MXPA05013189A - Transformacion y selección de plantas - Google Patents

Abstract

La presente invención se relaciona con un método independiente del genotipo para transformar y seleccionar explantes de planta. El método de transformación incluye precultivar los explante en presencia de un inductor de Agrobacterium y exponer los explantes transformados ante un medio de regeneración de brotes que acelera el desarrollo de los brotes. Se ofrecen plantas generadas a partir de este método de transformación. En particular, se presentan métodos para obtener células transgénicas de Eucalyptus y pino y para regenerarárboles de pino y Eucalyptus transformados en forma estable. La invención también ofrece medios, métodos y plásmidos para seleccionar y regenerar plantas, en particular, deárboles de interés forestal.

Description

TRANSFORMACIÓN Y SELECCIÓN DE PLANTAS CAMPO DE A INVENCIÓN La presente invención se relaciona con un método independiente del genotipo para transformar células de árboles con ADN donador y regenerar, a partir de éstas, árboles transformados de manera estable. De manera particular, esta invención enseña un método de transferencia de genes mediado por Agrobacterium para transformar y regenerar plantas transgénicas de explantes de árboles . El proceso de transformación que se describe en la presente utiliza un medio de precultivo que estimula la división celular y un medio de generación de brotes que acelera el desarrollo de los brotes. Se producen plantas generadas a partir de este proceso de transformación. En particular, la invención ofrece métodos para aumentar la eficiencia de transformación y regeneración de brotes a partir de clones de élite y resistentes a los microbios . La invención se relaciona también con medios, métodos y plásmidos para la selección y regeneración de plantas, en particular, de árboles de interés forestal.

ANTECEDENTES DE IA INVENCIÓN La ingeniería genética de plantas proporciona un gran potencial para mejorar especies de plantas comercialmente importantes. En los años recientes, la ingeniería genética de árboles ha ido ganando impulso y encuentra particular aplicación en las industrias de la pulpa y la madera. Existen varios sistemas establecidos de transformación de árboles -para especies tales como liquidámbar (Sullivan y Lagrinini, 1993) , alerce europeo (Huang y col., 1991), álamo amarillo (Wilde y col., 1992) y muchos Populus sp. (Minocha y col., 1986, Fillatti y col., 1988, De Block, 1990, Brasileiro y col. 1992, Tsai y col., 1994) . Las especies del género Populus han servido de sistemas modelo para la ingeniería genética de árboles (Kim y col., 1997). En estas especies de árboles se han modificado, mediante ingeniería genética diversos rasgos, tales como la resistencia a los insectos y la tolerancia a los herbicidas (Klopfenstein y col., 1993, De Block, 1990). De este modo, es grande el potencial que existe para modificar por ingeniería genética especies de árboles de importancia comercial, incluida la del Eucalyptus . Los árboles Eucalyptus son plantas poligénero que contienen más de quinientas especies. El Eucalyptus tiene una elevada tasa de crecimiento, se adapta a una amplia variedad de ambientes y es poco susceptible a los daños provocados por insectos. Además de sus excepcionales propiedades de crecimiento, los árboles del género Eucalyptus representan la principal fuente de fibras de la industria papelera. Por lo general, las fibras de las especies de madera dura, como el Eucalyptus, son más cortas que las de madera suave, como el pino. Las fibras más cortas producidas del Eucalyptus dan como resultado la producción de pulpa y papel con las características superficiales deseadas, incluidos el brillo y la lisura, aunque con baja resistencia al desgarre o a la tensión. En su uso como madera, el Eucalyptus representa para la industria madera recta y larga con una densidad de mediana a alta. La madera de Eucalyptus es de uso general, se le usa en las industrias de los enchapados y aglomerados, mueblera y es fuente de material de construcción y como leña. La mayoría de los informes que demuestran la transformación del Eucalyptus utilizan Eucalyptus de vivero en vez de los genotipos de élite obtenidos a través de programas de cultivo. Por ejemplo, el documento WO 99/48355 describe un método para transformar explantes jóvenes de hojas a partir de plantas de vivero de E. granáis y E. camaldulensis . Aunque la transformación fue exitosa, el método descrito tiene dos problemas. En el primero, el protocolo de regeneración funciona con explantes de plantas de vivero, pero no con explantes de genotipos de élite. En el segundo, incluso con explantes de plantas de vivero y las mejoras reivindicadas, la eficiencia de transformación está limitada a 2.2% o menos para explantes de cotiledón de las dos especies y los explantes de hipocótilo de E. camaldulensis . Ho y col., Plant Cell Reports 17:675-680 (1998), reportan un mejor protocolo de transformación y regeneración para plantas de vivero de E. camaldulensis; sin embargo, el protocolo no fue reproducible ni siquiera con plantas de vivero de E. camaldulensis . Se cultivaron miles de explantes y se produjeron líneas de callo transgénico, no obstante, el número de brotes recuperados fue mínimo. Harcourt y col., Molecular Breeding 6:306-315 (2000) , reportaron la transformación de plantas de vivero de E. camaldulensis con el gen insecticida cry3A y el gen ¿ar, resistente a herbicidas . Aunque a partir de un sinnúmero de explantes derivados de cincuenta plantas de vivero se regeneraron cinco líneas de callo resistentes a herbicidas, una línea dio problemas para propagarse en cultivo o en invernadero y se demostró gue otra línea era asilvestrada. Además, la línea con dificultad para propagarse era una de las dos líneas que se analizaron a nivel molecular y era la única línea con una sola inserción. Estos estudios indican que aun cuando es posible recuperar plantas transgénicas de Eucalyptus, la baja eficiencia de transformación no permite gue un gen deseado sea suministrado a muchos genotipos . Es así que sigue existiendo la necesidad de un método independiente del genotipo para la transformación y regeneración de Eucalyptus . Aunque se ha realizado la micro propagación de plantas de Eucalyptus de vivero, la regeneración de brotes nuevos se ha limitado a plantas de vivero en vez de a clones selectos o de "élite" de especies de Eucalyptus de importancia comercial. Los genotipos de élite, producidos mediante rondas sucesivas de cultivo, son valiosos por su combinación de rasgos económicamente deseables A diferencia de la transformación de plantas de vivero, que necesita de un gran número de genotipos para asegurar la cosegregación de rasgos de crecimiento junto con el rasgo deseado, conferido mediante expresión transgénica, la transformación de clones de élite proporcionaría un sistema eficiente y provechoso para especies de árboles genéticamente modificados. Los genotipos de élite pueden seleccionarse con base en muchos años de pruebas en el campo de la clonación con un gran número de genotipos de partida. Para el Eucalyptus, al igual que para muchas otras especies de árboles de madera dura y rápido crecimiento, se necesitan años de evaluación de campo antes de que se puedan formular predicciones relativamente precisas acerca de algún rasgo. Por lo tanto, si con fines de ingeniería genética se usan plantas de vivero, se necesitará un número aún mayor de genotipos para la exitosa selección de un rasgo de crecimiento junto con un rasgo deseado, conferido por medio de expresión transgénica. Dos documentos, el GB2298205 (WO/9625504) y el EP 1050209, reivindican el uso de 1- (2-cloro-4-piridil) -3-fenilurea o N- (2-cloro-4-piridil) -N' -fenilurea (4-PU o 4CPPU) como la citoquinina primaria para la regeneración de brotes transgénicos . En ambos casos, como agentes de selección se usaron antibióticos. En el documento WO/9625504 se demuestra la transformación de explantes de genotipos maduros, aunque para demostrar la transformación, los inventores usaron explantes de vivero de E. globulus y E. nitens . El documento EP 1050209 utiliza un sistema de cultivo vertical giratorio para inducir la formación de brotes transgénicos. Aunque la transformación se demostró con explantes rejuvenecidos de árboles maduros, la eficiencia de transformación se calculó con base en la producción del callo transgénico y no hubo ninguna indicación de la frecuencia de producción de plantas transgénicas. Puesto que en ingeniería genética es crítica la eficiente regeneración de brotes nuevos, existe la necesidad de desarrollar un sistema de regeneración de gran eficiencia para seleccionar los clones de especies de Eucalyptus de importancia comercial. Además de la necesidad de un mejor sistema de transformación, también existe la necesidad de métodos mejorados para seleccionar plantas transformadas. La mayoría de los protocolos de transformación de plantas usan la selección con antibiótico, que incorporan un antibiótico en el medio de selección y un gen para la resistencia a los antibióticos en el constructo del gen de transformación. Un método común de selección utiliza nptll o hptll como marcador seleccionable y kanamicina o geneticina o higromicina, respectivamente, como agente de selección. Si bien la selección con antibiótico ofrece un medio para seleccionar células transformadas, tiene varias limitaciones. En primer lugar, la incorporación de un gen para la resistencia a los antibióticos en un organismo transgénico no cuenta con el favor del público en general, debido a la preocupación generalizada referente a los antibióticos y a la propagación de los genes para la resistencia a los antibióticos desde el organismo transgénico hacia el ambiente. En segundo lugar, los marcadores seleccionables con antibiótico no brindan a la planta ningún fenotipo comercialmente deseable, puesto que funcionan solamente en la selección de las células transformadas. Evidentemente, la producción constitutiva de la proteína para la resistencia a antibióticos puede ir en detrimento del valor de la planta transformada puesto que puede distraer una importante biomasa del fenotipo comercialmente deseable.

Para resolver estas limitaciones, los profesionales en el campo han investigado indicadores o marcadores seleccionables para usarlos en la producción de plantas transgénicas. Un sustituto popular del marcador seleccionable antibiótico es la resistencia a herbicidas, como la mediada por ciertos genes mutantes que codifican para enzimas tales como acetolactato sintasa (ALS, Acetolactate Synthase) . La enzima ALS cataliza el primer paso común en la ruta biosintética de la planta para la producción de los aminoácidos de cadena ramificada valina, leucina e isoleucina. Varios herbicidas eficaces y de uso extendido se dirigen a la enzima ALS, entre los que se incluyen sulfonilureas, imidazolinonas y triazolopirimidinas . Otro tipo de gen para la resistencia que se ha estudiado para usarlo en la selección de plantas transgénicas muestra resistencia a un inhibidor metabólico que imita la inhibición natural por retroalimentación durante la producción de un producto biosintético, por medio de un gen mutante gue vence al inhibidor metabólico gracias a la sobreproducción constitutiva del producto. Un ejemplo de un gen de este tipo es la antranilato sintasa (ASA, Anthranila te Synthase ), que media un paso crítico en la producción de triptófano y está sometido normalmente a la inhibición por retroalimentación por triptófano. Además de actuar como marcadores seleccionables, estos genes pueden conferir a la planta transgénica un fenotipo de crecimiento deseable si el producto bioquímico, triptófano en este caso, es normalmente un factor limitante para el crecimiento de la planta. Si bien los genes marcadores seleccionables no antibióticos superan algunos de los problemas asociados con el uso de marcadores para la resistencia a los antibióticos, el uso de genes marcadores seleccionables no antibióticos no ha sido la panacea para las transformaciones de plantas. Un problema asociado con estos marcadores es una elevada proporción de falsos positivos. De este modo, los profesionales en este campo se ven obligados a evaluar muchos transformantes para identificar un positivo verdadero. Este tamizado excesivo aumenta en gran medida el tiempo y el costo asociados con la creación de plantas transgénicas . En consecuencia, existe la necesidad de mejores métodos para seleccionar plantas transformadas. En consecuencia, existe la necesidad de aumentar la frecuencia para transformar células de Eucalyptus y regenerar plantas transformadas en forma estable a partir de clones de germoplasma de élite.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN En la presente invención se tiene considerado un método para transformar al menos una célula de un explante de árbol con un ADN donador, el método comprende: (i) precultivar un explante de árbol en un medio que contiene un inductor de Agrobacterium; (ii) exponer el explante ante una cepa de Agrobacterium que contiene un vector de transformación que transporta el ADN donador; (iii) seleccionar un explante transformado, en el cual el ADN donador se transfiera por lo menos a una célula del explante transformado; y (iv) regenerar el explante transformado para producir una planta completa. De preferencia, el inductor de Agrobacterium es acetosiringona y la concentración de ésta varía aproximadamente entre 10 y 400 mg/1. Se prefiere también que la concentración de la acetosiringona esté aproximadamente entre 5 y 200 mg/1 y el medio contenga además auxina y/o citoquinina . La invención considera un paso de precultivo que consiste en cultivar un explante de planta en un medio nutriente antes de la transformación con Agrobacterium . El medio de precultivo contiene un inductor del Agrobacterium, tal como la acetosiringona. En una modalidad, el explante se precultiva en la oscuridad durante aproximadamente entre 1 y 6 días. De preferencia, el explante se precultiva aproximadamente durante 4 días . En una modalidad, el medio de precultivo puede contener, opcionalmente, reguladores del crecimiento de la planta, incluidas la auxina y la citoquinina. En otra modalidad, la auxina se selecciona del grupo formado por NAA, 2,4-D, IBA e IAA. En una modalidad, el intervalo de concentraciones de cualquiera de NAA, 2,4-D, IBA e IAA varía aproximadamente entre 0.1 y 10 mg/1. De preferencia, el intervalo de concentraciones varía aproximadamente entre 0.2 y 5 mg/1. Con más preferencia, el intervalo de concentraciones varía aproximadamente entre 0.2 y 3 mg/1. En otra modalidad, la citoguinina se selecciona del grupo formado por zeatina, cinetina y BA. En una modalidad, el intervalo de concentraciones de cualguiera de zeatina, cinetina y BA varía aproximadamente entre 0.25 y 15 mg/1. De preferencia, el intervalo de concentraciones varía aproximadamente entre 1 y 10 mg/1. Con más preferencia, el intervalo de concentraciones varía aproximadamente entre 1 y 6 mg/1. En otra modalidad, el explante es al menos alguno de: una hoja, peciolo, tejido internodal, tejido floral y tejido o cultivo embriogénico. En una modalidad, los tejidos se seleccionan en forma independiente a la edad o etapa de desarrollo. En otra modalidad, el método es independiente del genotipo . En otra modalidad, todas las células del explante transformado contienen el ADN donador. En una modalidad, el explante se selecciona del grupo formado por especies de Eucalyptus o de pino. En la presente invención también se describe una planta transgénica de Eucalyptus, donde dicha planta es una planta transgénica no quimérica. De preferencia, la planta transgénica de Eucalyptus es una planta no quimérica de E. granáis, no quimérica de E. nitens, no quimérica de E. globulus, no quimérica de E. áunnii, no quimérica de E. saligna, no quimérica de E. occidentalis o híbridos de las mismas . Por otra parte, la presente invención describe un método para producir un árbol no quimérico, el método comprende : (i) precultivar un explante en un medio que contiene un inductor de Agrobacterium; (ii) exponer el explante ante una cepa de Agrobacterium que alberga un vector capaz de transferir un gen a la célula de una planta; (iii) seleccionar un explante transformado; y (iv) cultivar el explante para producir un árbol no quimérico. En una modalidad, el método es independiente del genotipo . También se describe un método para producir un árbol transgénico, el método comprende: (i) precultivar el explante en un medio que contiene un inductor de Agrobacterium; (ii) transformar el explante con una cepa de Agrobacterium que alberga un vector capaz de transferir un gen a la célula de una planta; (iii) seleccionar un explante transformado; y (iv) regenerar el explante para producir una planta transgénica. En una modalidad, el método es independiente del genotipo. En otra modalidad, el método produce una planta transgénica de Eucalyptus . En otra modalidad, el método produce una planta transgénica de Eucalyptus que tiene un gen para la resistencia a herbicidas y un gen ajeno o donado. En otro aspecto, la invención proporciona una planta transgénica de Eucalyptus, donde la planta se transforma de manera estable con un ADN ajeno o donador y tiene la capacidad de transmitir a su progenie el ADN donado. En algunas modalidades, la planta transgénica de Eucalyptus es E. granáis y sus híbridos, E. nitens y sus híbridos, E. globulus y sus híbridos, E. dunnii y sus híbridos, E. saligna y sus híbridos y E. occidentalis y sus híbridos . En otro aspecto, la invención suministra la composición de un medio para planta, la cual contiene un herbicida de sulfonilo y un compuesto de tipo hidrolisato de caseína, donde el compuesto prácticamente carece de aminoácidos de cadena ramificada. En un tenor relacionado, la invención proporciona un método para producir una planta transgénica, el método comprende : (i) precultivar el explante en un medio que contiene un inductor de Agrobacterium; (ii) exponer el explante ante una cepa de Agrobacterium que alberga un vector capaz de transferir un gen a la célula de una planta; (iii) seleccionar un explante transformado en un medio de cultivo que contiene un herbicida de sulfonilurea o imidazolinona y un compuesto de tipo hidrolisato de caseína, donde el compuesto prácticamente carece de aminoácidos de cadena ramificada y no interfiere con la selección con sulfonilurea o imidazolinona; y (iv) regenerar una planta completa a partir del explante. En otro aspecto, la invención provee una planta transgénica del Eucalyptus, E. occi?entalis . Se describe también una planta transgénica del Eucalyptus, E. ?unnii, una planta de E. occi?entalis constituida al menos por una célula transformada de manera estable con ADN ajeno, una de E. dunnii infértil transformada con ADN ajeno y una planta de E. saligna transformada de manera estable, donde dicha planta tiene la capacidad de transmitir a su progenie el ADN aj eno . En otro aspecto, la invención proporciona un medio de precultivo para árboles, el cual contiene un inductor de Agrobacterium . También se describe un medio de precultivo para Eucalyptus, que contiene un inductor de Agroba cterium . En otro aspecto, la invención presenta un método para obtener pulpa de madera, el método comprende: (i) cultivar un explante de árbol en un medio de precultivo que contiene un inductor de Agrobacterium; (ii) exponer el explante ante una cepa de Agrobacterium que contiene un vector de transformación que transporta el ADN donador; (iii) seleccionar un explante transformado, en el cual el ADN donador se transfiera por lo menos a una célula del explante transformado; (iv) regenerar el explante transformado para producir una planta completa; y (v) obtener pulpa de madera a partir de dicha planta. En otro aspecto, la invención presenta un método para obtener madera, el método comprende: (i) cultivar un explante de árbol en un medio de precultivo gue contiene un inductor de Agrobacterium; (ii) exponer el explante ante una cepa de Agrobacterium que contiene un vector de transformación que transporta el ADN donador; (iii) seleccionar un explante transformado, en el cual el ADN donador se transfiera por lo menos a una célula del explante transformado; (iv) regenerar el explante transformado para producir una planta completa; y (v) obtener madera a partir de dicha planta. En otro aspecto, la invención presenta un método para obtener papel, el método comprende: (i) cultivar un explante de árbol en un medio de precultivo que contiene un inductor de Agrobacterium; (ii) exponer el explante ante una cepa de Agrobacterium que contiene un vector de transformación que transporta el ADN donador; (iii) seleccionar un explante transformado, en el cual el ADN donador se transfiera por lo menos a una célula del explante transformado; (iv) regenerar el explante transformado para producir una planta completa; y (v) obtener papel a partir de dicha planta. En otro aspecto, la invención presenta un método para obtener aceite, el método comprende: (i) cultivar un explante de árbol en un medio de precultivo gue contiene un inductor de Agrobacterium; (ii) exponer el explante ante una cepa de Agrobacterium que contiene un vector de transformación que transporta el ADN donador; (iii) seleccionar un explante transformado, en el cual el ADN donador se transfiera por lo menos a una célula del explante transformado; (iv) regenerar el explante transformado para producir una planta completa; y (v) obtener aceite a partir de dicha planta. En un tenor relacionado, la invención presenta un método para obtener pulpa de madera, el método comprende: (i) precultivar un explante en un medio que contiene un inductor de Agrobacterium; (ii) exponer el explante ante una cepa de Agrobacterium que alberga un vector capaz de transferir un gen a la célula de una planta; (iii) seleccionar un explante transformado en un medio de cultivo que contiene un herbicida de sulfonilurea o imidazolinona y un compuesto de tipo hidrolisato de caseína, donde el compuesto prácticamente carece de aminoácidos de cadena ramificada y no interfiere con la selección con sulfonilurea o imidazolinona; (iv) regenerar una planta completa a partir del explante; y (v) obtener pulpa de madera a partir de dicha planta. En otro aspecto, la invención presenta un método para obtener madera, el método comprende: (i) precultivar un explante en un medio que contiene un inductor de Agrobacterium; (ii) exponer el explante ante una cepa de Agrobacterium que alberga un vector capaz de transferir un gen a la célula de una planta; (iii) seleccionar un explante transformado en un medio de cultivo que contiene un herbicida de sulfonilurea o imidazolinona y un compuesto de tipo hidrolisato de caseína, donde el compuesto prácticamente carece de aminoácidos de cadena ramificada y. no interfiere con la selección con sulfonilurea o imidazolinona; (iv) regenerar una planta completa a partir del explante; y (v) obtener madera a partir de dicha planta. En otro aspecto, la invención presenta un método para obtener papel, el método comprende: (i) precultivar un explante en un medio que contiene un inductor de Agrobacterium; (ii) exponer el explante ante una cepa de Agrobacterium que alberga un vector capaz de transferir un gen a la célula de una planta; (iii) seleccionar un explante transformado en un medio de cultivo que contiene un herbicida' de sulfonilurea o imidazolinona y un compuesto de tipo hidrolisato de caseína, donde el compuesto prácticamente carece de aminoácidos de cadena ramificada y no interfiere con la selección con sulfonilurea o imidazolinona; (iv) regenerar una planta completa a partir del explante; y (v) obtener papel a partir de dicha planta. En otro aspecto, la invención presenta un método para obtener aceite, el método comprende: (i) precultivar un explante en un medio que contiene un inductor de Agrobacterium; (ii) exponer el explante ante una cepa de Agrobacterium que alberga un vector capaz de transferir un gen a la célula de una planta; (iii) seleccionar un explante transformado en un medio de cultivo que contiene un herbicida de sulfonilurea o imidazolinona y un compuesto de tipo hidrolisato de caseína, donde el compuesto prácticamente carece de aminoácidos de cadena ramificada y no interfiere con la selección con sulfonilurea o imidazolinona; (iv) regenerar una planta completa a partir del explante; y (v) obtener aceite a partir de dicha planta. Otros objetos, características y ventajas de la presente invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada. La descripción detallada, así como los ejemplos específicos, si bien indican modalidades preferidas, se proporcionan únicamente en forma ilustrativa, puesto que si se parte de esta descripción detallada a los que tienen experiencia en la técnica les serán evidentes diversos cambios y modificaciones dentro del espíritu y alcance de la invención. Adicionalmente, los ejemplos demuestran el principio de la invención y no es de esperarse que ilustre específicamente la aplicación de esta invención en todos los ejemplos en los que sea evidentemente útil para los que tienen experiencia en la técnica anterior.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 muestra una representación esquemática del vector pWVC20. La Figura 2 muestra una representación esquemática del vector pWVC21. La Figura 3 muestra una representación esquemática del vector pWVC23. La Figura 4 muestra una representación esquemática del vector pWVC24. La Figura 5 muestra una representación esquemática de los vectores pWVC25 y pWVC26. La Figura 6 muestra una representación esquemática del vector pWVC30. La Figura 7 muestra una representación esquemática del vector pWVC33. La Figura 8 muestra una representación esquemática de los vectores pWVC34 y pWVC35. La Figura 9 muestra datos gráficos que demuestran el impacto del hidrolisato de caseína en los efectos herbicidas de la sulfonilurea o la imidazolinona. La Figura 10 ilustra el efecto herbicida de una sulfonilurea en presencia de varias composiciones de hidrolisato de caseína. La Figura 11 muestra el efecto del triptófano sobre el efecto herbicida del 5MT. La Figura 12 demuestra la capacidad del 5MT y la AMT para actuar como agentes de selección cuando se usan con el marcador seleccionable ASA2 para identificar plantas transgénicas .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA MODALIDAD PREFERIDA Los métodos de la presente invención para transformar árboles en forma independiente del genotipo superan las bajas eficiencias de transformación obtenidas por la transformación de genotipos de élite. En su aspecto más amplio, los métodos se relacionan con el aumento en las eficiencias de transformación y regeneración de brotes a partir de explantes de árbol. Los aumentos en la eficiencia de transformación se consiguen precultivando los explantes en un medio que estimule la división celular. La frecuencia de regeneración de los brotes de explantes transformados mejora al cultivarlos en un medio que promueve la regeneración de los brotes . La presente invención presenta composiciones de medios útiles para seleccionar plantas transgénicas. Los medios pueden usarse para cultivar cualquier célula de planta que haya sido transformada con uno o más marcadores seleccionables que alteran el metabolismo de los aminoácidos. Los medios y los métodos de la invención son particularmente útiles para seleccionar árboles transgénicos de interés forestal. En una modalidad, los medios contienen un agente de selección que dirige la ALS y un derivado del hidrolisato de caseína que prácticamente carece de aminoácidos de cadena ramificada. El derivado también contiene grandes concentraciones de aminoácidos, tales como glutamina y arginina, que son importantes aminoácidos para el desarrollo y la manutención o conservación de células regenerables en ciertas plantas en un cultivo de tejido de la planta. En otra modalidad, los medios contienen, como agente de selección, un análogo del triptófano que dirige la antranilato sintasa y un derivado del hidrolisato de caseína que prácticamente carece de triptófano. El derivado también contiene grandes concentraciones de aminoácidos, tales como glutamina y arginina, gue son importantes aminoácidos para el desarrollo y la manutención o conservación de células regenerables en ciertas plantas en un cultivo de tejido de la planta. En la siguiente descripción, hay varios términos técnicos y científicos que se utilizan con mucha frecuencia. A menos que se definan de otra forma, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente comparten el mismo significado que el comúnmente conocido por cualquiera con experiencia ordinaria en la técnica a la que pertenece esta invención. Las siguientes definiciones se ofrecen para facilitar la comprensión de la invención. Abaxial, como se utiliza en la presente, se refiere al lado inferior de una hoja. Inductor de Agrobacterium se refiere a una molécula que induce la expresión de genes a la virulencia por Agrobacterium que codifican para productos que controlan la eliminación y suministro del ADN-T en el núcleo de la planta hospederaa. En esta descripción, los inductores de Agrobacterium se añadieron tanto al medio de precultivo como al medio de cultivo del Agrobacterium . En esta invención, los inductores de Agrobacterium incluyen, aunque no se limitan a, compuestos fenólicos, tales como la acetosiringona. La adición de un inductor mejora la frecuencia y congruencia de la infección con Agrobacterium. La transformación mediada por Agrobacterium es un método gracias al cual el ADN se inserta de manera estable en el genoma de la célula de una planta mediante el uso del plásmido Ti ( " tumor inducing" o inductor de tumores) proveniente de Agrobacterium turne f aciens . En el núcleo de la célula de la planta hospedera se incorpora una pegueña porción del plásmido Ti, conocida como ADN-T. De manera alternativa, para la transformación se puede utilizar el plásmido Ri del Agrobacterium rhizogenes . En la transformación mediada por Agrobacterium, el o los genes o el ADN destinado a introducirlos en la planta se colocan entre los bordes derecho e izquierdo del ADN-T. Antioxidante, como se utiliza en la presente, se refiere a un compuesto que reduce al mínimo la exudación de materiales fenólicos de provenientes del explante de una planta. En la presente invención, como antioxidante se puede usar ácido ascórbico. En la presente descripción, el término auxina abarca una clase de reguladores del crecimiento de plantas, gue se caracterizan, principalmente, por su capacidad para estimular la división celular en tejidos cortados de plantas. Además de su función en la división celular y el alargamiento celular, las auxinas influyen en otros procesos de desarrollo que incluyen la iniciación de la raíz. En la presente invención, la auxina y los reguladores de tipo auxina incluyen, aunque no se limitan a, ácido naftalenacético (NAA), ácido 2, 4-diclorofenoxiacético (2,4-D), ácido indol-3-butírico (IBA) y ácido indol-3-acético (IAA) . El término compuesto de tipo hidrolisato de caseína se refiere a una composición que está estructural y funcionalmente relacionada con el hidrolisato de caseína.

