BR112018008705B1 - Método para produzir uma planta transgênica - Google Patents
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Abstract
método para produzir uma planta transgênica e método para produzir uma planta transformada. trata-se de métodos e composições para a transformação de plantas rápida e eficaz. a revelação fornece adicionalmente métodos para produzir uma planta transgênica que compreende (a) transformar uma célula de um explante com um construto de expressão que compreende (i) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo homeobox wus/wox; (ii) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de ap2-dna; ou (iii) uma combinação de (i) e (ii); e (b) permitir a expressão do polipeptídeo de (a) em cada célula transformada para formar uma estrutura de planta regenerável na ausência de citocinina exógena, em que nenhum calo é formado; e (c) germinar a estrutura de planta regenerável para formar a planta transgênica. este resumo se destina a ser uma ferramenta de varredura com propósitos de pesquisa na técnica específica e não se destina a limitar a presente invenção.
Description
[0001] A presente revelação refere-se, em geral, ao campo de biologia molecular vegetal, incluindo manipulação genética de plantas. Mais especificamente, a presente revelação se refere a métodos rápidos e altamente eficazes e composições para produzir uma planta transformada na ausência de citoquinina e sem formação de calo.
[0002] Este pedido reivindica prioridade do Pedido de Patente Provisório n° US 62/248578, depositado em 30 de outubro de 2015, que é incorporado ao presente documento em sua totalidade a título de referência.
[0003] A cópia oficial da listagem de sequências é enviada eletronicamente por meio de EFS-Web como uma listagem de sequências formatada em ASCII com um arquivo nomeado 20160826_6752WOPCT_SeqList, criado em 17 de agosto de 2016, e que tem um tamanho de 1.000 KB e é depositado simultaneamente com o relatório descritivo. A listagem de sequências contida nesse documento formatado em ASCII faz parte do relatório descritivo e está incorporada ao presente documento a título de referência em sua totalidade.
[0004] As vantagens principais em transformação de planta ocorreram nos últimos diversos anos. A transformação de uma variedade de plantas agronomicamente importante, por exemplo, milho, feijão-soja, canola, trigo, arroz Indica, cana de açúcar e sorgo, e linhagens endogâmicas continuam a ser difíceis e demoradas. Tradicionalmente, o único modo de obter uma resposta à cultura tem sido otimizando-se os componentes de meios e/ou material e fonte de explante. Isso levou ao sucesso em alguns genótipos, mas muitas plantas de cultura importante, incluindo consanguíneos de elite ou variedades, falham em produzir uma resposta de cultura favorável. Embora a transformação de genótipos modelos possa ser eficaz, o processo de introduzir transgenes em consanguíneos de produção é laborioso, caro e demorado. Isso economizaria tempo e dinheiro se os genes pudessem ser introduzidos e avaliados com maior velocidade e eficiência.
[0005] Apesar das limitações, transformação de monocotiledôneas mediada por Agrobacterium como milho, arroz e trigo permanece uma abordagem experimental amplamente usada, frequentemente com o uso de tecido meristemático como embriões imaturos como os explantes de escolha (por exemplo, Ishida et al., 1996; Zhao et al., 2001; Frame et al., 2002). Para o arroz, a transformação de sementes embebidas também foi relatada (Toki et al., 2006). Até o momento, os métodos mais comuns usados para colocar as células em contato com Agrobacterium incluem: cultivar tecido de explante como embriões imaturos ("cocultura"), que incluem possivelmente uma etapa de “atraso" ou "repouso" (não seletivo), seguida pela cultura no meio de seleção contendo auxina (ou auxinas) que permite a não diferenciação de células para formar calo. Durante essa fase de formação de calo, o tecido de calo resistente transformado é selecionado na presença de um agente de seleção adequado em um meio de seleção. Isso é seguido pelo crescimento de células sob condições que promovem a diferenciação do calo e regeneração do calo em plantas em meios de regeneração e enraizamento. Esse processo exigiu, tipicamente, pelo menos de 10 a 12 semanas para produzir plantas que podem ser transferidas para o solo para mais crescimento. O processo também exige diversas transferências manuais de tecido ao longo do processo de transformação e usa diversos tipos diferentes de meios.
[0006] Desse modo, o uso de protocolos padrão de transformação e regeneração é demorado e ineficaz, e impacta negativamente nas linhas de tempo de desenvolvimento de produto transgênico, dado que há normalmente uma “janela de desenvolvimento de prioridade” limitada por estação para tomar decisões relacionadas a quais construtos genéticos priorizar para uso em trabalho de campo de grande escala com base nos resultados obtidos durante a pesquisa inicial. Os métodos de transformação e regeneração padrão disponíveis têm múltiplas desvantagens que limitam a velocidade e a eficácia com a qual as plantas transgênicas podem ser produzidas e triadas. Por exemplo, muitos métodos de transformação e regeneração padrão exigem o uso de altos níveis de auxina ou citoquinina e exigem etapas que envolvem formação de calo embriogênica ou organogênese, levando a procedimentos que podem levar semanas antes de produzir plantas para crescimento em uma definição de estufa seguindo a transformação. Relatou-se (Zhong et al. (1992) Planta 187:490 a 497) que tais métodos podem levar de 12 a 23 semanas para produzir plantas, que incluem as etapas de fornecer 2,4-D para estimular a formação de embrião somático em milho (levando até 8 semanas), produção de calo embriogênico dos embriões somáticos primários (levando até 8 semanas adicionais), formação de brotos (levando até 3 semanas adicionais), e, finalmente, enraizamento (levando até 1 a 3 semanas adicionais). Alternativamente, Zhong et al. Fornecem, imediatamente, uma citoquinina juntamente com a auxina para estimular a morfogênese direta para produzir brotos e formação de planta direta de 8 a 28 semanas (Zhong et al. (1992) Planta 187:490 a 497).
[0007] Apesar do avanços na biologia molecular vegetal, particularmente, em métodos de transformação e regeneração de planta permanece uma necessidade de um sistema de alta produtividade para produzir plantas transgênicas rápida e eficientemente para fornecer mais tempo e flexibilidade para fazer pesquisa e tomar decisões de desenvolvimento de produto. Tal sistema de alta produtividade para transformação facilita a produção de grande quantidade de plantas transgênicas para teste de gene e/ou desenvolvimento de produto enquanto abaixa os custos de material e trabalho.
[0008] Em vários aspectos, a presente revelação fornece mais métodos para produzir uma planta transgênica que compreende: (a) transformar uma célula de um explante com um construto de expressão que compreende: (i) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo homeobox WUS/WOX; ou (ii) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA; ou (iii) uma combinação de (i) e (ii); e (b) permitir a expressão do polipeptídeo de (a) em cada célula transformada para formar uma estrutura de planta regenerável na ausência de citocinina exógena, em que nenhum calo é formado; e (c) germinar a estrutura de planta regenerável para formar a planta transgênica. Em um aspecto, o construto de expressão compreende tanto a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX quanto a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA. Em um aspecto, o construto de expressão compreende a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX. Em um aspecto, o construto de expressão compreende a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA. Em um aspecto, a expressão da sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX e/ou a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2 ocorre menos de 1 dia, menos de 2 dias, menos de 5 dias, menos de 7 dias ou menos de cerca de 14 dias após iniciação da transformação. Em um aspecto, o construto de expressão compreende adicionalmente uma sequência de nucleotídeos que codifica uma recombinase específica a sítio. Em um aspecto, a recombinase específica a sítio é selecionada dentre FLP, Cre, SSV1, lambda Int, phi C31 Int, HK022, R, Gin, Tn1721, CinH, ParA, Tn5053, Bxb1, TP907- 1 ou U153. Em um aspecto, a recombinase específica a sítio é um peptídeo de fusão desestabilizado. Em um aspecto, o peptídeo de fusão desestabilizado é TETR(L17G)~CRE ou ESR(L17G)~CRE. Em um aspecto, a sequência de nucleotídeos que codifica uma recombinase específica a sítio é operacionalmente ligada a um promotor constitutivo, um promotor induzível ou um promotor regulado em desenvolvimento. Em um aspecto, a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é operacionalmente ligada a um promotor constitutivo, um promotor induzível ou um promotor regulado em desenvolvimento. Em um aspecto, a sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA é operacionalmente ligada a um promotor constitutivo, um promotor induzível ou um promotor regulado em desenvolvimento. Em um aspecto, o promotor constitutivo operacionalmente ligado à sequência de nucleotídeos que codifica uma recombinase específica a sítio e/ou à sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX e/ou a sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA é selecionado dentre UBI, LLDAV, EVCV, DMMV, BSV (AY) PRO, CYMV PRO FL, UBIZM PRO, SI-UB3 PRO, SB- UBI PRO (ALT1), USB1ZM PRO, ZM-GOS2 PRO, ZM-H1B PRO (1,2 KB), IN2- 2, NOS, a versão -135 de 35S, ou ZM-ADF PRO (ALT2). Em um aspecto, o promotor induzível operacionalmente ligado à sequência de nucleotídeos que codifica uma recombinase específica a sítio e/ou à sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX e/ou a sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA é selecionado dentre AXIG1, DR5, XVE, GLB1, OLE, LTP2, HSP17.7, HSP26, HSP18A ou promotores ativados por tetraciclina, etametsulfurona ou clorsulfurona. Em um aspecto, o promotor regulado em desenvolvimento operacionalmente ligado à sequência de nucleotídeos que codifica uma recombinase específica a sítio e/ou à sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX e/ou à sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA é selecionado dentre PLTP, PLTP1, PLTP2, PLTP3, LGL, LEA-14A ou LEA-D34. Em um aspecto, o promotor induzível é um promotor quimicamente induzível. Em um aspecto, o promotor quimicamente induzível é XVE. Em um aspecto, o promotor quimicamente induzível é reprimido por TETR, ESR ou CR, e a não repressão ocorre mediante a adição de ligantes relacionados a tetraciclina ou sulfonilureia. Em um aspecto, o repressor é TETR e o ligante relacionado a tetraciclina é doxiciclina ou anidrotetraciclina. Em um aspecto, o repressor é ESR e o ligante de sulfonilureia é etametsulfurona, clorsulfurona, metsulfurona- metila, sulfometurona metila, clorimurona etila, nicosulfurona, primisulfurona, tribenurona, sulfosulfurona, trifloxisulfurona, foramsulfurona, iodosulfurona, prosulfurona, tifensulfurona, rimsulfurona, mesosulfurona ou halosulfurona. Em um aspecto, o promotor induzível é um promotor induzível de auxina. Em um aspecto, o promotor induzível de auxina é um AXIG1. Em um aspecto, o promotor AXIG1 compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 39. Em um aspecto, o promotor induzível compreende um elemento de resposta de auxina. Em um aspecto, o promotor induzível contém um ou mais motivos intensificadores de DR5. Em um aspecto, o promotor é um promotor constitutivo fraco modificado por repressão e não repressão. Em um aspecto, uma ou mais sequências de operador no promotor foram posicionadas perto ou sobrepondo o TATA box e/ou o sítio de início de transcrição. Em um aspecto, o promotor é selecionado dentre NOS, AXIG1, ZM-GOS2, CC-UBI1-PRO ou ZM-ADF4-PRO. Em um aspecto, o promotor induzível é o promotor DR5 que compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 40. Em um aspecto, o promotor é um promotor não reprimível. Em um aspecto, o promotor não reprimível é TETR, ESR ou CR. Em um aspecto, o promotor regulado em desenvolvimento é selecionado dentre PLTP, PLTP1, PLTP2 ou PLTP3. Em um aspecto, o PLTP, PLTP1, PLTP2 ou PLTP3 promotor é derivado de uma monocotiledônea. Em um aspecto, a monocotiledônea é cevada, milho, painço, aveias, arroz, centeio, Setaria sp., sorgo, cana de açúcar, painço amarelo, triticale, relva ou trigo. Em um aspecto, a monocotiledônea é milho, sorgo, arroz ou Setaria sp. Em um aspecto, a monocotiledônea é milho, sorgo ou arroz. Em um aspecto, a monocotiledônea é milho. Em um aspecto, o promotor PLTP, PLTP1, PLTP2 ou PLTP3 é derivado de uma dicotiledônea. Em um aspecto, a dicotiledônea é couve, couve-flor, brócolis, planta de mostarda, repolho, ervilha, cravo-da-índia, alfafa, feijão-fava, tomate, mandioca, feijão-soja, canola, alfafa, girassol, cártamo, tabaco, Arabidopsis ou algodão. Em um aspecto, o promotor PLTP, PLTP1, PLTP2 ou PLTP3 compreende qualquer uma dentre SEQ ID NO: 1 a 2 ou 55 a 61. O promotor PLTP compreende qualquer uma dentre SEQ ID NO: 1 ou 2. Em um aspecto, o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é selecionado dentre polipeptídeo WUS1, WUS2, WUS3, WOX2A, WOX4, WOX5 ou WOX9. Em um aspecto, a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é um nucleotídeo de monocotiledônea. Em um aspecto, a monocotiledônea é cevada, milho, painço, aveias, arroz, centeio, Setaria sp., sorgo, cana de açúcar, painço amarelo, triticale, relva ou trigo. Em um aspecto, a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é um nucleotídeo de dicotiledônea. Em um aspecto, a dicotiledônea é couve, couve-flor, brócolis, planta de mostarda, repolho, ervilha, cravo-da-índia, alfafa, feijão-fava, tomate, mandioca, feijão-soja, canola, alfafa, girassol, cártamo, tabaco, Arabidopsis ou algodão. Em um aspecto, a sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo homeobox WUS/WOX codifica uma sequência de aminoácidos que compreende qualquer uma dentre SEQ ID NOs:4, 6, 8, 10, 12, 14 ou 16. Em um aspecto, a sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo homeobox WUS/WOX compreende qualquer uma dentre SEQ ID NOs:3, 5, 7, 9, 11, 13 ou 15. Em um aspecto, o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é um polipeptídeo WUS1. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS1 é um polipeptídeo WUS1 de milho, sorgo, arroz ou Setaria sp. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS1 é um polipeptídeo WUS1 de milho ou arroz. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS1 é um polipeptídeo WUS1 de milho. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS1 compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS1 é codificado por uma sequência de nucleotídeos que compreende SEQ ID NO: 3. Em um aspecto, o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é um polipeptídeo WUS2. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS2 é um polipeptídeo WUS2 de milho, sorgo, arroz ou Setaria sp. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS2 é um polipeptídeo WUS2 de milho ou arroz. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS2 é um polipeptídeo WUS2 de milho. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS2 compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:6. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS2 é codificado por uma sequência de nucleotídeos que compreende SEQ ID NO: 5. Em um aspecto, o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é um polipeptídeo WUS3. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS3 é um polipeptídeo WUS3 de milho, sorgo, arroz ou Setaria. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS3 é um polipeptídeo WUS3 de milho ou arroz. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS3 é um polipeptídeo WUS3 de milho. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS3 compreende a sequência de aminos de SEQ ID NO:8. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS3 é codificado por uma sequência de nucleotídeos que compreende SEQ ID NO:7. Em um aspecto, o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é um polipeptídeo WOX5. Em um aspecto, o polipeptídeo WOX5 é um polipeptídeo WOX5A. Em um aspecto, o polipeptídeo WOX5 é um polipeptídeo WOX5 de milho, sorgo, arroz ou Setaria. Em um aspecto, o polipeptídeo WOX5 é um polipeptídeo WOX5 de milho ou arroz. Em um aspecto, o polipeptídeo WOX5 é um polipeptídeo WOX5 de milho. Em um aspecto, o polipeptídeo WOX5 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14. Em um aspecto, o polipeptídeo WOX5 é codificado por uma sequência de nucleotídeos que compreende SEQ ID NO: 13. Em um aspecto, o polipeptídeo que compreende os dois domínios de ligação de AP2-DNA é um polipeptídeo ODP2, BBM2, BMN2 ou BMN3. Em um aspecto, o polipeptídeo que compreende os dois domínios de ligação de AP2- DNA é um polipeptídeo de monocotiledônea. Em um aspecto, a monocotiledônea é cevada, milho, painço, aveias, arroz, centeio, Setaria sp., sorgo, cana de açúcar, painço amarelo, triticale, relva ou trigo. Em um aspecto, a monocotiledônea é milho, sorgo, arroz ou Setaria sp. Em um aspecto, a monocotiledônea é milho ou arroz. Em um aspecto, a monocotiledônea é milho. Em um aspecto, o polipeptídeo que compreende os dois domínios de ligação de AP2-DNA é um polipeptídeo de dicotiledônea. Em um aspecto, a dicotiledônea é couve, couve-flor, brócolis, planta de mostarda, repolho, ervilha, cravo-da-índia, alfafa, feijão-fava, tomate, mandioca, feijão-soja, canola, alfafa, girassol, cártamo, tabaco, Arabidopsis ou algodão. Em um aspecto, o polipeptídeo que compreende os dois domínios de ligação de AP2-DNA compreende uma sequência de aminoácidos de qualquer uma dentre SEQ ID NO: 18, 20, 63, 65 ou 67. Em um aspecto, o polipeptídeo que compreende os dois domínios de ligação de AP2- DNA é codificado por uma sequência de nucleotídeos que compreende qualquer uma dentre SEQ ID NO: 17, 19, 21, 62, 64, 66 ou 68. Em um aspecto, o polipeptídeo que compreende os dois domínios de ligação de AP2-DNA é um polipeptídeo ODP2. Em um aspecto, o polipeptídeo ODP2 é um polipeptídeo de monocotiledônea. Em um aspecto, a monocotiledônea é cevada, milho, painço, aveias, arroz, centeio, Setaria sp., sorgo, cana de açúcar, painço amarelo, triticale, relva ou trigo. Em um aspecto, a monocotiledônea é milho, arroz ou Setaria sp. Em um aspecto, a monocotiledônea é milho ou arroz. Em um aspecto, o ODP2 é um polipeptídeo de dicotiledônea. Em um aspecto, a dicotiledônea é couve, couve-flor, brócolis, planta de mostarda, repolho, ervilha, cravo-da-índia, alfafa, feijão-fava, tomate, mandioca, feijão-soja, canola, alfafa, girassol, cártamo, tabaco, Arabidopsis ou algodão. Em um aspecto, o polipeptídeo ODP2 compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma dentre SEQ ID NO: 18, 63, 65 ou 67. Em um aspecto, o polipeptídeo ODP2 é codificado por uma sequência de nucleotídeos que compreende a sequência de qualquer uma dentre SEQ ID NO: 17, 21, 62, 64, 66, ou 68. Em um aspecto, o polipeptídeo que compreende os dois domínios de ligação de AP2-DNA é um polipeptídeo de BBM2. Em um aspecto, o polipeptídeo BBM2 é um polipeptídeo de monocotiledônea. Em um aspecto, a monocotiledônea é cevada, milho, painço, aveias, arroz, centeio, Setaria sp., sorgo, cana de açúcar, painço amarelo, triticale, relva ou trigo. Em um aspecto, a monocotiledônea é milho, cana de açúcar, arroz ou Setaria sp. Em um aspecto, a monocotiledônea é milho ou arroz. Em um aspecto, a monocotiledônea é milho. Em um aspecto, o polipeptídeo de BBM2 é um polipeptídeo de dicotiledônea. Em um aspecto, a dicotiledônea é couve, couve-flor, brócolis, planta de mostarda, repolho, ervilha, cravo-da-índia, alfafa, feijão-fava, tomate, mandioca, feijão-soja, canola, alfafa, girassol, cártamo, tabaco, Arabidopsis ou algodão. Em um aspecto, o polipeptídeo BBM2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20. Em um aspecto, o polipeptídeo BBM2 é codificado por uma sequência de nucleotídeos que compreende a sequência de SEQ ID NO: 19. Em um aspecto, a estrutura de planta regenerável é formada dentre cerca de 0 a cerca de 7 dias de transformação da célula ou dentro de cerca de 0 a cerca de 14 dias de transformação da célula e a planta transgênica é formada em cerca de 14 dias de transformação da célula a cerca de 60 dias de transformação da célula. Em um aspecto, o método é realizado na ausência de meio de enraizamento. Em um aspecto, o método é realizado na presença de meio de enraizamento. Em um aspecto, o explante é um embrião imaturo. Em um aspecto, o embrião imaturo é um embrião imaturo de 1 a 5 mm. Em um aspecto, o embrião imaturo é um embrião imaturo de 3,5 a 5 mm. Em um aspecto, a citocinina exógena é usada durante a germinação após cerca de 7 dias de transformação da célula ou após cerca de 14 dias de transformação da célula. Em um aspecto, a expressão de um polipeptídeo de (a) é transiente. Em um aspecto, a germinação é realizada na presença de citocinina exógena.
