JP6990653B2 - 迅速な植物形質転換のための方法および組成物 - Google Patents
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Description
本願は、2015年10月30日に出願された米国仮特許出願第62/248578号の優先権を主張するものであり、その内容は全て参照により本明細書に組み込まれる。
配列表の正式な写しは、2016年8月17日作成の20160826_6752WOPCT_SeqList.txtのファイル名を備え、1000KBのサイズを有するASCIIフォーマットの配列表としてEFS-Webを介して電子的に提出され、本明細書と同時に提出されている。このASCIIフォーマットの文書内に含まれる配列表は、本明細書の一部であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
植物分子生物学、とりわけ植物形質転換および再生が進歩しているにもかかわらず、トランスジェニック植物を迅速かつ効率良く作製し、研究および製品の開発決定により多くの時間と自由度を与える高スループットシステムが依然として求められている。そのような形質転換の高スループットシステムは、材料および労働のコストを下げつつ、遺伝子実験および/または製品開発のための多数のトランスジェニック植物の生産を促進する。
含むポリペプチドは、ODP2、BBM2、BMN2またはBMN3ポリペプチドである。一態様では、2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドは、単子葉植物のポリペプチドである。一態様では、単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属(Setaria)種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである。一態様では、単子葉植物は、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属(Setaria)種である。一態様では、単子葉植物は、トウモロコシまたはイネである。一態様では、単子葉植物はトウモロコシである。一態様では、2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドは、双子葉植物のポリペプチドである。一態様では、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ(Arabidopsis)またはワタである。一態様では、2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドは、配列番号18、20、63、65および67のいずれか1つのアミノ酸配列を含む。一態様では、2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドは、配列番号17、19、21、62、64、66および68のいずれか1つを含むヌクレオチド配列によってコードされる。一態様では、2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドは、ODP2ポリペプチドである。一態様では、ODP2ポリペプチドは、単子葉植物のポリペプチドである。一態様では、単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属(Setaria)種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである。一態様では、単子葉植物は、トウモロコシ、イネまたはエノコログサ属(Setaria)種である。一態様では、単子葉植物は、トウモロコシまたはイネである。一態様では、ODP2は双子葉植物のポリペプチドである。一態様では、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ(Arabidopsis)またはワタである。一態様では、ODP2ポリペプチドは、配列番号18、63、65および67のいずれか1つのアミノ酸配列を含む。一態様では、ODP2ポリペプチドは、配列番号17、21、62、64、66および68のいずれか1つの配列を含むヌクレオチド配列によってコードされる。一態様では、2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドは、BBM2ポリペプチドである。一態様では、BBM2ポリペプチドは、単子葉植物のポリペプチドである。一態様では、単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属(Setaria)種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである。一態様では、単子葉植物は、トウモロコシ、サトウキビ、イネまたはエノコログサ属(Setaria)種である。一態様では、単子葉植物は、トウモロコシまたはイネである。一態様では、単子葉植物はトウモロコシである。一態様では、BBM2ポリペプチドは、双子葉植物のポリペプチドである。一態様では、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ(Arabidopsis)またはワタである。一態様では、BBM2ポリペプチドは、配列番号20のアミノ酸配列を含む。一態様では、BBM2ポリペプチドは、配列番号19の配列を含むヌクレオチド配列によってコードされる。一態様では、細胞の形質転換から約0~約7日以内、または細胞の形質転換から約0~約14日以内に再生可能な植物構造体が形成され、細胞の形質転換から約14日~約60日でトランスジェニック植物が形成される。一態様では、この方法は、発根培地なしで行われる。一態様では、この方法は、発根培地の存在下で行われる。一態様では、外植体は未熟胚である。一態様では、未熟胚は、1~5mmの未熟胚である。一態様では、未熟胚は、3.5~5mmの未熟胚である。一態様では、細胞の形質転換の約7日後、または細胞の形質転換の約14日後の発芽期間中に、外因性サイトカイニンを使用する。一態様では、(a)のポリペプチドの発現は一過性である。一態様では、発芽は、外因性サイトカイニンの存在下で行われる。
ペプチドは、WOX5Aポリペプチドである。一態様では、WOX5ポリペプチドは、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属(Setaria)種のWOX5ポリペプチドである。一態様では、WOX5ポリペプチドは、トウモロコシまたはイネのWOX5ポリペプチドである。一態様では、WOX5ポリペプチドは、トウモロコシのWOX5ポリペプチドである。一態様では、WOX5ポリペプチドは、配列番号14のアミノ酸配列を含む。一態様では、WOX5ポリペプチドは、配列番号13を含むヌクレオチド配列によってコードされる。一態様では、2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドは、ODP2、BBM2、BMN2またはBMN3ポリペプチドである。一態様では、2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドは、単子葉植物のポリペプチドである。一態様では、単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属(Setaria)種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである。一態様では、単子葉植物は、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属(Setaria)種である。一態様では、単子葉植物は、トウモロコシまたはイネである。一態様では、単子葉植物はトウモロコシである。一態様では、2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドは、双子葉植物のポリペプチドである。一態様では、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ(Arabidopsis)またはワタである。一態様では、2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドは、配列番号18、20、63、65および67のいずれか1つのアミノ酸配列を含む。一態様では、2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドは、配列番号17、19、21、62、64、66および68のいずれか1つを含むヌクレオチド配列によってコードされる。一態様では、2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドは、ODP2ポリペプチドである。一態様では、ODP2ポリペプチドは、単子葉植物のポリペプチドである。一態様では、単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属(Setaria)種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである。一態様では、単子葉植物は、トウモロコシ、イネまたはエノコログサ属(Setaria)種である。一態様では、単子葉植物は、トウモロコシまたはイネである。一態様では、ODP2は双子葉植物のポリペプチドである。一態様では、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ(Arabidopsis)またはワタである。一態様では、ODP2ポリペプチドは、配列番号18、63、65および67のいずれか1つのアミノ酸配列を含む。一態様では、ODP2ポリペプチドは、配列番号17、21、62、64、66および68のいずれか1つの配列を含むヌクレオチド配列によってコードされる。一態様では、2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドは、BBM2ポリペプチドである。一態様では、BBM2ポリペプチドは、単子葉植物のポリペプチドである。一態様では、単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属(Setaria)種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである。一態様では、単子葉植物は、トウモロコシ、サトウキビ、イネまたはエノコログサ属(Setaria)種である。一態様では、単子葉植物は、トウモロコシまたはイネである。一態様では、単子葉植物はトウモロコシである。一態様では、BBM2ポリペプチドは、双子葉植物のポリペプチドである。一態様では、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ(Arabidopsis)またはワタである。一態様では、BBM2ポリペプチドは、配列番号20のアミノ酸配列を含む。一態様では、BBM2ポリペプチドは、配列番号19の配列を含むヌクレオチド配列によってコードされる。一態様では、細胞の形質転換から約0~約7日以内、または細胞の形質転換から約0~約14日以内に再生可能な植物構造体が形成され、細胞の形質転換から約14日~約60日でトランスジェニック植物が形成される。一態様では、この方法は、発根培地なしで行われる。一態様では、この方法は、発根培地の存在下で行われる。一態様では、外植体は未熟胚である。一態様では、未熟胚は、1~5mmの未熟胚である。一態様では、未熟胚は、3.5~5mmの未熟胚である。一態様では、細胞の形質転換の約7日後、または細胞の形質転換の約14日後の発芽期間中に、外因性サイトカイニンを使用する。一態様では、(a)のポリペプチドの発現は一過性である。一態様では、発芽は、外因性サイトカイニンの存在下で行われる。
プチドは、トウモロコシのWOX5ポリペプチドである。一態様では、WOX5ポリペプチドは、配列番号14のアミノ酸配列を含む。一態様では、WOX5ポリペプチドは、配列番号13を含むヌクレオチド配列によってコードされる。一態様では、2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドは、ODP2、BBM2、BMN2またはBMN3ポリペプチドである。一態様では、2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドは、単子葉植物のポリペプチドである。一態様では、単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属(Setaria)種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである。一態様では、単子葉植物は、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属(Setaria)種である。一態様では、単子葉植物は、トウモロコシまたはイネである。一態様では、単子葉植物はトウモロコシである。一態様では、2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドは、双子葉植物のポリペプチドである。一態様では、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ(Arabidopsis)またはワタである。一態様では、2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドは、配列番号18、20、63、65および67のいずれか1つのアミノ酸配列を含む。一態様では、2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドは、配列番号17、19、21、62、64、66および68のいずれか1つを含むヌクレオチド配列によってコードされる。一態様では、2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドは、ODP2ポリペプチドである。一態様では、ODP2ポリペプチドは、単子葉植物のポリペプチドである。一態様では、単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属(Setaria)種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである。一態様では、単子葉植物は、トウモロコシ、イネまたはエノコログサ属(Setaria)種である。一態様では、単子葉植物は、トウモロコシまたはイネである。一態様では、ODP2は双子葉植物のポリペプチドである。一態様では、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ(Arabidopsis)またはワタである。一態様では、ODP2ポリペプチドは、配列番号18、63、65および67のいずれか1つのアミノ酸配列を含む。一態様では、ODP2ポリペプチドは、配列番号17、21、62、64、66および68のいずれか1つの配列を含むヌクレオチド配列によってコードされる。一態様では、2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドは、BBM2ポリペプチドである。一態様では、BBM2ポリペプチドは、単子葉植物のポリペプチドである。一態様では、単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属(Setaria)種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである。一態様では、単子葉植物は、トウモロコシ、サトウキビ、イネまたはエノコログサ属(Setaria)種である。一態様では、単子葉植物は、トウモロコシまたはイネである。一態様では、単子葉植物はトウモロコシである。一態様では、BBM2ポリペプチドは、双子葉植物のポリペプチドである。一態様では、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ(Arabidopsis)またはワタである。一態様では、BBM2ポリペプチドは、配列番号20のアミノ酸配列を含む。一態様では、BBM2ポリペプチドは、配列番号19の配列を含むヌクレオチド配列によってコードされる。一態様では、細胞の形質転換から約0~約7日以内、または細胞の形質転換から約0~約14日以内に再生可能な植物構造体が形成され、細胞の形質転換から約14日~約60日でトランスジェニック植物が形成される。一態様では、この方法は、発根培地なしで行われる。一態様では、この方法は、発根培地の存在下で行われる。一態様では、外植体は未熟胚である。一態様では、未熟胚は、1~5mmの未熟胚である。一態様では、未熟胚は、3.5~5mmの未熟胚である。一態様では、細胞の形質転換の約7日後、または細胞の形質転換の約14日後の発芽期間中に、外因性サイトカイニンを使用する。一態様では、(a)のポリペプチドの発現は一過性である。一態様では、発芽は、外因性サイトカイニンの存在下で行われる。
N2またはBMN3ポリペプチドである。一態様では、2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドは、単子葉植物のポリペプチドである。一態様では、単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属(Setaria)種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである。一態様では、単子葉植物は、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属(Setaria)種である。一態様では、単子葉植物は、トウモロコシ、ソルガムまたはイネである。一態様では、単子葉植物はトウモロコシである。一態様では、2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドは、双子葉植物のポリペプチドである。一態様では、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ(Arabidopsis)またはワタである。一態様では、2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドは、配列番号18、20、63、65および67のいずれか1つのアミノ酸配列を含む。一態様では、2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドは、配列番号17、19、21、62、64、66および68のいずれか1つを含むヌクレオチド配列によってコードされる。一態様では、2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドは、ODP2ポリペプチドである。一態様では、ODP2ポリペプチドは、単子葉植物のポリペプチドである。一態様では、単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属(Setaria)種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである。一態様では、単子葉植物は、トウモロコシ、イネまたはエノコログサ属(Setaria)種である。一態様では、単子葉植物は、トウモロコシまたはイネである。一態様では、ODP2は双子葉植物のポリペプチドである。一態様では、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ(Arabidopsis)またはワタである。一態様では、ODP2ポリペプチドは、配列番号18、63、65および67のいずれか1つのアミノ酸配列を含む。一態様では、ODP2ポリペプチドは、配列番号17、21、62、64、66および68のいずれか1つを含むヌクレオチド配列によってコードされる。一態様では、2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドは、BBM2ポリペプチドである。一態様では、BBM2ポリペプチドは、単子葉植物のポリペプチドである。一態様では、単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属(Setaria)種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである。一態様では、単子葉植物は、トウモロコシ、サトウキビ、イネまたはエノコログサ属(Setaria)種である。一態様では、単子葉植物は、トウモロコシまたはイネである。一態様では、単子葉植物はトウモロコシである。一態様では、BBM2ポリペプチドは、双子葉植物のポリペプチドである。一態様では、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ(Arabidopsis)またはワタである。一態様では、BBM2ポリペプチドは、配列番号20のアミノ酸配列を含む。一態様では、BBM2ポリペプチドは、配列番号19の配列を含むヌクレオチド配列によってコードされる。一態様では、細胞の形質転換から約0~約7日以内、または細胞の形質転換から約0~約14日以内に再生可能な植物構造体が形成され、細胞の形質転換から約14日~約60日でトランスジェニック植物が形成される。一態様では、この方法は、発根培地なしで行われる。一態様では、この方法は、発根培地の存在下で行われる。一態様では、外植体は未熟胚である。一態様では、未熟胚は、1~5mmの未熟胚である。一態様では、未熟胚は、3.5~5mmの未熟胚である。一態様では、細胞の形質転換の約7日後、または細胞の形質転換の約14日後の発芽期間中に、外因性サイトカイニンを使用する。一態様では、(a)のポリペプチドの発現は一過性である。一態様では、発芽は、外因性サイトカイニンの存在下で行われる。
のAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドは、ODP2、BBM2、BMN2またはBMN3ポリペプチドである。一態様では、2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドは、単子葉植物のポリペプチドである。一態様では、単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属(Setaria)種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである。一態様では、単子葉植物は、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属(Setaria)種である。一態様では、単子葉植物は、トウモロコシまたはイネである。一態様では、単子葉植物はトウモロコシである。一態様では、2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドは、双子葉植物のポリペプチドである。一態様では、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ(Arabidopsis)またはワタである。一態様では、2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドは、配列番号18、20、63、65および67のいずれか1つのアミノ酸配列を含む。一態様では、2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドは、配列番号17、19、21、62、64、66および68のいずれか1つを含むヌクレオチド配列によってコードされる。一態様では、2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドは、ODP2ポリペプチドである。一態様では、ODP2ポリペプチドは、単子葉植物のポリペプチドである。一態様では、単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属(Setaria)種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである。一態様では、単子葉植物は、トウモロコシ、イネまたはエノコログサ属(Setaria)種である。一態様では、単子葉植物は、トウモロコシまたはイネである。一態様では、ODP2は双子葉植物のポリペプチドである。一態様では、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ(Arabidopsis)またはワタである。一態様では、ODP2ポリペプチドは、配列番号18、63、65および67のいずれか1つのアミノ酸配列を含む。一態様では、ODP2ポリペプチドは、配列番号17、21、62、64、66および68のいずれか1つを含むヌクレオチド配列によってコードされる。一態様では、2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドは、BBM2ポリペプチドである。一態様では、BBM2ポリペプチドは、単子葉植物のポリペプチドである。一態様では、単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属(Setaria)種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである。一態様では、単子葉植物は、トウモロコシ、サトウキビ、イネまたはエノコログサ属(Setaria)種である。一態様では、単子葉植物は、トウモロコシまたはイネである。一態様では、単子葉植物はトウモロコシである。一態様では、BBM2ポリペプチドは、双子葉植物のポリペプチドである。一態様では、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ(Arabidopsis)またはワタである。一態様では、BBM2ポリペプチドは、配列番号20のアミノ酸配列を含む。一態様では、BBM2ポリペプチドは、配列番号19の配列を含むヌクレオチド配列によってコードされる。一態様では、細胞の形質転換から約0~約7日以内、または細胞の形質転換から約0~約14日以内に再生可能な植物構造体が形成される。一態様では、この方法は、発根培地なしで行われる。一態様では、この方法は、発根培地の存在下で行われる。一態様では、外植体は未熟胚である。一態様では、未熟胚は、1~5mmの未熟胚である。一態様では、未熟胚は、3.5~5mmの未熟胚である。一態様では、細胞の形質転換の約7日後、または細胞の形質転換の約14日後の発芽期間中に、外因性サイトカイニンを使用する。一態様では、(a)のポリペプチドの発現は一過性である。一態様では、発芽は、外因性サイトカイニンの存在下で行われる。
は、WOX5ポリペプチドは、配列番号13を含むヌクレオチド配列によってコードされる。一態様では、2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドは、ODP2、BBM2、BMN2またはBMN3ポリペプチドである。一態様では、2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドは、単子葉植物のポリペプチドである。一態様では、単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属(Setaria)種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである。一態様では、単子葉植物は、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属(Setaria)種である。一態様では、単子葉植物は、トウモロコシまたはイネである。一態様では、単子葉植物はトウモロコシである。一態様では、2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドは、双子葉植物のポリペプチドである。一態様では、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ(Arabidopsis)またはワタである。一態様では、2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドは、配列番号18、20、63、65および67のいずれか1つのアミノ酸配列を含む。一態様では、2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドは、配列番号17、19、21、62、64、66および68のいずれか1つを含むヌクレオチド配列によってコードされる。一態様では、2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドは、ODP2ポリペプチドである。一態様では、ODP2ポリペプチドは、単子葉植物のポリペプチドである。一態様では、単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属(Setaria)種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである。一態様では、単子葉植物は、トウモロコシ、イネまたはエノコログサ属(Setaria)種である。一態様では、単子葉植物は、トウモロコシまたはイネである。一態様では、ODP2は双子葉植物のポリペプチドである。一態様では、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ(Arabidopsis)またはワタである。一態様では、ODP2ポリペプチドは、配列番号18、63、65および67のいずれか1つのアミノ酸配列を含む。一態様では、ODP2ポリペプチドは、配列番号17、21、62、64、66および68のいずれか1つを含むヌクレオチド配列によってコードされる。一態様では、2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドは、BBM2ポリペプチドである。一態様では、BBM2ポリペプチドは、単子葉植物のポリペプチドである。一態様では、単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属(Setaria)種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである。一態様では、単子葉植物は、トウモロコシ、サトウキビ、イネまたはエノコログサ属(Setaria)種である。一態様では、単子葉植物は、トウモロコシまたはイネである。一態様では、単子葉植物はトウモロコシである。一態様では、BBM2ポリペプチドは、双子葉植物のポリペプチドである。一態様では、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ(Arabidopsis)またはワタである。一態様では、BBM2ポリペプチドは、配列番号20のアミノ酸配列を含む。一態様では、BBM2ポリペプチドは、配列番号19の配列を含むヌクレオチド配列によってコードされる。一態様では、この方法は、発根培地なしで行われる。一態様では、この方法は、発根培地の存在下で行われる。一態様では、外植体は未熟胚である。一態様では、未熟胚は、1~5mmの未熟胚である。一態様では、未熟胚は、3.5~5mmの未熟胚である。一態様では、細胞の形質転換の約7日後、または細胞の形質転換の約14日後の発芽期間中に、外因性サイトカイニンを使用する。一態様では、(a)のポリペプチドの発現は一過性である。一態様では、発芽は、外因性サイトカイニンの存在下で行われる。
種態様において、2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドは、双子葉植物のポリペプチドである。各種態様において、各種態様において、一態様では、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ(Arabidopsis)またはワタである。各種態様において、2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドは、配列番号18、20、63、65および67のいずれか1つのアミノ酸配列を含む。各種態様において、2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドは、配列番号17、19、21、62、64、66および68のいずれか1つを含むヌクレオチド配列によってコードされる。各種態様において、2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドは、ODP2ポリペプチドである。各種態様において、ODP2ポリペプチドは、単子葉植物のポリペプチドである。各種態様において、単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属(Setaria)種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである。各種態様において、単子葉植物は、トウモロコシ、イネまたはエノコログサ属(Setaria)種である。各種態様において、単子葉植物は、トウモロコシまたはイネである。各種態様において、ODP2は、双子葉植物のポリペプチドである。各種態様において、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ(Arabidopsis)またはワタである。各種態様において、ODP2ポリペプチドは、配列番号18、63、65および67のいずれか1つのアミノ酸配列を含む。各種態様において、ODP2ポリペプチドは、配列番号17、21、62、64、66および68のいずれか1つの配列を含むヌクレオチド配列によってコードされる。各種態様において、2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドは、BBM2ポリペプチドである。各種態様において、BBM2ポリペプチドは、単子葉植物のポリペプチドである。各種態様において、単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属(Setaria)種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである。各種態様において、単子葉植物は、トウモロコシ、サトウキビ、イネまたはエノコログサ属(Setaria)種である。各種態様において、単子葉植物は、トウモロコシまたはイネである。各種態様において、単子葉植物はトウモロコシである。各種態様において、BBM2ポリペプチドは、双子葉植物のポリペプチドである。各種態様において、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ(Arabidopsis)またはワタである。各種態様において、BBM2ポリペプチドは、配列番号20のアミノ酸配列を含む。各種態様において、BBM2ポリペプチドは、配列番号19の配列を含むヌクレオチド配列によってコードされる。各種態様において、外植体は単子葉植物に由来する。各種態様において、単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属(Setaria)種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである。各種態様において、外植体は双子葉植物に由来する。各種態様において、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ(Arabidopsis)またはワタである。各種態様において、細胞の形質転換から約0~約7日以内、または細胞の形質転換から約0~約14日以内に再生可能な植物構造体が形成され、細胞の形質転換から約14日~約60日でトランスジェニック植物が形成される。各種態様において、この方法は、発根培地なしで行われる。各種態様において、この方法は、発根培地の存在下で行われる。各種態様において、外植体は未熟胚である。各種態様において、未熟胚は、1~5mmの未熟胚である。各種態様において、未熟胚は、3.5~5mmの未熟胚である。各種態様において、細胞の形質転換の約7日後、または細胞の形質転換の約14日後の発芽期間中に、外因性サイトカイニンを使用する。各種態様において、(a)のポリペプチドの発現は一過性である。各種態様において、本方法により生産された植物の種子が提供される。
。各種態様において、2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドは、配列番号17、19、21、62、64、66および68のいずれか1つを含むヌクレオチド配列によってコードされる。各種態様において、2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドは、ODP2ポリペプチドである。各種態様において、ODP2ポリペプチドは、単子葉植物のポリペプチドである。各種態様において、単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属(Setaria)種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである。各種態様において、単子葉植物は、トウモロコシ、イネまたはエノコログサ属(Setaria)種である。各種態様において、単子葉植物は、トウモロコシまたはイネである。各種態様において、ODP2は、双子葉植物のポリペプチドである。各種態様において、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ(Arabidopsis)またはワタである。各種態様において、ODP2ポリペプチドは、配列番号18、63、65および67のいずれか1つのアミノ酸配列を含む。各種態様において、ODP2ポリペプチドは、配列番号17、21、62、64、66および68のいずれか1つの配列を含むヌクレオチド配列によってコードされる。各種態様において、2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドは、BBM2ポリペプチドである。各種態様において、BBM2ポリペプチドは、単子葉植物のポリペプチドである。各種態様において、単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属(Setaria)種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである。各種態様において、単子葉植物は、トウモロコシ、サトウキビ、イネまたはエノコログサ属(Setaria)種である。各種態様において、単子葉植物は、トウモロコシまたはイネである。各種態様において、単子葉植物はトウモロコシである。各種態様において、BBM2ポリペプチドは、双子葉植物のポリペプチドである。各種態様において、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ(Arabidopsis)またはワタである。各種態様において、BBM2ポリペプチドは、配列番号20のアミノ酸配列を含む。各種態様において、BBM2ポリペプチドは、配列番号19の配列を含むヌクレオチド配列によってコードされる。各種態様において、外植体は、単子葉植物に由来する。各種態様において、単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属(Setaria)種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである。各種態様において、外植体は、双子葉植物に由来する。各種態様において、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ(Arabidopsis)またはワタである。各種態様において、細胞の形質転換から約0~約7日以内、または細胞の形質転換から約0~約14日以内に再生可能な植物構造体が形成され、細胞の形質転換から約14日~約60日でトランスジェニック植物が形成される。各種態様において、この方法は、発根培地なしで行われる。各種態様において、この方法は、発根培地の存在下で行われる。各種態様において、外植体は未熟胚である。各種態様において、未熟胚は、1~5mmの未熟胚である。各種態様において、未熟胚は、3.5~5mmの未熟胚である。各種態様において、細胞の形質転換の約7日後、または細胞の形質転換の約14日後の発芽期間中に、外因性サイトカイニンを使用する。各種態様において、(a)のポリペプチドの発現は一過性である。各種態様において、本方法により生産された植物の種子が提供される。