En el contexto de la expresión "compuesto de tipo hidrolisato de caseína", el término denota un compuesto que tiene una composición similar de aminoácidos como el hidrolisato de caseína y realiza la misma función que el hidrolisato de caseína, aunque difiere en uno o más componentes. Por ejemplo, un compuesto de tipo hidrolisato de caseína puede contener grandes concentraciones de aminoácidos, tales como glutamina y arginina, que son importantes aminoácidos para el desarrollo y la manutención o conservación de células regenerables en ciertas plantas en un cultivo de tejido de la planta. Un vector de clonación es un elemento genético, tal como un plásmido, cósmido o bacteriófago, que tiene la capacidad para replicarse en forma autónoma en una célula hospedera. Los vectores de clonación contienen uno o unos cuantos sitios de reconocimiento de endonucleasa de restricción, en los cuales las secuencias de ADN ajeno pueden insertarse en una orientación determinable y un gen marcador que codifica un producto adecuado para identificar y seleccionar las células transformadas con el vector de clonación. Los genes marcadores incluyen genes cuyos productos confieren resistencia a herbicidas o antibióticos. La inserción de una secuencia de ADN ajeno en un vector de clonación no interfiere con una función biológica esencial del vector de clonación o del gen marcador . El término citoquinina se refiere a una clase de reguladores del crecimiento de plantas que se caracteriza por su capacidad para estimular la división celular y la organogénesis de brotes en un cultivo de tejido. En la presente invención, las citoquininas incluyen, aunque no se limitan a, N6-bencilaminopurina (BAP) , N6-benciladenina (BA) , zeatina, cinetina, tiadiazurón (TDZ) , 2-isopenteniladenina (2ip) y 4-CPPU (N- (2-cloro-4-piridil) -N'-fenilurea) ) . El término derivado se refiere a una sustancia que está estructural y funcionalmente relacionada con otra. En el contexto de la expresión "derivado de hidrolisato de caseína", el término denota una sustancia que tiene una composición similar de aminoácidos como el hidrolisato de caseína y que realiza la misma función que el hidrolisato de caseína, aunque difiere en uno o más componentes. Por ejemplo, un derivado del hidrolisato de caseína puede tener más arginina y/o menos valina que un hidrolisato de caseína típico. Como se utiliza en la presente, el término genotipo de élite se refiere a genotipos comercialmente importantes obtenidos y seleccionados mediante programas de cultivo sucesivo. El término explante se refiere al tejido de una planta que es el objetivo de la transformación. Los explantes preferidos incluyen hojas, peciolo, tejido floral, tejidos internodales y tejidos embriogénicos recolectados de plantas cultivadas in vivo y/o in vitro . El término expresión se refiere a la biosíntesis de un producto génico. Por ejemplo, la expresión de un gen incluye la transcripción de la secuencia de ADN en el ARNm y la traducción del ARNm en uno o más polipéptidos . El ARN generado puede codificar para una proteína o polipéptido o puede codificar para un ARN de interferencia o una molécula antisentido. Un vector de expresión es un elemento genético que contiene una secuencia génica que se expresa en una célula hospedera. Por lo general, la expresión de la secuencia génica es controlada por varios elementos reguladores, entre los que se incluyen promotores constitutivos e inducibles, elementos reguladores de tejido preferido y potenciadores . Se dice que un gen de este tipo está "funcionalmente ligado" a los elementos reguladores. Un ADN donador o ajeno es un ADN aislado de otras especies o de la especie de interés y reintroducido en esta misma especie. El ADN puede ser un gen estructural, un gen antisentido, fragmentos de ADN, etc. Un gen es una secuencia de ADN heredable que se transcribe en el ARN mensajero (ARNm) , el cual se traduce entonces en una secuencia de aminoácidos característica de un polipéptido. Una planta transgénica no quimérica es el producto de un suceso de transformación, donde esencialmente todas las células se transforman y un ADN ajeno se transfiere a la progenie. La expresión "funcionalmente ligado" describe la combinación de dos o más moléculas de tal manera que una vez combinadas, funcionan adecuadamente en la célula de una planta. Por ejemplo, un promotor está funcionalmente ligado a un gen estructural cuando el promotor controla la transcripción del gen estructural. Como se utiliza en la presente, el término "planta" se refiere a cualguiera de los diversos organismos multicelulares eucarióticos y fotosintéticos del reino Plantae, que de manera característica producen embriones y contienen cloroplastos y paredes celulares de celulosa. Como parte de una planta, el tejido de una planta puede ser tratado de conformidad con los métodos de la presente invención para producir una planta transgénica. Muchos tejidos de plantas adecuados pueden ser transformados de conformidad con la presente invención e incluir, aunque sin limitarse a, embriones somáticos, polen, hojas, tallos, callos, estolones, microtubérculos y brotes. Así, la presente invención prevé la transformación de plantas angiospermas y gimnospermas, tales como césped, trigo, maíz, arroz, cebada, avena, remolacha de azúcar, papa, jitomate, tabaco, alfalfa, lechuga, zanahoria, fresa, casava, papa dulce, geranio, soya, roble, pino, abeto, acacia, eucalipto, nogal y palma. De conformidad con la presente invención, el tejido de plantas también incluye células de la planta. Las células de planta incluyen cultivos de suspensión, callo, embriones, regiones meristémicas, tejido de callo, hojas, raíces, brotes, gametofitos, esporofitos, polen, semillas y micro esporas. Los tejidos de planta pueden estar en distintas etapas de madurez y pueden cultivarse en un cultivo líquido o sólido o en tierra o en medios adecuados en macetas, invernaderos o en el campo. Un tejido de planta incluye también cualquier clon, semilla, progenie, propágula de esta planta, generada ya sea por la vía sexual o asexual, y la descendencia de cualesquiera de estos, tales como recortes y semillas. Existe un particular interés por las coniferas, tales como pino, abeto y picea; las monocotiledóneas, tales como el pasto azul de Kentucky, agrostis rastrero, maíz y trigo; y las dicotiledóneas, tales como Eucalyptus, Acacia, álamo temblón, liquidámbar, álamo, algodón, jitomate, lechuga, Arabi?opsis, tabaco y geranio. Un promotor de plantas es un promotor capaz de iniciar la transcripción en células de plantas, ya sea que provengan o no de células de plantas . Promotores de planta ilustrativos incluyen, aungue no se limitan a, las que se obtienen de plantas, bacterias y virus de plantas, tales como Agrobacterium o Rhizobium, que contienen genes expresados en células de plantas. Ejemplos de promotores sometidos al control del desarrollo incluyen promotores que, de preferencia, inician la transcripción en ciertos tejidos, tales como hojas, raíces o semillas. A estos promotores se les denomina promotores de tejido preferido. A los promotores que inician la transcripción solamente en ciertos tejidos se les denomina promotores de tejido específico . Un promotor especifico del tipo de célula impulsa principalmente la expresión en ciertos tipos de células en uno o más órganos, por ejemplo, en células vasculares de raíces u hojas. Un promotor inducible o reprimible es un promotor que está sometido al control del ambiente. Los ejemplos de condiciones ambientales que pueden realizar la transcripción por medio de promotores inducibles incluyen las condiciones anaeróbicas o la presencia de la luz. Los promotores de tejido específico, de tejido preferido, específicos del tipo de célula e inducibles constituyen la clase de promotores no constitutivos. Un promotor constitutivo es un promotor que es activo en la mayoría de condiciones ambientales y en la mayoría de las partes de la planta.

El término "medio de precultivo", como se utiliza en la presente, es el medio nutriente en el que se cultivan los explantes de la planta antes de la transformación con Agrobacterium y que se necesita para aumentar la eficiencia de transformación y la regeneración de la planta. El medio de precultivo contiene un inductor del Agrobacterium, tal como la acetosiringona. El medio de precultivo puede contener, opcionalmente, reguladores del crecimiento de la planta, incluidas la auxina y la citoquinina. Progenie: una "progenie" de la presente invención, tal como la progenie de una planta transgénica, es aquella que nace, es engendrada por o se deriva de una planta o de la planta transgénica. Así, una planta de "progenie", es decir, una planta de generación "Fl" es un vastago o un descendiente de la planta transgénica producida por los métodos de la invención. La progenie de una planta transgénica puede contener al menos uno, algunos o todos los genomas de la célula y, el polinucleótido deseado que se integró en una célula de la planta transgénica parental usando los métodos descritos en la presente. Así, el polinucleótido deseado es "transmitido a" o "heredado por" la planta de progenie. El polinucleótido deseado heredado de este modo a la planta de progenie puede residir en un constructo de ADN-T, que también es heredado por la planta de progenie por su progenitor. También puede considerarse que el término "progenie", como se utiliza en la presente, son los vastagos o descendientes de un grupo de plantas. El medio de regeneración de brotes es el medio de la invención diseñado para regenerar los brotes transgénicas . El medio de regeneración de brotes contiene sales inorgánicas, una mezcla de aminoácidos y vitaminas, un antioxidante, nitrógeno orgánico y reguladores del crecimiento de la planta. La embriogénesis somática es un método de propagación clonal, en el cual el embrión se desarrolla a partir de tejido vegetativo o somático, en vez de producto o fusión de gametos . La expresión "transformado de manera estable" se refiere a una planta transgénica gue tiene la capacidad de trasmitir a su progenie un ADN ajeno. Un gen estructural es una secuencia de ADN que se transcribe en el ARN mensajero (ARNm), el cual se traduce entonces en una secuencia de aminoácidos característica de un polipéptido. La expresión "que prácticamente carece de" se refiere a la ausencia relativa de un primer compuesto en un segundo compuesto. El término denota que en el segundo compuesto puede detectarse menos de 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% o incluso 0% del primer compuesto.

Una planta transgénica es una planta que contiene ADN ajeno. En esta invención, una planta transgénica se deriva de la transformación mediada por Agrobacterium . De preferencia, la planta transgénica es fértil y tiene la capacidad de transmitir a su progenie el ADN ajeno, mediante reproducción sexual. Terminadores de transcripción y traducción: La expresión de los constructos de ADN de la presente invención tiene, por lo general, una región de terminación transcripcional en el extremo opuesto a la región reguladora del inicio de la transcripción. La región de terminación transcripcional puede seleccionarse, en cuanto a la estabilidad del ARNm para aumentar la expresión y/o para la adición de las colas de poliadenilación añadidas al producto de la transcripción génica. Árbol, como se utiliza en la presente, se refiere a cualquier planta perenne que acumula un núcleo de madera. Los árboles incluyen especies angiospermas y gimnospermas. Los ejemplos de árboles incluyen: álamo, Eucalyptus, abeto Douglas, pino, azúcar y Monterey; nogales, por ejemplo, de nuez de Castilla y almendro; árboles frutales, por ejemplo, manzana, ciruela, cítricos y chabacano; y árboles de madera dura, tales como fresno, abedul, roble y teca. Existe un interés particular por las coniferas, tales como pino, abeto, picea, Eucalyptus, Acacia, álamo temblón, liquidámbar y álamo. La presente invención proporciona métodos independientes del genotipo para transformar explantes de árboles y generar la progenie transgénica de éstos. Los métodos de la presente invención consideran precultivar explantes de árboles en presencia de un inductor de Agrobacterium . Los métodos de la presente invención prevén además cultivar los explantes transformados en un medio de regeneración de brotes que contiene aminoácidos, vitaminas, reguladores del crecimiento de plantas, glucosa y un antioxidante . Los métodos de la presente invención proporcionan un método independiente del genotipo para la transformación de explantes de Eucalyptus y la regeneración de sus brotes . Cualquier explante de Eucalyptus puede ser transformado usando los métodos de la presente invención, incluidos los árboles de Eucalyptus que crecieron en entornos naturales y los explantes de Eucalyptus propagados por clonación. Los explantes pueden seleccionarse de cualquier especie de Eucalyptus, entre las que se incluyen: Eucalyptus alba, Eucalyptus bancroftii, Eucalyptus botryoides, Eucalyptus bridgesiana, Eucalyptus calophylla, Eucalyptus camaldulensis , Eucalyptus citriodora, Eucalyptus cladocalyx, Eucalyptus coccifera, Eucalyptus curtisii, Eucalyptus dalrympleana, Eucalyptus ?eglupta, Eucalyptus áelagatensis, Eucalyptus ?iversicolor, Eucalyptus ?unnii, Eucalyptus fici folia , Eucalyptus globulus, Eucalyptus gomphocephala, Eucalyptus gunnii, Eucalyptus henryi, Eucalyptus laevopinea , Eucalyptus macarthurii, Eucalyptus macrorhyncha, Eucalyptus maculata, Eucalyptus marginata, Eucalyptus megacarpa, Eucalyptus mellio?ora, Eucalyptus nicholii, Eucalyptus nitens, Eucalyptus nova-angelica, Eucalyptus obliqua, Eucalyptus occi?entalis, Eucalyptus obtusiflora, Eucalyptus orea?es, Eucalyptus pauciflora, Eucalyptus polybractea, Eucalyptus regnans, Eucalyptus resinífera, Eucalyptus robusta, Eucalyptus ruáis, Eucalyptus saligna, Eucalyptus si?eroxylon, Eucalyptus stuartiana, Eucalyptus tereticornis, Eucalyptus torelliana, Eucalyptus urnigera, Eucalyptus urophylla, Eucalyptus viminalis, Eucalyptus viri?is , Eucalyptus wan?oo y Eucalyptus youmanni . También se prefiere gue la planta objetivo se seleccione del grupo formado por: Pinus banksiana , Pinus brutia, Pinus caribaea, Pinus clasusa , Pinus contorta, Pinus coulteri, Pinus echinata, Pinus el?arica, Pinus elliotii, Pinus jeff re i, Pinus lambertiana, Pinus massoniana, Pinus montícola , Pinus nigra, Pinus palustris, Pinus pinaster, Pinus pon?erosa , Pinus radiata, Pinus resinosa , Pinus rígida , Pinus serótina, Pinus strobus, Pinus sylvestris , Pinus taeda, Pinus virginiana, Abies amabilis , Abies balsamea , Abies concolor, Abies granáis, Abies lasiocarpa, Abies magnifica, Abies procera, Chamaecyparis lawsoniona , Chamaecyparis nootkatensis, Chamaecyparis thyoi?es , Juniperus virginiana, Larix ?eci?ua, Larix laricina, Larix leptolepis, Larix occidentalis, Larix siberica, Libocedrus ?ecurrens, Picea abies, Picea engelmanni, Picea glauca, Picea mariana, Picea pungens , Picea rubens , Picea sitchensis, Pseu?otsuga menziesii, Sequoia gigantea, Sequoia sempervirens , Taxo?ium ?istichum, Tsuga cana?ensis, Tsuga heterophylla, Tsuga mertensiana, Thuja occi?entalis, Thuja plicata . En particular, la planta transgénica puede ser Eucalyptus granáis o sus híbridos, Pinus raáiata, Pinus tae?a L (pino de incienso) o sus híbridos, Populus nigra, Populus ?eltoi?es, Populus alba o Populus hybri?s, Acacia mangium o Liqui?amber styraciflua . Los métodos de la presente invención consideran la transformación de explantes de Eucalyptus obtenidos de un cultivo madre de genotipos élite de Eucalyptus . Los cultivos de brotes micropropagados pueden generarse cosechando brotes apicales o auxiliares recién nivelados y esterilizando superficialmente los tejidos en una solución esterilizadora . En la técnica se conocen soluciones de esterilización, tales como la solución blanqueadora al 1-5%, y el enjuague repetido puede realizarse con agua destilada esterilizada. Los cultivos madre de Eucalyptus pueden sustentarse como cúmulos de genes en un medio de manutención que contiene sales inorgánicas, fuentes de carbono, vitaminas y citoquininas . En la presente invención, los cultivos madre se sustentan en el medio de Manutención de Eucalyptus (EM, Eucalyptus Maintenance) (ver el Cuadro 1) que contiene sales del medio para plantas leñosas (WPM, Woo?y Plant Me?ium) (Loyd y McCown, 1980) y N6-benciladenina (BA) . En forma alternativa, se pueden usar otros medios salinos, tales como el medio MS (Murashige and Skoog 1962) o el medio de Lepoivre .

CUADRO 1. MEDIO DE CONVERVACION DE EUCALYPTUS (MEDIO EM) La presente invención presenta un método de transformación gue es independiente del genotipo. Los métodos de la presente invención enseñan la transformación de explantes independientes de la edad y la etapa de desarrollo. Para la transformación se pueden usar los explantes obtenidos del cultivo madre. Los explantes de árboles pueden seleccionarse de uno o más de los siguientes tejidos: foliar, peciolar, internodal y floral. En la presente invención, se seleccionan los explantes foliares, debido a que se encuentran en forma abundante y por su facilidad de transformación. La porción de punta de las hojas puede quitarse o perforarse con unos fórceps para aumentar el número de células lesionadas. En esta aplicación, los explantes de hoja se colocan en el medio de precultivo con el lado abaxial hacia abajo. En la presente invención, los explantes de planta se cultivan en un medio de precultivo. Un medio de precultivo es un medio nutriente en el que los explantes de planta se cultivan antes de la transformación con Agrobacterium . Específicamente, el medio de precultivo de la invención aumenta la eficiencia de transformación y la regeneración de la planta. El medio de precultivo contiene un inductor del Agrobacterium, tal como la acetosiringona. Alternativamente, se pueden usar otros inductores de Agrobacterium, tales como los hidroxifenilpropanoides, los compuestos fenólicos y la coniferina. En la presente invención se usaron las sales del medio para plantas leñosas (WPM, Wooáy Plant Me?ium (Loyd and McCown, 1980) ; no obstante, se pueden utilizar otros medios salinos, tales como el medio MS (Murashige y Skoog, 1962) o el medio de Lepoivre. De manera opcional, el medio de precultivo puede contener reguladores del crecimiento de la planta, incluidas la auxina y la citoquinina. En la presente invención, los explantes de planta se precultivaron en el medio de cultivo del Cuadro 2, por un periodo de cuatro días en oscuridad. También se pueden usar otros medios de precultivo y periodos .

