以上のさらなる植物成長調節因子(例えば、1つ以上のオーキシン、1つ以上のサイトカイニン、1つ以上のジベレリン、1つ以上のアブシジン酸およびそれらの混合物など)をさらに含む。本発明のいくつかの実施形態において、この再生培地は、1つ以上の一置換IAA誘導体および/または1つ以上の二置換IAA誘導体および/または1つ以上の多置換IAA誘導体、およびそれらの混合物を含み得、かつ2,4−D、BAP、ABA、ゼアチンリボシド、キネチン、2iPおよびジクマンバからなる群から選択される1つ以上の化合物をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、この再生培地は、5−BrIAA、ならびに1つ以上のオーキシン、1つ以上のサイトカイニン、1つ以上のジベレリン、1つ以上のアブシジン酸およびそれらの混合物からなる群から選択される植物成長調節化合物を含む。いくつかの実施形態において、この再生培地は、5−BrIAA、ゼアチンリボシドおよびABAを含む。
【0018】
本発明のさらなる目的は、植物成長に影響を与える方法を提供することであり、この方法は、1つ以上の一置換IAA誘導体および/または1つ以上の二置換IAA誘導体および/または1つ以上の多置換IAA誘導体、あるいはそれらの混合物を含み、かつ1つ以上のさらなる植物成長調節因子(例えば、1つ以上のオーキシン、1つ以上のサイトカイニン、1つ以上のジベレリン、1つ以上のアブシジン酸およびそれらの混合物など)をさらに含む、有効量の植物成長影響組成物を、植物サンプルに適用する工程を包含する。本発明のいくつかの実施形態において、この組成物は、1つ以上の一置換IAA誘導体および/または1つ以上の二置換IAA誘導体および/または1つ以上の多置換IAA誘導体、およびそれらの混合物を含み得、かつ2,4−D、BAP、ABA、ゼアチンリボシド、キネチン、2iPおよびジクマンバからなる群から選択される1つ上の化合物をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、この組成物は、5−BrIAA、および1つ以上のオーキシン、1つ以上のサイトカイニン、1つ以上のジベレリン、1つ以上のアブシジン酸およびそれらの混合物からなる群から選択される植物成長調節化合物を含む。特定の実施形態において、本発明は、植物の成長に影響を与える、5−BrIAAおよびサイトカイニンを含む組成物で例示される。いくつかの実施形態において、この方法は、植物サンプルを、植物成長に影響を与える組成物の存在下でインキュベートする工程をさらに包含する。いくつかの実施形態において、この植物サンプルは、植物全体、植物部位、植物細胞、植物組織、植物種子またはそれらのいずれかの一部であり得る。いくつかの好ましい実施形態において、この植物サンプルは、トランスジェニック植物の全体または一部である。
【0019】
植物サンプルから植物を再生する方法であって、植物由来のサンプルを提供する工程、植物サンプルの再生を生じさせる条件下で再生培地と接触させてサンプルを培養する工程、を包含する方法を提供することが、本発明の目的であり、この再生培地は、1種以上の一置換IAA誘導体および/または1種以上の二置換IAA誘導体および/または1種以上の多置換IAA誘導体あるいはそれらの混合物を含み、そしてさらに、1種以上のさらなる植物成長調節因子(例えば、1種以上のオーキシン、1種以上のサイトカイニン、1種以上のジベレリン、1種以上のアブシジン酸、およびそれらの混合物など)を含む。本発明のいくつかの実施形態において、再生培地は、1種以上の一置換IAA誘導体および/または1種以上の二置換IAA誘導体および/または1種以上の多置換IAA誘導体を含み得、そしてさらに、2,4−D、BAP、ABA、ゼアチンリボシド、キネチン、2iPおよびジクマンバからなる群から選択される1以上の化合物を含み得る。いくつかの実施形態において、この再生培地は、5−BrIAAならびに1種以上のオーキシン、1種以上のサイトカイニン、1種以上のジベレリン、1種以上のアブシジン酸、およびそれらの混合物からなる群から選択される、食物成長調節化合物を含む。いくつかの実施形態において、この再生培地は、5−BrIAA、ゼアチンリボシド、およびABAを含む。いくつかの実施形態において、この植物組織サンプルが、成熟植物組織からに由来し得る。適切な植物としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:トウモロコシ、コムギ、モロコシ、サトウダイコン、ジャガイモ、ダイズ、イネおよび食物源として一般に栽培されている他の食物。いくつかの実施形態において、この植物組織は、成熟トウモロコシ種子に由来する。他の実施形態において、この方法は、このサンプルの切取り前に低温で植物をインキュベートする工程をさらに包含し得る。いくつかの実施形態において、この培養工程は、膜ベースの液体培養物中で実施される。
【0020】
分化した植物組織由来の植物を再生する方法であって、植物由来のサンプル(このサンプルは、分化した植物組織を含む)を提供する工程、カルスの形成を生じさせる条件下でカルス形成培地と接触させてサンプルを培養する工程、およびこのカルスから植物を再生させる工程、を包含する方法を提供することが、本発明の目的であり、このカルス形成培地は、1種以上の一置換IAA誘導体および/または1種以上の二置換IAA誘導体および/または1種以上の多置換IAA誘導体あるいはそれらの混合物を含み、そしてさらに、1種以上のさらなる植物成長調節因子(例えば、1種以上のオーキシン、1種以上のサイトカイニン、1種以上のジベレリン、1種以上のアブシジン酸、およびそれらの混合物など)を含む。いくつかの実施形態において、カルス形成培地は、1種以上の一置換IAA誘導体および/または1種以上の二置換IAA誘導体および/または1種以上の多置換IAA誘導体を含み得、そしてさらに、2,4−D、BAP、ABA、ゼアチンリボシド、キネチン、2iPおよびジクマンバからなる群から選択される1以上の化合物を含み得る。いくつかの実施形態において、このカルス形成培地は、5−BrIAA、ならびに1種以上のオーキシン、1種以上のサイトカイニン、1種以上のジベレリン、1種以上のアブシジン酸、およびそれらの混合物からなる群から選択される、植物成長調節化合物を含む。いくつかの実施形態において、このカルス形成培地は、5−BrIAA、ならびに2,4−D、BAP、ABA、ゼアチンリボシド、キネチン、2iPおよびジクマンバからなる群から選択される植物成長調節化合物を含む。いくつかの実施形態において、カルス形成培地は、5−BrIAA、2,4−D、BAPおよびABAを含む。いくつかの実施形態において、この方法は、カルスの再生を生じさせる条件下で再生培地にカルスを移動させる工程をさらに包含し得、この再生培地は、1種以上の一置換IAA誘導体および/または1種以上の二置換IAA誘導体および/または1種以上の多置換IAA誘導体あるいはそれらの混合物を含み、そしてさらに、1種以上のさらなる植物成長調節因子(例えば、1種以上のオーキシン、1種以上のサイトカイニン、1種以上のジベレリン、1種以上のアブシジン酸、およびそれらの混合物など)を含む。本発明のいくつかの実施形態において、再生培地は、1種以上の一置換IAA誘導体および/または1種以上の二置換IAA誘導体および/または1種以上の多置換IAA誘導体ならびにそれらの混合物を含み得、そしてさらに、2,4−D、BAP、ABA、ゼアチンリボシド、キネチン、2iPおよびジクマンバからなる群から選択される1以上の化合物を含み得る。いくつかの実施形態において、再生培地は、5−BrIAA、ならびに1種以上のオーキシン、1種以上のサイトカイニン、1種以上のジベレリン、1種以上のアブシジン酸、およびそれらの混合物からなる群から選択される植物成長調節化合物を含む。いくつかの実施形態において、この再生培地は、5−BrIAA、ゼアチンリボシド、およびABAを含む。いくつかの実施形態において、このカルス形成培地は、再生培地と異なる。いくつかの実施形態において、この植物サンプルは、成熟植物組織に由来し得る。適切な植物としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:トウモロコシ、コムギ、モロコシ、サトウダイコン、ジャガイモ、ダイズ、イネおよび一般に栽培されている他の食物。いくつかの実施形態において、この植物サンプルは、成熟トウモロコシ種子の全てまたは一部を含み得る。いくつかの実施形態において、この方法は、この再生培地にカルスを移動させる前に、カルスを増幅するさらなる工程を含み得る。他の実施形態において、この方法は、サンプルを切除する前に、低温で植物組織をインキュベートする工程をさらに包含し得る。いくつかの実施形態において、低温は、約0℃〜約20℃、好ましくは、約0℃〜約10℃、より好ましくは、約0℃〜約5℃、そして最も好ましくは、約4℃であり得る。いくつかの実施形態において、この培養工程は、膜ベースの液体培養物中で実施される。
【0021】
植物サンプル由来の胚形成カルスの生成のための方法を提供することが、本発明の目的である。いくつかの実施形態において、この方法は、植物サンプルを提供する工程、1種以上の一置換IAA誘導体および/または1種以上の二置換IAA誘導体および/または1種以上の多置換IAA誘導体あるいはそれらの混合物、およびさらに1種以上のさらなる植物成長調節因子(例えば、1種以上のオーキシン、1種以上のサイトカイニン、1種以上のジベレリン、1種以上のアブシジン酸、およびそれらの混合物など)を含む組成物と植物サンプルを接触させる工程、ならびに胚形成カルスの形成を生じさせる条件下でサンプルを培養する工程を包含する。いくつかの実施形態において、この組成物は、1種以上の一置換IAA誘導体および/または1種以上の二置換IAA誘導体および/または1種以上の多置換IAA誘導体を含み得、そして2,4−D、BAP、ABA、ゼアチンリボシド、キネチン、2iPおよびジクマンバからなる群から選択される、1以上の化合物をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、この組成物は、5−BrIAAならびに1種以上のオーキシン、1種以上のサイトカイニン、1種以上のジベレリン、1種以上のアブシジン酸、およびそれらの混合物からなる群から選択される植物成長調節化合物をさらに含む。いくつかの実施形態において、この組成物は、5−BrIAAならびに2,4−D、BAP、ABA、ゼアチンリボシド、キネチン、2iPおよびジクマンバからなる群から選択される植物成長調節化合物を含む。いくつかの実施形態において、この組成物は、5−BrIAA、2,4−D、BAPおよびABAを含む。いくつかの好ましい実施形態において、この組成物は、5−BrIAAを含み得る。いくつかの実施形態において、このサンプルは、成熟植物に由来し得る。適切な植物としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:トウモロコシ、コムギ、モロコシ、サトウダイコン、ジャガイモ、ダイズ、イネおよび一般に栽培されている他の食物。いくつかの実施形態において、植物サンプルは、トウモロコシに由来し得る。いくつかの実施形態において、このサンプルは、種子、または種子の一部である。いくつかの実施形態において、この植物サンプルは、トウモロコシ種子に由来し得る。いくつかの実施形態において、この植物サンプルは、B73、H99およびPA91からなる群から選択されるトウモロコシ変種由来の種子または種子の一部であり得る。
【0022】
植物サンプルからの胚形成カルスの生成のための方法を提供することが、本発明の目的であり、ここで、この方法は、植物サンプルを提供する工程、低温でサンプルをインキュベートする工程、カルス形成培地の存在下で植物サンプルを培養する工程、およびカルスからの植物を再生する工程を包含し、ここで、このカルス形成培地は、1種以上の一置換IAA誘導体および/または1種以上の二置換IAA誘導体および/または1種以上の多置換IAA誘導体あるいはそれらの混合物、およびさらに、1種以上のさらなる植物成長調節因子(例えば、1種以上のオーキシン、1種以上のサイトカイニン、1種以上のジベレリン、1種以上のアブシジン酸、およびそれらの混合物など)を含む。いくつかの実施形態において、カルス形成培地は、1種以上の一置換IAA誘導体および/または1種以上の二置換IAA誘導体および/または1種以上の多置換IAA誘導体を含み得、そしてさらに、2,4−D、BAP、ABA、ゼアチンリボシド、キネチン、2iPおよびジクマンバからなる群から選択される1以上の化合物を含み得る。いくつかの実施形態において、このカルス形成培地は、5−BrIAA、ならびに1種以上のオーキシン、1種以上のサイトカイニン、1種以上のジベレリン、1種以上のアブシジン酸、およびそれらの混合物を含む。いくつかの実施形態において、このカルス形成培地は、5−BrIAA、ならびに2,4−D、BAP、ABA、ゼアチンリボシド、キネチン、2iPおよびジクマンバからなる群から選択される植物成長調節化合物を含む。いくつかの実施形態において、このカルス形成培地は、5−BrIAA、2,4−D、BAP、およびABAを含む。いくつかの好ましい実施形態において、この培地は、5−BrIAAを含み得る。いくつかの実施形態において、このサンプルの一部は、サンプルが低温でインキュベートされた後に、切取られそして培養され得る。いくつかの実施形態において、低温は、約0℃〜約20℃、好ましくは、約0℃〜約10℃、より好ましくは、約0℃〜約5℃、そして最も好ましくは、約4℃であり得る。いくつかの実施形態において、この植物サンプルは、成熟植物由来であり得る。適切な植物としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:トウモロコシ、コムギ、モロコシ、サトウダイコン、ジャガイモ、ダイズ、イネおよび一般に栽培されている他の食物。いくつかの実施形態において、この植物サンプルは、トウモロコシ由来であり得る。いくつかの実施形態において、この植物サンプルは、種子または種子の一部である。いくつかの実施形態において、この植物サンプルは、トウモロコシ種子に由来し得る。いくつかの実施形態において、この植物サンプルは、B73、H99およびPA91からなる群から選択されるトウモロコシの変種由来であり得る。いくつかの実施形態において、インキュベーション工程は、4℃で約1日〜10間実施され得る。いくつかの実施形態において、このインキュベーション工程は、4日間実施され得る。
【0023】
カルスから苗条を再生する方法あって、再生培地とカルスとを接触させる工程およびこのカルスから苗条の再生を生じさせる条件下でカルスをインキュベートする工程、を包含する方法を提供することが、本発明の目的である。いくつかの実施形態において、この培地は、オーキシン、サイトカイニン、ジベレリンおよびアブシジン酸からなる群から選択される、再生誘導量の1以上の植物ホルモンを含み得る。いくつかの好ましい実施形態において、この再生培地は、1種以上の一置換IAA誘導体および/または1種以上の二置換IAA誘導体および/または1種以上の多置換IAA誘導体あるいはそれらの混合物を含み、そしてさらに、1種以上のさらなる植物成長調節因子(例えば、1種以上のオーキシン、1種以上のサイトカイニン、1種以上のジベレリン、1種以上のアブシジン酸、およびそれらの混合物など)を含む。本発明のいくつかの実施形態において、この再生培地は、1種以上の一置換IAA誘導体および/または1種以上の二置換IAA誘導体および/または1種以上の多置換IAA誘導体およびそれらの混合物を含み得、そしてさらに、2,4−D、BAP、ABA、ゼアチンリボシド、キネチン、2iPおよびジクマンバからなる群から選択される1以上の化合物を含み得る。いくつかの実施形態において、この再生培地は、5−BrIAA、ならびに1種以上のオーキシン、1種以上のサイトカイニン、1種以上のジベレリン、1種以上のアブシジン酸、およびそれらの混合物からなる群から選択される植物成長調節化合物を含む。いくつかの実施形態において、この再生培地は、5−BrIAA、ゼアチンリボシド、およびABAを含む。いくつかの実施形態において、このカルスは、成熟植物由来であり得る。適切な植物としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:トウモロコシ、コムギ、モロコシ、サトウダイコン、ジャガイモ、ダイズ、イネおよび一般に栽培されている他の食物。いくつかの実施形態において、このカルスは、トウモロコシ由来であり得る。いくつかの実施形態において、このカルスは、種子または種子の一部由来であり得る。いくつかの実施形態において、このカルスは、トウモロコシ種子由来であり得る。いくつかの実施形態において、このカルスは、B73、H99およびPA91からなる群から選択される、トウモロコシ変種由来であり得る。
【0024】
形質転換植物の再生のための方法を提供することが本発明の目的であり、この方法は、植物サンプルを提供する工程、カルス形成培地の存在下で植物サンプルを培養する工程であって、このカルス形成培地が、1つ以上のモノ置換IAA誘導体および/または1つ以上のジ置換IAA誘導体および/または1つ以上の多置換IAA誘導体またはこれらの混合物を含み、そして胚形成カルスを産生するために、1つ以上のさらなる植物成長調節因子(例えば、1つ以上のオーキシン、1つ以上のサイトカイニン、1つ以上のジベレリン、1つ以上のアブシジン酸およびこれらの混合物など)をさらに含む工程、このカルスを形質転換する工程およびカルスの再生を引き起こす条件下でこの形質転換されたカルスをインキュベートする工程を包含する。いくつかの実施形態において、カルス形成培地は、1つ以上のモノ置換IAA誘導体および/または1つ以上のジ置換IAA誘導体および/または1つ以上の多置換IAA誘導体を含み得、そして2,4−D、BAP、ABA、ゼアチンリボシド、キネチン、2iP、およびジクマンバ(dicmamba)からなる群より選択される1つ以上の化合物をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、カルス形成培地は、5−BrIAAならびに1つ以上のオーキシン、1つ以上のサイトカイニン、1つ以上のジベレリン、1つ以上のアブシジン酸およびこれらの混合物からなる群より選択される植物成長調節化合物を含む。いくつかの実施形態において、カルス形成培地は、5−BrIAAならびに2,4−D、BAP、ABA、ゼアチンリボシド、キネチン、2iP、およびジクマンバからなる群より選択される植物成長調節化合物を含む。いくつかの実施形態において、カルス形成培地は、5−BrIAA、2,4−D、BAPおよびABAを含む。いくつかの実施形態において、この方法は、さらに、カルスの再生を引き起こす条件下でカルスを再生培地に移す工程を包含し、この再生培地は、1つ以上のモノ置換IAA誘導体および/または1つ以上のジ置換IAA誘導体および/または1つ以上の多置換IAA誘導体またはこれらの混合物を含み、そして1つ以上のさらなる植物成長調節因子(例えば、1つ以上のオーキシン、1つ以上のサイトカイニン、1つ以上のジベレリン、1つ以上のアブシジン酸およびこれらの混合物など)をさらに含む。本発明のいくつかの実施形態において、再生培地は、1つ以上のモノ置換IAA誘導体および/または1つ以上のジ置換IAA誘導体および/または1つ以上の多置換IAA誘導体およびこれらの混合物を含み、そして2,4−D、BAP、ABA、ゼアチンリボシド、キネチン、2iP、およびジクマンバからなる群より選択される1つ以上の化合物をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、再生培地は、5−BrIAAならびに1つ以上のオーキシン、1つ以上のサイトカイニン、1つ以上のジベレリン、1つ以上のアブシジン酸およびこれらの混合物からなる群より選択される植物成長調節化合物を含む。いくつかの実施形態において、再生培地は、5−BrIAA、ゼアチンリボシド、およびABAを含む。いくつかの実施形態において、カルス形成培地は、再生培地とは異なる。いくつかの実施形態において、植物組織サンプルは、成熟植物組織から誘導され得る。適切な植物としては、限定しないが、トウモロコシ、コムギ、モロコシ、サトウダイコン、ジャガイモ、ダイズ、イネ、および通常栽培される他の植物が挙げられる。いくつかの実施形態において、植物サンプルは、トウモロコシから誘導され得る。いくつかの実施形態において、植物サンプルは、種子または種子の一部分であり得る。いくつかの実施形態において、植物サンプルは、トウモロコシの種子から誘導され得る。いくつかの実施形態において、植物サンプルは、B73、H99、およびPA91からなる群より選択されるトウモロコシの品種由来の種子または種子の一部であり得る。いくつかの実施形態において、この方法は、カルスを再生培地に移す前にこのカルスを増幅させるさらなる工程を包含し得る。他の実施形態において、この方法は、さらに、サンプルの切除の前に低下した温度で植物組織をインキュベートする工程を包含し得る。いくつかの実施形態において、低下した温度は、約0℃〜約20℃、好ましくは約0℃〜約10℃、より好ましくは約0℃〜約5℃、そして最も好ましくは約4℃であり得る。いくつかの実施形態において、1つ以上の工程が、膜に基づく液体培養物中で実行される。