単子葉植物はトウモロコシである。各種態様において、2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドは、双子葉植物のポリペプチドである。各種態様において、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ(Arabidopsis)またはワタである。各種態様において、2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドは、配列番号18、20、63、65および67のいずれか1つのアミノ酸配列を含む。各種態様において、2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドは、配列番号17、19、21、62、64、66および68のいずれか1つを含むヌクレオチド配列によってコードされる。各種態様において、2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドは、ODP2ポリペプチドである。各種態様において、ODP2ポリペプチドは、単子葉植物のポリペプチドである。各種態様において、単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属(Setaria)種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである。各種態様において、単子葉植物は、トウモロコシ、イネまたはエノコログサ属(Setaria)種である。各種態様において、単子葉植物は、トウモロコシまたはイネである。各種態様において、ODP2は、双子葉植物のポリペプチドである。各種態様において、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ(Arabidopsis)またはワタである。各種態様において、ODP2ポリペプチドは、配列番号18、63、65および67のいずれか1つのアミノ酸配列を含む。各種態様において、ODP2ポリペプチドは、配列番号17、21、62、64、66および68のいずれか1つの配列を含むヌクレオチド配列によってコードされる。各種態様において、2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドは、BBM2ポリペプチドである。各種態様において、BBM2ポリペプチドは、単子葉植物のポリペプチドである。各種態様において、単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属(Setaria)種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである。各種態様において、各種態様において、単子葉植物は、トウモロコシ、サトウキビ、イネまたはエノコログサ属(Setaria)種である。各種態様において、単子葉植物は、トウモロコシまたはイネである。各種態様において、単子葉植物はトウモロコシである。各種態様において、BBM2ポリペプチドは、双子葉植物のポリペプチドである。各種態様において、各種態様において、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ(Arabidopsis)またはワタである。各種態様において、BBM2ポリペプチドは、配列番号20のアミノ酸配列を含む。各種態様において、BBM2ポリペプチドは、配列番号19の配列を含むヌクレオチド配列によってコードされる。各種態様において、外植体は、単子葉植物に由来する。各種態様において、単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属(Setaria)種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである。各種態様において、外植体は、双子葉植物に由来する。各種態様において、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ(Arabidopsis)またはワタである。各種態様において、細胞の形質転換から約0~約7日以内、または細胞の形質転換から約0~約14日以内に再生可能な植物構造体が形成される。各種態様において、この方法は、発根培地なしで行われる。各種態様において、この方法は、発根培地の存在下で行われる。各種態様において、外植体は未熟胚である。各種態様において、未熟胚は、1~5mmの未熟胚である。各種態様において、未熟胚は、3.5~5mmの未熟胚である。各種態様において、細胞の形質転換の約7日後、または細胞の形質転換の約14日後の発芽期間中に、外因性サイトカイニンを使用する。各種態様において、(a)のポリペプチドの発現は一過性である。各種態様において、本方法により生産された植物の種子が提供される。
a)種である。各種態様において、単子葉植物は、トウモロコシまたはイネである。各種態様において、単子葉植物はトウモロコシである。各種態様において、2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドは、双子葉植物のポリペプチドである。各種態様において、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ(Arabidopsis)またはワタである。各種態様において、2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドは、配列番号18、20、63、65および67のいずれか1つのアミノ酸配列を含む。各種態様において、2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドは、配列番号17、19、21、62、64、66および68のいずれか1つを含むヌクレオチド配列によってコードされる。各種態様において、2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドは、ODP2ポリペプチドである。各種態様において、ODP2ポリペプチドは、単子葉植物のポリペプチドである。各種態様において、単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属(Setaria)種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである。各種態様において、単子葉植物は、トウモロコシ、イネまたはエノコログサ属(Setaria)種である。各種態様において、単子葉植物は、トウモロコシまたはイネである。各種態様において、ODP2は、双子葉植物のポリペプチドである。各種態様において、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ(Arabidopsis)またはワタである。各種態様において、ODP2ポリペプチドは、配列番号18、63、65および67のいずれか1つのアミノ酸配列を含む。各種態様において、ODP2ポリペプチドは、配列番号17、21、62、64、66および68のいずれか1つの配列を含むヌクレオチド配列によってコードされる。各種態様において、2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドは、BBM2ポリペプチドである。各種態様において、BBM2ポリペプチドは、単子葉植物のポリペプチドである。各種態様において、単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属(Setaria)種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである。各種態様において、単子葉植物は、トウモロコシ、サトウキビ、イネまたはエノコログサ属(Setaria)種である。各種態様において、単子葉植物は、トウモロコシまたはイネである。各種態様において、単子葉植物はトウモロコシである。各種態様において、BBM2ポリペプチドは、双子葉植物のポリペプチドである。各種態様において、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ(Arabidopsis)またはワタである。各種態様において、BBM2ポリペプチドは、配列番号20のアミノ酸配列を含む。各種態様において、BBM2ポリペプチドは、配列番号19の配列を含むヌクレオチド配列によってコードされる。各種態様において、外植体は、単子葉植物に由来する。各種態様において、単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属(Setaria)種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである。各種態様において、外植体は、双子葉植物に由来する。各種態様において、双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ(Arabidopsis)またはワタである。各種態様において、この方法は、発根培地なしで行われる。各種態様において、この方法は、発根培地の存在下で行われる。各種態様において、外植体は未熟胚である。各種態様において、未熟胚は、1~5mmの未熟胚である。各種態様において、未熟胚は、3.5~5mmの未熟胚である。各種態様において、細胞の形質転換の約7日後、または細胞の形質転換の約14日後の発芽期間中に、外因性サイトカイニンを使用する。各種態様において、(a)のポリペプチドの発現は一過性である。各種態様において、本方法により生産された植物の種子が提供される。
(項目1)
トランスジェニック植物の生産方法であって、
(a)
(i)WUS/WOXホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
(ii)2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または
(iii)(i)および(ii)の組み合わせ
を含む発現コンストラクトで外植体細胞を形質転換する工程と;
(b)形質転換された各細胞中で前記(a)のポリペプチドを発現させて、外因性サイトカイニンの非存在下で再生可能な植物構造体を形成する(但し、カルスは形成されない)工程と;
(c)前記再生可能な植物構造体を発芽させて前記トランスジェニック植物を形成する工程と
を含む方法。
(項目2)
トランスジェニック植物の生産方法であって、
(a)
(i)WUS/WOXホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
(ii)2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または
(iii)それらの組み合わせ
を含む発現コンストラクトで外植体細胞を形質転換する工程と;
(b)形質転換された各細胞中で(a)のポリペプチドを発現させて、外因性サイトカイニンの非存在下で再生可能な植物構造体を形成する(但し、カルスは形成されない)工程と;
(c)前記再生可能な植物構造体を発芽させて前記トランスジェニック植物を形成する工程と
を含み、
前記WUS/WOXホメオボックスポリペプチドが配列番号4、6、8、10、12、14および16のいずれか1つのアミノ酸配列を含むか;または前記WUS/WOXホメオボックスポリペプチドが配列番号3、5、7、9、11、13および15のいずれか1つのヌクレオチド配列によってコードされ;
前記2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドが配列番号18、20、63、65および67のいずれか1つのアミノ酸配列を含むか;または前記2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドが配列番号17、19、21、62、64、66および68のいずれか1つのヌクレオチド配列によってコードされる方法。
(項目3)
トランスジェニック植物の生産方法であって、
(a)
(i)WUS2ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
(ii)ODP2ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または
(iii)それらの組み合わせ
を含む発現コンストラクトで外植体細胞を形質転換する工程と;
(b)形質転換された各細胞中で(a)のポリペプチドを発現させて、外因性サイトカイニンの非存在下で再生可能な植物構造体を形成する(但し、カルスは形成されない)工程と;
(c)前記再生可能な植物構造体を発芽させて前記トランスジェニック植物を形成する工程と
を含み、
前記WUS2ポリペプチドが配列番号4のアミノ酸配列を含むか;または前記WUS2ポリペプチドが配列番号3のヌクレオチド配列によってコードされ;
前記ODP2ポリペプチドが配列番号18のアミノ酸配列を含むか;または前記2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドが配列番号17および21のいずれか1つのヌクレオチド配列によってコードされる方法。
(項目4)
トランスジェニック植物の生産方法であって、
(a)WUS/WOXホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクトで外植体細胞を形質転換する工程と;
(b)形質転換された各細胞中で前記(a)のポリペプチドを発現させて、外因性サイトカイニンの非存在下で再生可能な植物構造体を形成する(但し、カルスは形成されない)工程と;
(c)前記再生可能な植物構造体を発芽させて前記トランスジェニック植物を形成する工程と
を含む方法。
(項目5)
トランスジェニック植物の生産方法であって、
(a)2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクトで外植体細胞を形質転換する工程と;
(b)形質転換された各細胞中で前記(a)のポリペプチドを発現させて、外因性サイトカイニンの非存在下で再生可能な植物構造体を形成する(但し、カルスは形成されない)工程と;
(c)前記再生可能な植物構造体を発芽させて前記トランスジェニック植物を形成する工程と
を含む方法。
(項目6)
トランスジェニック植物の生産方法であって、
(a)
(i)WUS/WOXホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および
(ii)2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列
を含む発現コンストラクトで外植体細胞を形質転換する工程と;
(b)形質転換された各細胞中で前記(a)のポリペプチドを発現させて、外因性サイトカイニンの非存在下で再生可能な植物構造体を形成する(但し、カルスは形成されない)工程と;
(c)前記再生可能な植物構造体を発芽させて前記トランスジェニック植物を形成する工程と
を含む方法。
(項目7)
トランスジェニック植物の生産方法であって、
(a)
(i)WUS/WOXホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
(ii)2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または
(iii)(i)および(ii)の組み合わせ
を含む発現コンストラクトで外植体細胞を形質転換する工程と;
(b)形質転換された各細胞中で前記(a)のポリペプチドを発現させて、外因性サイトカイニンの非存在下で再生可能な植物構造体を形成する(但し、カルスは形成されない)工程と;
(c)前記(b)の再生可能な植物構造体を発芽させて、約14日~約60日で前記トランスジェニック植物を形成する工程と
を含む方法。
(項目8)
トランスジェニック植物の生産方法であって、
(a)
(i)WUS/WOXホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
(ii)2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または
(iii)(i)および(ii)の組み合わせ
を含む発現コンストラクトで外植体細胞を形質転換する工程と;
(b)形質転換された各細胞中で(a)のポリペプチドを発現させて、外因性サイトカイニンの非存在下で再生可能な植物構造体を形成する(但し、カルスは形成されず、かつ前記再生可能な植物構造体は前記細胞の形質転換から約0~7日以内または約0~14日以内に形成される)工程と;
(c)前記(b)の再生可能な植物構造体を発芽させて、前記細胞の形質転換から約14日~約60日で前記トランスジェニック植物を形成する工程と
を含む方法。
(項目9)
前記発現コンストラクトは、前記WUS/WOXホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、前記2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の両方を含む項目1~3および6~8のいずれか一項に記載の方法。
(項目10)
前記発現コンストラクトは、前記WUS/WOXホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む項目1~4および6~9のいずれか一項に記載の方法。
(項目11)
前記発現コンストラクトは、前記2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む項目1~3および5~9のいずれか一項に記載の方法。
(項目12)
前記WUS/WOXホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および/または前記2つのAP2結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現は、形質転換開始後、1日未満、2日未満、5日未満、7日未満、または約14日未満で起こる項目1~11のいずれか一項に記載の方法。
(項目13)
前記発現コンストラクトはさらに、部位特異的リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列を含む項目1~12のいずれか一項に記載の方法。
(項目14)
前記部位特異的リコンビナーゼは、FLP、Cre、SSV1、lambda Int、phi C31 Int、HK022、R、Gin、Tn1721、CinH、ParA、Tn5053、Bxb1、TP907-1、またはU153から選択される項目13に記載の方法。
(項目15)
前記部位特異的リコンビナーゼは、不安定化融合ポリペプチドである項目13または14に記載の方法。
(項目16)
前記不安定化融合ポリペプチドは、TETR(L17G)~CREまたはESR(L17G)~CREである項目15に記載の方法。
(項目17)
前記部位特異的リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列は、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、または発生的に調節されるプロモーターに作動可能に連結している項目13~16のいずれか一項に記載の方法。
(項目18)
前記WUS/WOXホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、または発生的に調節されるプロモーターに作動可能に連結している項目1~4、6~10および12~17のいずれか一項に記載の方法。
(項目19)
前記2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、または発生的に調節されるプロモーターに作動可能に連結している項目1~3、5~9および11~17のいずれか一項に記載の方法。
(項目20)
前記構成的プロモーターは、UBI、LLDAV、EVCV、DMMV、BSV(AY)PRO、CYMV PRO FL、UBIZM PRO、SI-UB3 PRO、SB-UBI PRO(ALT1)、USB1ZM PRO、ZM-GOS2 PRO、ZM-H1B PRO(1.2KB)、IN2-2、NOS、35Sの-135バージョン、またはZM-ADF PRO(ALT2)から選択される項目17~19のいずれか一項に記載の方法。
(項目21)