Cuadro 2. Medio de precultivo de plantas Los métodos de la presente invención enseñan a precultivar de explantes en un medio de precultivo que contiene una elevada concentración de auxina o de reguladores del crecimiento de tipo auxina. De preferencia, la auxina o un regulador de crecimiento de tipo auxina se selecciona del grupo formado por ácido naftalenacético (NAA), ácido 2, 4-diclorofenoxiacético (2,4-D), ácido indol-3-butírico (IBA) y ácido indol-3-acético (IAA) . Con más preferencia, la auxina es el NAA. El intervalo de concentraciones de la auxina varía aproximadamente entre 0.1 y 10 mg/1. De preferencia, el intervalo de concentraciones varía aproximadamente entre 0.2 y 5 mg/1. Con más preferencia, la concentración de auxina varía aproximadamente entre 0.2 y 3 mg/1. De preferencia, los métodos de la presente invención permiten precultivar explantes de árbol en un medio de precultivo gue contiene suficiente citoquinina. La citoquinina se selecciona del grupo formado por N6-bencilaminopurina (BAP) , N6-benciladenina (BA) , zeatina, cinetina, 4-CPPU (N- (2-cloro-4-piridil) -N' -fenilurea) ) , tiadiazurón (TDZ) y 2-isopenteniladenina (2ip) . El intervalo de concentraciones de la citoquinina varía aproximadamente entre 0.25 y 15 mg/1. De preferencia, el intervalo de concentraciones de la citoquinina varía aproximadamente entre 1 y 10 mg/1. Con más preferencia, el intervalo de concentraciones de la citoquinina varía aproximadamente entre 1 y 6 mg/1. Los métodos de la presente invención permiten precultivar explantes de árbol en un medio de precultivo que contiene un inductor de Agrobacterium . El inductor puede ser acetosiringona. El intervalo de concentraciones de la acetosiringona varía aproximadamente entre 10 y 400 mg/1. De preferencia, el intervalo de concentraciones varía aproximadamente entre 5 y 200 mg/1. La presente invención contempla el método de precultivar, de manera óptima, explantes de planta en un medio de precultivo que contiene tanto una auxina como un inductor de Agrobacterium . La invención demuestra que la combinación de una auxina con un inductor de Agrobacterium produce mayores tasas de infección que las de cualquiera de los componentes por separado. Los explantes pueden precultivarse en el medio de precultivo durante aproximadamente entre 1 y 6 días antes de la introducción del Agrobacterium . De preferencia, los explantes se precultivan aproximadamente durante 4 días. El paso del precultivo puede realizarse tanto en condiciones iluminadas como a oscuras, no obstante, se prefiere precultivar en la oscuridad. La transformación de explantes de Eucalyptus se realiza con diferentes cepas de A. tumefaciens que albergan un vector de transformación. Uno de estos vectores es el GV2260, que contiene un gen GUS que funcionalmente ligado con un promotor, tal como un promotor de actina o un promotor constitutivo. El vector también portará un gen de resistencia a herbicidas funcionalmente ligado a un promotor. En la presente invención, el gen de la acetolactato sintasa (ALS) confiere la resistencia a los herbicidas y es impulsado por su promotor nativo de Arabiáopsis . Ver la patente de EE.UU. Núm. 6,225,105. Con una pipeta se gotea un cultivo de A. tumefaciens suspendido en un medio de inducción (formulación AIM) en los explantes, de tal modo que todos los bordes cortados estén expuestos a la bacteria. En forma alternativa, los explantes pueden transformarse mediante infiltración al vacío, inmersión floral y otros métodos de transformación mediada por Agrobacterium que son bien conocidos en la técnica. Para realizar una revisión de la transformación mediada por Agrobacterium, ver Gelvin, SB. Microbiol . Mol Biol Rev 67:1:16-37 (2003). Después de la introducción del Agrobacterium, los explantes se cocultivan con Agrobacterium en el mismo medio durante aproximadamente 3 días. Después del cocultivo, los explantes se transfieren a un medio de regeneración de brotes para recuperar brotes transgénicos . La presente invención enseña métodos para la regeneración de brotes, donde los explantes transformados se cultivan en un medio que contiene una mezcla de aminoácidos y vitaminas, reguladores de crecimiento de plantas, glucosa y un antioxidante. En el Cuadro 3 se enumera uno de estos medios de formulación completos, al que se le denomina medio de regeneración de Euc (eucalipto) . Al medio de regeneración de Euc se puede añadir un antioxidante, tal como ácido ascórbico, para reducir al mínimo la exudación de compuestos fenólicos de planta. Al medio se le puede añadir glucosa y glutamina para acelerar la regeneración de brotes . Para evitar un crecimiento bacteriano excesivo, el medio también puede incluir antibióticos, tales como carbenicilina, cefotaxima y Timentin. El antibiótico preferido es Timentin. La concentración de antibiótico varía aproximadamente entre 75 y 800 mg/1. De preferencia, la concentración de antibiótico es aproximadamente de 400 mg/1. El medio de regeneración de Euc contiene una mezcla de aminoácidos gue no interfiere con la biosíntesis de aminoácidos. En la presente invención, el medio de regeneración de Euc no interfiere con la selección del herbicida basado en sulfonilurea. De preferencia, el medio de regeneración de Euc no contiene aminoácidos de cadena ramificada (por ejemplo, leucina, isoleucina y valina) . Con más preferencia, los medios tienen una mezcla de aminoácidos que sustituye al hidrolisato de caseína. Con la máxima preferencia, la mezcla de aminoácidos contiene aminoácidos importantes para el crecimiento del cultivo de tej idos de plantas . Cuadro 3. Medio de regeneración de Eucaliptus Componentes para 1 litro del Gramos medio KN03 1 NH4H2P04 0.25 MgS04.7H20 0.25 CaCl2.2H20 0.10 FeS04.7H20 0.0139 Na2EDTA.2H20 0.01865 MES (Duchefa ml501) 600.0 MS Micro (1/2 concentración) MnS04.H2? 0.00845 ZnS04.7H20 0.0043 CuS04.5H20 0.0000125 CoCl2.6H20 0.0000125 KI 0.000415 H3BO3 0.0031 Na2Mo?4.2H20 0.000125 Reguladores del creci . de plantas Zeatina NAA (ácido naftalenacético) Azúcares Glucosa/Sacarosa 20.0 Mio-inositol 0.100 Aminoácido y mezcla de vitaminas Ácido nicotínico 0.010 Tiamina 0.010 Pantotenato de Ca 0.001 Piridoxina 0.001 Biotina 0.00001 Ácido ascórbico 0.050 L-glutamina 0.1 Arginina 0.0258 Glicina 0.00199 Lisina 0.0508 Metionina 0.0132 Fenilalanina 0.0257 Serina 0.00904 Treonina 0.00852 Triptófano 0.0122 Tirosina 0.0127 Agente gelificante Gelrite 3.0 En la presente invención, hay un periodo de recuperación de 4 días antes de seleccionar las plantas transformadas. Para seleccionar las plantas transformadas, se añade al medio de regeneración cualquier marcador seleccionable. Los marcadores seleccionables incluyen herbicidas y antibióticos. Adicionalmente, para seleccionar una planta transformada se puede utilizar cualquier marcador tamizable. Ejemplos de marcadores tamizables incluyen B-glucuroniáasa (GUS) , proteína verde fluorescente (GFP) y luciferasa. En la presente invención, se utiliza un agente de selección herbicida. En tanto que el herbicida de la presente invención es Alli, se puede usar cualquier herbicida. Otros herbicidas incluyen Oust y Liberty. La concentración de herbicida puede variar, dependiendo de la sensibilidad de los explantes de una especie específica. Los explantes seleccionados se subcultivan entre dos y tres semanas, hasta la formación de yemas adventicias. Los brotes adventicios transformados se separan de los agrupamientos de brotes y se tiñen para la expresión del GUS (B-glucuroni?asa) . Jefferson y col. EMBO: 6 : 13 : 901-3907 (1987) . Para determinar la eficiencia de transformación se usó un ensayo de gen indicador o reportero y, para asegurarse de que los brotes transformados no sean asilvestradas ni quimeras. Después de confirmar la transformación, por medio de la expresión de un gen marcador tamizable, análisis de transferencia Southern, análisis por PCR u otro método conocido en la técnica, los brotes transformados se transfieren, preferentemente, a un medio para el alargamiento del brote. La presente invención tiene considerado un medio de alargamiento de brotes que contiene sales de MS, sacarosa, auxina y ácido giberélico. El NAA es la auxina preferida y el GA3 es el ácido giberélico preferido. Los brotes se cultivan en el medio de alargamiento de brotes aproximadamente entre 10 y 14 días, de preferencia, en condiciones de oscuridad. Para el alargamiento de clones de E . áunnii es necesario agregar al medio de alargamiento más auxina y los brotes deben cultivarse en la oscuridad por lo que dure el alargamiento. Después del alargamiento de los brotes, éstos se retiran y transfieren a un medio de inducción de raíces. Dependiendo de las condiciones de iluminación, quizá sea necesario añadir reguladores del crecimiento de plantas al medio de inducción de raíces. Los métodos de la presente invención enseñan el corte de los brotes en el nodo o un poco por debajo del nodo. Con más preferencia, los brotes se cortan de un nodo cercano del ápice del brote. Uno de estos medios para el crecimiento de raíces (Cuadro 4) está compuesto por nutrientes BTM-1 (Chalupa, 1988), carbón activado (MeadWestvaco, Nuchar) y una cantidad adicional de CaCl2. En forma alternativa, en el medio de inducción de raíces se pueden usar otros medios de bajo contenido de sal, tales como el medio para plantas leñosas y MS de 1/2 concentración . Dependiendo de las condiciones de luz, el medio para el crecimiento de raíces puede contener reguladores del crecimiento para inducir la formación de la raíz. Por ejemplo, en condiciones de oscuridad que inducen la etiolación y la producción de auxina en el meristema apical del brote, quizá no sea necesario que el medio para el crecimiento de raíces contenga auxina. Adicionalmente, si los brotes se cortan en la oscuridad, quizá no sea necesario limitar el origen del corte a las regiones nodales y/o al ápice del brote. En forma alternativa, si el paso del crecimiento de las raíces se realiza con luz, quizá sea necesario que el medio de crecimiento contenga auxina. Además, si el paso de crecimiento de la raíz se realiza en la luz, se prefiere cortar los brotes en un nodo cerca del meristema apical del brote.

Cuadro 4. Medio preferido para el crecimiento de las raices de Eucalyptus Componentes del medio BTM- mg/1 NH4N03 412 KN03 475 Ca{N03)2.4H20 640 CaCl2.2H20 440* MgS04.7H20 370 KH2P04 170 MnS04. H20 2.3 ZnS04.7H20 8.6 CuS04.5H20 0.25 CoCl2.6H20 0.02 KI 0.15 H3BO3 6.2 Na2Mo04.2H20 0.25 FeS04.7H20 27.8 Na2EDTA.2H20 37.3 Mio-inositol 100 Ácido nicotínico 0.5 Piridoxina HCl 0.5 Tiamina HCl 1 Glicina 2 Sacarosa 20000 Carbón activado 5000 *A1 medio se añadieron 400 mg/1 más de CaCl2.2H20 En el caso de especies de difícil arraigamiento, los brotes cortados pueden someterse a un tratamiento con pulsos en un medio que contiene bajos niveles de auxina para inducir la formación de brotes. Por ejemplo, para el tratamiento con pulsos se puede usar un medio que contiene 0.25 mg/1 de 2,4-D. De preferencia, los brotes se tratan con pulsos aproximadamente de 5 a 14 días antes de ser transferidos al medio BTM-1 que contiene carbón activado. El método de transformación de la presente invención puede usarse para introducir en especies de Eucalyptus o de pino cualquier ADN ajeno. Gracias al uso de los métodos de la presente invención, cualquier ADN ajeno puede integrarse de manera estable en la célula de una planta y transmitirse a su progenie. Por ejemplo, usando los métodos presentes se puede introducir un gen involucrado en la biosíntesis de lignina, el desarrollo floral, la síntesis de celulosa, la absorción y el transporte de nutrientes, la resistencia a las enfermedades o una mayor resistencia a las condiciones del medio ambiente . Los métodos de la presente invención pueden ser utilizados para reducir la expresión génica en especies de pino o Eucalyptus . Se puede lograr reducir la expresión génica utilizando los métodos conocidos en la técnica, entre los que se incluyen: la supresión antisentido, la cosupresión (la expresión en el mismo sentido) y la interferencia de ARN de doble filamento. Para hacer una revisión general de las técnicas de supresión génica, ver Science, 288:1370-1372 (2000). Los documentos WO 99/49029 y WO 99/53050 también describen métodos de bloqueo génico. Para la supresión antisentido, una secuencia de ADNc se dispone en orientación inversa con respecto a la secuencia del promotor en un constructo de ADN. La longitud de la secuencia de ADNc no tiene que estar completa con respecto a cualquier producto de transcripción primaria o ARNm totalmente procesado. En general, para compensar el uso de una secuencia más corta se puede usar una mayor • identidad. Además, no es necesario que la secuencia introducida tenga el mismo patrón del intrón o del exón y la identidad de los segmentos que no son de codificación puede ser igual de eficaz. Por lo regular, deberá usarse una secuencia de aproximadamente entre 30 y 40 nucleótidos, aunque se prefiere usar una secuencia al menos de aproximadamente 100 nucleótidos, sin embargo, se tiene una mayor preferencia por una secuencia al menos de aproximadamente 200 nucleótidos y, en especial, se prefiere una secuencia de aproximadamente entre 500 y 3500 nucleótidos. El segmento de ácidos nucleicos que será introducido será prácticamente idéntico al menos a una porción del gen o genes endógenos que serán reprimidos. No obstante, la secuencia no tiene que ser perfectamente idéntica para inhibir la expresión. Los vectores de la presente invención pueden diseñarse de tal modo que el efecto inhibidor se aplique a otros genes en una familia de genes que muestran identidad o un importante grado de identidad con el gen objetivo. Otro método bien conocido de supresión génica en plantas es la cosupresión en el mismo sentido. La introducción de una configuración de secuencia de ácidos nucleicos en la orientación en el mismo sentido brinda un medio eficaz mediante el cual se bloquea la transcripción de los genes objetivo. Ver: Assaad et al . , Plant Mol . Bio . 22: 1067-1085 (1993); Flavell, Proc. Nati . Aca?. Sci . USA 91: 3490-3496 (1994); Stam et al . , Annals Bot . 79: 3-12 (1997); Napoli y et al . , The Plant Cell 2:279-289 (1990); y las patentes de EE.UU. Núm. 5,034,323, 5,231,020 y 5,283,184. Para la cosupresión, la longitud de la secuencia introducida no tiene que estar completa con respecto a ningún producto de transcripción primaria o ARNm totalmente procesado. De preferencia, la longitud de la secuencia introducida no es completa, de modo que se evite un fenotipo de sobreexpresión concurrente en el mismo sentido. En general, una mayor identidad en una secuencia de longitud menor que toda la longitud completa compensa una secuencia más larga y menos idéntica. Gracias al uso de los métodos de la presente invención, se puede usar la supresión antisentido de un gen involucrado en la biosíntesis de la lignina para modificar el contenido de lignina y/o la composición en una planta de Eucalyptus transformada. Se ha demostrado que la expresión antisentido de secuencias que codifican para el alcohol cinamílico deshidrogenasa (CAD) en álamo, N. tabacum y pino lleva a la producción de lignina, la cual tiene una composición monomérica modificada. Grand y et al . , Planta 163: 232-37 (1985), Yahiaoui et al . , Phyt o chemistry 49: 295-306 (1998) y Baucher et al . , Plant Physiol . 112: 1479 (1996), respectivamente. En consecuencia, los métodos de la presente invención pueden ser usados para transformar y regenerar especies de Eucalyptus que tienen la supresión antisentido de un ADN ajeno involucrado en la biosíntesis de lignina. Los métodos de la presente invención pueden ser utilizados para regular el desarrollo floral en una especie de pino o Eucalyptus . Se ha identificado que varios productos génicos son componentes críticos para el desarrollo de anteras y la formación de polen. Por ejemplo, la degradación prematura de la callosa, que es esencial para la formación de la pared celular de la microespora y la liberación de la microespora, es suficiente para provocar la esterilidad en plantas macho. Worrall et al , Plant Cell 4:7:759-71(1992). En consecuencia, se han desarrollado varios métodos para producir plantas macho estériles. Por ejemplo, la patente de EE.UU. Núm. 5,962,769 describe plantas transgénicas macho que se volvieron estériles mediante la expresión de la avidina. La avidina puede expresarse constitutivamente en una forma que no es específica del tejido o en otros tejidos específicos de antera. Además, la esterilidad en machos puede inducirse mediante la supresión antisentido del gen calcona sintasa A. van der Meer et al . , The Plant Cell 4:253 (1992). Gracias a los métodos de la presente invención, se pueden producir y regenerar especies macho estériles de pino y Eucalyptus . La presente invención brinda medios para plantas, los cuales contienen un herbicida de sulfonilurea o algún otro herbicida relacionado y un derivado del hidrolisato de caseína, donde el derivado prácticamente carece de aminoácidos de cadena ramificada. El hidrolisato de caseína, conocido también como polvo de caseína o casaminoácidos, es una mezcla de aminoácidos y fragmentos de péptidos cortos obtenidos por la hidrólisis de la caseína. Si bien en la literatura se informa de varias composiciones de aminoácidos y diversas composiciones de aminoácidos pueden obtenerse de varias fuentes de caseína y diversos medios de hidrólisis, el hidrolisato de caseína obtenido de cualguier fuente utilizando cualguier medio contiene, por lo regular, aminoácidos de cadena ramificada que incluyen valina, leucina e isoleucina; aminoácidos aromáticos, tales como el triptófano; y otros aminoácidos, como la glicina. Adicionalmente, si bien la composición varía, los profesionales en el campo están de acuerdo en que el compuesto es crítico para iniciar el crecimiento de las células de la planta, en particular, de muchos tipos de cultivos embriogénicos y células de plantas coniferas in vitro . Los que tienen experiencia en la técnica del cultivo de tejidos de plantas leñosas consideran que la suplementación de los componentes de medios inorgánicos con componentes de nitrógeno reducidos, tales como aminoácidos y en particular, hidrolisato de caseína, es un elemento esencial para inducir o sostener el crecimiento de los cultivos a partir de los cuales posteriormente se pueden regenerar plantas. Por ejemplo, los medios de inicio, inducción y/o manutención o sostenimiento de cultivos de células embriogénicas de especies de coniferas contienen, por lo regular, hidrolisato de caseína. Ver, por ejemplo, las patentes de EE.UU. Núm. 5,034,326, 5,036,007, 5,041,382, 5,236,841, 5,310,672, 5,491,090, 5,413,930, 5,506,136, 5,534,433, 5,534,434, 5,563,061, 5,610,051, 5,821,126, 5,850,032, 6,200,809 y 6,518,485. De este modo, sin importar si los medios de los posteriores pasos de cultivo contienen hidrolisato de caseína, persisten en éstos pequeñas cantidades de este compuesto. Estas cantidades del orden de trazas pueden provocar problemas durante la selección. Por ejemplo, pequeñas cantidades de hidrolisato de caseína pueden inhibir la efectividad de los agentes de selección, tales como sulfonilureas, imidazolinonas y triazolopirimidinas, cuya función es identificar células de plantas transgénicas después de la transfección mediante un vector de interés. Como se señaló arriba, estos agentes de selección se dirigen a la acetolactato sintasa (ALS) , la cual cataliza el primer paso común en la ruta biosintética de los aminoácidos de cadena ramificada valina, leucina e isoleucina de una planta. Como marcadores seleccionables en constructos de ADN recombinante se usaron formas mutantes de la ALS resistentes a estos agentes y se aparearon con los agentes de selección para identificar las células de planta transformadas . Por lo tanto, cantidades pequeñas de hidrolisato de caseína en el medio de selección permiten que las células no transformadas crezcan en presencia de sulfonilureas, imidazolinonas o triazolopirimidinas. Estos falsos positivos dificultan la producción de plantas transgénicas puesto que se tienen que evaluar más muestras para identificar los transformantes deseados. La presente invención resuelve este problema al modificar la composición del hidrolisato de caseína de tal modo que prácticamente carece de aminoácidos de cadena ramificada. En otra modalidad, el derivado de hidrolisato de caseína contiene un mayor porcentaje de aminoácidos que son importantes en el crecimiento del cultivo de tejidos de planta, tales como arginina o glutamina.