【0025】
形質転換植物の再生のための方法を提供することが本発明の目的であり、この方法は、植物サンプルを提供する工程、植物サンプルを形質転換する工程、ならびにこの植物サンプルをカルス形成培地の存在下で培養して形質転換されたカルスを生成する工程であって、このカルス形成培地が、1つ以上のモノ置換IAA誘導体および/または1つ以上のジ置換IAA誘導体および/または1つ以上の多置換IAA誘導体またはこれらの混合物を含み、そして1つ以上のさらなる植物成長調節因子(例えば、1つ以上のオーキシン、1つ以上のサイトカイニン、1つ以上のジベレリン、1つ以上のアブシジン酸およびこれらの混合物など)をさらに含む工程、ならびにこのカルスの再生を引き起こす条件下でこの形質転換されたカルスをインキュベートする工程を包含する。いくつかの実施形態において、カルス形成培地は、1つ以上のモノ置換IAA誘導体および/または1つ以上のジ置換IAA誘導体および/または1つ以上の多置換IAA誘導体を含み得、そして2,4−D、BAP、ABA、ゼアチンリボシド、キネチン、2iP、およびジクマンバからなる群より選択される1つ以上の化合物をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、カルス形成培地は、5−BrIAAならびに1つ以上のオーキシン、1つ以上のサイトカイニン、1つ以上のジベレリン、1つ以上のアブシジン酸およびこれらの混合物からなる群より選択される植物成長調節化合物を含む。いくつかの実施形態において、カルス形成培地は、5−BrIAAならびに2,4−D、BAP、ABA、ゼアチンリボシド、キネチン、2iP、およびジクマンバからなる群より選択される植物成長調節化合物を含む。いくつかの実施形態において、カルス形成培地は、5−BrIAA、2,4−D、BAPおよびABAを含む。いくつかの実施形態において、この方法は、さらに、カルスの再生を引き起こす条件下でカルスを再生培地に移す工程を包含し、この再生培地は、1つ以上のモノ置換IAA誘導体および/または1つ以上のジ置換IAA誘導体および/または1つ以上の多置換IAA誘導体またはこれらの混合物を含み、そして1つ以上のさらなる植物成長調節因子(例えば、1つ以上のオーキシン、1つ以上のサイトカイニン、1つ以上のジベレリン、1つ以上のアブシジン酸およびこれらの混合物など)をさらに含む。本発明のいくつかの実施形態において、再生培地は、1つ以上のモノ置換IAA誘導体および/または1つ以上のジ置換IAA誘導体および/または1つ以上の多置換IAA誘導体およびこれらの混合物を含み得、そして2,4−D、BAP、ABA、ゼアチンリボシド、キネチン、2iP、およびジクマンバからなる群より選択される1つ以上の化合物をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、再生培地は、5−BrIAAならびに1つ以上のオーキシン、1つ以上のサイトカイニン、1つ以上のジベレリン、1つ以上のアブシジン酸およびこれらの混合物からなる群より選択される植物成長調節化合物を含む。いくつかの実施形態において、再生培地は、5−BrIAA、ゼアチンリボシド、およびABAを含む。いくつかの実施形態において、カルス形成培地は、再生培地とは異なる。いくつかの実施形態において、植物組織サンプルは、成熟植物組織から誘導され得る。適切な植物としては、限定しないが、トウモロコシ、コムギ、モロコシ、サトウダイコン、ジャガイモ、ダイズ、イネ、および通常栽培される他の植物が挙げられる。いくつかの実施形態において、植物サンプルは、トウモロコシから誘導され得る。いくつかの実施形態において、植物サンプルは、種子または種子の一部分であり得る。いくつかの実施形態において、植物サンプルは、トウモロコシの種子から誘導され得る。いくつかの実施形態において、植物サンプルは、B73、H99、およびPA91からなる群より選択されるトウモロコシの品種由来の種子または種子の一部であり得る。いくつかの実施形態において、この方法は、カルスを再生培地に移す前にこのカルスを増幅させるさらなる工程を包含し得る。他の実施形態において、この方法は、さらに、サンプルの切除の前に低下した温度で植物組織をインキュベートする工程を包含し得る。いくつかの実施形態において、低下した温度は、約0℃〜約20℃、好ましくは約0℃〜約10℃、より好ましくは約0℃〜約5℃、そして最も好ましくは約4℃であり得る。いくつかの実施形態において、1つ以上の工程が、膜に基づく液体培養物中で実行される。
【0026】
形質転換植物の再生のための方法を提供することが本発明の目的であり、この方法は、植物サンプルを提供する工程、植物サンプルを形質転換する工程、ならびにこの植物サンプルを再生培地(1つ以上のモノ置換IAA誘導体および/または1つ以上のジ置換IAA誘導体および/または1つ以上の多置換IAA誘導体またはこれらの混合物を含み、そして1つ以上のさらなる植物成長調節因子(例えば、1つ以上のオーキシン、1つ以上のサイトカイニン、1つ以上のジベレリン、1つ以上のアブシジン酸およびこれらの混合物など)をさらに含む)の存在下で培養する工程を包含する。本発明のいくつかの実施形態において、再生培地は、1つ以上のモノ置換IAA誘導体および/または1つ以上のジ置換IAA誘導体および/または1つ以上の多置換IAA誘導体およびこれらの混合物を含み得、そして2,4−D、BAP、ABA、ゼアチンリボシド、キネチン、2iP、およびジクマンバからなる群より選択される1つ以上の化合物をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、再生培地は、5−BrIAAならびに1つ以上のオーキシン、1つ以上のサイトカイニン、1つ以上のジベレリン、1つ以上のアブシジン酸およびこれらの混合物からなる群より選択される植物成長調節化合物を含む。いくつかの実施形態において、再生培地は、5−BrIAA、ゼアチンリボシドおよびABAを含む。いくつかの実施形態において、植物組織サンプルは、成熟植物組織から誘導され得る。適切な植物としては、限定しないが、トウモロコシ、コムギ、モロコシ、サトウダイコン、ジャガイモ、ダイズ、イネ、および通常栽培される他の植物が挙げられる。いくつかの実施形態において、植物サンプルは、トウモロコシから誘導され得る。いくつかの実施形態において、植物サンプルは、種子または種子の一部分であり得る。いくつかの実施形態において、植物サンプルは、トウモロコシの種子から誘導され得る。いくつかの実施形態において、植物サンプルは、B73、H99、およびPA91からなる群より選択されるトウモロコシの品種由来の種子または種子の一部であり得る。他の実施形態において、この方法は、さらに、サンプルの切除の前に低下した温度で植物組織をインキュベートする工程を包含し得る。いくつかの実施形態において、低下した温度は、約0℃〜約20℃、好ましくは約0℃〜約10℃、より好ましくは約0℃〜約5℃、そして最も好ましくは約4℃であり得る。いくつかの実施形態において、1つ以上の工程が、膜に基づく液体培養物中で実行される。
【0027】
本発明はまた、本発明の方法を実行するためのキットに関し、特に、カルス(好ましくは、胚形成カルス)を再生する際における使用のためのキットに関する。いくつかの好ましい実施形態において、本発明は、植物サンプルの形質転換および/または再生のためのキットを提供し得る。このようなキットは、1つ以上の容器、1つ以上の培地形成処方物、固体支持体(例えば、膜および/または寒天)を含み得る。このようなキットは、必要に応じて、1つ以上の適切な緩衝液、1つ以上のサイトカイニン、および1つ以上のオーキシンからなる群より選択される1つ以上のさらなる成分を含み得る。
【0028】
本発明の他の好ましい実施形態は、以下の図面、本発明の記載を考慮して、そして特許請求の範囲を考慮して、当業者に明かである。
【0029】
(発明の詳細な説明)
(定義)
以下の記載において、生物工学の当業者によって通常使用される多数の用語が広範に使用される。明細書および特許請求の範囲(このような用語に与えられる範囲を含む)の明確かつより一貫した理解を提供するために、以下の定義が提供される。
【0030】
本明細書中で使用される用語IAA誘導体または5−ブロモインドール−3−酢酸または5−BrIAAは、遊離酸形態だけではなく、IAA誘導体または5−BrIAAのアミド、エステル、または塩の形態をいう。適切なIAA誘導体は、1996年11月29日に出願されたAuxinic Analogues of Indole−3−Acetic Acidと題された米国特許出願第08/758,416号(本明細書中において参考として具体的に援用される)に記載される。IAA誘導体または5−BrIAAの意味には、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、ジメチルアミン、エタノールアミンなどの塩およびアミドおよび低級アルキルエステルのような、塩およびエステル誘導体を含む。
【0031】
本明細書中に使用される場合、用語「植物成長調節因子」または「ホルモン」は、植物の成長に影響を与えるホルモンとして作用する天然に存在する化合物または合成化合物をいう。重要な成長調節因子は、オーキシン、サイトカイニン、アブシジン酸およびジベレリンによって例示される。
【0032】
用語「オーキシン」は、本明細書中に使用される場合、植物の成長に影響を与える植物成長調節因子をいう。オーキシンは、例えば、インドール−3−酢酸(IAA)、インドール−3−酪酸(IBA)、2,4−ジクロロフェノキシ酢酸(2,4−D)、ナフタレン酢酸(NAA)、5,6−ジクロロインドール−3−酢酸(5,6−Cl2−IAA)などの化合物によって例示される。
【0033】
用語「サイトカイニン」は、本明細書中に使用される場合、植物の成長に影響を与える植物成長調節因子をいう。サイトカイニンは、例えば、6−ベンジルアミノプリン(BAP)、N6(Δ2−イソペンテニル)アデニン(2iP)、イソペンテニルピロリン酸(ipp)、6−(4−ヒドロキシ−3−メチル−2−トランスブテニルアミノ)プリン(ゼアチン)、6−フルフリルアミノプリン(キネチン)などの化合物によって例示される。化合物は、バイオアッセイを用いてオーキシン活性に関して試験され得る(例えば、Avena sativaの子葉鞘の伸長(Bottgerら(1978)Planta 140:89)またはハクサイの根の成長阻害(Marumoら(1974)Plant Growth Substance,419頁,Hirokawa Publishing Co.,Inc.,Tokyo)または緑豆の胚軸膨張(Marumoら(1974)前出)。サイトカイニン活性は、当該分野で周知であるような植物の成長促進を評価するために設計されたアッセイ(例えば、タバコアッセイなど)において測定され得る(Skoogら(1967)Phytochem 6:1169−1192;Morris(1986)Ann.Rev.Plant Physiol.37:509−538;Horgan(1984)Advanced Plant Physiol.(Wilkins,M.B.編)53−75頁,Pitman Publishing,London;LethamおよびPalni(1983)Ann.Rev.Plant Physiol.34:163−197;ならびにChen(1981)Metabolism and Molecular Activities of Cytokinins(Guern,J.およびPeaud−Lenoel,C.編,Springer,New York,34−43頁)。サイトカイニン/オーキシンの濃度比のバリエーションは、植物の成長の増殖を特定の組織で優先的に生じさせる。例えば、高いサイトカイニン/オーキシン比は、苗条の成長を促進し、オーキシンに対して低いサイトカイニンの比は、根の成長を促進する(Depickerら(1983)Genetic Engineering of Plants、T.Kosunge,C.P.MeredithおよびA.Hollaender編、Plenum Press,New York,154頁)。
【0034】
用語「培地」または「培養培地」は、本明細書中に使用される場合、生育力を維持し、植物サンプルの成長および/または再生を支持し得る組成物をいう。一般的に使用される培地としては、MS培地(Life Technologies,Inc.Rockville,MDから市販される)およびN6培地(Sigma,St.Louis,MOから市販される)が挙げられる。
【0035】
用語「植物サンプル」は、本明細書中に使用される場合、全体の植物または植物の一部をいう。この用語は、植物の部位、植物の細胞、植物の組織、外植片、植物の種子、または植物の種子の一部を含むようであるが、これらに限定されない。この用語はさらに、懸濁培養物または組織培養物の形態の植物(カルス、プロトプラスト、胚、器官、オルガネラなどの培養物が挙げられるが、これらに限定されない)を意図する。
【0036】
植物、植物サンプルおよび/または植物組織に関する場合の用語「形質転換した(形質転換された)」は、本明細書中に使用される場合、植物、植物サンプルおよび/または植物組織への外来核酸の導入をいう。外来核酸は、DNA、RNA、DNAおよびRNAの混合物または1つ以上の分子がリボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドの両方を含むハイブリッドであり得る。
【0037】
用語「トランスジェニック植物」または「トランスジェニック植物組織」は、本明細書中に使用される場合、個々の植物細胞に導入される外来核酸分子を用いて安定に形質転換された、植物または植物組織をいう。
【0038】
用語「発現」は、DNA分子からのRNAの合成をいう。一過性発現は、有限期間のみ生じる発現である。一般的に、一過性発現は、DNAの導入直後に宿主細胞に導入されたDNA分子から生じる発現をいうために使用される。
【0039】
用語「遺伝子操作」は、本明細書中に使用される場合、外来(しばしばキメラの)遺伝子の、生存した全体の植物に再生し得る1つ以上の植物細胞への導入をいう。従って、いくつかの場合、生成された植物は、自己授粉するか、または同じ種の別の植物と交雑授粉され得、その結果、生殖細胞系に保有される外来遺伝子は、農業的に有用な植物品種に導入されるかまたはこれに交配され得る。
【0040】
用語「再生」は、本明細書中に使用される場合、培養植物サンプルまたは培養植物単位(例えば、葉のディスク(leaf disc)、種子など)からの、少なくとも1つの新規に発生または再生された植物組織(例えば、根、苗条、カルスなど)の生成をいう。
【0041】
用語「再生の割合」「%再生」または「再生率」は、本明細書中に使用される場合、組織培養された植物単位の総数の百分率としての、少なくとも1つの新規に発生または再生された組織を生成する組織培養された植物単位の数をいう(例えば、(新規に発生した組織を有する植物単位の数/植物単位の総数)×100)。
【0042】
用語「植物成長に影響を与える(こと)」または「増殖に影響を与える(こと)」または「影響を与える因子(affector)」または「影響」は、本明細書中に使用される場合、成長調節因子の非存在下で観察されることに対して、全体的な植物成長のいくつかの特徴を改善または変化させる多数の植物応答のうちの任意の1つをいい、これには、発根を含む種子の出芽刺激、苗条の抑制、細胞増殖の促進、カルス成長の刺激などが挙げられる、これらに限定されない。
【0043】
用語「有効量」は、本明細書中に使用される場合、植物に投与される植物成長調節因子またはホルモンである化合物が種々の植物成長応答のうちの1つ以上を刺激または引き起こすような、この化合物の量または濃度をいう。植物成長応答としては、幹の伸長の誘導、根の形成の促進、カルス形成の刺激、葉の成長の増強、種子の出芽刺激、多数の植物および植物の一部の乾燥重量含有量の増加などが挙げられるが、これらに限定されない。
【0044】
句「膜に基づく液体培養」とは、本明細書中に使用される場合、植物サンプルを培養する方法をいい、ここで、サンプルは、液体培地の頂部でフロートによって支持される膜の頂部に配置される。この技術のより詳細な議論は、Linら,In vitro,31:30A(1995)およびLinら,Focus 17(3):95(1995)に提供される。この技術は、Life Technologies,Inc.Rockville MDから市販される試薬および装置を用いて実行され得る。
【0045】
本発明は、IAA誘導体(特に5−BrIAA)が、植物成長に影響を与える化合物としての有用性を有するという発見に関する。5−BrIAAは、単子葉植物および双子葉植物の両方においてオーキシンとして機能する際にIAAよりも優れていることが見いだされた。従って、本発明は、少なくとも1つのIAA誘導体を含む植物の成長に影響を与えるための新規組成物を意図する。いくつかの実施形態において、本発明の新規組成物は、5−BrIAAを含む。
【0046】
いくつかの好ましい実施形態において、本発明の新規組成物の成長効果は、植物組織からの胚発生カルスの生成を刺激することである。例えば、5−BrIAAは、Arabidopsis thaliana由来の緑色カルスの再生を刺激する際に、IAAよりも2倍と4倍との間でより有効であった。Arabidopsis組織培養の応答に関する先行技術の教示である「カルス誘導および再生の頻度は、根に関して高く、葯および幹に関して低く、そして葉の外植片に関して最も低い」ということを考慮すると、5−BrIAAの効果はいっそう顕著である。本発明に従って、5−BrIAAは、Arabidopsis thalianaの葉からの再生に関して100%の効率を提供する(米国特許第5,674,731号を参照のこと)。
【0047】
いくつかの好ましい実施形態において、本発明の新規組成物の成長効果は、植物サンプルの再生の刺激であり得る。本発明の組成物は、植物サンプルの再生に関する先行技術の組成物よりも、予想外に優れている。5−BrIAAの優位性はまた、単子葉植物の再生において観察された。単子葉植物(例えば、イネ)から組織再生を得るために使用された先行技術の方法は、約3ヶ月および2つ以上の異なる培養培地での未成熟な種子のインキュベーションを必要とする。対照的に、オーキシンとして5−BrIAAを使用する本発明に従って、成熟な種子に由来するイネの胚性カルスからの苗条の再生は、約1ヶ月半で得られ、5−BrIAAおよびサイトカイニン(例えば、BAP)を含むインキュベーション培地を1つのみ必要とし、100%の再生率をもたらした。植物組織およびトランスジェニック植物組織からの再生を示すために実行された全てのアッセイにおいて、5−BrIAAは、オーキシンとして機能して、IAA(当該分野のオーキシンの標準物)と少なくとも同様に、そして多くの場合IAAよりも良好に、成長を刺激した。