前記誘導性プロモーターは、AXIG1、DR5、XVE、GLB1、OLE、LTP2、HSP17.7、HSP26、HSP18A、またはテトラサイクリン、エタメトスルフロンもしくはクロルスルフロンによって活性化されるプロモーターから選択される項目17~19のいずれか一項に記載の方法。
(項目22)
前記発生調節プロモーターは、PLTP、PLTP1、PLTP2、PLTP3、LGL、LEA-14A、またはLEA-D34から選択される項目17~19のいずれか一項に記載の方法。
(項目23)
前記誘導性プロモーターは、化学誘導性プロモーターである項目17~19および21のいずれか一項に記載の方法。
(項目24)
前記化学誘導性プロモーターは、XVEである項目23に記載の方法。
(項目25)
前記化学誘導性プロモーターは、TETR、ESRまたはCRによって抑制され、脱抑制は、テトラサイクリン関連リガンドまたはスルホニル尿素リガンドの付加により起こる項目23または24に記載の方法。
(項目26)
前記リプレッサーはTETRであり、前記テトラサイクリン関連リガンドは、ドキシサイクリンまたはアンヒドロテトラサイクリンである項目25に記載の方法。
(項目27)
前記リプレッサーはESRであり、前記スルホニル尿素リガンドは、エタメツルフロン、クロルスルフロン、メツスルフロンメチル、スルホメツロンメチル、クロリムロンエチル、ニコスルフロン、プリミスルフロン、トリベヌロン、スルホスルフロン、トリフロキシスルフロン、ホラムスルフロン、ヨードスルフロン、プロスルフロン、チフェンスルフロン、リムスルフロン、メソスルフロン、またはハロスルフロンである項目25に記載の方法。
(項目28)
前記誘導性プロモーターは、オーキシン誘導性プロモーターである項目17~19および21のいずれか一項に記載の方法。
(項目29)
前記オーキシン誘導性プロモーターは、AXIG1である項目28に記載の方法。
(項目30)
前記AXIG1プロモーターは、配列番号39のヌクレオチド配列を含む項目29に記載の方法。
(項目31)
前記誘導性プロモーターは、オーキシン応答エレメントを含む項目17~19、21および28~30のいずれか一項に記載の方法。
(項目32)
前記誘導性プロモーターは、1つ以上のDR5エンハンサーモチーフを含む項目17~19、21、28および31のいずれか一項に記載の方法。
(項目33)
前記プロモーターは、抑制および脱抑制のために改変された弱い構成的プロモーターである項目17~19、21および25~32のいずれか一項に記載の方法。
(項目34)
前記プロモーター中の1つ以上のオペレーター配列は、TATAボックスおよび/または転写開始部位の近傍に、または重なって位置している項目33に記載の方法。
(項目35)
前記プロモーターは、NOS、AXIG1、ZM-GOS2、CC-UBI1-PROまたはZM-ADF4-PROから選択される項目33に記載の方法。
(項目36)
前記誘導性プロモーターは、配列番号40のヌクレオチド配列を含むDR5プロモーターである項目17~19、21、28および31~32のいずれか一項に記載の方法。
(項目37)
前記プロモーターは、脱抑制プロモーターである項目17~19、21および33のいずれか一項に記載の方法。
(項目38)
前記脱抑制プロモーターは、TETR、ESRまたはCRである項目17~19、21、25~27、33および37のいずれか一項に記載の方法。
(項目39)
前記発生調節プロモーターは、PLTP、PLTP1、PLTP2またはPLTP3から選択される項目17~19および22のいずれか一項に記載の方法。
(項目40)
前記PLTP、PLTP1、PLTP2またはPLTP3プロモーターは、単子葉植物に由来する項目22または39に記載の方法。
(項目41)
前記単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属(Setaria)種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである項目40に記載の方法。
(項目42)
前記単子葉植物は、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属(Setaria)種である項目41に記載の方法。
(項目43)
前記単子葉植物は、トウモロコシ、ソルガムまたはイネである項目42に記載の方法。
(項目44)
前記単子葉植物はトウモロコシである項目43に記載の方法。
(項目45)
前記PLTP、PLTP1、PLTP2またはPLTP3プロモーターは、双子葉植物に由来する項目22または39に記載の方法。
(項目46)
前記双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ(Arabidopsis)またはワタである項目45に記載の方法。
(項目47)
前記PLTP、PLTP1、PLTP2またはPLTP3プロモーターは、配列番号1~2および55~61のいずれか1つを含む項目22または39に記載の方法。
(項目48)
前記PLTPプロモーターは、配列番号1および2のいずれかいずれか1つを含む項目22、39および47のいずれか一項に記載の方法。
(項目49)
前記WUS/WOXホメオボックスポリペプチドは、WUS1、WUS2、WUS3、WOX2A、WOX4、WOX5またはWOX9ポリペプチドから選択される項目1~4、6~8、9~10、12~18および20~48のいずれか一項に記載の方法。
(項目50)
前記WUS/WOXホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、単子葉植物ヌクレオチドである項目1~4、6~8、9~10、12~18および20~49のいずれか一項に記載の方法。
(項目51)
前記単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属(Setaria)種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである項目50に記載の方法。
(項目52)
前記WUS/WOXホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、双子葉植物ヌクレオチドである項目1~4、6~8、9~10、12~18および20~49のいずれか一項に記載の方法。
(項目53)
前記双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ(Arabidopsis)またはワタである項目52に記載の方法。
(項目54)
WUS/WOXホメオボックスポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列は、配列番号4、6、8、10、12、14および16のいずれか1つを含むアミノ酸配列をコードする項目1~4、6~8、9~10、12~18および20~49のいずれか一項に記載の方法。
(項目55)
WUS/WOXホメオボックスポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列は、配列番号3、5、7、9、11、13および15のいずれか1つを含む項目1~4、6~8、9~10、12~18および20~49のいずれか一項に記載の方法。
(項目56)
前記WUS/WOXホメオボックスポリペプチドは、WUS1ポリペプチドである項目1~4、6~8、9~10、12~18および20~49のいずれか一項に記載の方法。
(項目57)
前記WUS1ポリペプチドは、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属(Setaria)種のWUS1ポリペプチドである項目56に記載の方法。
(項目58)
前記WUS1ポリペプチドは、トウモロコシまたはイネのWUS1ポリペプチドである項目57に記載の方法。
(項目59)
前記WUS1ポリペプチドは、トウモロコシのWUS1ポリペプチドである項目58に記載の方法。
(項目60)
前記WUS1ポリペプチドは、配列番号4のアミノ酸配列を含む項目56または59に記載の方法。
(項目61)
前記WUS1ポリペプチドは、配列番号3を含むヌクレオチド配列によってコードされる項目56または59に記載の方法。
(項目62)
前記WUS/WOXホメオボックスポリペプチドは、WUS2ポリペプチドである項目1~4、6~8、9~10、12~18および20~49のいずれか一項に記載の方法。
(項目63)
前記WUS2ポリペプチドは、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属(Setaria)種のWUS2ポリペプチドである項目62に記載の方法。
(項目64)
前記WUS2ポリペプチドは、トウモロコシまたはイネのWUS2ポリペプチドである項目63に記載の方法。
(項目65)
前記WUS2ポリペプチドは、トウモロコシのWUS2ポリペプチドである項目64に記載の方法。
(項目66)
前記WUS2ポリペプチドは、配列番号6のアミノ酸配列を含む項目62または65に記載の方法。
(項目67)
前記WUS2ポリペプチドは、配列番号5を含むヌクレオチド配列によってコードされる項目63または65に記載の方法。
(項目68)
前記WUS/WOXホメオボックスポリペプチドは、WUS3ポリペプチドである項目1~4、6~8、9~10、12~18および20~49のいずれか一項に記載の方法。
(項目69)
前記WUS3ポリペプチドは、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属(Setaria)種のWUS3ポリペプチドである項目68に記載の方法。
(項目70)
前記WUS3ポリペプチドは、トウモロコシまたはイネのWUS3ポリペプチドである項目69に記載の方法。
(項目71)
前記WUS3ポリペプチドは、トウモロコシのWUS3ポリペプチドである項目70に記載の方法。
(項目72)
前記WUS3ポリペプチドは、配列番号8のアミノ酸配列を含む項目68または71に記載の方法。
(項目73)
前記WUS3ポリペプチドは、配列番号7を含むヌクレオチド配列によってコードされる項目68または71に記載の方法。
(項目74)
前記WUS/WOXホメオボックスポリペプチドは、WOX5ポリペプチドである項目1~4、6~8、9~10、12~18および20~49のいずれか一項に記載の方法。
(項目75)
前記WOX5ポリペプチドは、WOX5Aポリペプチドである項目74に記載の方法。
(項目76)
前記WOX5ポリペプチドは、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属(Setaria)種のWOX5ポリペプチドである項目74または75に記載の方法。
(項目77)
前記WOX5ポリペプチドは、トウモロコシまたはイネのWOX5ポリペプチドである項目74または75に記載の方法。
(項目78)
前記WOX5ポリペプチドは、トウモロコシのWOX5ポリペプチドである項目74または75に記載の方法。
(項目79)
前記WOX5ポリペプチドは、配列番号14のアミノ酸配列を含む項目74~75および78のいずれか一項に記載の方法。
(項目80)
前記WOX5ポリペプチドは、配列番号13を含むヌクレオチド配列によってコードされる項目74~75および78のいずれか一項に記載の方法。
(項目81)
前記2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドは、ODP2、BBM2、BMN2またはBMN3ポリペプチドである項目1~3、5~9、11~17および19~48のいずれか一項に記載の方法。
(項目82)
前記2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドは、単子葉植物のポリペプチドである項目1~3、5~9、11~17、19~48および81のいずれか一項に記載の方法。
(項目83)
前記単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属(Setaria)種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである項目82に記載の方法。
(項目84)
前記単子葉植物は、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属(Setaria)種である項目83に記載の方法。
(項目85)
前記単子葉植物は、トウモロコシまたはイネである項目84に記載の方法。
(項目86)
前記単子葉植物はトウモロコシである項目85に記載の方法。
(項目87)
前記2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドは、双子葉植物のポリペプチドである項目1~3、5~9、11~17、19~48および81のいずれか一項に記載の方法。
(項目88)
前記双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ(Arabidopsis)またはワタである項目87に記載の方法。
(項目89)
前記2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドは、配列番号18、20、63、65および67のいずれか1つのアミノ酸を含む項目1~3、5~9、11~17および19~48のいずれか一項に記載の方法。
(項目90)
前記2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドは、配列番号17、19、21、62、64、66および68のいずれか1つを含むヌクレオチド配列によってコードされる項目1~3、5~9、11~17および19~48のいずれか一項に記載の方法。
(項目91)
前記2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドは、ODP2ポリペプチドである項目1~3、5~9、11~17および19~48のいずれか一項に記載の方法。
(項目92)
前記ODP2ポリペプチドは、単子葉植物のポリペプチドである項目91に記載の方法。
(項目93)
前記単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属(Setaria)種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである項目92に記載の方法。
(項目94)
前記単子葉植物は、トウモロコシ、イネまたはエノコログサ属(Setaria)種である項目93に記載の方法。
(項目95)
前記単子葉植物は、トウモロコシまたはイネである項目94に記載の方法。
(項目96)
前記ODP2ポリペプチドは、双子葉植物のポリペプチドである項目91に記載の方法。
(項目97)
前記双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ(Arabidopsis)またはワタである項目96に記載の方法。
(項目98)
前記ODP2ポリペプチドは、配列番号18、63、65および67のいずれか1つのアミノ酸配列を含む項目91または92に記載の方法。
(項目99)
前記ODP2ポリペプチドは、配列番号17、21、62、64、66および68のいずれか1つを含むヌクレオチド配列によってコードされる項目91または92に記載の方法。
(項目100)
前記2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドは、BBM2ポリペプチドである項目1~3、5~9、11~17および19~48のいずれか一項に記載の方法。
(項目101)
前記BBM2ポリペプチドは、単子葉植物のポリペプチドである項目100に記載の方法。
(項目102)
前記単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属(Setaria)種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである項目101に記載の方法。
(項目103)
前記単子葉植物は、トウモロコシ、サトウキビ、イネまたはエノコログサ属(Setaria)種である項目102に記載の方法。
(項目104)
前記単子葉植物は、トウモロコシまたはイネである項目103に記載の方法。
(項目105)
前記単子葉植物はトウモロコシである項目104に記載の方法。
(項目106)
前記BBM2ポリペプチドは、双子葉植物のポリペプチドである項目100に記載の方法。
(項目107)
前記双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ(Arabidopsis)またはワタである項目106に記載の方法。
(項目108)
前記BBM2ポリペプチドは、配列番号20のアミノ酸配列を含む項目100または101に記載の方法。
(項目109)
前記BBM2ポリペプチドは、配列番号19の配列を含むヌクレオチド配列によってコードされる項目100または101に記載の方法。
(項目110)
前記細胞の形質転換から約0~約7日以内、または前記細胞の形質転換から約0~約14日以内に前記再生可能な植物構造体が形成され、前記細胞の形質転換から約14日~前記細胞の形質転換から約60日で前記トランスジェニック植物が形成される項目1~109のいずれか一項に記載の方法。
(項目111)
発根培地なしで行われる項目1~110のいずれか一項に記載の方法。
(項目112)
発根培地の存在下で行われる項目1~1110のいずれか一項に記載の方法。
(項目113)
前記外植体は未熟胚である項目1~112のいずれか一項に記載の方法。
(項目114)
前記未熟胚は、1~5mmの未熟胚である項目113に記載の方法。
(項目115)
前記未熟胚は、3.5~5mmの未熟胚である項目113に記載の方法。
(項目116)
前記細胞の形質転換の約7日後、または細胞の形質転換の約14日後の発芽期間中に、外因性サイトカイニンを使用する項目1~115のいずれか一項に記載の方法。
(項目117)
前記(a)のポリペプチドの発現は一過性である項目1~8のいずれか一項に記載の方法。
(項目118)
発芽は、外因性サイトカイニンの存在下で行われる項目1~117のいずれか一項に記載の方法。
本特許または本出願書類は、少なくとも1つのカラーで作成された図面を含む。カラー図面を有する本特許または本特許出願公開物の写しは、請求があり、必要な料金が支払われれば、特許庁から提供されるであろう。
本開示は、トランスジェニック植物を作製するための方法および組成物であって、(a)(i)WUS/WOXホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、(ii)2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または(iii)(i)および(ii)の組み合わせを含む発現コンストラクトを有する外植体細胞を形質転換する工程と;(b)形質転換された各細胞中で(a)のポリペプチドを発現させて、外因性サイトカイニンの非存在下で再生可能な植物構造体を形成する(但し、カルスは形成されない)工程と;(c)再生可能な植物構造体を発芽させてトランスジェニック植物を形成する工程とを含む方法および組成物を含む。再生可能な植物構造体は、約0~7日または約0~14日以内に作製される。一態様では、発芽工程は、外因性サイトカイニンを含む成熟培地への再生可能な植物構造体の移行、およびトランスジェニック植物の形成を含む。一態様では、WUS/WOXホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、再生可能な植物構造体の形成を促進することができる。一態様では、2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、再生可能な植物構造体の形成を促進することができる。
