BR112020022160A2 - genes para regeneração de plantas livres de hormônio - Google Patents

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BR112020022160A2
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Bernardus SCHERES
Renze Heidstra
Menno Christian Cyrano PIJNENBURG
Michiel Theodoor Jan De Both
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Abstract

  “GENES PARA REGENERAÇÃO DE PLANTAS LIVRESDE HORMÔNIO”. A invenção se refere a um método para regenerar uma célula de planta, de preferência, regenerando um rebento de uma célula de planta alterando os níveis de expressão de pelo menos uma proteína WOX5 e PLT, de preferência WOX5 e PLT1. Além disso, os níveis de expressão de proteínas adicionais podem ser alterados, tais como, WIND1, SHR, SCR, RBR, PLT4 e PLT5 para regenerar um rebento de uma célula de planta. De preferência, os níveis de expressão são alterados temporariamente. A invenção se refere adicionalmente a um construto de ácido nucleico adequada para a expressão temporária de proteínas e o uso das combinações de proteínas para regenerar um rebento de uma célula de planta.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: “GENES PARA REGENERAÇÃO DE PLANTAS LIVRES DE HORMÔNIO” Campo da invenção
[001] A presente invenção se refere ao campo da biologia molecular de plantas, em particular, ao campo da regeneração de plantas. A invenção se refere a métodos para melhorar a regeneração de células de planta sem a necessidade de hormônios de crescimento de plantas.
Antecedentes
[002] A tecnologia atual de regeneração de plantas é variável no que se refere à engenharia bem-sucedida de características desejadas em espécies de cultura importantes. Os protocolos de regeneração atuais ainda dependem principalmente da aplicação de dois hormônios de planta essenciais, auxina e citocinina, para controlar a regeneração da planta de novo em um processo de duas etapas (Skoog e Miller, 1957). Em geral, meio rico em auxina é usado para induzir calo competente para regeneração a partir do qual a organogênese do rebento é induzida por meio rico em citocinina. A manipulação de espécies de plantas recalcitrantes aos protocolos atuais resulta no uso ineficaz da biotecnologia moderna para seu melhoramento genético. Consequentemente, métodos são necessários para aumentar a eficácia de regeneração para permitir a organogênese de rebentos independente do genótipo.
[003] Experimentos em Arabidopsis thaliana revelaram que a competência do calo para produzir um rebento é acompanhada pelo aparecimento de características de raízes que mostram a aquisição da identidade de raízes das células do calo (Sugimoto et al., 2010). A expressão de características de raízes em calos competentes para regeneração é seguida pela expressão de genes específicos do rebento, demonstrando a importância da aquisição temporária da raiz para gerar células primárias para a iniciação à regeneração do rebento (Rosspopoff et al., 2017). Estudos genéticos apoiam a importância da aquisição de características de raízes para o potencial de regeneração do tecido de calo (Sugimoto et al., 2010) (Kareem et al., 2015) (Fan et al., 2012). Esses estudos revelam o envolvimento de reguladores adicionais para a regeneração de rebentos, mas ainda contam com a indução hormonal durante o processo de regeneração. Essa dependência da indução do hormônio de planta, portanto, ainda pode prejudicar a eficácia de regeneração das células de planta.
[004] Iwase et al. (2015) mostraram que a superexpressão de WIND1 pode ignorar o pré-tratamento com auxina, mas ainda requer a presença do hormônio de planta citocinina.
[005] A regeneração de rebentos na ausência de fitormônios foi mostrada na técnica anteriormente, mas requer ferimento da planta (Iwase et al., 2017).
[006] Portanto, ainda há uma necessidade na técnica de métodos que atribuam potencial regenerativo a espécies de plantas, em particular, espécies de plantas recalcitrantes, ou que intensifiquem sua eficácia de regeneração, independentemente de hormônios vegetais aplicados externamente e não exigindo ferir a planta.
Adicionalmente, existe uma necessidade de construtos de DNA recombinante que aumentem ou induzam o potencial regenerativo de, por exemplo, plantas recalcitrantes após introdução na célula de planta.
Sumário
[007] Em um aspecto, a invenção se refere a um método para regenerar um rebento de uma célula de planta, compreendendo as etapas de: a) introduzir ou aumentar na célula de planta a expressão de uma combinação de proteínas compreendendo pelo menos: i) uma proteína homeobox 5 (WOX5) relacionada a WUSCHEL; e ii) uma proteína PLETORA (PLT) selecionada do grupo que consiste em PLT1, PLT2, PLT3, PLT4, PLT5 e PLT7, de preferência PLT1; em que a expressão de pelo menos uma das proteínas da combinação de proteínas é temporariamente introduzida ou aumentada; e b) permitir que a célula da planta se regenere no rebento.
Em uma forma de realização, a combinação de proteínas compreende adicionalmente iii) uma proteína de DIFERENCIAÇÃO CELULAR INDUZIDA POR FERIDA 1 (WIND1).
[008] Em uma forma de realização, a combinação de proteínas compreende adicionalmente: iv) uma proteína SHORT ROOT (SHR); v) uma proteína SCARECROW (SCR); e vi) pelo menos três proteínas PLETHORA (PLT) selecionadas do grupo que consiste em PLT1, PLT2, PLT3, PLT4, PLT5 e PLT7.
[009] Em uma forma de realização, a combinação de proteínas compreende pelo menos três proteínas PLT selecionadas que incluem pelo menos uma ou mais de PLT1, PLT4 e PLT5, em que de preferência as pelo menos três proteínas PLT selecionadas são PLT1, PLT4 e PLT5.
[0010] Em uma forma de realização, a etapa a) compreende adicionalmente diminuir a expressão de uma proteína relacionada ao retinoblastoma endógena (RBR), em que, de preferência, a expressão da proteína RBR é temporariamente diminuída.
[0011] De preferência, a expressão de todas as proteínas da combinação de proteínas conforme definida nesse documento é temporariamente introduzida ou aumentada, em que opcionalmente a expressão da proteína RBR é temporariamente diminuída.
[0012] De preferência, a expressão de todas as proteínas da combinação de proteínas conforme definida nesse documento é de maneira simultânea temporariamente introduzida ou aumentada e, opcionalmente, a expressão da proteína RBR é, de maneira simultânea, temporariamente diminuída com a combinação de proteínas.
[0013] Em uma forma de realização, a expressão de pelo menos uma das proteínas da combinação de proteínas conforme definidas nessa invenção, de preferência, a expressão de todas as proteínas da combinação de proteínas, é temporariamente introduzida ou aumentada por ativação temporária de sua expressão e, opcionalmente, a expressão de a proteína RBR é temporariamente diminuída pela ativação temporária da expressão de um repressor de RBR.
[0014] Em uma outra forma de realização, i) a sequência de aminoácidos da proteína SHR tem pelo menos 60% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1; ii) a sequência de aminoácidos da proteína SCR tem pelo menos 60% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 2;
iii) a sequência de aminoácidos da proteína WOX5 tem pelo menos 60% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 3; iv) a sequência de aminoácidos das proteínas PLT1, PLT2, PLT3, PLT4, PLT5 e PLT7 tem pelo menos 60% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 30, respectivamente; v) a sequência de aminoácidos da proteína RBR tem pelo menos 60% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 17; e vi) a sequência de aminoácidos da proteína WIND1 tem pelo menos 60% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:
28.
[0015] Em uma forma de realização, i) a proteína SHR é codificada por uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 60% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 9; ii) a proteína SCR é codificada por uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 60% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 10; iii) a proteína WOX5 é codificada por uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 60% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 11; iv) as proteínas PLT1, PLT2, PLT3, PLT4, PLT5 e PLT7 são codificadas por uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 60% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 e SEQ ID NO: 19, respectivamente; v) a proteína RBR é codificada por uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 60% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 18; e vi) a proteína WIND1 é codificada por uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 60% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 29.
[0016] Em uma outra forma de realização, a célula de planta é parte de um tecido multicelular, de preferência, um tecido de calo, um órgão ou um explante de planta. De preferência, o órgão da planta é uma raiz.
[0017] Em uma forma de realização, a célula de planta pode ser obtida de uma planta selecionada do grupo que consiste em Arabidopsis, cevada, repolho, canola, mandioca, couve-flor, chicória, crisântemo, algodão, pepino, berinjela, uva, pimenta, alface, milho, melão, colza, batata, abóbora, arroz, centeio, sorgo, soja, abóbora, cana-de-açúcar, beterraba sacarina, girassol, pimentão, tomate, melancia, trigo e abobrinha. Opcionalmente, a célula de planta pode ser obtida a partir de uma planta da família das Solanaceae, opcionalmente do gênero Solanum, opcionalmente da espécie Solanum lycopersicum ou Solanum melongena. Opcionalmente, a célula de planta pode ser obtida da família de Brassicaceae, opcionalmente a espécie, ou subespécie, é Raphanus sativus, Brassica oleracea, Brassica rapa, Brassica napus, Armoracia rusticana ou Arabidopsis thaliana.
[0018] Em uma forma de realização, o método compreende uma etapa c) de formar uma planta ou parte da planta a partir do rebento regenerado.
[0019] Em um outro aspecto, a invenção se refere a uma composição que compreende pelo menos duas moléculas de ácido nucleico, em que i) uma primeira molécula de ácido nucleico compreende: ii) uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína WOX5 operacionalmente ligada a um promotor induzível; e iii) uma segunda molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína PLT selecionada do grupo que consiste em PLT1, PLT2, PLT3, PLT4, PLT5 e PLT7, de preferência PLT1, operacionalmente ligada a um promotor induzível.
[0020] Em outro aspecto, a invenção se refere a um construto de ácido nucleico que compreende a sequência de nucleotídeos da primeira e da segunda moléculas de ácido nucleico conforme definidas nesse documento.
[0021] De preferência, o construto de ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeos adicional que codifica um transativador que é, de preferência, operacionalmente ligado a um promotor, em que o transativador ao se ligar a um indutor, ativa o promotor induzível. De preferência, o referido promotor induzível é parte de pelo menos um cassete de expressão. De preferência, o referido promotor induzível é operacionalmente ligado a pelo menos uma das sequências de nucleotídeos que codificam proteínas SHR, SCR, WOX5, WIND, PLT1, PLT2, PLT3, PLT4, PLT5 e PLT7 e repressor de RBR conforme definido nessa invenção.
[0022] De preferência, o transativador é codificado por uma sequência de nucleotídeos tendo: i) pelo menos 60% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 21 e em que o transativador é capaz de se ligar ao corticoide dexamatasona ou um derivado do mesmo; ou ii) pelo menos 60% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 27 e em que o transativador é capaz de se ligar a β-estradiol ou um derivado do mesmo.
[0023] Em um outro aspecto, a invenção se refere a uma célula de planta que compreende pelo menos um de: i) uma primeira molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína WOX5 operacionalmente ligada a um promotor induzível e uma segunda molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína PLT selecionada do grupo que consiste em PLT1, PLT2, PLT3, PLT4, PLT5 e PLT7, de preferência PLT1, operacionalmente ligada a um promotor induzível; e ii) o construto de ácido nucleico conforme definida nesse documento.
[0024] Em outro aspecto, a invenção se refere a um rebento, planta ou parte da planta que pode ser obtido(a) pelo método conforme definido nesse documento.
[0025] Em um aspecto, a invenção se refere ao uso de uma combinação de proteínas conforme definidas nessa invenção, e opcionalmente um repressor de RBR conforme definido nessa invenção, ou uma composição de ácido nucleico ou construto conforme definido nessa invenção, para regenerar rebento de uma célula de planta.
Definições
[0026] Vários termos relacionados aos(às) métodos, composições, usos e outros aspectos da presente invenção são usados ao longo do relatório descritivo e das reivindicações. Esses termos devem ter seu significado comum na técnica à qual a invenção pertence, a menos que indicado de outra forma. Outros termos definidos especificamente devem ser interpretados de maneira consistente com a definição fornecida nesse documento.
[0027] É claro para a pessoa habilitada que quaisquer métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos descritos nesse documento podem ser usados para praticar a presente invenção.
[0028] Os métodos de realização das técnicas convencionais usadas nos métodos da invenção serão evidentes para o técnico habilitado. A prática de técnicas convencionais em biologia molecular, bioquímica, química computacional, cultura de células, DNA recombinante, bioinformática, sequenciamento genômico e campos relacionados são bem conhecidas dos habilitados na técnica e são discutidas, por exemplo, nas seguintes referências de literatura: Sambrook et al.. Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2ª Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; Ausubel et al..
Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley e Filhos, Nova Iorque, 1987 e atualizações periódicas; e a série Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego.
[0029] Os termos singulares “um”, “uma” e “o” e “a” incluem referentes plurais, a menos que o contexto dite claramente o contrário. Assim, por exemplo, a referência a “uma célula de planta” inclui uma combinação de duas ou mais células de planta e semelhantes. O artigo indefinido “um” ou “uma”, portanto, geralmente significa “pelo menos um(a)”.
[0030] O termo “e/ou” se refere a uma situação em que um ou mais dos casos apresentados podem ocorrer, sozinho ou em combinação tendo pelo menos um dos casos apresentados, até com todos os casos apresentados.
[0031] Como usado nesse documento, o termo “cerca de” é usado para descrever e explicar pequenas variações. Por exemplo, o termo pode se referir a menor que ou igual a ±(+ ou -) 10%, tal como menor que ou igual a ±5%, menor que ou igual a ±4%, menor que ou igual a ±3%, menor que ou igual a ±2%, menor que ou igual a ±1%, menor que ou igual a ±0,5%, menor que ou igual a ±0,1%, ou menor que ou igual a ±0,05%.
[0032] Adicionalmente, quantidades, razões e outros valores numéricos, às vezes, são apresentados nesse documento em um formato de faixa. Deve ser entendido que tal formato de faixa é usado por conveniência e brevidade e deve ser entendido de forma flexível para incluir valores numéricos explicitamente especificados como limites de uma faixa, mas também para incluir todos os valores numéricos individuais ou subfaixas englobadas dentro dessa faixa como se cada valor numérico e subfaixa sejam especificados explicitamente. Por exemplo, uma razão na faixa de cerca de 1 a cerca de 200 deve ser entendida para incluir os limites explicitamente indicados de cerca de 1 e cerca de 200, mas também para incluir razões individuais, tais como, cerca de 2, cerca de 3 e cerca de 4, e subfaixas, tais como, cerca de 10 a cerca de 50, cerca de 20 a cerca de 100 e assim por diante.
[0033] O termo “compreendendo” é interpretado como inclusivo e aberto, e não exclusivo. Especificamente, o termo e variações do mesmo significam que o(a)s recursos, etapas ou componentes especificados estão incluídos. Estes termos não devem ser interpretados para excluir a presença de outro(a)s recursos, etapas ou componentes.
[0034] O termo “hormônio de planta”, “hormônio de crescimento de planta”, “regulador de crescimento de planta” ou “fitormônio” deve ser entendido nesse documento como um produto químico que influencia o crescimento e o desenvolvimento de células e tecidos de planta. Os reguladores de crescimento de plantas compreendem compostos químicos dos cinco grupos a seguir: auxinas, citocininas, giberelinas, ácido abscísico (ABA) e etileno. Além dos cinco grupos principais, duas outras classes de compostos químicos são frequentemente consideradas reguladores do crescimento de plantas: brassinosteróides e poliaminas.
Para a indução da regeneração de rebentos em tecidos de planta, uma combinação de uma ou mais de citocininas e uma ou mais de auxinas é(são) geralmente empregada(s).
[0035] Os termos “proteína” ou “polipeptídeo” são usados indistintamente e se referem a moléculas que consistem em uma cadeia de aminoácidos, sem referência a um modo de ação, tamanho, estrutura tridimensional ou origem específico(a). Um “fragmento” ou “porção” de uma proteína pode, portanto, ainda ser referido como uma “proteína”. Uma “proteína isolada” é usada para se referir a uma proteína que não está mais em seu ambiente natural, por exemplo, in vitro ou em uma célula hospedeira de planta ou bactéria recombinante.
[0036] “Planta” se refere a toda a planta ou a partes de uma planta, tais como, células, tecidos ou órgãos (por exemplo, pólen, sementes, gametas, raízes, folhas, flores, botões de flores, anteras, frutos, etc.) obtidos a partir da planta, bem como derivados de qualquer um desses e progênies derivadas de tal planta por autofecundação ou cruzamento.
[0037] “Célula(s) de planta” inclui(em) protoplastos, gametas, culturas em suspensão, micrósporos, grãos de pólen, etc., isoladamente ou dentro de um tecido, órgão ou organismo. A célula de planta pode, por exemplo, ser parte de uma estrutura multicelular, tal como, um calo, órgão de planta meristema ou um explante.
[0038] “Condições similares” para o cultivo da planta/célula de planta significa, entre outras coisas, o uso de condições similares de temperatura, umidade, nutrição e luz, e irrigação e ritmo cicardiano similares.
[0039] Os termos “homologia”, “identidade de sequência” e semelhantes são usados indistintamente nesse 14 documento. A identidade de sequência é definida nesse documento como uma relação entre duas ou mais sequências de aminoácidos (polipeptídeos ou proteínas) ou duas ou mais sequências de ácidos nucleicos (polinucleotídeos), como determinado pela comparação das sequências. Na técnica, “identidade” também significa o grau de relação de sequência entre as sequências de aminoácidos ou de ácidos nucleicos, conforme o caso, como determinado pela correspondência entre as cadeias dessas sequências.
“Similaridade” entre duas sequências de aminoácidos é determinada comparando a sequência de aminoácidos e seus substitutos de aminoácidos conservados de um polipeptídeo com a sequência de um segundo polipeptídeo. “Identidade” e “similaridade” podem ser facilmente calculadas por métodos conhecidos. A porcentagem de identidade/similaridade de sequência pode ser determinada em todo o comprimento da sequência.
[0040] “Identidade de sequência” e “similaridade de sequência” podem ser determinadas pelo alinhamento de duas sequências de peptídeos ou duas sequências de nucleotídeos usando algoritmos de alinhamento global ou local, dependendo do comprimento das duas sequências. Sequências de comprimentos similares são, de preferência, alinhadas usando um algoritmo de alinhamento global (por exemplo, Needleman Wunsch) que alinha as sequências de forma ideal ao longo de todo o comprimento, enquanto as sequências de comprimentos substancialmente diferentes são, de preferência, alinhadas usando um algoritmo de alinhamento local (por exemplo, Smith Waterman). As sequências podem,
então, ser referidas como “substancialmente idênticas” ou
“essencialmente similares” quando elas (quando alinhadas de maneira ideal pelos programas GAP ou BESTFIT usando parâmetros padrão) compartilham pelo menos uma certa porcentagem mínima de identidade de sequência (conforme definido abaixo). GAP usa o algoritmo de alinhamento global
Needleman e Wunsch para alinhar duas sequências em todo o seu comprimento (comprimento total), maximizando o número de correspondências e minimizando o número de lacunas.
Um alinhamento global é usado de forma adequada para determinar a identidade da sequência quando as duas sequências têm comprimentos similares.
Geralmente, os parâmetros padrão GAP são usados, com uma penalidade de criação de lacuna = 50 (nucleotídeos)/8 (proteínas) e penalidade de extensão de lacuna = 3 (nucleotídeos)/2
(proteínas). Para nucleotídeos, a matriz de pontuação padrão usada é nwsgapdna e para proteínas, a matriz de pontuação padrão é Blosum62 (Henikoff & Henikoff, 1992,
PNAS 89, 915-919). Alinhamentos de sequência e pontuações para identidade de sequência percentual podem ser determinados usando programas de computador, tais como, GCG
Wisconsin Package, Versão 10.3 disponíveis na Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, CA 92121-3752 EUA, ou usando software de código aberto, tal como o programa “agulha” (usando o Algoritmo Needleman Wunsch global) ou “água” (usando o algoritmo Smith Waterman local) no EmbossWIN versão 2.10.0, usando os mesmos parâmetros do GAP acima, ou usando as configurações padrão (para ‘agulha’ como para ‘água’ e alinhamentos para proteínas e para DNA, a penalidade de abertura de lacuna padrão é 10,0 e a penalidade de extensão de lacuna padrão é 0,5; as matrizes de pontuação padrão são Blossum62 para proteínas e DNAFull para DNA). Quando as sequências têm comprimentos totais substancialmente diferentes, os alinhamentos locais, como aqueles que usam o algoritmo Smith Waterman, são preferidos.
[0041] Alternativamente, a porcentagem de similaridade ou identidade pode ser determinada por pesquisa em bancos de dados públicos, usando algoritmos, tais como, FASTA, BLAST, etc. Assim, as sequências de ácidos nucleicos e de proteína da presente invenção podem ainda ser usadas como uma “sequência de consulta” para realizar uma busca contra bancos de dados públicos para, por exemplo, identificar outros membros da família ou sequências relacionadas. Essas buscas podem ser realizadas usando os programas BLASTn e BLASTx (versão 2.0) de Altschul, et al. (1990) J. Mol.
Biol. 215:403-10. As pesquisas de nucleotídeos do BLAST podem ser realizadas com o programa NBLAST, pontuação = 100, comprimento de palavra = 12 para obter sequências de nucleotídeos homólogas às moléculas de ácido nucleico da invenção. As pesquisas de proteína de BLAST podem ser realizadas com o programa BLASTx, pontuação = 50, comprimento de palavra = 3 para obter sequências de aminoácidos homólogas às moléculas de proteína da invenção.
Para obter alinhamentos com lacunas para fins de comparação, Gapped BLAST pode ser utilizado como descrito em Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-
3402. Ao utilizar os programas BLAST e Gapped BLAST, os parâmetros padrão dos respectivos programas (por exemplo, BLASTx e BLASTn) podem ser usados. Ver a página inicial do National Center for Biotechnology Information em http://www.ncbi.nlm.nih.gov/.
[0042] O termo “complementaridade” é definido nesse documento como a identidade de sequência de uma sequência para uma fita totalmente complementar. Por exemplo, uma sequência que é 100% complementar (ou totalmente complementar) é entendida nesse documento como tendo 100% de identidade de sequência com a cadeia complementar e, por exemplo, uma sequência que é 80% complementar é entendida nesse documento como tendo 80% de identidade de sequência com a fita (totalmente) complementar.