【0048】
本発明の成長に影響を与える組成物は、1つ以上のインドール−3−酢酸(IAA)誘導体を、必要に応じて1つ以上のさらなる成長調節因子(例えば、オーキシン、サイトカイニン、ジベレリン、アブシジン酸など)を含む混合物中に含み得る。いくつかの好ましい実施形態において、5−BrIAAまたは5−BrIAAおよび1つ以上のさらなる植物成長調節因子(例えば、オーキシン、アブシジン酸、サイトカイニン、ジベレリンなど)との混合物は、キャリアまたは補助栄養因子と混合され得る。BAP、2iPおよびキネチンの使用は、本発明の特定の実施形態において例示される。当該分野で公知の他のサイトカイニンまたは他の植物成長調節因子が、5−BrIAAと共に使用されて、本発明の成長に影響を与える組成物を作製し得ることが、意図される。1つより多くのサイトカイニンまたは異なる植物成長調節因子(例えば、ジベレリンなど)が、5−BrIAAと混合されて、本発明の成長を増強する組成物を作製し得ることがまた、意図される。同じく、植物成長調節因子の選択は、特定の植物の成長を特徴付けるインキュベーションまたは適用サイクルの異なる段階で変化し得る。植物成長調節因子は、当該分野で公知であり、Skoogら(1967)Phytochemistry 6:1169−1192およびTheologis(1989)Plant Biotechnology(KungおよびArntzen編)Butterworth Publishers,Stoneham,Massに記載されるように、これらとしては、BAP、2iP、ipp、ゼアチン、キネチン、ジベレリンなどが挙げられるがこれらに限定されない。
【0049】
本発明の実施は、広範な種々の植物成長応答を意図し、これらとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない:種子の発芽の刺激および休眠状態の破壊;収量の増加;果実の熟成および色生成の促進;開花および果実の増加;苗条形成の刺激;カルス発生の誘導;発根の誘導および細胞増殖の発生;種々の植物種の耐久性の増加;ならびに多数の植物および植物の一部の乾燥重量含有量の増加。これらの応答の分類に加えて、正味の結果が、農業および園芸の作物もしくは種子の成長に影響を与えるかまたはこれらの任意の有利な特性もしくは所望の特性を最大化する限り、植物、種子、果実または野菜の任意の他の改変は、本発明の実施によって達成された有利な応答の範囲内に含まれることが意図される。
【0050】
植物組織培養物への本発明の増殖を促進する化合物の適切な適用は、苗条、根またはカルスの再生を誘導することが示された。この効果は、単子葉植物種および双子葉植物種の両方において例示され、そして広範な種々の植物に適用可能である。
【0051】
本発明の組成物は、トランスジェニック植物からの植物再生のためにさらに利用された。
【0052】
一般的に、植物の遺伝子操作は、2つの相補的なプロセスを含む。最初のプロセスは、特異的に特徴付けられた型の1つ以上の植物細胞の遺伝子形質転換を含む。形質転換によって、外来遺伝子(代表的には、キメラ遺伝子構築物)は、代表的にベクター(このベクターは、目的の遺伝子を培養物中の植物細胞のゲノムに移入させる能力を有する)の補助を介して個々の植物細胞のゲノムに導入される。次いで、第2のプロセスは、この形質転換された植物細胞の性的に有能な(sexually competent)全体の植物への再生を含む。形質転換プロセスも再生プロセスも、100%成功する必要はないが、妥当な割合の細胞が形質転換されて全体の植物に再生され得るように、妥当な程度の信頼性および再現性を有さなければならない。
【0053】
これら2つのプロセス(形質転換および再生)は、相補的でなければならない。これら2つのプロセスの相補性は、形質転換プロセスによって首尾よく遺伝子的に形質転換される組織が、首尾よく植物全体に再生され得るような型および特徴のものでなければならず、そして首尾よく植物全体に再生され得るように十分に健常であり、反応能があり、かつ活力がなければならないようなものでなければならない。
【0054】
首尾よい形質転換および再生技術は、単子葉植物および双子葉植物に対して、先行技術において実証されてきた。例えば、タバコ植物の形質転換および再生は、Bartonら、Cell 32:1033(1983年4月)において報告されており、一方で綿花の再生は、Umbeckの米国特許第5,004,863号(1991年4月2日発行)において、記載されている。さらに、イネの形質転換および再生は、Abdullahら(1986)Bio/Technology 4:1087−1090によって記載され、一方でトウモロコシは、Rhodesら(1988)Bio/Technology 6:56−60およびScience 240:204−207に記載されるように形質転換および再生された。さらに、成熟種子に由来する培養物からのトウモロコシの再生は、米国特許第4,806,483号(1989年2月21日発行)に示されており、そして未熟胚由来の培養物からの再生は、米国特許第5,134,074号(1992年7月28日発行)に示されている。
【0055】
双子葉植物種の細胞の形質転換のために最も通常使用される方法論は、植物病原体Agrobacterium tumefaciensの使用を包含する。Agrobacteriumにより媒介される形質転換は、いくつかの単子葉植物において達成されたが、Wu,Plant Biotechnology(1989)35−51頁,Butterworth Publishers,Stoneham,Massによって記載されるように、遺伝子移入の他の方法(例えば、ポリエチレングリコール法、エレクトロポレーション、直接注入、粒子ボンバードメントなど)が、より効果的であった。本発明は、植物の再生工程を包含する形質転換の任意の方法を用いて、有用である。
【0056】
特定の実施形態において、本発明は、培養物中の植物組織の遺伝的形質転換を想定する。いくつかの実施形態において、これらの組織は、葉円盤(leaf disc)または胚軸外植片由来であり得る。形質転換された組織は、植物全体に再生され得る植物組織構造を形成するよう誘導され得る。他の実施形態において、本発明は、成熟種子由来の培養物における組織の形質転換を考慮する。形質転換された組織は、植物全体に再生され得る。いくつかの実施形態において、この組織は、成熟トウモロコシ種子由来であり得る。
【0057】
いくつかの実施形態において、本発明の形質転換技術は、A.tumefaciensのTiプラスミドを利用する技術であり得る。A.tumefaciens培養物を形質転換ビヒクルとして使用する際には、形質転換された組織の正常な非腫瘍形成性分化が可能であるように、Agrobacteriumの非腫瘍形成性株をベクターキャリアとして使用することが、最も有利である。効果的であるためには、一旦、植物細胞に導入されると、目的の外来遺伝子を含むキメラ構築物は、植物細胞において目的の遺伝子の転写を引き起こすために効果的なプロモーターおよびポリアデニル化配列または転写制御配列(これらもまた、植物細胞において認識される)を含み得る。植物細胞において効果的であることが公知のプロモーターとしては、AgrobacteriumのT−DNAから単離されたノパリンシンターゼプロモーター、およびカリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーターが挙げられる。他の適切なプロモーターが、当該分野において公知である。形質転換された細胞が培養物中で形質転換されていない細胞から選択され得るように、目的の外来遺伝子を保有するベクターが、1つ以上の選択マーカー遺伝子をも内部に含むこともまた好ましい。多くの用途において、好ましいマーカー遺伝子は、抗生物質抵抗性遺伝子および/または除草剤抵抗性遺伝子を含み、その結果、適切な抗生物質および/または除草剤を使用して、形質転換された細胞を、形質転換されていない細胞から分離および選択し得る。
【0058】
このような目的の外来遺伝子を含むベクターの構築の詳細は、植物遺伝子工学の当業者に公知であり、そしてタバコ、ペチュニアおよび他のモデル植物種において以前に効果的であることが実証された実施と、本質的に異ならない。外来遺伝子は、明らかに、マーカー遺伝子として(Jeffersonら(1987)EMBO J.6:3901−3907)、または植物細胞において何らかの所望の効果を達成するように、選択されるべきである。この効果は、成長の促進、病気抵抗性、植物形態もしくは植物産物品質の変化、または遺伝子操作によって達成され得る他の任意の変化であり得る。キメラ遺伝子構築物は、1つ以上の外因性タンパク質の発現をコードし得るか、または負鎖RNAの転写を引き起こして、病気プロセスまたは所望でない内因性植物機能のいずれかを制御または阻害し得る。
【0059】
植物組織に対して形質転換および再生のプロセスを開始するためには、最初に組織の表面を滅菌して、得られる培養物の不注意な汚染を防止することが必要である。この組織が種子である場合には、これらの種子を、殺真菌薬を含む適切な発芽培地において発芽させ得る。発芽の4〜10日後、未熟植物の胚軸部分を除去し、そして1片につき平均約0.5センチメートルの小さな断片に切断する。この胚軸外植片を安定化させ、そして液体または寒天の植物組織培養培地において、生存を維持する。
【0060】
一旦、これらの組織を滅菌すると、これらの組織に、形質転換能のある非腫瘍形成性Agrobacteriumの懸濁培養物をすぐに接種し得る。接種プロセスは、短時間(例えば、2日間)にわたって、室温(すなわち、24℃)で続けられる。
【0061】
接種時間の終了時に、残りの処理された組織を選択寒天培地に移し得る。この培地は、Agrobacteriumに対して毒性であるが植物組織に対しては毒性ではない、1つ以上の抗生物質を、培養物中に残っている任意のAgrobacteriumを殺傷するに十分な濃度で含む。このような培地において使用するために適した抗生物質としては、カルベニシリン、セフォタキシムなど(Agrobacteriumに対する殺菌薬として)、およびカナマイシン、ハイグロマイシン、PPTなど(形質転換された植物組織に対する選択的抗生物質として)が挙げられるが、これらに限定されない。
【0062】
ここで組織は、その通常の成分に加えて選択因子を含む組織培養培地において、培養される。この選択因子(本明細書中においてはカナマイシンにより例示される)は、形質転換されていない細胞に対しては毒性であるが、この選択因子に対する遺伝抵抗性を組み込まれ、そしてこの抵抗性を発現する、形質転換された細胞に対しては、毒性ではない。適切な組織培養培地は、抗生物質ありまたはなしで植物ホルモン5−BrIAAおよびサイトカイニンが添加された、MS培地である。生存している形質転換された組織は、二次培地に移されて、組織再生を誘導され得る。従って、この生存している形質転換された組織は、本発明の再生技術、または他の任意の代替の植物再生プロトコルを介して、植物全体に再生され続ける。
【0063】
本発明の方法は、カルス(好ましくは、胚形成カルス)の、植物サンプルからの生成のための方法を包含する。植物サンプルからのカルスの生成の効率は、このサンプルを低温でのインキュベーションに供することによって、増加し得ることが、予測に反して見出された。低温とは、インキュベーションの温度が室温より低いことを意味する。いくつかの実施形態において、サンプルは、約0℃〜約15℃、好ましくは、約0℃〜約10℃、そしてより好ましくは、約0℃〜約5℃の温度で、インキュベートされ得る。他の実施形態において、植物サンプルは、凍結され得る。低温でのインキュベーションは、植物サンプルからのカルスの生成を刺激するに十分な時間にわたって実施され得る。いくつかの実施形態において、インキュベーションは、約1時間〜約10日間、好ましくは、約1日間〜約7日間、そしてより好ましくは、約4日間実施され得る。いくつかの実施形態において、インキュベーションは、サンプルが周囲大気に曝露している間に実施され得る。例えば、サンプルは、冷蔵庫内でインキュベートされ得る。いくつかの実施形態において、インキュベーションは、サンプルが液体に曝露している間に実施され得る。いくつかの実施形態において、サンプルは、水中に浸漬されている間に低温でインキュベートされ得る。他の実施形態において、サンプルは、塩および/または緩衝剤の溶液中に浸漬されている間に、低温でインキュベートされ得る。いくつかの実施形態において、サンプルは、植物の成長に影響を与える化合物を含む溶液に浸漬され得る。いくつかの実施形態において、サンプルは、1種以上の本発明のIAA誘導体(例えば、5−BrIAA)を含む溶液中で、低温でインキュベートされ得る。
【0064】
本発明の実施において使用される成長に影響を与える組成物の正確な量は、所望の応答の型、使用される処方物および処理される植物の型に依存する。本発明は、約50.0と0.001との間、そして好ましくは、約5.0と0.05との間、そしてより好ましくは、約2.0と0.25との間の、サイトカイニン濃度対オーキシン濃度の比の使用を意図する。成長に影響を与える化合物の濃度は、代表的に、約1μg/mL〜約100mg/mL、好ましくは約500μg/mL〜約10mg/mL、そしてより好ましくは、約1mg/mL〜約5mg/mLの範囲内である。
【0065】
本発明の成長を増強する組成物の活性成分として使用される、化学化合物は、先行技術において周知のプロセスによって調製され得るか、または容易に利用可能な供給源から市販で入手され得る。
【0066】
本発明の組成物は、植物種の任意の発達段階において適用されて、使用される濃度、使用される処方物、および処理される植物種の型に依存して、成熟の間中植物ホルモンまたは維持効果を得、そして初期の発達段階の間に損傷した組織において、再成長を促進し得る。
【0067】
本発明の組成物は、好ましくは、特定の補助的栄養剤または他の植物成長調節因子と、特定の相乗的な成長増強応答を種々の型の植物において達成するために正確な割合で組み合わせられて使用される。本発明の組成物は、さらに、殺真菌薬と組み合わせて使用されて、種々の植物の病気抵抗性を増加させ得、天然の病気の免疫性を調節する酵素および植物のプロセスに影響を与えることによって、この植物組織を、病原体による侵入に対して抵抗性にする。本発明の組成物は、それ自体では植物に有毒な活性を本質的に有さないが、これらは時々、除草剤と組み合わせて使用されて、所望でない植物を除草剤に対してより感受性にするために、このような植物の成長に刺激を与え得る。しかし、本発明の実施において達成される結果を、農作物および園芸作物、ならびに多年生家庭植物種および一年生家庭植物種における成長増強応答とみなすことが、好ましい。
【0068】
以下の実施例は、種々の植物種に対する本発明の好ましい組成物の適用によって実現され得る、広範な植物成長応答の例示である。それにもかかわらず、本発明が活性成分のこれらの最適な比に限定されることは意図されない。なぜなら、当業者は、本明細書中上記に記載される本発明の組成物が、効果的な成長エンハンサーであることを見出すからである。また、本発明による組成物を、本明細書中に具体的には示されない他の植物、種子、果実および野菜と組み合わせて使用する、改善された結果の認識は、容易に当業者の能力の範囲内であることを、当業者は容易に想到するはずである。以下の実施例は、本発明の範囲を限定することなく、本発明の有用性を説明する役に立つ。
【0069】
本明細書中に記載される方法および適用に対する、他の適切な改変および適合が明らかであり、そして本発明の範囲からもそのいかなる実施形態からも逸脱することなくなされ得ることが、関連分野の当業者に容易に明らかである。本発明を詳細に記載したが、本発明は、以下の実施例を参照してさらに明瞭に理解される。これらの実施例は、本発明を説明するためのみの目的で本明細書中に組み込まれ、そして本発明を制限することは意図されない。
【0070】
(実施例1)
(培養培地の調製)
MS塩ベースの培地については、GIBCO BRL Murashige and Skoog(MS)Complete Medium−50X Concentrate(カタログ番号10494−011)を用いた。20mlの各々の成分、Salt I、Salt IIおよびAcid Solubleを、メンブレンに基づく液体増殖様式のために、940mlの滅菌水と混合した。培養を半固体様式で行う場合は、0.8%アガーまたは0.25%Gelrite(Sigma.カタログ番号G1910)のいずれかを、この混合物中に加えた。N6塩+B5ビタミンについては、CHU(N6)基本塩混合物(Sigma、カタログ番号C1416)を1mlのGamborgのビタミン溶液(Sigma、カタログ番号G1019)と混合し、最終容量1Lの培地調製物とした。
【0071】
基本培地に植物成長調節混合物の1つを補充した。この培地に添加した調節因子およびこの培地中のその最終濃度を、表1に示す。
【0072】
【表1】
(実施例2)
(培養用の植物組織サンプルの調製)
スイートコーン(トウモロコシ)(Zea mays)の種子をUSDA、Iowaから入手した。登録番号は、PA91についてAmes19325;H99についてAmes 15931、そしてV924−6についてPI 550473である。トウモロコシの種子を最初に30分間、穏やかに攪拌しながら滅菌水中に入れておくことによって滅菌した。次いで、この種子を95%アルコールに1分間浸した。このアルコール溶液を取り除いて、種子を枝付きフラスコ中に入れた。15%の市販の漂白剤+0.1% Tween(登録商標)(ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノラウレート)の溶液を用意して、このフラスコに添加した。振盪しながら20分間この種子に真空を付与した。真空を取り除き、そしてさらに25分間振盪を続けた。この種子をクリーンフード中で滅菌水により3回リンスした。いくつかの実施形態では、この種子を、室温で滅菌水にさらに5日間浸漬してもよい。他の実施形態では、この種子を室温で1日間浸漬し、その後滅菌水中で4℃でインキュベートしてもよい。
【0073】
この時点で、胚は、解剖顕微鏡下で種子から切り取られ得る。この胚は3つの切片(頂部、中間部、根部)に切断され得、ここで中間切片は、図1に示すように、頂部および根部切片の一部を有する。
【0074】
(実施例3)
(組織サンプルからの胚形成性カルスの生成)
好ましい実施形態において、種子由来の成熟胚の中間切片を、胚形成性カルス形成の刺激用の異なる成長調節因子混合物を含む、MS培地上に配置し得る。この中間切片は、この根部領域が培地に接触するように、または傍らに配置されるべきであり、ただし決して上下逆には配置されるべきではない。次いで、この切片を6〜8週間、暗野で25℃でインキュベートする。
【0075】
成長調節因子の種々の混合物を、それらが胚形成性カルスの形成を刺激する能力について試験した。PA91成熟種子(20〜30種子)を、上記のように、表面滅菌し、切り取って、異なる植物成長調節因子混合物を含有するMS培地上に移した。表2に示す結果は、2ヶ月間、暗野における室温での組織のインキュベーション後に得られた。
【0076】
【表2】
SECF−1で観察された刺激効果が、他のトウモロコシの品種でも見られるか否かを決定するため、多数の異なる品種を試験した。成熟種子(20〜30種子)を、上記のように、表面滅菌し、切り取って、異なる植物成長調節因子混合物を含有するN6+B5ビタミン培地上に移した。表3に示す結果は、2ヶ月間、暗野における室温での組織のインキュベーション後に得られた。数値は、それぞれの処理において胚形成性カルスを形成した組織サンプルの%の数値である。