本開示の方法は、胚珠発育タンパク質2(ODP2)ポリペプチド、および、例えばベビーブーム(Babyboom)(BBM)タンパク質ファミリータンパク質などの関連ポリペプチドの、ポリヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を含む。一態様では、2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドは、ODP2、BBM2、BMN2またはBMN3ポリペプチドである。本開示のODP2ポリペプチドは、2つの予測APETALA2(AP2)ドメインを含み、AP2タンパク質ファミリーに属する(PFAMアクセッション PF00847)。トウモロコシODP2ポリペプチドのAP2ドメインは、配列番号2のアミノ酸の略S273~N343および略S375~R437に位置している。推定転写因子のAP2ファミリーは、広範な発達プロセスを調節することがわかっており、ファミリーのメンバーは、AP2 DNA結合ドメインを有することを特徴としている。この保存コアはDNAに結合する両親媒性のアルファヘリックスを形成すると予想される。AP2ドメインは最初にAPETALA2、すなわち、分裂組織の決定、花器の特定、種皮の発達、および花芽のホメオティック遺伝子の発現を調節するシロイヌナズナ(Arabidopsis)のタンパク質で確認された。今では、AP2ドメインは様々なタンパク質で見出されている。
本開示の方法は、WUS/WOXホメオボックスポリペプチドのポリヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を含む。Wuschelタンパク質(以下、WUSという)は、多能性幹細胞プールを含む頂端分裂組織の開始および維持に重要な役割を果たす(Endrizzi,et al.,(1996)Plant Journal 10:967-979;Laux,et al.,(1996)Development 122:87-96;およびMayer,et al.,(1998)Cell 95:805-815)。WUS遺伝子用のシロイヌナズナ(Arabidopsis)植物変異体は、特定されておらず、分化するように見える幹細胞を含む。WUSは、転写調節因子として機能すると推定される新規のホメオドメインタンパク質をコードする(Mayer,et al.,(1998)Cell95:805-815)。シロイヌナズナ(Arabidopsis)シュート分裂組織の幹細胞集団は、器官の開始を促進するCLAVATA(CLV)遺伝子と幹細胞同一性に必要なWUS遺伝子との間の調節ループによって維持される(CLV遺伝子が転写レベルでWUSを抑制し、WUSが分裂組織細胞同一性と幹細胞マーカーCLV3の発現を十分に誘導し得るだけ発現する)と考えられている(Brand,et al.,(2000)Science 289:617-619;Schoof,et al.,(2000)Cell 100:635-644)。シロイヌナズナ(Arabidopsis)におけるWUSの構成的発現が葉からの不定のシュート増殖(植物内で)に導くことが示された(Laux,T.,第XVI回国際植物科学会議(the XVI International Botanical Congress Meeting),Aug.1-7,1999,St.Louis,Mo.での発表)。
本開示の方法および組成物は、様々な形質転換の方法に適宜使用することができる。すなわち、形質転換のプロトコル、およびヌクレオチド配列を植物へ導入するためのプロトコルは、形質転換の標的とする植物または植物細胞の種類に応じて、すなわち、単子葉植物であるか双子葉植物であるかに応じて変えることができる。ヌクレオチド配列の植物細胞への導入、およびその後の植物ゲノムへの挿入に好適な方法としては、マイクロインジェクション法(Crossway et al.(1986)Biotechniques4:320-334)、エレクトロポレーション法(Riggs et al.(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA83:5602-5606、アグロバクテリウム(Agrobacterium)媒介形質転換法(Townsend et al.の米国特許第5,563,055号明細書、Zhao et al.の米国特許第5,981,840号明細書)、遺伝子直接導入法(Paszkowski et al.(1984)EMBO J.3:2717-2722)および弾道粒子加速法(ballistic particle acceleration)(例えば、Sanford et al.の米国特許第4,945,050号明細書、Tomes et al.の米国特許第5,879,918号明細書、Tomes et al.の米国特許第5,886,244号明細書、Bidney et al.の米国特許第5,932,782号明細書、Tomes et al.(1995)“Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment、”in Plant Cell,Tissue,and Organ Culture:Fundamental Methods,ed.Gamborg and Phillips(Springer-Verlag,Berlin);およびMcCabe et al.(1988)Biotechnology 6:923-926を参照)が挙げられる。また、Weissinger et al.(1988)Ann.Rev.Genet.22:421-477、Sanford et al.(1987)Particulate Science and Technology5:27-37(タマネギ)、Christou et al.(1988)Plant Physiol.87:671-674(ダイズ)、McCabe et al.(1988)Bio/Technology 6:923-926(ダイズ)、Finer and McMullen(1991)In Vitro Cell Dev.Biol.27P:175-182(ダイズ)、Singh et al.(1998)Theor.Appl.Genet.96:319-324(ダイズ)、Datta et al.(1990)Biotechnology 8:736-740(イネ)、Klein et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:4305-4309(トウモロコシ)、Klein et al.(1988)Biotechnology 6:559-563(トウモロコシ);Tomesの米国特許第5,240,855号明細書、Buising et al.の米国特許第5,322,783号明細書および同第5,324,646号明細書、Tomes et al.(1995)“Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment、”in Plant Cell,Tissue,and Organ Culture:Fundamental Methods,ed.Gamborg(Springer-Verlag,Berlin)(トウモロコシ);Klein et al.(1988)Plant Physiol.91:440-444(トウモロコシ)、Fromm et al.(1990)Biotechnology 8:833-839(トウモロコシ)、Hooykaas-Van Slogteren et al.(1984)Nature(London)311:763-764、Bowen et al.の米国特許第5,736,369号明細書(穀類);Bytebier et al.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:5345-5349(ユリ科(Liliaceae))、De Wet et al.(1985)in The Experimental Manipulation of Ovule Tissues、ed.Chapman et al.(Longman、New York)、pp.197-209(花粉);Kaeppler et al.(1990)Plant Cell Reports 9:415-418およびKaeppler et al.(1992)Theor.Appl.Genet.84:560-566(ウィスカー媒介形質転換);D’Halluin et al.(1992)Plant Cell 4:1495-1505;Li et al.(1993)Plant Cell Reports 12:250-255およびChristou and Ford(1995)Annals of Botany 75:407-413(イネ)、Osjoda et al.(1996)Nature Biotechnology 14:745-750(トウモロコシ、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)による)(これらの文献は全て参照により本明細書に組み込まれる)も参照されたい。
本開示は、高効率かつ高速で形質転換されたトランスジェニック植物を産生するための新規な組成物および方法を提供する。本開示の方法および組成物は、さらに、良好な形質および特性を与えるポリヌクレオチドを含む。
一態様において、本開示の方法および組成物は、植物中の標的遺伝子の抑制に有用なポリヌクレオチドを高効率かつ高速で植物に導入するために使用することができる。植物における遺伝子操作のいくつかの態様では、特定の遺伝子の活性低下(遺伝子サイレンシングまたは遺伝子抑制としても知られる)が望まれる。多くの遺伝子サイレンシング技術が当業者に知られており、例えば、限定はされないが、アンチセンス技術(例えば、Sheehy et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:8805-8809、ならびに米国特許第5,107,065号明細書、同第5,453,566号明細書および同第5,759,829号明細書を参照);コサプレッション(例えば、Taylor(1997)Plant Cell 9:1245、Jorgensen(1990)Trends Biotech.8(12):340-344、Flavell(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:3490-3496、Finnegan et al.(1994)Bio/Technology 12:883-888およびNeuhuber et al.(1994)Mol.Gen.Genet.244:230-241);RNA干渉(Napoli et al.(1990)Plant Cell 2:279-289、米国特許第5,034,323号明細書;Sharp(1999)Genes Dev.13:139-141、Zamore et al.(2000)Cell 101:25-33、Javier(2003)Nature 425:257-263、およびMontgomery et al.(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:15502-15507);ウイルス誘導遺伝子サイレンシング(Burton,et al.(2000)Plant Cell 12:691-705、およびBaulcombe(1999)Curr.Op.Plant Bio.2:109-113);標的RNA特異的リボザイム(Haseloff et al.(1988)Nature 334:585-591);ヘアピン構造(Smith et al.(2000)Nature 407:319-320、国際公開第WO99/53050号パンフレット、同第02/00904号パンフレットおよび同第98/53083号パンフレット);リボザイム(Steinecke et al.(1992)EMBO J.11:1525、米国特許第4,987,071号明細書、およびPerriman et al.(1993)Antisense Res.Dev.3:253);オリゴヌクレオチド媒介標的改変(例えば、国際公開第03/076574号パンフレットおよび同第99/25853号パンフレット);Znフィンガー標的分子(例えば、国際公開第01/52620号パンフレット、同第03/048345号パンフレットおよび同第00/42219号パンフレット);人工マイクロRNA(US8106180、Schwab et al.(2006)Plant Cell 18:1121-1133);および当業者に知られる他の方法、または上記方法の組み合わせが挙げられる。
一態様において、本開示の方法および組成物は、植物体のゲノムの改変に特異的な部位を標的とするのに有用なポリヌクレオチドを高効率かつ高速で植物に導入するために使用することができる。本開示の方法および組成物によって導入することができる部位特異的改変としては、部位特異的改変を導入する任意の方法によるもの、例えば、限定はされないが、遺伝子修復オリゴヌクレオチドの使用(例えば、米国特許出願公開第2013/0019349号明細書)、または、TALEN、マガヌクレオチド、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、CRISPR-Casなどの二本鎖切断技術によるものが挙げられる。例えば、植物もしくは植物細胞のゲノム中の標的配列の改変のために、植物を選択するために、塩基または配列を欠失させるために、遺伝子編集のために、そして目的ポリヌクレオチドを植物のゲノムに挿入するために、本開示の方法および組成物を使用して、CRISPR-Casシステムを植物細胞へ導入することができる。したがって、本開示の方法および組成物は、CRISPR-Casシステムと共に使用して、植物体、植物細胞または種子のゲノム中の標的部位および目的ヌクレオチドを変更または改変するのに提供することができる。
一態様において、本開示の方法および組成物は、植物体へのヌクレオチド配列の標的組み込みに有用なポリヌクレオチドを、高効率かつ高速に植物へ導入するために使用することができる。例えば、本開示の方法および組成物は、標的部位を含む植物体を形質転換するために、非同一組み換え部位が隣接する目的ヌクレオチド配列を含むトランスファーカセットを導入するのに使用することができる。一態様では、標的部位は、トランスファーカセット上のそれに対応した、非同一組み換え部位を少なくとも1セット含む。組み換え部位が隣接するヌクレオチド配列の置換は、リコンビナーゼにより影響を受ける。このように、本開示の方法および組成物は、ヌクレオチド配列の標的組み込みのためのトランスファーカセットの導入に使用することができ、非同一組み換え部位が隣接するトランスファーカセットは、非同一組み換え部位を認識し、非同一組み換え部位で組み換えを行うリコンビナーゼにより認識される。したがって、本開示の方法および組成物は、再生可能な植物構造体由来の、非同一組み換え部位を含有する植物体の生長の効率および速度の改善に使用することができる。
対照的に、本開示は、植物ゲノムにおけるヌクレオチド配列の置換、ターゲティング、配置、挿入および発現の制御に、非同一FRTを使用する。
本明細書の下記実験では、表1に示すT-DNAを含むプラスミドを使用した。表1に示すプラスミドは、表示の成分を含有するT-DNAを宿す。
実施例では、形質転換および細胞培養で使用する各種培地が参照される。培地組成を下記の表2~9に示す。
衝撃の前に、10~12DAPにPioneer近交系PH184Cトウモロコシの雌穂から未熟胚を分離し、16%スクロースを加えた培養培地上に3時間置き、胚盤細胞を原形質分離した。
A.アグロバクテリウム(Agrobacterium)マスタープレートの調製
バイナリードナーベクターを宿すアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)を、-80℃の凍結アリコートから固体12V培地上にストリークし、28℃の暗所で2~3日間培養し、マスタープレートを作った。
アグロバクテリウム属(Agrobacterium)の単一コロニーまたは複数のコロニーをマスタープレートから採取し、810I培地を含有する第2のプレートにストリークし、28℃の暗所で1~2日間インキュベートした。フード中で、アグロバクテリウム(Agrobacterium)感染培地(700培地;5ml)および100mMの3’-5’-ジメトキシ-4’-ヒドロキシアセトフェノン(アセトシリンゴン;5μL)を14mLのコニカルチューブに加えた。白金耳約3杯の、第2のプレートからのアグロバクテリウム属(Agrobacterium)をチューブに懸濁させ、その後、チューブをボルテックスして、均一な懸濁液とした。懸濁液(1ml)を分光光度計のチューブに移し、懸濁液の光学濃度(550nm)を約0.35~2.0の読みに調節した。アグロバクテリウム属(Agrobacterium)の濃度は約0.5~2.0×109cfu/mLであった。2mLのマイクロ遠心チューブのそれぞれが懸濁液1mLを含有するように、最終のアグロバクテリウム属(Agrobacterium)懸濁液を分取した。その後、できるだけ早く懸濁液を使用した。
あるいは、アグロバクテリウム属(Agrobacterium)は、液体培地での培養により形質転換用として調製することができる。感染の1日前に、30mlの557A培地(10.5g/lのリン酸水素二カリウム、4.5g/lのリン酸水素一カリウム無水物、1g/lの硫酸アンモニウム、0.5g/lのクエン酸ナトリウム脱水物、10g/lのスクロース、1mMの硫酸マグネシウム)、ならびに30μLのスペクチノマイシン(50mg/mL)および30μLのアセトシリンゴン(20mg/mL)が入った125mlのフラスコを準備した。白金耳に半量の、第2のプレートからのアグロバクテリウム属(Agrobacterium)をフラスコに懸濁させ、200rpmに設定したオービタルシェーカーにセットし、28℃で終夜インキュベートした。アグロバクテリウム属(Agrobacterium)培養物を5000rpmで10分間遠心分離した。上清を除き、アセトシリンゴン溶液を含むアグロバクテリウム属(Agrobacterium)感染培地を加えた。ボルテックスして細菌を再懸濁させ、アグロバクテリウム属(Agrobacterium)懸濁液の光学濃度(550nm)を約0.35~2.0の読みに調節した。
Tween20を1滴加えた20%(体積/体積)漂白剤(5.25%次亜塩素酸ナトリウム)中で、トウモロコシ(Zea mays L)品種の雌穂の表面を15~20分間滅菌し、続いて滅菌水で3回洗浄した。未熟胚(IE)をトウモロコシの雌穂から分離し、アセトシリンゴン溶液を含む2mlのアグロバクテリウム属(Agrobacterium)感染培地に移した。胚の最適サイズは近交系により変化するが、WUS2およびODP2による形質転換では、幅広いサイズの未熟胚を使用することができるであろう。溶液を抜き出し、1mlのアグロバクテリウム属(Agrobacterium)懸濁液を胚に加え、チューブを5~10秒間ボルテックスした。フード内で5分間、マイクロチューブを静置した。アグロバクテリウム属(Agrobacterium)と胚の懸濁液を710I共培養培地(表9を参照)上に注いだ。チューブ内に残った胚を、滅菌したスパチュラを使用してプレートに移した。アグロバクテリウム属(Agrobacterium)懸濁液を抜き出し、胚を軸側を下にして培地上に置いた。Parafilm M(登録商標)フィルム(耐湿柔軟性プラスチック、BemisCompany、Inc.,1 Neenah Center 4thfloor,POBox 669,Neenah,WI 54957から入手可能)でプレートを密封し、21℃の暗所で1~3日間の共培養のためにインキュベートした。
以下の実験は、ODP2およびWUS2の発現が、アグロバクテリウム属(Agrobacterium)の感染直後から直接的な体細胞胚の形成をもたらすことを示した。
授粉から約11日後、Pioneerトウモロコシ近交系PH184Cから未熟胚(長さ2~2.5mm)を収穫し、実施例3の記載のように、以下の組成を有するT-DNA含有アグロバクテリウム属(Agrobacterium)株AGL1を感染させた;RB+NOS PRO::Top2::ZM-WUS2::IN2-1 TERM+ZM-PLTP PRO::ZM-ODP2::OS-T28 TERM+GZ-W64A TERM+UBI PRO::UBI1ZM INTRON::ESR::SB-SAG12 TERM+SB-ALS PRO::HRA::SB-PEPC1 TERM+LTP2 PRO::ZS-YELLOW::PINII TERM-LB。PLTP PROについては、配列番号1を参照されたい。アグロバクテリウム属(Agrobacterium)菌を、光学密度が0.5(520nmで)になるまで液体培地で培養し、未成熟胚(3つの別個の耳からの、約53、52、および56の胚)をこのアグロバクテリウム属(Agrobacterium)懸濁液中で5分間インキュベートした後、液体から取り出して710I固体培地上に置いた。