En otro aspecto, la invención ofrece composiciones de medios para seleccionar plantas transgénicas que contienen un análogo del triptófano, donde los medios prácticamente carecen de triptófano. Las formas insensibles a la realimentación del AS permiten que los marcadores seleccionables sean útiles en transformaciones de plantas. Estos marcadores trabajan en conjunción con los análogos del triptófano para identificar a los transformantes. Un marcador seleccionable preferido es la ASA2. El triptófano aparece comúnmente en los medios para plantas como componente del hidrolisato de caseína. La presencia de pequeñas cantidades de triptófano en los medios de selección puede permitir que los no transformantes escapen al proceso de selección, produciéndose así falsos positivos . Se descubrió que la selección de transformantes en medios que prácticamente carecían de triptófano mejoraba el proceso de selección al reducir el número de falsos positivos. Así, un aspecto de la presente invención ofrece un método para seleccionar una célula de planta transformada, el método comprende: transformar una célula de planta con un vector que contiene un gen de interés y un gen que codifica para una forma insensible a la realimentación de la antranilato sintasa (AS) y cultivar la célula transformada en composiciones de medios que contienen un análogo del triptófano, donde los medios prácticamente carecen de triptófano. Los métodos, medios y plásmidos descritos en la presente son útiles para seleccionar líneas de plantas o árboles transgénicos de interés forestal mediante el uso de agentes de selección, tales como herbicidas de sulfonilurea e imidazolinona y análogos de triptófano metilados, que alteran el metabolismo de los aminoácidos. Éstos además son útiles en los medios de selección, preselección y pretransformación utilizados para cultivar el material de las plantas que será sometido a la transformación con marcadores seleccionables que alteran el metabolismo de los aminoácidos . Los métodos, medios y plásmidos arriba descritos son adicionalmente útiles para regenerar plantas a partir de líneas celulares que se seleccionaron utilizando agentes de selección que alteran el metabolismo de los aminoácidos. Éstos pueden utilizarse para obtener plantas transformadas con marcadores seleccionables que alteran el metabolismo de los aminoácidos y que también pueden ser resistentes a los herbicidas que alteran el metabolismo de los aminoácidos. En consecuencia, las presentes invenciones también son útiles para obtener reservas o existencias de árboles resistentes a herbicidas. Además, las invenciones son útiles para ofrecer material de cosecha adecuado para el manejo de malezas con herbicidas en las plantaciones forestales . Se pueden usar los métodos, medios y plásmidos de la invención para seleccionar y regenerar plantas transformadas con genes que producen la sobreproducción de aminoácidos específicos, tales como triptófano. En consecuencia, pueden ser adicionalmente útiles para obtener reservas de árboles que como resultado de dicha sobreproducción presentan un crecimiento mayor o alterado. Los métodos aquí descritos son, por lo general, útiles para desarrollar y probar nuevos medios de selección y dosis de agentes selectivos. Los mismos principios utilizados para diseñar estos medios pueden aplicarse al diseño de los medios de selección de métodos de selección positiva, tales como el uso de azúcares normalmente no metabolizados . Los métodos de la invención son útiles para desarrollar formulaciones de mezclas de aminoácidos para suplir al medio de cultivo de tejidos de plantas. En otra modalidad, la invención provee constructos recombinantes útiles para expresar proteínas heterólogas en plantas. Ejemplos de vectores de la invención incluyen los siguientes: pWVC20 (Figura 1), pWVC21 (Figura 2), pWVC23 (Figura 3), pWVC24 (Figura 4), pWVC25 (Figura 5), pWVC26 (Figura 5), pWVC30 (Figura 6), pWVC33 (Figura 7), pWVC34 (Figura 8) y pWVC35 (Figura 8). Otro aspecto de la invención ofrece métodos para obtener madera, pulpa de madera, papel y aceite de una planta transformada y seleccionada usando los métodos de la presente invención. En lo anterior se presentaron métodos para transformar y seleccionar una planta transgénica, mismos gue se conocen en la técnica. Una planta transformada puede cultivarse o desarrollarse en cualguiera de las condiciones adecuadas. Por ejemplo, el pino puede cultivarse y desarrollarse como se describe en la publicación de la solicitud de patente de EE.UU. Número 2002/0100083. El Eucalyptus puede cultivarse y desarrollarse como se describe, por ejemplo, en Rydelius et al., Growing Eucalyptus for Pulp and Energy, presentado en la conferencia Mechanization in Short Rotation, Intensive Culture Forestry Conference, Mobile, AL, 1994. De las plantas puede obtenerse madera, pulpa de madera, papel y aceite mediante el uso de cualquiera de los medios conocidos en la técnica. Como se señaló antes, la madera y la pulpa de madera obtenidas de conformidad con esta invención pueden presentar mejores características que incluyen, aunque no se limitan a una o más de: composición de lignina, estructura lignínica, composición de la madera, polimerización de la celulosa, dimensiones de la fibra, proporción de fibras a otros componentes de la planta, división celular de la planta, desarrollo de las células de la planta, número de células por unidad de área, tamaño y forma de las células, composición de la pared celular, tasa de formación de la madera, aspecto estético de la madera, formación de defectos en el tallo, tasa de crecimiento, velocidad de formación de la raíz, proporción de raíz a ramas, desarrollo vegetativo, índice de área foliar y de forma de las hojas, incluido el aumento o la disminución en el contenido de lignina, aumento en la facilidad para procesar la lignina con tratamientos químicos, mejorar la reactividad de la lignina; aumento o disminución en el contenido de celulosa, aumento en la estabilidad dimensional, aumento en la resistencia a la tensión, aumento en la resistencia al esfuerzo de corte, aumento en la resistencia a la compresión, aumento en la resistencia al choque, aumento en la rigidez, aumento o disminución de la dureza, reducción en la espiralidad, reducción en la contracción y diferencias en el peso, la densidad y el peso específico . El fenotipo puede ser evaluado mediante cualguiera de los medios adecuados. Las plantas pueden evaluarse con base en su morfología general. Las plantas transgénicas pueden observase a simple vista, se pueden pesar y medir su altura. La planta puede examinarse aislando capas individuales de tejido de la planta, a saber, el floema y el cámbium, el cual se secciona adicionalmente en células meristémicas, expansión temprana, expansión tardía, formación de pared secundaria y maduración tardía de las células. Ver, por ejemplo, Hertzberg, anteriormente citado. Las plantas también pueden ser evaluadas utilizando análisis al microscopio o análisis químico . El análisis al microscopio incluye el examen de los tipos de células, la etapa de desarrollo y la absorción de la tintura por tejidos y células. La morfología de la fibra, como el grosor de la pared de la fibra y el ángulo de la microfibrilla de las fibras de pulpa de madera, pueden observarse usando, por ejemplo, elipsometría microscópica de transmisión. Ver, Ye y Sundstróm, Tappi J. , 80:181 (1997). La resistencia de la madera, la densidad y la pendiente del grano en la madera húmeda y en los árboles en pie pueden determinarse por medio de los datos del espectro visible y del infrarrojo cercano en conjunción con el análisis multivariante. Ver la publicación de las solicitudes de patente de EE.UU. Núm. 2002/0107644 y 2002/0113212. El tamaño del diámetro interno puede medirse utilizando microscopía electrónica de barrido. La estructura y propiedades químicas de la lignina pueden determinarse utilizando - espectroscopia de resonancia magnética nuclear, según se describe en Marita et al., J. Chem . Soc , Perkin Trans . 12939 (2001). La característica bioquímica de la lignina, celulosa, carbohidratos y otros extractos de la planta pueden evaluarse por medio de cualquier método estándar conocido entre los que se incluyen: espectrofotometría, espectroscopia de fluorescencia, HPLC, espectroscopia de masas y métodos de tinción de tejidos. Los que tienen experiencia ordinaria en la técnica relacionada reconocerán con facilidad que a los métodos y aplicaciones descritos en la presente se les pueden realizar otras modificaciones y adaptaciones adecuadas sin apartarse del alcance de la invención o de cualquier modalidad de la misma. Los siguientes ejemplos se exponen como representativos de modalidades específicas y preferidas de la presente invención. De ninguna manera deberá interpretarse que estos ejemplos limitan el alcance de la invención. Deberá entenderse que pueden realizarse numerosas variantes y modificaciones, en tanto permanezcan dentro del espíritu y alcance de la invención.

EJEMPLOS : EJEMPLO 1 - MATERIALES DE LA PLANTA Todos los clones de élite se mantuvieron como grupos de brotes en cajas Magenta y se subcultivaron cada 4-6 semanas. Los grupos de brotes se dividieron según lo necesario y se conservaron como el cultivo madre. A menos que se indique de otra manera, todos los cultivos se realizaron a la sombra de luz fluorescente fría con una intensidad de 30-40 µE/m2/s y un fotoperiodo de 16 horas, la temperatura de la sala de cultivo era de 21°C. Con excepción de los clones de E. áunnii seleccionados, en todos los clones seleccionados se usaron explantes de hoja. El clon comercial de élite de E. áunnii DUN00001 fue suministrado por Rijesa, una subsidiaria de MeadWestvaco Brasil. Los grupos de brotes se mantuvieron en 4 grupos por caja Magenta. El explante preferido de estos clones son los tejidos con avanzados tejidos vasculares, tales como internodos, pecíolos y venas centrales. Los clones de E. granáis fueron suministrados por Rubicon, Nueva Zelanda. Los clones de E. granáis se recibieron como grupos de brotes en un medio sólido. Los grupos fueron transferidos al medio de conservación de Euc (Cuadro 1) con BA a 0.2-0.5 mg/1 en cajas Magenta. Los grupos de brotes eran transferidos a un medio nuevo cada 4-6 semanas.

Los clones comerciales de E. granáis x urophylla IPB1 fueron suministrados por International Paper, EE.UU. Los grupos de brotes se recibieron en la misma forma que la descrita para E . granáis . Los procedimientos para el establecimiento de la reserva y las condiciones de cultivo fueron las mismas que para el E. granáis, con la excepción de que todos los cultivos se desarrollaron en condiciones de iluminación total a una intensidad de aproximadamente 120 µE/m2/s. Los clones comerciales de E. camaláulensis se recibieron como recortes de International Paper, EE.UU. Los brotes apicales y auxiliares recién nivelados se sometieron a esterilización superficial con blanqueador comercial al 10-15% durante 5-10 minutos, un enjuague rápido con etanol al 70% y tres enjuagues con agua esterilizada. Los nodos se separaron y cultivaron en el medio de conservación de Euc. Cuando a partir de los nodos se iniciaron los brotes auxiliares, se transfirieron al medio de conservación de Euc nuevo para que proliferaran aún más. Los cultivos madre o de reserva se establecieron en el mismo medio después de 3-4 ciclos de cultivo. Los cultivos madre se mantuvieron a las mismas condiciones que la anteriormente descritas para los otros clones.

EJEMPLO 2 - CONSTRUCTO Para los experimentos de transformación se usaron dos constructos: pWVZ20 y pWVR133. El plásmido binario pWVZ20 contiene un gen resistente a herbicidas impulsado por un promotor de plantas y el gen de ß-glucuroniáasa (GUS) impulsado por un promotor constitutivo entre los bordes de ADN-T. El plásmido binario pWVRl33 contiene el mismo constructo de gen resistente a herbicidas, pero el gen de GUS contiene un intrón y es impulsado por un promotor de actina . La expresión GUS del pWVR133 solamente se presenta en las células de plantas y no en células bacterianas. Para los estudios de transformación se usó la cepa de Agrobacterium GV2260 (Deblaere et al. 1985). Cualquiera de habilidad ordinaria en la técnica podría utilizar cualquier constructo binario que tenga un gen resistente a herbicidas funcionalmente ligado a un promotor constitutivo de plantas .

EJEMPLO 3 - PREPARACIÓN DEL AGROBACTERIÜM PARA LA TRANSFORMACIÓN El Agrobacterium, que contiene cualquiera de pWVZ20 o pWVR133, se cultivó en el medio YEP (10 g/l de extracto de levadura, 10 g/l de peptona y 50 mg/1 de NaCl, pH 7.0-7.2) durante 3 días. De la placa se seleccionó una sola colonia y se cultivó en 20-50 ml del medio YEP líquido con kanamicina a 100 mg/1 y rifampicina a 50 mg/1. Los cultivos se incubaron durante toda la noche en una incubadora de sacudidas a 28°C y 150 rpm. El cultivo de toda la noche con un OD de aproximadamente 0.6-1.1 se sometió a centrifugación en una centrífuga de escritorio a 3000 g durante 20 minutos y se resuspendió con medio de inducción de Agrobacterium o AIM (sales del WPM con 5 g/l de glucosa, acetosiringona 250 µM, amortiguador de fosfato 2 mM y MES 0.05 M, pH de 5.8) con un OD de aproximadamente 0.6-1.1. Los cultivos se incubaron durante 25 minutos a 28 °C antes de la infección. La concentración bacteriana se determinó antes y después de la infección.

EJEMPLO 4 - PREPARACIÓN DE EXPLANTES PARA INFECCIÓN Y PRECULTIVO Como fuentes de los explantes se usaron los cultivos madre de Eucalyptus mantenidos en medio de manutención de Euc. Aunque para la transformación se pueden usar hojas, pecíolos, internodos, tejidos florales y embriogénicos, se seleccionan los explantes de hojas, debido a la abundancia de las hojas. Para la transformación se seleccionaron hojas sanas y recién abiertas. Las porciones de punta de las hojas se quitaron con tijeras o fórceps para aumentar el número de células lesionadas . Los explantes se colocaron en el medio de precultivo (Cuadro 2) con el lado abaxial hacia abajo. El medio de precultivo es un medio nutriente en el que los explantes de planta se cultivaron antes de la transformación con Agrobacterium. Específicamente, el medio de precultivo de la invención aumenta la eficiencia de transformación y la regeneración de la planta. Si bien el presente medio de precultivo contiene acetosiringona, se pueden usar otros inductores de Agrobacterium . En el presente medio de precultivo se usaron las sales del medio para plantas leñosas o WPM, (Loyd and McCown, 1980) ; no obstante, se pueden utilizar otros medios salinos, tales como el medio MS (Murashige y Skoog, 1962) o el medio de Lepoivre . De manera opcional, el medio de precultivo puede contener reguladores del crecimiento de la planta, incluidas la auxina y la citoguinina. En la presente invención, los explantes de planta se precultivaron durante cuatro días en condiciones de oscuridad en el medio de cultivo mostrado en el Cuadro 2. Si bien no es necesario, el presente medio de precultivo contenía tanto auxina como citoquinina. Adicionalmente, los explantes de planta pueden cultivarse en el medio de precultivo de uno a seis días antes de la transformación con Agrobacterium .

EJEMPLO 5 - INOCULACIÓN Y ELIMINACIÓN DE AGROBACTERIÜM El cultivo de Agrobacterium inducido se preparó tal como se describió en el Ejemplo 3 y el cultivo se agregó por goteo con una pipeta encima de cada explante.

Para asegurar gue todos los bordes cortados estuviesen cubiertos con la solución bacteriana, se goteó una cantidad suficiente de cultivo de Agrobacterium . En forma alternativa, los explantes pueden transformarse mediante infiltración al vacío, inmersión floral y otros métodos de transformación mediada por Agrobacterium . Después de la transformación, los explantes cubiertos con el cultivo de Agrobacterium se colocaron en la oscuridad para cuatro días de cocultivo. Alternativamente, los explantes pueden cocultivarse con Agrobacterium en condiciones iluminadas. De manera adicional, los explantes pueden cocultivarse con Agrobacterium en condiciones de luz u oscuridad durante 2-10 días, de preferencia, durante 4 días. Después del cocultivo, los explantes se transfirieron al medio de regeneración de Euc (Cuadro 3) con 400 mg/1 de Timentin. No es necesario lavar los explantes . Los explantes se cultivaron en este medio durante cuatro días antes de transferirlos a un medio de selección. En el ejemplo presente, el medio de selección es el medio de regeneración de Euc suplido tanto con Timentin como con un agente de selección herbicida.

EJEMPLO 6 - REGENERACIÓN DE BROTES TRANSGÉNICOS Los grupos de brotes que sobrevivieron a la selección se mantuvieron en el medio de regeneración de Euc que contenía herbicida y Timentin y se transfirieron cada 3 semanas hasta la proliferación de los brotes y su alargamiento inicial. Para los experimentos de transformación con pWVRl33, se tiñeron los tejidos de hojas y tallos de los brotes regenerados para la expresión de GUS en cuanto se desarrollaron los brotes. Para los experimentos de transformación con pWVZ20, se tiñeron los tejidos de hojas y tallos de los brotes regenerados para la expresión de GUS cuando los brotes se desarrollaron aún más y se liberaron del Agrobacterium residual.

EJEMPLO 7—TINCIÓN DE GUS Para vigilar la frecuencia de infección con Agrobacterium y asegurar que los brotes seleccionados no fueran asilvestrados ni quimeras, se realizó la tinción de GUS. Para los experimentos de transformación con pWVRl33, se tiñeron los tejidos de hojas y tallos de los brotes regenerados para la expresión de GUS inmediatamente después de que se desarrollaron los brotes. Para los experimentos de transformación con pWVZ20, se tiñeron los tejidos de hojas y tallos de los brotes regenerados para la expresión de GUS cuando los brotes se desarrollaron aún más y se liberaron del Agrobacterium residual. Para determinar la actividad de la GUS, los explantes se incubaron en un sustrato que contenía amortiguador de fosfato 100 mM (pH de 7.0), sulfóxido de dimetilo al 0.05%, Tritón X-100 al 0.05%, EDTA 10 mM, ferrocianuro de potasio 0.5 mM y 1.5 mg/ml de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-J3-D-glucurónido (X-gluc) . Los explantes se sometieron a un vacío durante 10 minutos antes de incubarse durante toda la noche a 37 °C. Después de incubarse toda la noche, se contaron los focos de GUS.

EJEMPLO 8 - AISLAMIENTO DEL ARN El ARN se aisló de los tejidos de hojas y tallos de plantas de E. grandis, E. grandis x urophylla y E. camal?ulensis transformados y de tipo silvestre con el kit RNAqueous™-96, de conformidad con las instrucciones del fabricante. De 0.1 a 1.5 mg de tejido se suspendieron, por poco tiempo, en 300 µl de amortiguador de lisis/unión y con un pistilo de plástico se molieron hasta obtener un polvo fino. Las muestras se centrifugaron durante 3 minutos a máxima velocidad y el sobrenadante se transfirió a una placa nueva. Al sobrenadante se añadieron trescientos µl (lx v/v) de etanol al 64% y las muestras se sometieron brevemente a agitación vorticial. Las muestras se centrifugaron entonces durante 2 minutos a 1850 g. Después de la centrifugación, se realiza un paso optativo de tratamiento con DNasa. Para cada muestra, en el centro de la almohadilla del filtro se añadieron 5 µl de DNasa + 35 µl de amortiguador de DNasa y las muestras se incubaron a temperatura ambiente por 20 minutos. Después de la incubación de 20 minutos, a cada muestra se le añadieron 600 ml del amortiguador A de lavado y las muestras se centrifugaron a máxima velocidad durante 2 minutos. Después de la centrifugación, se desecharon los sobrenadantes y a la almohadilla del filtro de cada muestra se le añadieron 600 µl del amortiguador B de lavado. Después de centrifugar a máxima velocidad durante 2 minutos, se desecharon los sobrenadantes y a cada almohadilla de filtro se añadieron 600 µl del amortiguador C/D de lavado. Las muestras se centrifugaron a máxima velocidad durante 2 minutos y se desecharon los sobrenadantes . Después de un segundo enjuague con el amortiguador de lavado C/D, a las muestras se les añadieron 50 µl de la solución de elución del ARN y se centrifugaron a máxima velocidad por 2-3 minutos. El paso de la elución de ARN se repitió y las muestras de ARN eluido se almacenaron a -80 grados Celsius hasta su uso posterior.

EJEMPLO 9 - RT-PCR Para determinar la presencia y expresión del gen de resistencia a herbicidas ALS, se realizó la RT-PCR. Se aisló el total del ARN, de la manera descrita en el Ejemplo 8, de muestras de plantas de E. granáis, E. granáis x urophylla, and E. camal?ulensis transformadas y de tipo silvestre. Después del aislamiento y cuantificación del ARN, se realizó la RT-PCR con un kit de RT-PCR "Listo para usar" (Pharmacia) , de conformidad con las instrucciones del fabricante. Por lo general, a una mezcla de reacción de 45 µl para RT-PCR que contenía 1 µl de oligo dTn, 1 µl-3 µM del cebador directo de ALS, 1 µl-3 µM del cebador inverso de ALS y 42 µl de agua se le añaden 5 µl del ARN total (aproximadamente 20 ng de ARN) . Para desnaturalizar el ARN, los tubos se calentaron a una temperatura de al menos 75°C por 3 minutos. Las muestras se incubaron entonces a 42 °C durante minutos. Después de la incubación, la RT-PCR se realizó como sigue : Ciclo 1 : 95 °C por 5 minutos 55 °C por 1 minuto 72 °C por 1 minuto Ciclos 2-30 : 95 °C por 1 minuto 55 °C por 1 minuto 72 °C por 1 minuto Ciclo 31 : 95 °C por 1 minuto 55 °C por 1 minuto 72 °C por 10 minutos Después de completar la RT-PCR, los productos de la amplificación por PCR se visualizaron en un gel de agarosa teñida con bromuro de etidio . EJEMPLO 10 - OPTIMIZACIÓN DE LOS REGULADORES DEL CRECIMIENTO Este ej emplo enseña un método para optimizar los niveles de los reguladores del crecimiento para la regeneración de brotes a partir del clon comercial de E. áunnii DUN00001, resistente a los microbios o de otros clones resistentes a los microbios. Los explantes internodales se prepararon tal como se describió en el Ejemplo 1 y se inocularon con Agrobacterium, como se describió en el Ejemplo 5. Después del cocultivo, los grupos de brotes transformados se transfirieron a un medio de regeneración de brotes . En estudios previos a este ejemplo, solamente la combinación de zeatina y NAA dio origen a la regeneración de brotes, mientras que otras combinaciones de citoquininas BA, 2ip y auxina 2,4-D, IAA, IBA no produjeron brotes adventicios. Para optimizar las concentraciones de auxina y citoquinina en el medio de regeneración de brotes, se evaluaron varias combinaciones de hormonas, en función de la producción de brotes alargados. Muchas combinaciones, tales como TDZ Y NAA producen primordios de brote, pero no brotes alargados. Durante el tamizado inicial, los niveles de zeatina fueron de 10, 1 y 0.1 mg/1 y los niveles de NAA fueron de 0.01, 0.1 y 1 mg/1. La zeatina produjo mejores resultados a 10 mg/1 que a 1 mg/1 o 0.1 mg/1. Los datos siguientes resumen el intento por optimizar el nivel de zeatina y NAA.