【0077】
【表3】
凝固試薬の型および塩培地の組成物の関数として形成された胚形成性カルスの%値を比較した。PA91成熟種子(20〜30種子)を、上記のように、表面滅菌し、切り取って、植物成長調節因子混合物SECF−3を含有する異なる培地上に移した。メンブレンに基づく液体培養を以下のとおり実施した:PA91成熟種子(20〜30種子)を、Linら(FOCUS 17,95,1995)に記載のように、表面滅菌し、切り取って、メンブレンに基づく液体培養中のLifeRaftメンブレン上で培養した。表4に示す結果は、2ヶ月間、暗野における室温での組織のインキュベーション後に得られた。
【0078】
【表4】
胚形成性カルス形成に対する温度の効果を検討した。上記のように、トウモロコシ種子PA91の表面滅菌後、この種子を5日間室温で滅菌水に浸した。これらの種子の胚形成性カルス形成能力を、4℃で4日間、次に胚の切り取りの前に室温で1日滅菌水に浸漬した種子と比較した。切り取った胚をSECF−1混合物を補充したN6塩+B5ビタミン培地上に移し、そして2ヶ月間室温で暗野週でインキュベートした。結果を表5に示す。
【0079】
【表5】
いくつかの実施形態において、形成されたカルスを増殖することが所望され得る。胚形成性カルス形成の後、このカルスを、カルス増殖用の2mg 2,4−Dを含有するMS塩+N6塩ベースの培地上に移し得る。このカスルを1ヶ月間25℃で、暗野でインキュベートし得る。
【0080】
(実施例4)
(胚形成性カルスからの苗条の再生)
上記のように準備した胚形成性カルスを、異なる植物成長調節因子混合物を含有する、新しい苗条再生培地に移し得る。この胚形成性カルスを、苗条再生のために、2〜3週間、25℃で、16時間光および8時間暗野のサイクルでインキュベートし得る。再生した苗条を、さらなる植物成長のための植物成長調節因子混合物を含有しないMS培地上に移し得る。胚形成性カルスからの苗条の再生に対する、異なる植物成長調節因子混合物の効果を検討した。上記のように準備した胚形成性カルスを、示した苗条再生培地の存在下でインキュベートし、その結果を表6に示す。
【0081】
【表6】
ここで、理解の明確化のために例示および実施例の方法によって、ある程度詳細に本発明を記載してきたが、本発明およびその任意の特定の実施形態の範囲に影響を及ぼすことなく、広範かつ等価な範囲の条件、処方物および他のパラメーター内で、本発明を改変または変化することによって、同等の内容が実施され得ること、ならびにこのような改変または変化が、添付の特許請求の範囲内に包含されることが意図されていることは当業者には明白である。
【0082】
本明細書中に言及されたすべての刊行物、特許および特許出願は、本発明が属する当業者の技術のレベルを示すものであり、そして各個々の刊行物、特許または特許出願が、参考として援用されるべきことが特におよび個々に示されているのと同じ程度まで参考として本明細書に援用される。
【図面の簡単な説明】
【図1】
図1は、本発明の方法に従った培養のための適切な組織サンプルの切除を示すトウモロコシ種子の概略的な表示である。
(発明の背景)
(発明の分野)
本発明は、農業生物工学の分野に関する。詳細には、本発明は、植物の成長に影響し、そして植物組織または形質転換された植物組織から植物を再分化させる組成物および方法を提供する。
【0002】
(関連技術)
植物成長は、種々の物理的因子または化学的因子によって影響される。物理的因子としては、利用可能な光、日長、水分および温度が挙げられる。化学的因子としては、ミネラル、硝酸塩、コファクター、栄養物質および植物成長調節因子またはホルモン(例えば、オーキシン、サイトカイニンおよびジベレリン)が挙げられる。
【0003】
インドール−3−酢酸(IAA)は、植物中で同定される天然に存在する植物成長ホルモンである。IAAは、インビボおよびインビトロにおける植物中の成長の増加を直接担うことが示されている。IAAによって影響される特徴としては、細胞伸長、節間距離(高さ)、葉の表面積および作物収量が挙げられる。IAAおよびIAAのホルモン調節活性に類似した活性を示す他の化合物が、「オーキシン」と呼ばれる植物成長因子のクラスに含まれる。
【0004】
植物においてオーキシンとして機能することが知られている化合物は、茎伸長を誘導するようにそして根の形成を促進するように作用する、例えば、天然に存在する植物成長調節因子である4−クロロインドール−3−酢酸(4−Cl−IAA)を含む。IAAが、植物の多数の器官において見出される一方で、4−Cl−IAAは、Pisum sativumの未成熟の種子および成熟した種子において存在することが示されていたが、他の器官においては示されていない(Ulvskovら(1992)188:182−189)。いくつかの合成オーキシンとしては、例えば、ナフタレン−1−酢酸(NAA)、5,6−ジクロロ−インドール−3−酢酸(5,6−Cl2−IAA)、4−クロロ−2−メチルフェノキシ酢酸(MCPA);2,4−ジクロロフェノキシ酢酸(2,4D);2,4,5−トリクロロフェノキシ酢酸(2,4,5−T);2−(4−クロロ−2−メチルフェノキシ)プロピオン酸(CMPP);4−(2,4−ジクロロフェノキシ)酪酸(2,4−DB);2,4,5−トリクロロ安息香酸(TBA);および3,5−ジクロロ−2−メトキシ安息香酸(dicamba)が挙げられる。上記の酸全てがそれらの塩およびエステルの形態(例えば、それらのナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、ジメチルアミン塩およびエタノールアミン塩、ならびにそれらの低級アルコールエステル)で活性である。これらの合成オーキシンの多数は、効果的な除草剤として一般に使用されており、そして、これらのいくつかは、処理された植物の形態形成に不利に影響することが公知である。
【0005】
サイトカイニン(例えば、6−フルフリルアミノプリン(カイネチン)および6−ベンジルアミノプリン(BAP))に基づく調製物はまた、成長刺激因子であることが公知である。しかし、サイトカイニンベースの調製物は、オーキシンと組み合わせて、最も効果的である。サイトカイニンが植物の成長周期に影響する機構は、理解されるにはほど遠いが、それらが葉の成長に影響し、そして、特定の植物において加齢を妨げることが明らかである。
【0006】
組織培養および遺伝子操作のような方法を使用する主要作物の植物を首尾良く再生することが、この分野における一般的な目的である。植物組織培養の技術は、長年活発な研究の領域であったが、過去5〜10年にわたって、トウモロコシ、コムギ、イネ、ダイズ、およびワタのような重要な農業作物についての再分化可能な植物組織培養手順を開発するために、強化された科学的努力がなされてきた。
【0007】
インビトロ培養技術が、植物交配で十分に確立されている(Reinert,J.およびBajaj,Y.P.S.編(1977)Plant Cell,Tissue and Organ Culture,Berlin:Springer;Simmonds,N.W.(1979)Principles of Crop Improvement,London:Longman;Vasil,I.K.,Ahuja,M.K.およびVasil,V.(1979)「Plant tissue cultures in genetics and plant breeding」Adv.Genet.20:127−215)。第1に、何十年の間、胚培養は、困難な種間交雑を作製することに対する価値ある補助であった。第2に、より最近のものであるが、十分に確立されているのは、茎頂点培養であり、これは、迅速なクローンの操作、ウイルスフリーのクローンの開発および遺伝子供給源保存作業において用途を見出す。両方の技術は、成長点の組織的な統合性の保持に依存する。別の頻繁に使用される技術は、組織が失われるが、多くの場合で回収され得る植物組織のインビトロ培養を含む。この型の技術の例としては、カルス、細胞、およびプロトプラスト培養を含む。培養された細胞の適用は、インビトロハイブリダイゼーションであり、これは、再分化後、種間複二倍体を生じた。この技術は、従来の手段によって作製され得ない所望の複二倍体を提供し得、そして、そのいくつかの改変体による体細胞組換えの可能性を提供する。上記技術は、広範に使用される(Chaleff,R.S.(1981)Genetics of Higher Plants,Applications of Cell Culture,Cambridge;Cambridge University Press)。
【0008】
植物遺伝子操作技術は、以下の工程を可能にする:(a)特定の遺伝子の同定;(b)この遺伝子の単離およびクローニング;(c)レシピエント植物宿主細胞への遺伝子の移入;(d)レシピエント細胞中のDNAの組み込み、転写および翻訳;ならびに(e)トランスジェニック植物の増殖および使用(T.Kosuge,C.P.MeredithおよびA.Hollaender編(1983)Genetic Engneering of Plants,26:5−25;Rogersら(1988)Methods for Plant Molecular Biology,A.WeissbachおよびH.Weissbach編、Academic Press,Inc.,San Diego,Calif.)。新しく挿入された外来遺伝子は、植物の再分化の間に安定して維持され、そして代表的なメンデル形質として子孫に伝達されることが示されている(Horschら(1984)Science 223:496、およびDeBlockら(1984)EMBO 3:1681)。外来遺伝子は、それらの正常組織の特異的および発生的発現パターンを保持する。
【0009】
成功した形質転換および再分化技術が、多数の植物種について先行技術において示されており、そして、これらの方法を使用して、種々の植物種を遺伝子的に操作する。Agrobacterium tumefaciens媒介形質転換系が、多数の双子葉植物種について効率的であると証明されている。例えば、Bartonら(1983、Cell 32:1033)は、タバコ植物の形質転換および再分化を報告しており、そして、Changら(1994、Planta 5:551−558)は、Arabidopsis thalianaの安定した遺伝子形質転換を報告した。
【0010】
遺伝子移入のためのAgrobacterium方法がまた、単子葉植物(例えば、LiliaceaeおよびAmaryllidaceae科(Hooykaas−Van Slogterenら、1984,Nature 311:763−764)およびDioscorea bulbifera(サツマイモ)(Schaferら、1987,Nature 327:529−532)の植物)に適用された。さらに、Agrobacteriumベースの形質転換方法は、重要な食用作物のイネ(Oryza sativa、Hieiら、Plant Journal,6:271−282,1994を参照のこと)およびトウモロコシ(Zea mays、Ishidaら、Nature Biotechnology,14:745−750,1996を参照のこと)について開発されてきた。
【0011】
食用作物の形質転換は、代替的な方法を用いて(例えば、ポリエチレングリコール(PEG)促進性DNA取り込み(Uchimiyaら(1986)Mol.Gen.Genet.204:204−207)およびエレクトロポレーション(Frommら(1986)Nature 319:791−793)(この両方は、移入標的としてプロトプラストを使用した)によって)得られた。単子葉および双子葉組織は、DNAコーティング粒子による組織のボンバードメントによって形質転換され得る(Wangら(1988)Plant Mol.Biol.11:433−439;Wu,Plant Biotechnology(1989),KungおよびAmtzen編、Butterworth Publishers,Stoneham,Mass)。再分化は、イネ(Abdullahら(1986)Bio/Technology 4:1087−1090)およびトウモロコシ(Rhodesら(1988)Bio/Technology 6:56−60および(1988)Science 240:204−207)において記載されていた。
【0012】
(発明の簡単な要旨)
本発明の主な目的は、1つ以上のインドール−3−酢酸(IAA)誘導体を含む成長影響性組成物を提供することである。本発明の組成物は、種々の植物種において、多数の成長影響性応答を誘導する際に重要な役割を果たす。適切なIAA誘導体は、1996年11月29日に出願された、表題Auxinic Analogues of Indole−3−Acetic Acidの米国特許出願番号08/758,416において記載され、これは、本明細書中に参考文献として詳細に援用される。いくつかの好ましい実施形態において、本発明の組成物は、IAAの置換された誘導体を含み得る。本発明のIAAの誘導体は、IAA分子において1つ以上の置換を含み得る。いくつかの好ましい実施形態において、IAA誘導体は、一置換のIAA分子であり得る。いくつかの好ましい実施形態において、本発明のIAA誘導体は、二置換のIAAであり得る。いくつかの好ましい実施形態において、本発明のIAA誘導体は、多重置換のIAA分子であり得る。この誘導体は、酸、エステル、アミドまたは塩の形態であり得る。いくつかの好ましい実施形態において、本発明は、IAAの2、4、5、6、または7位に置換基を有する一置換IAAを含む成長影響性組成物を意図し、ここで、置換基は、ハロゲン、アルキル基、アルコキシ基、アシル基、およびアシルアミド基または1〜10個の炭素を有するアシルオキシ基であり得る。いくつかの好ましい実施形態において、IAA誘導体は、IAAの2、4、5、6、または7位の2つに置換基を有する二置換IAA誘導体であり得、ここで、置換基は、同一であるかまたは異なり得、そしてハロゲン、アルキル基、アルコキシ基、アシル基、およびアシルアミド基または1〜10個の炭素を有するアシルオキシ基であり得る。いくつかの好ましい実施形態において、IAA誘導体は、IAAの2、4、5、6、または7位の3つ以上に置換基を有する多重置換IAA誘導体であり得、ここで、置換基は、同一であるかまたは異なり得、そしてハロゲン、アルキル基、アルコキシ基、アシル基、およびアシルアミド基または1〜10個の炭素を有するアシルオキシ基であり得る。いくつかの好ましい実施形態において、本発明の組成物は、植物成長影響性応答を達成するために十分な量で、酸、エステル、アミドまたは塩の形態で、IAA誘導体5−ブロモインドール−3−酢酸(5−BrIAA)を含み得る。本発明は、単子葉植物および双子葉植物の両方で成長に影響する5−BrIAAの使用を意図する。
【0013】
植物成長に影響を及ぼすための組成物を提供することもまた本発明の目的であり、この組成物は、植物成長に影響する応答を達成するために、1つ以上のインドール−3−酢酸(IAA)誘導体を、1つ以上のさらなる植物成長調節因子(例えば、オーキシン、サイトカイニン、ジベレリン、アブシジン酸など)との混合物で、様々な植物に対する広範な適用のための限定された割合および濃度で含む。一局面において、この組成物は、1つ以上の一置換IAA誘導体および/または1つ以上の二置換IAA誘導体および/または1つ以上の多置換IAA誘導体、あるいはそれらの混合物を含み得、かつ1つ以上のさらなる植物成長調節因子(例えば、1つ以上のオーキシン、1つ以上のサイトカイニン、1つ以上のジベレリン、1つ以上のアブシジン酸、およびそれらの混合物など)をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、この組成物は、1つ以上の一置換IAA誘導体および/または1つ以上の二置換IAA誘導体および/または1つ以上の多置換IAA誘導体を含み得、かつ(2,4−ジクロロフェノキシ)酢酸(2,4−D)、6−ベンジルアミノプリン(BAP)、アブシン酸(ABA)、ゼアチンリボシド、キネチン、(2−イソペンチル)アデニン(2iP)およびジクマンバ(dicmamba)からなる群から選択される1つ以上の化合物をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、この組成物は、一置換IAA誘導体を含み得、かつ1つ以上のオーキシン、1つ以上のサイトカイニン、1つ以上のジベレリン、1つ以上のアブシジン酸およびそれらの混合物からなる群から選択される少なくとも1つの植物成長調節化合物をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、この組成物は、5−BrIAAを含み得、かつ1つ以上のオーキシン、1つ以上のサイトカイニン、1つ以上のジベレリン、1つ以上のアブシジン酸およびそれらの混合物からなる群から選択される少なくとも1対の植物成長調節化合物をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、この組成物は、5−BrIAAを含み得、かつ2,4−D、BAP、ABA、ゼアチンリボシド、キネチン、2iPおよびジクマンバからなる群から選択される少なくとも1つの化合物をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、この組成物は、5−BrIAA、2,4−D、BAPおよびABAを含み得る。いくつかの実施形態において、この組成物は、5−BrIAA、ゼアチンリボシドおよびABAを含み得る。特定の実施形態において、本発明は、植物の成長に影響を与える、5−BrIAAおよびサイトカイニンを含む組成物で例示される。
【0014】
一局面において、本発明は、1つ以上の一置換IAA誘導体および/または1つ以上の二置換IAA誘導体および/または1つ以上の多置換IAA誘導体、あるいはそれらの混合物を、1つ以上のさらなる植物成長調節因子(例えば、1つ以上のオーキシン、1つ以上のサイトカイニン、1つ以上のジベレリン、1つ以上のアブシジン酸およびそれらの混合物など)と混合することによって形成される組成物を提供する。いくつかの実施形態において、この組成物は、1つ以上の一置換IAA誘導体および/または1つ以上の二置換IAA誘導体および/または1つ以上の多置換IAA誘導体を、2,4−D、BAP、ABA、ゼアチンリボシド、キネチン、2iPおよびジクマンバからなる群から選択される1つ以上の化合物と混合することによって形成され得る。いくつかの実施形態において、この組成物は、一置換IAAを、1つ以上のオーキシン、1つ以上のサイトカイニン、1つ以上のジベレリン、1つ以上のアブシジン酸およびそれらの混合物からなる群から選択される植物成長調節化合物と混合することによって形成され得る。いくつかの実施形態において、この組成物は、5−BrIAAを、1つ以上のオーキシン、1つ以上のサイトカイニン、1つ以上のジベレリン、1つ以上のアブシジン酸およびそれらの混合物からなる群から選択される植物成長調節化合物と混合することによって形成され得る。いくつかの実施形態においてこの組成物は、5−BrIAAを、2,4−D、BAP、ABA、ゼアチンリボシド、キネチン、2iPおよびジクマンバからなる群から選択される植物成長調節化合物と混合することによって形成され得る。いくつかの実施形態において、この組成物は、5−BrIAA、2,4−D、BAPおよびABAを混合することによって形成され得る。いくつかの実施形態において、この組成物は、5−BrIAA、ゼアチンリボシドおよびABAを混合することによって形成され得る。
【0015】