この実験は2回反復して行ったが、2回の反復間で、開始未熟胚の数と、実験の成功段階へ進む胚(または植物体)の数のみが相違した。両反復実験で、Pioneer近交系PH184Cからの未熟胚に、以下のT-DNA(PHP77833からの)を含有するアグロバクテリウム属(Agrobacterium)株AGL1(THY-)を感染させた;RB+NOS PRO::Top2::ZM-WUS2::IN2-1 TERM+ZM-PLTP PRO::ZM-ODP2::OS-T28 TERM+GZ-W64A TERM+UBI PRO:UBI1ZM INTRON:ESR::SB-SAG12 TERM+SB-ALS PRO::HRA::SB-PEPC1 TERM+LTP2 PRO::ZS-YELLOW::PINII TERM-LB。アグロバクテリウム属(Agrobacterium)液体懸濁物中で5分間感染させた後、未熟胚を固体培養培地(270I培地)に移し、終夜置いた。翌日、胚を3種の培地、すなわち605T;0.1mg/lのエタメツルフロン(選択のための除草剤イマザピル(0.1mg/l)も含有)に分枝アミノ酸(「AA」と略記、100mMのロイシン、イソロイシン、またはバリンを含有)を加えた605T;または0.1mg/lのエタメツルフロン(選択のための除草剤イマザピル(0.1mg/l)も含有)を含むが、分枝アミノ酸は含まない605Tの1つに移した。12日後、胚を成熟培地に移した。すなわち、605T培地の胚を0.1mg/lのイマザピル含有289Q培地(成熟中に選択)へ移し、0.1mg/lのエタメツルフロンおよびAAを含む培地605T培地の胚を289Q培地(早期に選択され、成熟中は選択されない)へ移し、そして0.1mg/lのエタメツルフロンを含む培地605Tの胚を289Q培地(早期に選択)に移した。16日後、健康な体細胞胚を有する胚を再生培地272V培地に移した。
両処理で、Pioneer近交系PH184Cから未熟胚を収穫し、それぞれのプラスミドを含有するアグロバクテリウム属(Agrobacterium)株AGL1(THY-)で処理し、アグロバクテリウム属(Agrobacterium)を含む培地710Iで1日間の共培養を行った後、605T培地へ移し、605T培地で10日間培養し、0.1mg/lのエタメツルフロンを含む13226Dに移して2日間置き、その後成熟培地(0.1mg/lのイマザピルを含む289Q)に移して13日間置いた。成熟後、小植物体(イベント)を発根(発芽)培地13158に移して10日間置いた(発根段階)。
80個の未熟胚をPHP78157(配列番号23)含有アグロバクテリウム属(Agrobacterium)で処理した。最初、処理した全ての未熟胚は、各胚盤表面に多数の個々の体細胞胚を急速に生成することにより反応した。発根段階の終わりには、18個の小植物体が生じた。10個の植物体のサブセットを温室に送り、PCR分析用の試料とした(温室までの全経過日数は46日であった)。これら10個の中で、6個はマルチコピーであり、かつ/またはプラスミド主鎖(BB)を含有しており、4個のエスケープがあった。
70個の未熟胚を、PHP78156を含有し、かつ下記のものを含有するT-DNAを宿すアグロバクテリウム属(Agrobacterium)で処理した:RB+NOS PRO::Top2::WUS2::IN2-1 TERM+DR5 PRO:Top3:ODP2::OS-T28 TERM+GZ-W64A TERM+UBI PRO::ESR::SB-SAG12 TERM+SB-ALS PRO::HRA::SB-PEPC1 TERM+LTP2 PRO::ZS-YELLOW::PINII TERM-LB(配列番号24)。
PLTPプロモーターの制御下にあるODP2の発現、およびAXIG1プロモーターの制御下にあるWUS2の発現は、植物体回収の改善、温室へ送られる植物体の高頻度化、およびシングルコピーイベントの一層の高頻度化をもたらした。
元の接合未熟胚の支持胚盤から体細胞胚を分離することにより、独立したトランスジェニック植物体の回収が改善された。
Pioneer近交系PHH5Gからの未熟胚を、プラスミドPHP79066(配列番号28)(表1を参照)を宿すアグロバクテリウム属(Agrobacterium)株AGL1(THY-)を使用して形質転換した。45個の未熟胚とアグロバクテリウム属(Agrobacterium)とを、培地710I上で1日間共培養した後、未熟胚を静止培地(605T培地)に移して選択せずに12日間置いた。胚を成熟培地に移して13日間置いたところ、元は単一の接合未熟胚から得られたものであることが、複数の成熟体細胞胚で明瞭に観察された(図3)。この時点で、胚を固体培地から移し、液体培養液(289R培地)中に入れた。その後、組織が分散したように見えるまで、懸濁液を10~15秒毎に目視で観察しながら、懸濁したトウモロコシ組織を含有するチューブを30~60秒間、高出力でボルテックスした。その後、液体懸濁液を固体発根培地(0.1mg/lのイマザピル除草剤を含む13158H培地)に注ぎ、液体分をピペットでプレートから取り除いた。この材料から、200を超える植物体が生成され(代表的な植物体を図4に示す)、形質転換された各出発胚から平均4.4個の植物体が回収された。約200個のT0植物体の中で、152個をPCR分析用の試料とし、その結果に基づけば全部が形質転換されており(エスケープなし)、43植物体が導入遺伝子に関してアグロの主鎖を含まないシングルコピーであった(シングルコピーでBBなし 28.3%)。この頻度、回収されたT0植物体の総数および胚の出発時の数に基づけば、品質を伴った生成物、すなわち使用可能なT0イベント(シングルコピー、主鎖なし)は出発時の胚の数に対して100%を超えた。
A.UBI::CRE::PINII媒介切除。
Pioneer近交系HC69(293個の胚)およびPH184C(241個の胚)から未熟胚を収穫し、表1に示す遺伝子成分を含有するプラスミドPHP80334(配列番号42)を宿すアグロバクテリウム属(Agrobacterium)株AGL1(THY-)で形質転換した。液体培地710I中でアグロバクテリウム属(Agrobacterium)に5分間曝露した後、終夜の共培養のために胚をプレートから寒天固化710I培地に移した。1日間の共培養の後、胚を静止培地(選択剤なしの605T)に移して7日間置き、成熟培地(0.1mg/lのイマザピルを含む289Q)に移して14日間置き、その後、発根(発芽)培地に移して少なくとも14日間置き、その後、植物体を温室に移した。形質転換された胚の元の数に対して、19.1%および13.8%の元の胚が、それぞれHC69およびPH184Cでトランスジェニック植物体を生成した。切除の頻度を決定するために、7回のPCR反応を行って、CRE、WUS2、ODP2、ZS-GREEN1およびESR発現カセット(すなわち、当初T-DNA内の2つのLOXP部位間に存在した、全てのポリヌクレオチドセグメント)の非存在、ならびにHRA発現カセットの存在を試験した。PCRの結果により、HRA発現カセット(除草剤イマザピルに対する耐性を付与する)のみを含有する、21%のHC69植物体で、2つの元のLOXP部位間の断片が切除されていることが明らかになった。したがって、これらの植物体はもはやCRE、WUS2、ODP2、ZS-GREEN1およびESR発現カセットを含有していない。他の全てのカセットが切除され、HRAカセットが存在することを植物体で分析すると、PH184Cでの切除の頻度は、47%の植物体で完全完璧な切除がなされたことを示しており、HC69よりも高かった。
Pioneer近交系PH184Cから未熟胚を収穫し、表1に示す遺伝子成分を含有するプラスミドPHP80338(配列番号43)を宿すアグロバクテリウム属(Agrobacterium)株AGL1(THY-)で形質転換した。形質転換、選択および植物体の発芽方法は、上記実施例8-AのUBI PRO::CREの実験で記載したものと同じであった。T0植物体のPCR分析では、シングルコピー植物体の58%が、成長遺伝子(ODP2およびWUS)ならびにCREの完全な切除を受けていたことが示された。胚の成長期(LTP2、OLE、END-2)か、またはストレス(IN2-1)による刺激を受けて発現を駆動することが知られている代替プロモーターもまた、トランスジェニックT0植物体を生成する発芽の前に、成長遺伝子(ODP2、WUS2)およびCREの切除をもたらした。
PH184Cから未成熟の雌穂を収穫し、粒子衝撃処理の日に2.0mmの未熟胚を穀粒から取り出した。粒子衝撃の前に、胚を高浸透性の培地(13224B培地)に3時間置いた。以下の発現カセットを含有する等モル比のプラスミドを未熟胚に衝突させた;FRT1:PMI::PINII TERM:FRT87+UBI PRO:UBI1ZM INTRON::MO-FLP::PINII TERM+ZM-PLTP PRO::ZM-ODP2::PINII TERM+ZM-AXIG1 PRO::ZM-WUS2::PINII TERM。粒子衝撃の後、未熟胚を終夜、高浸透性培地上に残し、その後静止培地(150mg/lのG418を含む13266K培地)に移し8日間置いた。静止期間の後、胚を成熟培地(150mg/lのG418を含む289O培地)に移して21日間置き、その後、発根培地(150mg/lのG418を含む272X培地)に移して14~17日間(根が土壌に移植するのに十分な大きさになるまで)置いた。小植物体の段階で、元の標的遺伝子座のFRT1部位とFRT87部位とに挟まれた内部の遺伝子がもはや存在せず、かつドナーカセット中の新しい遺伝子が標的遺伝子座に正しく組み換えられていることを確認するために、PCR分析用として葉の組織を試料とし、そして正確なRMCE(リコンビナーゼ媒介カセット交換(Recombinase-Mediated Cassette Exchange))イベントが同定された。これにより、SSIサイクル全体、すなわち形質転換から正確なRMCEで得られた植物体を温室で得るまでの日数が、根が十分に張るのに必要な期間に依存するものの、43~50日に短縮された。代替として、AXIG1 PRO::WUS2+PLTP PTO::ODP2を含むコンストラクトを使用するアグロバクテリウム属(Agrobacterium)媒介SSI法が開発された。次の2種のT-DNAを2つの別々の実験で送達した;第1のT-DNAは、PMI、WUS2、ODP2およびDsRED発現カセットをFRT1とFRT87とで挟まれた組み換え部位に含有し(RB-UBI PRO:UBI1ZM INTRON::MO-FLP::PINII TERM+CaMV35S TERM+FRT1:PMI::PINII TERM+ZM-AXIG1 PRO::ZM-WUS2::IN2-1 TERM+ZM-PLTP PRO::ZM-ODP2::OS-T28 TERM+UBI PRO::UBI1ZM INTRON::DsRED:FRT87-LB)(RV003866)、第2のT-DNAは、PMIおよびDsREDのみをFRT1部位とFRT87部位に含有する(RB-+ZM-AXIG1 PRO::ZM-WUS2::IN2-1 TERM+ZM-PLTP PRO::ZM-ODP2::OS-T28 TERM UBI PRO:UBI1ZM INTRON::MO-FLP::PINII TERM+CaMV35S TERM+FRT1:PMI::PINII TERM+UBI PRO::UBI1ZM INTRON::DsRED:FRT87-LB)(RV004886)。米国仮特許出願第62/296639号明細書(参照により全体が本明細書に組み込まれる)に記載のように、FRT1~FRT87の着地部位を含む標的ラインに、アグロ媒介形質転換により各T-DNAを送達した。正確なRMCEイベントは、#5907 USPSPに記載されているように、マルチプレックスPCR分析を使用して同定し、そのデータを表11に要約した。アグロSSIにAXIG1 PRO::WUS2+PLTP PTO::ODP2発現カセットを使用することにより、SSIイベントを生成する通常の形質転換法と比べて、SSIプロセス全体が数週間(少なくとも3~4週間)短縮された。
トウモロコシゲノムのCAS9媒介切断を、トウモロコシのALS2遺伝子に単一コドンの改変を導入するために使用する。ALS2編集アレルを作製するために、794bpの相同体断片をプラスミドベクターにクローニングし、天然配列と比べると数個のヌクレオチド改変を有する修復テンプレートとして、2つの127ヌクレオチドの一本鎖DNAオリゴを試験した。794bpの修復テンプレートは、アミノ酸の165位置でプロリンに対応するDNA配列をセリン(P165S)に変える編集を指示する一塩基変異、ならびにALS-CR4標的部位およびPAM配列内に3つの追加の改変を含む。修復テンプレート内のPAM配列の改変は、メチオニンコドン(AUG)をイソロイシン(AUU)に変えるが、これはALS1遺伝子では自然に起こることである。粒子衝撃、選択および再生で使用した培地は、本明細書で使用するものに類似している。1回の処理当たり約1,000個の未熟胚に、2つのオリゴまたは単一プラスミドの修復テンプレート、すなわちUBI PRO:UBI1ZM INTRON:CAS9::PINII、POLIII PRO::ALS~CR4gRNA、UBI PRO:UBI1ZM INTRON:MOPAT~DSRED::PINII TERM、ZM-PLTP PRO::ZM-ODP2::PINII TERMおよびZM-AXIG1 PRO::ZM-WUS2::PINII TERMを衝突させる。粒子衝撃の後、未熟胚をビアラホス3mg/lを含む培地に置き、除草剤耐性体細胞胚を選択した。8日間の静止期間の後、胚をビアラホスを含む成熟培地に移して21日間置き、その後、発根培地に移して14~17日間(根が土壌に移植するのに十分な大きさになるまで)置いた。形質転換から5週後、選択培地で成長している200個(1回の処理当たり)の、ランダムに選択した独立した若い小植物体を、PlantCon(商標)容器(高さ6”までの植物体を入れることができる滅菌プラスチック容器)内の新鮮なビアラホス培地に移した。残りの小植物体(1回の処理当たり約800個)を、PlantCons(商標)(MP Biomedicals LLC,3 Hutton Center Drive,Suite 100,Santa Anna,CA 92707から入手可能な、予め殺菌されている植物組織培養容器)内の、編集されたALS2遺伝子を直接選択するために100ppmのクロロスルフロンを含有する固体培地に移した。1ヶ月後、ランダムにサンプリングした384個の小植物体(選択せず)およびクロロスルフロン選択で生存した7個の小植物体を分析用の試料とした。編集されたALS2アレルが9個の小植物体で検出された:2個は、ビアラホス上で成長し、794bpの修復DNAテンプレートを使用して生成した、ランダム選択の小植物体から得られ、残りの7個は、127ntの一本鎖オリゴを使用して編集した、クロロスルフロン耐性小植物体から得られた。ALS1遺伝子の分析からは、野生型配列のみが見出され、ALS-CR4gRNAの高い特異性が確認された。
最適化したアグロバクテリウム(Agrobacterium)媒介プロトコル(Wu et al.,2014,In Vitro Cellular and Developmental Biology 50:8-14)を用いてモロコシ属(Sorghum)の形質転換を行った(その方法は下に要約されている)。
本研究では、タンニンを含まないソルガムの変種であるTX430を使用した。温室の平均温度は、日中29℃、夜間20℃であり、光周期は昼/夜12時間とし、メタルハライドランプ(1,000W)と高圧ナトリウム(1,000W)ランプを3:1の比で補助光として用いた。本研究で使用した培地成分を表2に示す。基準の形質転換プロトコルはZhaoらの「treatment C」(Plant Mol.Biol.(2000)44:789-798)に詳しく説明されている。簡潔に説明すると、収穫した新鮮なソルガムの未成熟粒を、真空下、50%の漂白剤および0.1%のTween-20で30分間滅菌し、その後、滅菌水で3回洗浄した。以下の連続する5工程を胚に供した。(1)アグロバクテリウム属(Agrobacterium)の感染:PHI-I培地を含むアグロバクテリウム属(Agrobacterium)懸濁液(550nmでOD=1.0)中で胚を5分間インキュベートした;(2)共培養:感染後、PHI-T培地上、25℃の暗所で胚を3日間培養した;(3)静止:100mg/lのカルベニシリンを加えたPHI-T培地上、28℃の暗所で胚を7日間培養した;(4)選択:PHI-U培地上で胚を2週間培養し、続いて二次培養の間隔を2~3週間として、PHI-V培地上、胚を28℃の暗所で残りの選択過程の間培養した;(5)再生:シュートの成長を促進するために、PHI-X培地上、暗所でカルスを2~3週間培養し、続いて、25℃で光照射16時間(40~120μEm-2s-1)、および暗所8時間の条件で1週間培養し、根の成長を促すために、PHI-Z培地上で最終の二次培養を光照射下(16時間、40~120μEm-2s-1)で2~3週間行った。再生した小植物体を土壌に移植し、温室で栽培した(Zhao et al.2000)。T0植物体を自家授粉し、さらなる分析のためにT1の子孫を作った。
アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)株LBA4404(Lazo et al.(1991)Biotechnology 9:963-967)を使用した。これは、アグロバクテリウム属(Agrobacterium)vir遺伝子を含む第1のプラスミド(Komari(1990)Plant Cell 9:303-306;Komari et al.(1996)Plant J 10:165-174)と、以下の成分を含むT-DNAを含有する第2のプラスミド(PHP80334)とを含有した:RB+ZM-AXIG1 PRO::ZM-WUS2::IN2-1 TERM+ZM-PLTP PRO::ZM-ODP2::OS-T28 TERM+GZ-W64A TERM+UBI PRO:UBI1ZM INTRON:ESR::SB-SAG12 TERM+SB-ALS PRO::HRA::SB-PEPC1 TERM+UBI PRO:UBI1ZM INTRON:ZS-GREEN1::PINII TERM:SB-ACTIN TERM-LB。比較のために、T-DNA中にUBI PRO:UBI1 ZM INTRON:PMI::PINII TERM発現カセットのみを含む(ZM-WUS2発現カセットもZM-ODP2発現カセットも含まない)第2のプラスミドを含有する、別のアグロバクテリウム属(Agrobacterium)を使用した。これは本実験ではコントロールの処理を意味する。
コントロールプラスミドを使用した場合、全体の形質転換頻度は20%であり、温室に送られ、qPCRで分析されたT0植物体の40%は、アグロバクテリウム属(Agrobacterium)の主鎖を含まない、シングルコピーであった。コントロール処理では、アグロバクテリウム属(Agrobacterium)感染からT0植物体が温室へ送られるまでの日数は10~13週であった。
A.コムギの形質転換法
目的のベクターを含有するアグロバクテリウム属(Agrobacterium)株LBA4404のアリコートを-80℃の貯蔵場所から取り、選択剤(細菌株が含有するプラスミドによりカナマイシンまたはスペクチノマイシン)を含有する固体LB培地上にストリークした。LBプレート上、21℃の暗所でアグロバクテリウム属(Agrobacterium)を2~3日間培養し、その時点でプレートから単一のコロニーを選択し、選択剤を含有する810D培地プレート上にストリークし、その後、28℃の暗所で終夜インキュベートした。アグロバクテリウム属(Agrobacterium)の培養物を滅菌スパチュラでプレートから移し、400μMのアセトシリンゴン(AS)を含む約5mLのコムギ感染培地(WI4)に懸濁させた。同じ培地を使用して懸濁液の光学密度(600nm)を約0.1~0.7に調節した。
アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)株LBA4404(Lazo et al.1991、Biotechnology9:963-967)を使用した。これは、第1のスーパーバイナリーヘルパープラスミド(pVIR9、米国仮特許出願第62/252229号明細書(参照によりその全体が本明細書に組み込まれる))、および、次の成分を含むT-DNAを含有する成長遺伝子を有する第2のプラスミド(PHP79066)を含有した;RB+ZM-AXIG1 PRO::ZM-WUS2::IN2-1 TERM+ZM-PLTP PRO::ZM-ODP2::OS-T28 TERM+SB-ALS PRO::HRA::SB-PEPC1 TERM+LTP2 PRO::ZS-YELLOW1 N1::PINII TERM+LB。比較のために、以下のT-DNAを含む第2のプラスミド(PHP24600)を含有する別のアグロバクテリウム属(Agrobacterium)を使用した: RB+CAMV35S TERM:PAT:CAMVS PRO+UBIZM PRO:DS-RED:PINII TERM+LB(これは、この実験ではコントロール処理を意味する)。