[0043] Os termos “construto de ácido nucleico”, “vetor de ácido nucleico”, “vetor” e “vetor de expressão” são usados indistintamente nesse documento e são definidos nesse documento como uma molécula de ácido nucleico artificial resultante do uso de tecnologia de DNA recombinante. Os termos “construto de ácido nucleico” e “vetor de ácido nucleico”, portanto, não incluem moléculas de ácido nucleico de ocorrência natural, embora um construto de ácido nucleico possa compreender (partes de) moléculas de ácido nucleico de ocorrência natural.
[0044] O esqueleto do vetor pode ser, por exemplo, um vetor binário ou superbinário (ver, por exemplo, Patente US
5.591.616, US 2002138879 e WO 95/06722), um vetor cointegrado ou um vetor T-DNA, como conhecido na técnica e como descrito em outro lugar nesse documento, no qual um gene quimérico está integrado ou, se uma sequência reguladora de transcrição adequada já estiver presente, apenas uma sequência de ácidos nucleicos desejada (por exemplo, uma sequência de codificação, um sequência de repetição antissentido ou uma invertida) é integrada a jusante do sequência reguladora de transcrição. Os vetores podem compreender outros elementos genéticos para facilitar o seu uso na clonagem molecular, tais como, por exemplo, marcadores selecionáveis, múltiplos sítios de clonagem e semelhantes.
[0045] O termo “gene” significa um fragmento de DNA compreendendo uma região (região transcrita), que é transcrita em uma molécula de RNA (por exemplo, um mRNA) em uma célula. O gene pode ser operacionalmente ligado a regiões reguladoras adequadas (por exemplo, um promotor).
Um gene usualmente compreenderá vários fragmentos operativamente ligados, tais como, um promotor, uma sequência líder 5’, uma região de codificação e uma sequência 3’ não traduzida (extremidade 3’) compreendendo um sítio de poliadenilação.
[0046] “Expressão de um gene” se refere ao processo em que uma região de DNA que é operacionalmente ligada a regiões reguladoras apropriadas, particularmente um promotor, é transcrita em um RNA e, no caso de o RNA codificar uma proteína ou peptídeo biologicamente ativa(o), subsequentemente traduzida(o) em um(a) proteína ou peptídeo biologicamente ativo(a).
[0047] O termo “operacionalmente ligado” se refere a uma ligação de elementos polinucleotídicos em uma relação funcional. Um ácido nucleico é “operacionalmente ligado” quando é colocado em uma relação funcional com outra sequência de ácidos nucleicos. Por exemplo, um promotor, ou melhor, uma sequência reguladora da transcrição, é operacionalmente ligado a uma sequência de codificação se afetar a transcrição da sequência de codificação. Ligado operacionalmente pode significar que as sequências de DNA a serem ligadas são contíguas.
[0048] “Promotor” se refere a um fragmento de ácido nucleico que funciona para controlar a transcrição de um ou mais de ácidos nucleicos. Um fragmento do promotor é localizado a montante (5’) em relação à direção da transcrição do sítio de iniciação da transcrição do gene, e é estruturalmente identificado pela presença de um sítio de ligação para RNA polimerase dependente de DNA, sítio(s) de iniciação da transcrição e pode adicionalmente compreender quaisquer outras sequências de DNA, incluindo, mas não se limitando a, sítios de ligação de fator de transcrição, sítios de ligação de proteína repressora e ativadora e quaisquer outras sequências de nucleotídeos conhecidas por um habilitado na técnica para atuar direta ou indiretamente para regular a quantidade de transcrição do promotor.
[0049] Opcionalmente, o termo “promotor” também pode incluir a região UTR 5’ (região 5' não traduzida) (por exemplo, o promotor pode incluir nesse documento uma ou mais de partes a montante do códon de iniciação da tradução da região transcrita, uma vez que essa região pode ter um papel na transcrição e/ou tradução de regulação). Um promotor “constitutivo” é um promotor que é ativo na maioria dos tecidos sob a maioria das condições fisiológicas e de desenvolvimento. Um promotor “induzível”
é um promotor que é fisiologicamente (por exemplo, por aplicação externa de certos compostos) ou regulado pelo desenvolvimento. Um promotor “específico de tecido” só está ativo em tipos específicos de tecidos ou células.
[0050] O termo “regeneração” é definido nesse documento como a formação de um novo tecido e/ou um novo órgão a partir de uma única célula de planta, um calo, um explante, um tecido ou um órgão. De preferência, a regeneração é pelo menos uma de regeneração de rebento, formação de meristema apical ectópico e regeneração de raiz. A regeneração pode ocorrer por meio da embriogênese ou organogênese somática. No contexto da presente invenção, a regeneração inclui pelo menos organogênese, de preferência a regeneração é através do processo de organogênese. De preferência, a regeneração conforme definida nesse documento se refere, pelo menos, à formação de rebentos de novo. A regeneração pode incluir adicionalmente a formação de uma nova planta a partir de uma única célula de planta ou, por exemplo, um calo, um explante, um tecido ou um órgão. A célula de planta para regeneração pode ser uma célula de planta não diferenciada.
O processo de regeneração, portanto, pode ocorrer diretamente a partir de tecidos precursores ou indiretamente, por exemplo, através da formação de um calo.
[0051] “Condições que permitem a regeneração” é entendido nesse documento como um ambiente em que uma célula ou um tecido de planta pode se regenerar. Essas condições incluem, no mínimo, temperatura, nutrição, ritmo cirdadiano e irrigação adequados.
[0052] “Nível de expressão alterado” de uma proteína é entendido nesse documento como um nível de expressão que se desvia dos níveis de expressão endógena da proteína em uma célula de planta de tipo selvagem não modificada. A célula de planta não modificada e a célula de planta tendo uma expressão de proteína alterada têm, de preferência, a mesma referência genética. Os níveis de expressão alterados podem ser aumentados ou diminuídos em comparação com os níveis de expressão endógena. No contexto da invenção, os níveis de expressão alterados de WOX5, WIND1, SHR, SCR, PLT1, PLT2, PLT3, PLT4, PLT5 ou PLT7 são, de preferência, uma expressão aumentada ou introduzida. Um nível de expressão alterado de RBR é, de preferência, uma expressão diminuída. Os níveis de expressão podem ser medidos por qualquer método adequado na técnica, tais como, mas não se limitando a, qPCR, Northern blot, microarranjo, etc.
[0053] Descrição detalhada
[0054] A regeneração das células de planta requer a exposição das células aos hormônios de planta, tal como a citocinina e/ou auxina. Verificou-se que a expressão oportuna de um grupo específico de proteínas torna obsoleta a presença de tais hormônios de planta. Em outras palavras, observou-se que a expressão desse grupo específico de proteínas induz regeneração espontânea, em particular organogênese espontânea
[0055] Em um primeiro aspecto, a invenção, portanto, se refere a um método para regenerar uma célula de planta.
Em uma forma de realização, o método se refere à regeneração de um meristema a partir de uma célula de planta, em que, de preferência, o meristema cresce para formar rebentos. Portanto, a invenção se refere a um método para regenerar um rebento de uma célula de planta. O rebento pode ser dissecado da massa celular subjacente e induzido a formar raízes. Alternativamente, os rebentos podem ser dissecados da massa celular subjacente e as raízes podem ser formadas sem qualquer indução adicional.
[0056] A invenção, portanto, também se refere a um método para regenerar um rebento de uma célula de planta, sem a necessidade de que a célula de planta seja exposta a um hormônio de crescimento de planta para induzir ou estimular a regeneração. Portanto, o método conforme definido nessa invenção é um método independente de hormônio para regenerar um rebento de uma célula de planta.
[0057] De preferência, a regeneração dos rebentos é feita através do processo de organogênese. Portanto, o método para regeneração conforme definido nessa invenção é,
de preferência, um método para organogênese, de preferência, organogênese de rebentos. A organogênese de rebento pode ser uma organogênese direta do rebento ou uma organogênese indireta do rebento.
[0058] A este respeito, na cultura de tecidos de plantas, existem duas vias alternativas para a formação de novo de novas plantas (isto é, regeneração) a partir de explantes de calos ou de tecido: organogênese e embriogênese somática. Organogênese envolve induzir o calo ou tecido para formar órgãos (rebentos ou raízes). Um tipo preferido de organogênese em cultura de tecidos é a organogênese de rebentos. A embriogênese somática é o processo pelo qual explantes de calo ou tecido, usualmente através de uma fase de calo embriogênica, desenvolve estruturas semelhantes a embriões zigóticos, que germinam em plântulas completas (Chieng, LMN et al (2014) Induction of organogenesis and somatic embryogenesis of Gonystylus bancanus (Miq.) Kurz (Ramin) em Sarawak. SARAWAK FORESTRY Corporation & ITTO, Kuching, Malaysia & ITTO; ISBN 978-967- 12855-3-4). Essas vias diferem em uma série de características, como estabelecido nesse documento.
[0059] Explantes são pedaços de tecido primário retirados de uma planta, que podem servir como fonte de regeneração por meio da organogênese ou da embriogênese somática. Explantes podem incluir segmentos de caule e raiz, seções de folhas, seções de inflorescência, partes de mudas, tais como, cotilédones, hipocótilos e embriões de sementes imaturos e maduros (Thorpe, TA (1993) In vitro Organogenesis and Somatic Embryogenesis: Physiological and Biochemical Aspects. In: Roubelakis-Angelakis K.A., Van Thanh K.T. (eds) Morphogenesis in Plants. Série NATO ASI (Série A: Life Sciences), Vol. 253. Springer, Boston, MA).
Através da manipulação de reguladores de crescimento de plantas e condições de cultura, o explante pode desenvolver rebentos (ou raízes) diretamente. Isso é chamado de organogênese direta. Se a formação dos rebentos passa por uma fase de calo, isso é denominado organogênese indireta.
De forma similar, na embriogênese somática, os embriões podem se desenvolver diretamente do explante (embriogênese somática direta) ou por meio de uma fase de calo (embriogênese somática indireta, Thorpe, supra; Chieng et al., supra).
[0060] Organogênese do rebento: A organogênese do rebento é a via de regeneração pela qual as células do calo ou explante formam um meristema apical do rebento de novo que se desenvolve em um rebento com primórdios foliares e folhas. Como existe apenas um meristema apical, esta é uma estrutura unipolar e as raízes não são formadas neste estágio. O sistema vascular do rebento geralmente está conectado ao tecido original. Somente após os rebentos estarem totalmente formados e alongados e serem retirados do calo ou explante, a formação de raízes pode ser induzida em uma etapa de indução de raiz separada em um meio de cultura diferente (Thorpe, supra). Na técnica, a organogênese do caule é induzida por reguladores de crescimento de planta (PGRs), usualmente citocininas apenas em diferentes concentrações ou em combinação com uma auxina, em que as citocininas permanecem um constituinte do meio de cultura até que os novos meristemas apicais do caule e os rebentos tenham sido formados e são suficientemente alongados para retirá-los do explante primário ou calo.
[0061] As citocininas são, por exemplo, 6-aminopurina (BAP), zeatina, cinetina, tidiazuron (TDZ) e 6-( , - dimetilalilamino)purina (2-iP). Para organogênese de rebentos por uma combinação de citocinina e auxina, a razão citocinina para auxina deve ser >1 (Dodds, JH e Roberts, LW (1985) Experiments in plant tissue culture. Cambridge University Press, Cambridge, Reino Unido).
[0062] Embriogênese somática: Em contraste, a embriogênese somática leva à formação de estruturas bipolares semelhantes a embriões zigóticos, que contêm um eixo raiz-rebento com um sistema vascular independente fechado. Em outras palavras, os primórdios da raiz e do rebento estão sendo formados de maneira simultânea e não há conexão vascular com o tecido subjacente (Dodds e Roberts,
supra). A embriogênese somática pode ser induzida indiretamente a partir de calos ou suspensões de células,
ou podem ser induzidas diretamente em células de explantes
(Thorpe, supra). A formação do embrião somático passa por vários estágios distintos, desde o estágio globular
(pequenos aglomerados de células isodiamétricas), passando pelo estágio cardíaco (estruturas bilateralmente simétricas) até o estágio de torpedo (alongamento). A transição globular para coração é marcada pelo crescimento dos dois cotilédones e o início do desenvolvimento da radícula ((Zimmerman, JL (1993) Somatic Embryogenesis: A
Model for Early Development in Higher Plants.
The Plant
Cell 5: 1411-1423; Von Arnold et al (2002) Developmental pathways of somatic embryogenesis.
Plant Cell, Tissue and
Organ Culture 69: 233–249). Finalmente, embriões somáticos em estágio de torpedo podem se desenvolver em plântulas que contêm cotilédones verdes, hipocótilos alongados e radículas desenvolvidas com pelos de raiz claramente diferenciados (Zimmerman, supra), em um processo que é denominado ‘germinação’ (análogo a embriões zigóticos) ou
‘conversão’ ou ‘maturação’ (Von Arnold et al., supra ). Na indução da embriogênese somática, direta ou indiretamente,
as auxinas são usadas no estágio inicial para induzir um estado embriogênico no calo, mas os embriões só se formam após a passagem da cultura para um meio sem ou com níveis reduzidos de auxinas. As auxinas usadas para indução de embriões somáticos são, por exemplo, ácido 1- naftalenoacético (NAA), ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D), picloram e dicamba.
Tabela 1. Diferenças entre organogênese e embriogênese somática de acordo com a técnica Organogênese Embriogênese somática Unipolar Bipolar Tecido vascular conectado ao Tecido vascular não conectado tecido subjacente Indução por alto nível de Indução por alta razão de citocinina ou alta razão de citocinina para auxina auxina para citocinina embriões somáticos se indução contínua em crescimento formam após a remoção ou de plantas redução da auxina passa por fases distintas de Sem fases distintas formação do embrião nenhum cotilédone ou radícula ou embriões contêm cotilédones e embrião formado radícula (a)
[0063] Em uma forma de realização, a invenção se refere a um método para regenerar uma célula de planta, de preferência um rebento de uma célula de planta, em que o método compreende uma etapa de introdução ou aumento da expressão de pelo menos uma proteína SHORT ROOT (SHR). Os termos SHR, SGR7, SHOOT GRAVITROPISM 7 e SHORT ROOT são usados indistintamente nesse documento. De preferência, a expressão é temporariamente introduzida ou aumentada. A proteína SHR é um fator de transcrição, que pode ser expressado na estela e se deslocar para as células vizinhas, incluindo o centro quiescente.
[0064] O centro quiescente é um grupo de células que agem como um organizador para prevenir a diferenciação das células-tronco circundantes. Cada célula-tronco que é adjacente ao centro quiescente se divide assimetricamente para se renovar e produzir uma célula filha que se divide várias vezes na zona meristemática antes de sair do ciclo celular na zona de transição. Subsequentemente, as células se alongam e adquirem um status de diferenciação específico. As células-tronco que são distais ao centro quiescente produzem células-filhas que se diferenciam (Heidstra e Sabatini, 2014). No centro quiescente, SHR pode ativar SCARECROW (SCR).
[0065] Além disso, ou alternativamente, o método compreende uma etapa de introdução ou aumento da expressão de pelo menos uma proteína SCARECROW (SCR). Os termos SCR, SCARECROW, SGR1 e SHOOT GRAVITROPISM 1 são usados indistintamente nesse documento. De preferência, a expressão é temporariamente introduzida ou aumentada. A proteína SCR é conhecida por ser necessária para a especificação do centro quiescente, está envolvida na manutenção das células-tronco e na diferenciação de sua progênie. No centro quiescente, o SCR pode reprimir diretamente a expressão do fator de transcrição ARR1 da resposta à citocinina que promove a diferenciação.
[0066] Além disso, ou alternativamente, o método compreende uma etapa de introdução ou aumento da expressão de pelo menos uma proteína homeobox 5 (WOX5) relacionada a WUSCHEL. De preferência, a expressão é temporariamente introduzida ou aumentada. WOX5 é um homólogo de WUS e marca o centro quiescente desde o início. A perda da função WOX5 é conhecida por resultar na diferenciação das células- tronco da columela distal sem alterar o crescimento da raiz e o tamanho do meristema. No entanto, as análises de mutantes indicaram que WOX5 pode controlar redundantemente a manutenção de células-tronco proximais (Sarkar et al.
2007).
[0067] Além disso, ou alternativamente, o método compreende uma etapa de introdução ou aumento da expressão de pelo menos uma proteína PLETHORA (PLT). De preferência, a expressão é temporariamente introduzida ou aumentada. As proteínas PLT se acumulam no centro quiescente para formar um gradiente instrutivo e os níveis mais altos de proteína no nicho de células-tronco coincidem com o máximo de auxina. As PLTs podem regular a expressão da família do gene PIN, o que sugere uma malha de alimentação direta para manter altos níveis de auxina e PLT no nicho de células- tronco (Heidstra and Sabatini, 2014). A proteína PLT pode ser selecionada do grupo que consiste em PLT1, PLT2, PLT3, PLT4, PLT5 e PLT7.
[0068] Além disso, ou alternativamente, o método compreende uma etapa de introdução ou aumento da expressão de pelo menos 2, 3, 4 ou 5 proteínas PLT, de preferência, pelo menos 3 proteínas PLT, e de preferência uma etapa de introdução ou aumento da expressão de 3 proteínas PLT. De preferência, a expressão de pelo menos 2, 3, 4, 5 ou 6 proteínas PLT é temporariamente introduzida ou aumentada.
As proteínas PLT podem ser selecionadas do grupo que consiste em PLT1, PLT2, PLT3, PLT4, PLT5 e PLT7. De preferência, as proteínas PLT para uso no método da invenção são PLT1, PLT4 e PLT5. De preferência, a expressão dessas três proteínas é temporariamente introduzida ou aumentada. Os termos PLT4 e BBM são usados indistintamente nesse documento. De forma similar, os termos PLT5, AIL5, AINTEGUMENTA-LIKE 5, CHO1, CHOTTO 1, EMBRYOMAKER e EMK podem ser usados indistintamente nesse documento. Além disso, os termos PLT7, AIL7, AINTEGUMENTA-LIKE 7 e PLETHORA 7 podem ser usados indistintamente nesse documento.
[0069] Além disso, ou alternativamente, o método compreende uma etapa para diminuir na célula de planta a expressão de uma proteína relacionada a retinoblastoma (RBR). Os termos RBR, ATRBR1, RB, RB1, RBR1, RETINOBLASTOMA 1, RELACIONADA A RETINOBLASTOMA, RELACIONADA A
RETINOBLASTOMA 1 e PROTEÍNA RELACIONADA A RETINOBLASTOMA 1 são usados indistintamente nesse documento. De preferência, a expressão da proteína RBR é temporariamente diminuída. A proteína RBR, o homólogo de planta da proteína supressora de tumor RB, tem um papel crucial nos nichos de células- tronco do rebento e da raiz. Como em animais, RBR inibe a progressão do ciclo celular ao interagir com um homólogo do fator de transcrição E2F. Além disso, níveis reduzidos de RBR resultam em um aumento no número de células-tronco, e níveis aumentados de RBR levam à diferenciação de células- tronco, o que indica um papel proeminente para RBR na manutenção das células-tronco (Heidstra e Sabatini, 2014).
[0070] Além disso ou alternativamente, o método compreende uma etapa de introdução ou aumento da expressão de pelo menos uma DIFERENCIAÇÃO CELULAR INDUZIDA POR FERIDA 1 (WIND1). Os termos WIND1, ATWIND1, RAP2.4, RELACIONADO A AP2 4 e DIFERENCIAÇÃO CELULAR INDUZIDA POR FERIDA 1 podem ser usados indistintamente nesse documento. De preferência, a expressão da proteína WIND1 é temporariamente introduzida ou aumentada. A proteína WIND1 é um regulador central da reprogramação celular induzida por feridas em plantas. Foi demonstrado anteriormente que WIND1 promove a formação de calos e regeneração de rebentos, regulando positivamente a expressão do gene ESR1 em Arabidopsis thaliana (Iwase et al, 2017).
[0071] Em uma forma de realização, a invenção se refere a um método para regenerar uma célula de planta, de preferência, um rebento de uma célula de planta, em que o método compreende a etapa de aumentar na célula de planta a expressão de pelo menos uma combinação das proteínas detalhadas nesse documento acima, como uma das seguintes combinações de proteínas:
- uma proteína SHR e uma proteína SCR;
- uma proteína SHR e uma proteína WOX5;
- uma proteína SHR e pelo menos uma ou mais de proteínas PLT;
- uma proteína SHR e uma proteína WIND1;
- uma proteína SCR e uma proteína WOX5;
- uma proteína SCR e pelo menos uma ou mais de proteínas PLT;
- uma proteína SCR e uma proteína WIND1;
- uma proteína WOX5 e pelo menos uma ou mais de proteínas PLT;
- uma proteína WOX5 e uma proteína WIND1;
- uma ou mais de proteínas PLT e uma proteína WIND1;
- uma proteína SHR, uma proteína SCR e uma proteína
WOX5;
- uma proteína SHR, uma proteína SCR e pelo menos uma ou mais de proteínas PLT;
- uma proteína SHR, uma proteína SCR e uma proteína
WIND1; - uma proteína SHR, uma proteína WOX5 e pelo menos uma ou mais de proteínas PLT; - uma proteína SHR, uma proteína WOX5 e uma proteína WIND1; - uma proteína SCR, uma proteína WOX5 e pelo menos uma ou mais de proteínas PLT; - uma proteína SCR, uma proteína WOX5 e uma proteína WIND1; - uma WOX5, pelo menos uma ou mais de proteínas PLT e uma proteína WIND1; - uma proteína SHR, uma proteína SCR, uma proteína WOX5 e pelo menos uma ou mais de proteínas PLT; - uma proteína SHR, uma proteína SCR, uma proteína WOX5 e uma proteína WIND1; - uma proteína SHR, uma proteína SCR, pelo menos uma ou mais de proteínas PLT, e uma proteína WIND1 - uma proteína SHR, uma proteína WOX5, pelo menos uma ou mais de proteínas PLT e uma proteína WIND1; - uma proteína SCR, uma proteína WOX5, pelo menos uma ou mais de proteínas PLT, uma proteína WIND1; e - uma proteína SHR, uma proteína SCR, uma proteína WOX5, pelo menos uma ou mais de proteínas PLT, uma proteína WIND1.