[0009] Em vários aspectos, a presente revelação fornece mais métodos para produzir uma planta transgênica que compreende: (a) transformar uma célula de um explante com um construto de expressão que compreende (i) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo homeobox WUS/WOX; ou (ii) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA; ou (iii) uma combinação dos mesmos; (b) permitir a expressão de um polipeptídeo de (a) em cada célula transformada para formar uma estrutura de planta regenerável na ausência de citocinina exógena, em que nenhum calo é formado; e (c) germinar a estrutura de planta regenerável para formar a planta transgênica; em que o polipeptídeo homeobox WUS/WOX compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma dentre SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14 ou 16; ou em que o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é codificado pela sequência de nucleotídeos de qualquer uma dentre SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13 ou 15; e em que o polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma dentre SEQ ID NO: 18, 20, 63, 65 ou 67; ou em que o polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA é codificado pela sequência de nucleotídeos de qualquer uma dentre SEQ ID NO: 17, 19, 21, 62, 64, 66 ou 68. Em um aspecto, o construto de expressão compreende tanto a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX quanto a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA. Em um aspecto, o construto de expressão compreende a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX. Em um aspecto, o construto de expressão compreende a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA. Em um aspecto, a expressão da sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX e/ou a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2 ocorre menos de 1 dia, menos de 2 dias, menos de 5 dias, menos de 7 dias ou menos de cerca de 14 dias após iniciação da transformação. Em um aspecto, o construto de expressão compreende adicionalmente uma sequência de nucleotídeos que codifica uma recombinase específica a sítio. Em um aspecto, a recombinase específica a sítio é selecionada dentre FLP, Cre, SSV1, lambda Int, phi C31 Int, HK022, R, Gin, Tn1721, CinH, ParA, Tn5053, Bxb1, TP907-1 ou U153. Em um aspecto, a recombinase específica a sítio é um peptídeo de fusão desestabilizado. Em um aspecto, o peptídeo de fusão desestabilizado é TETR(L17G)~CRE ou ESR(L17G)~CRE. Em um aspecto, a sequência de nucleotídeos que codifica uma recombinase específica a sítio é operacionalmente ligada a um promotor constitutivo, um promotor induzível ou um promotor regulado em desenvolvimento. Em um aspecto, a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é operacionalmente ligada a um promotor constitutivo, um promotor induzível ou um promotor regulado em desenvolvimento. Em um aspecto, a sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA é operacionalmente ligada a um promotor constitutivo, um promotor induzível ou um promotor regulado em desenvolvimento. Em um aspecto, o promotor constitutivo operacionalmente ligado à sequência de nucleotídeos que codifica uma recombinase específica a sítio e/ou à sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX e/ou a sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA é selecionado dentre UBI, LLDAV, EVCV, DMMV, BSV (AY) PRO, CYMV PRO FL, UBIZM PRO, SI- UB3 PRO, SB-UBI PRO (ALT1), USB1ZM PRO, ZM-GOS2 PRO, ZM-H1B PRO (1,2 KB), IN2-2, NOS, a versão -135 de 35S, ou ZM-ADF PRO (ALT2). Em um aspecto, o promotor induzível operacionalmente ligado à sequência de nucleotídeos que codifica uma recombinase específica a sítio e/ou à sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX e/ou a sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA é selecionado dentre AXIG1, DR5, XVE, GLB1, OLE, LTP2, HSP17.7, HSP26, HSP18A ou promotores ativados por tetraciclina, etametsulfurona ou clorsulfurona. Em um aspecto, o promotor regulado em desenvolvimento operacionalmente ligado à sequência de nucleotídeos que codifica uma recombinase específica a sítio e/ou à sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX e/ou à sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA é selecionado dentre PLTP, PLTP1, PLTP2, PLTP3, LGL, LEA-14A ou LEA-D34. Em um aspecto, o promotor induzível é um promotor quimicamente induzível. Em um aspecto, o promotor quimicamente induzível é XVE. Em um aspecto, o promotor quimicamente induzível é reprimido por TETR, ESR ou CR, e a não repressão ocorre mediante a adição de ligantes relacionados a tetraciclina ou sulfonilureia. Em um aspecto, o repressor é TETR e o ligante relacionado a tetraciclina é doxiciclina ou anidrotetraciclina. Em um aspecto, o repressor é ESR e o ligante de sulfonilureia é etametsulfurona, clorsulfurona, metsulfurona- metila, sulfometurona metila, clorimurona etila, nicosulfurona, primisulfurona, tribenurona, sulfosulfurona, trifloxisulfurona, foramsulfurona, iodosulfurona, prosulfurona, tifensulfurona, rimsulfurona, mesosulfurona ou halosulfurona. Em um aspecto, o promotor induzível é um promotor induzível de auxina. Em um aspecto, o promotor induzível de auxina é um AXIG1. Em um aspecto, o promotor AXIG1 compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 39. Em um aspecto, o promotor induzível compreende um elemento de resposta de auxina. Em um aspecto, o promotor induzível contém um ou mais motivos intensificadores de DR5. Em um aspecto, o promotor é um promotor constitutivo fraco modificado por repressão e não repressão. Em um aspecto, uma ou mais sequências de operador no promotor foram posicionadas perto ou sobrepondo o TATA box e/ou o sítio de início de transcrição. Em um aspecto, o promotor é selecionado dentre NOS, AXIG1, ZM-GOS2, CC-UBI1-PRO ou ZM-ADF4-PRO. Em um aspecto, o promotor induzível é o promotor DR5 que compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 40. Em um aspecto, o promotor é um promotor não reprimível. Em um aspecto, o promotor não reprimível é TETR, ESR ou CR. Em um aspecto, o promotor regulado em desenvolvimento é selecionado dentre PLTP, PLTP1, PLTP2 ou PLTP3. Em um aspecto, o PLTP, PLTP1, PLTP2 ou PLTP3 promotor é derivado de uma monocotiledônea. Em um aspecto, a monocotiledônea é cevada, milho, painço, aveias, arroz, centeio, Setaria sp., sorgo, cana de açúcar, painço amarelo, triticale, relva ou trigo. Em um aspecto, a monocotiledônea é milho, sorgo, arroz ou Setaria sp. Em um aspecto, a monocotiledônea é milho, sorgo ou arroz. Em um aspecto, a monocotiledônea é milho. Em um aspecto, o promotor PLTP, PLTP1, PLTP2 ou PLTP3 é derivado de uma dicotiledônea. Em um aspecto, a dicotiledônea é couve, couve-flor, brócolis, planta de mostarda, repolho, ervilha, cravo-da-índia, alfafa, feijão-fava, tomate, mandioca, feijão-soja, canola, alfafa, girassol, cártamo, tabaco, Arabidopsis ou algodão. Em um aspecto, o promotor PLTP, PLTP1, PLTP2 ou PLTP3 compreende qualquer uma dentre SEQ ID NO: 1 a 2 ou 55 a 61. O promotor PLTP compreende qualquer uma dentre SEQ ID NO: 1 ou 2. Em um aspecto, o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é selecionado dentre polipeptídeo WUS1, WUS2, WUS3, WOX2A, WOX4, WOX5 ou WOX9. Em um aspecto, a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é um nucleotídeo de monocotiledônea. Em um aspecto, a monocotiledônea é cevada, milho, painço, aveias, arroz, centeio, Setaria sp., sorgo, cana de açúcar, painço amarelo, triticale, relva ou trigo. Em um aspecto, a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é um nucleotídeo de dicotiledônea. Em um aspecto, a dicotiledônea é couve, couve-flor, brócolis, planta de mostarda, repolho, ervilha, cravo-da-índia, alfafa, feijão-fava, tomate, mandioca, feijão-soja, canola, alfafa, girassol, cártamo, tabaco, Arabidopsis ou algodão. Em um aspecto, a sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo homeobox WUS/WOX codifica uma sequência de aminoácidos que compreende qualquer uma dentre SEQ ID NOs:4, 6, 8, 10, 12, 14 ou 16. Em um aspecto, a sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo homeobox WUS/WOX compreende qualquer uma dentre SEQ ID NOs:3, 5, 7, 9, 11, 13 ou 15. Em um aspecto, o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é um polipeptídeo WUS1. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS1 é um polipeptídeo WUS1 de milho, sorgo, arroz ou Setaria sp. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS1 é um polipeptídeo WUS1 de milho ou arroz. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS1 é um polipeptídeo WUS1 de milho. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS1 compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS1 é codificado por uma sequência de nucleotídeos que compreende SEQ ID NO: 3. Em um aspecto, o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é um polipeptídeo WUS2. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS2 é um polipeptídeo WUS2 de milho, sorgo, arroz ou Setaria sp. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS2 é um polipeptídeo WUS2 de milho ou arroz. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS2 é um polipeptídeo WUS2 de milho. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS2 compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:6. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS2 é codificado por uma sequência de nucleotídeos que compreende SEQ ID NO: 5. Em um aspecto, o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é um polipeptídeo WUS3. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS3 é um polipeptídeo WUS3 de milho, sorgo, arroz ou Setaria. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS3 é um polipeptídeo WUS3 de milho ou arroz. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS3 é um polipeptídeo WUS3 de milho. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS3 compreende a sequência de aminos de SEQ ID NO:8. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS3 é codificado por uma sequência de nucleotídeos que compreende SEQ ID NO:7. Em um aspecto, o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é um polipeptídeo WOX5. Em um aspecto, o polipeptídeo WOX5 é um polipeptídeo WOX5A. Em um aspecto, o polipeptídeo WOX5 é um polipeptídeo WOX5 de milho, sorgo, arroz ou Setaria. Em um aspecto, o polipeptídeo WOX5 é um polipeptídeo WOX5 de milho ou arroz. Em um aspecto, o polipeptídeo WOX5 é um polipeptídeo WOX5 de milho. Em um aspecto, o polipeptídeo WOX5 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14. Em um aspecto, o polipeptídeo WOX5 é codificado por uma sequência de nucleotídeos que compreende SEQ ID NO: 13. Em um aspecto, o polipeptídeo que compreende os dois domínios de ligação de AP2-DNA é um polipeptídeo ODP2, BBM2, BMN2 ou BMN3. Em um aspecto, o polipeptídeo que compreende os dois domínios de ligação de AP2- DNA é um polipeptídeo de monocotiledônea. Em um aspecto, a monocotiledônea é cevada, milho, painço, aveias, arroz, centeio, Setaria sp., sorgo, cana de açúcar, painço amarelo, triticale, relva ou trigo. Em um aspecto, a monocotiledônea é milho, sorgo, arroz ou Setaria sp. Em um aspecto, a monocotiledônea é milho ou arroz. Em um aspecto, a monocotiledônea é milho. Em um aspecto, o polipeptídeo que compreende os dois domínios de ligação de AP2-DNA é um polipeptídeo de dicotiledônea. Em um aspecto, a dicotiledônea é couve, couve-flor, brócolis, planta de mostarda, repolho, ervilha, cravo-da-índia, alfafa, feijão-fava, tomate, mandioca, feijão-soja, canola, alfafa, girassol, cártamo, tabaco, Arabidopsis ou algodão. Em um aspecto, o polipeptídeo que compreende os dois domínios de ligação de AP2-DNA compreende uma sequência de aminoácidos de qualquer uma dentre SEQ ID NO: 18, 20, 63, 65 ou 67. Em um aspecto, o polipeptídeo que compreende os dois domínios de ligação de AP2- DNA é codificado por uma sequência de nucleotídeos que compreende qualquer uma dentre SEQ ID NO: 17, 19, 21, 62, 64, 66 ou 68. Em um aspecto, o polipeptídeo que compreende os dois domínios de ligação de AP2-DNA é um polipeptídeo ODP2. Em um aspecto, o polipeptídeo ODP2 é um polipeptídeo de monocotiledônea. Em um aspecto, a monocotiledônea é cevada, milho, painço, aveias, arroz, centeio, Setaria sp., sorgo, cana de açúcar, painço amarelo, triticale, relva ou trigo. Em um aspecto, a monocotiledônea é milho, arroz ou Setaria sp. Em um aspecto, a monocotiledônea é milho ou arroz. Em um aspecto, o ODP2 é um polipeptídeo de dicotiledônea. Em um aspecto, a dicotiledônea é couve, couve-flor, brócolis, planta de mostarda, repolho, ervilha, cravo-da-índia, alfafa, feijão-fava, tomate, mandioca, feijão-soja, canola, alfafa, girassol, cártamo, tabaco, Arabidopsis ou algodão. Em um aspecto, o polipeptídeo ODP2 compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma dentre SEQ ID NO: 18, 63, 65 ou 67. Em um aspecto, o polipeptídeo ODP2 é codificado por uma sequência de nucleotídeos que compreende a sequência de qualquer uma dentre SEQ ID NO: 17, 21, 62, 64, 66, ou 68. Em um aspecto, o polipeptídeo que compreende os dois domínios de ligação de AP2-DNA é um polipeptídeo de BBM2. Em um aspecto, o polipeptídeo BBM2 é um polipeptídeo de monocotiledônea. Em um aspecto, a monocotiledônea é cevada, milho, painço, aveias, arroz, centeio, Setaria sp., sorgo, cana de açúcar, painço amarelo, triticale, relva ou trigo. Em um aspecto, a monocotiledônea é milho, cana de açúcar, arroz ou Setaria sp. Em um aspecto, a monocotiledônea é milho ou arroz. Em um aspecto, a monocotiledônea é milho. Em um aspecto, o polipeptídeo de BBM2 é um polipeptídeo de dicotiledônea. Em um aspecto, a dicotiledônea é couve, couve-flor, brócolis, planta de mostarda, repolho, ervilha, cravo-da-índia, alfafa, feijão-fava, tomate, mandioca, feijão-soja, canola, alfafa, girassol, cártamo, tabaco, Arabidopsis ou algodão. Em um aspecto, o polipeptídeo BBM2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20. Em um aspecto, o polipeptídeo BBM2 é codificado por uma sequência de nucleotídeos que compreende a sequência de SEQ ID NO: 19. Em um aspecto, a estrutura de planta regenerável é formada dentre cerca de 0 a cerca de 7 dias de transformação da célula ou dentro de cerca de 0 a cerca de 14 dias de transformação da célula e a planta transgênica é formada em cerca de 14 dias de transformação da célula a cerca de 60 dias de transformação da célula. Em um aspecto, o método é realizado na ausência de meio de enraizamento. Em um aspecto, o método é realizado na presença de meio de enraizamento. Em um aspecto, o explante é um embrião imaturo. Em um aspecto, o embrião imaturo é um embrião imaturo de 1 a 5 mm. Em um aspecto, o embrião imaturo é um embrião imaturo de 3,5 a 5 mm. Em um aspecto, a citocinina exógena é usada durante a germinação após cerca de 7 dias de transformação da célula ou após cerca de 14 dias de transformação da célula. Em um aspecto, a expressão de um polipeptídeo de (a) é transiente. Em um aspecto, a germinação é realizada na presença de citocinina exógena.