A.成長中の体細胞胚の形態。
Pioneer近交系PH184Cからの未熟胚を、次の発現カセットを含有するT-DNAを宿すアグロバクテリウム属(Agrobacterium)株LBA4404で形質転換後、体細胞胚が急速に(すなわち、4~6日以内に)胚盤表面に形成された;ZM-AXIG1 PRO::ZM-WUS2::IN2-1I TERM+ZM-PLTP PRO::ZM-ODP2::PINII+UBI PRO:UBI1ZM INTRON:ZS-GREEN::PINII TERM。直接形成された、単一の体細胞胚を、アグロバクテリウム属(Agrobacterium)の感染開始から2、4、7、および12日後に観察した。近交系PH184Cでは、NOS PRO::ZM-WUS2::PINII TERM+ZM-PLTP::ODP2::PINII TERMの組み合わせを使用した場合、単一の体細胞胚が、胚柄を反復しているように見える薄い細胞の綱によって当初形質転換した接合胚の胚盤に結合しているのが観察された。胚の成長が続くと、頂端分裂組織の成長の発端で頂端分裂組織を囲む特色のある子葉鞘のリングの形成、および胚軸周りの胚盤の形成(これは白色かつ不透明になる)を含む、接合胚で通常見られる別の形態的特徴が観察された。
アグロバクテリウム(Agrobacterium)(AXIG1 PRO::ZM-WUS2::IN2-1 TERM+ZM-PLTP PRO::ODP2::PINII TERMを含有するT-DNAを含む)媒介形質転換後に、未熟接合胚の胚盤表面で成長している直接形成の体細胞胚を、アグロバクテリウム属(Agrobacterium)の感染から2、4および7日後にサンプリングし、70%のイソプロパノール中で5分間洗浄し、その後、70%のイソプロパノール中の0.5%「オイルレッドO」溶液中で20分間染色し、イソプロパノールで2分間洗浄し、その後水中でそれぞれ5分間の洗浄を2回行った(全て室温で)。アグロバクテリウム属(Agrobacterium)の感染から2日後、組織内の赤色発色によって証拠付けられる非常に小さい脂質の染色が未熟接合胚に存在した。アグロバクテリウム属(Agrobacterium)の感染開始から4日後には、多数の球形構造体(新たに形成した体細胞胚)が、当初形質転換された接合胚表面で成長しているのが明らかに目視でき、これらの新たな体細胞胚は明瞭に赤色に染められており、脂質の蓄積を示した。7日目に、次のような構造体の混合が観察された;成長を続け、赤く染色された明らかに体細胞胚であるもの(図12中、黒色の矢印)、および、脂質の蓄積に関係する赤色染色を既に失い始めている分裂組織および葉を分化させ始めているいくつかの体細胞胚(図12)を形質転換することができた。図12によれば、また、当初アグロバクテリウム属(Agrobacterium)に感染した接合胚の胚盤は、これらの培養条件下では脂質をほとんど有さなかった。
脂質は、類似の染色プロトコルを使用して、薄片にした体細胞胚の中に検出することができる。アグロバクテリウム属(Agrobacterium)の感染開始から、2、4、8、および12日後に、直接形成の単一の体細胞胚をサンプリングし、上記のように、固定化し、乾燥させ、プラスチックを染み込ませ、薄片にした。脂質の染色用に、0.5%「オイルレッドO」溶液を加えた60%トリエチルリン酸(水溶液)を調製し、ろ過した。スライドガラス上の組織の薄片を60%トリエチルリン酸で短時間濯ぎ、その後「オイルレッドO」中で10~20分間染色した。染色後、薄片を再度トリエチルリン酸で1~2秒間濯ぎ、その後、蒸留した脱イオン水で洗浄した。その後、薄片を0.5%セレスチンブルーを加えた5%硫酸第二鉄アンモニウム水溶液で15分間対比染色し、再度DI水で洗浄した。その後、水性封入培地を用いて薄片を埋め込み、観察した。成長中の体細胞胚の中に、胚盤中で蓄積している脂質が赤く現れ、薄片全体(胚盤および胚軸を含む)にわたって各細胞の核が青色に染色されることになろう。
3種のPioneer近交系(PH184C、HC69およびPHH5G)から未熟胚を収穫し、以下のPHP79066(配列番号27)、PHP80912(配列番号53)およびPHP80913(配列番号54;それぞれ表1に詳しく説明されている)を含むアグロバクテリウム属(Agrobacterium)株LBA4404で形質転換するために、各近交系からの胚を等しく分取した。
3種の遺伝子型(HC69、PHH5GおよびPH184C)の未熟胚(9-11DAP)にPHP79066を感染させた。胚を共培養培地(710I)へ移して1~3日間置き、静止培地605G(605J培地+2mg/lのメロペネム)に7日間、その後、成熟培地13329(289O+0.1mg/lのイマザピル)に移した。成熟培地に3~4週間置いた後、強い1本のシュートをEXcel Plugs(40/80)(International Horticulture Technologies,LLC,2410 Airline Hwy,Hollister,CA,95023)に移し、Moisturin(WellPlant,Inc.,940 Spice Islands Drive,Sparks,NV,89431)を散布した。Valoya(Valoya Oy,Lauttasaarentie 54A,00200 Helsinki,Finland)R-シリーズNS2 LED光(220-305μmol/m2/sec)の下、27℃で2~3週間シュートを培養した。必要に応じて、2~3日毎に、6N塩およびビタミンに0.1mg/Lのイマザピルを加えたもので灌水した。根付いた後、T0を受け入れる温室へプラグを移し、さらに2週間栽培した。この時間枠の終わりに、各遺伝子型について生存データを収集した。これを下記表13に示す。
モロコシ(Sorghum bicolor)のPLTPプロモーター(SB-PLTP PRO)は、配列番号2で示される。Pioneer近交系PH184CまたはPHH5Gからの未熟胚をT-DNA(SEQ ID NO:95),RB+ZM-AXIG1 PRO::ZM-WUS2::IN2-1 TERM+SB-PLTP1 PRO::ZM-ODP2::OS-T28 TERM+GZ-W64A TERM+UBI PRO:UBI1ZM INTRON:ESR::SB-SAG12 TERM+SB-ALS PRO::HRA::SB-PEPC1 TERM+UBI PRO::ZS-GREEN1::PINII TERM:SB-ACTIN TERM-LBを含有するプラスミドRV012608を含むアグロバクテリウム属(Agrobacterium)株LBA4404で形質転換した。4~6日間の培養後、近交系の接合胚表面に、多くの目立たない体細胞胚が形成された。これらの初期の体細胞胚は、互いを明瞭に区別でき(すなわち、形成中の体細胞胚の間に非トランスジェニック組織が介在して)、緑色蛍光タンパク質の発現に基づきトランスジェニック体であると確認された。これらの胚を0.1mg/lのイマザピルを含む成熟培地に移すと胚は成長を続け、発芽培地に移すとシュートと根が伸長した。
WUS/WOXパラログ(ファミリーのメンバー遺伝子であり、タンパク質をコードする)およびODP2/BBMファミリーメンバーのリスト、ならびにそれらの対応する配列番号を下記表14に示す。
この実験では、T-DNA(配列番号104)にZM-AXIG1 PRO::ZM-WUS2+ZM-PLTP PRO::ZM-ODP2を含有するポジティブコントロールプラスミドは、近交系PH1V5TおよびPHH5Gで中程度(スコア2)の反応を示したが、近交系PH1V69ではより低いスコア「1」であった。これに対し、ZM-WUS2を3種のトウモロコシのWOXファミリーメンバーに代えると、ZM-WOX2Aからの比較的高い体細胞胚反応から、ZM-WOX4での低反応ないし無反応およびWOX5での低反応(T-DNA配列は、それぞれ配列番号100、配列番号101および配列番号102で与えられる)まで変動する体細胞胚形成の反応範囲が観察された(表15)。WOX5およびWOX4は形質転換された未熟胚表面に生成される体細胞胚は少なかったが、WOX5を含む3種全ての近交系およびWOX4を含む近交系のサブセットで依然としてポジティブな反応を示した。低レベルの反応を示した処理では、近交系PH1V5Tは、WUS2およびODP2発現カセットの非存在下では低レベルの成長を示すため、解釈は困難であった。しかしながら、そのような処理で、他の2種の近交系は、バックグラウンドの成長を示さず、そして低レベル反応(1)であることが明白であったので、はるかに多くの情報を有するものになった。
様々な「相同の」プロモーターを使用すると、3種の異なるPioneer近交系で、スコアが1と2の間であるコントロール処理(ZM-PLTP PRO)と比べて、ある範囲の急速体細胞胚の形成をもたらした(表16)。
前の実験では、UBI PRO::ZM-LEC1は、形質転換可能なトウモロコシハイブリッドHi-IIで形質転換頻度を刺激したことが示された(Lowe et al.,2007、米国特許第7,268,271号明細書を参照)。
NOS PRO::ZM-WUS2::IN2+UBI PRO::ZM-ODP2::PINII+UBI PRO::ZS-GREEN::PINIIを含有するトウモロコシのコンストラクトから出発して、イネ(Oryza sativa)およびアワ(Setaria italica)で同定されたWUS2およびODP2のオーソログを合成し、上のコンストラクト中のトウモロコシの遺伝子を置換した。PHP80911(トウモロコシWUS2およびODP2)、PHP79530(イネの遺伝子)またはPHP79531(アワの遺伝子)を含有するアグロバクテリウム属(Agrobacterium)株LBA4404を使用して、近交系PHH5GおよびPH184Cからの未熟胚を形質転換した。培養培地上で14日後、解剖顕微鏡および落射蛍光実体顕微鏡で未熟胚を観察し、先に説明した体細胞胚形成基準(0~4)を使用してスコアを付けた。近交系PH184Cでは、アグロバクテリウム属(Agrobacterium)の感染から14日後の体細胞胚のスコアは、2、2および1(それぞれ、トウモロコシ、キビおよびイネの遺伝子対で)であった。近交系PHH5Gでは、アグロバクテリウム属(Agrobacterium)の感染から14日後の体細胞胚のスコアは、3、3および2(それぞれ、トウモロコシ、キビおよびイネの遺伝子対で)であった。これらの未熟胚は、上記セクション5A、5Bおよび5Cの2倍の時間、WUS2およびODP2の発現を経験しており、このため、データが7日目に収集され場合より高い体細胞胚形成スコアが付与された。それぞれの種からの同族のWUSおよびODP2遺伝子の組み合わせは、体細胞胚の形成を促進した。WUS2またはODP2が存在しない場合、PHH5Gで体細胞胚の形成は観察されなかった。
シロイヌナズナ(Arabidopsis)のWUS遺伝子を用いて形質転換を改善し得る新規のプロモーターを見出すために、この遺伝子の使用を再検討した。アグロバクテリウム(Agrobacterium)媒介形質転換直後およびカルスの成長期間を通じて発現した、シロイヌナズナ(Arabidopsis)WUSの高レベルの発現(例えば、ダイズEF1A PRO使用の場合)により、イベントの生成速度が増大した。しかしながら、この転写因子のこのレベルの発現を継続させると、イベントの再生が妨げられた。可能性のある解決策としては、小植物体の再生前に、この遺伝子を切除し、体細胞胚の分化および成熟に際してシロイヌナズナ(Arabidopsis)WUSの異所性発現を制限することであろう。このことに基づき、培養細胞、胚、および成長中の未成熟種子で発現し、別の植物組織では発現が全くないかまたは非常に低レベルである新規のプロモーターを探索した。ダイズLTP3プロモーターがこれらの基準を満たした。これまでに確認されていないダイズのリン脂質トランスフェラーゼ遺伝子である。図14および図15に示すように、EF1A PROの構成的発現(図14)と比較すると、LTP3の発現(図15)は、i)成長中の未成熟種子で強く、かつii)別の試料および植物の部分では弱いかまたは発現しないが、EF1Aの発現は全ての組織で観察された。
切除-活性化HRA発現をもたらすベクターを構築するために、単一のloxP標的部位を中心に有するST-LS1イントロンをHRA遺伝子に割り込ませ、loxP含有イントロンが適切に機能することを示すためにその遺伝子を試験した。HRA発現カセットを半分にしたもの2つ(loxP部位で分割)をT-DNAの反対側の端部に移動させ、それぞれの半分にそれ自身の内部loxP部位を持たせて、loxP部位がHRAの半分よりもT-DNAの中心に近くなるようにした。2つのloxP部位内には、AXIG1 PRO::WUS2::IN2 TERM、PLTP PRO::ODP2::OS-T28 TERM、ZM-GLB1 PRO::CRE::pinIIおよびSB-UBI PRO::ZS-GREEN::OS-UBI TERM発現カセットが存在した(表1のPHP81814および配列番号80を参照)。
これらの実験では、ポジティブコントロールとして以下の構造でスタートし、単一のT-DNA構造を使用する:RB+ZM-AXIG1 PRO::ZM-WUS2::IN2-1 TERM+ZM-PLTP PRO::ZM-ODP2::OS-T28 TERM+GZ-W64A TERM+UBI PRO:UBI1ZM INTRON:ESR::SB-SAG12 TERM+SB-ALS PRO::HRA::SB-PEPC1 TERM+UBI PRO::ZS-GREEN1::PINII TERM:SB-ACTIN TERM-LB。ポジティブコントロールをWUS2およびODP2の発現を駆動する胚特異的プロモーターを有するプラスミドと比較する。比較のベースラインを与えるために、ネガティブコントロールとして、プラスミドPHP24600を使用する(WUS2およびODP2導入遺伝子の発現はない)。
本開示では様々な配列に言及する。配列番号を下記表18に示す。
Claims (48)
- トランスジェニック植物の生産方法であって、
(a)目的のポリヌクレオチドと、
(i)WUS/WOXホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
(ii)2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または
(iii)それらの組み合わせ
とを含む発現コンストラクトで外植体細胞を形質転換する工程と;
(b)前記細胞の形質転換の開始後1~7日間にわたり、形質転換された各細胞中で(a)の前記発現コンストラクトを発現させる工程であって、外因性サイトカイニンの非存在下で、前記細胞の形質転換の開始後1~7日以内に再生可能な植物構造体が形成される(但し、カルスは形成されない)工程と;
(c)前記再生可能な植物構造体を発芽させて前記トランスジェニック植物を形成する工程と
を含み、
前記WUS/WOXホメオボックスポリペプチドが配列番号4、6、8、10、12もしくは14のいずれか1つのアミノ酸配列を含むか;または前記WUS/WOXホメオボックスポリペプチドが配列番号3、5、7、9、11もしくは13のいずれか1つのヌクレオチド配列によってコードされ;
前記2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドが配列番号18、63、65もしくは67のいずれか1つのアミノ酸配列を含むか;または前記2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドが配列番号17、21、62、64、66もしくは68のいずれか1つのヌクレオチド配列によってコードされる方法。 - トランスジェニック植物の生産方法であって、
(a)目的のポリヌクレオチドと、
(i)WUS/WOXホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
(ii)2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または
(iii)それらの組み合わせ
とを含む発現コンストラクトで外植体細胞を形質転換する工程と;
(b)前記細胞の形質転換の開始後1~14日間にわたり、形質転換された各細胞中で(a)の前記発現コンストラクトを発現させる工程であって、外因性サイトカイニンの非存在下で、前記細胞の形質転換の開始後1~14日以内に再生可能な植物構造体が形成される(但し、カルスは形成されない)工程と;
(c)前記再生可能な植物構造体を発芽させて前記トランスジェニック植物を形成する工程と
を含み、
前記WUS/WOXホメオボックスポリペプチドが配列番号4、6、8、10、12もしくは14のいずれか1つのアミノ酸配列を含むか;または前記WUS/WOXホメオボックスポリペプチドが配列番号3、5、7、9、11もしくは13のいずれか1つのヌクレオチド配列によってコードされ;
前記2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドが配列番号18、63、65もしくは67のいずれか1つのアミノ酸配列を含むか;または前記2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドが配列番号17、21、62、64、66もしくは68のいずれか1つのヌクレオチド配列によってコードされる方法。 - トランスジェニック植物の生産方法であって、
(a)目的のポリヌクレオチドと、
(i)WUS2ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
(ii)ODP2ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または
(iii)それらの組み合わせ
とを含む発現コンストラクトで外植体細胞を形質転換する工程と;
(b)前記細胞の形質転換の開始後1~7日間にわたり、形質転換された各細胞中で(a)の前記発現コンストラクトを発現させる工程であって、外因性サイトカイニンの非存在下で、前記細胞の形質転換の開始後1~7日以内に再生可能な植物構造体が形成される(但し、カルスは形成されない)工程と;
(c)前記再生可能な植物構造体を発芽させて前記トランスジェニック植物を形成する工程と
を含み、
前記WUS2ポリペプチドが配列番号6のアミノ酸配列を含むか;または前記WUS2ポリペプチドが配列番号5のヌクレオチド配列によってコードされ;
前記ODP2ポリペプチドが配列番号18のアミノ酸配列を含むか;または前記ODP2ポリペプチドが配列番号17もしくは21のいずれか1つのヌクレオチド配列によってコードされる方法。 - トランスジェニック植物の生産方法であって、
(a)目的のポリヌクレオチドと、
(i)WUS2ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
(ii)ODP2ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または
(iii)それらの組み合わせ
とを含む発現コンストラクトで外植体細胞を形質転換する工程と;
(b)前記細胞の形質転換の開始後1~14日間にわたり、形質転換された各細胞中で(a)の前記発現コンストラクトを発現させる工程であって、外因性サイトカイニンの非存在下で、前記細胞の形質転換の開始後1~14日以内に再生可能な植物構造体が形成される(但し、カルスは形成されない)工程と;
(c)前記再生可能な植物構造体を発芽させて前記トランスジェニック植物を形成する工程と
を含み、
前記WUS2ポリペプチドが配列番号6のアミノ酸配列を含むか;または前記WUS2ポリペプチドが配列番号5のヌクレオチド配列によってコードされ;
前記ODP2ポリペプチドが配列番号18のアミノ酸配列を含むか;または前記ODP2ポリペプチドが配列番号17もしくは21のいずれか1つのヌクレオチド配列によってコードされる方法。 - トランスジェニック植物の生産方法であって、