[0072] De preferência, a expressão das proteínas listadas acima é temporariamente introduzida ou aumentada na célula de planta.
[0073] De preferência, uma ou mais de proteínas PLT é(são) selecionada(s) do grupo que consiste em PLT1, PLT2, PLT3, PLT4, PLT5 e PLT7, de preferência, as proteínas PLT selecionadas incluem pelo menos um ou mais de PLT1, PLT4 e PLT5. De preferência, uma ou mais de proteínas PLT é(são) PLT1 ou pelo menos PLT1. De preferência, as proteínas PLT são PLT1, PLT4 e PLT5.
[0074] Além de cada uma dessas combinações listadas acima, a expressão de uma proteína RBR endógena pode ser diminuída na célula de planta. De preferência, a expressão da proteína RBR é temporariamente diminuída.
[0075] Em uma forma de realização particularmente preferida, a invenção se refere a um método para regenerar uma célula de planta, de preferência, um rebento de uma célula de planta, em que o método compreende a etapa de alterar na célula de planta a expressão de pelo menos uma das seguintes combinações de proteínas: - aumentar a expressão de uma proteína WOX5 e uma proteína PLT1 - aumentar a expressão de uma proteína WIND1, uma proteína WOX5 e uma proteína PLT1; - aumentar a expressão de uma proteína SHR, uma proteína SCR, uma proteína WOX5, uma proteína PLT1, PLT 4 e
PLT5; e - aumentar a expressão de uma proteína WIND1 e uma proteína SHR, uma proteína SCR, uma proteína WOX5, uma proteína PLT1, PLT 4 e PLT5, e regulação negativa de uma proteína RBR, de preferência regulação negativa temporária da proteína RBR.
[0076] De preferência, a expressão introduzida ou aumentada das proteínas listadas acima é temporariamente introduzida ou aumentada na célula de planta.
[0077] Em uma forma de realização, o método compreende uma etapa de permitir que a célula de planta se regenere, de preferência no rebento.
[0078] Em uma forma de realização, as proteínas na combinação de proteínas são derivadas de diferentes famílias, por exemplo, derivadas de 2, 3, 4, 5 ou 6 famílias diferentes. A primeira família inclui RBR, a segunda família inclui WIND1, a terceira família inclui SHR, a quarta família inclui SCR, a quinta família inclui WOX5 e a sexta família inclui as proteínas PLT, em particular a sexta família inclui PLT1, PLT2, PLT3, PLT4, PLT5 e PLT7. A pessoa habilitada entende que outros membros da família podem ser igualmente adequados no método da invenção.
[0079] Em uma forma de realização, a invenção se refere a um método para regenerar uma célula de planta, de preferência, um rebento de uma célula de planta, compreendendo as etapas de: a1) introduzir ou aumentar na célula de planta da expressão de uma proteína WOX5 e de pelo menos uma proteína PLT. De preferência, a pelo menos uma proteína PLT é selecionada do grupo que consiste em PLT1, PLT2, PLT3, PLT4, PLT5 e PLT7. De preferência, a pelo menos uma proteína PLT é PLT1. De preferência, a expressão de pelo menos uma da proteína WOX5 e pelo menos uma proteína PLT é temporariamente introduzida ou aumentada e a2) opcionalmente diminuir na célula de planta a expressão de uma proteína RBR endógena, em que de preferência, a expressão da proteína RBR é temporariamente diminuída; e b) permitir que a célula da planta se regenere, de preferência, no rebento.
[0080] Em uma forma de realização, a invenção se refere a um método para regenerar uma célula de planta, de preferência um rebento de uma célula de planta, compreendendo as etapas de: a1) introduzir ou aumentar na célula de planta da expressão de uma proteína WOX5, pelo menos uma proteína PLT e WIND1. De preferência, a pelo menos uma proteína PLT é selecionada do grupo que consiste em PLT1, PLT2, PLT3, PLT4, PLT5 e PLT7. De preferência, a pelo menos uma proteína PLT é PLT1. De preferência, a expressão de pelo menos uma da proteína WOX5, da proteína WIND1 e pelo menos uma proteína PLT é temporariamente introduzida ou aumentada e a2) opcionalmente diminuir na célula de planta a expressão de uma proteína RBR endógena, em que de preferência, a expressão da proteína RBR é temporariamente diminuída; e b) permitir que a célula da planta se regenere, de preferência no rebento.
[0081] Em uma forma de realização, a invenção se refere a um método para regenerar uma célula de planta, de preferência, um rebento de uma célula de planta, compreendendo as etapas de: a1) introduzir ou aumentar na célula de planta a expressão de uma proteína SHR, uma proteína SCR, uma proteína WOX5 e pelo menos uma proteína PLT. De preferência, a pelo menos uma proteína PLT é selecionada do grupo que consiste em PLT1, PLT2, PLT3, PLT4, PLT5 e PLT7.
De preferência, a expressão de pelo menos uma da proteína SHR, da proteína SCR, da proteína WOX5 e pelo menos uma proteína PLT é temporariamente introduzida ou aumentada e a2) opcionalmente diminuir na célula de planta a expressão de uma proteína RBR endógena, em que de preferência, a expressão da proteína RBR é temporariamente diminuída; e b) permitir que a célula da planta se regenere, de preferência, no rebento.
[0082] Em uma outra forma de realização, a invenção se refere a um método para regenerar uma célula de planta, de preferência, um rebento de uma célula de planta, compreendendo as etapas de: a1) introduzir ou aumentar na célula de planta a expressão de uma proteína SHR, uma proteína SCR, uma proteína WOX5 e pelo menos duas proteínas PLT. De preferência, as pelo menos duas proteínas PLT são selecionadas do grupo que consiste em PLT1, PLT2, PLT3, PLT4, PLT5 e PLT7. De preferência, a expressão de pelo menos uma da proteína SHR, da proteína SCR, da proteína WOX5 e pelo menos uma das duas proteínas PLT, ou ambas as proteínas PLT, é temporariamente introduzida ou aumentada; a2) opcionalmente diminuir na célula de planta a expressão de uma proteína RBR endógena, em que de preferência, a expressão da proteína RBR é temporariamente diminuída; e b) permitir que a célula da planta se regenere, de preferência, no rebento.
[0083] Em outra forma de realização, a invenção se refere a um método para gerar uma célula de planta, de preferência, regenerando um rebento de uma célula de planta, em que o método compreende as etapas de a1) introduzir ou aumentar na célula de planta a expressão de uma proteína SHR, uma proteína SCR, uma proteína WOX5 e pelo menos três proteínas PLT. De preferência, as pelo menos três proteínas PLT são selecionadas do grupo que consiste em PLT1, PLT2, PLT3, PLT4, PLT5 e PLT7. De preferência, as pelo menos três proteínas PLT selecionadas incluem pelo menos uma ou mais de PLT1, PLT4 e PLT5. De preferência, as pelo menos três proteínas PLT selecionadas são PLT1, PLT4 e PLT5. De preferência, a expressão de pelo menos uma das proteínas SHR, proteína SCR, proteína WOX5 e pelo menos uma das proteínas PLT selecionadas do grupo que consiste em PLT1, PLT2, PLT3, PLT4, PLT5 e PLT7 é temporariamente introduzida ou aumentada. De preferência, a expressão de pelo menos uma da proteína SHR, da proteína SCR, da proteína WOX5, da proteína PLT1, da proteína PLT4 e da proteína PLT5 é temporariamente introduzida ou aumentada; a2) opcionalmente diminuir na célula de planta a expressão de uma proteína RBR endógena, em que de preferência, a expressão da proteína RBR é temporariamente diminuída; e b) permitir que a célula de planta se regenere, de preferência em um rebento.
[0084] Em outra forma de realização, a invenção se refere a um método para gerar uma célula de planta, de preferência, regenerando um rebento de uma célula de planta, em que o método compreende as etapas de:
a1) introduzir ou aumentar na célula de planta a expressão de uma proteína SHR, uma proteína SCR, uma proteína WOX5, uma proteína WIND1 e pelo menos três proteínas PLT.
De preferência, as pelo menos três proteínas
PLT são selecionadas do grupo que consiste em PLT1, PLT2,
PLT3, PLT4, PLT5 e PLT7. De preferência, as pelo menos três proteínas PLT selecionadas incluem pelo menos uma ou mais de PLT1, PLT4 e PLT5. De preferência, as pelo menos três proteínas PLT selecionadas são PLT1, PLT4 e PLT5. De preferência, a expressão de pelo menos uma da proteína SHR,
da proteína SCR, da proteína WOX5, da proteína WIND1 e pelo menos uma das proteínas PLT selecionadas do grupo que consiste em PLT1, PLT2, PLT3, PLT4, PLT5 e PLT7 é temporariamente introduzida ou aumentada.
De preferência, a expressão de pelo menos uma da proteína SHR, da proteína
SCR, da proteína WOX5, da WIND1, da proteína PLT1, da proteína PLT4 e da proteína PLT5 é temporariamente introduzida ou aumentada;
a2) opcionalmente diminuir na célula de planta a expressão de uma proteína RBR endógena, em que de preferência, a expressão da proteína RBR é temporariamente diminuída; e b) permitir que a célula de planta se regenere, de preferência em um rebento.
Proteínas para uso no método da invenção
[0085] A combinação de proteínas para uso na invenção inclui pelo menos um de SHR, SCR, WOX5, PLT1, PLT2, PLT3, PLT4, PLT5, PLT7, RBR e WIND1. De preferência, a combinação de proteínas para uso no método inclui pelo menos WOX5 e uma proteína PLT selecionada do grupo que consiste em PLT1, PLT2, PLT3, PLT4, PLT5 e PLT7.
[0086] Combinações particularmente preferidas de proteínas compreendem pelo menos ou no máximo: - uma proteína WOX5 e uma proteína PLT1 - uma proteína WIND1, uma proteína WOX5 e uma proteína PLT1; - uma proteína SHR, uma proteína SCR, uma proteína WOX5, uma proteína PLT1, PLT 4 e PLT5; e - uma proteína WIND1 e uma proteína SHR, uma proteína SCR, uma proteína WOX5, uma proteína PLT1, PLT 4 e PLT5 e uma proteína RBR,
[0087] De preferência, as proteínas das combinações de proteínas têm uma expressão induzida ou aumentada, com exceção de RBR. De preferência, a proteína RBR tem uma expressão diminuída.
[0088] A sequência de aminoácidos da proteína SHR pode ter pelo menos cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%,
85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1. SEQ ID NO: 1 é a proteína SHR de Arabidopsis thaliana (ver Tabela 5 para uma visão geral de todas as SEQ ID NOs usadas nesse documento). Em uma forma de realização, a sequência de aminoácidos SHR é ou é derivada de AT4G37650, um homólogo da mesma, ou uma sequência tendo pelo menos cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com AT4G37650 ou seu homólogo.
[0089] A sequência de aminoácidos da proteína SCR pode ter pelo menos cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 2. A SEQ ID NO: 2 é a proteína SCR de Arabidopsis thaliana. Em uma forma de realização, a sequência de aminoácidos SCR é ou é derivada de AT3G54220, um homólogo da mesma, ou uma sequência tendo pelo menos cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com AT3G54220 ou seu homólogo.
[0090] A sequência de aminoácidos da proteína WOX5 pode ter pelo menos cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 3. A SEQ ID NO: 3 é a proteína WOX5 de Arabidopsis thaliana. Em uma forma de realização, a sequência de aminoácidos WOX5 é ou é derivada de AT3G11260,
um homólogo da mesma, ou uma sequência tendo pelo menos cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com AT3G11260 ou seu homólogo.
[0091] A sequência de aminoácidos da proteína PLT1 pode ter pelo menos cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 4. A SEQ ID NO: 4 é a proteína PLT1 de Arabidopsis thaliana. Em uma forma de realização, a sequência de aminoácidos PLT1 é ou é derivada de AT3G20840, um homólogo da mesma, ou uma sequência tendo pelo menos cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com AT3G20840 ou seu homólogo.
[0092] A sequência de aminoácidos da proteína PLT2 pode ter pelo menos cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 5. A SEQ ID NO: 5 é a proteína PLT2 de Arabidopsis thaliana. Em uma forma de realização, a sequência de aminoácidos PLT2 é ou é derivada de AT1G51190, um homólogo da mesma, ou uma sequência tendo pelo menos cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com AT1G51190 ou seu homólogo.
[0093] A sequência de aminoácidos da proteína PLT3 pode ter pelo menos cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 6. A SEQ ID NO: 6 é a proteína PLT3 de Arabidopsis thaliana. Em uma forma de realização, a sequência de aminoácidos PLT3 é ou é derivada de AT5G10510, um homólogo da mesma, ou uma sequência tendo pelo menos cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com AT5G10510 ou seu homólogo.
[0094] A sequência de aminoácidos da proteína PLT4 pode ter pelo menos cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 7. A SEQ ID NO: 7 é a proteína PLT4 de Arabidopsis thaliana. Em uma forma de realização, a sequência de aminoácidos PLT4 é ou é derivada de AT5G17430, um homólogo da mesma, ou uma sequência tendo pelo menos cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com AT5G17430 ou seu homólogo.
[0095] A sequência de aminoácidos da proteína PLT5 pode ter pelo menos cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8. A SEQ ID NO: 8 é a proteína PLT5 de Arabidopsis thaliana. Em uma forma de realização, a sequência de aminoácidos PLT5 é ou é derivada de AT5G57390,
um homólogo da mesma, ou uma sequência tendo pelo menos cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com AT5G57390 ou seu homólogo.
[0096] A sequência de aminoácidos da proteína PLT7 pode ter pelo menos cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 30. A SEQ ID NO: 30 é a proteína PLT7 de Arabidopsis thaliana. Em uma forma de realização, a sequência de aminoácidos PLT7 é ou é derivada de AT5G65510, um homólogo da mesma, ou uma sequência tendo pelo menos cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com AT5G65510 ou seu homólogo.
[0097] A sequência de aminoácidos da proteína WIND1 pode ter pelo menos cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 28. A SEQ ID NO: 28 é a proteína WIND1 de Arabidopsis thaliana. Em uma forma de realização, a sequência de aminoácidos WIND1 é ou é derivada de AT1G78080, um homólogo da mesma, ou uma sequência tendo pelo menos cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com AT1G78080 ou seu homólogo.
[0098] A sequência de aminoácidos da proteína RBR pode ter pelo menos cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 17. A SEQ ID NO: 17 é a proteína RBR de Arabidopsis thaliana. Em uma forma de realização, a sequência de aminoácidos RBR é ou é derivada de AT3G12280, um homólogo da mesma, ou uma sequência tendo pelo menos cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com AT3G12280 ou seu homólogo.
[0099] As proteínas, conforme definidas nesse documento, podem compreender adicionalmente uma etiqueta, tal como, mas não se limitando a, uma etiqueta T7 (por exemplo, etiqueta T7 tendo pelo menos cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85 %, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 53), uma etiqueta Myc (por exemplo, etiqueta Myc tendo uma sequência de pelo menos cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 43), etiqueta FLAG (por exemplo, etiqueta FLAG tendo uma sequência de pelo menos cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 46), uma etiqueta V5 (por exemplo, etiqueta V5 tendo pelo menos cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 50), ou uma etiqueta His. De preferência, a etiqueta está localizada no terminal C da proteína, antes do códon de parada original.
Ácidos nucleicos para uso no método da invenção
[00100] Em uma forma de realização, a proteína SHR é codificada por uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 9. A sequência de nucleotídeos que codifica a proteína SHR pode ser o, ou pode ser derivada do, gene AT4G37650, um homólogo do mesmo ou uma sequência tendo pelo menos cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com AT4G37650 ou seu homólogo. A porcentagem de identidade pode ser determinada em todo o comprimento da sequência genômica. Alternativamente, a percentagem de identidade pode ser determinada ao longo de todo o comprimento da sequência de codificação do gene.
[00101] Exemplos de homólogos incluem Brachypodium distachyon (Braquipódio-de-duas-espigas) (BRADI1G23060), Glycine max (Soja) (GLYMA01G40180, GLYMA05G22460, GLYMA11G05110, GLYMA11G23690 ou GLYMA17G17400), Oryza sativa (Arroz) (SHR1 e SHR2), Physcomitrella patens (Musgo) (PHYPADRAFT_14911 e PHYPADRAFT_22633), Populus trichocarpa (Álamo bálsamo ocidental) (POPTR_0012S06430G), Solanum lycopersicum (Tomate) (SOLYC02G092370.1), Sorghum bicolor (Sorgo) (SB01G031720 e SB02G037890) e Vitis vinifera (Uva) VIT_07S0129G00030.
[00102] Em uma forma de realização, a proteína SCR é codificada por uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 10. A sequência de nucleotídeos que codifica a proteína SCR pode ser, ou pode ser derivada do, gene AT3G54220, um homólogo do mesmo, ou uma sequência tendo pelo menos cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com AT3G54220 ou seu homólogo. A porcentagem de identidade pode ser determinada em todo o comprimento da sequência genômica. Alternativamente, a percentagem de identidade pode ser determinada ao longo de todo o comprimento da sequência de codificação do gene.
[00103] Exemplos de homólogos incluem Brachypodium distachyon (Braquipódio-de-duas-espigas) (BRADI4G44090), Glycine max (Soja) (GLYMA09G40620 e GLYMA18G45220), Oryza sativa (Arroz) (SCR1 e SCR2), Physcomitrella patens (Musgo) (PHYPADRAFT_150910, PHYPADRAFT_22273, PHYPADRAFT_42008 e PHYPADRAFT_65480), Populus trichocarpa (Álamo bálsamo ocidental) (POPTR_0006S11500G e POPTR_0016S15060G), Solanum lycopersicum (Tomate) SOLYC10G074680.1, Sorghum bicolor
(Sorgo) SB05G001500 e Vitis vinifera (Uva) VIT_08S0056G00050.
[00104] Em uma forma de realização, a proteína WOX5 é codificada por uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 11. A sequência de nucleotídeos que codifica a proteína WOX5 pode ser, ou pode ser derivada do, gene AT3G11260, um homólogo do mesmo ou uma sequência tendo pelo menos cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com AT3G11260 ou seu homólogo. A porcentagem de identidade pode ser determinada em todo o comprimento da sequência genômica. Alternativamente, a percentagem de identidade pode ser determinada ao longo de todo o comprimento da sequência de codificação do gene.
[00105] Exemplos de homólogos incluem Arabidopsis thaliana (Erva-estrelada) (AT5G05770.1), Brachypodium distachyon (Braquipódio-de-duas-espigas) (BRADI2G55270), Glycine max (Soja) (GLYMA02G42200), Oryza sativa (Arroz) (WOX9), Populus trichocarpa (Álamo bálsamo ocidental) (POPTR_0008S06560G e POPTR_0010S19950G), Solanum lycopersicum (Tomate) (SOLYC03G096300.2), Sorghum bicolor (Sorgo) (SB03G040210) e Vitis vinifera (Uva) (VIT_13S0019G03460).
[00106] Em uma forma de realização, a proteína PLT1 é codificada por uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 12. A sequência de nucleotídeos que codifica a proteína PLT1 pode ser, ou pode ser derivada do, gene AT3G20840, um homólogo do mesmo, ou uma sequência tendo pelo menos cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com AT3G20840 ou seu homólogo. A porcentagem de identidade pode ser determinada em todo o comprimento da sequência genômica. Alternativamente, a percentagem de identidade pode ser determinada ao longo de todo o comprimento da sequência de codificação do gene.
[00107] Exemplos de homólogos incluem Arabidopsis thaliana (Erva-estrelada) (AT1G51190.1), Glycine max (Soja) (GLYMA11G14040 e GLYMA12G06010), Populus trichocarpa (Álamo bálsamo ocidental) (POPTR_0001S05580G e POPTR_0003S20470G), Solanum lycopersicum (Tomate) (SOLYC11G061750.1), e Vitis vinifera (Uva) (VIT_06S0004G01800).
[00108] Em uma forma de realização, a proteína PLT2 é codificada por uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 13. A sequência de nucleotídeos que codifica a proteína PLT2 pode ser ou pode ser derivada do gene AT1G51190, um homólogo do mesmo ou uma sequência tendo pelo menos cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com AT1G51190 ou seu homólogo. A porcentagem de identidade pode ser determinada em todo o comprimento da sequência genômica. Alternativamente, a percentagem de identidade pode ser determinada ao longo de todo o comprimento da sequência de codificação do gene.
[00109] Exemplos de homólogos incluem Arabidopsis thaliana (Erva-estrelada) (AT3G20840.1), Glycine max (Soja) (GLYMA11G14040 e GLYMA12G06010), Populus trichocarpa (Álamo bálsamo ocidental) (POPTR_0001S05580G e POPTR_0003S20470G), Solanum lycopersicum (Tomate SOLYC11G061750.1) e Vitis vinifera (Uva) (VIT_06S0004G01800).
[00110] Em uma forma de realização, a proteína PLT3 é codificada por uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 14. A sequência de nucleotídeos que codifica a proteína PLT3 pode ser, ou pode ser derivada do, gene AT5G10510, um homólogo do mesmo, ou uma sequência tendo pelo menos cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com AT5G10510 ou seu homólogo. A porcentagem de identidade pode ser determinada em todo o comprimento da sequência genômica. Alternativamente, a percentagem de identidade pode ser determinada ao longo de todo o comprimento da sequência de codificação do gene.
[00111] Em uma forma de realização, a proteína PLT4 é codificada por uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 15. A sequência de nucleotídeos que codifica a proteína PLT4 pode ser, ou pode ser derivada do, gene AT5G17430, um homólogo do mesmo, ou uma sequência tendo pelo menos cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com AT5G17430 ou seu homólogo. A porcentagem de identidade pode ser determinada em todo o comprimento da sequência genômica. Alternativamente, a percentagem de identidade pode ser determinada ao longo de todo o comprimento da sequência de codificação do gene.
[00112] Os exemplos de homólogos incluem Brachypodium distachyon (Braquipódio-de-duas-espigas) (BRADI3G48697 e BRADI5G14960), Glycine max (Soja) (GLYMA09G38370 e GLYMA10G31440), Oryza sativa (Arroz) (OSJNBB0116K07.8), Populus trichocarpa (Álamo bálsamo ocidental) (POPTR_0008S07610G e POPTR_0010S18840G), Solanum lycopersicum (Tomate) (SOLYC11G008560.1) e Sorghum bicolor
(Sorgo) (SB04G025960).