[0010] Em vários aspectos, a presente revelação fornece mais métodos para produzir uma planta transgênica que compreende: (a) transformar uma célula de um explante com um construto de expressão que compreende (i) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo WUS2; ou (ii) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo ODP2; ou (iii) uma combinação dos mesmos; (b) permitir a expressão de um polipeptídeo de (a) em cada célula transformada para formar uma estrutura de planta regenerável na ausência de citocinina exógena, em que nenhum calo é formado; e (c) germinar a estrutura de planta regenerável para formar a planta transgênica; em que o polipeptídeo WUS2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; ou em que o polipeptídeo WUS2 é codificado pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 3; e em que o polipeptídeo ODP2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18; ou em que o polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA é codificado pela sequência de nucleotídeos de qualquer uma dentre SEQ ID NO: 17 ou 21. Em um aspecto, o construto de expressão compreende tanto a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX quanto a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA. Em um aspecto, o construto de expressão compreende a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX. Em um aspecto, o construto de expressão compreende a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA. Em um aspecto, a expressão da sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX e/ou a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2 ocorre menos de 1 dia, menos de 2 dias, menos de 5 dias, menos de 7 dias ou menos de cerca de 14 dias após iniciação da transformação. Em um aspecto, o construto de expressão compreende adicionalmente uma sequência de nucleotídeos que codifica uma recombinase específica a sítio. Em um aspecto, a recombinase específica a sítio é selecionada dentre FLP, Cre, SSV1, lambda Int, phi C31 Int, HK022, R, Gin, Tn1721, CinH, ParA, Tn5053, Bxb1, TP907- 1 ou U153. Em um aspecto, a recombinase específica a sítio é um peptídeo de fusão desestabilizado. Em um aspecto, o peptídeo de fusão desestabilizado é TETR(L17G)~CRE ou ESR(L17G)~CRE. Em um aspecto, a sequência de nucleotídeos que codifica uma recombinase específica a sítio é operacionalmente ligada a um promotor constitutivo, um promotor induzível ou um promotor regulado em desenvolvimento. Em um aspecto, a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é operacionalmente ligada a um promotor constitutivo, um promotor induzível ou um promotor regulado em desenvolvimento. Em um aspecto, a sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA é operacionalmente ligada a um promotor constitutivo, um promotor induzível ou um promotor regulado em desenvolvimento. Em um aspecto, o promotor constitutivo operacionalmente ligado à sequência de nucleotídeos que codifica uma recombinase específica a sítio e/ou à sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX e/ou a sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA é selecionado dentre UBI, LLDAV, EVCV, DMMV, BSV (AY) PRO, CYMV PRO FL, UBIZM PRO, SI-UB3 PRO, SB- UBI PRO (ALT1), USB1ZM PRO, ZM-GOS2 PRO, ZM-H1B PRO (1,2 KB), IN2- 2, NOS, a versão -135 de 35S, ou ZM-ADF PRO (ALT2). Em um aspecto, o promotor induzível operacionalmente ligado à sequência de nucleotídeos que codifica uma recombinase específica a sítio e/ou à sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX e/ou a sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA é selecionado dentre AXIG1, DR5, XVE, GLB1, OLE, LTP2, HSP17.7, HSP26, HSP18A ou promotores ativados por tetraciclina, etametsulfurona ou clorsulfurona. Em um aspecto, o promotor regulado em desenvolvimento operacionalmente ligado à sequência de nucleotídeos que codifica uma recombinase específica a sítio e/ou à sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX e/ou à sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA é selecionado dentre PLTP, PLTP1, PLTP2, PLTP3, LGL, LEA-14A ou LEA-D34. Em um aspecto, o promotor induzível é um promotor quimicamente induzível. Em um aspecto, o promotor quimicamente induzível é XVE. Em um aspecto, o promotor quimicamente induzível é reprimido por TETR, ESR ou CR, e a não repressão ocorre mediante a adição de ligantes relacionados a tetraciclina ou sulfonilureia. Em um aspecto, o repressor é TETR e o ligante relacionado a tetraciclina é doxiciclina ou anidrotetraciclina. Em um aspecto, o repressor é ESR e o ligante de sulfonilureia é etametsulfurona, clorsulfurona, metsulfurona- metila, sulfometurona metila, clorimurona etila, nicosulfurona, primisulfurona, tribenurona, sulfosulfurona, trifloxisulfurona, foramsulfurona, iodosulfurona, prosulfurona, tifensulfurona, rimsulfurona, mesosulfurona ou halosulfurona. Em um aspecto, o promotor induzível é um promotor induzível de auxina. Em um aspecto, o promotor induzível de auxina é um AXIG1. Em um aspecto, o promotor AXIG1 compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 39. Em um aspecto, o promotor induzível compreende um elemento de resposta de auxina. Em um aspecto, o promotor induzível contém um ou mais motivos intensificadores de DR5. Em um aspecto, o promotor é um promotor constitutivo fraco modificado por repressão e não repressão. Em um aspecto, uma ou mais sequências de operador no promotor foram posicionadas perto ou sobrepondo o TATA box e/ou o sítio de início de transcrição. Em um aspecto, o promotor é selecionado dentre NOS, AXIG1, ZM-GOS2, CC-UBI1-PRO ou ZM-ADF4-PRO. Em um aspecto, o promotor induzível é o promotor DR5 que compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 40. Em um aspecto, o promotor é um promotor não reprimível. Em um aspecto, o promotor não reprimível é TETR, ESR ou CR. Em um aspecto, o promotor regulado em desenvolvimento é selecionado dentre PLTP, PLTP1, PLTP2 ou PLTP3. Em um aspecto, o PLTP, PLTP1, PLTP2 ou PLTP3 promotor é derivado de uma monocotiledônea. Em um aspecto, a monocotiledônea é cevada, milho, painço, aveias, arroz, centeio, Setaria sp., sorgo, cana de açúcar, painço amarelo, triticale, relva ou trigo. Em um aspecto, a monocotiledônea é milho, sorgo, arroz ou Setaria sp. Em um aspecto, a monocotiledônea é milho, sorgo ou arroz. Em um aspecto, a monocotiledônea é milho. Em um aspecto, o promotor PLTP, PLTP1, PLTP2 ou PLTP3 é derivado de uma dicotiledônea. Em um aspecto, a dicotiledônea é couve, couve-flor, brócolis, planta de mostarda, repolho, ervilha, cravo-da-índia, alfafa, feijão-fava, tomate, mandioca, feijão-soja, canola, alfafa, girassol, cártamo, tabaco, Arabidopsis ou algodão. Em um aspecto, o promotor PLTP, PLTP1, PLTP2 ou PLTP3 compreende qualquer uma dentre SEQ ID NO: 1 a 2 ou 55 a 61. O promotor PLTP compreende qualquer uma dentre SEQ ID NO: 1 ou 2. Em um aspecto, o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é selecionado dentre polipeptídeo WUS1, WUS2, WUS3, WOX2A, WOX4, WOX5 ou WOX9. Em um aspecto, a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é um nucleotídeo de monocotiledônea. Em um aspecto, a monocotiledônea é cevada, milho, painço, aveias, arroz, centeio, Setaria sp., sorgo, cana de açúcar, painço amarelo, triticale, relva ou trigo. Em um aspecto, a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é um nucleotídeo de dicotiledônea. Em um aspecto, a dicotiledônea é couve, couve-flor, brócolis, planta de mostarda, repolho, ervilha, cravo-da-índia, alfafa, feijão-fava, tomate, mandioca, feijão-soja, canola, alfafa, girassol, cártamo, tabaco, Arabidopsis ou algodão. Em um aspecto, a sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo homeobox WUS/WOX codifica uma sequência de aminoácidos que compreende qualquer uma dentre SEQ ID NOs:4, 6, 8, 10, 12, 14 ou 16. Em um aspecto, a sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo homeobox WUS/WOX compreende qualquer uma dentre SEQ ID NOs:3, 5, 7, 9, 11, 13 ou 15. Em um aspecto, o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é um polipeptídeo WUS1. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS1 é um polipeptídeo WUS1 de milho, sorgo, arroz ou Setaria sp. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS1 é um polipeptídeo WUS1 de milho ou arroz. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS1 é um polipeptídeo WUS1 de milho. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS1 compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS1 é codificado por uma sequência de nucleotídeos que compreende SEQ ID NO: 3. Em um aspecto, o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é um polipeptídeo WUS2. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS2 é um polipeptídeo WUS2 de milho, sorgo, arroz ou Setaria sp. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS2 é um polipeptídeo WUS2 de milho ou arroz. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS2 é um polipeptídeo WUS2 de milho. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS2 compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:6. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS2 é codificado por uma sequência de nucleotídeos que compreende SEQ ID NO: 5. Em um aspecto, o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é um polipeptídeo WUS3. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS3 é um polipeptídeo WUS3 de milho, sorgo, arroz ou Setaria. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS3 é um polipeptídeo WUS3 de milho ou arroz. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS3 é um polipeptídeo WUS3 de milho. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS3 compreende a sequência de aminos de SEQ ID NO:8. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS3 é codificado por uma sequência de nucleotídeos que compreende SEQ ID NO:7. Em um aspecto, o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é um polipeptídeo WOX5. Em um aspecto, o polipeptídeo WOX5 é um polipeptídeo WOX5A. Em um aspecto, o polipeptídeo WOX5 é um polipeptídeo WOX5 de milho, sorgo, arroz ou Setaria. Em um aspecto, o polipeptídeo WOX5 é um polipeptídeo WOX5 de milho ou arroz. Em um aspecto, o polipeptídeo WOX5 é um polipeptídeo WOX5 de milho. Em um aspecto, o polipeptídeo WOX5 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14. Em um aspecto, o polipeptídeo WOX5 é codificado por uma sequência de nucleotídeos que compreende SEQ ID NO: 13. Em um aspecto, o polipeptídeo que compreende os dois domínios de ligação de AP2-DNA é um polipeptídeo ODP2, BBM2, BMN2 ou BMN3. Em um aspecto, o polipeptídeo que compreende os dois domínios de ligação de AP2- DNA é um polipeptídeo de monocotiledônea. Em um aspecto, a monocotiledônea é cevada, milho, painço, aveias, arroz, centeio, Setaria sp., sorgo, cana de açúcar, painço amarelo, triticale, relva ou trigo. Em um aspecto, a monocotiledônea é milho, sorgo, arroz ou Setaria sp. Em um aspecto, a monocotiledônea é milho ou arroz. Em um aspecto, a monocotiledônea é milho. Em um aspecto, o polipeptídeo que compreende os dois domínios de ligação de AP2-DNA é um polipeptídeo de dicotiledônea. Em um aspecto, a dicotiledônea é couve, couve-flor, brócolis, planta de mostarda, repolho, ervilha, cravo-da-índia, alfafa, feijão-fava, tomate, mandioca, feijão-soja, canola, alfafa, girassol, cártamo, tabaco, Arabidopsis ou algodão. Em um aspecto, o polipeptídeo que compreende os dois domínios de ligação de AP2-DNA compreende uma sequência de aminoácidos de qualquer uma dentre SEQ ID NO: 18, 20, 63, 65 ou 67. Em um aspecto, o polipeptídeo que compreende os dois domínios de ligação de AP2- DNA é codificado por uma sequência de nucleotídeos que compreende qualquer uma dentre SEQ ID NO: 17, 19, 21, 62, 64, 66 ou 68. Em um aspecto, o polipeptídeo que compreende os dois domínios de ligação de AP2-DNA é um polipeptídeo ODP2. Em um aspecto, o polipeptídeo ODP2 é um polipeptídeo de monocotiledônea. Em um aspecto, a monocotiledônea é cevada, milho, painço, aveias, arroz, centeio, Setaria sp., sorgo, cana de açúcar, painço amarelo, triticale, relva ou trigo. Em um aspecto, a monocotiledônea é milho, arroz ou Setaria sp. Em um aspecto, a monocotiledônea é milho ou arroz. Em um aspecto, o ODP2 é um polipeptídeo de dicotiledônea. Em um aspecto, a dicotiledônea é couve, couve-flor, brócolis, planta de mostarda, repolho, ervilha, cravo-da-índia, alfafa, feijão-fava, tomate, mandioca, feijão-soja, canola, alfafa, girassol, cártamo, tabaco, Arabidopsis ou algodão. Em um aspecto, o polipeptídeo ODP2 compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma dentre SEQ ID NO: 18, 63, 65 ou 67. Em um aspecto, o polipeptídeo ODP2 é codificado por uma sequência de nucleotídeos que compreende a sequência de qualquer uma dentre SEQ ID NO: 17, 21, 62, 64, 66, ou 68. Em um aspecto, o polipeptídeo que compreende os dois domínios de ligação de AP2-DNA é um polipeptídeo de BBM2. Em um aspecto, o polipeptídeo BBM2 é um polipeptídeo de monocotiledônea. Em um aspecto, a monocotiledônea é cevada, milho, painço, aveias, arroz, centeio, Setaria sp., sorgo, cana de açúcar, painço amarelo, triticale, relva ou trigo. Em um aspecto, a monocotiledônea é milho, cana de açúcar, arroz ou Setaria sp. Em um aspecto, a monocotiledônea é milho ou arroz. Em um aspecto, a monocotiledônea é milho. Em um aspecto, o polipeptídeo de BBM2 é um polipeptídeo de dicotiledônea. Em um aspecto, a dicotiledônea é couve, couve-flor, brócolis, planta de mostarda, repolho, ervilha, cravo-da-índia, alfafa, feijão-fava, tomate, mandioca, feijão-soja, canola, alfafa, girassol, cártamo, tabaco, Arabidopsis ou algodão. Em um aspecto, o polipeptídeo BBM2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20. Em um aspecto, o polipeptídeo BBM2 é codificado por uma sequência de nucleotídeos que compreende a sequência de SEQ ID NO: 19. Em um aspecto, a estrutura de planta regenerável é formada dentre cerca de 0 a cerca de 7 dias de transformação da célula ou dentro de cerca de 0 a cerca de 14 dias de transformação da célula e a planta transgênica é formada em cerca de 14 dias de transformação da célula a cerca de 60 dias de transformação da célula. Em um aspecto, o método é realizado na ausência de meio de enraizamento. Em um aspecto, o método é realizado na presença de meio de enraizamento. Em um aspecto, o explante é um embrião imaturo. Em um aspecto, o embrião imaturo é um embrião imaturo de 1 a 5 mm. Em um aspecto, o embrião imaturo é um embrião imaturo de 3,5 a 5 mm. Em um aspecto, a citocinina exógena é usada durante a germinação após cerca de 7 dias de transformação da célula ou após cerca de 14 dias de transformação da célula. Em um aspecto, a expressão de um polipeptídeo de (a) é transiente. Em um aspecto, a germinação é realizada na presença de citocinina exógena.