Cuadro 5. Efecto de los niveles de zeatina y NAA sobre la producción de primordio verde de brotes (GSP, Green Shoot Primodia) y brotes alargados (a) Total . de piezas Datos a las 12 semanas Zeatina/NAA de explante Frecuencia GSP Frecuencia de (mg/1) (%) regeneración (%) 5/0.01 18 61 0 5/0.03 18 39 0 5/0.05 18 56 0 5/0.07 18 33 17 5/0.09 18 33 6 5/0.11 18 44 44 10/0.01 18 67 6 10/0.03 18 50 0 10/0.05 18 72 0 10/0.07 18 61 0 10/0.09 18 50 0 10/0.11 18 56 0 (b) Total . de piezas Datos a las 12 semanas Zeatina/NAA de explante Frecuencia GSP Frecuencia de (mg/1) (%) regeneración (%) 5/0.01 90 47 1 5/0.03 90 51 7 5/0.05 90 34 4 5/0.07 90 38 3 5/0.09 90 53 13 5/0.11 90 62 24 10/0.01 90 31 2 10/0.03 90 56 3 10/0.05 90 52 4 10/0.07 90 56 4 10/0.09 90 66 2 10/0.11 90 64 8 Dos experimentos mostraron, congruentemente, que a zeatina a 5 mg/1 es mejor que 10 mg/1 y gue la NAA a 0.11 mg/1 es mejor que los niveles bajos para la inducción de brotes . Estudios adicionales mostraron que niveles menores de zeatina no son tan eficaces como los 5 mg/1 para la regeneración de clones resistentes a los microbios, tales como los clones de E. áunnii seleccionados y los aumentos en el NAA tienden a inducir el indeseable crecimiento del callo. Así, la zeatina a 5 mg/1 y el NAA a 0.11 mg/1 se seleccionan como los reguladores básicos del crecimiento del medio de regeneración de Euc. Para inducir • el desarrollo de los brotes de cualquier clon se puede usar el medio de regeneración de Euc. Puesto que diferentes clones pueden necesitar diferentes concentraciones de los reguladores del crecimiento de plantas, el medio de regeneración de Euc debe optimizarse para cada clon. El medio de regeneración de Euc se utiliza, por lo general, para inducir brotes adventicios en clones seleccionados, como los clones de E. granáis FC1-5 y FC9, el clon 4590 de E. camaláulensis y el clon IPB1 de E. granáis x urophylla . La eficiencia de regeneración es, por lo regular, mayor de 90 por ciento después de 12 semanas de cultivo.

EJEMPLO 11 - MEZCLA DE AMINOÁCIDOS PARA LA REGENERACIÓN DE BROTES Este ejemplo enseña el uso de la mezcla de aminoácidos y vitaminas (ver la fórmula en el Cuadro 2) para acelerar el proceso de regeneración de brotes mediante la promoción del crecimiento de masas de brotes . Los explantes foliares del clon FC3 de E. granáis se prepararon como se describió en el Ejemplo 1 y el inoculo de Agrobacterium se preparó de conformidad con el Ejemplo 4. Los explantes fueron inoculados tal como se describió en el Ejemplo 5 y se cocultivaron por tres días. Después del cocultivo se cosecharon los explantes foliares y se colocaron (10 piezas por caja Magenta) en un medio con o sin la mezcla de aminoácidos. A las 4 semanas, la fase temprana de la organogénesis se evaluó como la frecuencia con que los explantes forman brotes adventicios y se midió el tamaño de los grupos con primordios de brotes, brotes pequeños y callo (ver el Cuadro 6) .

Cuadro 6. Efecto de la mezcla de aminoácidos sobre la organogénesis del clon FC3 de E. grandis .

Como se muestra en este estudio, la inclusión de la mezcla de aminoácidos (Cuadro 2) aceleró la regeneración de brotes mediante el aumento del tamaño del grupo.

EJEMPLO 12 - MÉTODO PARA AUMENTAR LA TASA DE INFECCIÓN Este ejemplo enseña un método para aumentar la tasa o velocidad de infección con Agrobacterium . En particular, este ejemplo enseña un método que estimula el crecimiento celular, aumenta el número de células objetivo y promueve la infección. Los explantes del clon IPB1 de Eucalyptus grandis x urophylla de élite se prepararon como se describió en el Ejemplo 1 y la cepa GV2260 de Agrobacterium que contenía el pWVR133 se preparó como se describió en el Ejemplo 3. Los explantes cosechados se incubaron en la oscuridad durante 4 días ya sea en el medio de regeneración de Euc o en un medio con varios reguladores de crecimiento rico en auxina. El cultivo con Agrobacterium se goteó sobre los explantes y se cocultivó en la oscuridad por 3 días en el mismo medio que los explantes. A continuación, se retiraron los explantes del caldo de Agrobacterium y se transfirieron al medio de regeneración de Euc suplido con 400 mg/1 de Timentin para un periodo de 4 días. Después de la transferencia al medio de regeneración, los explantes se tiñeron para la expresión de la GUS. Como se muestra en los Cuadros 7 y 8, varios reguladores del crecimiento de tipo auxina tuvieron un efecto positivo en la expresión de la GUS a los 7 días después de la infección.

Cuadro 7. El pretratamiento con auxina aumenta la velocidad de infección con Agrobacterium en un clon IPB1 de Eucalyptus grandis x urophylla de élite Medio de Núm. de Núm. % de Núm. de Núm. pro . de pretratamiento (medio explantes de GUS+ focos focos/explande reg. de Euc + PGR GUS+ GUS tes en mg/1) respondientes .0 de zeatina/0.1 de 25 3 12 6 2.3 NAA (medio de control de la regeneración) 0.25 de 2,4-D/0.5 de 24 4 17 7 1.5 zeatina 1.0 de 2,4-D/0.5 de 25 15 60 155 10.3 zeatina Aunque hay un aumento significativo en la velocidad de infección y en el número de células que expresan GUS, el control muestra un retraso en la regeneración de brotes en el medio con 1.0 mg/1 de 2,4-D. El nivel de zeatina se aumentó a 5 mg/1, el mismo nivel que en el medio de regeneración.

Cuadro 8. Varios reguladores del crecimiento de tipo auxina muestran una influencia positiva en la infección de un clon IPBl de Eucalyptus grandis x urophylla de élite Medio de pretratamiento Núm. de Núm. de % de Núm. de Núm. prom. (medio de reg. de Euc + 5 explantes GUS+ GUS+ focos de mg/1 de zeatina + auxinas GUS focos/exen mg/1) plantes respondientes 0. .1 de NAA 25 16 1.3 medio de control de la regeneración) 1.0 de 2,4-D 25 12 48 64 5.3 0.5 tie 2,4-D 25 20 80 97 4.9 2. .0 de NAA 25 9 36 30 3.3 1. .0 de NAA 25 13 52 35 2.7 3. .0 de IAA 48 46 96 565 12.3 2, .0 de IAA 25 16 64 167 10.4 1, .0 de IAA 25 16 64 116 7.3 1. .0 de TDZ 25 0 0 0 0.0 0, .5 de TDZ 25 1 4 3 3.0 0, .1 de TDZ 25 3 12 25 8.3 Los resultados de los experimentos anteriores muestran que el precultivo de los explantes con el medio rico en diversos reguladores del crecimiento de plantas de tipo auxina aumenta la velocidad de infección, evaluada por medio de la frecuencia de los explantes con focos de GUS y el número promedio de focos de GUS por explante respondiente. Además, la regeneración no se ve afectada por el precultivo en los experimentos de control.

EJEMPLO 13 - EL INDUCTOR DE AGROBACTERIUM MEJORA LA VELOCIDAD DE INFECCIÓN Este ejemplo muestra que la sola inclusión de la acetosiringona (AS) en el medio de precultivo mejora significativamente la velocidad de infección. En este experimento, los explantes foliares de los clones FC3 y FC5 de E. granáis se precultivaron durante 4 días con cuatro medios: medio de regeneración de Euc, medio de regeneración de Euc con 250 µM o 750 µM de acetosiringona o medio de regeneración de Euc con la combinación de reguladores del crecimiento 0.25 mg/1 de 2,4-D y 5 mg/1 de zeatina. A continuación, los explantes se infectaron con Agrobacterium y se cocultivaron durante 3 días en el mismo medio antes de transferirlos al medio de regeneración de Euc con 400 mg/1 de Timentin. La tinción de la GUS se realizó cuatro días después del cocultivo. Los datos se resumen en los Cuadros 9 y 10.

Cuadro 9. Efecto de la acetosiringona en la infección con Agrobacterium de los clones FC3 de E. Grandis Medio de precultivo Núm. de Núm. % de Núm. de Núm. prom. (medio de reg. de Euc. explantes de GUS+ focos de focos/ex¬ + PGR en mg/1) GUS+ GUS plantes respondientes .0 de zeatina/0.1 de 25 2 8 4 2 NAA (medio de control de la regeneración) 5.0 de zeatina/0.1 de 25 19 76 162 8.5 NAA + AS 250 µM 5.0 de zeatina/0.1 de 25 22 88 232 10.5 NAA + AS 750 µM 5.0 de zeatina/0.25 de 25 16 64 62 3.9 2,4-D Cuadro 10. Efecto de la acetosiringona en la infección con Agrobacterium de los clones FC5 de E. Grandis Medio de precultivo Núm . de Núm. de % de Núm. de Núm. prom. (medio de reg . de Euc . explantes GUS+ GUS+ focos de focos/ex- + PGR en mg/1 ) GUS plantes respondientes . 0 de zeatina/0 . 1 de 25 0 0 0 0 NAA (medio de control de la regeneración) .0 de zeatina/0.1 de 25 3 12 4 1.3 NAA + AS 250 µM 5.0 de zeatina/0.1 de 26 9 35 23 2.6 NAA + AS 750 µM 5.0 de zeatina/0.25 de 26 14 54 51 3.6 2,4-D Los resultados indican que la AS sola en el medio de precultivo estimula la infección. Además, la tinción de la GUS indica que la AS aumenta la infección de las células lesionadas a lo largo de los bordes cortados, donde normalmente surgen las plantas transgénicas .

EJEMPLO 14 - LA COMBINACIÓN DEL INDUCTOR DE AGROBACTERIÜM Y EL REGULADOR DEL CRECIMIENTO MEJORA LA VELOCIDAD DE INFECCIÓN Este ejemplo indica que la combinación de AS y auxinas en la fase de precultivo podría lograr que el aumento en la velocidad de infección sea aún mayor. En los siguientes ejemplos, los explantes de los clones FC1-5 de E. granáis y el clon IPB1 de E. granáis x urophylla se cultivaron en un medio de precultivo rico en auxina con o sin AS (250 µM) antes de la infección. Los explantes se precultivaron usando como control el medio de regeneración de Euc. Después del precultivo, los explantes se inocularon con Agrobacterium, como se describió en el Ejemplo 5.

Cuadro 11. Efecto de la combinación de auxina con el inductor de Agrobacterium en la infección del clon IPBl de (a) E. grandis x urophylla Medio de precultivo Núm. de Núm. de % de Núm. de Núm. prom. (medio de reg. de Euc. + explantes GUS+% GUS+ focos de PGR en mg/1) GUS focos/explantes respondientes .0 de zeatina/0.1 de NAA 50 11 22 37 3.4 (medio de control de la regeneración) 5.0 de zeatina/0.25 de 50 36 72 388 10.8 2,4-D 5.0 de zeatina/0.25 de 50 42 84 754 18.0 2,4-D + AS 5.0 de zeatina/2 de IAA 49 36 73 289 8.0 .0 de zeatina/2 de IAA + 49 47 96 855 18.2 AS (b) clon FCl de E. grandis Medio de precultivo Núm. de Núm. de % de Núm. de Nú . prom. (medio de reg. de Euc. + explantes GUS+ GUS+ focos de PGR en mg/1) GUS focos/explantes respondientes .0 de zeatina/0.1 de NAA 25 7 28 17 2.4 (medio de control de la regeneración) 5.0 de zeatina/0.25 de 25 11 44 65 5.9 2,4-D 5.0 de zeatina/0.25 de 25 17 68 106 6.2 2,4-D + AS 5.0 de zeatina/2 de IAA 24 15 63 76 5.1 .0 de zeatina/2 de IAA + 25 24 96 272 11.3 AS (c) clon FC3 de E. Grandis Medio de precultivo Núm. de Núm. de % de Núm. de Núm. prom. (medio de reg. de Euc. + explantes GUS+ GUS+ focos de PGR en mg/1) GUS focos/explantes respondientes .0 de zeatina/0.1 de NAA 25 0 0 0 0 (medio de control de la regeneración) 5.0 de zeatina/0.25 de 25 17 68 97 5.7 2,4-D 5.0 de zeatina/0.25 de 25 17 68 77 4.5 2,4-D + AS 5.0 de zeatina/2 de IAA 24 7 28 11 1.6 .0 de zeatina/2 de IAA + 25 14 56 66 4.7 AS (d) clon FC4 de E. grandis Medio de precultivo Núm. de Núm. de % de Núm. de Núm. prom. (medio de reg. de Euc. + explantes GUS+ GUS+ focos de PGR en mg/1) GUS focos/explantes respondientes .0 de zeatina/0.1 de NAA 51 7 14 33 4.7 (medio de control de la regeneración) 5.0 de zeatina/0.25 de 50 13 26 26 2.0 2,4-D 5.0 de zeatina/0.25 de 50 22 44 111 5.0 2,4-D + AS 5.0 de zeatina/2 de IAA 51 6 12 23 3.8 .0 de zeatina/2 de IAA + 50 24 48 173 7.2 AS (e) clon FC5 de E. Grandis Medio de precultivo Núm. de Núm. de % de Núm. de Núm. prom. (medio de reg. de Euc. + explantes GUS+ GUS+ focos de PGR en mg/1) GUS focos/explantes respondientes .0 de zeatina/0.1 de NAA 26 4 15 10 2.5 (medio de control de la regeneración) 5.0 de zeatina/0.25 de 25 17 68 113 6.6 2,4-D 5.0 de zeatina/0.25 de 26 21 81 135 6.4 2,4-D + AS 5.0 de zeatina/2 de IAA 25 9 36 30 3.3 .0 de zeatina/2 de IAA + 26 21 81 100 4.8 AS (f) clon FC12 de E. grandis x saligna Medio de precultivo Núm. de Núm. de % de Núm. de Núm. prom. (medio de reg. de Euc. + explantes GUS+ GUS+ focos de focos/ PGR en mg/1) GUS explantes respondientes .0 de zeatina/0.25 de 25.0 14 0 56.0 86.0 6.1 2,4-D 5.0 de zeatina/0.25 de 25.0 21 0 84.0 297.0 14.1 2,4-D + AS 5.0 de zeatina/2 de IAA 25.0 18 0 72.0 195.0 10.8 .0 de zeatina/2 de IAA + 25.0 23 0 92.0 363.0 15.8 AS Estos resultados muestran un efecto benéfico congruente sobre la infección en una gama de clones mediante gracias al uso tanto de AS como de la estimulación con auxina en el medio de precultivo. Los clones tienen un aumento tanto en la frecuencia de infección como en el número promedio de focos de GUS por planta respondiente. Además, la infección de las células lesionadas a lo largo del borde de recorte aumenta en forma significativa.

EJEMPLO 15 Este ejemplo muestra que la combinación de AS y auxinas en la fase de cocultivo aumenta adicionalmente la velocidad de infección. Los explantes foliares del clon comercial DUN00003 de E. áunnii se precultivaron en un medio de regeneración que contenía sólo 750 µM de AS o la combinación de 250 µM de AS y una elevada concentración de auxina (2 mg/1 de IAA vs . 0.1 mg/1 de NAA) . Los explantes se infectaron con la cepa GV2260 de Agrobacterium que contenía el pWVR31, que contenía un gen de GUS (impulsada por un promotor constitutivo) y un gen NPTII (impulsado por un promotor constitutivo diferente) . En este ejemplo, los explantes se inocularon directamente con Agrobacterium (sin precultivo) y se les evaluó la expresión de GUS después de 4 días de cocultivo.

Cuadro 12. Explantes de hoja del clon DUN00003 de E. dunnii EJEMPLO 16 Este ejemplo muestra que la combinación de AS y auxinas en las fases de precultivo y de cocultivo podría aumentar adicionalmente la velocidad de infección. Los explantes foliares del clon comercial DUN00003 de E. áunnii se precultivaron en cualquier medio de regeneración con la combinación de AS 250 µM y una elevada cantidad de auxina (2 mg/1 de IAA vs . 0.1 mg/1 de NAA en el medio de regeneración) . Los explantes se precultivaron durante 4 días y después se infectaron con la cepa GV2260 de Agrobacterium que contenía el pARBIOOl, que contiene el gen GUS (impulsado por un promotor constitutivo) y el gen NPTII (impulsado por un promotor constitutivo diferente) . En cincuenta explantes se evaluó la expresión transitoria de GUS después de 4 días de precultivo y 3 días de cocultivo. Del medio de regeneración suplido con 30 mg/1 de Geneticina y 400 mg/1 de Timentin se seleccionaron doscientos explantes . A los tres meses de la selección en el medio de regeneración, los explantes con callo que sobrevivieron la selección se tiñeron para la expresión de la GUS.

Cuadro 13. ?xplantes de hoja del clon DUN00003 de E. dunnii EJEMPLO 17 Este ejemplo compara dos combinaciones de AS y auxinas en las fases de precultivo y cocultivo. Los explantes foliares del clon comercial DUNOOOOl de E. áunnii se cultivaron ya sea en el medio de regeneración con la combinación de AS 250 µM y una elevada cantidad de auxina (ya sea IAA a 2 mg/1 de IAA o 2,4-D a 0.25 mg/1) o en el medio de regeneración con 0.1 mg/1 de NAA. Los explantes se precultivaron durante 4 días y después se infectaron con la cepa GV2260 de Agrobacterium que contenía el pARBIOOl, como se describió en el Ejemplo 16. En cincuenta explantes de cada tratamiento se evaluó la expresión transitoria de GUS después de 4 días de precultivo y 3 días de cocultivo.

Cuadro 14. Explantes de hoja del clon DUNOOOOl de E. dunnii EJEMPLO 18 Este ejemplo compara la infección de cualquier explante foliar o internodal con dos cepas de Agrobacterium, GV2260 y EHA105 Los medios de precultivo y cocultivo son el medio de regeneración con la combinación de AS (250 µM) y una elevada cantidad de auxina, como IAA, a 2 mg/1 de IAA (vs. 0.1 mg/1 de NAA en un medio de regeneración normal) . Los explantes foliares y 5 mm de internodos se cosecharon de cultivos madre del clon comercial DUN00003 de E. ?unnii y se cultivaron en el medio de precultivo, como se describió en el Ejemplo 4. Los explantes se precultivaron durante 4 días y después se infectaron con alguna de las cepas GV2260 o EHA105 de Agrobacterium que contenían el pARBIOOl. En cincuenta explantes de cada tratamiento se evaluó la expresión transitoria de GUS después de 4 días de precultivo y 3 días de cocultivo , Cuadro 15 . Explantes de hoja del clon DUN00003 de E. dunnii Tipo de explante/cepa de Núm. de Núm. % de Núm. de Núm. prom.

Agrro a c ter i um explantes de GUS+ focos de focos/ GUS+ GUS explantes respondientes Internodos/ERA 40 27 67.5 239 8.9 Internodos/GV2260 50 46 92 378 8.2 Internodos/EHA 50 34 68 342 10.0 Internodos/GV2260 50 34 68 264 7.8 EJEMPLO 19 - TRANSFORMACIÓN DEL EUCALYPTUS OCCIDENTALIS DE FLORACIÓN TEMPRANO Este ejemplo detalla la infección y transformación de tres clones de Eucalyptus occi?entalis de floración temprana, E066, E0129 y EO208, por medio del método de transformación de la invención. Los explantes foliares se cosecharon y precultivaron durante 4 días, enseguida, los explantes se infectaron con la cepa GV2260 de Agrobacterium que alberga el p35SGÜSINT (35S : :GUSINT, NOS::NPTII). Para el E066, la cepa de Agrobacterium fue la GV2260 que albergaba el p35SGUSINT (35S : :GUSINT, NOS::NPTII). Para los clones E0129 y EO208, la cepa de Agrobacterium fue la misma GV2260, pero el constructo fue el pWVK192 (el promotor de la 4CoA ligasa de pino que impulsa el gen GUS con un intrón -4CL:: GUSINT, constitutivo : :NPTII) . Los explantes se precultivaron en el medio de regeneración, con la modificación de que el NHH2PO_ se aumentó a 0.5 g/l en vez de 0.25 g/l. El medio contenía AS 750 µM y no contenía una elevada concentración de auxina. Los datos de expresión transitoria de la GUS se recopilaron después de los pasos de precultivo y cocultivo. Para el E066, los datos de expresión transitoria de la GUS se recopilaron después de los pasos de precultivo y cocultivo. Para los clones E0129 y EO208 no hubo recolección de datos de la expresión transitoria de la GUS. 144, 400 y 200 explantes de los clones E066, E0129 y EO208, respectivamente, se transplantaron a un medio de selección como el medio de regeneración normal con 30 mg/1 de Geneticina. Seis meses después, los brotes regenerados se tiñeron para la expresión de la GUS, los resultados se muestran en el Cuadro 16.

Cuadro 16 . Transformación del clon E066 de E. occidentalis de floración temprana Clon Medio de Núm. de Núm. % de Núm. de Núm. Líneas Velocidad pretratamien explantes de GUS+ focos total de de de to (medio de GUS+ GUS exbrotes transforreg. de Euc) plantes GUS+ mación iniciales (%) E066 Con AS 250 20 17 85 130 144 2 1.4 µM + 0.25 mg/1 de NH4H2P04 E0129 Con AS 250 ND ND ND ND 400 29 7.3 µM + 0.25 mg/1 de NH4H2P04 E0208 Con AS 250 ND ND ND ND 200 17 8.5 µM + 0.25 mg/1 de NH4H2PO4 EJEMPLO 20 - TRANSFORMACIÓN DE CLONES DE ÉLITE DE VARIAS ESPECIES DE EUCALYPTUS Este ejemplo presenta la transformación de clones de élite. Los explantes de los clones de élite se prepararon como se describió en el Ejemplo 4 y se precultivaron en un medio que contenía auxina y el inductor de Agrobacterium . Los explantes se transformaron con Agrobacterium y se cocultivaron como se describió en el Ejemplo 5. Después del cocultivo y la selección de transformantes, los explantes transformados se transfirieron a un medio de regeneración, tal como se detalló en el Ejemplo 6. Después de confirmar la expresión de la GUS, los brotes se cosecharon y transfirieron a un medio para el crecimiento de raíces . El crecimiento de las raíces se realiza en el medio BTM-1 suplido con 5 g/l de carbón activado Nuchar de MeadWestvaco y el crecimiento de las raíces ocurre, por lo regular, después de 2-4 semanas. Una vez que el sistema de raíces se ha desarrollado, el transformante se transfiere al suelo.