[00113] Em uma forma de realização, a proteína PLT5 é codificada por uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 16. A sequência de nucleotídeos que codifica a proteína PLT5 pode ser ou pode ser derivada do gene AT5G57390, um homólogo do mesmo, ou uma sequência tendo pelo menos cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com AT5G57390 ou seu homólogo. A porcentagem de identidade pode ser determinada em todo o comprimento da sequência genômica. Alternativamente, a percentagem de identidade pode ser determinada ao longo de todo o comprimento da sequência de codificação do gene.
[00114] Exemplos de homólogos incluem Arabidopsis thaliana (Erva-estrelada) (AT4G37750.1), Brachypodium distachyon (Braquipódio-de-duas-espigas) (BRADI1G07290), Glycine max (Soja) (GLYMA0041S50, GLYMA01G40380, GLYMA02G31035, GLYMA05G22970, GLYMA06G05170, GLYMA11G04910, GLYMA14G10130 e GLYMA17G17010), Oryza sativa (Arroz) (OSJNBA0072F13.9), Physcomitrella patens (Musgo) PHYPADRAFT_127673, PHYPADRAFT_127688, PHYPADRAFT_136724 e PHYPADRAFT_189336), Populus trichocarpa (Álamo bálsamo ocidental) (POPTR_0002S11550G, POPTR_0005S19220G,
POPTR_0007S14690G e POPTR_0014S01260G), Solanum lycopersicum (Tomate) (SOLYC02G092050.2, SOLYC03G123430.2 e SOLYC04G077490.2), Sorghum bicolor (Sorgo) (SB01G006830) e Vitis vinifera (Uva) (VIT_07S0151G00440 e VIT_18S0001G08610).
[00115] Em uma forma de realização, a proteína PLT7 é codificada por uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 19. A sequência de nucleotídeos que codifica a proteína PLT7 pode ser ou pode ser derivada do gene AT5G65510, um homólogo do mesmo ou uma sequência tendo pelo menos cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com AT5G65510 ou seu homólogo. A porcentagem de identidade pode ser determinada em todo o comprimento da sequência genômica. Alternativamente, a percentagem de identidade pode ser determinada ao longo de todo o comprimento da sequência de codificação do gene.
[00116] Exemplos de homólogos incluem Arabidopsis thaliana (Erva-estrelada) (AT5G10510.2), Brachypodium distachyon (Braquipódio-de-duas-espigas) (BRADI1G31337), Glycine max (Soja) (GLYMA01G02760, GLYMA08G38190, GLYMA09G33241 e GLYMA18G29400), Oryza sativa (Arroz) (P0677B10.15), Populus trichocarpa (Álamo bálsamo ocidental) (POPTR_0007S14210G), Solanum lycopersicum (Tomate) (SOLYC05G051380.2 e SOLYC11G010710.1), Sorghum bicolor (Sorgo) (SB10G026150) e Vitis vinifera (Uva) (VIT_00S0772G00020 e VIT_00S1291G00010).
[00117] Em uma forma de realização, a proteína WIND1 é codificada por uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 29. A sequência de nucleotídeos que codifica a proteína WIND1 pode ser, ou pode ser derivada do, gene AT1G78080, um homólogo do mesmo ou uma sequência tendo pelo menos cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com AT1G78080 ou seu homólogo. A porcentagem de identidade pode ser determinada em todo o comprimento da sequência genômica. Alternativamente, a percentagem de identidade pode ser determinada ao longo de todo o comprimento da sequência de codificação do gene.
[00118] Exemplos de homólogos incluem Arabidopsis thaliana (Erva-estrelada) (AT1G22190.1, AT1G36060.1, AT1G64380.1, AT2G20880.1, AT2G22200.1, AT4G13620.1, AT4G28140.1, AT4G39780.1 e AT5G65130.1), Brachypodium distachyon (Braquipódio-de-duas-espigas) (BRADI1G45470), Glycine max (Soja) (GLYMA01G43450, GLYMA05G31370, GLYMA06G45010, GLYMA08G14600, GLYMA10G33700, GLYMA11G02050,
GLYMA12G12270, GLYMA12G33020, GLYMA13G01930, GLYMA13G37451, GLYMA14G34590, GLYMA18G02170 e GLYMA20G33890), Oryza sativa (Arroz) (OS06G0222400 e P0516A04.31), Physcomitrella patens (Musgo) (PHYPADRAFT_142112 e PHYPADRAFT_151367), Populus trichocarpa (Álamo bálsamo ocidental) (POPTR_0001S10540G, POPTR_0001S32250G, POPTR_0002S09480G, POPTR_0003S13910G, POPTR_0005S07900G, POPTR_0005S16690G, POPTR_0007S05690G, POPTR_0013S13920G, POPTR_0017S08250G e POPTR_0019S13330G), Solanum lycopersicum (Tomate) (DREB3, SOLYC04G054910.2, SOLYC07G054220.1, SOLYC08G082210.2, SOLYC09G091950.1, SOLYC12G013660.1 e SOLYC12G056980.1), Sorghum bicolor (Sorgo) (SB01G044410, SB02G023230, SB07G020090, SB08G007411 e SB10G007780) e Vitis vinifera (Uva) (VIT_00S0662G00030, VIT_00S0662G00040, VIT_02S0025G01360, VIT_05S0029G00140, VIT_12S0059G00280, VIT_18S0001G05250 e VIT_19S0014G03180).
[00119] A sequência que codifica a proteína SHR, SCR, WOX5, PLT1, PLT2, PLT3, PLT4, PLT5, PLT7 ou WIND1 é, de preferência, otimizada por códon para expressão em células de planta, de preferência, otimizada por códon para expressão na célula de planta do método do invenção, de preferência, otimizada por códon para a espécie da célula de planta usada no método da invenção. Como um exemplo não limitativo, a proteína superexpressada ou expressada de novo, conforme definido nesse documento, pode ser uma proteína endógena, enquanto a sequência que codifica esta proteína endógena é uma sequência exógena otimizada por códon. Alternativamente, a sequência otimizada por códon pode codificar uma proteína que é exógena para a célula de planta.
[00120] Em uma forma de realização da invenção, as proteínas tendo expressão aumentada ou introduzida, conforme definido nesse documento, são proteínas funcionais. Uma SHR conforme definida nessa invenção está, de preferência, cumprindo a mesma função ou função similar em uma célula de planta como a função de uma proteína tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 em Arabidopsis thaliana. Uma SCR conforme definida nesse documento está, de preferência, cumprindo a mesma função ou função similar em uma célula de planta como a função de uma proteína tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 em Arabidopsis thaliana. Uma WOX5 conforme definida nessa invenção está, de preferência, cumprindo a mesma função ou função similar em uma célula de planta como a função de uma proteína tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 em Arabidopsis thaliana. Uma PLT1 conforme definida nessa invenção está, de preferência, cumprindo a mesma função ou função similar em uma célula de planta como a função de uma proteína tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 em Arabidopsis thaliana. Uma PLT2 conforme definida nessa invenção está, de preferência, cumprindo a mesma função ou função similar em uma célula de planta como a função de uma proteína tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 em Arabidopsis thaliana. Uma PLT3 conforme definida nessa invenção está, de preferência, cumprindo a mesma função ou função similar em uma célula de planta como a função de uma proteína tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 em Arabidopsis thaliana. Uma PLT4 conforme definida nessa invenção está, de preferência, cumprindo a mesma função ou função similar em uma célula de planta como a função de uma proteína tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 em Arabidopsis thaliana. Uma PLT5 conforme definida nessa invenção está, de preferência, cumprindo a mesma função ou função similar em uma célula de planta como a função de uma proteína tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 em Arabidopsis thaliana. Uma PLT7 conforme definida nesse documento está, de preferência, cumprindo a mesma função ou função similar em uma célula de planta como a função de uma proteína tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30 em Arabidopsis thaliana. Uma WIND1 conforme definida nesse documento, está de preferência cumprindo a mesma função ou função similar em uma célula de planta como a função de uma proteína tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28 em Arabidopsis thaliana.
[00121] Em uma forma de realização, a proteína RBR endógena é codificada por uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 18. A sequência de nucleotídeos que codifica a proteína RBR pode ser, ou pode ser derivada do, gene AT3G12280, um homólogo do mesmo ou uma sequência tendo pelo menos cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com AT3G12280 ou seu homólogo. A porcentagem de identidade pode ser determinada em todo o comprimento da sequência genômica. Alternativamente, a percentagem de identidade pode ser determinada ao longo de todo o comprimento da sequência de codificação do gene.
[00122] Os exemplos de homólogos incluem Brachypodium distachyon (Braquipódio-de-duas-espigas) (BRADI3G41630), Chlamydomonas reinhardtii (Septina) (MAT3), Glycine max (Soja) (GLYMA04G36700, GLYMA13G26170 e GLYMA15G36890), Oryza sativa (Arroz) (RBR1), Physcomitrella patens (Musgo) (PHYPADRAFT_88833, RBL1502 e RBR), Populus trichocarpa (Álamo bálsamo ocidental) (RBL901), Solanum lycopersicum (Tomate) (SOLYC09G091280.2), Sorghum bicolor (Sorgo) (SB07G025760) e Vitis vinifera (Uva) (VIT_04S0008G02780).]
[00123] Em uma forma de realização da invenção, a proteína RBR com uma expressão diminuída é uma proteína funcional. Portanto, um RBR conforme definido nessa invenção está, de preferência, cumprindo a mesma função ou função similar em uma célula de planta como a função de uma proteína tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 em Arabidopsis thaliana.
[00124] Em uma forma de realização, a pessoa habilitada pode usar uma sequência tendo pelo menos cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 17 ou SEQ ID NO: 18 para encontrar uma sequência, de preferência, uma sequência genômica, que codifica uma proteína RBR homóloga em uma célula de planta, de preferência no genoma de uma célula de planta, conforme definido nesse documento. Esta sequência pode ser subsequentemente usada para direcionar e regular negativamente a expressão de uma proteína RBR endógena, por exemplo, usando a mecanismo de RNAi.
Aumento temporário (SHR, SCR, WOX5, PLT1-PL5, PLT7, WIND1) ou expressão diminuída (RBR)
[00125] Em uma forma de realização, a expressão de pelo menos uma da proteína SHR, da proteína SCR, da proteína WOX5, da proteína WIND1 e a expressão de pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou seis proteínas PLT selecionada(s) do grupo que consiste em PLT1, PLT2, PLT3, PLT4, PLT5 e PLT7, é temporariamente introduzido ou aumentado. Opcionalmente, adicionalmente, a expressão da proteína RBR endógena é temporariamente diminuída.
[00126] Em uma forma de realização, a expressão de pelo menos WOX5 e uma proteína PLT selecionada do grupo que consiste em PLT1, PLT2, PLT3, PLT4, PLT5 e PLT7 é temporariamente introduzida ou aumentada. De preferência, a expressão de pelo menos WOX5 e PLT1 é temporariamente introduzida ou aumentada. A expressão de apenas WOX5 e PLT1 pode ser temporariamente introduzida ou aumentada.
[00127] Em uma forma de realização, a expressão de pelo menos WIND1, WOX5 e uma proteína PLT selecionada do grupo que consiste em PLT1, PLT2, PLT3, PLT4, PLT5 e PLT7 é temporariamente introduzida ou aumentada. De preferência, a expressão de pelo menos WIND1, WOX5 e PLT1 é temporariamente introduzida ou aumentada. A expressão de apenas WIND1, WOX5 e PLT1 pode ser temporariamente introduzida ou aumentada.
[00128] Em uma forma de realização, a expressão de pelo menos SHR, SCR, WOX5 e uma, duas ou três proteínas PLT selecionadas do grupo que consiste em PLT1, PLT2, PLT3, PLT4, PLT5 e PLT7 é temporariamente introduzida ou aumentada. De preferência, a expressão de pelo menos SHR, SCR, WOX5, PLT1, PLT4 e PLT5 é temporariamente introduzida ou aumentada. A expressão de apenas SHR, SCR, WOX5, PLT1, PLT4 e PLT5 pode ser temporariamente introduzida ou aumentada.
[00129] Em uma forma de realização, a expressão de pelo menos WIND1, SHR, SCR, WOX5 e uma, duas ou três proteínas PLT selecionadas do grupo que consiste em PLT1, PLT2, PLT3, PLT4, PLT5 e PLT7 é temporariamente introduzida ou aumentada. De preferência, a expressão de pelo menos WIND1, SHR, SCR, WOX5, PLT1, PLT4 e PLT5 é temporariamente introduzida ou aumentada. A expressão de apenas WIND1, SHR, SCR, WOX5, PLT1, PLT4 e PLT5 pode ser temporariamente introduzida ou aumentada. Além disso, a expressão da proteína RBR endógena é temporariamente diminuída.
[00130] A expressão aumentada ou diminuída das proteínas, conforme definido nessa invenção, induz a regeneração de uma célula de planta, de preferência a regeneração do rebento. A expressão temporária introduzida ou aumentada e, opcionalmente, a expressão diminuída temporária das proteínas, conforme definidas nesse documento, pode ser sequencial ou de maneira simultânea.
Por exemplo, a expressão temporária de uma primeira proteína ou de proteínas de uma combinação de proteínas conforme definidas nessa invenção, tal como, por exemplo, WIND1, pode ocorrer antes da expressão temporária de uma proteína ou de proteínas subsequente(s) conforme definida(s) nesse documento. A expressão aumentada ou introduzida dessas proteínas ou proteínas subsequentes da combinação de proteínas pode ser durante ou após a expressão aumentada ou introduzida da primeira proteína ou de proteínas.
[00131] De forma similar, a expressão diminuída temporária de uma proteína RBR conforme definida nesse documento pode ocorrer antes, durante ou após a expressão temporária introduzida ou aumentada da proteína ou de proteínas conforme definida(s) nessa invenção. Da mesma forma, a expressão aumentada ou introduzida da proteína ou de proteínas pode ser antes, durante ou após a expressão diminuída da proteína RBR.
[00132] De preferência, em um período de tempo, há uma expressão simultânea aumentada ou introduzida na célula de planta de pelo menos duas, três, quatro, cinco ou seis proteínas selecionadas do grupo que consiste em WIND1, SHR, SCR, WOX5, PLT1, PLT2, PLT3, PLT4, PLT5 e PLT7.
Opcionalmente, a expressão da proteína RBR é diminuída concomitantemente ou durante o mesmo período de tempo.
[00133] De preferência, em um período de tempo, há uma expressão simultânea aumentada ou introduzida na célula de planta de pelo menos duas, três, quatro, cinco ou seis proteínas selecionadas do grupo que consiste em WIND1, SHR, SCR, WOX5, PLT1, PLT4 e PLT5.
[00134] Por exemplo, em um período de tempo há expressão aumentada ou introduzida simultânea de pelo menos WOX5 e PLT1, ou expressão aumentada ou introduzida simultânea de pelo menos WOX5, PLT1 e WIND1, ou expressão aumentada ou introduzida simultânea de pelo menos SHR, SCR, WOX5 , PLT1, PLT4 e PLT5, ou expressão simultânea aumentada ou introduzida de pelo menos WIND1, SHR, SCR, WOX5, PLT1, PLT4 e PLT5. Opcionalmente, a expressão da proteína RBR é diminuída concomitantemente ou durante o mesmo período de tempo.
[00135] Alternativamente ou adicionalmente, a expressão de uma proteína ou de proteínas, conforme definida(s) nesse documento, pode ser temporariamente introduzida ou aumentada, e opcionalmente diminuída, antes da expressão introduzida ou aumentada de uma proteína ou proteínas subsequente(s). Em uma forma de realização, a expressão de WIND1 é temporariamente introduzida ou aumentada e, opcionalmente, a expressão de RBR é temporariamente diminuída, antes da expressão introduzida ou aumentada de um ou mais de SHR, SCR, WOX5 e uma ou mais de proteínas PLT conforme definida(s) nessa invenção.
[00136] Como um exemplo não limitativo, a expressão de WIND1 pode ser temporariamente aumentada ou introduzida antes que a expressão temporária aumentada ou introduzida de pelo menos WOX5 e PLT1. A expressão de WIND1 pode ser temporariamente aumentada ou introduzida antes da expressão temporária aumentada ou introduzida de pelo menos WOX5, PLT1, SHR, SCR, PLT4 e PLT5. A expressão de RBR pode ser diminuída de maneira simultânea com a expressão aumentada ou introduzida de WIND1.
[00137] A expressão introduzida ou aumentada de WIND1 e, opcionalmente, a expressão de RBR diminuída, pode ocorrer antes da expressão de qualquer uma das outras proteínas conforme definidas nesse documento. Os níveis de expressão de WIND1 e, opcionalmente, os níveis de expressão de RBR, podem permanecer alterados durante a expressão introduzida ou aumentada de outras proteínas da combinação de proteínas conforme definidas nessa invenção.
Alternativamente, os níveis de expressão de WIND1 e, opcionalmente, de RBR, podem ter retornado aos níveis endógenos antes da expressão aumentada ou introduzida das outras proteínas da combinação de proteínas conforme definidas nessa invenção.
[00138] O período de tempo entre a introdução da WIND1 alterada e, opcionalmente, os níveis de expressão RBR e a indução dos níveis de expressão alterados das outras proteínas da composição de proteínas conforme definido nessa invenção, é de preferência pelo menos cerca de 0, 1, 2, 3, 4, 5 , 6, 7, 8, 9, 10, 12 ou pelo menos cerca de 14 dias.
Período de tempo
[00139] O período de tempo em que as proteínas, conforme definidas nesse documento, têm uma expressão 67 aumentada ou introduzida, ou opcionalmente diminuída (como especificada nesse documento para as proteínas particulares) na célula de planta é, de preferência, um período que é suficientemente longo para induzir a regeneração da célula de planta. No entanto, manter os níveis de expressão alterados pode dificultar o desenvolvimento adicional da célula de planta regenerada em uma planta. Portanto, em uma forma de realização preferida, a expressão alterada de pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou seis proteínas é temporária. Os níveis de expressão das proteínas, conforme definidos nessa invenção, podem ser devolvidos aos níveis endógenos, isto é, aos níveis de proteínas antes do aumento, introdução ou diminuição da expressão, de preferência antes de a proteína ou as proteínas induzir(em) a formação de meristema descontrolado. Retornar os níveis de proteína aos níveis endógenos, de preferência, inicia a diferenciação do tecido.
[00140] Em uma forma de realização, o período de tempo em que uma combinação de proteínas, conforme definido nesse documento, tem uma expressão aumentada, introduzida ou diminuída na célula de planta é de pelo menos cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou pelo menos cerca de 50 dias. O período de tempo pode ser de pelo menos cerca de 1,
2,3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou pelo menos cerca de 10 semanas.
Após este período de tempo, os níveis de proteína de pelo menos uma proteína, de preferência, todas as proteínas, podem retornar aos níveis endógenos. Portanto, o período de tempo pode ser menor que cerca de 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20 ou menor que cerca de 15 dias. O período de tempo pode ser menor que cerca de 20, 15, 12, 10, 8, 7, 6, 5, 4, 3 ou menor que cerca de 2 semanas. O período em que a proteína ou as proteínas, conforme definida(s) nesse documento, te(ê)m uma expressão aumentada ou introduzida pode ser de cerca de 0,5 - 10 semanas, 1 - 8 semanas, 1 - 6 semanas, 1 - 4 semanas, cerca de 1 - 3 semanas ou cerca de 2 semanas.
[00141] De preferência, no mesmo período de tempo conforme definido acima, em que pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou seis proteínas selecionadas do grupo que consiste em WIND1, SHR, SCR, WOX5, PLT1, PLT2, PLT3, PLT4 e PLT5, têm uma expressão aumentada ou introduzida na célula de planta, de preferência, o mesmo período de tempo em que cada uma das proteínas de uma combinação de proteínas conforme definidas nessa invenção tem uma expressão aumentada ou introduzida, a célula de planta também tem uma expressão diminuída de uma proteína RBR endógena.
[00142] O período de tempo para introduzir, aumentar e, opcionalmente, diminuir a expressão da proteína ou das proteínas, conforme definida(s) nesse documento, pode ser dependente do tipo de célula de planta e/ou das condições de regeneração, e o período de tempo adequado pode ser determinado usando meios convencionais conhecidos na técnica. Como um exemplo não limitativo, a expressão das proteínas pode ser introduzida ou aumentada e opcionalmente diminuída conforme definida nesse documento e a morfologia da planta em regeneração pode ser monitorada. Os níveis de proteína podem retornar ao normal, ou aos níveis endógenos, pouco antes ou após a regeneração. Por exemplo, a expressão introduzida ou aumentada, e opcionalmente diminuída, das proteínas das combinações de proteínas, conforme definidas nesse documento, pode retornar aos níveis endógenos de cerca de 2, 4, 6, 8 ou 10 semanas ou cerca de 2, 4, 6, 8 ou 10 meses após a regeneração, por exemplo, após o aparecimento do primeiro rebento.
Expressão temporariamente introduzida ou aumentada
[00143] Em uma forma de realização, a expressão de pelo menos um de WOX5, WIND1, SHR, SCR, PLT1, PLT2, PLT3, PLT4, PLT5 e PLT7 é introduzida ou aumentada em uma célula de planta. Tal aumento pode ser devido ao aumento da expressão de proteínas endógenas (isto é, através de mutações no gene endógeno que codifica essas proteínas - as sequências reguladoras ou de codificação - que resultam no aumento da expressão de proteínas funcionais ou através de mutações nas sequências reguladoras ou codificadoras que resultam em aumento de função de proteína) ou via introdução transgênica de construtos que codificam as sequências de proteínas. A expressão introduzida ou aumentada é, de preferência, uma expressão temporária.
Portanto, a expressão é introduzida ou aumentada durante um certo período de tempo conforme definido acima, de preferência, a expressão é introduzida ou aumentada apenas durante um certo período de tempo. A expressão temporária aumentada ou introduzida pode ser realizada usando qualquer meio adequado conhecido na técnica. Por exemplo, a expressão da proteína ou das proteínas introduzidas anteriormente pode ser eliminada, por exemplo, usando mutagênese direcionada ou RNAi.