[0011] Em vários aspectos, a presente revelação fornece mais métodos para produzir uma planta transgênica que compreende: (a) transformar uma célula de um explante com um construto de expressão que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo homeobox WUS/WOX; (b) permitir a expressão do polipeptídeo de (a) em cada célula transformada para formar uma estrutura de planta regenerável na ausência de citocinina exógena, em que nenhum calo é formado; e (c) germinar a estrutura de planta regenerável para formar a planta transgênica. Em um aspecto, a expressão da sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX ocorre menos de 1 dia, menos de 2 dias, menos de 5 dias, menos de 7 dias ou menos de cerca de 14 dias após iniciação da transformação. Em um aspecto, o construto de expressão compreende adicionalmente uma sequência de nucleotídeos que codifica uma recombinase específica a sítio. Em um aspecto, a recombinase específica a sítio é selecionada dentre FLP, Cre, SSV1, lambda Int, phi C31 Int, HK022, R, Gin, Tn1721, CinH, ParA, Tn5053, Bxb1, TP907- 1 ou U153. Em um aspecto, a recombinase específica a sítio é um peptídeo de fusão desestabilizado. Em um aspecto, o peptídeo de fusão desestabilizado é TETR(L17G)~CRE ou ESR(L17G)~CRE. Em um aspecto, a sequência de nucleotídeos que codifica uma recombinase específica a sítio é operacionalmente ligada a um promotor constitutivo, um promotor induzível ou um promotor regulado em desenvolvimento. Em um aspecto, a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é operacionalmente ligada a um promotor constitutivo, um promotor induzível ou um promotor regulado em desenvolvimento. Em um aspecto, o promotor constitutivo operacionalmente ligado à sequência de nucleotídeos que codifica uma recombinase específica a sítio e/ou à sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é selecionado dentre UBI, LLDAV, EVCV, DMMV, BSV (AY) PRO, CYMV PRO FL, UBIZM PRO, SI-UB3 PRO, SB-UBI PRO (ALT1), USB1ZM PRO, ZM-GOS2 PRO, ZM-H1B PRO (1,2 KB), IN2-2, NOS, a versão -135 de 35S, ou ZM-ADF PRO (ALT2). Em um aspecto, o promotor induzível operacionalmente ligado à sequência de nucleotídeos que codifica uma recombinase específica a sítio e/ou à sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é selecionado dentre AXIG1, DR5, XVE, GLB1, OLE, LTP2, HSP17.7, HSP26, HSP18A ou promotores ativados por tetraciclina, etametsulfurona ou clorsulfurona. Em um aspecto, o promotor regulado em desenvolvimento operacionalmente ligado à sequência de nucleotídeos que codifica uma recombinase específica a sítio e/ou à sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é selecionado dentre PLTP, PLTP1, PLTP2, PLTP3, LGL, LEA- 14A ou LEA-D34. Em um aspecto, o promotor induzível é um promotor quimicamente induzível. Em um aspecto, o promotor quimicamente induzível é XVE. Em um aspecto, o promotor quimicamente induzível é reprimido por TETR, ESR ou CR, e a não repressão ocorre mediante a adição de ligantes relacionados a tetraciclina ou sulfonilureia. Em um aspecto, o repressor é TETR e o ligante relacionado a tetraciclina é doxiciclina ou anidrotetraciclina. Em um aspecto, o repressor é ESR e o ligante de sulfonilureia é etametsulfurona, clorsulfurona, metsulfurona-metila, sulfometurona metila, clorimurona etila, nicosulfurona, primisulfurona, tribenurona, sulfosulfurona, trifloxisulfurona, foramsulfurona, iodosulfurona, prosulfurona, tifensulfurona, rimsulfurona, mesosulfurona ou halosulfurona. Em um aspecto, o promotor induzível é um promotor induzível de auxina. Em um aspecto, o promotor induzível de auxina é um AXIG1. Em um aspecto, o promotor AXIG1 compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 39. Em um aspecto, o promotor induzível compreende um elemento de resposta de auxina. Em um aspecto, o promotor induzível contém um ou mais motivos intensificadores de DR5. Em um aspecto, o promotor é um promotor constitutivo fraco modificado por repressão e não repressão. Em um aspecto, uma ou mais sequências de operador no promotor foram posicionadas perto ou sobrepondo o TATA box e/ou o sítio de início de transcrição. Em um aspecto, o promotor é selecionado dentre NOS, AXIG1, ZM-GOS2, CC-UBI1-PRO ou ZM-ADF4-PRO. Em um aspecto, o promotor induzível é o promotor DR5 que compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 40. Em um aspecto, o promotor é um promotor não reprimível. Em um aspecto, o promotor não reprimível é TETR, ESR ou CR. Em um aspecto, o promotor regulado em desenvolvimento é selecionado dentre PLTP, PLTP1, PLTP2 ou PLTP3. Em um aspecto, o PLTP, PLTP1, PLTP2 ou PLTP3 promotor é derivado de uma monocotiledônea. Em um aspecto, a monocotiledônea é cevada, milho, painço, aveias, arroz, centeio, Setaria sp., sorgo, cana de açúcar, painço amarelo, triticale, relva ou trigo. Em um aspecto, a monocotiledônea é milho, sorgo, arroz ou Setaria sp. Em um aspecto, a monocotiledônea é milho, sorgo ou arroz. Em um aspecto, a monocotiledônea é milho. Em um aspecto, o promotor PLTP, PLTP1, PLTP2 ou PLTP3 é derivado de uma dicotiledônea. Em um aspecto, a dicotiledônea é couve, couve-flor, brócolis, planta de mostarda, repolho, ervilha, cravo-da-índia, alfafa, feijão-fava, tomate, mandioca, feijão-soja, canola, alfafa, girassol, cártamo, tabaco, Arabidopsis ou algodão. Em um aspecto, o promotor PLTP, PLTP1, PLTP2 ou PLTP3 compreende qualquer uma dentre SEQ ID NO: 1 a 2 ou 55 a 61. O promotor PLTP compreende qualquer uma dentre SEQ ID NO: 1 ou 2. Em um aspecto, o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é selecionado dentre polipeptídeo WUS1, WUS2, WUS3, WOX2A, WOX4, WOX5 ou WOX9. Em um aspecto, a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é um nucleotídeo de monocotiledônea. Em um aspecto, a monocotiledônea é cevada, milho, painço, aveias, arroz, centeio, Setaria sp., sorgo, cana de açúcar, painço amarelo, triticale, relva ou trigo. Em um aspecto, a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é um nucleotídeo de dicotiledônea. Em um aspecto, a dicotiledônea é couve, couve-flor, brócolis, planta de mostarda, repolho, ervilha, cravo-da-índia, alfafa, feijão-fava, tomate, mandioca, feijão-soja, canola, alfafa, girassol, cártamo, tabaco, Arabidopsis ou algodão. Em um aspecto, a sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo homeobox WUS/WOX codifica uma sequência de aminoácidos que compreende qualquer uma dentre SEQ ID NOs:4, 6, 8, 10, 12, 14 ou 16. Em um aspecto, a sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo homeobox WUS/WOX compreende qualquer uma dentre SEQ ID NOs:3, 5, 7, 9, 11, 13 ou 15. Em um aspecto, o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é um polipeptídeo WUS1. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS1 é um polipeptídeo WUS1 de milho, sorgo, arroz ou Setaria sp. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS1 é um polipeptídeo WUS1 de milho ou arroz. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS1 é um polipeptídeo WUS1 de milho. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS1 compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS1 é codificado por uma sequência de nucleotídeos que compreende SEQ ID NO: 3. Em um aspecto, o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é um polipeptídeo WUS2. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS2 é um polipeptídeo WUS2 de milho, sorgo, arroz ou Setaria sp. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS2 é um polipeptídeo WUS2 de milho ou arroz. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS2 é um polipeptídeo WUS2 de milho. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS2 compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:6. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS2 é codificado por uma sequência de nucleotídeos que compreende SEQ ID NO: 5. Em um aspecto, o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é um polipeptídeo WUS3. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS3 é um polipeptídeo WUS3 de milho, sorgo, arroz ou Setaria. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS3 é um polipeptídeo WUS3 de milho ou arroz. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS3 é um polipeptídeo WUS3 de milho. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS3 compreende a sequência de aminos de SEQ ID NO:8. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS3 é codificado por uma sequência de nucleotídeos que compreende SEQ ID NO:7. Em um aspecto, o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é um polipeptídeo WOX5. Em um aspecto, o polipeptídeo WOX5 é um polipeptídeo WOX5A. Em um aspecto, o polipeptídeo WOX5 é um polipeptídeo WOX5 de milho, sorgo, arroz ou Setaria. Em um aspecto, o polipeptídeo WOX5 é um polipeptídeo WOX5 de milho ou arroz. Em um aspecto, o polipeptídeo WOX5 é um polipeptídeo WOX5 de milho. Em um aspecto, o polipeptídeo WOX5 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14. Em um aspecto, o polipeptídeo WOX5 é codificado por uma sequência de nucleotídeos que compreende SEQ ID NO: 13. Em um aspecto, a estrutura de planta regenerável é formada dentre cerca de 0 a cerca de 7 dias de transformação da célula ou dentro de cerca de 0 a cerca de 14 dias de transformação da célula e a planta transgênica é formada em cerca de 14 dias de transformação da célula a cerca de 60 dias de transformação da célula. Em um aspecto, o método é realizado na ausência de meio de enraizamento. Em um aspecto, o método é realizado na presença de meio de enraizamento. Em um aspecto, o explante é um embrião imaturo. Em um aspecto, o embrião imaturo é um embrião imaturo de 1 a 5 mm. Em um aspecto, o embrião imaturo é um embrião imaturo de 3,5 a 5 mm. Em um aspecto, a citocinina exógena é usada durante a germinação após cerca de 7 dias de transformação da célula ou após cerca de 14 dias de transformação da célula. Em um aspecto, a expressão de um polipeptídeo de (a) é transiente. Em um aspecto, a germinação é realizada na presença de citocinina exógena.
[0012] Em vários aspectos, a presente revelação fornece mais métodos para produzir uma planta transgênica que compreende: (a) transformar uma célula de um explante com um construto de expressão que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação AP2-DNA; (b) permitir a expressão do polipeptídeo de (a) em cada célula transformada para formar uma estrutura de planta regenerável na ausência de citocinina exógena, em que nenhum calo é formado; e (c) germinar a estrutura de planta regenerável para formar a planta transgênica. Em um aspecto, a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2 ocorre menos de 1 dia, menos de 2 dias, menos de 5 dias, menos de 7 dias, ou menos de cerca de 14 dias após iniciação da transformação. Em um aspecto, o construto de expressão compreende adicionalmente uma sequência de nucleotídeos que codifica uma recombinase específica a sítio. Em um aspecto, a recombinase específica a sítio é selecionada dentre FLP, Cre, SSV1, lambda Int, phi C31 Int, HK022, R, Gin, Tn1721, CinH, ParA, Tn5053, Bxb1, TP907-1 ou U153. Em um aspecto, a recombinase específica a sítio é um peptídeo de fusão desestabilizado. Em um aspecto, o peptídeo de fusão desestabilizado é TETR(L17G)~CRE ou ESR(L17G)~CRE. Em um aspecto, a sequência de nucleotídeos que codifica uma recombinase específica a sítio é operacionalmente ligada a um promotor constitutivo, um promotor induzível ou um promotor regulado em desenvolvimento. Em um aspecto, a sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA é operacionalmente ligada a um promotor constitutivo, um promotor induzível ou um promotor regulado em desenvolvimento. Em um aspecto, o promotor constitutivo operacionalmente ligado à sequência de nucleotídeos que codifica uma recombinase específica a sítio e/ou à sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA é selecionado dentre UBI, LLDAV, EVCV, DMMV, BSV (AY) PRO, CYMV PRO FL, UBIZM PRO, SI-UB3 PRO, SB- UBI PRO (ALT1), USB1ZM PRO, ZM-GOS2 PRO, ZM-H1B PRO (1,2 KB), IN2- 2, NOS, a versão -135 de 35S, ou ZM-ADF PRO (ALT2). Em um aspecto, o promotor induzível operacionalmente ligado à sequência de nucleotídeos que codifica uma recombinase específica a sítio e/ou à sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA é selecionado dentre AXIG1, DR5, XVE, GLB1, OLE, LTP2, HSP17.7, HSP26, HSP18A ou promotores ativados por tetraciclina, etametsulfurona ou clorsulfurona. Em um aspecto, o promotor regulado em desenvolvimento operacionalmente ligado à sequência de nucleotídeos que codifica uma recombinase específica a sítio e/ou à sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA é selecionado dentre PLTP, PLTP1, PLTP2, PLTP3, LGL, LEA- 14A ou LEA-D34. Em um aspecto, o promotor induzível é um promotor quimicamente induzível. Em um aspecto, o promotor quimicamente induzível é XVE. Em um aspecto, o promotor quimicamente induzível é reprimido por TETR, ESR ou CR, e a não repressão ocorre mediante a adição de ligantes relacionados a tetraciclina ou sulfonilureia. Em um aspecto, o repressor é TETR e o ligante relacionado a tetraciclina é doxiciclina ou anidrotetraciclina. Em um aspecto, o repressor é ESR e o ligante de sulfonilureia é etametsulfurona, clorsulfurona, metsulfurona-metila, sulfometurona metila, clorimurona etila, nicosulfurona, primisulfurona, tribenurona, sulfosulfurona, trifloxisulfurona, foramsulfurona, iodosulfurona, prosulfurona, tifensulfurona, rimsulfurona, mesosulfurona ou halosulfurona. Em um aspecto, o promotor induzível é um promotor induzível de auxina. Em um aspecto, o promotor induzível de auxina é um AXIG1. Em um aspecto, o promotor AXIG1 compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 39. Em um aspecto, o promotor induzível compreende um elemento de resposta de auxina. Em um aspecto, o promotor induzível contém um ou mais motivos intensificadores de DR5. Em um aspecto, o promotor é um promotor constitutivo fraco modificado por repressão e não repressão. Em um aspecto, uma ou mais sequências de operador no promotor foram posicionadas perto ou sobrepondo o TATA box e/ou o sítio de início de transcrição. Em um aspecto, o promotor é selecionado dentre NOS, AXIG1, ZM-GOS2, CC-UBI1-PRO ou ZM-ADF4-PRO. Em um aspecto, o promotor induzível é o promotor DR5 que compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 40. Em um aspecto, o promotor é um promotor não reprimível. Em um aspecto, o promotor não reprimível é TETR, ESR ou CR. Em um aspecto, o promotor regulado em desenvolvimento é selecionado dentre PLTP, PLTP1, PLTP2 ou PLTP3. Em um aspecto, o PLTP, PLTP1, PLTP2 ou PLTP3 promotor é derivado de uma monocotiledônea. Em um aspecto, a monocotiledônea é cevada, milho, painço, aveias, arroz, centeio, Setaria sp., sorgo, cana de açúcar, painço amarelo, triticale, relva ou trigo. Em um aspecto, a monocotiledônea é milho, sorgo, arroz ou Setaria sp. Em um aspecto, a monocotiledônea é milho, sorgo ou arroz. Em um aspecto, a monocotiledônea é milho. Em um aspecto, o promotor PLTP, PLTP1, PLTP2 ou PLTP3 é derivado de uma dicotiledônea. Em um aspecto, a dicotiledônea é couve, couve-flor, brócolis, planta de mostarda, repolho, ervilha, cravo-da-índia, alfafa, feijão-fava, tomate, mandioca, feijão-soja, canola, alfafa, girassol, cártamo, tabaco, Arabidopsis ou algodão. Em um aspecto, o promotor PLTP, PLTP1, PLTP2 ou PLTP3 compreende qualquer uma dentre SEQ ID NO: 1 a 2 ou 55 a 61. O promotor PLTP compreende qualquer uma dentre SEQ ID NO: 1 ou 2. Em um aspecto, o polipeptídeo que compreende os dois domínios de ligação de AP2-DNA é um polipeptídeo ODP2, BBM2, BMN2 ou BMN3. Em um aspecto, o polipeptídeo que compreende os dois domínios de ligação de AP2-DNA é um polipeptídeo de monocotiledônea. Em um aspecto, a monocotiledônea é cevada, milho, painço, aveias, arroz, centeio, Setaria sp., sorgo, cana de açúcar, painço amarelo, triticale, relva ou trigo. Em um aspecto, a monocotiledônea é milho, sorgo, arroz ou Setaria sp. Em um aspecto, a monocotiledônea é milho ou arroz. Em um aspecto, a monocotiledônea é milho. Em um aspecto, o polipeptídeo que compreende os dois domínios de ligação de AP2-DNA é um polipeptídeo de dicotiledônea. Em um aspecto, a dicotiledônea é couve, couve-flor, brócolis, planta de mostarda, repolho, ervilha, cravo-da-índia, alfafa, feijão-fava, tomate, mandioca, feijão-soja, canola, alfafa, girassol, cártamo, tabaco, Arabidopsis ou algodão. Em um aspecto, o polipeptídeo que compreende os dois domínios de ligação de AP2-DNA compreende uma sequência de aminoácidos de qualquer uma dentre SEQ ID NO: 18, 20, 63, 65 ou 67. Em um aspecto, o polipeptídeo que compreende os dois domínios de ligação de AP2- DNA é codificado por uma sequência de nucleotídeos que compreende qualquer uma dentre SEQ ID NO: 17, 19, 21, 62, 64, 66 ou 68. Em um aspecto, o polipeptídeo que compreende os dois domínios de ligação de AP2-DNA é um polipeptídeo ODP2. Em um aspecto, o polipeptídeo ODP2 é um polipeptídeo de monocotiledônea. Em um aspecto, a monocotiledônea é cevada, milho, painço, aveias, arroz, centeio, Setaria sp., sorgo, cana de açúcar, painço