Cuadro 17 EJEMPLO 21 - RT-PCR PARA EVALUAR LA EXPRESIÓN DEL GEN DE TOLERANCIA A HERBICIDAS Este ejemplo muestra la presencia y expresión de un gen de tolerancia a herbicidas en una muestra de líneas transgénicas. Como se describió en el Ejemplo 8, el ARN se aisló de los tejidos de hojas y tallo de cada línea transgénica putativa. En particular, el ARN se aisló de las líneas transformadas de E. granáis, E. granáis x urophylla y E. camal?ulensis . En forma adicional, el ARN se aisló de plantas de tipo silvestre de E. granáis, E. granáis x urophylla y E. camal?ulensis . Para cada línea, se usó una muestra de ARN de 5 µl para la RT-PCR que evalúa la presencia y expresión de un gen para la tolerancia a herbicidas. La RT-PCR se realizó con el kit para RT-PCR "Listo para usar" (Pharmacia) , de conformidad con las instrucciones del fabricante. En pocas palabras, cada preparación de ARN de 5 µl se añadió a reacciones separadas de RT-PCR que contenían oligo (dT)n y cebadores del gen resistente a herbicidas. Después de la RT-PCR, los productos de la amplificación se visualizaron en un gel de agarosa teñido con bromuro de etidio. La electroforesis en gel de agarosa de los productos de la RT-PCR reveló que todas las líneas de Eucalyptus transgénico probadas expresan el gen de tolerancia a herbicidas. Específicamente, las diez líneas de E. granáis en las que se analizó la presencia del gen de tolerancia a herbicidas, sí expresaron este gen, en tanto que las plantas de E . granáis de tipo silvestre no lo expresaron. Adicionalmente, sí lo expresaron las ocho líneas de E. granáis x urophylla , en tanto que las plantas de control no expresaron la ALS. En cuatro líneas transgénicas de E. camal?ulensis se evaluó la expresión de ALS, las cuatro líneas expresaron la ALS. En ninguna de las plantas de control se detectó la expresión del gen de tolerancia a herbicidas.

EJEMPLO 22 Este ejemplo demuestra la adaptabilidad de la presente metodología de transformación a un marcador seleccionable diferente, el gen de neomicina fosfotransferasa (NPTII), que confiere resistencia a los antibióticos aminoglicósidos neomicina, kanamicina o Geneticina (G418). Los explantes foliares del clon comercial IPB1 de E. granáis x urophylla se infectaron con la cepa GV2260 de Agrobacterium que albergaba el pWVC33, que contenía el gen GUS (impulsado por un promotor constitutivo) y el gen NPTII (impulsado por un promotor constitutivo diferente) . Antes de la transformación, los explantes se precultivaron durante 4 días en un medio enriquecido con auxina (IAA a 2 mg/1 en vez de 0.1 mg/1 de NAA en un medio de regeneración estándar) y acetosiringona (250 µM) . Como se describió en el Ejemplo 6, los explantes se infectaron con Agrobacterium, se cocultivaron en el mismo medio durante 3 días y después se transfirieron a un medio de regeneración suplido con 400 mg/1 de Timentin por un periodo de 4 días. Posteriormente, los explantes se transfirieron a un medio de selección que contenía Geneticina en lugar de una agente de selección herbicida. Los transformantes se colocaron en el medio de selección de Geneticina que contenía la Geneticina (ya sean 20 o 30 mg/1) . En vez de los ciclos de transferencia de 3 o 4 semanas utilizados con un medio de selección herbicida, los explantes se transfirieron dos veces a la semana a un nuevo medio de Geneticina. Después de aproximadamente 10 semanas de crecimiento en el medio de selección de Geneticina, se recolectaron muestras de callos resistentes a la Geneticina y se tiñeron con x-gluc para la expresión de GUS, como se describió en el Ejemplo 7. Los datos siguientes resumen la expresión de GUS en los transformantes seleccionados en Geneticina.

Cuadro 18. Transformación del clon IPB1 de Eucalyptus grandis x urophylla con marcador seleccionable antibiótico (NPTII) Concentración de Condiciones de Núm. de Núm. de Núm. de callos Geneticina iluminación de explantes callos GUS+ (mg/1) los cultivos teñidos 20 Resguardado 162 5 0 normal de la luz 30 Resguardado 162 17 13 normal de la luz 30 Oscuridad 162 6 4 EJEMPLO 23 Este ejemplo demuestra que los explantes de Eucalyptus pueden transformarse con la cepa GV2260 de Agrobacterium que alberga el p35SGUSINT (35S:: GUSINT, NOS::NPTII) . En forma semejante a los métodos expuestos en el Ejemplo 16, el clon C9 de E. camaláulensis se transformó con la GV2260 que alberga el p35SGUSINT. Después de la regeneración, los explantes se transfirieron a un medio de selección que contenía Geneticina (30, 40, 50 o 60 mg/1 de Geneticina) . Para los niveles de Geneticina de 30 y 50 mg/1, se precultivaron por 1 día conjuntos adicionales de explantes. Después de 8 semanas en el medio de selección, se recolectaron las muestras de cultivos de brotes resistentes a la Geneticina en la etapa de desarrollo temprano y se tiñeron con x-gluc para la expresión de la GUS. Los datos de la expresión de la GUS se resumen en el cuadro siguiente.

Cuadro 19. Transformación del clon C9 de E. camaldulensis con un marcador seleccionable antibiótico (NPTII) Concentración de Duración del Núm. de Núm. de Núm. de % de Geneticina (mg/1) precultivo explantes líneas de líneas de brotes (días) brotes brotes GUS+ teñidas GUS+ 30 4 181 39 5 12.8 40 4 176 68 8 11.8 50 4 178 31 7 19.4 60 4 182 8 4 50 30 1 180 29 11 37.9 50 1 181 12 6 50 Las líneas de brotes de GUS positivos se produjeron en forma congruente en todos los tratamientos.

Mayores concentraciones de Geneticina y tiempos más cortos de precultivo produjeron líneas transgénicas con un limitado número de líneas asilvestradas .

EJEMPLO 24 Este ejemplo demuestra que un clon comercial de E. granáis pueden transformarse con la cepa GV2260 de Agrobacterium que alberga otro constructo de pWVR8 (Arabi?opsis Actinll: :GUSINT, constitutivo : : NPTII) . Como se describió en el Ejemplo 4, los explantes foliares del clon IP1 de E. grandis se precultivaron en un medio de precultivo que contenía auxina y un inductor de Agrobacterium . Los explantes se transformaron con Agrobacterium y se cocultivaron durante 3 días en un medio de precultivo enriquecido con auxina (IAA a 2 mg/1 en vez de 0.1 mg/1 de NAA en un medio de regeneración estándar) y acetosiringona (250 µM) . Enseguida, los explantes se transfirieron al medio de regeneración de Euc suplido con 400 mg/1 de Timentin por un periodo de 4 días. Los explantes se transfirieron entonces a un medio de selección que contenía Geneticina (30 o 40 mg/1 de Geneticina) . Después de 8 semanas en el medio de selección, se recolectaron las muestras de cultivos de brotes resistentes a la Geneticina en la etapa de desarrollo temprano y se tiñeron con x-gluc para la expresión de la GUS. Los datos de expresión de la GUS se resumen en el cuadro 20.

Cuadro 20. Transformación del clon IP1 de E. camaldulensis con un marcador seleccionable antibiótico (NPTII) Origen del Concentració Núm. de Núm. de Núm. de % de explante n de explantes líneas de líneas de brotes Geneticina brotes brotes GUS+ GUS+ (mg/1) teñidas Grupo de 30 198 16 8 50 brotes Plantas con 30 198 1 0 0 raíz Grupo de 40 198 7 4 57 brotes EJEMPLO 25 Con base en los datos de los ejemplos anteriores, los clones élite de Eucalyptus pueden transformarse con un ADN ajeno utilizando el método descrito. Por ejemplo, los clones élite de Eucalyptus pueden transformarse con un gen que codifica para una enzima implicada en la síntesis de celulosa, tal como la celulosa sintasa. La celulosa sintasa liga la UDP-glucosa y transfiere el azúcar al extremo no reductor de la cadena incipiente de glucano. Usando los métodos de la presente invención, el dominio de unión de UDP-glucosa puede sobreexpresarse en una planta transgénica. La transformación de clones élite de Eucalyptus con una secuencia de dominio de unión de UDP-glucosa en sentido, funcionalmente ligada a un promotor constitutivo confiere un fenotipo de mejor crecimiento, como lo atestiguan los aumentos en la síntesis de celulosa, la densidad de la madera y la resistencia a la tensión. Los explantes foliares se cosechan de plantas de Eucalyptus de reserva y los explantes se cultivan en un medio de precultivo. El medio de precultivo contiene auxina, citoquinina y un inductor de Agrobacterium, tal como la acetosiringona, para estimular la división celular a lo largo de los bordes cortados del explante de tejido. Después de cuatro días de precultivo, los explantes se inocularon con la cepa GV2260 de Agrobacterium que contenía un plásmido que portaba una porción de la región que codifica para GS funcionalmente ligada al promotor constitutivo. Los explantes se cocultivaron durante 3 días antes de transferirlos al medio de regeneración de Euc. Los explantes se cultivaron en el medio de regeneración de Euc por 4 días antes de transferirlos al medio de selección que contiene un herbicida. Después de la selección de los transformantes resistentes a herbicidas, se evaluó la expresión de la GUS en los mismos. Después de confirmar la expresión de la GUS, los brotes se cosecharon y transfirieron a un medio para el crecimiento de raíces . El medio para el crecimiento de raíces contiene sales de BTM-1 suplidos con 5 g/l de carbón activado, el desarrollo de las raíces se realiza después de 2-4 semanas. Después del desarrollo del sistema primario de raíces, las plantas transformadas se transfieren al suelo.

EJEMPLO 26. EVALUACIÓN DE ALS/SULFONILUREA EN LA SELECCIÓN DE PLANTAS TRANSGÉNICAS Este ejemplo describe la selección de un pino genéticamente transformado, utilizando un marcador seleccionable que codifica para la ALS en un medio de selección que contiene un herbicida de sulfonilurea, en un nivel suficiente para la selección en plantas modelo. En algunos experimentos, incluido el descrito en el ejemplo siguiente, un vector que expresaría al gen ais en el tejido de la planta fue cobombardeado en las células con un vector que expresaría el gen nptll en el tejido de la planta y las células cobombardeadas se dividieron entonces en dos grupos y se colocaron en el medio de selección que contenía ya sea un herbicida de sulfonilurea o Geneticina, de modo que la frecuencia con la que se seleccionan los transformantes en la Geneticina podría compararse con la frecuencia de selección en herbicida. Las líneas de células embriogénicas de pino del incienso ( Pinus taeda ) y del pino híbrido ( P. tae?a x P. rigi?a) se iniciaron a partir de embriones cigóticos de megagametofitos inmaduros individuales utilizando los procedimientos descritos en la patente de EE.UU. Núm. 5,506,136. Los conos con semillas inmaduras se recolectaron de huertos de cultivo cerca de Charleston, Carolina del Sur cuando el embrión cigótico dominante está en la etapa de desarrollo precotiledonar . Mediante el uso del sistema de clasificación de von Arnold y Hakman ( J. Plant Phys . , 132:164-169 (1988)), se dice que el embrión cigótico dominante de esta etapa está en la etapa 2; es decir, es un embrión con una prominente región embrionaria de superficie lisa y brillante, subtendida por las células suspensorias alargadas que están muy vacuoladas. Sin embargo, para iniciar los cultivos embriogénicos también pueden utilizarse embriones cigóticos en una etapa temprana de desarrollo (etapa 1) . Para iniciar el cultivo, las semillas intactas retiradas de conos o pinas de semillas se sometieron a esterilización superficial con una solución blanqueadora comercial al 10-20% (equivalente a 0.525% a 1.050% de solución de hipoclorito de sodio) durante 15 minutos, seguida de tres enjuagues con agua esterilizada (cada uno con una duración de cinco minutos) . Del recubrimiento de la semilla y las membranas nucleares se retiró entonces el megagametofito intacto (que contiene los embriones cigóticos en desarrollo) y se colocó en el medio de inicio DCRi o WV5X.

Las mezclas salinas básales eficaces para iniciar el cultivo embriogénico del pino incluyen, aunque no se limitan a, las formulaciones de sales básales DCR o WV5 enumeradas en el Cuadro 21. Las formulaciones completas de los medios utilizados para el inicio, manutención y crecimiento proliferativo de cultivos embriogénicos de pino en éste y en posteriores ejemplos se enumeran en el Cuadro 22. El pH del medio se ajustó en 5.8 con KOH y HCl antes de procesarse en autoclave a 110 kPa (16 psi) y 121°C por 20 minutos . Los que tienen experiencia en el cultivo de tejidos de plantas reconocerán que en el presente método se pueden utilizar muchas otras condiciones de esterilización.

Cuadro 21 Formulaciones básales de medios de cultivos para la embriogénesis de pino a De conformidad con Coke (1996) . b De conformidad con Gupta y Durzan (1985) . c De conformidad con Becwar y col. (1990) . d Añadida, en forma de solución madre acuosa esterilizada por filtrado, al medio tratado en autoclave mientras éste aún estaba caliente (aproximadamente a 60°C).

Cuadro 22 Medios de inicio, conservación y proliferación para la embriogénesis de pino a Consultar en el Cuadro 19 la composición del medio basal. b En algunos de los siguientes ejemplos, las mezclas de aminoácidos definidas son sustituidas por hidrolisato de caseína. c GELRITE® (goma gelana fabricada por Merck, Inc.). d Ácido 2, 4-diclorofenoxiacético (2,4-D) o ácido naftalenacético (NAA) . e N6-bencilaminopurina (BAP) o N6-benciladenina (BA) . f Para todos los medios gelificados, en cada caja petri de plástico esterilizado de 100 x 15 mm se vertieron aproximadamente 10, 15 o 20 ml del medio y el medio se refrigeró o almacenó a temperatura ambiente hasta su uso.

En ninguno de los medios líquidos de cultivo se añadió agente gelificante y el medio se almacenó en lotes de 500 ml en refrigeración o congelación antes de usarlos.

El perímetro de cada caja petri se selló con dos capas de la película NESCOFILM® (distribuido en el comercio por Karlan Company) . Las cajas se incubaron en la oscuridad a una temperatura constante de 23°C ± 2°C. Después de aproximadamente 7-21 días, el tejido embriogénico se extrudió del micrópilo de los explantes de megagametofito.

A las seis semanas, después de la colocación del explante en el medio de inicio, las masas de tejido que se extrudieron y proliferaron de los explantes individuales se aislaron en cajas petri individuales en el medio de conservación DCR2 o WV52. A las individuales se les asignaron números de línea. Después de uno a tres meses de cultivo en el medio de conservación, los cultivos de tejido se sometieron a criopreservación. Específicamente, las células se añadieron a un volumen igual del medio líguido DCR que contiene sorbitol, para una concentración final de sorbitol de 0.2-0.4M. A la suspensión en hielo se añadieron alícuotas del crioprotector dimetilsulfóxido (DMSO) para llevar la concentración final de DMSO a 10%. Alícuotas de un mililitro de la suspensión de celular que contiene el DMSO se transfirieron a los viales de congelación, se colocaron en un congelador programable y se enfriaron a -35°C a una velocidad de 0.33°C por minuto. Los viales de congelación se sumergieron posteriormente en nitrógeno líquido en el interior de un recipiente de almacenamiento criobiológico para el almacenamiento de largo plazo. Los que tienen experiencia en la técnica del cultivo de tejido de plantas reconocerán que al presente método se le podrían aplicar otros protocolos de criopreservación. Los cultivos congelados se recuperaron para usarlos en los experimentos retirando los viales individuales del recipiente de almacenamiento criobiológico y colocando los viales en agua a 42° ± 2°C para descongelar rápidamente las suspensiones de células congeladas. Las suspensiones de células descongeladas se vaciaron asépticamente del criovial en un soporte esterilizado de membrana de poliéster (cortado de un perno de tela de poliéster distribuido en el comercio por Sefar, número de catálogo PeCap® Catalog No. 7-35/11), se colocaron en un papel filtro esterilizado (Whatman no. 2, Whatman International Ltd.) por unos cuantos minutos para permitir que la solución del DMSO crioprotector para difundirse del tejido embriogénico hacia el papel. El tejido embriogénico en la membrana de soporte de poliéster se transfirió entonces al medio de manutención DCR2 y se incubó a 23°C en la oscuridad durante 24 horas para permitir que el DMSO se difunda adicionalmente desde el tejido hacia el medio. El soporte de poliéster que porta el tejido embriogénico se retiró entonces del medio y se transfirió a un nuevo medio DCR2 de conservación, después de lo cual, cada 14-21 días se transfirió a una nueva placa hasta que la cantidad de células por placa llega aproximadamente a 1 g. El entorno de cultivo durante la recuperación postcriopreservación y el crecimiento era de 23 °C ± 2°C y de oscuridad. Los que tienen experiencia en la técnica reconocerán que con este método se pueden usar muchos procedimientos diferentes de criopreservación y recuperación y que el detalle en este ejemplo no puede interpretarse como limitante de la aplicación del método. Para el experimento se utilizaron tres líneas embriogénicas, provenientes de tres familias diferentes (dos familias de pino de incienso genéticamente diversas y una familia de un híbrido de pino de incienso x de pino de resina) . Los cultivos de suspensión uniformes de cada una de las líneas de cultivo de tejidos genéticamente diferentes se establecieron inoculando un matraz Nephelo con brazo lateral de 250 ml (Kontes Chemistry y Life Sciences Products) con 1 g de tejido de cada uno en 20 ml del medio líguido DCR4. Los matraces que contenían las células en el medio líquido se colocaron en un agitador giratorio a 100 rpm en un cuarto de cultivo oscuro a una temperatura de 23°C ± 2°C. Una semana después, el líquido de cada matraz se llevó a 35 ml vaciando en el matraz de cultivo 15 ml de medio nuevo y agitándolo con vortex para distribuir las células de manera uniforme. El crecimiento celular se midió en el brazo lateral al decantar las células y el medio en la porción del brazo lateral de los matraces, permitiendo que las células se asentaran durante 30 minutos y midiendo después el volumen de células asentadas o SCV, por "settled cell volume" . Cuando el SCV es mayor o igual que la mitad del SCV máximo (50% del volumen del matraz ocupado por las células de la planta) , cada cultivo se transfiere a un matraz de brazo lateral de 500 ml que contiene un total de 80 ml de células y medio y el cultivo transferido se mantiene a las mismas condiciones . Veinte réplicas idénticas de las células de la suspensión de cada una de estas tres líneas de pino se prepararon para la transferencia génica, de conformidad con el método descrito en la patente de EE.UU. Núm. 6,518,485. Los soportes de membrana de poliéster de peso definido se esterilizaron en autoclave y se colocaron en embudos Buchner esterilizados y separados, y encima de cada soporte se gotearon, con una pipeta, aproximadamente 1.5 ml de la suspensión uniforme embriogénica de pino de 30 SCV, de tal modo que el tejido embriogénico estuviese uniformemente distribuido en la superficie de éste. A continuación, el medio líquido se succionó de los tejidos utilizando un vacío moderado y cada soporte que porta el tejido embriogénico se colocó sobre un medio de preparación de DCR3 de Gelrite® solidificado (Cuadro 20) en cajas petri de plástico de 100 x 25 mm, las cuales se incubaron en una cámara de crecimiento a oscuras a 23 °C ± 2°C por aproximadamente 24 horas. El ADN se transfirió entonces a tejidos y/o embriones por medio de la tecnología de bombardeo de partículas portadoras (microproyectiles) , usando el sistema de suministro de partículas PDS-1000/He BIOLISTICS® Partióle Delivery System (distribuido por BioRad Laboratories) . Los ADN de interés, aquí, cantidades equimolares de los vectores que contienen, respectivamente, el gen marcador visual uiáA y el potencial marcador seleccionable ais y el marcador seleccionable nptll, se precipitaron en la superficie de micropartículas de oro. Las cajas petri que contenían el soporte de tela y los tejidos embrionarios se colocaron entonces en el interior del aparato PDS 1000/He BIOLISTICS® y se le aplicó un vacío del orden de 28 pulgadas de Hg. Las partículas de oro que portaban 1 µg de ADN se aceleraron hacia cada placa de tejido embriogénico después de la acumulación de helio y el estallamiento regulado por un disco de ruptura de 1550 psi. En el aparato PDS-1000/He BIOLISTICS®, la separación entre el disco de ruptura y el macroportador (distancia de la separación) era de 5 mm y la distancia de viaje del macroportador era de 13 mm. Después de la transferencia de ADN, las cajas petri que contenían el soporte de tela y los tejidos se incubaron en una cámara de crecimiento a oscuras y a 23 °C ± 2°C durante aproximadamente 24 horas. Los tejidos y el soporte de tela se transfirieron entonces a un medio de manutención semisólido, DCRi (Cuadro 20) , para la recuperación del bombardeo de partículas portadoras e incubarlos en una cámara de crecimiento a oscuras a 23 °C ± 2°C durante un periodo de 5 días. En este punto se sacrificó una placa por línea celular para la tinción de GUS (un gen uidA insertado, que codifica para una enzima ß~ glucuronidasa que se expresa en células de cultivo de tejido, se detectó al teñir de azul marino las células de cada una de las líneas transgénicas después de la exposición a una sustrato enzimático de glucuronidasa colorigénica, "X-gluc", distribuida comercialmente por Inalco, de conformidad con las técnicas bien conocidas en el campo de la transformación de plantas) y el análisis al microscopio demuestra que la división celular se ha reanudado y que la expresión transitoria del transgen uidA muestra la frecuencia normal de estos bombardeos . El resto de los tejidos se transfirió entonces en su soporte de tela a un medio de selección, medio de conservación semisólido DCRi que contiene un nivel del agente de selección inhibidor del crecimiento de células no transformadas. En este ejemplo, la mitad de las réplicas se colocaron en un medio de selección gue contiene Geneticina (distribuida en el comercio por Gibco/BRL) a 15 mg/1 y la otra mitad se colocó en un medio de selección que contiene Oust® 50 nM (distribuido en el comercio por DuPont™) . Las placas se incubaron en una cámara de crecimiento a oscuras a 23°C ± 2°C y los soportes de tela que portan los tejidos eran transferidos, cada 3 semanas, al nuevo medio de cultivo de la misma composición El crecimiento activo en el medio de selección se presenta en varios sectores aislados de muchas de las cajas petri. Este crecimiento activo en presencia del agente de selección es, por lo general, una indicación de que los tejidos en crecimiento han integrado el gen de selección en sus cromosomas y se transforman en forma estable. Estas áreas de crecimiento activo se tratan como sucesos de transformación independientes y, en lo sucesivo, se denominan sublíneas transgénicas putativas. El tejido embriogénico supuestamente transgénico se multiplicó al transferir los sectores transgénicos en crecimiento al nuevo medio de conservación semisólido DCR2 suplido con el respectivo agente de selección. Cualquier tejido embriogénico supuestamente transgénico y en crecimiento activo se transfirió a un nuevo medio de selección de conservación semisólido en intervalos de 3 semanas por un periodo de aproximadamente seis a doce semanas, dependiendo de la velocidad de crecimiento de las sublíneas individuales del tejido embriogénico transgénico. La transformación estable se verificó en el 100% de las 12 sublíneas transgénicas putativas probadas, seleccionadas en Geneticina, mediante la combinación del crecimiento en el medio de selección, el ensayo de la expresión del gen marcador visual y la amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de segmentos específicos de la secuencia de ADN transgénica. Estas técnicas se realizaron utilizando técnicas bien conocidas por los que tienen experiencia en el campo de la biología molecular. Ochenta por ciento de las sublíneas transgénicas putativas que se probaron y seleccionaron en Oust eran falsos positivos.