[00144] Alternativamente, a expressão aumentada temporária pode ser conseguida por introdução temporária de uma ou mais das proteínas conforme definidas nesse documento na célula de planta. Alternativamente ou adicionalmente, a expressão temporária é alcançada através da introdução de uma ou mais de construtos de ácido nucleico em uma célula de planta, em que o construto de ácido nucleico compreende uma sequência de codificação que codifica uma ou mais das proteínas, conforme definida nesse documento, e em que a referida sequência de codificação está operacionalmente ligada a um elemento regulador, por exemplo, um promotor constitutivo ou específico do tecido.
Entende-se aqui que um promotor “constitutivo” é um promotor que é ativo na maioria dos tecidos sob a maioria das condições fisiológicas e de desenvolvimento. Um promotor “específico de tecido” só está ativo em tipos específicos de tecidos ou células.
[00145] Alternativamente ou adicionalmente, a expressão temporária da proteína ou de proteínas conforme definida(s) nesse documento é realizada por ativação temporária da sua expressão gênica. Assim, a expressão de pelo menos uma das proteínas WOX5, WIND1, SHR, SCR, PLT1, PLT2, PLT3, PLT4, PLT5 e PLT7, de preferência, uma combinação de proteínas conforme definidas nessa invenção, é temporariamente introduzida ou aumentada por ativação temporária de sua expressão.
[00146] A ativação temporária da expressão pode ser alcançada colocando uma ou mais das sequências que codificam uma proteína, conforme definida nesse documento, sob o controle de um promotor induzível. Um promotor “induzível” é definido nesse documento como um promotor que é fisiologicamente (por exemplo, por aplicação externa de certos compostos) ou regulado pelo desenvolvimento. De preferência, pelo menos um, dois, três, quatro, cinco, seis ou pelo menos sete gene(s) que codifica(m) WOX5, WIND1, SHR, SCR, PLT1, PLT2, PLT3, PLT4, PLT5 ou a proteína PLT7,
respectivamente, é(são) colocado(s) sob o controle de um promotor induzível. A expressão das proteínas conforme definidas nesse documento pode ser controlada pelo mesmo tipo de promotor induzível. Alternativamente, a expressão das diferentes proteínas pode ser controlada por diferentes tipos de promotores induzíveis.
[00147] O promotor induzível pode ser colocado a montante de, e operacionalmente ligado a, um ou mais de genes endógenos, em que o gene endógeno codifica uma proteína conforme definido nessa invenção, por exemplo, a montante de um gene endógeno que codifica WOX5, WIND1, SHR, SCR, PLT1, PLT2, PLT3, PLT4, PLT5 ou PLT7. Exemplos preferidos de promotores induzíveis são descritos nesse documento abaixo no segundo aspecto.
[00148] Alternativamente ou adicionalmente, a célula de planta pode ser transformada de forma estável com um construto, em que a expressão de pelo menos um de WOX5, WIND1, SHR, SCR PLT1, PLT2, PLT3, PLT4 ou PLT5 é controlada por um promotor induzível. De preferência, a célula de planta é transformada com um construto como descrito abaixo no segundo aspecto. De preferência, a célula de planta é transformada de forma estável com o construto de expressão, ou as construtos conforme definida(s) nessa invenção no segundo aspecto.
[00149] Como um exemplo não limitativo, um transativador pode se ligar ao promotor induzível e, subsequentemente, induz a transcrição de uma das proteínas conforme definidas nessa invenção. Esses transativadores podem primeiro ser ativados pela ligação a um composto específico (um indutor). Alternativamente, a ligação do transativador ao promotor induzível pode ser reprimida quando um composto específico (um repressor) está presente.
De preferência, o transativador para uso no método da presente invenção é ativado após a ligação a um composto específico (um indutor). De preferência, o indutor é um indutor como descrito nesse documento abaixo no segundo aspecto.
Expressão temporariamente diminuída
[00150] Em combinação com a expressão aumentada ou introduzida de pelo menos uma das proteínas conforme definidas acima nesse documento, em uma forma de realização, a expressão de uma proteína RBR é diminuída em uma célula de planta, de preferência, a expressão é temporariamente diminuída. É entendido nesse documento que a expressão diminuída de uma proteína RBR é uma expressão diminuída da proteína endógena. Essa expressão diminuída pode ser devido a uma ou mais de mutações do gene endógeno, isto é, mutações na sequência reguladora (tal como o promotor) ou sequência de codificação, que resultam na expressão diminuída da proteína funcional endógena, ou via introdução transgênica de construtos que codificam repressores.
[00151] A expressão é, de preferência, diminuída durante um certo período de tempo, conforme definido acima, de preferência, a expressão é diminuída apenas durante um certo período de tempo, conforme definido acima. A expressão diminuída temporária pode ser realizada usando qualquer meio adequado conhecido na técnica. Por exemplo, a expressão diminuída temporária pode ser realizada pela introdução de um pequeno transcrito de RNA em uma célula (por exemplo, um miRNA ou um siRNA direcionado ao transcrito do gene RBR) ou pela introdução de um construto de RNAi na célula de planta, em que a expressão do pequeno RNA (tal como um miRNA ou siRNA) pode ser controlado por um elemento regulador, por exemplo, um promotor constitutivo ou específico do tecido.
[00152] Alternativamente ou adicionalmente, a expressão de RBR diminuída temporária pode ser realizada por expressão temporária de um repressor de RBR. Um exemplo não limitativo de um repressor de RBR é uma pequena molécula de RNA não codificante, por exemplo, um miRNA ou siRNA, direcionada a transcrito de RNA RBR. O siRNA ou miRNA maduro pode compreender pelo menos 20, 21, 22, 23, 24 ou pelo menos 25 nucleotídeos contíguos. O siRNA ou miRNA maduro pode compreender pelo menos 20, 21, 22, 23, 24 ou pelo menos 25 nucleotídeos contíguos que têm pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de complementaridade de sequência com uma sequência contígua no transcrito RBR endógeno.
[00153] O transcrito RBR endógeno é, de preferência, a molécula de mRNA RBR endógena e, de preferência, inclui a sequência de RBR não traduzida 3’ e 5’. Portanto, a sequência do pequeno RNA não codificador pode ser, parcial ou completamente, complementar a uma sequência compreendida na sequência de codificação de RBR ou complementar a uma sequência compreendida na região 3’ ou 5’ não traduzida do transcrito RBR. De preferência, o siRNA ou miRNA pode ser parcial ou completamente complementar a uma sequência compreendida na sequência de codificação de RBR. Por exemplo, pelo menos 20, 21, 22, 23, 24 ou pelo menos 25 nucleotídeos contíguos da pequena molécula de RNA tem pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de complementaridade de sequência com uma sequência contígua de pelo menos 20, 21, 22, 23, 24 ou pelo menos 25 nucleotídeos contíguos do transcrito RBR endógeno, respectivamente.
[00154] O habilitado na técnica entende como projetar uma pequena molécula de RNA que é capaz de regular negativamente a expressão da proteína RBR endógena usando RNAi convencional, em que a proteína RBR é uma proteína RBR conforme definida acima.
[00155] Em uma forma de realização, a pequena molécula de RNA para inibir a expressão de RBR pode compreender uma sequência tendo pelo menos cerca de 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 23. A pequena molécula de RNA pode compreender uma sequência tendo pelo menos cerca de 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 24.
[00156] A ativação temporária da expressão do repressor de RBR, conforme definido nesse documento, pode ser conseguida colocando a sequência que codifica o repressor de RBR a montante de, e operacionalmente ligada a, um promotor induzível. O promotor induzível que controla a expressão do repressor de RBR pode ser o mesmo tipo de promotor induzível que controla a expressão de pelo menos uma da proteína WOX5, WIND1, SHR, SCR, PLT1, PLT2, PLT3, PLT4, PLT5 ou PLT7. Alternativamente, o promotor induzível pode ser um tipo diferente de promotor induzível. A expressão temporária do repressor de RBR resulta na diminuição temporária da expressão da proteína RBR conforme definida nessa invenção.
[00157] Os exemplos preferidos de promotores induzíveis são descritos nesse documento abaixo no segundo aspecto.
Uso do construto da invenção
[00158] Em uma forma de realização, a célula de planta pode ser transformada de forma estável com um ou mais de ácidos nucleicos compreendendo um cassete de expressão no qual a expressão de pelo menos um de WOX5, WIND1, SHR, SCR, PLT1, PLT2, PLT3, PLT4, PLT5 e PLT7, de preferência, pelo menos um de WOX5, WIND1, SHR, SCR, PLT1, PLT4 ou PLT5 é controlado por um promotor induzível.
Opcionalmente, a célula de planta pode ser adicionalmente transformada de forma estável com um construto de ácido nucleico compreendendo um cassete de expressão no qual a expressão de um repressor de RBR é controlada por um promotor induzível. Vários ou todos os ácidos nucleicos podem ser compreendidos em um único construto.
[00159] De preferência, a célula de planta é transformada com uma ou mais de construtos como descritos abaixo no segundo aspecto.
[00160] Em uma forma de realização, a invenção se refere, portanto, a um método para regenerar uma célula de planta, de preferência, regenerando um rebento de uma célula de planta, em que o método compreende uma etapa de a) introduzir, de preferência, introduzir de forma estável, em uma célula de planta, um ou mais de ácidos nucleicos ou construtos de ácido nucleico conforme definidos nessa invenção no segundo aspecto;
b) manter a célula de planta em um meio compreendendo um indutor; c) opcionalmente, detectar os níveis de expressão de pelo menos uma ou mais de proteínas, conforme definido nesse documento, e, opcionalmente, selecionar uma célula de planta tendo uma expressão alterada de pelo menos uma ou mais de proteínas, conforme definida(s) nesse documento; d) opcionalmente, manter a célula de planta selecionada em um meio compreendendo o indutor durante um período de tempo conforme definido nesse documento; e e) permitir que a célula da planta se regenere, de preferência, no rebento.
[00161] Depois que a célula da planta é regenerada, o indutor pode ser removido do meio.
[00162] O construto pode ser e ainda introduzido na célula de planta usando qualquer meio convencional conhecido na técnica. Exemplos não limitativos de métodos de transformação incluem transformação de tecido de planta por Agrobacterium, bombardeamento de microprojéteis e eletroporação. Um método de transformação preferido é a transformação por Agrobacterium, por exemplo, usando o método de imersão floral (Clough et al, 1998).
[00163] As concentrações preferidas do indutor na etapa b) são concentrações que são conhecidas na técnica para ativar eficazmente o transativador conforme definido nesse documento, resultando na ativação subsequente do promotor induzível. Uma concentração preferida é cerca de 0,05 µM - 50 µM, de preferência cerca de 0,1 µM - 15 µM, de preferência cerca de 10 µM.
[00164] Em uma forma de realização, a invenção se refere a um método para regenerar uma célula de planta conforme definido nessa invenção, em que a célula de planta não é exposta a um hormônio de crescimento de planta antes, após e/ou durante a regeneração da célula de planta. O hormônio de crescimento de planta pode ser pelo menos um de uma citocinina ou uma auxina. De preferência, a célula de planta não é exposta a concentrações de um hormônio de crescimento de planta que induziria a regeneração da célula de planta não modificada, por exemplo, de tipo selvagem.
[00165] É ainda contemplado nesse documento que a célula de planta pode ser exposta a um hormônio de crescimento de planta, no entanto, a presença do hormônio de planta não é um requisito essencial para a regeneração da célula de planta.
[00166] Em uma forma de realização preferida, a invenção se refere a um método para a regeneração de rebento independente de hormônio a partir de uma célula de planta, compreendendo as etapas de a) introduzir ou aumentar na célula de planta a expressão de uma combinação de proteínas compreendendo pelo 80 menos: i) uma proteína homeobox 5 (WOX5) relacionada com WUSCHEL; e ii) uma proteína PLETORA (PLT) selecionada do grupo que consiste em PLT1, PLT2, PLT3, PLT4, PLT5 e PLT7, de preferência PLT1; em que a expressão de pelo menos uma das proteínas da combinação de proteínas é temporariamente introduzida ou aumentada; e b) permitir que a célula da planta se regenere no rebento.
[00167] “Regeneração de rebentos independente de hormônio” é entendida nesse documento como regeneração de rebentos sem uma exposição necessária da célula de planta aos hormônios de crescimento de planta. De preferência, a regeneração de rebentos é organogênese de rebentos.
[00168] Em uma forma de realização, o tecido da planta não é ferido para estimular a regeneração da planta.
O ferimento é uma etapa bem conhecida nas técnicas de cultura de tecidos e a pessoa habilitada sabe como ferir uma célula de planta e induzir o estresse do ferimento. É contemplado nesse documento que um tecido de planta pode ser ferido, no entanto, o ferimento não é uma etapa essencial para a regeneração.
Tecidos de planta multicelulares
[00169] Em uma forma de realização, a célula de planta é parte de um tecido multicelular. O tecido multicelular da planta pode compreender células diferenciadas. Alternativamente ou adicionalmente, um tecido multicelular pode compreender células não diferenciadas. Em uma forma de realização, todas as células do tecido multicelular têm, em um determinado ponto ou período de tempo, uma expressão aumentada ou introduzida de uma ou mais das proteínas, conforme definidas nesse documento. De preferência, pelo menos cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou cerca de 100% das células do tecido multicelular têm, em um determinado ponto ou período de tempo, uma expressão aumentada ou de novo de pelo menos uma de uma proteína WOX5, WIND1, SHR, SCR, WOX5, PLT1, PLT2, PLT3, PLT4, PLT5 e PLT7 e, opcionalmente, uma expressão diminuída de uma proteína RBR conforme definida nessa invenção.
[00170] Em uma forma de realização, pelo menos cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou cerca de 100% das células do tecido multicelular têm, em um determinado ponto ou período de tempo, uma expressão alterada de todas as proteínas de uma combinação de proteínas conforme definidas nesse documento.
[00171] Todas as células do tecido de planta multicelular podem ser transformadas para ter uma expressão aumentada ou introduzida, de preferência, expressão temporariamente aumentada ou introduzida, de uma ou mais de proteínas conforme definido nessa invenção. Além disso, todas as células do tecido multicelular podem ser transformadas para ter uma expressão diminuída de uma proteína RBR conforme definida nessa invenção. De preferência, pelo menos cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou cerca de 100% das células do tecido multicelular são transformadas para ter uma expressão alterada de todas as proteínas de uma combinação de proteínas conforme definidas nessa invenção.
[00172] O tecido multicelular pode ser um tecido de calo, um órgão ou um explante de planta. Em uma forma de realização, a célula de planta tendo uma expressão aumentada ou introduzida de uma ou mais das proteínas, conforme definidas nesse documento, pode ser parte de um órgão de planta. O órgão da planta pode ser um órgão vegetativo ou um órgão reprodutivo. Um órgão vegetativo pode ser derivado do sistema de rebentos ou sistema radicular. O órgão pode ser pelo menos um de raízes, caules e folhas. Um órgão reprodutivo da planta pode ser selecionado do grupo que consiste em flor, semente, fruta,
cone, soro, estróbilo e gametóforos. De preferência, o órgão da planta é uma raiz. Uma raiz é entendida nesse documento como as partes do corpo da planta sem folhas e sem nós. Um arranjo típico das células em uma raiz é pelo, epiderme, epiblema, córtex, endoderme, periciclo e tecido vascular. Em uma forma de realização, pelo menos as células, ou parte das células, de pelo menos um de pelo da raiz, epiderme, epiblema, córtex, endoderme, periciclo e o tecido vascular têm uma expressão de novo ou aumentada de pelo menos uma de uma proteína WOX5, WIND1, SHR, SCR, WOX5, PLT1, PLT2, PLT3, PLT4, PLT5 e PLT7 conforme definida nessa invenção e opcionalmente têm uma expressão diminuída de uma proteína RBR endógena. De preferência, pelo menos as células, ou parte das células, de pelo menos uma de pelo de raízes, epiderme, epiblema, córtex, endoderme, periciclo e o tecido vascular têm uma expressão alterada de todas as proteínas de uma combinação de proteínas conforme definidas nessa invenção em um período de tempo conforme definido acima.
[00173] Alternativamente ou adicionalmente, a célula de planta com expressão alterada de uma ou mais das proteínas, conforme definida nesse documento, pode ser parte de uma muda.
[00174] Alternativamente ou adicionalmente, a célula de planta tendo expressão alterada de uma ou mais das proteínas, conforme definidas nesse documento, pode ser parte de um calo. Um calo é um grupo de células não diferenciadas, de preferência, derivadas de células adultas. As células de calo podem ser capazes de sofrer a embriogênese e formar uma planta inteiramente nova. Um calo de planta é considerado uma massa crescente de células desorganizadas do parênquima vegetal. O calo pode ser produzido a partir de uma única célula diferenciada, e as células do calo podem ser totipotentes, sendo capazes de regenerar todo o corpo da planta. O calo da planta pode ser derivado de um tecido ou tecidos somático(s), por exemplo, um tecido que está disponível para cultura de explante. As células que dão origem a calos e embriões somáticos sofrem, de preferência, uma divisão rápida e/ou são parcialmente não diferenciadas, como o tecido meristemático. A célula de calo usada no método da invenção pode ser friável ou compacta. Além disso, ou alternativamente, a célula do calo pode ser radicular, brotada ou embriogênica (Ikeuchi M, Plant Cell. Set. de 2013; 25(9): 3159–3173).
[00175] Em uma forma de realização, a célula de planta tendo uma expressão alterada de uma ou mais das proteínas, conforme definidas nesse documento, pode ser parte de um explante. Um explante pode ser definido nesse documento como uma amostra obtida de uma parte de uma planta. A amostra da planta pode ser colocada em um meio de cultura sólido ou meio líquido. Explantes podem ser retirados de muitas partes diferentes de uma planta, incluindo porções de rebentos, folhas, caules, flores, raízes, células não diferenciadas individuais e de células maduras. As células contêm, de preferência, citoplasma e núcleos vivos e são capazes de se desdiferenciar e retomar a divisão celular. Um explante pode ser, ou pode ser obtenível ou obtido de uma extremidade meristemática de uma planta, tal como, por exemplo, a ponta do caule, ponta do broto axilar ou ponta da raiz. Em uma forma de realização, o explante é selecionado do grupo que consiste em um explante de hipocótilo, um explante de caule, um explante de cotilédone, um explante de raiz, um explante de folha, um explante de flor e um tecido meristemático.
[00176] Em uma outra forma de realização, a célula de planta pode ser obtida a partir de uma planta selecionada do grupo que consiste em Arabidopsis, cevada, repolho, canola, mandioca, couve-flor, chicória, crisântemo, algodão, pepino, berinjela, uva, pimenta, alface, milho, melão, colza, batata, abóbora, arroz, centeio, sorgo, soja, abóbora, cana-de-açúcar, beterraba sacarina, girassol, pimentão, tomate, melancia, trigo e abobrinha. Opcionalmente, a célula de planta pode ser obtida de uma planta da família das Solanaceae, opcionalmente do gênero Solanum, opcionalmente da espécie
Solanum lycopersicum ou Solanum melongena. Opcionalmente, a célula de planta pode ser obtida da família de Brassicaceae, opcionalmente a espécie, ou subespécie, é Raphanus sativus, Brassica oleracea, Brassica rapa, Brassica napus, Armoracia rusticana ou Arabidopsis thaliana.
[00177] Em uma forma de realização, a célula de planta é uma célula de planta recalcitrante, isto é, uma célula de planta na qual a eficácia de regeneração falha ou em que a eficácia de regeneração é fraca. Exemplos não limitados incluem pimenta, soja, pepino e beterraba sacarina.
[00178] Em uma outra forma de realização, a célula de planta é selecionada do grupo que consiste em Arabidopsis, tomate e pimentão.
[00179] De preferência, a planta não é ou não pode ser obtida do gênero Nicotiana. De preferência, a planta não é ou não pode ser obtida da espécie Nicotiana tabacum.
[00180] Em uma forma de realização, o método compreende uma etapa de formação de uma planta ou parte da planta a partir do rebento regenerado. “Formar”, “produzir” ou “regenerar” uma planta ou parte da planta inclui, de preferência, uma etapa de alongamento do rebento formado.
De preferência, o rebento alongado é obtido do calo ou explante.
[00181] A formação subsequente de raízes pode ser induzida em uma etapa de indução de raiz separada, por exemplo, incubando os rebentos em um meio de cultura diferente (Thorpe, supra). Alternativamente, as raízes podem ser formadas naturalmente com qualquer indução adicional. O regenerante pode subsequentemente ser cultivado no solo, por exemplo, para portar sementes.
[00182] A planta formada, parte da planta ou produto da planta pode compreender células que foram transformadas para ter uma expressão alterada, de preferência, uma alteração temporária, de todas as proteínas ou uma combinação de proteínas conforme definidas nessa invenção.
A planta formada, parte da planta ou produto da planta pode consistir em células que foram transformadas para ter uma expressão alterada, de preferência uma alteração temporária, de todas as proteínas ou uma combinação de proteínas conforme definidas nessa invenção.
[00183] De preferência, pelo menos cerca de 0,0001%; 0,001%; 0,01%; 0,1%; 1%; 10%; 20%; 30%; 40%; 50%; 60%; 70%; 80%; 90%; 95%; 97%; 98%; 99% ou cerca de 100% das células da planta formada, parte da planta ou produto da planta foram transformados para ter uma expressão alterada, de preferência temporariamente alterada, de todas as proteínas de uma combinação de proteínas conforme definidas nessa invenção.
[00184] De preferência, a planta ou parte da planta formada não tem uma expressão introduzida ou aumentada de pelo menos uma de proteína WIND1, WOX5, SHR, SCR, PLT1, PLT2, PLT3, PLT4, PLT5 ou PLT7 conforme definida nessa invenção. De preferência, a planta ou parte da planta formada não tem uma expressão diminuída de uma proteína RBR conforme definida nessa invenção. Assim, pelo menos uma de proteína WIND1, WOX5, SHR, SCR, WOX5, PLT1, PLT2, PLT3, PLT4, PLT5, PLT7 e RBR conforme definida nessa invenção têm níveis de expressão endógenos planta ou parte da planta. De preferência, a proteína WIND1, WOX5, SHR, SCR, PLT1, PLT2, PLT3, PLT4, PLT5, PLT7 e RBR conforme definida nessa invenção têm níveis de expressão endógena na planta ou parte da planta formada. De preferência, os níveis de expressão de todas as proteínas da combinação de proteínas conforme definidas nessa invenção têm níveis de expressão endógena na planta ou parte da planta formada. No entanto, a planta ou parte da planta formada pode compreender um construto conforme definido no segundo aspecto desse documento, que pode estar presente em pelo menos uma quantidade detectável.