amarelo, triticale, relva ou trigo. Em um aspecto, a monocotiledônea é milho, arroz ou Setaria sp. Em um aspecto, a monocotiledônea é milho ou arroz. Em um aspecto, o ODP2 é um polipeptídeo de dicotiledônea. Em um aspecto, a dicotiledônea é couve, couve-flor, brócolis, planta de mostarda, repolho, ervilha, cravo-da-índia, alfafa, feijão-fava, tomate, mandioca, feijão-soja, canola, alfafa, girassol, cártamo, tabaco, Arabidopsis ou algodão. Em um aspecto, o polipeptídeo ODP2 compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma dentre SEQ ID NO: 18, 63, 65 ou 67. Em um aspecto, o polipeptídeo ODP2 é codificado por uma sequência de nucleotídeos que compreende a sequência de qualquer uma dentre SEQ ID NO: 17, 21, 62, 64, 66, ou 68. Em um aspecto, o polipeptídeo que compreende os dois domínios de ligação de AP2-DNA é um polipeptídeo de BBM2. Em um aspecto, o polipeptídeo BBM2 é um polipeptídeo de monocotiledônea. Em um aspecto, a monocotiledônea é cevada, milho, painço, aveias, arroz, centeio, Setaria sp., sorgo, cana de açúcar, painço amarelo, triticale, relva ou trigo. Em um aspecto, a monocotiledônea é milho, cana de açúcar, arroz ou Setaria sp. Em um aspecto, a monocotiledônea é milho ou arroz. Em um aspecto, a monocotiledônea é milho. Em um aspecto, o polipeptídeo de BBM2 é um polipeptídeo de dicotiledônea. Em um aspecto, a dicotiledônea é couve, couve-flor, brócolis, planta de mostarda, repolho, ervilha, cravo-da-índia, alfafa, feijão-fava, tomate, mandioca, feijão-soja, canola, alfafa, girassol, cártamo, tabaco, Arabidopsis ou algodão. Em um aspecto, o polipeptídeo BBM2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20. Em um aspecto, o polipeptídeo BBM2 é codificado por uma sequência de nucleotídeos que compreende a sequência de SEQ ID NO: 19. Em um aspecto, a estrutura de planta regenerável é formada dentre cerca de 0 a cerca de 7 dias de transformação da célula ou dentro de cerca de 0 a cerca de 14 dias de transformação da célula e a planta transgênica é formada em cerca de 14 dias de transformação da célula a cerca de 60 dias de transformação da célula. Em um aspecto, o método é realizado na ausência de meio de enraizamento. Em um aspecto, o método é realizado na presença de meio de enraizamento. Em um aspecto, o explante é um embrião imaturo. Em um aspecto, o embrião imaturo é um embrião imaturo de 1 a 5 mm. Em um aspecto, o embrião imaturo é um embrião imaturo de 3,5 a 5 mm. Em um aspecto, a citocinina exógena é usada durante a germinação após cerca de 7 dias de transformação da célula ou após cerca de 14 dias de transformação da célula. Em um aspecto, a expressão de um polipeptídeo de (a) é transiente. Em um aspecto, a germinação é realizada na presença de citocinina exógena.
[0013] Em vários aspectos, a presente revelação fornece mais métodos para produzir uma planta transgênica que compreende: (a) transformar uma célula de um explante com um construto de expressão que compreende (i) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo homeobox WUS/WOX; e (ii) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação AP2-DNA; (b) permitir a expressão do polipeptídeo de (a) em cada célula transformada para formar uma estrutura de planta regenerável na ausência de citocinina exógena, em que nenhum calo é formado; e (c) germinar a estrutura de planta regenerável para formar a planta transgênica. Em um aspecto, o construto de expressão compreende tanto a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX quanto a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA. Em um aspecto, o construto de expressão compreende a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX. Em um aspecto, o construto de expressão compreende a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA. Em um aspecto, a expressão da sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX e/ou a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2 ocorre menos de 1 dia, menos de 2 dias, menos de 5 dias, menos de 7 dias ou menos de cerca de 14 dias após iniciação da transformação. Em um aspecto, o construto de expressão compreende adicionalmente uma sequência de nucleotídeos que codifica uma recombinase específica a sítio. Em um aspecto, a recombinase específica a sítio é selecionada dentre FLP, Cre, SSV1, lambda Int, phi C31 Int, HK022, R, Gin, Tn1721, CinH, ParA, Tn5053, Bxb1, TP907-1 ou U153. Em um aspecto, a recombinase específica a sítio é um peptídeo de fusão desestabilizado. Em um aspecto, o peptídeo de fusão desestabilizado é TETR(L17G)~CRE ou ESR(L17G)~CRE. Em um aspecto, a sequência de nucleotídeos que codifica uma recombinase específica a sítio é operacionalmente ligada a um promotor constitutivo, um promotor induzível ou um promotor regulado em desenvolvimento. Em um aspecto, a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é operacionalmente ligada a um promotor constitutivo, um promotor induzível ou um promotor regulado em desenvolvimento. Em um aspecto, a sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA é operacionalmente ligada a um promotor constitutivo, um promotor induzível ou um promotor regulado em desenvolvimento. Em um aspecto, o promotor constitutivo operacionalmente ligado à sequência de nucleotídeos que codifica uma recombinase específica a sítio e/ou à sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX e/ou a sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA é selecionado dentre UBI, LLDAV, EVCV, DMMV, BSV (AY) PRO, CYMV PRO FL, UBIZM PRO, SI-UB3 PRO, SB- UBI PRO (ALT1), USB1ZM PRO, ZM-GOS2 PRO, ZM-H1B PRO (1,2 KB), IN2- 2, NOS, a versão -135 de 35S, ou ZM-ADF PRO (ALT2). Em um aspecto, o promotor induzível operacionalmente ligado à sequência de nucleotídeos que codifica uma recombinase específica a sítio e/ou à sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX e/ou a sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA é selecionado dentre AXIG1, DR5, XVE, GLB1, OLE, LTP2, HSP17.7, HSP26, HSP18A ou promotores ativados por tetraciclina, etametsulfurona ou clorsulfurona. Em um aspecto, o promotor regulado em desenvolvimento operacionalmente ligado à sequência de nucleotídeos que codifica uma recombinase específica a sítio e/ou à sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX e/ou à sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA é selecionado dentre PLTP, PLTP1, PLTP2, PLTP3, LGL, LEA-14A ou LEA-D34. Em um aspecto, o promotor induzível é um promotor quimicamente induzível. Em um aspecto, o promotor quimicamente induzível é XVE. Em um aspecto, o promotor quimicamente induzível é reprimido por TETR, ESR ou CR, e a não repressão ocorre mediante a adição de ligantes relacionados a tetraciclina ou sulfonilureia. Em um aspecto, o repressor é TETR e o ligante relacionado a tetraciclina é doxiciclina ou anidrotetraciclina. Em um aspecto, o repressor é ESR e o ligante de sulfonilureia é etametsulfurona, clorsulfurona, metsulfurona- metila, sulfometurona metila, clorimurona etila, nicosulfurona, primisulfurona, tribenurona, sulfosulfurona, trifloxisulfurona, foramsulfurona, iodosulfurona, prosulfurona, tifensulfurona, rimsulfurona, mesosulfurona ou halosulfurona. Em um aspecto, o promotor induzível é um promotor induzível de auxina. Em um aspecto, o promotor induzível de auxina é um AXIG1. Em um aspecto, o promotor AXIG1 compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 39. Em um aspecto, o promotor induzível compreende um elemento de resposta de auxina. Em um aspecto, o promotor induzível contém um ou mais motivos intensificadores de DR5. Em um aspecto, o promotor é um promotor constitutivo fraco modificado por repressão e não repressão. Em um aspecto, uma ou mais sequências de operador no promotor foram posicionadas perto ou sobrepondo o TATA box e/ou o sítio de início de transcrição. Em um aspecto, o promotor é selecionado dentre NOS, AXIG1, ZM-GOS2, CC-UBI1-PRO ou ZM-ADF4-PRO. Em um aspecto, o promotor induzível é o promotor DR5 que compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 40. Em um aspecto, o promotor é um promotor não reprimível. Em um aspecto, o promotor não reprimível é TETR, ESR ou CR. Em um aspecto, o promotor regulado em desenvolvimento é selecionado dentre PLTP, PLTP1, PLTP2 ou PLTP3. Em um aspecto, o PLTP, PLTP1, PLTP2 ou PLTP3 promotor é derivado de uma monocotiledônea. Em um aspecto, a monocotiledônea é cevada, milho, painço, aveias, arroz, centeio, Setaria sp., sorgo, cana de açúcar, painço amarelo, triticale, relva ou trigo. Em um aspecto, a monocotiledônea é milho, sorgo, arroz ou Setaria sp. Em um aspecto, a monocotiledônea é milho, sorgo ou arroz. Em um aspecto, a monocotiledônea é milho. Em um aspecto, o promotor PLTP, PLTP1, PLTP2 ou PLTP3 é derivado de uma dicotiledônea. Em um aspecto, a dicotiledônea é couve, couve-flor, brócolis, planta de mostarda, repolho, ervilha, cravo-da-índia, alfafa, feijão-fava, tomate, mandioca, feijão-soja, canola, alfafa, girassol, cártamo, tabaco, Arabidopsis ou algodão. Em um aspecto, o promotor PLTP, PLTP1, PLTP2 ou PLTP3 compreende qualquer uma dentre SEQ ID NO: 1 a 2 ou 55 a 61. O promotor PLTP compreende qualquer uma dentre SEQ ID NO: 1 ou 2. Em um aspecto, o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é selecionado dentre polipeptídeo WUS1, WUS2, WUS3, WOX2A, WOX4, WOX5 ou WOX9. Em um aspecto, a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é um nucleotídeo de monocotiledônea. Em um aspecto, a monocotiledônea é cevada, milho, painço, aveias, arroz, centeio, Setaria sp., sorgo, cana de açúcar, painço amarelo, triticale, relva ou trigo. Em um aspecto, a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é um nucleotídeo de dicotiledônea. Em um aspecto, a dicotiledônea é couve, couve-flor, brócolis, planta de mostarda, repolho, ervilha, cravo-da-índia, alfafa, feijão-fava, tomate, mandioca, feijão-soja, canola, alfafa, girassol, cártamo, tabaco, Arabidopsis ou algodão. Em um aspecto, a sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo homeobox WUS/WOX codifica uma sequência de aminoácidos que compreende qualquer uma dentre SEQ ID NOs:4, 6, 8, 10, 12, 14 ou 16. Em um aspecto, a sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo homeobox WUS/WOX compreende qualquer uma dentre SEQ ID NOs:3, 5, 7, 9, 11, 13 ou 15. Em um aspecto, o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é um polipeptídeo WUS1. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS1 é um polipeptídeo WUS1 de milho, sorgo, arroz ou Setaria sp. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS1 é um polipeptídeo WUS1 de milho ou arroz. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS1 é um polipeptídeo WUS1 de milho. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS1 compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS1 é codificado por uma sequência de nucleotídeos que compreende SEQ ID NO: 3. Em um aspecto, o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é um polipeptídeo WUS2. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS2 é um polipeptídeo WUS2 de milho, sorgo, arroz ou Setaria sp. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS2 é um polipeptídeo WUS2 de milho ou arroz. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS2 é um polipeptídeo WUS2 de milho. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS2 compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:6. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS2 é codificado por uma sequência de nucleotídeos que compreende SEQ ID NO: 5. Em um aspecto, o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é um polipeptídeo WUS3. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS3 é um polipeptídeo WUS3 de milho, sorgo, arroz ou Setaria. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS3 é um polipeptídeo WUS3 de milho ou arroz. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS3 é um polipeptídeo WUS3 de milho. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS3 compreende a sequência de aminos de SEQ ID NO:8. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS3 é codificado por uma sequência de nucleotídeos que compreende SEQ ID NO:7. Em um aspecto, o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é um polipeptídeo WOX5. Em um aspecto, o polipeptídeo WOX5 é um polipeptídeo WOX5A. Em um aspecto, o polipeptídeo WOX5 é um polipeptídeo WOX5 de milho, sorgo, arroz ou Setaria. Em um aspecto, o polipeptídeo WOX5 é um polipeptídeo WOX5 de milho ou arroz. Em um aspecto, o polipeptídeo WOX5 é um polipeptídeo WOX5 de milho. Em um aspecto, o polipeptídeo WOX5 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14. Em um aspecto, o polipeptídeo WOX5 é codificado por uma sequência de nucleotídeos que compreende SEQ ID NO: 13. Em um aspecto, o polipeptídeo que compreende os dois domínios de ligação de AP2-DNA é um polipeptídeo ODP2, BBM2, BMN2 ou BMN3. Em um aspecto, o polipeptídeo que compreende os dois domínios de ligação de AP2- DNA é um polipeptídeo de monocotiledônea. Em um aspecto, a monocotiledônea é cevada, milho, painço, aveias, arroz, centeio, Setaria sp., sorgo, cana de açúcar, painço amarelo, triticale, relva ou trigo. Em um aspecto, a monocotiledônea é milho, sorgo, arroz ou Setaria sp. Em um aspecto, a monocotiledônea é milho ou arroz. Em um aspecto, a monocotiledônea é milho. Em um aspecto, o polipeptídeo que compreende os dois domínios de ligação de AP2-DNA é um polipeptídeo de dicotiledônea. Em um aspecto, a dicotiledônea é couve, couve-flor, brócolis, planta de mostarda, repolho, ervilha, cravo-da-índia, alfafa, feijão-fava, tomate, mandioca, feijão-soja, canola, alfafa, girassol, cártamo, tabaco, Arabidopsis ou algodão. Em um aspecto, o polipeptídeo que compreende os dois domínios de ligação de AP2-DNA compreende uma sequência de aminoácidos de qualquer uma dentre SEQ ID NO: 18, 20, 63, 65 ou 67. Em um aspecto, o polipeptídeo que compreende os dois domínios de ligação de AP2- DNA é codificado por uma sequência de nucleotídeos que compreende qualquer uma dentre SEQ ID NO: 17, 19, 21, 62, 64, 66 ou 68. Em um aspecto, o polipeptídeo que compreende os dois domínios de ligação de AP2-DNA é um polipeptídeo ODP2. Em um aspecto, o polipeptídeo ODP2 é um polipeptídeo de monocotiledônea. Em um aspecto, a monocotiledônea é cevada, milho, painço, aveias, arroz, centeio, Setaria sp., sorgo, cana de açúcar, painço amarelo, triticale, relva ou trigo. Em um aspecto, a monocotiledônea é milho, arroz ou Setaria sp. Em um aspecto, a monocotiledônea é milho ou arroz. Em um aspecto, o ODP2 é um polipeptídeo de dicotiledônea. Em um aspecto, a dicotiledônea é couve, couve-flor, brócolis, planta de mostarda, repolho, ervilha, cravo-da-índia, alfafa, feijão-fava, tomate, mandioca, feijão-soja, canola, alfafa, girassol, cártamo, tabaco, Arabidopsis ou algodão. Em um aspecto, o polipeptídeo ODP2 compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma dentre SEQ ID NO: 18, 63, 65 ou 67. Em um aspecto, o polipeptídeo ODP2 é codificado por uma sequência de nucleotídeos que compreende a sequência de qualquer uma dentre SEQ ID NO: 17, 21, 62, 64, 66, ou 68. Em um aspecto, o polipeptídeo que compreende os dois domínios de ligação de AP2-DNA é um polipeptídeo de BBM2. Em um aspecto, o polipeptídeo BBM2 é um polipeptídeo de monocotiledônea. Em um aspecto, a monocotiledônea é cevada, milho, painço, aveias, arroz, centeio, Setaria sp., sorgo, cana de açúcar, painço amarelo, triticale, relva ou trigo. Em um aspecto, a monocotiledônea é milho, cana de açúcar, arroz ou Setaria sp. Em um aspecto, a monocotiledônea é milho ou arroz. Em um aspecto, a monocotiledônea é milho. Em um aspecto, o polipeptídeo de BBM2 é um polipeptídeo de dicotiledônea. Em um aspecto, a dicotiledônea é couve, couve-flor, brócolis, planta de mostarda, repolho, ervilha, cravo-da-índia, alfafa, feijão-fava, tomate, mandioca, feijão-soja, canola, alfafa, girassol, cártamo, tabaco, Arabidopsis ou algodão. Em um aspecto, o polipeptídeo BBM2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20. Em um aspecto, o polipeptídeo BBM2 é codificado por uma sequência de nucleotídeos que compreende a sequência de SEQ ID NO: 19. Em um aspecto, a estrutura de planta regenerável é formada dentre cerca de 0 a cerca de 7 dias de transformação da célula ou dentro de cerca de 0 a cerca de 14 dias de transformação da célula e a planta transgênica é formada em cerca de 14 dias de transformação da célula a cerca de 60 dias de transformação da célula. Em um aspecto, o método é realizado na ausência de meio de enraizamento. Em um aspecto, o método é realizado na presença de meio de enraizamento. Em um aspecto, o explante é um embrião imaturo. Em um aspecto, o embrião imaturo é um embrião imaturo de 1 a 5 mm. Em um aspecto, o embrião imaturo é um embrião imaturo de 3,5 a 5 mm. Em um aspecto, a citocinina exógena é usada durante a germinação após cerca de 7 dias de transformação da célula ou após cerca de 14 dias de transformação da célula. Em um aspecto, a expressão de um polipeptídeo de (a) é transiente. Em um aspecto, a germinação é realizada na presença de citocinina exógena.