本発明のさらなる目的は、植物成長に影響を与えるための培養培地を提供することであり、この培地は、1つ以上のインドール−3−酢酸(IAA)誘導体、および植物発生または組織再生の間に植物を保持し、またはビヒクルとして働き、それにより1つ以上のインドール−3−酢酸(IAA)誘導体が適用され得る培地の成分としての1つ以上のさらなる植物成長調節因子(例えば、1つ以上のオーキシン、サイトカイニン、ジベレリンおよび/またはアブシジン酸)の混合物を含む。一局面において、この培地は、1つ以上の一置換IAA誘導体および/または1つ以上の二置換IAA誘導体および/または1つ以上の多置換IAA誘導体、あるいはそれらの混合物を含み得、かつ1つ以上のさらなる植物成長調節因子(例えば、1つ以上のオーキシン、1つ以上のサイトカイニン、1つ以上のジベレリン、1つ以上のアブシジン酸およびそれらの混合物など)をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、この培地は、1つ以上の一置換IAA誘導体および/または1つ以上の二置換IAA誘導体および/または1つ以上の多置換IAA誘導体を含み得、かつ2,4−D、BAP、ABA、ゼアチンリボシド、キネチン、2iPおよびジクマンバからなる群から選択される1つ以上の化合物をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、この培地は、一置換IAA誘導体を含み得、かつ1つ以上のオーキシン、1つ以上のサイトカイニン、1つ以上のジベレリン、1つ以上のアブシジン酸およびそれらの混合物からなる群から選択される少なくとも1つの植物成長調節化合物をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、この培地は、5−BrIAAを含み得、かつ1つ以上のオーキシン、1つ以上のサイトカイニン、1つ以上のジベレリン、1つ以上のアブシジン酸およびそれらの混合物からなる群から選択される少なくとも1つの植物成長調節化合物をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、この培地は、5−BrIAAを含み得、かつ2,4−D、BAP、ABA、ゼアチンリボシド、キネチン、2iPおよびジクマンバからなる群から選択される少なくとも1つの化合物をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、この培地は、5−BrIAA、2,4−D、BAPおよびABAを含み得る。いくつかの実施形態において、この培地は、5−BrIAA、ゼアチンリボシドおよびABAを含み得る。特定の実施形態において、本発明は、植物の成長に影響を与える5−BrIAAおよびサイトカイニンを含む組成物で例示される。
【0016】
本発明の目的は、植物サンプルから、カルス、好ましくは胚形成カルスを形成するための培地を提供することである。いくつかの実施形態において、このカルス形成培地は、オーキシン、サイトカイニン、ジベレリンおよびアブシジン酸からなる群から選択されるカルス誘導量の1つ以上の植物成長調節化合物を含み得る。いくつかの好ましい実施形態において、このカルス形成培地は、1つ以上の一置換IAA誘導体および/または1つ以上の二置換IAA誘導体および/または1つ以上の多置換IAA誘導体、あるいはそれらの混合物を含み、かつ1つ以上のさらなる植物成長調節因子(例えば、1つ以上のオーキシン、1つ以上のサイトカイニン、1つ以上のジベレリン、1つ以上のアブシジン酸、およびそれらの混合物など)をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、このカルス形成培地は、1つ以上の一置換IAA誘導体および/または1つ以上の二置換IAA誘導体および/または1つ以上の多置換IAA誘導体を含み得、かつ2,4−D、BAP、ABA、ゼアチンリボシド、キネチン、2iPおよびジクマンバからなる群から選択される1つ以上の化合物をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、このカルス形成培地は、5−BrIAA、および1つ以上のオーキシン、1つ以上のサイトカイニン、1つ以上のジベレリン、1つ以上のアブシジン酸およびそれらの混合物からなる群から選択される植物成長調節化合物を含む。いくつかの実施形態において、このカルス形成培地は、5−BrIAA、および2,4−D、BAP、ABA、ゼアチンリボシド、キネチン、2iPおよびジクマンバからなる群から選択される植物成長調節化合物を含む。いくつかの実施形態において、このカルス形成培地は、5−BrIAA、2,4−D、BAPおよびABAを含む。いくつかの実施形態において、この培地は、5−BrIAAを含み得る。
【0017】
本発明の目的は、植物サンプルの再生のための培地を提供することである。いくつかの実施形態において、この植物サンプルは、カルス、好ましくは、胚形成カルスであり得る。いくつかの実施形態において、この培地は、オーキシン、サイトカイニン、ジベレリンおよびアブシジン酸からなる群から選択される再生誘発量の1つ以上の植物ホルモンを含み得る。いくつかの好ましい実施形態において、この再生培地は、1つ以上の一置換IAA誘導体および/または1つ以上の二置換IAA誘導体および/または1つ以上の多置換IAA誘導体、あるいはそれらの混合物を含み、かつ1つ以上のさらなる植物成長調節因子(例えば、1つ以上のオーキシン、1つ以上のサイトカイニン、1つ以上のジベレリン、1つ以上のアブシジン酸およびそれらの混合物など)をさらに含む。本発明のいくつかの実施形態において、この再生培地は、1つ以上の一置換IAA誘導体および/または1つ以上の二置換IAA誘導体および/または1つ以上の多置換IAA誘導体、およびそれらの混合物を含み得、かつ2,4−D、BAP、ABA、ゼアチンリボシド、キネチン、2iPおよびジクマンバからなる群から選択される1つ以上の化合物をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、この再生培地は、5−BrIAA、ならびに1つ以上のオーキシン、1つ以上のサイトカイニン、1つ以上のジベレリン、1つ以上のアブシジン酸およびそれらの混合物からなる群から選択される植物成長調節化合物を含む。いくつかの実施形態において、この再生培地は、5−BrIAA、ゼアチンリボシドおよびABAを含む。
【0018】
本発明のさらなる目的は、植物成長に影響を与える方法を提供することであり、この方法は、1つ以上の一置換IAA誘導体および/または1つ以上の二置換IAA誘導体および/または1つ以上の多置換IAA誘導体、あるいはそれらの混合物を含み、かつ1つ以上のさらなる植物成長調節因子(例えば、1つ以上のオーキシン、1つ以上のサイトカイニン、1つ以上のジベレリン、1つ以上のアブシジン酸およびそれらの混合物など)をさらに含む、有効量の植物成長影響組成物を、植物サンプルに適用する工程を包含する。本発明のいくつかの実施形態において、この組成物は、1つ以上の一置換IAA誘導体および/または1つ以上の二置換IAA誘導体および/または1つ以上の多置換IAA誘導体、およびそれらの混合物を含み得、かつ2,4−D、BAP、ABA、ゼアチンリボシド、キネチン、2iPおよびジクマンバからなる群から選択される1つ上の化合物をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、この組成物は、5−BrIAA、および1つ以上のオーキシン、1つ以上のサイトカイニン、1つ以上のジベレリン、1つ以上のアブシジン酸およびそれらの混合物からなる群から選択される植物成長調節化合物を含む。特定の実施形態において、本発明は、植物の成長に影響を与える、5−BrIAAおよびサイトカイニンを含む組成物で例示される。いくつかの実施形態において、この方法は、植物サンプルを、植物成長に影響を与える組成物の存在下でインキュベートする工程をさらに包含する。いくつかの実施形態において、この植物サンプルは、植物全体、植物部位、植物細胞、植物組織、植物種子またはそれらのいずれかの一部であり得る。いくつかの好ましい実施形態において、この植物サンプルは、トランスジェニック植物の全体または一部である。
【0019】
植物サンプルから植物を再生する方法であって、植物由来のサンプルを提供する工程、植物サンプルの再生を生じさせる条件下で再生培地と接触させてサンプルを培養する工程、を包含する方法を提供することが、本発明の目的であり、この再生培地は、1種以上の一置換IAA誘導体および/または1種以上の二置換IAA誘導体および/または1種以上の多置換IAA誘導体あるいはそれらの混合物を含み、そしてさらに、1種以上のさらなる植物成長調節因子(例えば、1種以上のオーキシン、1種以上のサイトカイニン、1種以上のジベレリン、1種以上のアブシジン酸、およびそれらの混合物など)を含む。本発明のいくつかの実施形態において、再生培地は、1種以上の一置換IAA誘導体および/または1種以上の二置換IAA誘導体および/または1種以上の多置換IAA誘導体を含み得、そしてさらに、2,4−D、BAP、ABA、ゼアチンリボシド、キネチン、2iPおよびジクマンバからなる群から選択される1以上の化合物を含み得る。いくつかの実施形態において、この再生培地は、5−BrIAAならびに1種以上のオーキシン、1種以上のサイトカイニン、1種以上のジベレリン、1種以上のアブシジン酸、およびそれらの混合物からなる群から選択される、食物成長調節化合物を含む。いくつかの実施形態において、この再生培地は、5−BrIAA、ゼアチンリボシド、およびABAを含む。いくつかの実施形態において、この植物組織サンプルが、成熟植物組織からに由来し得る。適切な植物としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:トウモロコシ、コムギ、モロコシ、サトウダイコン、ジャガイモ、ダイズ、イネおよび食物源として一般に栽培されている他の食物。いくつかの実施形態において、この植物組織は、成熟トウモロコシ種子に由来する。他の実施形態において、この方法は、このサンプルの切取り前に低温で植物をインキュベートする工程をさらに包含し得る。いくつかの実施形態において、この培養工程は、膜ベースの液体培養物中で実施される。
【0020】
分化した植物組織由来の植物を再生する方法であって、植物由来のサンプル(このサンプルは、分化した植物組織を含む)を提供する工程、カルスの形成を生じさせる条件下でカルス形成培地と接触させてサンプルを培養する工程、およびこのカルスから植物を再生させる工程、を包含する方法を提供することが、本発明の目的であり、このカルス形成培地は、1種以上の一置換IAA誘導体および/または1種以上の二置換IAA誘導体および/または1種以上の多置換IAA誘導体あるいはそれらの混合物を含み、そしてさらに、1種以上のさらなる植物成長調節因子(例えば、1種以上のオーキシン、1種以上のサイトカイニン、1種以上のジベレリン、1種以上のアブシジン酸、およびそれらの混合物など)を含む。いくつかの実施形態において、カルス形成培地は、1種以上の一置換IAA誘導体および/または1種以上の二置換IAA誘導体および/または1種以上の多置換IAA誘導体を含み得、そしてさらに、2,4−D、BAP、ABA、ゼアチンリボシド、キネチン、2iPおよびジクマンバからなる群から選択される1以上の化合物を含み得る。いくつかの実施形態において、このカルス形成培地は、5−BrIAA、ならびに1種以上のオーキシン、1種以上のサイトカイニン、1種以上のジベレリン、1種以上のアブシジン酸、およびそれらの混合物からなる群から選択される、植物成長調節化合物を含む。いくつかの実施形態において、このカルス形成培地は、5−BrIAA、ならびに2,4−D、BAP、ABA、ゼアチンリボシド、キネチン、2iPおよびジクマンバからなる群から選択される植物成長調節化合物を含む。いくつかの実施形態において、カルス形成培地は、5−BrIAA、2,4−D、BAPおよびABAを含む。いくつかの実施形態において、この方法は、カルスの再生を生じさせる条件下で再生培地にカルスを移動させる工程をさらに包含し得、この再生培地は、1種以上の一置換IAA誘導体および/または1種以上の二置換IAA誘導体および/または1種以上の多置換IAA誘導体あるいはそれらの混合物を含み、そしてさらに、1種以上のさらなる植物成長調節因子(例えば、1種以上のオーキシン、1種以上のサイトカイニン、1種以上のジベレリン、1種以上のアブシジン酸、およびそれらの混合物など)を含む。本発明のいくつかの実施形態において、再生培地は、1種以上の一置換IAA誘導体および/または1種以上の二置換IAA誘導体および/または1種以上の多置換IAA誘導体ならびにそれらの混合物を含み得、そしてさらに、2,4−D、BAP、ABA、ゼアチンリボシド、キネチン、2iPおよびジクマンバからなる群から選択される1以上の化合物を含み得る。いくつかの実施形態において、再生培地は、5−BrIAA、ならびに1種以上のオーキシン、1種以上のサイトカイニン、1種以上のジベレリン、1種以上のアブシジン酸、およびそれらの混合物からなる群から選択される植物成長調節化合物を含む。いくつかの実施形態において、この再生培地は、5−BrIAA、ゼアチンリボシド、およびABAを含む。いくつかの実施形態において、このカルス形成培地は、再生培地と異なる。いくつかの実施形態において、この植物サンプルは、成熟植物組織に由来し得る。適切な植物としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:トウモロコシ、コムギ、モロコシ、サトウダイコン、ジャガイモ、ダイズ、イネおよび一般に栽培されている他の食物。いくつかの実施形態において、この植物サンプルは、成熟トウモロコシ種子の全てまたは一部を含み得る。いくつかの実施形態において、この方法は、この再生培地にカルスを移動させる前に、カルスを増幅するさらなる工程を含み得る。他の実施形態において、この方法は、サンプルを切除する前に、低温で植物組織をインキュベートする工程をさらに包含し得る。いくつかの実施形態において、低温は、約0℃〜約20℃、好ましくは、約0℃〜約10℃、より好ましくは、約0℃〜約5℃、そして最も好ましくは、約4℃であり得る。いくつかの実施形態において、この培養工程は、膜ベースの液体培養物中で実施される。
【0021】
植物サンプル由来の胚形成カルスの生成のための方法を提供することが、本発明の目的である。いくつかの実施形態において、この方法は、植物サンプルを提供する工程、1種以上の一置換IAA誘導体および/または1種以上の二置換IAA誘導体および/または1種以上の多置換IAA誘導体あるいはそれらの混合物、およびさらに1種以上のさらなる植物成長調節因子(例えば、1種以上のオーキシン、1種以上のサイトカイニン、1種以上のジベレリン、1種以上のアブシジン酸、およびそれらの混合物など)を含む組成物と植物サンプルを接触させる工程、ならびに胚形成カルスの形成を生じさせる条件下でサンプルを培養する工程を包含する。いくつかの実施形態において、この組成物は、1種以上の一置換IAA誘導体および/または1種以上の二置換IAA誘導体および/または1種以上の多置換IAA誘導体を含み得、そして2,4−D、BAP、ABA、ゼアチンリボシド、キネチン、2iPおよびジクマンバからなる群から選択される、1以上の化合物をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、この組成物は、5−BrIAAならびに1種以上のオーキシン、1種以上のサイトカイニン、1種以上のジベレリン、1種以上のアブシジン酸、およびそれらの混合物からなる群から選択される植物成長調節化合物をさらに含む。いくつかの実施形態において、この組成物は、5−BrIAAならびに2,4−D、BAP、ABA、ゼアチンリボシド、キネチン、2iPおよびジクマンバからなる群から選択される植物成長調節化合物を含む。いくつかの実施形態において、この組成物は、5−BrIAA、2,4−D、BAPおよびABAを含む。いくつかの好ましい実施形態において、この組成物は、5−BrIAAを含み得る。いくつかの実施形態において、このサンプルは、成熟植物に由来し得る。適切な植物としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:トウモロコシ、コムギ、モロコシ、サトウダイコン、ジャガイモ、ダイズ、イネおよび一般に栽培されている他の食物。いくつかの実施形態において、植物サンプルは、トウモロコシに由来し得る。いくつかの実施形態において、このサンプルは、種子、または種子の一部である。いくつかの実施形態において、この植物サンプルは、トウモロコシ種子に由来し得る。いくつかの実施形態において、この植物サンプルは、B73、H99およびPA91からなる群から選択されるトウモロコシ変種由来の種子または種子の一部であり得る。
【0022】
植物サンプルからの胚形成カルスの生成のための方法を提供することが、本発明の目的であり、ここで、この方法は、植物サンプルを提供する工程、低温でサンプルをインキュベートする工程、カルス形成培地の存在下で植物サンプルを培養する工程、およびカルスからの植物を再生する工程を包含し、ここで、このカルス形成培地は、1種以上の一置換IAA誘導体および/または1種以上の二置換IAA誘導体および/または1種以上の多置換IAA誘導体あるいはそれらの混合物、およびさらに、1種以上のさらなる植物成長調節因子(例えば、1種以上のオーキシン、1種以上のサイトカイニン、1種以上のジベレリン、1種以上のアブシジン酸、およびそれらの混合物など)を含む。いくつかの実施形態において、カルス形成培地は、1種以上の一置換IAA誘導体および/または1種以上の二置換IAA誘導体および/または1種以上の多置換IAA誘導体を含み得、そしてさらに、2,4−D、BAP、ABA、ゼアチンリボシド、キネチン、2iPおよびジクマンバからなる群から選択される1以上の化合物を含み得る。いくつかの実施形態において、このカルス形成培地は、5−BrIAA、ならびに1種以上のオーキシン、1種以上のサイトカイニン、1種以上のジベレリン、1種以上のアブシジン酸、およびそれらの混合物を含む。いくつかの実施形態において、このカルス形成培地は、5−BrIAA、ならびに2,4−D、BAP、ABA、ゼアチンリボシド、キネチン、2iPおよびジクマンバからなる群から選択される植物成長調節化合物を含む。いくつかの実施形態において、このカルス形成培地は、5−BrIAA、2,4−D、BAP、およびABAを含む。いくつかの好ましい実施形態において、この培地は、5−BrIAAを含み得る。いくつかの実施形態において、このサンプルの一部は、サンプルが低温でインキュベートされた後に、切取られそして培養され得る。いくつかの実施形態において、低温は、約0℃〜約20℃、好ましくは、約0℃〜約10℃、より好ましくは、約0℃〜約5℃、そして最も好ましくは、約4℃であり得る。いくつかの実施形態において、この植物サンプルは、成熟植物由来であり得る。適切な植物としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:トウモロコシ、コムギ、モロコシ、サトウダイコン、ジャガイモ、ダイズ、イネおよび一般に栽培されている他の食物。いくつかの実施形態において、この植物サンプルは、トウモロコシ由来であり得る。いくつかの実施形態において、この植物サンプルは、種子または種子の一部である。いくつかの実施形態において、この植物サンプルは、トウモロコシ種子に由来し得る。いくつかの実施形態において、この植物サンプルは、B73、H99およびPA91からなる群から選択されるトウモロコシの変種由来であり得る。いくつかの実施形態において、インキュベーション工程は、4℃で約1日〜10間実施され得る。いくつかの実施形態において、このインキュベーション工程は、4日間実施され得る。
【0023】