[00185] Os níveis de expressão de proteína endógena são entendidos nesse documento como níveis de expressão de proteína não modificados, de ocorrência natural. Portanto, os níveis de expressão endógena são os níveis de expressão em uma, por exemplo, de outra forma idêntica, célula de planta que não é modificada para ter uma expressão alterada, por exemplo, introduzida, aumentada ou diminuída da proteína, ou das proteínas, conforme definida(s) nessa invenção.
[00186] Na planta ou parte da planta formada, os níveis de expressão da proteína ou das proteínas, conforme definidas nesse documento, podem ser iguais ou similares aos níveis de expressão da proteína endógena.
Alternativamente, a planta ou parte da planta formada pode manter uma expressão elevada de uma ou mais das proteínas conforme definidas nesse documento.
Construto de ácido nucleico
[00187] Em um segundo aspecto, a invenção se refere a uma molécula de ácido nucleico que compreende pelo menos um cassete de expressão, em que o cassete de expressão compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica pelo menos uma de uma proteína WIND1, uma proteína WOX5, uma proteína SHR, uma proteína SCR, uma Proteína PLT1, uma proteína PLT2, uma proteína PLT3, uma proteína PLT4, uma proteína PLT5, uma proteína PLT7 e um repressor de RBR conforme definido nessa invenção no primeiro aspecto.
[00188] Os termos “ácido nucleico” e “molécula de ácido nucleico” podem ser usados de forma intercambiável nesse documento.
[00189] Em uma forma de realização, a sequência de nucleotídeos que codifica pelo menos uma de uma proteína WIND1, WOX5, SHR, SCR, PLT1, PLT2, PLT3, PLT4 PLT5 e PLT7 é uma sequência conforme definida no primeiro aspecto. Em uma forma de realização, a sequência de nucleotídeos que codifica o repressor de RBR tem uma sequência conforme definida no primeiro aspecto.
[00190] De preferência, a sequência de nucleotídeos que codifica a proteína SHR tem pelo menos cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 9. De preferência, a sequência de nucleotídeos que codifica a proteína SCR tem pelo menos cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 10. De preferência, a sequência de nucleotídeos que codifica a proteína WOX5 tem pelo menos cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 11. De preferência, a sequência de nucleotídeos que codifica a proteína PLT1 tem pelo menos cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 12. De preferência, a sequência de nucleotídeos que codifica a proteína PLT2 tem pelo menos cerca de 50%, 55%, 60%, 65%,
70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 13. De preferência, a sequência de nucleotídeos que codifica a proteína PLT3 tem um pelo menos cerca de 50%, 55%, 60%,
65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 14. De preferência, a sequência de nucleotídeos que codifica a proteína PLT4 tem pelo menos cerca de 50%, 55%, 60%, 65%,
70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 15. De preferência, a sequência de nucleotídeos que codifica a proteína PLT5 tem pelo menos cerca de 50%, 55%, 60%, 65%,
70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 16. De preferência, a sequência de nucleotídeos que codifica a proteína PLT7 tem pelo menos cerca de 50%, 55%, 60%, 65%,
70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 19. De preferência, a sequência de nucleotídeos que codifica a proteína WIND1 tem pelo menos cerca de 50%, 55%, 60%, 65%,
70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 29. De preferência, a sequência de nucleotídeos que codifica o repressor de RBR tem pelo menos cerca de 85%, 90%, 95%,
98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID
NO: 23 ou, de preferência, a sequência de nucleotídeos que codifica o repressor de RBR tem pelo menos cerca de 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 24.
[00191] Em uma forma de realização, um promotor pode controlar a expressão de duas ou mais das proteínas conforme definidas nessa invenção. Nesse caso, as sequências que codificam as duas ou mais das proteínas são, de preferência, separadas com, por exemplo, um sítio de entrada de ribossomo interno (IRES) ou outro elemento adequado que permite a iniciação da tradução de uma maneira independente da capa.
[00192] Em uma forma de realização, cada um dos repressores de WIND1, WOX5, SHR, SCR, PLT1, PLT2, PLT3, PLT4, PLT5, PLT7 e RBR é controlado de forma independente por um promotor. Assim, o cassete de expressão pode compreender um promotor que controla a expressão de uma proteína SHR conforme definida nessa invenção, ou o cassete de expressão pode compreender um promotor que controla a expressão de uma proteína SCR conforme definida nessa invenção, ou o cassete de expressão pode compreender um promotor que controla a expressão de uma proteína WOX5 conforme definida nesse documento, ou o cassete de expressão pode compreender um promotor que controla a expressão de uma proteína PLT1 conforme definida nessa 93 invenção, ou o cassete de expressão pode compreender um promotor que controla a expressão de uma proteína PLT2 conforme definida nessa invenção, ou o cassete de expressão pode compreender um promotor que controla a expressão de uma proteína PLT3 conforme definida nessa invenção, ou o cassete de expressão pode compreender um promotor que controla a expressão de uma proteína PLT4 conforme definida nessa invenção ou o cassete de expressão pode compreender um promotor que controla a expressão de uma proteína PLT5 conforme definida nesse documento, ou o cassete de expressão pode compreender um promotor que controla a expressão de uma proteína PLT7 conforme definida nessa invenção, ou o cassete de expressão pode compreender um promotor que controla a expressão de uma proteína WIND1 conforme definida nessa invenção ou o cassete de expressão pode compreender um promotor que controla a expressão do repressor de RBR conforme definido nessa invenção.
[00193] O promotor no cassete de expressão é, de preferência, um promotor constitutivo, um promotor específico de tecido ou um promotor induzível. De preferência, a sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína ou repressor conforme definida(o) nessa invenção é operacionalmente ligada a um promotor induzível, de preferência um promotor induzível conforme definido abaixo nesse documento.
[00194] Os promotores induzíveis são bem conhecidos na técnica. Um promotor induzível preferido pode ser acionado por um agente indutor e é tipicamente ativo, desde que seja exposto ao agente indutor (isto é, indutor). O agente indutor pode ser um agente químico, tal como um(a) metabólito, regulador de crescimento, herbicida ou composto fenólico, ou um estresse fisiológico diretamente imposto sobre a célula de planta, tais como, frio, calor, sal, toxinas ou através da ação de um agente microbiano patógeno ou uma praga inseticida.
[00195] Consequentemente, os promotores induzíveis podem ser utilizados para regular a expressão da proteína ou das proteínas conforme definidas no primeiro aspecto.
[00196] O promotor induzível no cassete de expressão da presente invenção pode ser um promotor induzível por estresse, um promotor induzível por luz ou um promotor induzível quimicamente.
[00197] Exemplos de promotores induzíveis por estresse abiótico incluem, mas não se limitam a, promotores induzíveis por sal, tais como, promotores induzíveis por seca RD29A (Yamaguchi-Shinozalei et al., 1993); tais como promotor do gene rabl7 do milho (Pla et. al., 1993), promotor do gene rab28 do milho (Busk et. al., 1997) e promotor do gene Ivr2 do milho (Pelleschi et. al., 1999); promotores induzíveis por calor, tais como, promotor hsp80 de tomate por calor(Patente U.S. N 5.187.267) e o gene da proteína de choque térmico PHS1 (Takahashi et al., 1989).
[00198] Exemplos de promotores induzíveis pela luz incluem os três promotores da proteína coletora de luz da clorofila a/b (Leutwiler et al., 1986) e o promotor da pré- ferredoxina (Vorst et al., 1990).
[00199] Outros exemplos de promotores induzíveis incluem o promotor da subunidade de 27 kD da glutationa-S- transferase, isoforma II (GST-II-27). Esse promotor é induzido por compostos químicos conhecidos como “fitoprotetores de herbicida”, que podem ser aplicados na célula de planta para induzir o promotor. Ver PCT/GB92/01187 e PCT/GB90/00101, incorporados nesse documento por referência. Esse promotor funciona em monocotiledôneas e dicotiledôneas. De forma similar, o sistema de ativação do gene alcA/alcR de Aspergillus nidulans (por exemplo, compreendendo o elemento AlcA de SEQ ID NO: 32, ou qualquer sequência tendo pelo menos cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 32 e a sequência do transativador AlcR de SEQ ID NO: 31, ou qualquer sequência tendo pelo menos cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 31) pode ser usada para expressão de gene induzível quimicamente.
[00200] O sistema de ativação do gene AlcR/AlcA é induzível por etanol. Outros sistemas adequados para indução química incluem o comutador alc, GVE/VGE, GVG, pOp6/LhGR (Craft et al., 2005) e sistemas XVE (Moore et al, 2006, em particular a figura 3 e a Tabela 5, que são incorporados nesse documento por referência).
[00201] Os sistemas LhGR e GVG usam dexametasona como um indutor. O sistema XVE usa 17-β-estradiol como um indutor e o sistema VGE usa Metoxifenozida (Intrepid-F2). A pessoa habilitada na técnica sabe como usar esses sistemas induzíveis para a clonagem dos elementos promotores adequados a montante da sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína conforme definida nessa invenção no primeiro aspecto, a fim de alcançar um sistema de expressão induzível.
[00202] Em uma forma de realização, o sistema induzível usado para a ativação temporária da expressão, conforme definida nesse documento, é pelo menos um do sistema LhGR, GVG ou XVE ou uma combinação dos mesmos.
[00203] A molécula de ácido nucleico, ou moléculas de ácido nucleico conforme definida(s) nesse documento, pode(m) ser parte de um construto de ácido nucleico.
[00204] A invenção se refere adicionalmente a um construto de ácido nucleico compreendendo dois ou mais cassetes de expressão, tais como, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 cassetes de expressão diferentes, conforme definidos nessa invenção. Alternativamente ou adicionalmente, cada cassete de expressão conforme definido nesse documento pode estar presente mais de uma vez, por exemplo, 2, 3, 4 ou 5 vezes, dentro do construto de ácido nucleico. De preferência, cada cassete de expressão compreende uma sequência que codifica uma proteína WIND1, WOX5, SHR, SCR, PLT1, PLT2, PLT3, PLT4, PLT5 ou PLT7 ou repressor de RBR conforme definida(o) nesse documento sob o controle de um promotor induzível.
[00205] Em uma forma de realização, o construto de ácido nucleico pode compreender pelo menos - uma primeira sequência de ácidos nucleicos compreendendo um cassete de expressão tendo uma sequência que codifica uma proteína WIND1, WOX5, SHR, SCR, WOX, PLT1, PLT2, PLT3, PLT4, PLT5 ou PLT7 ou um repressor de RBR conforme definido nessa invenção sob o controle de um promotor induzível; e - uma segunda sequência de ácidos nucleicos compreendendo um segundo cassete de expressão tendo uma sequência que codifica um transativador operacionalmente ligado a um elemento regulador. O transativador pode ser um transativador conforme definido abaixo nesse documento. De preferência, o elemento regulador é um promotor constitutivo forte, tal como, promotor CaMV, G10-90, CsV, TCTP2 ou UBQ10. Após a ligação a um indutor, o 98 transativador expressado pode ligar-se ao promotor induzível da primeira molécula de ácido nucleico e iniciar a transcrição.
[00206] A molécula de ácido nucleico ou construto da invenção pode compreender cassetes de expressão para a expressão de cada um(a) das combinações ou proteínas e/ou do repressor conforme definida(o)(s) no primeiro aspecto nesse documento. Opcionalmente, as combinações de proteínas e/ou repressor do primeiro aspecto estão em construtos separadas, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 construtos diferentes, no entanto, de preferência, as combinações estão presentes em uma único construto.
O sistema GVG
[00207] A molécula de ácido nucleico e o cassete de expressão compreendida(o) na molécula de ácido nucleico podem compreender um ou mais de elementos UAS, cujos elementos estão, de preferência, ligados a um promotor mínimo, tal como, o promotor mínimo -46 35S. O promotor mínimo e os elementos estão localizados, de preferência, a montante e operacionalmente ligados à sequência que codifica um(a) proteína ou repressor conforme definida(o) no primeiro aspecto. De preferência, a molécula de ácido nucleico, e a cassete de expressão compreendida na molécula de ácido nucleico podem compreender pelo menos cerca de quatro ou cinco elementos UAS localizados a montante da sequência que codifica um(a) proteína ou repressor conforme definido(a) no primeiro aspecto. A sequência UAS tem, de preferência, pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 22. Os elementos UAS são, de preferência, operativamente ligados à sequência que codifica uma proteína ou repressor conforme definida(o) no primeiro aspecto. Este elemento ou elementos UAS pode(m) ser ligado(s) por um transativador, resultando na transcrição de um(a) proteína ou repressor conforme definido(a) nessa invenção.
[00208] O transativador que liga o elemento ou elementos UAS compreende, de preferência, um domínio de ligação de DNA GAL4, um domínio VP16 e um domínio do receptor de glicocorticóide (GR). Tais sistemas GVG são bem conhecidos na técnica e por exemplo, descrito em Moore et al (2006). O transativador pode iniciar a transcrição ao se ligar à dexametasona ou a um derivado do mesmo. Portanto, em uma forma de realização da invenção, um ácido nucleico pode compreender um cassete de expressão, em que o cassete de expressão compreende uma sequência que codifica um transativador. De preferência, o transativador é uma proteína que compreende um domínio de ligação aos elementos UAS, de preferência, um domínio GAL4. De preferência, o transativador compreende adicionalmente um domínio GR e um domínio VP16. Em uma forma de realização preferida, a sequência de nucleotídeos que codifica o transativador tem pelo menos cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 20.
O sistema LhGR
[00209] Em uma forma de realização, a molécula de ácido nucleico e o cassete de expressão compreendido na molécula de ácido nucleico podem compreender um ou mais de elementos LacOp, cujos elementos são, de preferência, ligados a um promotor mínimo, tal como o promotor mínimo - 46 35S. O promotor mínimo e os elementos são localizados, de preferência, a montante da e operacionalmente ligados à, sequência que codifica uma proteína ou um repressor conforme definida(o) no primeiro aspecto. De preferência, a molécula de ácido nucleico e o cassete de expressão compreendido na molécula de ácido nucleico podem compreender pelo menos cerca de cinco ou seis elementos LacOp localizados a montante da sequência que codifica uma proteína ou um repressor conforme definida(o) no primeiro aspecto. A sequência LacOp, de preferência, tem pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 25. Os elementos LacOp são, de preferência, ligados operacionalmente à sequência que codifica uma proteína ou um repressor conforme definida(o) no primeiro aspecto. Esse(s) elemento ou elementos LacOp podem ser ligados por um transativador, resultando na transcrição de uma proteína ou um repressor conforme definida(o) nessa invenção.
[00210] O transativador que liga o elemento ou os elementos LacOp compreende, de preferência, um domínio de ligação de DNA GAL4, um domínio VP16 e um domínio de receptor de glicocorticóide (GR). Tais sistemas LacOp são bem conhecidos na técnica e, por exemplo, descrito em Moore et al (2006). O transativador pode iniciar a transcrição ao se ligar à dexametasona ou a um derivado do mesmo.
Portanto, em uma forma de realização da invenção, um ácido nucleico pode compreender um cassete de expressão, em que o cassete de expressão compreende uma sequência que codifica o transativador. De preferência, o transativador é uma proteína que compreende um domínio de ligação aos elementos LacOp, de preferência, um domínio GAL4. De preferência, o transativador compreende adicionalmente um domínio GR e um domínio VP16. Em uma forma de realização preferida, a sequência de nucleotídeos que codifica o transativador tem pelo menos cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 21. De preferência, o transativador tem uma sequência de aminoácidos de pelo menos cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 58.
O sistema XVE
[00211] A molécula de ácido nucleico e o cassete de expressão compreendido na molécula de ácido nucleico podem compreender um ou mais de elementos LexAop, elementos esses que são, de preferência, ligados a um promotor mínimo, tal como o promotor mínimo -46 35S. O promotor mínimo e os elementos são localizados, de preferência, a montante, e operacionalmente ligados à sequência que codifica uma proteína ou um repressor conforme definida(o) no primeiro aspecto. De preferência, a molécula de ácido nucleico e o cassete de expressão compreendido na molécula de ácido nucleico podem compreender pelo menos cerca de sete ou oito elementos LexAop localizados a montante da sequência que codifica uma proteína ou um repressor conforme definida(o) no primeiro aspecto. A sequência de LexAop tem, de preferência, pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 26. Os elementos LexAop são, de preferência, operativamente ligados à sequência que codifica uma proteína ou um repressor conforme definida(o) no primeiro aspecto. Esse elemento ou esses elementos LexAop podem ser ligados por um transativador, resultando na transcrição de uma proteína ou um repressor conforme definida(o) nesse documento.
[00212] O transativador que liga o elemento ou os elementos LexAop compreende, de preferência, um domínio de ligação de DNA LEXA, um domínio VP16 e um domínio receptor de estrogênio (ER). Tais sistemas XVE são bem conhecidos na técnica e, por exemplo, descrito em Moore et al (2006). O transativador pode iniciar a transcrição mediante ligação a β-estradiol ou um derivado do mesmo. Portanto, em uma forma de realização da invenção, um ácido nucleico pode compreender um cassete de expressão, em que o cassete de expressão compreende uma sequência que codifica um transativador. De preferência, o transativador é uma proteína que compreende um domínio de ligação aos elementos LexAop, de preferência, um domínio LEXA. De preferência, o transativador compreende adicionalmente um domínio ER e um domínio VP16. Em uma forma de realização preferida, a sequência que codifica o transativador tem pelo menos cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 27.
[00213] Em uma forma de realização, o construto de ácido nucleico compreende pelo menos um ou mais de cassetes de expressão conforme definidos nesse documento. De preferência, o cassete de expressão compreende uma sequência que codifica uma proteína WIND1, WOX5, SHR, SCR, PLT1, PLT2, PLT3, PLT4, PLT5 ou PLT7 ou um repressor de RBR conforme definido nessa invenção, em que a sequência é operacionalmente ligada a um promotor induzível conforme definido nesse documento. O construto pode compreender mais de uma dessas cassetes de expressão. Em uma forma de realização, o construto pode compreender os seguintes elementos: - uma sequência de ácidos nucleicos que compreende um cassete de expressão que codifica uma proteína WIND1 conforme definida nesse documento operacionalmente ligada a um promotor induzível conforme definido nesse documento; e - uma sequência de ácidos nucleicos que compreende um cassete de expressão que codifica uma proteína WOX5 conforme definida nesse documento operacionalmente ligada a um promotor induzível conforme definido nesse documento.
[00214] Em uma outra forma de realização, o construto pode compreender os seguintes elementos: - uma sequência de ácidos nucleicos que compreende um cassete de expressão que codifica uma proteína WIND1 conforme definida nesse documento operacionalmente ligada a um promotor induzível conforme definido nesse documento; - uma sequência de ácidos nucleicos compreendendo um cassete de expressão que codifica uma proteína WOX5 conforme definida nesse documento operacionalmente ligada a um promotor induzível conforme definido nessa invenção; e - uma sequência de ácidos nucleicos que compreende um cassete de expressão que codifica uma proteína PLT1,
conforme definida nesse documento, operacionalmente ligado a um promotor induzível, conforme definido nesse documento.
[00215] Em uma forma de realização, o construto pode compreender os seguintes elementos: - uma sequência de ácidos nucleicos compreendendo um cassete de expressão que codifica uma proteína SHR conforme definida nesse documento operacionalmente ligada a um promotor induzível conforme definido nessa invenção; - uma sequência de ácidos nucleicos compreendendo um cassete de expressão que codifica uma proteína SCR conforme definida nesse documento operacionalmente ligada a um promotor induzível conforme definido nessa invenção; - uma sequência de ácidos nucleicos compreendendo um cassete de expressão que codifica uma proteína WOX5 conforme definida nesse documento operacionalmente ligada a um promotor induzível conforme definido nessa invenção; - uma sequência de ácidos nucleicos que compreende um cassete de expressão que codifica uma proteína PLT1, conforme definida nesse documento, operacionalmente ligado a um promotor induzível, conforme definido nesse documento; - uma sequência de ácidos nucleicos que compreende um cassete de expressão que codifica uma proteína PLT4, conforme definida nesse documento, operacionalmente ligado a um promotor induzível, conforme definido nesse documento; e
- uma sequência de ácidos nucleicos que compreende um cassete de expressão que codifica uma proteína PLT5, conforme definida nesse documento, operacionalmente ligado a um promotor induzível, conforme definido nesse documento.
[00216] Em uma outra forma de realização, o construto pode compreender os seguintes elementos: - uma sequência de ácidos nucleicos que compreende um cassete de expressão que codifica uma proteína WIND1 conforme definida nesse documento operacionalmente ligada a um promotor induzível conforme definido nesse documento; - uma sequência de ácidos nucleicos compreendendo um cassete de expressão que codifica uma proteína SHR conforme definida nesse documento operacionalmente ligada a um promotor induzível conforme definido nessa invenção; - uma sequência de ácidos nucleicos compreendendo um cassete de expressão que codifica uma proteína SCR conforme definida nesse documento operacionalmente ligada a um promotor induzível conforme definido nessa invenção; - uma sequência de ácidos nucleicos compreendendo um cassete de expressão que codifica uma proteína WOX5 conforme definida nesse documento operacionalmente ligada a um promotor induzível conforme definido nessa invenção; - uma sequência de ácidos nucleicos que compreende um cassete de expressão que codifica uma proteína PLT1 conforme definida nesse documento operacionalmente ligada a um promotor induzível conforme definido nesse documento; - uma sequência de ácidos nucleicos que compreende um cassete de expressão que codifica uma proteína PLT4 conforme definida nesse documento operacionalmente ligada a um promotor induzível conforme definido nesse documento; - uma sequência de ácidos nucleicos compreendendo um cassete de expressão que codifica uma proteína PLT5 conforme definida nesse documento operacionalmente ligada a um promotor induzível conforme definido nesse documento; e - uma sequência de ácidos nucleicos que compreende um cassete de expressão que codifica um repressor de RBR conforme definido nesse documento operacionalmente ligado a um promotor induzível conforme definido nesse documento.