[0014] Em vários aspectos, a presente revelação fornece mais métodos para produzir uma planta transgênica que compreende: (a) transformar uma célula de um explante com um construto de expressão que compreende (i) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo homeobox WUS/WOX; ou (ii) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação AP2-DNA; ou (iii) uma combinação de (i) e (ii); (b) permitir a expressão do polipeptídeo de (a) em cada célula transformada para formar uma estrutura de planta regenerável na ausência de citocinina exógena, em que nenhum calo é formado; e (c) germinar a estrutura de planta regenerável de (b) para formar a planta transgênica em cerca de 14 dias a cerca de 60 dias. Em um aspecto, o construto de expressão compreende tanto a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX quanto a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA. Em um aspecto, o construto de expressão compreende a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX. Em um aspecto, o construto de expressão compreende a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA. Em um aspecto, a expressão da sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX e/ou a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2 ocorre menos de 1 dia, menos de 2 dias, menos de 5 dias, menos de 7 dias ou menos de cerca de 14 dias após iniciação da transformação. Em um aspecto, o construto de expressão compreende adicionalmente uma sequência de nucleotídeos que codifica uma recombinase específica a sítio. Em um aspecto, a recombinase específica a sítio é selecionada dentre FLP, Cre, SSV1, lambda Int, phi C31 Int, HK022, R, Gin, Tn1721, CinH, ParA, Tn5053, Bxb1, TP907-1 ou U153. Em um aspecto, a recombinase específica a sítio é um peptídeo de fusão desestabilizado. Em um aspecto, o peptídeo de fusão desestabilizado é TETR(L17G)~CRE ou ESR(L17G)~CRE. Em um aspecto, a sequência de nucleotídeos que codifica uma recombinase específica a sítio é operacionalmente ligada a um promotor constitutivo, um promotor induzível ou um promotor regulado em desenvolvimento. Em um aspecto, a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é operacionalmente ligada a um promotor constitutivo, um promotor induzível ou um promotor regulado em desenvolvimento. Em um aspecto, a sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA é operacionalmente ligada a um promotor constitutivo, um promotor induzível ou um promotor regulado em desenvolvimento. Em um aspecto, o promotor constitutivo operacionalmente ligado à sequência de nucleotídeos que codifica uma recombinase específica a sítio e/ou à sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX e/ou a sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA é selecionado dentre UBI, LLDAV, EVCV, DMMV, BSV (AY) PRO, CYMV PRO FL, UBIZM PRO, SI- UB3 PRO, SB-UBI PRO (ALT1), USB1ZM PRO, ZM-GOS2 PRO, ZM-H1B PRO (1,2 KB), IN2-2, NOS, a versão -135 de 35S, ou ZM-ADF PRO (ALT2). Em um aspecto, o promotor induzível operacionalmente ligado à sequência de nucleotídeos que codifica uma recombinase específica a sítio e/ou à sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX e/ou a sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA é selecionado dentre AXIG1, DR5, XVE, GLB1, OLE, LTP2, HSP17.7, HSP26, HSP18A ou promotores ativados por tetraciclina, etametsulfurona ou clorsulfurona. Em um aspecto, o promotor regulado em desenvolvimento operacionalmente ligado à sequência de nucleotídeos que codifica uma recombinase específica a sítio e/ou à sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX e/ou à sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA é selecionado dentre PLTP, PLTP1, PLTP2, PLTP3, LGL, LEA-14A ou LEA-D34. Em um aspecto, o promotor induzível é um promotor quimicamente induzível. Em um aspecto, o promotor quimicamente induzível é XVE. Em um aspecto, o promotor quimicamente induzível é reprimido por TETR, ESR ou CR, e a não repressão ocorre mediante a adição de ligantes relacionados a tetraciclina ou sulfonilureia. Em um aspecto, o repressor é TETR e o ligante relacionado a tetraciclina é doxiciclina ou anidrotetraciclina. Em um aspecto, o repressor é ESR e o ligante de sulfonilureia é etametsulfurona, clorsulfurona, metsulfurona- metila, sulfometurona metila, clorimurona etila, nicosulfurona, primisulfurona, tribenurona, sulfosulfurona, trifloxisulfurona, foramsulfurona, iodosulfurona, prosulfurona, tifensulfurona, rimsulfurona, mesosulfurona ou halosulfurona. Em um aspecto, o promotor induzível é um promotor induzível de auxina. Em um aspecto, o promotor induzível de auxina é um AXIG1. Em um aspecto, o promotor AXIG1 compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 39. Em um aspecto, o promotor induzível compreende um elemento de resposta de auxina. Em um aspecto, o promotor induzível contém um ou mais motivos intensificadores de DR5. Em um aspecto, o promotor é um promotor constitutivo fraco modificado por repressão e não repressão. Em um aspecto, uma ou mais sequências de operador no promotor foram posicionadas perto ou sobrepondo o TATA box e/ou o sítio de início de transcrição. Em um aspecto, o promotor é selecionado dentre NOS, AXIG1, ZM-GOS2, CC-UBI1-PRO ou ZM-ADF4-PRO. Em um aspecto, o promotor induzível é o promotor DR5 que compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 40. Em um aspecto, o promotor é um promotor não reprimível. Em um aspecto, o promotor não reprimível é TETR, ESR ou CR. Em um aspecto, o promotor regulado em desenvolvimento é selecionado dentre PLTP, PLTP1, PLTP2 ou PLTP3. Em um aspecto, o PLTP, PLTP1, PLTP2 ou PLTP3 promotor é derivado de uma monocotiledônea. Em um aspecto, a monocotiledônea é cevada, milho, painço, aveias, arroz, centeio, Setaria sp., sorgo, cana de açúcar, painço amarelo, triticale, relva ou trigo. Em um aspecto, a monocotiledônea é milho, sorgo, arroz ou Setaria sp. Em um aspecto, a monocotiledônea é milho, sorgo ou arroz. Em um aspecto, a monocotiledônea é milho. Em um aspecto, o promotor PLTP, PLTP1, PLTP2 ou PLTP3 é derivado de uma dicotiledônea. Em um aspecto, a dicotiledônea é couve, couve-flor, brócolis, planta de mostarda, repolho, ervilha, cravo-da-índia, alfafa, feijão-fava, tomate, mandioca, feijão-soja, canola, alfafa, girassol, cártamo, tabaco, Arabidopsis ou algodão. Em um aspecto, o promotor PLTP, PLTP1, PLTP2 ou PLTP3 compreende qualquer uma dentre SEQ ID NO: 1 a 2 ou 55 a 61. O promotor PLTP compreende qualquer uma dentre SEQ ID NO: 1 ou 2. Em um aspecto, o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é selecionado dentre polipeptídeo WUS1, WUS2, WUS3, WOX2A, WOX4, WOX5 ou WOX9. Em um aspecto, a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é um nucleotídeo de monocotiledônea. Em um aspecto, a monocotiledônea é cevada, milho, painço, aveias, arroz, centeio, Setaria sp., sorgo, cana de açúcar, painço amarelo, triticale, relva ou trigo. Em um aspecto, a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é um nucleotídeo de dicotiledônea. Em um aspecto, a dicotiledônea é couve, couve-flor, brócolis, planta de mostarda, repolho, ervilha, cravo-da-índia, alfafa, feijão-fava, tomate, mandioca, feijão-soja, canola, alfafa, girassol, cártamo, tabaco, Arabidopsis ou algodão. Em um aspecto, a sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo homeobox WUS/WOX codifica uma sequência de aminoácidos que compreende qualquer uma dentre SEQ ID NOs:4, 6, 8, 10, 12, 14 ou 16. Em um aspecto, a sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo homeobox WUS/WOX compreende qualquer uma dentre SEQ ID NOs:3, 5, 7, 9, 11, 13 ou 15. Em um aspecto, o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é um polipeptídeo WUS1. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS1 é um polipeptídeo WUS1 de milho, sorgo, arroz ou Setaria sp. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS1 é um polipeptídeo WUS1 de milho ou arroz. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS1 é um polipeptídeo WUS1 de milho. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS1 compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS1 é codificado por uma sequência de nucleotídeos que compreende SEQ ID NO: 3. Em um aspecto, o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é um polipeptídeo WUS2. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS2 é um polipeptídeo WUS2 de milho, sorgo, arroz ou Setaria sp. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS2 é um polipeptídeo WUS2 de milho ou arroz. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS2 é um polipeptídeo WUS2 de milho. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS2 compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:6. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS2 é codificado por uma sequência de nucleotídeos que compreende SEQ ID NO: 5. Em um aspecto, o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é um polipeptídeo WUS3. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS3 é um polipeptídeo WUS3 de milho, sorgo, arroz ou Setaria. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS3 é um polipeptídeo WUS3 de milho ou arroz. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS3 é um polipeptídeo WUS3 de milho. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS3 compreende a sequência de aminos de SEQ ID NO:8. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS3 é codificado por uma sequência de nucleotídeos que compreende SEQ ID NO:7. Em um aspecto, o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é um polipeptídeo WOX5. Em um aspecto, o polipeptídeo WOX5 é um polipeptídeo WOX5A. Em um aspecto, o polipeptídeo WOX5 é um polipeptídeo WOX5 de milho, sorgo, arroz ou Setaria. Em um aspecto, o polipeptídeo WOX5 é um polipeptídeo WOX5 de milho ou arroz. Em um aspecto, o polipeptídeo WOX5 é um polipeptídeo WOX5 de milho. Em um aspecto, o polipeptídeo WOX5 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14. Em um aspecto, o polipeptídeo WOX5 é codificado por uma sequência de nucleotídeos que compreende SEQ ID NO: 13. Em um aspecto, o polipeptídeo que compreende os dois domínios de ligação de AP2-DNA é um polipeptídeo ODP2, BBM2, BMN2 ou BMN3. Em um aspecto, o polipeptídeo que compreende os dois domínios de ligação de AP2- DNA é um polipeptídeo de monocotiledônea. Em um aspecto, a monocotiledônea é cevada, milho, painço, aveias, arroz, centeio, Setaria sp., sorgo, cana de açúcar, painço amarelo, triticale, relva ou trigo. Em um aspecto, a monocotiledônea é milho, sorgo, arroz ou Setaria sp. Em um aspecto, a monocotiledônea é milho ou arroz. Em um aspecto, a monocotiledônea é milho. Em um aspecto, o polipeptídeo que compreende os dois domínios de ligação de AP2-DNA é um polipeptídeo de dicotiledônea. Em um aspecto, a dicotiledônea é couve, couve-flor, brócolis, planta de mostarda, repolho, ervilha, cravo-da-índia, alfafa, feijão-fava, tomate, mandioca, feijão-soja, canola, alfafa, girassol, cártamo, tabaco, Arabidopsis ou algodão. Em um aspecto, o polipeptídeo que compreende os dois domínios de ligação de AP2-DNA compreende uma sequência de aminoácidos de qualquer uma dentre SEQ ID NO: 18, 20, 63, 65 ou 67. Em um aspecto, o polipeptídeo que compreende os dois domínios de ligação de AP2- DNA é codificado por uma sequência de nucleotídeos que compreende qualquer uma dentre SEQ ID NO: 17, 19, 21, 62, 64, 66 ou 68. Em um aspecto, o polipeptídeo que compreende os dois domínios de ligação de AP2-DNA é um polipeptídeo ODP2. Em um aspecto, o polipeptídeo ODP2 é um polipeptídeo de monocotiledônea. Em um aspecto, a monocotiledônea é cevada, milho, painço, aveias, arroz, centeio, Setaria sp., sorgo, cana de açúcar, painço amarelo, triticale, relva ou trigo. Em um aspecto, a monocotiledônea é milho, arroz ou Setaria sp. Em um aspecto, a monocotiledônea é milho ou arroz. Em um aspecto, o ODP2 é um polipeptídeo de dicotiledônea. Em um aspecto, a dicotiledônea é couve, couve-flor, brócolis, planta de mostarda, repolho, ervilha, cravo-da-índia, alfafa, feijão-fava, tomate, mandioca, feijão-soja, canola, alfafa, girassol, cártamo, tabaco, Arabidopsis ou algodão. Em um aspecto, o polipeptídeo ODP2 compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma dentre SEQ ID NO: 18, 63, 65 ou 67. Em um aspecto, o polipeptídeo ODP2 é codificado por uma sequência de nucleotídeos que compreende a sequência de qualquer uma dentre SEQ ID NO: 17, 21, 62, 64, 66, ou 68. Em um aspecto, o polipeptídeo que compreende os dois domínios de ligação de AP2-DNA é um polipeptídeo de BBM2. Em um aspecto, o polipeptídeo BBM2 é um polipeptídeo de monocotiledônea. Em um aspecto, a monocotiledônea é cevada, milho, painço, aveias, arroz, centeio, Setaria sp., sorgo, cana de açúcar, painço amarelo, triticale, relva ou trigo. Em um aspecto, a monocotiledônea é milho, cana de açúcar, arroz ou Setaria sp. Em um aspecto, a monocotiledônea é milho ou arroz. Em um aspecto, a monocotiledônea é milho. Em um aspecto, o polipeptídeo de BBM2 é um polipeptídeo de dicotiledônea. Em um aspecto, a dicotiledônea é couve, couve-flor, brócolis, planta de mostarda, repolho, ervilha, cravo-da-índia, alfafa, feijão-fava, tomate, mandioca, feijão-soja, canola, alfafa, girassol, cártamo, tabaco, Arabidopsis ou algodão. Em um aspecto, o polipeptídeo BBM2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20. Em um aspecto, o polipeptídeo BBM2 é codificado por uma sequência de nucleotídeos que compreende a sequência de SEQ ID NO: 19. Em um aspecto, a estrutura de planta regenerável é formada dentro de cerca de 0 a cerca de 7 dias de transformação da célula ou dentro de cerca de 0 a cerca de 14 dias de transformação da célula. Em um aspecto, o método é realizado na ausência de meio de enraizamento. Em um aspecto, o método é realizado na presença de meio de enraizamento. Em um aspecto, o explante é um embrião imaturo. Em um aspecto, o embrião imaturo é um embrião imaturo de 1 a 5 mm. Em um aspecto, o embrião imaturo é um embrião imaturo de 3,5 a 5 mm. Em um aspecto, a citocinina exógena é usada durante a germinação após cerca de 7 dias de transformação da célula ou após cerca de 14 dias de transformação da célula. Em um aspecto, a expressão de um polipeptídeo de (a) é transiente. Em um aspecto, a germinação é realizada na presença de citocinina exógena.