カルスから苗条を再生する方法あって、再生培地とカルスとを接触させる工程およびこのカルスから苗条の再生を生じさせる条件下でカルスをインキュベートする工程、を包含する方法を提供することが、本発明の目的である。いくつかの実施形態において、この培地は、オーキシン、サイトカイニン、ジベレリンおよびアブシジン酸からなる群から選択される、再生誘導量の1以上の植物ホルモンを含み得る。いくつかの好ましい実施形態において、この再生培地は、1種以上の一置換IAA誘導体および/または1種以上の二置換IAA誘導体および/または1種以上の多置換IAA誘導体あるいはそれらの混合物を含み、そしてさらに、1種以上のさらなる植物成長調節因子(例えば、1種以上のオーキシン、1種以上のサイトカイニン、1種以上のジベレリン、1種以上のアブシジン酸、およびそれらの混合物など)を含む。本発明のいくつかの実施形態において、この再生培地は、1種以上の一置換IAA誘導体および/または1種以上の二置換IAA誘導体および/または1種以上の多置換IAA誘導体およびそれらの混合物を含み得、そしてさらに、2,4−D、BAP、ABA、ゼアチンリボシド、キネチン、2iPおよびジクマンバからなる群から選択される1以上の化合物を含み得る。いくつかの実施形態において、この再生培地は、5−BrIAA、ならびに1種以上のオーキシン、1種以上のサイトカイニン、1種以上のジベレリン、1種以上のアブシジン酸、およびそれらの混合物からなる群から選択される植物成長調節化合物を含む。いくつかの実施形態において、この再生培地は、5−BrIAA、ゼアチンリボシド、およびABAを含む。いくつかの実施形態において、このカルスは、成熟植物由来であり得る。適切な植物としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:トウモロコシ、コムギ、モロコシ、サトウダイコン、ジャガイモ、ダイズ、イネおよび一般に栽培されている他の食物。いくつかの実施形態において、このカルスは、トウモロコシ由来であり得る。いくつかの実施形態において、このカルスは、種子または種子の一部由来であり得る。いくつかの実施形態において、このカルスは、トウモロコシ種子由来であり得る。いくつかの実施形態において、このカルスは、B73、H99およびPA91からなる群から選択される、トウモロコシ変種由来であり得る。
【0024】
形質転換植物の再生のための方法を提供することが本発明の目的であり、この方法は、植物サンプルを提供する工程、カルス形成培地の存在下で植物サンプルを培養する工程であって、このカルス形成培地が、1つ以上のモノ置換IAA誘導体および/または1つ以上のジ置換IAA誘導体および/または1つ以上の多置換IAA誘導体またはこれらの混合物を含み、そして胚形成カルスを産生するために、1つ以上のさらなる植物成長調節因子(例えば、1つ以上のオーキシン、1つ以上のサイトカイニン、1つ以上のジベレリン、1つ以上のアブシジン酸およびこれらの混合物など)をさらに含む工程、このカルスを形質転換する工程およびカルスの再生を引き起こす条件下でこの形質転換されたカルスをインキュベートする工程を包含する。いくつかの実施形態において、カルス形成培地は、1つ以上のモノ置換IAA誘導体および/または1つ以上のジ置換IAA誘導体および/または1つ以上の多置換IAA誘導体を含み得、そして2,4−D、BAP、ABA、ゼアチンリボシド、キネチン、2iP、およびジクマンバ(dicmamba)からなる群より選択される1つ以上の化合物をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、カルス形成培地は、5−BrIAAならびに1つ以上のオーキシン、1つ以上のサイトカイニン、1つ以上のジベレリン、1つ以上のアブシジン酸およびこれらの混合物からなる群より選択される植物成長調節化合物を含む。いくつかの実施形態において、カルス形成培地は、5−BrIAAならびに2,4−D、BAP、ABA、ゼアチンリボシド、キネチン、2iP、およびジクマンバからなる群より選択される植物成長調節化合物を含む。いくつかの実施形態において、カルス形成培地は、5−BrIAA、2,4−D、BAPおよびABAを含む。いくつかの実施形態において、この方法は、さらに、カルスの再生を引き起こす条件下でカルスを再生培地に移す工程を包含し、この再生培地は、1つ以上のモノ置換IAA誘導体および/または1つ以上のジ置換IAA誘導体および/または1つ以上の多置換IAA誘導体またはこれらの混合物を含み、そして1つ以上のさらなる植物成長調節因子(例えば、1つ以上のオーキシン、1つ以上のサイトカイニン、1つ以上のジベレリン、1つ以上のアブシジン酸およびこれらの混合物など)をさらに含む。本発明のいくつかの実施形態において、再生培地は、1つ以上のモノ置換IAA誘導体および/または1つ以上のジ置換IAA誘導体および/または1つ以上の多置換IAA誘導体およびこれらの混合物を含み、そして2,4−D、BAP、ABA、ゼアチンリボシド、キネチン、2iP、およびジクマンバからなる群より選択される1つ以上の化合物をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、再生培地は、5−BrIAAならびに1つ以上のオーキシン、1つ以上のサイトカイニン、1つ以上のジベレリン、1つ以上のアブシジン酸およびこれらの混合物からなる群より選択される植物成長調節化合物を含む。いくつかの実施形態において、再生培地は、5−BrIAA、ゼアチンリボシド、およびABAを含む。いくつかの実施形態において、カルス形成培地は、再生培地とは異なる。いくつかの実施形態において、植物組織サンプルは、成熟植物組織から誘導され得る。適切な植物としては、限定しないが、トウモロコシ、コムギ、モロコシ、サトウダイコン、ジャガイモ、ダイズ、イネ、および通常栽培される他の植物が挙げられる。いくつかの実施形態において、植物サンプルは、トウモロコシから誘導され得る。いくつかの実施形態において、植物サンプルは、種子または種子の一部分であり得る。いくつかの実施形態において、植物サンプルは、トウモロコシの種子から誘導され得る。いくつかの実施形態において、植物サンプルは、B73、H99、およびPA91からなる群より選択されるトウモロコシの品種由来の種子または種子の一部であり得る。いくつかの実施形態において、この方法は、カルスを再生培地に移す前にこのカルスを増幅させるさらなる工程を包含し得る。他の実施形態において、この方法は、さらに、サンプルの切除の前に低下した温度で植物組織をインキュベートする工程を包含し得る。いくつかの実施形態において、低下した温度は、約0℃〜約20℃、好ましくは約0℃〜約10℃、より好ましくは約0℃〜約5℃、そして最も好ましくは約4℃であり得る。いくつかの実施形態において、1つ以上の工程が、膜に基づく液体培養物中で実行される。
【0025】
形質転換植物の再生のための方法を提供することが本発明の目的であり、この方法は、植物サンプルを提供する工程、植物サンプルを形質転換する工程、ならびにこの植物サンプルをカルス形成培地の存在下で培養して形質転換されたカルスを生成する工程であって、このカルス形成培地が、1つ以上のモノ置換IAA誘導体および/または1つ以上のジ置換IAA誘導体および/または1つ以上の多置換IAA誘導体またはこれらの混合物を含み、そして1つ以上のさらなる植物成長調節因子(例えば、1つ以上のオーキシン、1つ以上のサイトカイニン、1つ以上のジベレリン、1つ以上のアブシジン酸およびこれらの混合物など)をさらに含む工程、ならびにこのカルスの再生を引き起こす条件下でこの形質転換されたカルスをインキュベートする工程を包含する。いくつかの実施形態において、カルス形成培地は、1つ以上のモノ置換IAA誘導体および/または1つ以上のジ置換IAA誘導体および/または1つ以上の多置換IAA誘導体を含み得、そして2,4−D、BAP、ABA、ゼアチンリボシド、キネチン、2iP、およびジクマンバからなる群より選択される1つ以上の化合物をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、カルス形成培地は、5−BrIAAならびに1つ以上のオーキシン、1つ以上のサイトカイニン、1つ以上のジベレリン、1つ以上のアブシジン酸およびこれらの混合物からなる群より選択される植物成長調節化合物を含む。いくつかの実施形態において、カルス形成培地は、5−BrIAAならびに2,4−D、BAP、ABA、ゼアチンリボシド、キネチン、2iP、およびジクマンバからなる群より選択される植物成長調節化合物を含む。いくつかの実施形態において、カルス形成培地は、5−BrIAA、2,4−D、BAPおよびABAを含む。いくつかの実施形態において、この方法は、さらに、カルスの再生を引き起こす条件下でカルスを再生培地に移す工程を包含し、この再生培地は、1つ以上のモノ置換IAA誘導体および/または1つ以上のジ置換IAA誘導体および/または1つ以上の多置換IAA誘導体またはこれらの混合物を含み、そして1つ以上のさらなる植物成長調節因子(例えば、1つ以上のオーキシン、1つ以上のサイトカイニン、1つ以上のジベレリン、1つ以上のアブシジン酸およびこれらの混合物など)をさらに含む。本発明のいくつかの実施形態において、再生培地は、1つ以上のモノ置換IAA誘導体および/または1つ以上のジ置換IAA誘導体および/または1つ以上の多置換IAA誘導体およびこれらの混合物を含み得、そして2,4−D、BAP、ABA、ゼアチンリボシド、キネチン、2iP、およびジクマンバからなる群より選択される1つ以上の化合物をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、再生培地は、5−BrIAAならびに1つ以上のオーキシン、1つ以上のサイトカイニン、1つ以上のジベレリン、1つ以上のアブシジン酸およびこれらの混合物からなる群より選択される植物成長調節化合物を含む。いくつかの実施形態において、再生培地は、5−BrIAA、ゼアチンリボシド、およびABAを含む。いくつかの実施形態において、カルス形成培地は、再生培地とは異なる。いくつかの実施形態において、植物組織サンプルは、成熟植物組織から誘導され得る。適切な植物としては、限定しないが、トウモロコシ、コムギ、モロコシ、サトウダイコン、ジャガイモ、ダイズ、イネ、および通常栽培される他の植物が挙げられる。いくつかの実施形態において、植物サンプルは、トウモロコシから誘導され得る。いくつかの実施形態において、植物サンプルは、種子または種子の一部分であり得る。いくつかの実施形態において、植物サンプルは、トウモロコシの種子から誘導され得る。いくつかの実施形態において、植物サンプルは、B73、H99、およびPA91からなる群より選択されるトウモロコシの品種由来の種子または種子の一部であり得る。いくつかの実施形態において、この方法は、カルスを再生培地に移す前にこのカルスを増幅させるさらなる工程を包含し得る。他の実施形態において、この方法は、さらに、サンプルの切除の前に低下した温度で植物組織をインキュベートする工程を包含し得る。いくつかの実施形態において、低下した温度は、約0℃〜約20℃、好ましくは約0℃〜約10℃、より好ましくは約0℃〜約5℃、そして最も好ましくは約4℃であり得る。いくつかの実施形態において、1つ以上の工程が、膜に基づく液体培養物中で実行される。
【0026】
形質転換植物の再生のための方法を提供することが本発明の目的であり、この方法は、植物サンプルを提供する工程、植物サンプルを形質転換する工程、ならびにこの植物サンプルを再生培地(1つ以上のモノ置換IAA誘導体および/または1つ以上のジ置換IAA誘導体および/または1つ以上の多置換IAA誘導体またはこれらの混合物を含み、そして1つ以上のさらなる植物成長調節因子(例えば、1つ以上のオーキシン、1つ以上のサイトカイニン、1つ以上のジベレリン、1つ以上のアブシジン酸およびこれらの混合物など)をさらに含む)の存在下で培養する工程を包含する。本発明のいくつかの実施形態において、再生培地は、1つ以上のモノ置換IAA誘導体および/または1つ以上のジ置換IAA誘導体および/または1つ以上の多置換IAA誘導体およびこれらの混合物を含み得、そして2,4−D、BAP、ABA、ゼアチンリボシド、キネチン、2iP、およびジクマンバからなる群より選択される1つ以上の化合物をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、再生培地は、5−BrIAAならびに1つ以上のオーキシン、1つ以上のサイトカイニン、1つ以上のジベレリン、1つ以上のアブシジン酸およびこれらの混合物からなる群より選択される植物成長調節化合物を含む。いくつかの実施形態において、再生培地は、5−BrIAA、ゼアチンリボシドおよびABAを含む。いくつかの実施形態において、植物組織サンプルは、成熟植物組織から誘導され得る。適切な植物としては、限定しないが、トウモロコシ、コムギ、モロコシ、サトウダイコン、ジャガイモ、ダイズ、イネ、および通常栽培される他の植物が挙げられる。いくつかの実施形態において、植物サンプルは、トウモロコシから誘導され得る。いくつかの実施形態において、植物サンプルは、種子または種子の一部分であり得る。いくつかの実施形態において、植物サンプルは、トウモロコシの種子から誘導され得る。いくつかの実施形態において、植物サンプルは、B73、H99、およびPA91からなる群より選択されるトウモロコシの品種由来の種子または種子の一部であり得る。他の実施形態において、この方法は、さらに、サンプルの切除の前に低下した温度で植物組織をインキュベートする工程を包含し得る。いくつかの実施形態において、低下した温度は、約0℃〜約20℃、好ましくは約0℃〜約10℃、より好ましくは約0℃〜約5℃、そして最も好ましくは約4℃であり得る。いくつかの実施形態において、1つ以上の工程が、膜に基づく液体培養物中で実行される。
【0027】
本発明はまた、本発明の方法を実行するためのキットに関し、特に、カルス(好ましくは、胚形成カルス)を再生する際における使用のためのキットに関する。いくつかの好ましい実施形態において、本発明は、植物サンプルの形質転換および/または再生のためのキットを提供し得る。このようなキットは、1つ以上の容器、1つ以上の培地形成処方物、固体支持体(例えば、膜および/または寒天)を含み得る。このようなキットは、必要に応じて、1つ以上の適切な緩衝液、1つ以上のサイトカイニン、および1つ以上のオーキシンからなる群より選択される1つ以上のさらなる成分を含み得る。
【0028】
本発明の他の好ましい実施形態は、以下の図面、本発明の記載を考慮して、そして特許請求の範囲を考慮して、当業者に明かである。
【0029】
(発明の詳細な説明)
(定義)
以下の記載において、生物工学の当業者によって通常使用される多数の用語が広範に使用される。明細書および特許請求の範囲(このような用語に与えられる範囲を含む)の明確かつより一貫した理解を提供するために、以下の定義が提供される。
【0030】
本明細書中で使用される用語IAA誘導体または5−ブロモインドール−3−酢酸または5−BrIAAは、遊離酸形態だけではなく、IAA誘導体または5−BrIAAのアミド、エステル、または塩の形態をいう。適切なIAA誘導体は、1996年11月29日に出願されたAuxinic Analogues of Indole−3−Acetic Acidと題された米国特許出願第08/758,416号(本明細書中において参考として具体的に援用される)に記載される。IAA誘導体または5−BrIAAの意味には、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、ジメチルアミン、エタノールアミンなどの塩およびアミドおよび低級アルキルエステルのような、塩およびエステル誘導体を含む。
【0031】
本明細書中に使用される場合、用語「植物成長調節因子」または「ホルモン」は、植物の成長に影響を与えるホルモンとして作用する天然に存在する化合物または合成化合物をいう。重要な成長調節因子は、オーキシン、サイトカイニン、アブシジン酸およびジベレリンによって例示される。
【0032】
用語「オーキシン」は、本明細書中に使用される場合、植物の成長に影響を与える植物成長調節因子をいう。オーキシンは、例えば、インドール−3−酢酸(IAA)、インドール−3−酪酸(IBA)、2,4−ジクロロフェノキシ酢酸(2,4−D)、ナフタレン酢酸(NAA)、5,6−ジクロロインドール−3−酢酸(5,6−Cl2−IAA)などの化合物によって例示される。
【0033】
用語「サイトカイニン」は、本明細書中に使用される場合、植物の成長に影響を与える植物成長調節因子をいう。サイトカイニンは、例えば、6−ベンジルアミノプリン(BAP)、N6(Δ2−イソペンテニル)アデニン(2iP)、イソペンテニルピロリン酸(ipp)、6−(4−ヒドロキシ−3−メチル−2−トランスブテニルアミノ)プリン(ゼアチン)、6−フルフリルアミノプリン(キネチン)などの化合物によって例示される。化合物は、バイオアッセイを用いてオーキシン活性に関して試験され得る(例えば、Avena sativaの子葉鞘の伸長(Bottgerら(1978)Planta 140:89)またはハクサイの根の成長阻害(Marumoら(1974)Plant Growth Substance,419頁,Hirokawa Publishing Co.,Inc.,Tokyo)または緑豆の胚軸膨張(Marumoら(1974)前出)。サイトカイニン活性は、当該分野で周知であるような植物の成長促進を評価するために設計されたアッセイ(例えば、タバコアッセイなど)において測定され得る(Skoogら(1967)Phytochem 6:1169−1192;Morris(1986)Ann.Rev.Plant Physiol.37:509−538;Horgan(1984)Advanced Plant Physiol.(Wilkins,M.B.編)53−75頁,Pitman Publishing,London;LethamおよびPalni(1983)Ann.Rev.Plant Physiol.34:163−197;ならびにChen(1981)Metabolism and Molecular Activities of Cytokinins(Guern,J.およびPeaud−Lenoel,C.編,Springer,New York,34−43頁)。サイトカイニン/オーキシンの濃度比のバリエーションは、植物の成長の増殖を特定の組織で優先的に生じさせる。例えば、高いサイトカイニン/オーキシン比は、苗条の成長を促進し、オーキシンに対して低いサイトカイニンの比は、根の成長を促進する(Depickerら(1983)Genetic Engineering of Plants、T.Kosunge,C.P.MeredithおよびA.Hollaender編、Plenum Press,New York,154頁)。
【0034】
用語「培地」または「培養培地」は、本明細書中に使用される場合、生育力を維持し、植物サンプルの成長および/または再生を支持し得る組成物をいう。一般的に使用される培地としては、MS培地(Life Technologies,Inc.Rockville,MDから市販される)およびN6培地(Sigma,St.Louis,MOから市販される)が挙げられる。
【0035】
用語「植物サンプル」は、本明細書中に使用される場合、全体の植物または植物の一部をいう。この用語は、植物の部位、植物の細胞、植物の組織、外植片、植物の種子、または植物の種子の一部を含むようであるが、これらに限定されない。この用語はさらに、懸濁培養物または組織培養物の形態の植物(カルス、プロトプラスト、胚、器官、オルガネラなどの培養物が挙げられるが、これらに限定されない)を意図する。
【0036】
植物、植物サンプルおよび/または植物組織に関する場合の用語「形質転換した(形質転換された)」は、本明細書中に使用される場合、植物、植物サンプルおよび/または植物組織への外来核酸の導入をいう。外来核酸は、DNA、RNA、DNAおよびRNAの混合物または1つ以上の分子がリボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドの両方を含むハイブリッドであり得る。