[00217] Em uma forma de realização, a expressão de SHR, SCR, as proteínas PLT e WOX5 conforme definidas nessa invenção é controlada pelo sistema GVG conforme definido nessa invenção acima.
[00218] Em uma forma de realização, a expressão da proteína WIND1 e do repressor de RBR conforme definida(o) nesse documento é controlada pelo sistema XVE conforme definido acima.
[00219] Em uma forma de realização, o construto compreende adicionalmente pelo menos um cassete de expressão para a expressão de um transativador. De preferência, o construto compreende adicionalmente dois cassetes de expressão para a expressão de dois transativadores, em que a sequência que codifica os transativadores, de preferência, tem pelo menos cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 20 ou SEQ ID NO: 27, respectivamente.
[00220] Em uma outra forma de realização, o construto pode compreender um gene de resistência para selecionar plantas que integraram estavelmente o construto, por exemplo, mas não se limitando a, um marcador de resistência de Streptomyces hygroscopicus a herbicida BASTA.
Composição
[00221] Em um terceiro aspecto, a invenção se refere a uma composição. A composição pode compreender um construto de ácido nucleico conforme definida acima no segundo aspecto. Em uma forma de realização, a composição compreende, por exemplo, um estabilizador, sal ou diluente.
[00222] Alternativamente ou adicionalmente, a composição pode compreender duas construtos de ácido nucleico, em que a primeiro construto de ácido nucleico compreende um primeiro cassete de expressão tendo uma sequência que codifica uma proteína WIND1, WOX5, SHR, SCR, PLT1, PLT2, PLT3, PLT4, PLT5 ou PLT7 conforme definida nessa invenção ou um repressor de RBR conforme definido nessa invenção, sob o controle de um promotor induzível. A composição compreende adicionalmente uma segundo construto, em que a segundo construto compreende um cassete de expressão tendo uma sequência que codifica um transativador operacionalmente ligado a um elemento regulador. De preferência, o elemento regulador é um promotor constitutivo forte, tal como um promotor CaMV, G10-90, CsV, TCTP2 ou UBQ10. Após a ligação a um indutor, o transativador expressado pode ligar-se ao promotor induzível da primeiro construto e iniciar a transcrição.
[00223] A primeiro construto pode compreender cassetes de expressão adicionais, cada um tendo uma sequência que codifica uma proteína WIND1, WOX5, SHR, SCR, PLT1, PLT2, PLT3, PLT4, PLT5 ou PLT7 ou um repressor de RBR conforme definida(o) nessa invenção, sob o controle de um promotor induzível.
[00224] Alternativamente ou adicionalmente, a composição pode compreender construtos adicionais compreendendo um cassete de expressão tendo uma sequência que codifica uma proteína WIND1, WOX5, SHR, SCR, PLT1, PLT2, PLT3, PLT4, PLT5 ou PLT7 ou um repressor de RBR conforme definida(o) nessa invenção, sob o controle de um promotor induzível.
Planta e partes da planta
[00225] Em um quarto aspecto, a invenção se refere a 110 uma célula de planta que compreende pelo menos um de i) a molécula de ácido nucleico conforme definida no segundo aspecto; e ii) o construto de ácido nucleico conforme definida no segundo aspecto.
[00226] De preferência, a célula de planta pode ter uma expressão introduzida ou aumentada de pelo menos uma de proteína WIND1, WOX5, SHR, SCR, PLT1, PLT2, PLT3, PLT4, PLT5 e PLT7 e, opcionalmente, uma expressão diminuída de uma proteína RBR endógena conforme definida nesse documento mediante exposição da célula de planta a um indutor, conforme definido nesse documento. De preferência, em um ponto ou período de tempo conforme definido no primeiro aspecto, a célula de planta tem uma expressão introduzida ou aumentada de pelo menos WOX5 e PLT1 após a exposição da célula de planta a um indutor conforme definido nesse documento.
[00227] A célula de planta pode ser obtida, de preferência, de Arabidopsis, cevada, repolho, canola, mandioca, couve-flor, chicória, crisântemo, algodão, pepino, berinjela, uva, pimenta, alface, milho, melão, colza, batata, abóbora, arroz, centeio , sorgo, soja, abóbora, cana-de-açúcar, beterraba sacarina, girassol, pimentão, tomate, melancia, trigo e abobrinha.
Opcionalmente, a célula de planta pode ser obtida a partir de uma planta da família das Solanaceae, opcionalmente do gênero Solanum, opcionalmente da espécie Solanum lycopersicum ou Solanum melongena. Opcionalmente, a célula de planta pode ser obtida da família de Brassicaceae, opcionalmente a espécie, ou subespécie, é Raphanus sativus, Brassica oleracea, Brassica rapa, Brassica napus, Armoracia rusticana ou Arabidopsis thaliana.
[00228] Em um quinto aspecto, a invenção se refere a um(a) rebento, planta ou parte de planta que pode ser obtenível ou obtido(a) pelo método da invenção conforme definido nessa invenção. As células de planta obtidas da planta ou parte da planta têm, de preferência, níveis de expressão endógena de pelo menos uma de WOX5, SHR, SCR, WIND1, PLT1, PLT2, PLT3, PLT4, PLT5 e RBR. De preferência, as células de planta obtidas da planta ou parte da planta têm níveis endógenos de proteína WOX5, SHR, SCR, WIND1, PLT1, PLT2, PLT3, PLT4, PLT5 e RBR.
[00229] As células de planta do rebento, a planta ou parte da planta obteníveis ou obtidas pelo método da invenção, conforme definido nesse documento, podem compreender pelo menos, ou pelo menos parte de, uma de: i) uma molécula de ácido nucleico no segundo aspecto; e ii) o construto de ácido nucleico conforme definida no segundo aspecto.
[00230] A planta obtenível ou obtida pelo método da invenção é, de preferência, selecionada do grupo que consiste em Arabidopsis, cevada, repolho, canola, mandioca, couve-flor, chicória, crisântemo, algodão, pepino, berinjela, uva, pimenta, alface, milho, melão, colza, batata, abóbora, arroz, centeio, sorgo, soja, abóbora, cana-de-açúcar, beterraba sacarina, girassol, pimentão, tomate, melancia, trigo e abobrinha. Opcionalmente, a planta obtenível ou obtida pelo método da invenção é da família de Solanaceae, opcionalmente do gênero Solanum, opcionalmente da espécie Solanum lycopersicum ou Solanum melongena. Opcionalmente, a planta obtenível ou obtida pelo método da invenção é da família de Brassicaceae, opcionalmente da espécie, ou da subespécie, é Raphanus sativus, Brassica oleracea, Brassica rapa, Brassica napus, Armoracia rusticana ou Arabidopsis thaliana.
[00231] Alternativamente, cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% ou cerca de 99% das células de planta têm pelo menos, ou pelo menos parte de, uma de: i) uma molécula de ácido nucleico conforme definida no segundo aspecto; e ii) o construto de ácido nucleico conforme definida no segundo aspecto.
[00232] Em uma forma de realização, a parte da planta é uma semente, uma fruta ou um material não propagável.
[00233] Em um sexto aspecto, a invenção se refere a um produto derivado da planta ou parte da planta que pode ser obtenível ou obtido pelo método da invenção, por exemplo, frutas, folhas, órgãos de planta, gorduras de planta, óleos de planta, amido de planta e frações de proteína de planta, triturados, moídos ou ainda intactos, misturados com outros materiais, secos, congelados e assim por diante. Esses produtos podem não se propagar. De preferência, o referido produto de planta compreende pelo menos uma ou pelo menos parte de uma: i) da molécula de ácido nucleico conforme definida no segundo aspecto; e ii) do construto de ácido nucleico conforme definida no segundo aspecto.
[00234] De preferência, esses produtos compreendem pelo menos frações do(a) referido(a) ácido nucleico e/ou construto, o que permite avaliar se o produto de planta é derivado de uma planta obtida pelo método do primeiro aspecto da invenção conforme definido nessa invenção.
[00235] Em um sétimo aspecto, a invenção se refere à progênie da célula de planta, plântula ou planta obtenível ou obtida pelo método da invenção. As células de planta da progênie podem uma expressão aumentada ou induzida de pelo menos uma de uma proteína WOX5, SHR, SCR, WIND1, PLT1, PLT2, PLT3, PLT4 PLT5 e PLT7 conforme definida nesse documento e, opcionalmente, uma expressão diminuída de uma proteína RBR conforme definida nesse documento, mediante exposição a um indutor conforme definido nesse documento.
[00236] A referida progênie pode compreender o ácido nucleico e/ou um construto de expressão conforme definido(a) no segundo aspecto da invenção conforme definido nessa invenção. De preferência, a progênie pode gerar um rebento de uma célula de planta após a exposição a um ou mais de indutores conforme definidos nesse documento.
[00237] Em um oitavo aspecto, a invenção se refere a um método para a produção de uma planta, em que o método compreende as etapas de regeneração de um rebento de uma célula de planta, conforme definida no primeiro aspecto acima, e em que o rebento é desenvolvido em uma planta.
Uso das Proteínas da Invenção para Regeneração
[00238] Em um nono aspecto, a invenção se refere ao uso de uma combinação de proteínas e/ou repressor conforme definida(o)s nesse documento para regenerar um rebento de uma célula de planta. De preferência, a invenção se refere ao uso de uma combinação de pelo menos uma de: - uma proteína WOX5 e uma proteína PLT1; - uma proteína WIND1, uma proteína WOX5 e uma proteína PLT1;
- uma proteína SHR, uma proteína SCR, uma proteína WOX5, uma proteína PLT1, PLT4 e PLT5; e uma proteína WIND1 e uma proteína SHR, uma proteína SCR, uma proteína WOX5, uma proteína PLT1, PLT4 e PLT5 e um repressor de RBR para regenerar um rebento de uma célula de planta. A célula de planta é, de preferência, uma célula de planta conforme definida nessa invenção acima.
[00239] Em um décimo aspecto, a invenção se refere ao uso de uma molécula de ácido nucleico ou um construto de ácido nucleico conforme definida no segundo aspecto para regenerar um rebento de uma célula de planta. A célula de planta é, de preferência, uma célula de planta conforme definida nessa invenção acima.
Exemplos Exemplo 1
[00240] Composições e métodos são fornecidos para a indução da regeneração de rebentos de células de planta usando um conjunto de fatores de Arabidopsis (transcrição) definidos. As composições incluem construtos com os seguintes fatores: WIND1 (Iwase et al., 2011), um microRNA artificial direcionado a RETINOBLASTMA RELACIONADO (amiRBR;) (Cruz-Ramirez et al., 2013), SHORT ROOT (SHR) (Benfey et al., 1993), SCARECROW (SCR) (Di Laurenzio et al., 1996), PLETHORA1 (PLT1) (Aida et al., 2004),
BABYBOOM/PLETHORA4 (PLT4) (Boutilier et al., 2002, Galinha et al., 2007) , PLETHORA5 (PLT5) (Tsuwamoto et al., 2010,
Prasad et al., 2011) e WUSCHEL RELATED HOMEOBOX 5 (WOX5)
(Sarkar et al., 2007). Os fatores escolhidos foram divididos em dois conjuntos diferentes e colocados sob o controle de diferentes sistemas de transativação quimicamente induzíveis expressados constitutivamente para permitir a expressão regulada e cronometrada.
Os construtos foram construídos a partir de partes modulares usando o método de clonagem Golden Gate (Engler et al., 2014). Os sistemas de transativação incluem GVG/UAS, que consistem em uma transcrição quimérica, GVG, montada por fusão do domínio de ligação de DNA do fator de transcrição de levedura GAL4 (G), o domínio de transativação da proteína do vírus da herpes VP16 (V), e o domínio receptor do receptor de glicocorticóide de rato (G) que se liga a um promotor contendo seis cópias da sequência de ativação a montante de GAL4 fundida com o promotor mínimo -46 35S
(UAS) (Aoyama e Chua, 1997) e XVE/lexA, consistindo em um ativador de transcrição quimérico, XVE, foi montado pela fusão do domínio de ligação de DNA do repressor bacteriano
LexA (X), o domínio de transativação da proteína do vírus da herpes VP16 (V) e a região reguladora do receptor de estrogênio humano (E) que se liga a um promotor contendo oito cópias da sequência do operador LexA fundida com o promotor mínimo 35S −46 (lexA) (Zuo et al., 2000).
[00241] Como mais detalhado nesse documento abaixo, métodos são fornecidos para a indução cronometrada de fatores que envolvem a aplicação de indutores químicos para induzir separadamente ou de maneira simultânea a transcrição controlada. Métodos usando essas construtos para induzir a regeneração de rebentos de células de planta independentes de hormônios de planta adicionados externamente também são fornecidos.
Material e métodos Geração de construto
[00242] Um vetor foi construído compreendendo os seguintes elementos de transcrição: - o marcador de resistência de Streptomyces hygroscopicus a herbicida BASTA (BAR; Thompon et al., 1987), operacionalmente ligado ao promotor da nopalina sintase de Agrobacterium tumefaciens (NOSp; SEQ ID NO: 33) e o terminador da nopalina sintase de A. tumefaciens (NOST; SEQ ID NO: 34); - a sequência de codificação do fator de transcrição quimérico XVE (Zuo, 2000; SEQ ID NO: 27) operacionalmente ligada ao promotor da PROTEÍNA DO TUMOR CONTROLADO TRANSLACIONALMENTE 1 (AtTCTP1) de A. thaliana (Czechowski et al., 2005; SEQ ID NO: 35) e o terminador UBIQUITIN10 de A. thaliana (AtUBQ10Ter; SEQ ID NO: 36);
- a sequência de codificação do fator de transcrição quimérico GVG (Aoyama, 1997; SEQ ID NO: 20),
operacionalmente ligada ao promotor sintético G10: 90
(Ishige, 1999; SEQ ID NO: 37) e o terminador de subunidade pequena de ribulose 1,5-bisfosfato carboxilase de Pisum sativum (rbcST; SEQ ID NO: 38) e NOST (SEQ ID NO: 34);
- o microRNA artificial para superação de silenciamento de genes específica para sequência de codificação relacionada a retinoblastoma de A. thaliana
(AmiRBR) (Cruz-Ramirez, 2013; SEQ ID NO: 18),
operacionalmente ligada ao promotor LexA de Escherichia coli (Zuo, 2000) (SEQ ID NO: 39), o promotor mínimo 35S do vírus do mosaico da couve-flor (35Smini) (Odell et al.,
1985; SEQ ID NO: 40) e o terminador ATPase de Solanum lycopersicum (SlATPase) (Engler, 2014; SEQ ID NO: 41);
- a sequência de codificação de DIFERENCIAÇÃO CELULAR
INDUZIDA POR FERIDA 1 de A. thaliana (AtWIND1; SEQ ID NO:
29) compreendendo etiqueta C 4xMyc (4xMyc; SEQ ID NO: 42),
operativamente ligada ao promotor LexA+35Smini (LexAop; SEQ
ID NO: 26) e o terminador UBIQUITIN3 de A. thaliana
(AtUBQ3; SEQ ID NO: 44);
- a sequência codificante SHORT-ROOT de A. thaliana
(AtSHR; SEQ ID NO: 9) compreendendo a etiqueta C de octapeptídeo 3xFLAG (3xFLAG; SEQ ID NO: 45),
operacionalmente ligada ao promotor de Sequência de
Ativação a montante de Saccharomyces cerevisiae (UASp; SEQ ID NO: 47), o 35Smini (SEQ ID NO: 40) e o terminador da octopina sintase purificada de A. tumefaciens (AtuOCS; SEQ ID NO: 48); - a sequência de codificação SCARECROW de A. thaliana (AtSCR; SEQ ID NO: 10) compreendendo a etiqueta C do vírus símio 5 (V5; SEQ ID NO: 49), operacionalmente ligado ao promotor UAS+35Smini e ao terminador de manopina sintase de A. tumefaciens (AtuMas; SEQ ID NO: 51); - a sequência de codificação PLETHORA 1 de A. thaliana (AtPLT1) compreendendo a etiqueta C do gene 10 do bacteriófago T7 (T7; SEQ ID NO: 52), operacionalmente ligado ao promotor UAS + 35Smini (UAS; SEQ ID NO: 22) e ao terminador de proteína de choque térmico 18.2 de A.
thaliana (AtHSP; SEQ ID NO: 54); - a sequência de codificação de A. thaliana BABYBOOM (AtPLT4; SEQ ID NO: 15) compreendendo a etiqueta C T7 (SEQ ID NO: 52), operacionalmente ligada ao promotor UAS + 35Smini (UAS; SEQ ID NO: 22) e ao terminador UBIQUITIN5 de A. thaliana (AtUBQ5; SEQ ID NO: 55); - a sequência de codificação PLETHORA 5 de A. thaliana (AtPLT5; SEQ ID NO: 16) compreendendo a etiqueta C 3xFLAG (3xFLAG; SEQ ID NO: 45), operacionalmente ligada ao promotor UAS + 35Smini (UAS; SEQ ID NO: 22) e ao terminador álcool desidrogenase de A. thaliana (AtADH; SEQ ID NO: 56);
e, - a sequência de codificação WUSCHEL RELACIONADA A HOMEOBOX 5 de A. thaliana (AtWOX5; SEQ ID NO: 11) compreendendo a etiqueta C V5 (SEQ ID NO: 49), operacionalmente ligada ao promotor UAS + 35Smini (UAS; SEQ ID NO: 22) e ao terminador 35S do vírus do mosaico da couve-flor (T35S; SEQ ID NO: 57).
Transformação de Arabidopsis:
[00243] Para a transformação da planta, o vetor de REGENERAÇÃO DE REBENTO foi introduzido em A. tumefaciens (cepa C58C1.pMP90) por eletroporação. O transformante A.
tumefaciens foi usado para transformar plantas de A.thaliana do ecótipo Col-0 pelo método de imersão floral (Clough, 1998).
Germinação:
[00244] As sementes foram esterilizadas em superfície por gás cloro pelo método de esterilização a vapor (Lindsey, 2017). Após a esterilização, as sementes foram colocadas em suspensão em solução de agarose 0,1%, antes de serem estratificadas a 4 °C no escuro por 48 horas. Subsequentemente, as sementes foram semeadas em meio de germinação em condições estéreis. As sementes foram divididas em placas em uma malha de náilon fina (100 µm), que permitiu o contato com o meio sem permitir que as mudas penetrassem na malha. As placas com as mudas foram vedadas com esparadrapo (3M, Micropore) para evitar a dessecação.
As placas foram colocadas em posição vertical em uma câmara de crescimento (22 °C, 120 - 150 µmol/m2s com 16 h de luz/8 h de luz escura). As placas foram deixadas crescer nessas circunstâncias por 5 dias.
Indução:
[00245] Após 5 dias de crescimento, as mudas foram transplantadas sob condições estéreis, transportando a malha na qual estavam crescendo do meio de germinação para o meio de indução. As placas com as mudas foram vedadas com esparadrapo (3M, Micropore) para evitar a dessecação. As placas foram colocadas de volta na câmara de crescimento na posição vertical. As placas foram deixadas crescer nessa condição durante 14 dias. Os rebentos começaram a aparecer na segunda semana de indução.
Meio usado: Meio de germinação 5g de sacarose (Duchefa, número do produto S0809.5000) 1,1g de MS + vitaminas (Duchefa, número do produto M0222.0050) 4g de Ágar de Planta (Duchefa, número do produto P1001.1000) 0,5g/L de MES 5,8 mg/L Meio de indução 5g de sacarose (Duchefa, número do produto S0809.5000)
1,1g de MS + vitaminas (Duchefa, número do produto M0222.0050) 4g de Ágar de Planta (Duchefa, número do produto P1001.1000) 0,5g/L de MES 5,8 mg/L 400 µL de dexametasona a 10 mM (produto Sigma Aldrich número 101152255) dissolvido em DMSO (produto Sigma Aldrich número 100897077).
Resultados
[00246] As plantas transformadas com o vetor de REGENERAÇÃO DE REBENTO (AmiRBR e AtWIND1 transativado por XVE; AtSHR transativado por GVG, AtSCR, AtPLT1, AtPLT4, AtPLT5 e AtWOX5) foram cultivadas em meio contendo 17β- estradiol A 10 µM (EST: ativação de XVE) e/ou Dexametasona A 10 µM (DEX: ativação de GVG).
[00247] Em transformantes de 11 linhas contendo o vetor DE REGENERAÇÃO DE REBENTO que foram induzidos com EST e DEX, foi observado crescimento interrompido da raiz primária. A formação de calo na raiz primária foi observada em transformantes de todas as linhas independentes. A formação de calos verdes foi observada em transformantes de 55% de linhas transgênicas, e os transformantes de 67% dessas linhas regeneraram rebentos dos calos verdes observados sem a aplicação de hormônios vegetais (Tabela 3). Isso representa 36% de todos os transformantes testados
(Tabela 2).
[00248] Em transformantes de todas as linhas contendo o vetor de REGENERAÇÃO DE REBENTO que foram induzidos apenas com DEX, foi observado crescimento interrompido da raiz primária. A formação de calos na raiz primária foi observada em transformantes de 82% das linhas transgênicas. A formação de calos verdes foi observada em transformantes de 44% dessas linhas transgênicas, e os transformantes de todas essas linhas (100%) regeneraram rebentos dos calos verdes observados sem a aplicação de hormônios de planta (Tabela 3). Isso representa 36% de todos os transformantes testados (Tabela 2).
[00249] As plantas transformadas com o vetor de REGENERAÇÃO DE REBENTO-2 (AtWIND1 transativado por XVE; AtPLT1 e AtWOX5 transativados por GVG) foram cultivadas em meio contendo 17β-estradiol a 10 µM (EST: ativação de XVE) e/ou dexametasona a 10 µM (DEX: ativação de GVG).