[0015] Em vários aspectos, a presente revelação fornece mais métodos para produzir uma planta transgênica que compreende: (a) transformar uma célula de um explante com um construto de expressão que compreende (i) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo homeobox WUS/WOX; ou (ii) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA; ou (iii) uma combinação de (i) e (ii); (b) permitir a expressão do polipeptídeo de (a) em cada célula transformada para formar uma estrutura de planta regenerável na ausência de citocinina exógena, em que nenhum calo é formado, e em que a estrutura de planta regenerável é formada dentro de cerca de 0 a 7 dias ou cerca de 0 a 14 dias de transformação da célula; e (c) germinar a estrutura de planta regenerável de (b) para formar a planta transgênica em cerca de 14 dias a cerca de 60 dias de transformação da célula. Em um aspecto, o construto de expressão compreende tanto a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX quanto a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA. Em um aspecto, o construto de expressão compreende a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX. Em um aspecto, o construto de expressão compreende a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA. Em um aspecto, a expressão da sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX e/ou a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2 ocorre menos de 1 dia, menos de 2 dias, menos de 5 dias, menos de 7 dias ou menos de cerca de 14 dias após iniciação da transformação. Em um aspecto, o construto de expressão compreende adicionalmente uma sequência de nucleotídeos que codifica uma recombinase específica a sítio. Em um aspecto, a recombinase específica a sítio é selecionada dentre FLP, Cre, SSV1, lambda Int, phi C31 Int, HK022, R, Gin, Tn1721, CinH, ParA, Tn5053, Bxb1, TP907- 1 ou U153. Em um aspecto, a recombinase específica a sítio é um peptídeo de fusão desestabilizado. Em um aspecto, o peptídeo de fusão desestabilizado é TETR(L17G)~CRE ou ESR(L17G)~CRE. Em um aspecto, a sequência de nucleotídeos que codifica uma recombinase específica a sítio é operacionalmente ligada a um promotor constitutivo, um promotor induzível ou um promotor regulado em desenvolvimento. Em um aspecto, a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é operacionalmente ligada a um promotor constitutivo, um promotor induzível ou um promotor regulado em desenvolvimento. Em um aspecto, a sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA é operacionalmente ligada a um promotor constitutivo, um promotor induzível ou um promotor regulado em desenvolvimento. Em um aspecto, o promotor constitutivo operacionalmente ligado à sequência de nucleotídeos que codifica uma recombinase específica a sítio e/ou à sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX e/ou a sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA é selecionado dentre UBI, LLDAV, EVCV, DMMV, BSV (AY) PRO, CYMV PRO FL, UBIZM PRO, SI-UB3 PRO, SB- UBI PRO (ALT1), USB1ZM PRO, ZM-GOS2 PRO, ZM-H1B PRO (1,2 KB), IN2- 2, NOS, a versão -135 de 35S, ou ZM-ADF PRO (ALT2). Em um aspecto, o promotor induzível operacionalmente ligado à sequência de nucleotídeos que codifica uma recombinase específica a sítio e/ou à sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX e/ou a sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA é selecionado dentre AXIG1, DR5, XVE, GLB1, OLE, LTP2, HSP17.7, HSP26, HSP18A ou promotores ativados por tetraciclina, etametsulfurona ou clorsulfurona. Em um aspecto, o promotor regulado em desenvolvimento operacionalmente ligado à sequência de nucleotídeos que codifica uma recombinase específica a sítio e/ou à sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX e/ou à sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA é selecionado dentre PLTP, PLTP1, PLTP2, PLTP3, LGL, LEA-14A ou LEA-D34. Em um aspecto, o promotor induzível é um promotor quimicamente induzível. Em um aspecto, o promotor quimicamente induzível é XVE. Em um aspecto, o promotor quimicamente induzível é reprimido por TETR, ESR ou CR, e a não repressão ocorre mediante a adição de ligantes relacionados a tetraciclina ou sulfonilureia. Em um aspecto, o repressor é TETR e o ligante relacionado a tetraciclina é doxiciclina ou anidrotetraciclina. Em um aspecto, o repressor é ESR e o ligante de sulfonilureia é etametsulfurona, clorsulfurona, metsulfurona- metila, sulfometurona metila, clorimurona etila, nicosulfurona, primisulfurona, tribenurona, sulfosulfurona, trifloxisulfurona, foramsulfurona, iodosulfurona, prosulfurona, tifensulfurona, rimsulfurona, mesosulfurona ou halosulfurona. Em um aspecto, o promotor induzível é um promotor induzível de auxina. Em um aspecto, o promotor induzível de auxina é um AXIG1. Em um aspecto, o promotor AXIG1 compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 39. Em um aspecto, o promotor induzível compreende um elemento de resposta de auxina. Em um aspecto, o promotor induzível contém um ou mais motivos intensificadores de DR5. Em um aspecto, o promotor é um promotor constitutivo fraco modificado por repressão e não repressão. Em um aspecto, uma ou mais sequências de operador no promotor foram posicionadas perto ou sobrepondo o TATA box e/ou o sítio de início de transcrição. Em um aspecto, o promotor é selecionado dentre NOS, AXIG1, ZM-GOS2, CC-UBI1-PRO ou ZM-ADF4-PRO. Em um aspecto, o promotor induzível é o promotor DR5 que compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 40. Em um aspecto, o promotor é um promotor não reprimível. Em um aspecto, o promotor não reprimível é TETR, ESR ou CR. Em um aspecto, o promotor regulado em desenvolvimento é selecionado dentre PLTP, PLTP1, PLTP2 ou PLTP3. Em um aspecto, o PLTP, PLTP1, PLTP2 ou PLTP3 promotor é derivado de uma monocotiledônea. Em um aspecto, a monocotiledônea é cevada, milho, painço, aveias, arroz, centeio, Setaria sp., sorgo, cana de açúcar, painço amarelo, triticale, relva ou trigo. Em um aspecto, a monocotiledônea é milho, sorgo, arroz ou Setaria sp. Em um aspecto, a monocotiledônea é milho, sorgo ou arroz. Em um aspecto, a monocotiledônea é milho. Em um aspecto, o promotor PLTP, PLTP1, PLTP2 ou PLTP3 é derivado de uma dicotiledônea. Em um aspecto, a dicotiledônea é couve, couve-flor, brócolis, planta de mostarda, repolho, ervilha, cravo-da-índia, alfafa, feijão-fava, tomate, mandioca, feijão-soja, canola, alfafa, girassol, cártamo, tabaco, Arabidopsis ou algodão. Em um aspecto, o promotor PLTP, PLTP1, PLTP2 ou PLTP3 compreende qualquer uma dentre SEQ ID NO: 1 a 2 ou 55 a 61. O promotor PLTP compreende qualquer uma dentre SEQ ID NO: 1 ou 2. Em um aspecto, o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é selecionado dentre polipeptídeo WUS1, WUS2, WUS3, WOX2A, WOX4, WOX5 ou WOX9. Em um aspecto, a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é um nucleotídeo de monocotiledônea. Em um aspecto, a monocotiledônea é cevada, milho, painço, aveias, arroz, centeio, Setaria sp., sorgo, cana de açúcar, painço amarelo, triticale, relva ou trigo. Em um aspecto, a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é um nucleotídeo de dicotiledônea. Em um aspecto, a dicotiledônea é couve, couve-flor, brócolis, planta de mostarda, repolho, ervilha, cravo-da-índia, alfafa, feijão-fava, tomate, mandioca, feijão-soja, canola, alfafa, girassol, cártamo, tabaco, Arabidopsis ou algodão. Em um aspecto, a sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo homeobox WUS/WOX codifica uma sequência de aminoácidos que compreende qualquer uma dentre SEQ ID NOs:4, 6, 8, 10, 12, 14 ou 16. Em um aspecto, a sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo homeobox WUS/WOX compreende qualquer uma dentre SEQ ID NOs:3, 5, 7, 9, 11, 13 ou 15. Em um aspecto, o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é um polipeptídeo WUS1. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS1 é um polipeptídeo WUS1 de milho, sorgo, arroz ou Setaria sp. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS1 é um polipeptídeo WUS1 de milho ou arroz. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS1 é um polipeptídeo WUS1 de milho. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS1 compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS1 é codificado por uma sequência de nucleotídeos que compreende SEQ ID NO: 3. Em um aspecto, o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é um polipeptídeo WUS2. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS2 é um polipeptídeo WUS2 de milho, sorgo, arroz ou Setaria sp. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS2 é um polipeptídeo WUS2 de milho ou arroz. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS2 é um polipeptídeo WUS2 de milho. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS2 compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:6. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS2 é codificado por uma sequência de nucleotídeos que compreende SEQ ID NO: 5. Em um aspecto, o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é um polipeptídeo WUS3. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS3 é um polipeptídeo WUS3 de milho, sorgo, arroz ou Setaria. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS3 é um polipeptídeo WUS3 de milho ou arroz. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS3 é um polipeptídeo WUS3 de milho. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS3 compreende a sequência de aminos de SEQ ID NO:8. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS3 é codificado por uma sequência de nucleotídeos que compreende SEQ ID NO:7. Em um aspecto, o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é um polipeptídeo WOX5. Em um aspecto, o polipeptídeo WOX5 é um polipeptídeo WOX5A. Em um aspecto, o polipeptídeo WOX5 é um polipeptídeo WOX5 de milho, sorgo, arroz ou Setaria. Em um aspecto, o polipeptídeo WOX5 é um polipeptídeo WOX5 de milho ou arroz. Em um aspecto, o polipeptídeo WOX5 é um polipeptídeo WOX5 de milho. Em um aspecto, o polipeptídeo WOX5 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14. Em um aspecto, o polipeptídeo WOX5 é codificado por uma sequência de nucleotídeos que compreende SEQ ID NO: 13. Em um aspecto, o polipeptídeo que compreende os dois domínios de ligação de AP2-DNA é um polipeptídeo ODP2, BBM2, BMN2 ou BMN3. Em um aspecto, o polipeptídeo que compreende os dois domínios de ligação de AP2- DNA é um polipeptídeo de monocotiledônea. Em um aspecto, a monocotiledônea é cevada, milho, painço, aveias, arroz, centeio, Setaria sp., sorgo, cana de açúcar, painço amarelo, triticale, relva ou trigo. Em um aspecto, a monocotiledônea é milho, sorgo, arroz ou Setaria sp. Em um aspecto, a monocotiledônea é milho ou arroz. Em um aspecto, a monocotiledônea é milho. Em um aspecto, o polipeptídeo que compreende os dois domínios de ligação de AP2-DNA é um polipeptídeo de dicotiledônea. Em um aspecto, a dicotiledônea é couve, couve-flor, brócolis, planta de mostarda, repolho, ervilha, cravo-da-índia, alfafa, feijão-fava, tomate, mandioca, feijão-soja, canola, alfafa, girassol, cártamo, tabaco, Arabidopsis ou algodão. Em um aspecto, o polipeptídeo que compreende os dois domínios de ligação de AP2-DNA compreende uma sequência de aminoácidos de qualquer uma dentre SEQ ID NO: 18, 20, 63, 65 ou 67. Em um aspecto, o polipeptídeo que compreende os dois domínios de ligação de AP2- DNA é codificado por uma sequência de nucleotídeos que compreende qualquer uma dentre SEQ ID NO: 17, 19, 21, 62, 64, 66 ou 68. Em um aspecto, o polipeptídeo que compreende os dois domínios de ligação de AP2-DNA é um polipeptídeo ODP2. Em um aspecto, o polipeptídeo ODP2 é um polipeptídeo de monocotiledônea. Em um aspecto, a monocotiledônea é cevada, milho, painço, aveias, arroz, centeio, Setaria sp., sorgo, cana de açúcar, painço amarelo, triticale, relva ou trigo. Em um aspecto, a monocotiledônea é milho, arroz ou Setaria sp. Em um aspecto, a monocotiledônea é milho ou arroz. Em um aspecto, o ODP2 é um polipeptídeo de dicotiledônea. Em um aspecto, a dicotiledônea é couve, couve-flor, brócolis, planta de mostarda, repolho, ervilha, cravo-da-índia, alfafa, feijão-fava, tomate, mandioca, feijão-soja, canola, alfafa, girassol, cártamo, tabaco, Arabidopsis ou algodão. Em um aspecto, o polipeptídeo ODP2 compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma dentre SEQ ID NO: 18, 63, 65 ou 67. Em um aspecto, o polipeptídeo ODP2 é codificado por uma sequência de nucleotídeos que compreende a sequência de qualquer uma dentre SEQ ID NO: 17, 21, 62, 64, 66, ou 68. Em um aspecto, o polipeptídeo que compreende os dois domínios de ligação de AP2-DNA é um polipeptídeo de BBM2. Em um aspecto, o polipeptídeo BBM2 é um polipeptídeo de monocotiledônea. Em um aspecto, a monocotiledônea é cevada, milho, painço, aveias, arroz, centeio, Setaria sp., sorgo, cana de açúcar, painço amarelo, triticale, relva ou trigo. Em um aspecto, a monocotiledônea é milho, cana de açúcar, arroz ou Setaria sp. Em um aspecto, a monocotiledônea é milho ou arroz. Em um aspecto, a monocotiledônea é milho. Em um aspecto, o polipeptídeo de BBM2 é um polipeptídeo de dicotiledônea. Em um aspecto, a dicotiledônea é couve, couve-flor, brócolis, planta de mostarda, repolho, ervilha, cravo-da-índia, alfafa, feijão-fava, tomate, mandioca, feijão-soja, canola, alfafa, girassol, cártamo, tabaco, Arabidopsis ou algodão. Em um aspecto, o polipeptídeo BBM2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20. Em um aspecto, o polipeptídeo BBM2 é codificado por uma sequência de nucleotídeos que compreende a sequência de SEQ ID NO: 19. Em um aspecto, o método é realizado na ausência de meio de enraizamento. Em um aspecto, o método é realizado na presença de meio de enraizamento. Em um aspecto, o explante é um embrião imaturo. Em um aspecto, o embrião imaturo é um embrião imaturo de 1 a 5 mm. Em um aspecto, o embrião imaturo é um embrião imaturo de 3,5 a 5 mm. Em um aspecto, a citocinina exógena é usada durante a germinação após cerca de 7 dias de transformação da célula ou após cerca de 14 dias de transformação da célula. Em um aspecto, a expressão de um polipeptídeo de (a) é transiente. Em um aspecto, a germinação é realizada na presença de citocinina exógena.