【0037】
用語「トランスジェニック植物」または「トランスジェニック植物組織」は、本明細書中に使用される場合、個々の植物細胞に導入される外来核酸分子を用いて安定に形質転換された、植物または植物組織をいう。
【0038】
用語「発現」は、DNA分子からのRNAの合成をいう。一過性発現は、有限期間のみ生じる発現である。一般的に、一過性発現は、DNAの導入直後に宿主細胞に導入されたDNA分子から生じる発現をいうために使用される。
【0039】
用語「遺伝子操作」は、本明細書中に使用される場合、外来(しばしばキメラの)遺伝子の、生存した全体の植物に再生し得る1つ以上の植物細胞への導入をいう。従って、いくつかの場合、生成された植物は、自己授粉するか、または同じ種の別の植物と交雑授粉され得、その結果、生殖細胞系に保有される外来遺伝子は、農業的に有用な植物品種に導入されるかまたはこれに交配され得る。
【0040】
用語「再生」は、本明細書中に使用される場合、培養植物サンプルまたは培養植物単位(例えば、葉のディスク(leaf disc)、種子など)からの、少なくとも1つの新規に発生または再生された植物組織(例えば、根、苗条、カルスなど)の生成をいう。
【0041】
用語「再生の割合」「%再生」または「再生率」は、本明細書中に使用される場合、組織培養された植物単位の総数の百分率としての、少なくとも1つの新規に発生または再生された組織を生成する組織培養された植物単位の数をいう(例えば、(新規に発生した組織を有する植物単位の数/植物単位の総数)×100)。
【0042】
用語「植物成長に影響を与える(こと)」または「増殖に影響を与える(こと)」または「影響を与える因子(affector)」または「影響」は、本明細書中に使用される場合、成長調節因子の非存在下で観察されることに対して、全体的な植物成長のいくつかの特徴を改善または変化させる多数の植物応答のうちの任意の1つをいい、これには、発根を含む種子の出芽刺激、苗条の抑制、細胞増殖の促進、カルス成長の刺激などが挙げられる、これらに限定されない。
【0043】
用語「有効量」は、本明細書中に使用される場合、植物に投与される植物成長調節因子またはホルモンである化合物が種々の植物成長応答のうちの1つ以上を刺激または引き起こすような、この化合物の量または濃度をいう。植物成長応答としては、幹の伸長の誘導、根の形成の促進、カルス形成の刺激、葉の成長の増強、種子の出芽刺激、多数の植物および植物の一部の乾燥重量含有量の増加などが挙げられるが、これらに限定されない。
【0044】
句「膜に基づく液体培養」とは、本明細書中に使用される場合、植物サンプルを培養する方法をいい、ここで、サンプルは、液体培地の頂部でフロートによって支持される膜の頂部に配置される。この技術のより詳細な議論は、Linら,In vitro,31:30A(1995)およびLinら,Focus 17(3):95(1995)に提供される。この技術は、Life Technologies,Inc.Rockville MDから市販される試薬および装置を用いて実行され得る。
【0045】
本発明は、IAA誘導体(特に5−BrIAA)が、植物成長に影響を与える化合物としての有用性を有するという発見に関する。5−BrIAAは、単子葉植物および双子葉植物の両方においてオーキシンとして機能する際にIAAよりも優れていることが見いだされた。従って、本発明は、少なくとも1つのIAA誘導体を含む植物の成長に影響を与えるための新規組成物を意図する。いくつかの実施形態において、本発明の新規組成物は、5−BrIAAを含む。
【0046】
いくつかの好ましい実施形態において、本発明の新規組成物の成長効果は、植物組織からの胚発生カルスの生成を刺激することである。例えば、5−BrIAAは、Arabidopsis thaliana由来の緑色カルスの再生を刺激する際に、IAAよりも2倍と4倍との間でより有効であった。Arabidopsis組織培養の応答に関する先行技術の教示である「カルス誘導および再生の頻度は、根に関して高く、葯および幹に関して低く、そして葉の外植片に関して最も低い」ということを考慮すると、5−BrIAAの効果はいっそう顕著である。本発明に従って、5−BrIAAは、Arabidopsis thalianaの葉からの再生に関して100%の効率を提供する(米国特許第5,674,731号を参照のこと)。
【0047】
いくつかの好ましい実施形態において、本発明の新規組成物の成長効果は、植物サンプルの再生の刺激であり得る。本発明の組成物は、植物サンプルの再生に関する先行技術の組成物よりも、予想外に優れている。5−BrIAAの優位性はまた、単子葉植物の再生において観察された。単子葉植物(例えば、イネ)から組織再生を得るために使用された先行技術の方法は、約3ヶ月および2つ以上の異なる培養培地での未成熟な種子のインキュベーションを必要とする。対照的に、オーキシンとして5−BrIAAを使用する本発明に従って、成熟な種子に由来するイネの胚性カルスからの苗条の再生は、約1ヶ月半で得られ、5−BrIAAおよびサイトカイニン(例えば、BAP)を含むインキュベーション培地を1つのみ必要とし、100%の再生率をもたらした。植物組織およびトランスジェニック植物組織からの再生を示すために実行された全てのアッセイにおいて、5−BrIAAは、オーキシンとして機能して、IAA(当該分野のオーキシンの標準物)と少なくとも同様に、そして多くの場合IAAよりも良好に、成長を刺激した。
【0048】
本発明の成長に影響を与える組成物は、1つ以上のインドール−3−酢酸(IAA)誘導体を、必要に応じて1つ以上のさらなる成長調節因子(例えば、オーキシン、サイトカイニン、ジベレリン、アブシジン酸など)を含む混合物中に含み得る。いくつかの好ましい実施形態において、5−BrIAAまたは5−BrIAAおよび1つ以上のさらなる植物成長調節因子(例えば、オーキシン、アブシジン酸、サイトカイニン、ジベレリンなど)との混合物は、キャリアまたは補助栄養因子と混合され得る。BAP、2iPおよびキネチンの使用は、本発明の特定の実施形態において例示される。当該分野で公知の他のサイトカイニンまたは他の植物成長調節因子が、5−BrIAAと共に使用されて、本発明の成長に影響を与える組成物を作製し得ることが、意図される。1つより多くのサイトカイニンまたは異なる植物成長調節因子(例えば、ジベレリンなど)が、5−BrIAAと混合されて、本発明の成長を増強する組成物を作製し得ることがまた、意図される。同じく、植物成長調節因子の選択は、特定の植物の成長を特徴付けるインキュベーションまたは適用サイクルの異なる段階で変化し得る。植物成長調節因子は、当該分野で公知であり、Skoogら(1967)Phytochemistry 6:1169−1192およびTheologis(1989)Plant Biotechnology(KungおよびArntzen編)Butterworth Publishers,Stoneham,Massに記載されるように、これらとしては、BAP、2iP、ipp、ゼアチン、キネチン、ジベレリンなどが挙げられるがこれらに限定されない。
【0049】
本発明の実施は、広範な種々の植物成長応答を意図し、これらとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない:種子の発芽の刺激および休眠状態の破壊;収量の増加;果実の熟成および色生成の促進;開花および果実の増加;苗条形成の刺激;カルス発生の誘導;発根の誘導および細胞増殖の発生;種々の植物種の耐久性の増加;ならびに多数の植物および植物の一部の乾燥重量含有量の増加。これらの応答の分類に加えて、正味の結果が、農業および園芸の作物もしくは種子の成長に影響を与えるかまたはこれらの任意の有利な特性もしくは所望の特性を最大化する限り、植物、種子、果実または野菜の任意の他の改変は、本発明の実施によって達成された有利な応答の範囲内に含まれることが意図される。
【0050】
植物組織培養物への本発明の増殖を促進する化合物の適切な適用は、苗条、根またはカルスの再生を誘導することが示された。この効果は、単子葉植物種および双子葉植物種の両方において例示され、そして広範な種々の植物に適用可能である。
【0051】
本発明の組成物は、トランスジェニック植物からの植物再生のためにさらに利用された。
【0052】
一般的に、植物の遺伝子操作は、2つの相補的なプロセスを含む。最初のプロセスは、特異的に特徴付けられた型の1つ以上の植物細胞の遺伝子形質転換を含む。形質転換によって、外来遺伝子(代表的には、キメラ遺伝子構築物)は、代表的にベクター(このベクターは、目的の遺伝子を培養物中の植物細胞のゲノムに移入させる能力を有する)の補助を介して個々の植物細胞のゲノムに導入される。次いで、第2のプロセスは、この形質転換された植物細胞の性的に有能な(sexually competent)全体の植物への再生を含む。形質転換プロセスも再生プロセスも、100%成功する必要はないが、妥当な割合の細胞が形質転換されて全体の植物に再生され得るように、妥当な程度の信頼性および再現性を有さなければならない。
【0053】
これら2つのプロセス(形質転換および再生)は、相補的でなければならない。これら2つのプロセスの相補性は、形質転換プロセスによって首尾よく遺伝子的に形質転換される組織が、首尾よく植物全体に再生され得るような型および特徴のものでなければならず、そして首尾よく植物全体に再生され得るように十分に健常であり、反応能があり、かつ活力がなければならないようなものでなければならない。
【0054】
首尾よい形質転換および再生技術は、単子葉植物および双子葉植物に対して、先行技術において実証されてきた。例えば、タバコ植物の形質転換および再生は、Bartonら、Cell 32:1033(1983年4月)において報告されており、一方で綿花の再生は、Umbeckの米国特許第5,004,863号(1991年4月2日発行)において、記載されている。さらに、イネの形質転換および再生は、Abdullahら(1986)Bio/Technology 4:1087−1090によって記載され、一方でトウモロコシは、Rhodesら(1988)Bio/Technology 6:56−60およびScience 240:204−207に記載されるように形質転換および再生された。さらに、成熟種子に由来する培養物からのトウモロコシの再生は、米国特許第4,806,483号(1989年2月21日発行)に示されており、そして未熟胚由来の培養物からの再生は、米国特許第5,134,074号(1992年7月28日発行)に示されている。
【0055】
双子葉植物種の細胞の形質転換のために最も通常使用される方法論は、植物病原体Agrobacterium tumefaciensの使用を包含する。Agrobacteriumにより媒介される形質転換は、いくつかの単子葉植物において達成されたが、Wu,Plant Biotechnology(1989)35−51頁,Butterworth Publishers,Stoneham,Massによって記載されるように、遺伝子移入の他の方法(例えば、ポリエチレングリコール法、エレクトロポレーション、直接注入、粒子ボンバードメントなど)が、より効果的であった。本発明は、植物の再生工程を包含する形質転換の任意の方法を用いて、有用である。
【0056】
特定の実施形態において、本発明は、培養物中の植物組織の遺伝的形質転換を想定する。いくつかの実施形態において、これらの組織は、葉円盤(leaf disc)または胚軸外植片由来であり得る。形質転換された組織は、植物全体に再生され得る植物組織構造を形成するよう誘導され得る。他の実施形態において、本発明は、成熟種子由来の培養物における組織の形質転換を考慮する。形質転換された組織は、植物全体に再生され得る。いくつかの実施形態において、この組織は、成熟トウモロコシ種子由来であり得る。
【0057】
いくつかの実施形態において、本発明の形質転換技術は、A.tumefaciensのTiプラスミドを利用する技術であり得る。A.tumefaciens培養物を形質転換ビヒクルとして使用する際には、形質転換された組織の正常な非腫瘍形成性分化が可能であるように、Agrobacteriumの非腫瘍形成性株をベクターキャリアとして使用することが、最も有利である。効果的であるためには、一旦、植物細胞に導入されると、目的の外来遺伝子を含むキメラ構築物は、植物細胞において目的の遺伝子の転写を引き起こすために効果的なプロモーターおよびポリアデニル化配列または転写制御配列(これらもまた、植物細胞において認識される)を含み得る。植物細胞において効果的であることが公知のプロモーターとしては、AgrobacteriumのT−DNAから単離されたノパリンシンターゼプロモーター、およびカリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーターが挙げられる。他の適切なプロモーターが、当該分野において公知である。形質転換された細胞が培養物中で形質転換されていない細胞から選択され得るように、目的の外来遺伝子を保有するベクターが、1つ以上の選択マーカー遺伝子をも内部に含むこともまた好ましい。多くの用途において、好ましいマーカー遺伝子は、抗生物質抵抗性遺伝子および/または除草剤抵抗性遺伝子を含み、その結果、適切な抗生物質および/または除草剤を使用して、形質転換された細胞を、形質転換されていない細胞から分離および選択し得る。
【0058】
このような目的の外来遺伝子を含むベクターの構築の詳細は、植物遺伝子工学の当業者に公知であり、そしてタバコ、ペチュニアおよび他のモデル植物種において以前に効果的であることが実証された実施と、本質的に異ならない。外来遺伝子は、明らかに、マーカー遺伝子として(Jeffersonら(1987)EMBO J.6:3901−3907)、または植物細胞において何らかの所望の効果を達成するように、選択されるべきである。この効果は、成長の促進、病気抵抗性、植物形態もしくは植物産物品質の変化、または遺伝子操作によって達成され得る他の任意の変化であり得る。キメラ遺伝子構築物は、1つ以上の外因性タンパク質の発現をコードし得るか、または負鎖RNAの転写を引き起こして、病気プロセスまたは所望でない内因性植物機能のいずれかを制御または阻害し得る。
【0059】
植物組織に対して形質転換および再生のプロセスを開始するためには、最初に組織の表面を滅菌して、得られる培養物の不注意な汚染を防止することが必要である。この組織が種子である場合には、これらの種子を、殺真菌薬を含む適切な発芽培地において発芽させ得る。発芽の4〜10日後、未熟植物の胚軸部分を除去し、そして1片につき平均約0.5センチメートルの小さな断片に切断する。この胚軸外植片を安定化させ、そして液体または寒天の植物組織培養培地において、生存を維持する。
【0060】
一旦、これらの組織を滅菌すると、これらの組織に、形質転換能のある非腫瘍形成性Agrobacteriumの懸濁培養物をすぐに接種し得る。接種プロセスは、短時間(例えば、2日間)にわたって、室温(すなわち、24℃)で続けられる。
【0061】
接種時間の終了時に、残りの処理された組織を選択寒天培地に移し得る。この培地は、Agrobacteriumに対して毒性であるが植物組織に対しては毒性ではない、1つ以上の抗生物質を、培養物中に残っている任意のAgrobacteriumを殺傷するに十分な濃度で含む。このような培地において使用するために適した抗生物質としては、カルベニシリン、セフォタキシムなど(Agrobacteriumに対する殺菌薬として)、およびカナマイシン、ハイグロマイシン、PPTなど(形質転換された植物組織に対する選択的抗生物質として)が挙げられるが、これらに限定されない。
【0062】
ここで組織は、その通常の成分に加えて選択因子を含む組織培養培地において、培養される。この選択因子(本明細書中においてはカナマイシンにより例示される)は、形質転換されていない細胞に対しては毒性であるが、この選択因子に対する遺伝抵抗性を組み込まれ、そしてこの抵抗性を発現する、形質転換された細胞に対しては、毒性ではない。適切な組織培養培地は、抗生物質ありまたはなしで植物ホルモン5−BrIAAおよびサイトカイニンが添加された、MS培地である。生存している形質転換された組織は、二次培地に移されて、組織再生を誘導され得る。従って、この生存している形質転換された組織は、本発明の再生技術、または他の任意の代替の植物再生プロトコルを介して、植物全体に再生され続ける。
【0063】
本発明の方法は、カルス(好ましくは、胚形成カルス)の、植物サンプルからの生成のための方法を包含する。植物サンプルからのカルスの生成の効率は、このサンプルを低温でのインキュベーションに供することによって、増加し得ることが、予測に反して見出された。低温とは、インキュベーションの温度が室温より低いことを意味する。いくつかの実施形態において、サンプルは、約0℃〜約15℃、好ましくは、約0℃〜約10℃、そしてより好ましくは、約0℃〜約5℃の温度で、インキュベートされ得る。他の実施形態において、植物サンプルは、凍結され得る。低温でのインキュベーションは、植物サンプルからのカルスの生成を刺激するに十分な時間にわたって実施され得る。いくつかの実施形態において、インキュベーションは、約1時間〜約10日間、好ましくは、約1日間〜約7日間、そしてより好ましくは、約4日間実施され得る。いくつかの実施形態において、インキュベーションは、サンプルが周囲大気に曝露している間に実施され得る。例えば、サンプルは、冷蔵庫内でインキュベートされ得る。いくつかの実施形態において、インキュベーションは、サンプルが液体に曝露している間に実施され得る。いくつかの実施形態において、サンプルは、水中に浸漬されている間に低温でインキュベートされ得る。他の実施形態において、サンプルは、塩および/または緩衝剤の溶液中に浸漬されている間に、低温でインキュベートされ得る。いくつかの実施形態において、サンプルは、植物の成長に影響を与える化合物を含む溶液に浸漬され得る。いくつかの実施形態において、サンプルは、1種以上の本発明のIAA誘導体(例えば、5−BrIAA)を含む溶液中で、低温でインキュベートされ得る。
【0064】
本発明の実施において使用される成長に影響を与える組成物の正確な量は、所望の応答の型、使用される処方物および処理される植物の型に依存する。本発明は、約50.0と0.001との間、そして好ましくは、約5.0と0.05との間、そしてより好ましくは、約2.0と0.25との間の、サイトカイニン濃度対オーキシン濃度の比の使用を意図する。成長に影響を与える化合物の濃度は、代表的に、約1μg/mL〜約100mg/mL、好ましくは約500μg/mL〜約10mg/mL、そしてより好ましくは、約1mg/mL〜約5mg/mLの範囲内である。
【0065】
本発明の成長を増強する組成物の活性成分として使用される、化学化合物は、先行技術において周知のプロセスによって調製され得るか、または容易に利用可能な供給源から市販で入手され得る。
【0066】
本発明の組成物は、植物種の任意の発達段階において適用されて、使用される濃度、使用される処方物、および処理される植物種の型に依存して、成熟の間中植物ホルモンまたは維持効果を得、そして初期の発達段階の間に損傷した組織において、再成長を促進し得る。
【0067】