(a)目的のポリヌクレオチドと、WUS/WOXホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列とを含む発現コンストラクトで外植体細胞を形質転換する工程と;(b)前記細胞の形質転換の開始後1~7日間にわたり、形質転換された各細胞中で前記(a)の発現コンストラクトを発現させる工程であって、外因性サイトカイニンの非存在下で、前記細胞の形質転換の開始後1~7日以内に再生可能な植物構造体が形成される(但し、カルスは形成されない)工程と;
(c)前記再生可能な植物構造体を発芽させて前記トランスジェニック植物を形成する工程と
を含み、
前記WUS/WOXホメオボックスポリペプチドが配列番号4、6、8、10、12もしくは14のいずれか1つのアミノ酸配列を含むか;または前記WUS/WOXホメオボックスポリペプチドが配列番号3、5、7、9、11もしくは13のいずれか1つのヌクレオチド配列によってコードされる方法。 - トランスジェニック植物の生産方法であって、
(a)目的のポリヌクレオチドと、WUS/WOXホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列とを含む発現コンストラクトで外植体細胞を形質転換する工程と;(b)前記細胞の形質転換の開始後1~14日間にわたり、形質転換された各細胞中で前記(a)の発現コンストラクトを発現させる工程であって、外因性サイトカイニンの非存在下で、前記細胞の形質転換の開始後1~14日以内に再生可能な植物構造体が形成される(但し、カルスは形成されない)工程と;
(c)前記再生可能な植物構造体を発芽させて前記トランスジェニック植物を形成する工程と
を含み、
前記WUS/WOXホメオボックスポリペプチドが配列番号4、6、8、10、12もしくは14のいずれか1つのアミノ酸配列を含むか;または前記WUS/WOXホメオボックスポリペプチドが配列番号3、5、7、9、11もしくは13のいずれか1つのヌクレオチド配列によってコードされる方法。 - トランスジェニック植物の生産方法であって、
(a)目的のポリヌクレオチドと、2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列とを含む発現コンストラクトで外植体細胞を形質転換する工程と;
(b)前記細胞の形質転換の開始後1~7日間にわたり、形質転換された各細胞中で前記(a)の発現コンストラクトを発現させる工程であって、外因性サイトカイニンの非存在下で、前記細胞の形質転換の開始後1~7日以内に再生可能な植物構造体が形成される(但し、カルスは形成されない)工程と;
(c)前記再生可能な植物構造体を発芽させて前記トランスジェニック植物を形成する工程と
を含み、
前記2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドが配列番号18のアミノ酸配列を含むか;または前記2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドが配列番号17もしくは21のいずれか1つのヌクレオチド配列によってコードされる方法。 - トランスジェニック植物の生産方法であって、
(a)目的のポリヌクレオチドと、2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列とを含む発現コンストラクトで外植体細胞を形質転換する工程と;
(b)前記細胞の形質転換の開始後1~14日間にわたり、形質転換された各細胞中で前記(a)の発現コンストラクトを発現させる工程であって、外因性サイトカイニンの非存在下で、前記細胞の形質転換の開始後1~14日以内に再生可能な植物構造体が形成される(但し、カルスは形成されない)工程と;
(c)前記再生可能な植物構造体を発芽させて前記トランスジェニック植物を形成する工程と
を含み、
前記2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドが配列番号18のアミノ酸配列を含むか;または前記2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドが配列番号17もしくは21のいずれか1つのヌクレオチド配列によってコードされる方法。 - トランスジェニック植物の生産方法であって、
(a)目的のポリヌクレオチドと、
(i)WUS/WOXホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、
(ii)2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、
を含む発現コンストラクトで外植体細胞を形質転換する工程と;
(b)前記細胞の形質転換の開始後1~7日間にわたり、形質転換された各細胞中で前記(a)の発現コンストラクトを発現させる工程であって、外因性サイトカイニンの非存在下で、前記細胞の形質転換の開始後1~7日以内に再生可能な植物構造体が形成される(但し、カルスは形成されない)工程と;
(c)前記再生可能な植物構造体を発芽させて前記トランスジェニック植物を形成する工程と
を含み、
前記WUS/WOXホメオボックスポリペプチドが配列番号4、6、8、10、12もしくは14のいずれか1つのアミノ酸配列を含むか;または前記WUS/WOXホメオボックスポリペプチドが配列番号3、5、7、9、11もしくは13のいずれか1つのヌクレオチド配列によってコードされ;
前記2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドが配列番号18、63、65もしくは67のいずれか1つのアミノ酸配列を含むか;または前記2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドが配列番号17、21、62、64、66もしくは68のいずれか1つのヌクレオチド配列によってコードされる方法。 - トランスジェニック植物の生産方法であって、
(a)目的のポリヌクレオチドと、
(i)WUS/WOXホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、
(ii)2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、
を含む発現コンストラクトで外植体細胞を形質転換する工程と;
(b)前記細胞の形質転換の開始後1~14日間にわたり、形質転換された各細胞中で前記(a)の前記発現コンストラクトを発現させる工程であって、外因性サイトカイニンの非存在下で、前記細胞の形質転換の開始後1~14日以内に再生可能な植物構造体が形成される(但し、カルスは形成されない)工程と;
(c)前記再生可能な植物構造体を発芽させて前記トランスジェニック植物を形成する工程と
を含み、
前記WUS/WOXホメオボックスポリペプチドが配列番号4、6、8、10、12もしくは14のいずれか1つのアミノ酸配列を含むか;または前記WUS/WOXホメオボックスポリペプチドが配列番号3、5、7、9、11もしくは13のいずれか1つのヌクレオチド配列によってコードされ;
前記2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドが配列番号18、63、65もしくは67のいずれか1つのアミノ酸配列を含むか;または前記2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドが配列番号17、21、62、64、66もしくは68のいずれか1つのヌクレオチド配列によってコードされる方法。 - トランスジェニック植物の生産方法であって、
(a)目的のポリヌクレオチドと、
(i)WUS/WOXホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
(ii)2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または
(iii)(i)および(ii)の組み合わせ
とを含む発現コンストラクトで外植体細胞を形質転換する工程と;
(b)前記細胞の形質転換の開始後1~7日間にわたり、形質転換された各細胞中で前記(a)の発現コンストラクトを発現させる工程であって、外因性サイトカイニンの非存在下で、前記細胞の形質転換の開始後1~7日以内に再生可能な植物構造体が形成される(但し、カルスは形成されない)工程と;
(c)前記(b)の再生可能な植物構造体を発芽させて、14日~60日で前記トランスジェニック植物を形成する工程と
を含み、
前記WUS/WOXホメオボックスポリペプチドが配列番号4、6、8、10、12もしくは14のいずれか1つのアミノ酸配列を含むか;または前記WUS/WOXホメオボックスポリペプチドが配列番号3、5、7、9、11もしくは13のいずれか1つのヌクレオチド配列によってコードされ;
前記2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドが配列番号18、63、65もしくは67のいずれか1つのアミノ酸配列を含むか;または前記2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドが配列番号17、21、62、64、66もしくは68のいずれか1つのヌクレオチド配列によってコードされる方法。 - トランスジェニック植物の生産方法であって、
(a)目的のポリヌクレオチドと、
(i)WUS/WOXホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
(ii)2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または
(iii)(i)および(ii)の組み合わせ
とを含む発現コンストラクトで外植体細胞を形質転換する工程と;
(b)前記細胞の形質転換の開始後1~14日間にわたり、形質転換された各細胞中で前記(a)の発現コンストラクトを発現させる工程であって、外因性サイトカイニンの非存在下で、前記細胞の形質転換の開始後1~14日以内に再生可能な植物構造体が形成される(但し、カルスは形成されない)工程と;
(c)前記(b)の再生可能な植物構造体を発芽させて、14日~60日で前記トランスジェニック植物を形成する工程と
を含み、
前記WUS/WOXホメオボックスポリペプチドが配列番号4、6、8、10、12もしくは14のいずれか1つのアミノ酸配列を含むか;または前記WUS/WOXホメオボックスポリペプチドが配列番号3、5、7、9、11もしくは13のいずれか1つのヌクレオチド配列によってコードされ;
前記2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドが配列番号18、63、65もしくは67のいずれか1つのアミノ酸配列を含むか;または前記2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドが配列番号17、21、62、64、66もしくは68のいずれか1つのヌクレオチド配列によってコードされる方法。 - トランスジェニック植物の生産方法であって、
(a)目的のポリヌクレオチドと、
(i)WUS/WOXホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
(ii)2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または
(iii)(i)および(ii)の組み合わせ
とを含む発現コンストラクトで外植体細胞を形質転換する工程と;
(b)形質転換された各細胞中で(a)の前記発現コンストラクトを発現させて、外因性サイトカイニンの非存在下で再生可能な植物構造体を形成する(但し、カルスは形成されず、かつ前記再生可能な植物構造体は前記細胞の形質転換から1~7日以内に形成される)工程と;
(c)前記(b)の再生可能な植物構造体を発芽させて、前記細胞の形質転換から14日~60日で前記トランスジェニック植物を形成する工程と
を含み、
前記WUS/WOXホメオボックスポリペプチドが配列番号4、6、8、10、12もしくは14のいずれか1つのアミノ酸配列を含むか;または前記WUS/WOXホメオボックスポリペプチドが配列番号3、5、7、9、11もしくは13のいずれか1つのヌクレオチド配列によってコードされ;
前記2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドが配列番号18、63、65もしくは67のいずれか1つのアミノ酸配列を含むか;または前記2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドが配列番号17、21、62、64、66もしくは68のいずれか1つのヌクレオチド配列によってコードされる方法。 - トランスジェニック植物の生産方法であって、
(a)目的のポリヌクレオチドと、
(i)WUS/WOXホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
(ii)2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または
(iii)(i)および(ii)の組み合わせ
とを含む発現コンストラクトで外植体細胞を形質転換する工程と;
(b)形質転換された各細胞中で(a)の前記発現コンストラクトを発現させて、外因性サイトカイニンの非存在下で再生可能な植物構造体を形成する(但し、カルスは形成されず、かつ前記再生可能な植物構造体は前記細胞の形質転換から1~14日以内に形成される)工程と;
(c)前記(b)の再生可能な植物構造体を発芽させて、前記細胞の形質転換から14日~60日で前記トランスジェニック植物を形成する工程と
を含み、
前記WUS/WOXホメオボックスポリペプチドが配列番号4、6、8、10、12もしくは14のいずれか1つのアミノ酸配列を含むか;または前記WUS/WOXホメオボックスポリペプチドが配列番号3、5、7、9、11もしくは13のいずれか1つのヌクレオチド配列によってコードされ;
前記2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドが配列番号18、63、65もしくは67のいずれか1つのアミノ酸配列を含むか;または前記2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドが配列番号17、21、62、64、66もしくは68のいずれか1つのヌクレオチド配列によってコードされる方法。 - 前記発現コンストラクトはさらに、部位特異的リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列を含む請求項1~14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記部位特異的リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列は、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、または発生的に調節されるプロモーターに作動可能に連結している請求項15に記載の方法。
- 前記WUS/WOXホメオボックスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、または発生的に調節されるプロモーターに作動可能に連結している請求項1、2、5、6、および9~14、ならびに、請求項1、2、5、6および9~14のいずれか一項に従属する場合の請求項15および16のいずれか一項に記載の方法。
- 前記WUS2ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、または発生的に調節されるプロモーターに作動可能に連結している請求項3または4に記載の方法。
- 前記2つのAP2-DNA結合ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、または発生的に調節されるプロモーターに作動可能に連結している請求項1、2および7~14、ならびに、請求項1、2および7~14のいずれか一項に従属する場合の請求項15および16のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ODP2ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、または発生的に調節されるプロモーターに作動可能に連結している請求項3または4に記載の方法。
- 前記誘導性プロモーターは、化学誘導性プロモーターである請求項16~20のいずれか一項に記載の方法。
- 前記誘導性プロモーターは、オーキシン誘導性プロモーターである請求項16~20のいずれか一項に記載の方法。
- 前記オーキシン誘導性プロモーターは、配列番号39のヌクレオチド配列である請求項22に記載の方法。
- 前記誘導性プロモーターは、オーキシン応答エレメントを含む請求項16~20のいずれか一項に記載の方法。
- 前記構成的プロモーターは、抑制および脱抑制のために改変された弱い構成的プロモーターである請求項16~20および22~24のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プロモーター中の1つ以上のオペレーター配列は、TATAボックスおよび/または転写開始部位の近傍に、または重なって位置している請求項25に記載の方法。
- 前記誘導性プロモーターは、配列番号40のヌクレオチド配列である請求項16~20のいずれか一項に記載の方法。
- 前記誘導性プロモーターは、脱抑制プロモーターである請求項16~20および25のいずれか一項に記載の方法。
- 前記脱抑制プロモーターは、TETR、ESRまたはCRにより抑制される請求項28に記載の方法。
- 前記発生的に調節されるプロモーターは、PLTP、PLTP1、PLTP2またはPLTP3から選択される請求項16~20のいずれか一項に記載の方法。
- 前記PLTP、PLTP1、PLTP2またはPLTP3プロモーターは、単子葉植物に由来する請求項30に記載の方法。
- 前記単子葉植物は、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、エノコログサ属(Setaria)種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバまたはコムギである請求項31に記載の方法。
- 前記単子葉植物は、トウモロコシ、ソルガム、イネまたはエノコログサ属(Setaria)種である請求項32に記載の方法。
- 前記単子葉植物は、トウモロコシ、ソルガムまたはイネである請求項33に記載の方法。
- 前記単子葉植物はトウモロコシである請求項34に記載の方法。
- 前記PLTP、PLTP1、PLTP2またはPLTP3プロモーターは、双子葉植物に由来する請求項30に記載の方法。
- 前記双子葉植物は、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、マメ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ(Arabidopsis)またはワタである請求項36に記載の方法。
- 前記PLTP、PLTP1、PLTP2またはPLTP3プロモーターは、配列番号1~2もしくは55~61のいずれか1つを含む請求項30に記載の方法。
- 前記PLTPプロモーターは、配列番号1もしくは2のいずれかいずれか1つを含む請求項30および38のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞の形質転換から1~14日以内に前記再生可能な植物構造体が形成され、前記細胞の形質転換から14日~前記細胞の形質転換から60日で前記トランスジェニック植物が形成される請求項1~39のいずれか一項に記載の方法。
- 発根培地なしで行われる請求項1~40のいずれか一項に記載の方法。
- 発根培地の存在下で行われる請求項1~40のいずれか一項に記載の方法。
- 前記外植体は未熟胚である請求項1~42のいずれか一項に記載の方法。
- 前記未熟胚は、1~5mmの未熟胚である請求項43に記載の方法。
- 前記未熟胚は、3.5~5mmの未熟胚である請求項43に記載の方法。
- 前記細胞の形質転換の7日後、または細胞の形質転換の14日後の発芽期間中に、外因性サイトカイニンを使用する請求項1~45のいずれか一項に記載の方法。
- 前記(a)のポリペプチドの発現は一過性である請求項1~14のいずれか一項に記載の方法。
- 発芽は、外因性サイトカイニンの存在下で行われる請求項1~47のいずれか一項に記載の方法。
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