EJEMPLO 27. EVALUACIÓN DEL HIDROLISATO DE CASEÍNA SOBRE LA SELECTIVIDAD DE LA SULFONILUREA Se evaluaron seis líneas embriogénicas, de las cuales, había dos líneas de tres familias diferentes (dos familias de pino de incienso genéticamente diversas y una familia de un híbrido de pino de incienso x de pino de resina) . Se establecieron los cultivos en suspensión uniforme de cada una de las líneas de cultivo de tejidos genéticamente diferentes, tal como se describió en el Ejemplo 26. Tres réplicas idénticas de las células de la suspensión de cada una de estas seis líneas se aplicaron en placa, como se describió en el Ejemplo 26, sobre cada una de las diez formulaciones del medio DCR2, a saber, con y sin hidrolisato de caseína, y contenían el herbicida Oust (0, 10, 20, 40 y 80 nM) . Las placas se sellaron e incubaron a las mismas condiciones utilizadas para los pasos preexperimentales de inicio, manutención y selección del Ejemplo 26. Cada tres semanas, el cultivo se transfería a un medio nuevo de la misma formulación que la previamente suministrada, después de pesar, en condiciones de esterilidad, el tejido en el soporte de poliéster. El crecimiento de cada una de las seis líneas celulares en estos medios, después de un tiempo total de doce semanas, se muestra en la Figura 9. La Figura 9 muestra que el herbicida Oust de sulfonilurea es un agente de selección satisfactorio a varias concentraciones sólo en ausencia de hidrolisato de caseína . No se consigue detener el crecimiento de las células utilizando cualguier concentración del herbicida Oust de sulfonilurea, gue es lo que sería deseable si el herbicida se estuviese utilizando como el agente de selección de las células transgénicas, a menos gue esté ausente el hidrolisato de caseína. El crecimiento se retrasa o detiene en grado significativo en ausencia del hidrolisato de caseína y en forma simultánea a la presencia del Oust, el cual inhibe la biosíntesis de los aminoácidos de cadena ramificada, lo que sugiere que la biosíntesis de aminoácidos de cadena ramificada está activa durante el crecimiento de estas células y que, evidentemente, los aminoácidos de cadena ramificada son esenciales para el crecimiento. Al contrario de la creencia común entre los que tienen experiencia en el campo del cultivo de tejidos de plantas, las células fueron capaces de crecer sin la presencia de hidrolisato de caseína en el medio; no obstante, algunas líneas celulares experimentaron menores niveles de crecimiento. Experimentos adicionales demostraron que al menos una de las líneas había perdido el potencial de producir embriones germinables después de mantenerse en un medio que carecía de caseína que la misma línea mostraba después de mantenerse en un medio que contenía caseína. Del mismo modo, las otras dos líneas mostraron un potencial significativamente menor para producir embriones germinables después de mantenerse en un medio carente de hidrolisato de caseína con respecto al potencial mostrado después de mantenerse en un medio que contenía hidrolisato de caseína. El potencial para producir embriones germinables se determinó de la manera siguiente: Después que las masas celulares, cultivadas con un contenido del herbicida Oust de 0 nM, se dejaron proliferar por doce semanas, se resuspendieron nuevamente en el medio líquido DCR3. Cuando las suspensiones celulares se llevaron a un SCV uniforme (la mitad del máximo) , con pipeta se agregaron cantidades equivalentes de las células del cultivo en suspensión encima de soportes de membrana esterilizados y se colocaron en el medio de desarrollo/maduración MSGi, según se describe en la patente de EE.UU. Núm. 5,506,136, (Cuadro 23) para evaluar la capacidad de los cultivos para desarrollar suficientes embriones (cotiledonares) de etapa 3 de gran calidad. Las cajas se incubaron a oscuras en una cámara de crecimiento a 23 ± 2°C. Los soportes de membrana se transferían cada 3 semanas a nuevas cajas de petri que contenían medio nuevo. En la semana 9, se determinó visualmente la calidad de germinación de los embriones (cotiledonares) de la etapa 3.

Cuadro 23. Medios de desarrollo/maduración y germinación de células embriogénicas de pino a Consultar en el Cuadro 19 la composición del medio basal b GELRITE® (goma gelana fabricada por Merck, Inc.). c Polietilenglicol (con peso molecular de 4000) . d Ácido abscísico.

EJEMPLO 28. EVALUACIÓN DE LA SULFONILUREA UTLIZANDO MEDIOS SIN HIDROLISATO DE CASEÍNA En este ejemplo, cinco líneas celulares del pino de incienso provenientes de cuatro familias de élite se transformaron con plásmidos que contenían el marcador seleccionable ais y la selección se realizó en un medio de selección que contenía sulfonilurea y que se modificó para no incluir el hidrolisato de caseína. Las cinco líneas celulares de pino se iniciaron como se describió en el Ejemplo 26, con la excepción de que una de las cinco líneas era una línea de pino de incienso de cultivo cruzado, cultivada en un semillero de International Paper en Georgia. Las líneas se conservaron por criopreservación, se recuperaron y cultivaron como suspensiones uniformes, como se describió en el Ejemplo 26. Para preparar la transferencia génica, los soportes de membrana de poliéster se esterilizaron en autoclave y se colocaron en embudos Buchner separados y esterilizados, y para cada una de las seis placas replicadas por línea celular, encima de cada soporte se agregaron con pipeta de uno a tres mililitros de la suspensión embriogénica de pino, de modo tal que el tejido embriogénico se distribuya uniformemente. Se succionó el medio líquido de los tejidos y cada soporte portador del tejido embriogénico se colocó sobre el medio de preparación DCR3 gelificado para inocular el Agrobacterium, de conformidad con los métodos descritos en la publicación de patente de EE.UU. núm. 20020100083. Específicamente, los constructos binarios gue contienen el marcador seleccionable ais se introdujeron en Agrobacterium tumefaciens utilizando las técnicas bien conocidas por los que tienen experiencia en la técnica y la virulencia se indujo administrando la acetosiringona mediante las técnicas utilizadas, después de lo cual, el Agrobacterium inducido se entremezcló con el material de la planta. Las células se cocultivaron en la oscuridad a 22° ± 2°C por un periodo de aproximadamente 72 horas. Después del cocultivo, de los cultivos se eliminó el Agrobacterium . Las células se resuspendieron en un nuevo medio de lavado líquido DCR. (Cuadro 20) que contenía 400 mg/1 de TIMENTIN®. La resuspensión se inició al tomar con fórceps cada soporte de membrana portador de las células infectadas y enrollarlo, de modo gue pueda colocarse en el líquido de lavado. El líquido se agitó con suavidad para poner en suspensión a las células y el soporte de membrana se raspó con fórceps esterilizados, en caso de que las células estuvieran adheridas al mismo. Una vez que las células están en suspensión, la membrana se retira.

Después de cada paso de lavado, las células se colocaron en placas sobre nuevas membranas de soporte esterilizadas, del mismo tipo utilizado en el paso anterior, colocando de nuevo las nuevas membranas de soporte esterilizadas en un embudo Buchner esterilizado, agregando con pipeta la suspensión de células de planta encima de las membranas y succionando de los tejidos el medio líquido, utilizando un vacío moderado. Se realizaron lavados adicionales hasta que el medio que drena de las células esté claro. En cada ciclo de lavado sucesivo, las células se resuspenden en un nuevo medio de lavado esterilizado agitando en el líquido la membrana portadora de las células y las células adheridas se retiran raspando suavemente con los fórceps . Las células se vuelven a colocar en placas sobre soportes de membrana nuevos en embudos Buchner. Las líneas, transformadas con Agrobacterium y lavadas como se acaba de describirse, se colocan en placas sobre medio DCR gelificado como se describió en el Ejemplo 26, con excepción de que el medio contenía ABA 10 mM y 400 mg/1 de Timentin®. Este tratamiento de recuperación se continuó durante una semana. Las células portadas en soportes de membrana de poliéster se transfirieron entonces al mismo medio, con la excepción de que éste tampoco contenía hidrolisato de caseína, pero sí Ally® (DuPont™) a 50 nM o 100 nm y enseguida se transfirieron a un medio de selección nuevo en intervalos de 2 semanas. Para la amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se eligieron siete sublíneas supuestamente transformadas, después de que alcanzaron aproximadamente los 2 g, con el fin de verificar la presencia de transgenes, utilizando técnicas estándar. Los pares de cebador utilizados para las reacciones se muestran enseguida en el Cuadro 24.

Cuadro 24. Pares de cebador para la PCR Para la detección del gen ALS, se utilizaron dos conjuntos de cebadores, los cuales se diseñaron de tal modo que no deriven en un producto del gen de pino de tipo silvestre resultante. Se confirmó que una sublínea supuestamente transformada era transgénica si los cebadores del gen PAL del pino dieron un producto de control positivo, los cebadores del gen virD no dieron producto, lo que indicó que no quedaban remanentes de Agrobacterium contaminante ni cebadores de los productos adecuados convertidos en transgénicos. Seis de los siete transformantes probados dieron positivo, indicando una tasa de falsos positivos de sólo 14%, como resultado de las mejores condiciones de selección utilizadas en este ejemplo, en comparación con el Ejemplo 26. Esto demuestra que la ausencia de métodos de selección de caseína es suficiente para seleccionar las células transformadas utilizando el marcador seleccionable ais y, como agente de selección, el herbicida de sulfonilurea. Sin embargo, las células transgénicas seleccionadas en este experimento eran de crecimiento lento y no parecían ser lo suficientemente sanas como para diferenciar embriones cosechables y regenerables. De este modo, es claro que el método de selección mejorado, en el cual se omite el hidrolisato de caseína, no es suficiente para soportar un sistema de regeneración útil y son necesarias mejoras adicionales para el crecimiento y desarrollo normal de las células embriogénicas.

EJEMPLO 29 . PREPARACIÓN DE LOS VECTORES CON MARCADORES SELECCIONARLES ALS O ASA2 Los vectores de ADN se diseñaron de modo que contengan un gen reportero o indicador y el marcador seleccionable nptll, así como los marcadores seleccionables alternativos ais o asa2 impulsados por promotores constitutivos. Las posiciones relativas de los genes en los vectores se diseñaron de tal manera que en un vector binario, el marcador seleccionable nptll estaría cerca del borde que se pierde con la mayor frecuencia durante la transformación y el marcador seleccionable alternativo estaría entre el gen nptll y el gen indicador uidA. Esto se realizó con el fin de contar con experimentos de selección, en los cuales las células puedan seleccionarse primero o en paralelo utilizando nptll y la presencia del gen nptll, como se demuestra mediante la exitosa selección de Geneticina, da evidencia de una elevada probabilidad de que el marcador seleccionable alternativo esté presente, ligado entre estos dos genes. Esta configuración facilitó las pruebas y el desarrollo del sistema de selección que utiliza medidas rápidas y no moleculares del éxito de la transformación hasta que se hayan establecido las condiciones de selección del marcador alternativo. Los vectores se diseñaron de modo que los sitios de restricción convenientes permitan la posterior eliminación de los genes nptll y uidA, así como la inserción de otros genes de interés. El marcador seleccionable alternativo, colocado cerca del borde que con mayor frecuencia se pierde durante la transformación, admite que los genes de interés se cotransfieran con el marcador seleccionable alternativo. El gen ais es del conocimiento público y está disponible. El GenBank tiene muchos genes ais de plantas. Por ejemplo, los números de acceso gi 30693053, gi 30685789 y gi 30685785 del GenBank se correlacionan con genes ais aislados de Arabidopsis thaliana . En tanto que se puede usar cualquier secuencia ais, la presente invención utiliza una cásete ais subclonada, que usa Salí y Smal de pMLl (DuPont™) . La cásete ais se clonó entonces en el vector Bluescript™ (Stratagene) para elaborar el constructo pWVC20. (Figura 1) La cásete se colocó de conformidad con la expresión de un promotor de ubiquitina subclonado que utiliza las enzimas de restricción Hindlll y Ncol de p2554 (Norris et al., 1993, Plant Molecular Biology, 21:895-906) para elaborar el pWVC22 y ofrecer sitios de restricción adicionales y permitir una gran acumulación de copias . La mayor cásete de expresión de plantas ais (4.9 kb) , restringida con Apal y Notl , se insertó entonces en vectores binarios que contienen los genes nptll y uidA impulsados por diferentes promotores constitutivos, de tal modo que la cásete de expresión de plantas ais se ubique entre los genes nptll y ui?A y esté flanqueada por los sitios de restricción convenientes para dar origen al pWVC23 (Figura 3) y al pWVC24 (Figura 4) . De este modo, es directa la obtención del pWVC25 (Figura 5) , que solamente contiene las casetes de expresión de plantas ui?A y ais, y del pWVC36, que solamente contiene la cásete de expresión de plantas ais, estas casetes de interés pueden clonarse para insertarlas en plantas utilizando la selección ais . Estas casetes de interés pueden incluir, aunque no se limitan a, genes que se añadirán o aumentarán la producción de las moléculas de interés, tales como los genes de la biosíntesis de siringil lignina o genes de resistencia a la tensión o ARNi o constructos antisentido que disminuyen la producción de moléculas de interés. El gen asa2 es del conocimiento público y está disponible. El GenBank tiene muchos genes asa2 de plantas. Por ejemplo, los números de acceso gi 4256949 y gi 3348125 del GenBank se relacionan con genes asa2 aislados de plantas. Si bien se puede usar cualquier secuencia asa2, la presente invención utiliza un gen asa2 subclonado del plásmido pUC35SASA2 (Song, H.S. y et al., (1998), Plant Physiol . 117:2:533-548) que usa las enzimas de restricción Sphl y BamHI para producir un fragmento de 4800 bp sin promotor del pWVC30 (Figura 6) y se colocó de conformidad con el control de la expresión de un promotor de ubiquitina subclonado de p2554. Esta cásete ligada a T4 se clonó en el vector Bluescript™ pBSKIIt para producir los dos sitios de restricción adicionales Apal y Notl . Para el recorte y la obtención de un fragmento de 3800 bp se utilizaron estas enzimas de restricción, el cual se ligó dentro de un vector binario que contiene los genes nptll y ui?A impulsados por diferentes promotores constitutivos, como se describió en lo anterior, para producir el pWVC33 (Figura 7) . La cásete de expresión de plantas asa2 se ubica entre los genes nptll y ui?A y está flanqueada por convenientes sitios de restricción adicionales . De este modo, es directa la obtención del pWVC34 (Figura 8), que solamente contiene las casetes de expresión de plantas ui?A y asa2, y del pWVC35 (Figura 8), que solamente contiene la cásete de expresión de plantas asa2, estas casetes de interés pueden clonarse para insertarlas en plantas utilizando la selección asa2. Estas casetes de interés incluyen, aunque no se limitan a, genes que se añadirán o aumentarán la producción de las moléculas de interés, tales como los genes de la biosíntesis de siringil lignina o genes de resistencia a la tensión o AR?i o constructos antisentido que disminuyen la producción de moléculas de interés. Los plásmidos pWVC23 (Figura 3), pWVC24 (Figura 4) y pWVC33 (Figura 7) se transformaron en la línea celular competente de la bacteria Escherichia coli XLIO-Gold y la línea celular GV2260 de Agrobacterium tumefaciens, utilizando técnicas estándar.

EJEMPLO 30 Para la transformación se prepararon dos líneas celulares de pino de incienso, utilizando los mismos métodos del Ejemplo 28, y se cocultivaron con Agrobacterium tumefaciens transformado con pWVC23 (Figura 5) como también se describe en el Ejemplo 28. Después de erradicar el Agrobacterium, cada línea celular se dividió en partes iguales en un medio de selección que contenía Geneticina a 15 mg/1 o Ally, ya sea a 50 o 100 nM. Después de cultivar hasta un tamaño suficiente las sublíneas supuestamente transformadas y para comprobar de manera rápida el estado de transformación antes de la PCR, nueve sublíneas cultivadas en un medio que contenía Ally, se transíectaron con un medio que contenía Geneticina. El 100% de éstas líneas pudo crecer en el medio que contenía Geneticina. En cinco de estas líneas se realizó entonces la comprobación con PCR, utilizando los seis pares de cebador descritos en el Ejemplo 28. Mediante PCR se confirmó que el 100% de estas líneas eran transformantes positivos. Sin embargo, estas líneas mostraron los mismos fenotipos no regenerables de las líneas descritas en el Ejemplo 28. En un experimento similar, para la transformación se prepararon cinco líneas de pino de incienso y pino híbrido, utilizando los métodos del Ejemplo 28, con excepción de que una de las líneas iniciadas a partir de los conos recolectados del semillero de Rigesa en Tres Barras, Brasil. Las líneas se cocultivaron con Agrobacterium transformado con pWVC24 (Figura 4) , como se describió en el Ejemplo 28. Después de erradicar el Agrobacterium, cada línea celular se dividió en partes iguales en el medio de selección que contenía Geneticina a 15 mg/1 o Ally, a alguna de las concentraciones siguientes: 50, 75, 100 o 125 nM. Después de ocho semanas de selección, las sublíneas supuestamente transformadas habían crecido en Geneticina y en cada uno de los cuatro niveles de Ally. La transformación se confirmó mediante teñido con GUS y PCR. Sin embargo, estas líneas mostraron los mismos fenotipos no regenerables de las líneas descritas en el Ejemplo 28.

EJEMPLO 31. PREPARACIÓN Y PRUEBAS CON MEZCLAS DE HIDROLISATO DE CASEÍNA El hidrolisato de caseína es una mezcla compleja que contenía aminoácidos esencialmente libres, obtenidos mediante hidrólisis de la proteína de leche caseína, aunque contenía algo de amoníaco libre y pequeñas cantidades de dipéptidos, tripéptidos y péptidos más complejos. El siguiente Cuadro 23 muestra la composición de aminoácidos libres y la composición de amoníaco libre del hidrolisato de caseína, según se determinó utilizando los procedimientos analíticos citados en el catálogo de Sigma® en dos años diferentes.

Cuadro 25. Digestión de caseína (Sigma C4523) con tripsina. Ensayo de los aminoácidos libres típicos en mg/g de caseína Lista de 1990 Lista de 1993 Amoníaco 0.14 0.4 Prolina 1.25 1.25 Glicina 1.99 1.99 Ácido aspártico 2.31 2.31 Cisteína 2.5 2.5 Alanina 5.28 5.2 Ácido glutámico 5.45 5.45 Histidina 5.85 5.85 Treonina 8.52 8.52 Serina 9.04 9.04 Triptófano 12.12 12.2 Tirosina 12.7 12.7 Metionina 13.2 13.2 Valina 18.3 18.3 Fenilalanina 25.7 25.7 Arginina 25.8 25.8 Lisina 50.8 50.8 Leucina 54 54 Isoleucina 72.4 72.4 Al diseñar un hidrolisato de caseína sintético, se reconoció que algunos de los componentes del hidrolisato de caseína natural promueven el crecimiento y la diferenciación de células de plantas, en tanto que otros no tuvieron el efecto opuesto. Así, era importante sustituir solamente los componentes que se sabía impedían el crecimiento y la diferenciación de las células de plantas. Se preparó una variedad de mezclas de hidrolisato de caseína sintético, descrita en el Cuadro 26.

Cuadro 26. Mezclas de hidrolisato de caseína sintético mg/g en la mg/g en la mg/g en la mg/g en la mezcla mezcla mezcla mezcla aminoácido AA1 AA2 AA3 AA4 glicina 1.99 1.99 1.99 1.99 treonina 8.52 8.52 8.52 8.52 serina 9.04 9.04 9.04 9.04 triptófano 12.2 12.2 0 0 tirosina 12.7 12.7 0 12.7 metionina 13.2 13.2 13.2 13.2 valina 18.3 0 18.3 18.3 ienilalanina 25.7 25.7 0 25.7 arginina 25.8 25.8 25.8 25.8 lisina 50.8 50.8 50.8 50.8 leucina 54 0 54 54 Isoleucina 72.4 0 72.4 72.4 Las mezclas sintéticas se probaron en 13 líneas de pino de incienso y pino híbrido provenientes de 7 familias genéticamente diversas. Estas líneas se iniciaron y criopreservaron, como se describió en el Ejemplo 26, se pusieron en cultivos en suspensión uniformes y colocaron en placa sobre los medios de tratamiento respectivos, como se describió en el Ejemplo 27. Los medios para el experimento contenían medios de conservación DCR2 que contenían ya sea 0.5 g/l de hidrolisato de caseína, 0.5 g/l de una de las mezclas derivadas que tienen las proporciones mostradas en el Cuadro 24 o que carecían tanto de caseína como de mezclas de aminoácidos y cada uno de estos tratamientos estuvieron provistos de cada uno de los tratamientos con el herbicida Ally® (distribuido en el comercio por Dupont™) a 0, 10, 30 o 50 nM. A las seis semanas se promediaron los datos de crecimiento de las 13 líneas, como se muestra en la Figura 10. La Figura 10 muestra que la ausencia de hidrolisato de caseína reduce el crecimiento de la planta. Entre tanto, las dos mezclas sintéticas soportan un crecimiento igual o mejor que el alcanzado en el medio que contenía hidrolisato de caseína. Los resultados indican que las necesidades de hidrolisato de caseína para el crecimiento fueron satisfechas por los sustitutos sintéticos y que estos sustitutos promovieron un crecimiento superior en los cultivos de pino embriogénico. Adicionalmente, los resultados muestran que en un medio que contenía una mezcla de aminoácidos en la que no hay presencia de aminoácidos de cadena ramificada y que también contiene el herbicida de sulfonilurea Ally® el crecimiento se retrasó en un grado importante o se detuvo. Esto confirma que la biosíntesis de aminoácidos de cadena ramificada es esencial para el crecimiento. Además, los datos indican que el retraso del crecimiento de las células, debido al herbicida de sulfonilurea Ally®, es al menos tan eficaz en presencia de la mezcla que carece de aminoácidos de cadena ramificada como lo es en ausencia del hidrolisato de caseína. En otro experimento se usaron 10 diferentes líneas de pino de incienso y pino híbrido provenientes de ocho familias genéticamente diversas. Estas líneas se iniciaron y criopreservaron, como se describió en el Ejemplo 26, se pusieron en cultivos en suspensión uniformes y colocaron en placa sobre los medios de tratamiento respectivos, como se describió en el Ejemplo 26. Los medios para el experimento contenían medios de manutención DCR2 que contenían ya sea 0.5 g/l de hidrolisato de caseína, 0.5 g/l de la mezcla derivada AA4 que tiene las proporciones mostradas en el Cuadro 24 o que carecía tanto de caseína como de mezclas de aminoácidos y cada uno de estos tratamientos estuvieron provistos de cada uno de los tratamientos con 0, 3, 10 o 30 mg/1 de 5-metiltriptófano (5MT) . Se realizaron transferencias a medios nuevos y sus pesos se determinaron cada 2-3 semanas en las horas mostradas en la Figura 11. El eje vertical representa el aumento total del peso, en gramos, después del periodo respectivo. La Figura 11 muestra que la mezcla AA4 es capaz de sustituir el hidrolisato de caseína y que solamente en ausencia de triptófano es posible obtener una satisfactoria reducción del crecimiento con la aplicación de 5-metiltriptófano. Los datos muestran además que durante las dos primeras semanas en el medio que carecía de triptófano y que contenía niveles letales de 5-metiltriptófano, aún hubo un poco de crecimiento. Esto sugiere que el preagotamiento de los aminoácidos, como el triptófano en este caso, conseguido en el tejido del cultivo anterior en un medio que contenía hidrolisato de caseína normal representa un medio eficaz para el uso de un marcador seleccionable que bloquea una ruta biosintética de aminoácidos .