本発明の組成物は、好ましくは、特定の補助的栄養剤または他の植物成長調節因子と、特定の相乗的な成長増強応答を種々の型の植物において達成するために正確な割合で組み合わせられて使用される。本発明の組成物は、さらに、殺真菌薬と組み合わせて使用されて、種々の植物の病気抵抗性を増加させ得、天然の病気の免疫性を調節する酵素および植物のプロセスに影響を与えることによって、この植物組織を、病原体による侵入に対して抵抗性にする。本発明の組成物は、それ自体では植物に有毒な活性を本質的に有さないが、これらは時々、除草剤と組み合わせて使用されて、所望でない植物を除草剤に対してより感受性にするために、このような植物の成長に刺激を与え得る。しかし、本発明の実施において達成される結果を、農作物および園芸作物、ならびに多年生家庭植物種および一年生家庭植物種における成長増強応答とみなすことが、好ましい。
【0068】
以下の実施例は、種々の植物種に対する本発明の好ましい組成物の適用によって実現され得る、広範な植物成長応答の例示である。それにもかかわらず、本発明が活性成分のこれらの最適な比に限定されることは意図されない。なぜなら、当業者は、本明細書中上記に記載される本発明の組成物が、効果的な成長エンハンサーであることを見出すからである。また、本発明による組成物を、本明細書中に具体的には示されない他の植物、種子、果実および野菜と組み合わせて使用する、改善された結果の認識は、容易に当業者の能力の範囲内であることを、当業者は容易に想到するはずである。以下の実施例は、本発明の範囲を限定することなく、本発明の有用性を説明する役に立つ。
【0069】
本明細書中に記載される方法および適用に対する、他の適切な改変および適合が明らかであり、そして本発明の範囲からもそのいかなる実施形態からも逸脱することなくなされ得ることが、関連分野の当業者に容易に明らかである。本発明を詳細に記載したが、本発明は、以下の実施例を参照してさらに明瞭に理解される。これらの実施例は、本発明を説明するためのみの目的で本明細書中に組み込まれ、そして本発明を制限することは意図されない。
【0070】
(実施例1)
(培養培地の調製)
MS塩ベースの培地については、GIBCO BRL Murashige and Skoog(MS)Complete Medium−50X Concentrate(カタログ番号10494−011)を用いた。20mlの各々の成分、Salt I、Salt IIおよびAcid Solubleを、メンブレンに基づく液体増殖様式のために、940mlの滅菌水と混合した。培養を半固体様式で行う場合は、0.8%アガーまたは0.25%Gelrite(Sigma.カタログ番号G1910)のいずれかを、この混合物中に加えた。N6塩+B5ビタミンについては、CHU(N6)基本塩混合物(Sigma、カタログ番号C1416)を1mlのGamborgのビタミン溶液(Sigma、カタログ番号G1019)と混合し、最終容量1Lの培地調製物とした。
【0071】
基本培地に植物成長調節混合物の1つを補充した。この培地に添加した調節因子およびこの培地中のその最終濃度を、表1に示す。
【0072】
【表1】
(実施例2)
(培養用の植物組織サンプルの調製)
スイートコーン(トウモロコシ)(Zea mays)の種子をUSDA、Iowaから入手した。登録番号は、PA91についてAmes19325;H99についてAmes 15931、そしてV924−6についてPI 550473である。トウモロコシの種子を最初に30分間、穏やかに攪拌しながら滅菌水中に入れておくことによって滅菌した。次いで、この種子を95%アルコールに1分間浸した。このアルコール溶液を取り除いて、種子を枝付きフラスコ中に入れた。15%の市販の漂白剤+0.1% Tween(登録商標)(ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノラウレート)の溶液を用意して、このフラスコに添加した。振盪しながら20分間この種子に真空を付与した。真空を取り除き、そしてさらに25分間振盪を続けた。この種子をクリーンフード中で滅菌水により3回リンスした。いくつかの実施形態では、この種子を、室温で滅菌水にさらに5日間浸漬してもよい。他の実施形態では、この種子を室温で1日間浸漬し、その後滅菌水中で4℃でインキュベートしてもよい。
【0073】
この時点で、胚は、解剖顕微鏡下で種子から切り取られ得る。この胚は3つの切片(頂部、中間部、根部)に切断され得、ここで中間切片は、図1に示すように、頂部および根部切片の一部を有する。
【0074】
(実施例3)
(組織サンプルからの胚形成性カルスの生成)
好ましい実施形態において、種子由来の成熟胚の中間切片を、胚形成性カルス形成の刺激用の異なる成長調節因子混合物を含む、MS培地上に配置し得る。この中間切片は、この根部領域が培地に接触するように、または傍らに配置されるべきであり、ただし決して上下逆には配置されるべきではない。次いで、この切片を6〜8週間、暗野で25℃でインキュベートする。
【0075】
成長調節因子の種々の混合物を、それらが胚形成性カルスの形成を刺激する能力について試験した。PA91成熟種子(20〜30種子)を、上記のように、表面滅菌し、切り取って、異なる植物成長調節因子混合物を含有するMS培地上に移した。表2に示す結果は、2ヶ月間、暗野における室温での組織のインキュベーション後に得られた。
【0076】
【表2】
SECF−1で観察された刺激効果が、他のトウモロコシの品種でも見られるか否かを決定するため、多数の異なる品種を試験した。成熟種子(20〜30種子)を、上記のように、表面滅菌し、切り取って、異なる植物成長調節因子混合物を含有するN6+B5ビタミン培地上に移した。表3に示す結果は、2ヶ月間、暗野における室温での組織のインキュベーション後に得られた。数値は、それぞれの処理において胚形成性カルスを形成した組織サンプルの%の数値である。
【0077】
【表3】
凝固試薬の型および塩培地の組成物の関数として形成された胚形成性カルスの%値を比較した。PA91成熟種子(20〜30種子)を、上記のように、表面滅菌し、切り取って、植物成長調節因子混合物SECF−3を含有する異なる培地上に移した。メンブレンに基づく液体培養を以下のとおり実施した:PA91成熟種子(20〜30種子)を、Linら(FOCUS 17,95,1995)に記載のように、表面滅菌し、切り取って、メンブレンに基づく液体培養中のLifeRaftメンブレン上で培養した。表4に示す結果は、2ヶ月間、暗野における室温での組織のインキュベーション後に得られた。
【0078】
【表4】
胚形成性カルス形成に対する温度の効果を検討した。上記のように、トウモロコシ種子PA91の表面滅菌後、この種子を5日間室温で滅菌水に浸した。これらの種子の胚形成性カルス形成能力を、4℃で4日間、次に胚の切り取りの前に室温で1日滅菌水に浸漬した種子と比較した。切り取った胚をSECF−1混合物を補充したN6塩+B5ビタミン培地上に移し、そして2ヶ月間室温で暗野週でインキュベートした。結果を表5に示す。
【0079】
【表5】
いくつかの実施形態において、形成されたカルスを増殖することが所望され得る。胚形成性カルス形成の後、このカルスを、カルス増殖用の2mg 2,4−Dを含有するMS塩+N6塩ベースの培地上に移し得る。このカスルを1ヶ月間25℃で、暗野でインキュベートし得る。
【0080】
(実施例4)
(胚形成性カルスからの苗条の再生)
上記のように準備した胚形成性カルスを、異なる植物成長調節因子混合物を含有する、新しい苗条再生培地に移し得る。この胚形成性カルスを、苗条再生のために、2〜3週間、25℃で、16時間光および8時間暗野のサイクルでインキュベートし得る。再生した苗条を、さらなる植物成長のための植物成長調節因子混合物を含有しないMS培地上に移し得る。胚形成性カルスからの苗条の再生に対する、異なる植物成長調節因子混合物の効果を検討した。上記のように準備した胚形成性カルスを、示した苗条再生培地の存在下でインキュベートし、その結果を表6に示す。
【0081】
【表6】
ここで、理解の明確化のために例示および実施例の方法によって、ある程度詳細に本発明を記載してきたが、本発明およびその任意の特定の実施形態の範囲に影響を及ぼすことなく、広範かつ等価な範囲の条件、処方物および他のパラメーター内で、本発明を改変または変化することによって、同等の内容が実施され得ること、ならびにこのような改変または変化が、添付の特許請求の範囲内に包含されることが意図されていることは当業者には明白である。
【0082】
本明細書中に言及されたすべての刊行物、特許および特許出願は、本発明が属する当業者の技術のレベルを示すものであり、そして各個々の刊行物、特許または特許出願が、参考として援用されるべきことが特におよび個々に示されているのと同じ程度まで参考として本明細書に援用される。
【図面の簡単な説明】
【図1】
図1は、本発明の方法に従った培養のための適切な組織サンプルの切除を示すトウモロコシ種子の概略的な表示である。
Claims (56)
- 植物の成長に影響を与える組成物であって、該組成物は、一置換IAA誘導体、二置換IAA誘導体、多置換IAA誘導体、およびこれらの混合物からなる群から選択されるIAA誘導体を含み、そしてさらに少なくとも1種のさらなる植物成長調節因子を含む、組成物。
- 一置換IAA誘導体を含む、請求項1に記載の組成物。
- 5−Br−IAAを含む、請求項1に記載の組成物。
- 2,4−D、BAP、ABA、ゼアチンリボシド、キネチン、2iPおよびジカンバからなる群から選択される1つ以上の化合物を含む、請求項3に記載の組成物。
- 植物の成長に影響を与える組成物であって、該組成物は、一置換IAA誘導体、二置換IAA誘導体、多置換IAA誘導体、およびこれらの混合物からなる群から選択されるIAA誘導体と、少なくとも1種のさらなる植物成長調節因子とを混合することによって形成される、組成物。
- 一置換IAA誘導体と、少なくとも1種のさらなる植物成長調節因子とを混合することによって形成される、請求項5に記載の組成物。
- 5−Br−IAAと、少なくとも1種のさらなる植物成長調節因子とを混合することによって形成される、請求項5に記載の組成物。
- 5−Br−IAAと、以下:2,4−D、BAP、ABA、ゼアチンリボシド、キネチン、2iPおよびジカンバからなる群から選択される少なくとも1つの化合物とを混合することによって形成される、請求項7に記載の組成物。
- 植物サンプルを培養するための培地であって、該培地は、一置換IAA誘導体、二置換IAA誘導体、多置換IAA誘導体、およびこれらの混合物からなる群から選択されるIAA誘導体を含み、そしてさらに少なくとも1種のさらなる植物成長調節因子を含む、培地。
- 一置換IAA誘導体および少なくとも1種のさらなる植物成長調節因子を含む、請求項9に記載の培地。
- 5−Br−IAAおよび少なくとも1種のさらなる植物成長調節因子を含む、請求項9に記載の培地。
- 5−Br−IAAと、以下:2,4−D、BAP、ABA、ゼアチンリボシド、キネチン、2iPおよびジカンバからなる群から選択される1つ以上の化合物とを含む、請求項9に記載の培地。
- 植物の成長に影響を与える方法であって、該方法は、以下:
植物サンプルに、影響量の植物の成長に影響を与える組成物を適用する工程であって、該組成物は、一置換IAA誘導体、二置換IAA誘導体、多置換IAA誘導体、およびこれらの混合物からなる群から選択されるIAA誘導体を含み、そしてさらに少なくとも1種のさらなる植物成長調節因子を含む、工程、
を包含する、方法。 - 前記植物の成長に影響を与える組成物が、一置換IAA誘導体を含む、請求項13に記載の方法。
- 前記植物の成長に影響を与える組成物が、5−Br−IAAを含む、請求項13に記載の方法。
- 2,4−D、BAP、ABA、ゼアチンリボシド、キネチン、2iPおよびジカンバからなる群から選択される1つ以上の化合物をさらに含む、請求項15に記載の方法。
- 植物サンプルを再生する方法であって、該方法は、以下の工程:
植物サンプルの再生を引き起こす条件下で、該植物サンプルを培地と接触させる工程であって、ここで、該培地が、一置換IAA誘導体、二置換IAA誘導体、多置換IAA誘導体、およびこれらの混合物からなる群から選択されるIAA誘導体を含み、そして1種以上のさらなる植物成長調節因子をさらに含む、工程、
を包含する、方法。 - 前記培地が、一置換IAA誘導体を含む、請求項17に記載の方法。
- 前記培地が、5−Br−IAAを含む、請求項17に記載の方法。
- 前記培地が、2,4−D、BAP、ABA、ゼアチンリボシド、キネチン、2iPおよびジカンバからなる群から選択される1つ以上の化合物をさらに含む、請求項19に記載の方法。
- 植物サンプルを再生する方法であって、該方法は、以下の工程:
カルスの形成を引き起こす条件下で、カルス形成培地と接触したサンプルを培養する工程であって、該カルス形成培地が、一置換IAA誘導体、二置換IAA誘導体、多置換IAA誘導体、およびこれらの混合物からなる群から選択されるIAA誘導体を含み、そして1種以上のさらなる植物成長調節因子をさらに含む、工程;
該カルスを、該植物サンプルの再生を引き起こす条件下の培地に移す工程、
を包含する、方法。 - 前記カルス形成培地が、一置換IAA誘導体を含む、請求項21に記載の方法。
- 前記カルス形成培地が、5−Br−IAAを含む、請求項21に記載の方法。
- 前記カルス形成培地が、2,4−D、BAP、ABA、ゼアチンリボシド、キネチン、2iPおよびジカンバからなる群から選択される1つ以上の化合物を含む、請求項23に記載の方法。
- 植物サンプルから胚形成カルスを生成するための方法であって、該方法は、以下の工程:
胚形成カルスの生成を引き起こす条件下で、該植物サンプルを、組成物と接触させる工程であって、該組成物は、一置換IAA誘導体、二置換IAA誘導体、多置換IAA誘導体、およびこれらの混合物からなる群から選択されるIAA誘導体を含み、そして1種以上のさらなる植物成長調節因子をさらに含む、工程、
を包含する、方法。 - 前記組成物が、一置換IAA誘導体を含む、請求項25に記載の方法。
- 前記組成物が、5−Br−IAAを含む、請求項25に記載の方法。
- 前記組成物が、2,4−D、BAP、ABA、ゼアチンリボシド、キネチン、2iPおよびジカンバからなる群から選択される1つ以上の化合物を含む、請求項27に記載の方法。
- 植物サンプルから胚形成カルスを生成するための方法であって、該方法は、以下の工程:
植物サンプルを、減少した温度でインキュベートする工程;
胚形成カルスの生成を引き起こす条件下で、該植物サンプルを、組成物と接触させる工程であって、該組成物は、一置換IAA誘導体、二置換IAA誘導体、多置換IAA誘導体、およびこれらの混合物からなる群から選択されるIAA誘導体を含み、そして1種以上のさらなる植物成長調節因子をさらに含む、工程、
を包含する、方法。 - 前記組成物が、一置換IAA誘導体を含む、請求項29に記載の方法。
- 前記組成物が、5−Br−IAAを含む、請求項29に記載の方法。
- 前記組成物が、2,4−D、BAP、ABA、ゼアチンリボシド、キネチン、2iPおよびジカンバからなる群から選択される1つ以上の化合物を含む、請求項31に記載の方法。
- 前記減少した温度が、約0℃〜約10℃の温度である、請求項29に記載の方法。
- 前記減少した温度が、約4℃である、請求項29に記載の方法。
- カルスから苗条を再生する方法であって、該方法は、以下の工程:
カルスを再生培地と接触させる工程であって、該生成培地が、一置換IAA誘導体、二置換IAA誘導体、多置換IAA誘導体、およびこれらの混合物からなる群から選択されるIAA誘導体を含み、そして1種以上のさらなる植物成長調節因子をさらに含む、工程;ならびに
該カルスからの苗条の再生を引き起こす条件下で、該カルスをインキュベートする工程、
を包含する、方法。 - 前記再生培地が、一置換IAA誘導体を含む、請求項35に記載の方法。
- 前記再生培地が、5−Br−IAAを含む、請求項35に記載の方法。
- 前記再生培地が、2,4−D、BAP、ABA、ゼアチンリボシド、キネチン、2iPおよびジカンバからなる群から選択される1つ以上の化合物を含む、請求項37に記載の方法。
- 形質転換された植物サンプルを再生する方法であって、該方法は、以下の工程:
胚形成カルスの形成を引き起こす条件下、カルス形成培地の存在下で、植物サンプルを培養する工程であって、ここで、該カルス形成培地が、一置換IAA誘導体、二置換IAA誘導体、多置換IAA誘導体、およびこれらの混合物からなる群から選択されるIAA誘導体を含み、そして1種以上のさらなる植物成長調節因子をさらに含む、工程;
該胚形成カルスを形質転換する工程;ならびに
該植物サンプルの再生を引き起こす条件下で、該形質転換されたカルスをインキュベートする工程、
を包含する、方法。 - 前記カルス形成培地が、一置換IAA誘導体を含む、請求項39に記載の方法。
- 前記カルス形成培地が、5−Br−IAAを含む、請求項39に記載の方法。
- 前記カルス形成培地が、2,4−D、BAP、ABA、ゼアチンリボシド、キネチン、2iPおよびジカンバからなる群から選択される1つ以上の化合物を含む、請求項41に記載の方法。
- 減少した温度で、前記植物サンプルをインキュベートする工程をさらに包含する、請求項39に記載の方法。
- 形質転換された植物サンプルの再生のための方法であって、該方法は、以下の工程:
植物サンプルを形質転換する工程;
該植物サンプルの再生を引き起こす条件下で、該形質転換された植物サンプルを再生培地と接触させる工程であって、ここで、該再生培地が、一置換IAA誘導体、二置換IAA誘導体、多置換IAA誘導体、およびこれらの混合物からなる群から選択されるIAA誘導体を含み、そして1種以上のさらなる植物成長調節因子をさらに含む、工程、
を包含する、方法。 - 前記再生培地が、一置換IAA誘導体を含む、請求項44に記載の方法。
- 前記再生培地が、5−Br−IAAを含む、請求項44に記載の方法。
- 前記再生培地が、2,4−D、BAP、ABA、ゼアチンリボシド、キネチン、2iPおよびジカンバからなる群から選択される1つ以上の化合物を含む、請求項46に記載の方法。
- 請求項44に記載の方法であって、該方法は、さらに、以下の工程:
形質転換されたカルスの生成を引き起こす条件下で、前記形質転換された植物サンプルをカルス形成培地において培養する工程;および
該形質転換されたカルスの再生を引き起こす条件下で、該形質転換されたカルスを再生培地に移す工程、
を包含する、方法。 - 前記カルスを増幅する工程、をさらに包含する、請求項48に記載の方法。
- 前記植物サンプルが、トウモロコシ、コムギ、モロコシ、サトウダイコン、ジャガイモ、ダイズ、およびイネからなる群から選択される成熟植物由来である、請求項13、17、21、25、29、35、39または44のいずれか1項に記載の方法。
- 前記植物サンプルが、B73、H99およびPA91からなる群から選択されるトウモロコシ変種由来である、請求項50に記載の方法。
- 植物サンプルから胚形成カルスを生成するためのキットであって、該キットは、以下:
少なくとも1つの容器;および
カルス形成培地であって、ここで、該カルス形成培地が、一置換IAA誘導体、二置換IAA誘導体、多置換IAA誘導体、およびこれらの混合物からなる群から選択されるIAA誘導体を含み、そして1種以上のさらなる植物成長調節因子をさらに含む、カルス形成培地、
を備える、キット。 - 膜ベースの液体細胞培養物に適合された少なくとも1つの容器を備える、請求項52に記載のキット。
- 植物サンプルの再生のためのキットであって、該キットは以下:
少なくとも1つの容器;ならびに
再生培地であって、該再生培地が、一置換IAA誘導体、二置換IAA誘導体、多置換IAA誘導体、およびこれらの混合物からなる群から選択されるIAA誘導体を含み、そして1種以上のさらなる植物成長調節因子をさらに含む、再生培地、
を備える、キット。 - 膜ベースの液体細胞培養物に適合された少なくとも1つの容器を備える、請求項54に記載のキット。
- カルス形成培地をさらに備える、請求項55に記載のキット。
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