[00250] Em transformantes de todas as 25 linhas contendo o vetor de REGENERAÇÃO DE REBENTO-2 que foram induzidos com EST e DEX, foi observado crescimento interrompido da raiz primária. A formação de calos na raiz primária foi observada em transformantes de 20% das linhas transgênicas. A formação de calos verdes foi observada em transformantes de 60% dessas linhas transgênicas, e os transformantes de 33% dessas linhagens regeneraram rebentos dos calos verdes observados sem a aplicação de hormônios de planta (Tabela 3).
[00251] Em transformantes de todas as linhas contendo o vetor de REGENERAÇÃO DE REBENTO-2 que foram induzidos apenas com DEX, foi observado crescimento interrompido da raiz primária. A formação de calos na raiz primária foi observada em transformantes de 28% das linhas transgênicas. A formação de calos verdes foi observada nos transformantes de 57% dessas linhas transgênicas, e os transformantes de todas essas linhas (100%) regeneraram rebentos dos calos verdes observados sem a aplicação de hormônios de planta (Tabela 3). Isso representa 16% de todos os transformantes testados (Tabela 2).
[00252] As raízes de Arabidopsis de qualquer linha transformada que não foram induzidas com dexametasona ou estradiol nunca mostraram qualquer parada de crescimento da raiz, formação de calo ou regeneração de rebentos. Da mesma forma, as raízes de Arabidopsis não transformada, induzida com dexametasona ou estradiol 10 µM, nunca mostraram qualquer interrupção do crescimento da raiz, formação de calo ou regeneração de rebentos (Tabela 2 e Tabela 3).
[00253] A partir das raízes das plantas que regeneraram os rebentos, os rebentos emergentes foram dissecados e transferidos para o solo onde foram observados para formar plantas completas incluindo raízes, capazes de completar seu ciclo de vida e dar sementes.
[00254] Tabela 2. Efeito da indução por dexametasona (DEX) ou 17β-estradiol (EST) ou nenhuma indução (nenhum) em mudas de Arabidopsis transformadas com o construto de REGENERAÇÃO DE REBENTO ou de REGENERAÇÃO DE REBENTO-2, ou de mudas de Arabidopsis de tipo selvagem (não transformadas). Os efeitos de desenvolvimento registrados são a interrupção do crescimento da raiz, formação de calo, formação de calo verde e regeneração de rebentos. O número de mudas mostrando efeito de desenvolvimento é expressado como porcentagens do número total de mudas testadas.
Parada de Calo Regeneração Vetor de transformação Indução crescimento Calo verde de rebento da raiz REGENERAÇÃO DE REBENTO DEX + EST 100 100 55 36 REGENERAÇÃO DE REBENTO DEX 100 82 36 36 REGENERAÇÃO DE REBENTO nenhuma 0 0 0 0 REGENERAÇÃO DE REBENTO-2 DEX + EST 100 20 12 4 REGENERAÇÃO DE REBENTO-2 DEX 100 28 16 16 REGENERAÇÃO DE REBENTO-2 nenhuma 0 0 0 0 CONTROLE NÃO TRANSFORMADO DEX + EST 0 0 0 0 CONTROLE NÃO TRANSFORMADO DEX 0 0 0 0 CONTROLE NÃO TRANSFORMADO nenhuma 0 0 0 0
[00255] Tabela 3. Efeito da indução por dexametasona (DEX) ou 17β-estradiol (EST) ou nenhuma indução (nenhum) em mudas de Arabidopsis transformadas com o construto de REGENERAÇÃO DE REBENTO ou de REGENERAÇÃO DE REBENTO-2, ou de mudas de Arabidopsis de tipo selvagem (não transformadas). Os efeitos de desenvolvimento registrados são a interrupção do crescimento da raiz, formação de calo, formação de calo verde e regeneração de rebentos. O número de mudas apresentando parada do crescimento de raiz e formação de calo é expressado como porcentagem do número total de mudas testadas; os números que mostram a formação de calos verdes são expressados como uma porcentagem dos números com a formação de calos; e os números que mostram a regeneração de rebentos são expressados como uma porcentagem dos números com formação de calo verde.
parada de Vetor de calo regeneração de indução crescimento de calo transformação verde rebento raiz
REGENERAÇÃO DE DEX + EST 100 100 55 67
REBENTO
REGENERAÇÃO DE DEX 100 82 44 100
REBENTO
REGENERAÇÃO DE nenhuma 0 0 0 0
REBENTO
REGENERAÇÃO DE DEX + EST 100 20 60 33 REBENTO-2
REGENERAÇÃO DE DEX 100 28 57 100 REBENTO-2
REGENERAÇÃO DE nenhuma 0 0 0 0 REBENTO -2
CONTROLE NÃO DEX + EST 0 0 0 0
TRANSFORMADO
CONTROLE NÃO DEX 0 0 0 0
TRANSFORMADO
CONTROLE NÃO nenhuma 0 0 0 0
TRANSFORMADO
[00256] A excisão dos rebentos regenerou de forma confiável as plantas inteiras com sementes, sem indução adicional. Os rebentos excisados foram cultivados em ½ GM até as raízes se formarem naturalmente. Os regenerantes poderiam então ser cultivados no solo, onde produziriam sementes. Essa verificação foi consistente em ambos os tipos de construto e em vários eventos de inserção diferentes.
Exemplo 2 Indução da regeneração de rebentos em tomate
Construto de transformação para tomate
[00257] O construto de transformação de REGENERAÇÃO DE REBENTO do Exemplo 1 acima foi adaptada para a transformação de tomate substituindo o marcador de resistência a herbicida BASTA pelo marcador de resistência à canamicina nptII (Bevan et al., 1983; SEQ ID NOs: 59 e 64) sob o controle do promotor da nopalina sintase de Agrobacterium tumefaciens (NOSp; SEQ ID NO: 33) e do terminador da octopina sintase de A. tumefaciens (OCST; SEQ ID NO: 60). Esso construto permitiu a seleção fácil de tecido de tomate estavelmente transformado em meio contendo 50 mg/l de canamicina, para uso futuro (a seleção de canamicina não foi usada nesse exemplo). Além disso, os promotores e terminadores para conduzir a expressão dos fatores de transcrição XVE e GVG no construto original foram substituídos pelo promotor 35S do vírus do mosaico da couve-flor (Odell et al., 1985; SEQ ID NO: 61) e pelo terminador CaMV (T35S ; SEQ ID NO: 62). Finalmente, entre o primeiro e o segundo elementos transcricionais, um gene repórter fluorescente foi colocado, consistindo em um gene de proteína fluorescente verde direcionado ao retículo endoplasmático (ER) (erGFP; SEQ ID NOs: 63 e 65) sob controle do mesmo promotor 35S de CaMV e do terminador de CaMV. O construto de plasmídeo resultante foi denominada pKG11051 e foi clonada em E. coli e verificada por digestão com enzimas de restrição. O DNA do plasmídeo Miniprep foi eletroporado para cepa de Agrobacterium tumefaciens GV3101 para a transformação da planta.
[00258] De forma similar, o construto de transformação de REGENERAÇÃO DE REBENTO-2 do Exemplo 1 acima foi adaptada substituindo o marcador BASTA por nptII, substituindo os promotores para XVE e GVG pelo promotor 35S de CaMV e adicionando um gene repórter fluorescente erGFP.
O construto de plasmídeo resultante foi denominada pKG11052. O DNA do plasmídeo Miniprep foi eletroporado para cepa GV3101 de Agrobacterium tumefaciens para a transformação da planta.
Transformação de tomate
[00259] Ambas as construtos pKG11051 e pKG11052 foram introduzidas em tomate por transferência de genes mediada por Agrobacterium seguindo o método de Koornneef et al. (1986, 1987) com modificações. Aproximadamente 50 sementes de tomate foram esterilizadas e germinadas em meio ½MS10 por 11 dias. Explantes de cotilédones das mudas foram dissecados e pré-cultivados por 24 h em meio MS20 suplementado com 40 µg.l -1 de acetosiringona. Os explantes foram submersos em uma suspensão de Agrobacterium tumefaciens GV3101 portando pKG11051 ou pKG11052 cultivado durante a noite em meio TY contendo 20 mg.l-1 de estreptomicina e 50 de mg.l -1 de espectinomicina, e diluído para OD600 de 0,138. Os explantes foram secos por blot e co- cultivados por dois dias em placas de meio MS20 com 40 µg.l-1 de acetoseringona. O tratamento experimental consistiu na pré-indução do fator de transcrição definido pela adição de ß-estradiol a 10 µM durante o cocultivo sem a presença de quaisquer hormônios. O tratamento de controle consistiu na adição de 2 mg.l -1 de NAA e 1 mg.l-1 de BAP ao meio de cocultivo, como é prática padrão para a transformação de tomate.
[00260] Após a cocultura, os explantes foram transferidos para meio MS20CV consistindo em meio MS20 com 200 mg.l-1 de cefotaxim e 200 mg.l -1 de vancomicina para suprimir o crescimento de Agrobcaterium. Além disso, esse meio foi suplementado com dexametasona a 10 µM para induzir os genes do fator de transcrição sob controle de GVG (tratamento experimental) ou com 1 mg.l -1 de zeatina (regulador de crescimento de planta, prática padrão prática padrão na transformação de tomate). Dessa forma, o efeito dos genes das células-tronco transativadas foi comparado à adição de reguladores de crescimento de plantas. Os explantes foram cultivados a 25 °C e 3000 lux (fotoperíodo de 16/8 h) em câmara de crescimento. Os explantes foram subcultivados a cada duas semanas em meio fresco.
Registro de eficácias de regeneração de rebentos
[00261] O experimento foi conduzido duas vezes de maneira independente. A formação de rebentos e calosidades dos explantes foi registrada 28 dias após o início dos experimentos (Tabela 4). Os dados demonstram que a indução com estradiol e dexametasona resulta na formação de rebentos independente de hormônio com eficácias que são um pouco maiores do que após a indução de rebentos convencionais em reguladores de crescimento de plantas (isto é, primeiro NAA + BAP por dois dias, depois zeatina).
Esse efeito é aparente para explantes de tomate transformados com as construtos pKG11051 e pKG11052. O calo é formado nas bordas feridas dos explantes em todos os tratamentos de indução.
[00262] Explantes de controle sem qualquer indução não apresentaram formação de calo e formação de rebentos.
Explantes de tomate não transformados mostraram a indução de rebento normal em meio contendo reguladores de crescimento de planta convencionais (isto é, primeiro NAA+BAP por dois dias, depois zeatina), enquanto a indução por estradiol e dexametasona nesses explantes não resultou em qualquer formação de rebento. Esse experimento demonstra que a indução controlada dos genes do fator de transcrição presentes nas construtos gênicas resulta na formação de rebentos de novo sem a presença de quaisquer reguladores de crescimento. Os indutores estradiol e dexametasona por si só não são suficientes para induzir a formação de rebentos em tecidos não transformados.
Tabela 4. Eficácias de regeneração de rebentos e eficácias de formação de calos de explantes cotilédones de tomate Moneyberg transformados com os construtos pKG11051 e pKG11052, registradas como o número e a porcentagem de explantes formando rebentos e/ou calos. * = nesse tratamento, o número de explantes formadores de calos foi registrado por 97 explantes testados.
# de % de # de % de # expl expl Tratamento expl com expl com explantes com com rebentos rebentos calo calo controle (sem indução) 28 0 0,0 0 0,0 pKG11051 NAA+BAP, depois zeatina 50 10 20,0 50 100,0 ß-estradiol, depois dexametasona 157 45 28,0 (95 *) 97,9 pKG11052 NAA+BAP, depois zeatina 58 12 20,7 58 100,0 ß-estradiol, depois dexametasona 159 38 23,9 156 98,1 non-transformado 60 21 35,0 59 98,3 NAA+BAP, depois zeatina 61 0 0,0 10 16,4 ß-estradiol, depois dexametasona Tabela 5. Descrição de SEQ ID Nos SEQ ID NO: Descrição 1 Sequência de aminoácidos SHR de Arabidopsis thaliana 2 sequência de aminoácidos SCR de Arabidopsis thaliana 3 Sequência de aminoácidos WOX5 de Arabidopsis thaliana
SEQ ID NO: Descrição 4 Sequência de aminoácidos PLT1 de Arabidopsis thaliana 5 Sequência de aminoácidos PLT2 de Arabidopsis thaliana 6 Sequência de aminoácidos PLT3 de Arabidopsis thaliana 7 Sequência de aminoácidos PLT4 de Arabidopsis thaliana 8 Sequência de aminoácidos PLT5 de Arabidopsis thaliana 9 Sequência de nucleotídeos SHR de Arabidopsis thaliana 10 Sequência de nucleotídeos SCR de Arabidopsis thaliana 11 Sequência de nucleotídeos WOX5 de Arabidopsis thaliana 12 Sequência de nucleotídeos PLT1 de Arabidopsis thaliana 13 Sequência de nucleotídeos PLT2 de Arabidopsis thaliana 14 Sequência de nucleotídeos PLT3 de Arabidopsis thaliana 15 Sequência de nucleotídeos PLT4 de Arabidopsis thaliana 16 Sequência de nucleotídeos PLT5 de Arabidopsis thaliana 17 Sequência de aminoácidos RBR de Arabidopsis thaliana 18 Sequência de nucleotídeos RBR de Arabidopsis thaliana 19 Sequência de nucleotídeos PLT7 de Arabidopsis thaliana 20 Sequência de nucleotídeos de Transativator GVG 21 Sequência de nucleotídeos de Transativator LhGR 22 UAS 23 miRNA de RBR (precursor, como transcrito) 24 miRNA maduro de RBR 25 LacOp
SEQ ID NO: Descrição 26 LexAop 27 Sequência de nucleotídeos de Transativator XVE 28 Sequência de aminoácidos WIND1 de Arabidopsis thaliana 29 Sequência de nucleotídeos WIND1 de Arabidopsis thaliana 30 Sequência de aminoácidos PLT7 de Arabidopsis thaliana 31 Sequência de nucleotídeos de Transativator AlcR 32 AlcA 33 Promotor de nopalina sintase de A. tumefaciens (NOSp) 34 Promotor de nopalina sintase de A. tumefaciens (NOST) 35 Promotor de PROTEÍNA DE TUMOR CONTROLADA TRANSLACIONALMENTE 1 de A. thaliana (AtTCTP1) 36 Terminador UBIQUITIN10 de A. thaliana 37 Promotor sintético G10:90 38 Terminador de subunidade pequena ribulose-1,5- bisfosfato carboxilase de Pisum sativum (rbcST) 39 Promotor LexA de Escherichia coli 40 35Smini 41 Terminador ATPase de Solanum lycopersicum (SlATPase) 42 Sequência de nucleotídeos de etiqueta C 4xMyc (4xMyc) 43 Sequência de aminoácidos de etiqueta C 4xMyc (4xMyc) 44 Terminador UBIQUITIN3 de A. thaliana (AtUBQ3) 45 Sequência de nucleotídeos de etiqueta C de octapeptídeo 3xFLAG (3xFLAG) 46 Sequência de aminoácidos de etiqueta C de octapeptídeo 3xFLAG 47 Promotor de Sequência de Ativação a Montante de Saccharomyces cerevisiae (UASp) 48 Terminador de octopina sintase Purificado com A. tumefaciens (AtuOCS) 49 Sequência de nucleotídeos de etiqueta C de vírus símio 5 (V5)
SEQ ID NO: Descrição 50 Sequência de aminoácidos de etiqueta C de vírus símio 5 (V5) 51 Terminador de manopina sintase de A. tumefaciens (AtuMas) 52 Sequência de nucleotídeos de etiqueta C de gene 10 de bacteriófago T7 (T7) 53 Sequência de aminoácidos de gene 10 de bacteriófago T7 (T7) 54 Terminador de proteína de choque térmico de A. thaliana 18.2 (AtHSP) 55 Terminador UBIQUITIN5 de A. thaliana (AtUBQ5) 56 Terminador de álcool desidrogenase (AtADH) de A. thaliana 57 Terminador 35S do Vírus do mosaico de couve-flor (T35S) 58 Sequência de aminoácidos LhGR (transativador) Referências AIDA, M., BEIS, D., HEIDSTRA, R., WILLEMSEN, V., BLILOU, I., GALINHA, C., NUSSAUME, L., NOH, Y. S., AMASINO, R. & SCHERES, B. 2004. The PLETHORA genes mediate patterning of the Arabidopsis root stem cell niche. Cell, 119, 109-20.
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Claims (15)

REIVINDICAÇÕES
1. Método para regenerar um rebento de uma célula de planta, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de a) introduzir ou aumentar na célula de planta a expressão de uma combinação de proteínas compreendendo pelo menos: i) uma proteína homeobox 5 (WOX5) relacionada a WUSCHEL; e ii) uma proteína PLETORA (PLT) selecionada do grupo que consiste em PLT1, PLT2, PLT3, PLT4, PLT5 e PLT7, de preferência PLT1; em que a expressão de pelo menos uma das proteínas da combinação de proteínas é temporariamente introduzida ou aumentada; e b) permitir que a célula da planta se regenere no rebento.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a combinação de proteínas compreende adicionalmente iii) uma proteína de DIFERENCIAÇÃO CELULAR INDUZIDA POR FERIDA 1 (WIND1).
3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a combinação de proteínas compreende adicionalmente:
iv) uma proteína SHORT ROOT (SHR); v) uma proteína SCARECROW (SCR); e vi) pelo menos três proteínas PLETHORA (PLT) selecionadas do grupo que consiste em PLT1, PLT2, PLT3, PLT4, PLT5 e PLT7.
4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a combinação de proteínas compreende pelo menos três proteínas PLT selecionadas, que incluem pelo menos um ou mais de PLT1, PLT4 e PLT5, em que, de preferência, as pelo menos três proteínas PLT selecionadas são PLT1, PLT4 e PLT5.
5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a etapa a) compreende adicionalmente diminuir a expressão de uma proteína endógena relacionada a retinoblastoma (RBR), em que, de preferência, a expressão da proteína RBR é temporariamente diminuída.
6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a expressão de todas as proteínas da combinação de proteínas, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, é temporariamente introduzida ou aumentada, e em que opcionalmente a expressão da proteína RBR é temporariamente diminuída, em que, de preferência, a expressão de todas as proteínas da combinação de proteínas, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, é de maneira simultânea temporariamente introduzida ou aumentada e, opcionalmente, a expressão da proteína RBR é temporariamente diminuída de maneira simultânea com a combinação de proteínas.
7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a expressão de pelo menos uma das proteínas da combinação de proteínas conforme definidas em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, de preferência, a expressão de todas as proteínas da combinação de proteínas, é temporariamente introduzida ou aumentada pela ativação temporária da sua expressão e, opcionalmente, a expressão da proteína RBR é temporariamente diminuída pela ativação temporária da expressão de um repressor de RBR.
8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que i) a sequência de aminoácidos da proteína SHR tem pelo menos 60% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1; ii) a sequência de aminoácidos da proteína SCR tem pelo menos 60% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 2;
iii) a sequência de aminoácidos da proteína WOX5 tem pelo menos 60% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:
3;
iv) a sequência de aminoácidos das proteínas PLT1,
PLT2, PLT3, PLT4, PLT5 e PLT7 tem pelo menos 60% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5,
SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 30,
respectivamente;
v) a sequência de aminoácidos da proteína RBR tem pelo menos 60% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 17; e vi) a sequência de aminoácidos da proteína WIND1 tem pelo menos 60% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:
28;
e/ou em que a) a proteína SHR é codificada por uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 60% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 9;
b) a proteína SCR é codificada por uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 60% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 10;
c) a proteína WOX5 é codificada por uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 60% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 11;
d) as proteínas PLT1, PLT2, PLT3, PLT4, PLT5 e PLT7 são codificadas por uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 60% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO : 15, SEQ ID NO: 16 e SEQ ID NO: 19, respectivamente; e) a proteína RBR é codificada por uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 60% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 18; e f) a proteína WIND1 é codificada por uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 60% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 29.
9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a célula de planta é parte de um tecido multicelular, de preferência, um tecido de calo, um órgão ou um explante de planta, em que, de preferência, o órgão de planta é uma raiz e/ou em que, de preferência, a célula de planta pode ser obtida de uma planta selecionada do grupo que consiste em Arabidopsis, cevada, repolho, canola, mandioca, couve- flor, chicória, crisântemo, algodão, pepino, berinjela, uva, pimenta, alface, milho, melão, colza, batata, abóbora, arroz, centeio, sorgo, soja, abóbora, cana-de-açúcar, beterraba sacarina, girassol, pimentão, tomate, melancia, trigo e abobrinha.
10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, o método caracterizado pelo fato de que compreende uma etapa c) de formar uma planta ou parte da planta a partir do rebento regenerado.
11. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos duas moléculas de ácido nucleico, em que i) uma primeira molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína WOX5 operacionalmente ligada a um promotor induzível; e ii) uma segunda molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína PLT selecionada do grupo que consiste em PLT1, PLT2, PLT3, PLT4, PLT5 e PLT7, de preferência PLT1, operacionalmente ligada a um promotor induzível.
12. Construto de ácido nucleico, caracterizado pelo fato de que compreende a sequência de nucleotídeos da primeira e da segunda moléculas de ácido nucleico, conforme definidas na reivindicação 11, em que, de preferência, o construto de ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeos adicional que codifica um transativador que é, de preferência, operacionalmente ligada a um promotor, em que o transativador ao se ligar a um indutor, ativa o promotor induzível, e em que, de preferência, o transativador é codificado por uma sequência de nucleotídeos tendo i) pelo menos 60% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 21 e em que o transativador é capaz de se ligar ao corticoide dexamatasona ou um derivado do mesmo; ou ii) pelo menos 60% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 27 e em que o transativador é capaz de se ligar a β-estradiol ou um derivado do mesmo.
13. Célula de planta, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos um de: i) a primeira e a segunda moléculas de ácido nucleico conforme definidas na reivindicação 11; e ii) o construto de ácido nucleico conforme definida na reivindicação 12.
14. Rebento, planta ou parte de planta, caracterizado(a) pelo fato de ser obtenível pelo método conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a
10.
15. Uso de uma combinação de proteínas conforme definidas em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, e opcionalmente um repressor de RBR conforme definido na reivindicação 7, uma composição conforme definida na reivindicação 11, ou um construto de ácido nucleico conforme definida na reivindicação 12, caracterizado pelo fato de ser para regeneração do rebento de uma célula de planta.
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