EJEMPLO 32. EVALUACIÓN DE LA SELECTIVIDAD DEL 5MT y DEL AMT Para la transformación se prepararon dos líneas celulares de pino de incienso, utilizando el método del Ejemplo 28, y se cocultivaron con Agrobacterium tumefaciens transformado con pWVC33 (Figura 7) como también se describe en el Ejemplo 28. Después de erradicar el Agrobacterium, cada línea celular se dividió en partes iguales en 6 placas de cada uno de los 5 diferentes medios de selección que contenían 15 mg/1 de hidrolisato de caseína o de Geneticina o mezcla de aminoácidos AA4 y cualquiera de 5-metiltriptófano (5MT) , a 30 o 50 mg/1, o a-metiltriptófano (AMT), a 30 o 50 mg/1. Los resultados se muestran en la Figura 12. Las sublíneas supuestamente transformadas se cultivaron en placas que contenían Geneticina y en los dos tratamientos de selección en los cuales se incorporaron 30 mg/1 del análogo selectivo triptófano metilado. Después, cuando los supuestos transformantes tienen el tamaño suficiente, se someten a comprobación con PCR utilizando los pares de cebador nptll, uidA, VirD y PAL descritos en el Ejemplo 28 con los siguientes pares de cebador del asa2, diseñados específicamente de tal modo que no dan origen a un producto del gen ASA2 de pino nativo.

Cuadro 27. Pares de cebador para la PCR Los resultados de la PCR se muestran a continuación en el Cuadro 28. La proporción de falsos positivos no es significativamente diferente entre tratamientos de selección.

Cuadro 28. Resultados de la PCR del asa2 Los experimentos posteriores probaron el agotamiento de los aminoácidos en el medio antes de la selección mediante el suministro del medio de preparación libre de caseína y el medio de recuperación o del suministro de la mezcla de aminoácidos 7AA4 en el medio de preparación y el medio de recuperación.

EJEMPLO 33 En este experimento, para la transformación se prepararon seis líneas genéticamente diversas de pino de incienso y pino híbrido, que incluían una línea de pino de incienso brasileño proveniente de una familia de élite, como en el Ejemplo 30, y se cocultivaron, como en el Ejemplo 28, dividiendo las células de cada línea entre cepas de Agrobacterium transformado con pWVC24 (Figura 4) o pWVC33 (Figura 7) . Las células de cada línea se lavaron y colocaron en placas sobre el medio de recuperación carente de hidrolisato de caseína, de modo gue hay un agotamiento de una semana en los aminoácidos de cadena ramificada y en el triptófano. Las células se dividieron en los tratamientos de selección en los que las sales básales se variaron, utilizando ya sea DCR o Mi3 (Cuadro 27) . Esto demostró que las modificaciones hechas a los medios de selección de los Ejemplos 30-33 no funcionan en forma diferente en diferentes formulaciones de sal basal, pero pueden aplicarse en cualquier formulación de sal conocida por los que tienen experiencia en la técnica del cultivo de tejidos de plantas leñosas. Los transformantes con pWVC24 (Figura 4) se recuperaron de los medios de selección de Geneticina y de los medios de selección de Ally en las dos formulaciones de sal. Los transformantes con pWVC33 (Figura 7) se recuperaron de los medios de selección de Geneticina y de los medios de selección de a-metiltriptófano en las dos formulaciones de sal. De los medios de selección de Geneticina en ambas formulaciones de sal se recuperaron los transformantes, usando un plásmido de control que no contiene ni ais ni asa2. Los resultados muestran que las modificaciones hechas a los medios de selección de los Ejemplos 30-33 no funcionaron en forma diferente en diferentes formulaciones de sal basal y pueden aplicarse a cualquier formulación de sal conocida por los que tienen experiencia en la técnica del cultivo de tejidos de plantas leñosas.

Cuadro 29. Formulación del medio de conservación Mi3 en mg/litro y en concentración molar (mM) a Sigma C4523 b PhytaGel de Sigma P-8169 ° El total no incluye la caseína de peso molecular desconocido Las células transformadas se colocaron entonces en placas sobre el medio de diferenciación, como se describió en el Ejemplo 27, con el fin de obtener embriones germinables. Los embriones cosechables se recolectaron aproximadamente en igual número de los transformantes nptll cultivados en Geneticina, de los transformantes pWVC24 cultivados en Ally y de los transformantes WVC33 cultivados en a-metiltriptófano . Los embriones cosechados eran maduros, estaban convertidos en plantas aclimatadas y preparados para plantarlos en el campo. Los embriones, en soportes de tela, se transfirieron al medio MSG3 (Cuadro 21) y se incubaron aproximadamente por cuatro semanas en la oscuridad a una temperatura de 4°C+2°C. Posteriormente, los embriones en sus soportes de tela se incubaron encima de agua en recipientes sellados por un periodo de aproximadamente tres semanas en la oscuridad y a una temperatura de 25°C±2°C. Después de los dos tratamientos anteriores, los embriones, en sus soportes de tela, se transfirieron al medio MSG (Cuadro 21) y se incubaron aproximadamente por tres semanas en la oscuridad y a una temperatura de 25°C±2°C. Los embriones se retiraron entonces de sus soportes de tela y se colocaron en la superficie de un nuevo medio MSG para la germinación. La germinación se realizó a la luz a una temperatura de 25°C±2°C. Las placas de germinación se examinaron una vez a la semana durante un periodo aproximado de cuatro semanas y los embriones en germinación se transfirieron a cajas MAGENTA® gue contenían 100 ml del medio MSG para su conversión en plántulas. Las cajas MAGENTA® que contenían las plántulas en desarrollo se incubaron con luz por un periodo de aproximadamente entre ocho y doce semanas . Cuando las plántulas forman epicótilos (brotes recién formados de aproximadamente dos a cuatro cm) , se transfieren a recipientes llenos de mezcla para macetas [2:1:2 turba:perlita :vermiculita, que contenía 602 g/m3 de fertilizante OSMOCOTE (18-6-12), 340 g/m3 de caliza dolomítica y 78 g/m3 de la mezcla micro nutriente MICRO-MAX (Sierra Chemical Co.)]. Las plántulas crecieron durante un periodo de aproximadamente dos semanas en un invernadero sombreado y nebulizado de manera infrecuente. Se quitó la neblina para aclimatarlas en el invernadero por un periodo aproximado de cuatro semanas. Las plántulas se transfirieron entonces a un lugar exterior sin luz directa por un periodo de aproximadamente seis semanas para el aclimatado final antes de ponerlas directamente bajo la luz del sol. Aunque una porción significativamente menor de las líneas transgénicas de pWVC24 produjo embriones que sobrevivieron a la maduración, el porcentaje de líneas sobrevivientes a la plantación en el suelo fue similar en todos los tratamientos para controlar la germinación, Cuadro 30 Este método de selección de la invención ha generado al menos diez plantas por línea a partir de varias docenas de líneas de pino transformadas en forma estable con ais o con asa2, que serán plantadas en un sitio de campo funcionalmente preparado, de conformidad con una notificación APHIS posteriormente en este año. Este es el primer uso exitoso reportado de estos agente de selección y de estos marcadores seleccionables en la transformación de pino que produjo plantas regenerables de pino. En consecuencia, este método de selección puede ser utilizado para seleccionar diversos árboles transgénicos .

Claims (68)

1. REIVINDICACIONES 1. Un método para transformar con ADN ajeno al menos una célula de un explante de árbol, el método comprende : (i) cultivar un explante de árbol en un medio de precultivo que contiene un inductor de Agrobacterium; (ii) exponer el explante ante una cepa de Agrobacterium que contiene un vector de transformación que porta el ADN ajeno; (iii) seleccionar un explante transformado, en el cual el ADN ajeno se transfiera por lo menos a una célula del explante transformado; y (iv) regenerar el explante transformado para producir una planta completa.
2. 2. El método según la Reivindicación 1 donde el inductor de Agrobacterium es acetosiringona.
3. 3. El método según la Reivindicación 2 donde la concentración de la acetosiringona varía aproximadamente entre 10 y 400 mg/1.
4. 4. El método según la Reivindicación 3 donde la concentración de la acetosiringona varía aproximadamente entre 5 y 200 mg/1.
5. 5. El método según la Reivindicación 1 donde el medio además contiene auxina.
6. 6. El método según la Reivindicación 1 donde el medio además contiene citoquinina.
7. 7. El método según la Reivindicación 1 donde el explante se precultiva en la oscuridad durante aproximadamente entre 1 y 6 días .
8. 8. El método según la Reivindicación 1 donde el explante se precultiva aproximadamente por 4 días.
9. 9. El método según la Reivindicación 5 donde la auxina se selecciona del grupo formado por NAA, 2,4-D, IBA e IAA.
10. 10. El método según la Reivindicación 9 donde el intervalo de concentraciones de cualquiera de NAA, 2,4-D, IBA e IAA varía aproximadamente entre 0.1 y 10 mg/1.
11. 11. El método según la Reivindicación 10 donde el intervalo de concentraciones de la acetosiringona varía aproximadamente entre 0.2 y 5 mg/1.
12. 12. El método según la Reivindicación 11 donde el intervalo de concentraciones de la acetosiringona varía aproximadamente entre 0.2 y 3 mg/1.
13. 13. El método según la Reivindicación 6 donde la citoquinina se selecciona del grupo formado por zeatina, cinetina y BA.
14. 14. El método según la Reivindicación 13 donde el intervalo de concentraciones de cualquiera de zeatina, cinetina y BA varía aproximadamente entre 0.25 y 15 mg/1.
15. 15. El método según la Reivindicación 14 donde el intervalo de concentraciones varía aproximadamente entre 1 y 10 mg/1.
16. 16. El método según la Reivindicación 15 donde el intervalo de concentraciones varía aproximadamente entre 1 y 6 mg/1.
17. 17. El método según la Reivindicación 1 donde el explante es al menos una hoja, un pecíolo, un tejido internodal, floral o embriogénico.
18. 18. El método según la Reivindicación 1 donde los tejidos se seleccionan independientemente de la edad o etapa de desarrollo.
19. 19. El método según la Reivindicación 1 donde el método es independiente del genotipo.
20. 20. El método según la Reivindicación 1 donde todas las células del explante transformado contienen el ADN aj eno .
21. 21. El método según la Reivindicación 1 donde el explante se selecciona del grupo formado por especies de Eucalyptus o de pino.
22. 22. Una planta transgénica de Eucalyptus producida con el método de la Reivindicación 1.
23. 23. Una planta transgénica de pino producida con el método de la Reivindicación 1.
24. 24. Una planta transgénica de Eucalyptus, donde la planta es una planta transgénica no quimérica.
25. 25. Una planta transgénica de Eucalyptus, donde la planta es E. granáis no quimérico y sus híbridos.
26. 26. Una planta transgénica de Eucalyptus, donde la planta es E. nitens no quimérico y sus híbridos.
27. 27. Una planta transgénica de Eucalyptus, donde la planta es E. globulus no quimérico y sus híbridos.
28. 28. Una planta transgénica de Eucalyptus, donde la planta es E. ?unnii no quimérico y sus híbridos.
29. 29. Una planta transgénica de Eucalyptus, donde la planta es E. saligna no quimérico y sus híbridos.
30. 30. Una planta transgénica de Eucalyptus, donde la planta es E. occi?entalis no quimérico y sus híbridos.
31. 31. Un método para producir un árbol no quimérico, el método comprende: (i) precultivar un explante de árbol en un medio que contiene un inductor de Agrobacterium; (ii) exponer el explante ante una cepa de Agrobacterium que alberga un vector capaz de transferir un gen a la célula de una planta; (iii) seleccionar un explante transformado; y (iv) cultivar el explante para producir un árbol no quimérico.
32. 32. El método según la Reivindicación 31 donde el método es independiente del genotipo.
33. 33. Una planta transgénica de Eucalyptus producida con el método de la Reivindicación 31.
34. 34. Una planta transgénica de Eucalyptus producida con el método de la Reivindicación 31, donde la planta tiene un gen de resistencia a herbicidas y un gen ajeno.
35. 35. Un método para producir un árbol transgénico, el método comprende: (i) precultivar un explante de árbol en un medio que contiene un inductor de Agrobacterium; (ii) transformar el explante con una cepa de Agrobacterium que alberga un vector capaz de transferir un gen a la célula de una planta; (iii) seleccionar un explante transformado; y (iv) regenerar el explante para producir una planta transgénica.
36. 36. El método según la Reivindicación 35 donde el método es independiente del genotipo.
37. 37. Una planta transgénica de Eucalyptus producida con el método de la Reivindicación 35.
38. 38. Una planta transgénica de Eucalyptus producida con el método de la Reivindicación 35, donde la planta tiene un gen de resistencia a herbicidas y un gen a eno.
39. 39. Una planta transgénica de pino producida con el método de la Reivindicación 35, donde la planta tiene un gen de resistencia a herbicidas y un gen ajeno.
40. 40. Una planta transgénica de Eucalyptus, donde la planta se transformó en forma estable con un ADN ajeno y es capaz de transmitir el ADN ajeno a su progenie.
41. 41. Una composición para un medio que contiene un herbicida de sulfonilo y un compuesto de tipo hidrolisato de caseína, donde el compuesto carece prácticamente de aminoácidos de cadena ramificada.
42. 42. Un método para producir una planta transgénica, el método comprende: (i) precultivar un explante en un medio que contiene un inductor de Agrobacterium; (ii) exponer el explante ante una cepa de Agrobacterium que alberga un vector capaz de transferir un gen a la célula de una planta; (iii) seleccionar un explante transformado en un medio de cultivo que contiene un herbicida de sulfonilurea o imidazolinona y un compuesto de tipo hidrolisato de caseína, donde el compuesto prácticamente carece de aminoácidos de cadena ramificada y no interfiere con la selección con sulfonilurea o imidazolinona; y (iv) regenerar una planta completa a partir del explante.
43. 43. Una composición de un medio para seleccionar plantas transgénicas, la composición contiene un herbicida de sulfonilo y un derivado de hidrolisato de caseína, donde el derivado prácticamente carece de aminoácidos de cadena ramificada.
44. 44. Una composición de un medio que contiene un análogo del triptófano y un derivado de hidrolisato de caseína, donde el derivado prácticamente carece de triptófano.
45. 45. La composición del medio según la Reivindicación 41 donde el derivado de hidrolisato de caseína se optimiza para cultivar tejidos de plantas.
46. 46. Un método para seleccionar la célula de una planta transformada, el método comprende: (i) transformar la célula de una planta con un vector que contiene un gen que codifica para una forma resistente a herbicidas de la acetolactato sintasa (ALS) de planta y (ii) cultivar la célula transformada en el medio para plantas de la Reivindicación 41.
47. 47. Un método para seleccionar la célula de una planta transformada, el método comprende: (i) transformar la célula de una planta con un vector que contiene un gen que codifica para una forma insensible a la realimentación de la antranilato sintasa (AS) y (ii) cultivar la célula transformada en el medio de la Reivindicación 44.
48. 48. Una planta transgénica de E. occiáentalis .
49. 49. Una planta transgénica de E. ?unnii .
50. 50. Planta de E. occi?entalis que contiene al menos una célula transformada en forma estable con ADN ajeno.
51. 51. Una plante de E. ?unnii infértil transformado con ADN ajeno.
52. 52. Una planta de E. saligna transformada en forma estable, donde la planta tiene la capacidad de transmitir a su progenie el ADN ajeno.
53. 53. Un medio de precultivo para Eucalyptus, que contiene un inductor de Agrobacterium .
54. 54. Una pulpa de madera obtenida de una planta transgénica de Eucalyptus, donde la planta se produce con el método de la Reivindicación 1.
55. 55. Una fibra de madera obtenida de una planta transgénica de Eucalyptus, donde la planta se produce con el método de la Reivindicación 1.
56. 56. Aceite obtenido de una planta transgénica de Eucalyptus, donde la planta se produce con el método de la Reivindicación 42.
57. 57. Papel producido a partir de una planta transgénica de Eucalyptus, donde la planta se produce con el método de la Reivindicación 1.
58. 58. Té elaborado a partir de una planta transgénica de Eucalyptus, donde la planta se produce con el método de la Reivindicación 35.
59. 59. Una pulpa de madera obtenida a partir de una planta transgénica de pino producida con el método de la Reivindicación 1.
60. 60. Una fibra de madera obtenida a partir de una planta transgénica de pino producida con el método de la Reivindicación 1.
61. 61. Un método para preparar pulpa de madera, el método comprende: (i) cultivar un explante de árbol en un medio de precultivo que contiene un inductor de Agrobacterium; (ii) exponer el explante ante una cepa de Agrobacterium que contiene un vector de transformación que porta el ADN ajeno; (iii) seleccionar un explante transformado, donde el ADN ajeno se transfiere por lo menos a una célula del explante transformado; (iv) regenerar el explante transformado para producir una planta completa; y (v) obtener pulpa de madera a partir de dicha planta.
62. 62. Un método para elaborar madera, el método comprende : (i) cultivar un explante de árbol en un medio de precultivo que contiene un inductor de Agrobacterium; (ii) exponer el explante ante una cepa de Agrobacterium que contiene un vector de transformación que porta el ADN ajeno; (iii) seleccionar un explante transformado, donde el ADN ajeno se transfiere por lo menos a una célula del explante transformado; (iv) regenerar el explante transformado para producir una planta completa; y (v) obtener madera a partir de dicha planta.
63. 63. Un método para elaborar papel, el método comprende: (i) cultivar un explante de árbol en un medio de precultivo que contiene un inductor de Agroba cterium; (ii) exponer el explante ante una cepa de Agrobacterium que contiene un vector de transformación que porta el ADN ajeno; (iii) seleccionar un explante transformado, donde el ADN ajeno se transfiere por lo menos a una célula del explante transformado; (iv) regenerar el explante transformado para producir una planta completa; y (v) obtener papel a partir de dicha planta.
64. 64. Un método para elaborar aceite, el método comprende : (i) cultivar un explante de árbol en un medio de precultivo que contiene un inductor de Agroba cterium; (ii) exponer el explante ante una cepa de Agrobacterium que contiene un vector de transformación que porta el ADN ajeno; (iii) seleccionar un explante transformado, donde el ADN ajeno se transfiere por lo menos a una célula del explante transformado; (iv) regenerar el explante transformado para producir una planta completa; y (v) obtener aceite a partir de dicha planta .
65. 65. Un método para obtener pulpa de madera, el método comprende : (i) precultivar un explante en un medio que contiene un inductor de Agrobacterium; (ii) exponer el explante ante una cepa de Agrobacterium que alberga un vector capaz de transferir un gen a la célula de una planta; (iii) seleccionar un explante transformado en un medio de cultivo que contiene un herbicida de sulfonilurea o imidazolinona y un compuesto de tipo hidrolisato de caseína, donde el compuesto prácticamente carece de aminoácidos de cadena ramificada y no interfiere con la selección con sulfonilurea o imidazolinona; (iv) regenerar una planta completa a partir del explante; y (v) obtener pulpa de madera a partir de dicha planta.
66. 66. Un método para obtener madera, el método comprende : (i) precultivar un explante en un medio que contiene un inductor de Agrobacterium; (ii) exponer el explante ante una cepa de Agrobacterium que alberga un vector capaz de transferir un gen a la célula de una planta; (iii) seleccionar un explante transformado en un medio de cultivo gue contiene un herbicida de sulfonilurea o imidazolinona y un compuesto de tipo hidrolisato de caseína, donde el compuesto prácticamente carece de aminoácidos de cadena ramificada y no interfiere con la selección con sulfonilurea o imidazolinona; (iv) regenerar una planta completa a partir del explante; y (v) obtener madera a partir de dicha planta .
67. 67. Un método para obtener papel, el método comprende: (i) precultivar un explante en un medio gue contiene un inductor de Agrobacterium; (ii) exponer el explante ante una cepa de Agrobacterium gue alberga un vector capaz de transferir un gen a la célula de una planta; (iii) seleccionar un explante transformado en un medio de cultivo que contiene un herbicida de sulfonilurea o imidazolinona y un compuesto de tipo hidrolisato de caseína, donde el compuesto prácticamente carece de aminoácidos de cadena ramificada y no interfiere en la selección con sulfonilurea o imidazolinona; (iv) regenerar una planta completa a partir del explante; y (v) obtener papel a partir de dicha planta.
68. 68. Un método para obtener aceite, el método comprende : (i) precultivar un explante en un medio que contiene un inductor de Agrobacterium; (ii) exponer el explante ante una cepa de Agrobacterium que alberga un vector capaz de transferir un gen a la célula de una planta; (iii) seleccionar un explante transformado en un medio de cultivo que contiene un herbicida de sulfonilurea o imidazolinona y un compuesto de tipo hidrolisato de caseína, donde el compuesto prácticamente carece de aminoácidos de cadena ramificada y no interfiere con la selección con sulfonilurea o imidazolinona; (iv) regenerar una planta completa a partir del explante; y (v) obtener aceite a partir de dicha planta .