[0016] A presente revelação compreende métodos e composições para a transformação de plantas rápida e eficaz, por exemplo, plantas monocotiledôneas como milho. Em vários aspectos, a presente revelação fornece mais métodos para produzir uma planta transgênica que compreende: (a) transformar uma célula de um explante com um construto de expressão que compreende (i) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo homeobox WUS/WOX; ou (ii) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação AP2-DNA; ou (iii) uma combinação de (i) e (ii); e (b) permitir a expressão do polipeptídeo de (a) em cada célula transformada para formar uma estrutura de planta regenerável na ausência de citocinina exógena, em que nenhum calo é formado; e (c) germinar a estrutura de planta regenerável para formar a planta transgênica. Em um aspecto, a estrutura de planta regenerável é produzida dentro de cerca de 0 a cerca de 7 dias ou dentro de cerca de 0 a cerca de 14 dias de transformação da célula. Em um aspecto, a germinação compreende transferir a estrutura de planta regenerável para um meio de maturação que compreende uma citocinina exógena e forma a planta transgênica. Em um aspecto, o construto de expressão compreende adicionalmente uma sequência de nucleotídeos que codifica uma recombinase específica a sítio selecionado dentre FLP, Cre, SSV1, lambda Int, phi C31 Int, HK022, R, Gin, Tn1721, CinH, ParA, Tn5053, Bxb1, TP907-1 ou U153. Em um aspecto, a sequência de nucleotídeos que codifica uma recombinase específica a sítio é operacionalmente ligada a um promotor constitutivo, um promotor induzível ou um promotor regulado em desenvolvimento. Em um aspecto, (c) a germinação é realizada na presença de citocinina exógena. Em um aspecto, a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX e/ou a sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA é operacionalmente ligada a um promotor selecionado dentre um promotor induzível, um promotor regulado em desenvolvimento ou um promotor constitutivo. Em um aspecto, o promotor constitutivo operacionalmente ligado à sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX e/ou à sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA é selecionado dentre UBI, LLDAV, EVCV, DMMV, BSV(AY) PRO, CYMV PRO FL, UBIZM PRO, SI-UB3 PRO, SB-UBI PRO (ALT1), USB1ZM PRO, ZM-GOS2 PRO, ZM-H1B PRO (1,2 KB), IN2-2, NOS, a versão -135 de 35S ou ZM-ADF PRO (ALT2); o promotor induzível operacionalmente ligado à sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX e/ou à sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA é selecionado dentre AXIG1, DR5, XVE, GLB1, OLE, LTP2, HSP17.7, HSP26, HSP18A ou promotores ativados por tetraciclina, etametsulfurona ou clorsulfurona; e o promotor regulado em desenvolvimento operacionalmente ligado à sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX e/ou à sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA é selecionado dentre PLTP, PLTP1, PLTP2, PLTP3, SDR, LGL, LEA-14A ou LEA-D34. Em um aspecto, o explante é derivado de uma monocotiledônea ou uma dicotiledônea. Em um aspecto, uma semente da planta é produzida pelo método.
[0017] Em vários aspectos, a presente revelação fornece mais métodos para produzir uma planta transgênica que compreende: (a) transformar uma célula de um explante com um construto de expressão que compreende (i) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo homeobox WUS/WOX; ou (ii) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA; ou (iii) uma combinação de (i) e (ii); e (b) permitir a expressão de um polipeptídeo de (a) em cada célula transformada para formar uma estrutura de planta regenerável na ausência de citocinina exógena, em que nenhum calo é formado; e (c) germinar a estrutura de planta regenerável para formar a planta transgênica; em que o polipeptídeo homeobox WUS/WOX compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma dentre SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14 ou 16; ou em que o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é codificado pela sequência de nucleotídeos de qualquer uma dentre SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13 ou 15; e em que o polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma dentre SEQ ID NO: 18, 20, 63, 65 ou 67; ou em que o polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA é codificado pela sequência de nucleotídeos de qualquer uma dentre SEQ ID NO: 17, 19, 21, 62, 64, 66 ou 68. Em um aspecto, a estrutura de planta regenerável é produzida dentro de cerca de 0 a cerca de 7 dias ou dentro de cerca de 0 a cerca de 14 dias de transformação da célula. Em um aspecto, a germinação compreende transferir a estrutura de planta regenerável para um meio de maturação que compreende uma citocinina exógena e forma a planta transgênica. Em um aspecto, o construto de expressão compreende adicionalmente uma sequência de nucleotídeos que codifica uma recombinase específica a sítio selecionado dentre FLP, Cre, SSV1, lambda Int, phi C31 Int, HK022, R, Gin, Tn1721, CinH, ParA, Tn5053, Bxb1, TP907-1 ou U153. Em um aspecto, a sequência de nucleotídeos que codifica uma recombinase específica a sítio é operacionalmente ligada a um promotor constitutivo, um promotor induzível ou um promotor regulado em desenvolvimento. Em um aspecto, (c) a germinação é realizada na presença de citocinina exógena. Em um aspecto, a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX e/ou a sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA é operacionalmente ligada a um promotor selecionado dentre um promotor induzível, um promotor regulado em desenvolvimento ou um promotor constitutivo. Em um aspecto, o promotor constitutivo operacionalmente ligado à sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX e/ou à sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA é selecionado dentre UBI, LLDAV, EVCV, DMMV, BSV(AY) PRO, CYMV PRO FL, UBIZM PRO, SI-UB3 PRO, SB-UBI PRO (ALT1), USB1ZM PRO, ZM-GOS2 PRO, ZM-H1B PRO (1,2 KB), IN2-2, NOS, a versão -135 de 35S ou ZM-ADF PRO (ALT2); o promotor induzível operacionalmente ligado à sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX e/ou à sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA é selecionado dentre AXIG1, DR5, XVE, GLB1, OLE, LTP2, HSP17.7, HSP26, HSP18A ou promotores ativados por tetraciclina, etametsulfurona ou clorsulfurona; e o promotor regulado em desenvolvimento operacionalmente ligado à sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX e/ou à sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA é selecionado dentre PLTP, PLTP1, PLTP2, PLTP3, SDR, LGL, LEA-14A ou LEA-D34. Em um aspecto, o explante é derivado de uma monocotiledônea ou uma dicotiledônea. Em um aspecto, uma semente da planta é produzida pelo método.
[0018] Em vários aspectos, a presente revelação fornece mais métodos para produzir uma planta transgênica que compreende: (a) transformar uma célula de um explante com um construto de expressão que compreende (i) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo homeobox WUS/WOX; ou (ii) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA; ou (iii) uma combinação de (i) e (ii); (b) permitir a expressão do polipeptídeo de (a) em cada célula transformada para formar uma estrutura de planta regenerável na ausência de citocinina exógena, em que nenhum calo é formado; e (c) germinar a estrutura de planta regenerável de (b) para cerca de 14 a cerca de 60 dias para formar uma plântula; e (d) permitir que a plântula de (c) cresça em uma planta. Em um aspecto, a estrutura de planta regenerável é produzida dentro de cerca de 0 a cerca de 7 dias ou dentro de cerca de 0 a cerca de 14 dias de transformação da célula. Em um aspecto, a germinação compreende transferir a estrutura de planta regenerável para um meio de maturação que compreende uma citocinina exógena e forma a planta transgênica. Em um aspecto, o construto de expressão compreende adicionalmente uma sequência de nucleotídeos que codifica uma recombinase específica a sítio selecionado dentre FLP, Cre, SSV1, lambda Int, phi C31 Int, HK022, R, Gin, Tn1721, CinH, ParA, Tn5053, Bxb1, TP907-1 ou U153. Em um aspecto, a sequência de nucleotídeos que codifica uma recombinase específica a sítio é operacionalmente ligada a um promotor constitutivo, um promotor induzível ou um promotor regulado em desenvolvimento. Em um aspecto, (c) a germinação é realizada na presença de citocinina exógena. Em um aspecto, a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX e/ou a sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA é operacionalmente ligada a um promotor selecionado dentre um promotor induzível, um promotor regulado em desenvolvimento ou um promotor constitutivo. Em um aspecto, o promotor constitutivo operacionalmente ligado à sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX e/ou à sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA é selecionado dentre UBI, LLDAV, EVCV, DMMV, BSV(AY) PRO, CYMV PRO FL, UBIZM PRO, SI-UB3 PRO, SB-UBI PRO (ALT1), USB1ZM PRO, ZM-GOS2 PRO, ZM-H1B PRO (1,2 KB), IN2-2, NOS, a versão -135 de 35S ou ZM-ADF PRO (ALT2); o promotor induzível operacionalmente ligado à sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX e/ou à sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA é selecionado dentre AXIG1, DR5, XVE, GLB1, OLE, LTP2, HSP17.7, HSP26, HSP18A ou promotores ativados por tetraciclina, etametsulfurona ou clorsulfurona; e o promotor regulado em desenvolvimento operacionalmente ligado à sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX e/ou à sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA é selecionado dentre PLTP, PLTP1, PLTP2, PLTP3, SDR, LGL, LEA-14A ou LEA-D34. Em um aspecto, o explante é derivado de uma monocotiledônea ou uma dicotiledônea. Em um aspecto, uma semente da planta é produzida pelo método.
[0019] Em vários aspectos, a presente revelação fornece adicionalmente métodos para produzir uma planta transgênica que compreende (a) transformar uma ou mais células de um explante com um construto de expressão que compreende (i) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo homeobox WUS/WOX; ou (ii) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA; ou (iii) uma combinação de (i) e (ii); e (b) permitir a expressão do polipeptídeo de (a) em cada célula transformada para formar uma estrutura de planta regenerável na ausência de citocinina exógena, em que nenhum calo é formado; e germinar a estrutura de planta regenerável para formar a planta transgênica. Em um aspecto, a presente revelação fornece adicionalmente métodos para produzir uma plântula obtida a partir de uma estrutura de planta regenerável preparada com o uso dos métodos revelados. Em um aspecto, a presente revelação fornece adicionalmente métodos para produzir uma planta obtida a partir da estrutura de planta regenerável. Em vários aspectos, a germinação é realizada na presença de citocinina exógena. Em um aspecto, a presente revelação fornece adicionalmente kits que compreendem (a) um construto de expressão que compreende (i) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo homeobox WUS/WOX; ou (ii) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA; ou (iii) uma combinação de (i) e (ii); e (b) instruções para obter uma estrutura regenerável de planta na ausência de citocinina exógena, em que nenhum calo é formado; e (c) instruções parar germinar a estrutura de planta regenerável para formar uma planta transgênica.
[0020] A presente revelação compreende métodos e composições para a transformação de plantas rápida e eficaz, por exemplo, plantas monocotiledôneas como milho. Em vários aspectos, a presente revelação fornece métodos para produzir uma planta transgênica, que compreende (a) transformar uma célula de um explante com um construto de expressão que compreende (i) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo homeobox WUS/WOX; ou (ii) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA; ou (iii) uma combinação de (i) e (ii); e (b) permitir a expressão do polipeptídeo de (a) em cada célula transformada para formar uma estrutura de planta regenerável na ausência de citocinina exógena, em que nenhum calo é formado; e (c) germinar a estrutura de planta regenerável para formar a planta transgênica. Em vários aspectos, a estrutura de planta regenerável é produzida dentro de cerca de 0 a 7 dias ou cerca de 0 a 14 dias de transformação da célula. Em vários aspectos, a germinação compreende transferir a estrutura de planta regenerável para um meio de maturação que compreende uma citocinina exógena e forma a planta transgênica. Em vários aspectos, a germinação é realizada na presença de citocinina exógena. Em vários aspectos, o construto de expressão compreende adicionalmente uma sequência de nucleotídeos que codifica uma recombinase específica a sítio selecionado dentre FLP, Cre, SSV1, lambda Int, phi C31 Int, HK022, R, Gin, Tn1721, CinH, ParA, Tn5053, Bxb1, TP907-1 ou U153. Em vários aspectos, a sequência de nucleotídeos que codifica uma recombinase específica a sítio é operacionalmente ligada a um promotor constitutivo, um promotor induzível ou um promotor regulado em desenvolvimento. Em vários aspectos, o promotor induzível é GLB1, OLE, LTP2, HSP17.7, HSP26, HSP18A ou XVE. Em vários aspectos, a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é operacionalmente ligada a um promotor selecionado dentre um promotor induzível, um promotor regulado em desenvolvimento ou um promotor constitutivo. Em vários aspectos, o promotor constitutivo é selecionado dentre UBI, LLDAV, EVCV, DMMV, BSV (AY) PRO, CYMV PRO FL, UBIZM PRO, SI- UB3 PRO, SB-UBI PRO (ALT1), USB1ZM PRO, ZM-GOS2 PRO, ZM-H1B PRO (1,2 KB), IN2-2, NOS, a versão -135 de 35S ou ZM-ADF PRO (ALT2); o promotor induzível é selecionado dentre GLB1, OLE, LTP2, AXIG1 DR5, HSP17.7, HSP26, HSP18A ou XVE; e o promotor regulado em desenvolvimento é selecionado dentre PLTP, PLTP1, PLTP2, PLTP3, LGL, LEA-14A ou LEA-D34. Em vários aspectos, o explante é derivado de uma monocotiledônea ou uma dicotiledônea. Em vários aspectos, fornece- se uma semente da planta produzida pelo método.
[0021] Em um aspecto adicional, a presente revelação fornece métodos para produzir uma planta transgênica que compreende (a) transformar uma célula de um explante com um construto de expressão que compreende (i) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo homeobox WUS/WOX; ou (ii) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA; ou (iii) uma combinação dos mesmos; e (b) permitir a expressão de um polipeptídeo de (a) em cada célula transformada para formar uma estrutura de planta regenerável na ausência de citocinina exógena, em que nenhum calo é formado; e (c) germinar a estrutura de planta regenerável para formar a planta transgênica; em que o polipeptídeo homeobox WUS/WOX compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma dentre SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14 ou 16; ou em que o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é codificado pela sequência de nucleotídeos de qualquer uma dentre SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13 ou 15; e em que o polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma dentre SEQ ID NO: 18, 20, 63, 65 ou 67; ou em que o polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA é codificado pela sequência de nucleotídeos de qualquer uma dentre SEQ ID NO: 17, 19, 21, 62, 64, 66 ou 68. Em vários aspectos, a estrutura de planta regenerável é produzida dentro de cerca de 0 a 7 dias ou cerca de 0 a 14 dias de transformação da célula. Em vários aspectos, a germinação compreende transferir a estrutura de planta regenerável para um meio de maturação que compreende uma citocinina exógena e forma a planta transgênica. Em vários aspectos, a germinação é realizada na presença de citocinina exógena. Em vários aspectos, o construto de expressão compreende adicionalmente uma sequência de nucleotídeos que codifica uma recombinase específica a sítio selecionado dentre FLP, Cre, SSV1, lambda Int, phi C31 Int, HK022, R, Gin, Tn1721, CinH, ParA, Tn5053, Bxb1, TP907-1 ou U153. Em vários aspectos, a sequência de nucleotídeos que codifica uma recombinase específica a sítio é operacionalmente ligada a um promotor constitutivo, um promotor induzível ou um promotor regulado em desenvolvimento. Em vários aspectos, o promotor induzível é GLB1, OLE, LTP2, HSP17.7, HSP26, HSP18A ou XVE. Em vários aspectos, a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é operacionalmente ligada a um promotor selecionado dentre um promotor induzível, um promotor regulado em desenvolvimento ou um promotor constitutivo. Em vários aspectos, o promotor constitutivo é selecionado dentre UBI, LLDAV, EVCV, DMMV, BSV (AY) PRO, CYMV PRO FL, UBIZM PRO, SI-UB3 PRO, SB-UBI PRO (ALT1), USB1ZM PRO, ZM-GOS2 PRO, ZM-H1B PRO (1,2 KB), IN2-2, NOS, a versão -135 de 35S ou ZM-ADF PRO (ALT2); o promotor induzível é selecionado dentre GLB1, OLE, LTP2, AXIG1 DR5, HSP17.7, HSP26, HSP18A ou XVE; e o promotor regulado em desenvolvimento é selecionado dentre PLTP, PLTP1, PLTP2, PLTP3, LGL, LEA-14A ou LEA-D34. Em vários aspectos, o explante é derivado de uma monocotiledônea ou uma dicotiledônea. Em vários aspectos, fornece-se uma semente da planta produzida pelo método.
[0022] Em um aspecto adicional, a presente revelação fornece métodos para produzir uma planta transgênica que compreende: (a) transformar uma célula de um explante com um construto de expressão que compreende (i) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo homeobox WUS/WOX; (ii) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA; ou (iii) uma combinação de (i) e (ii); (b) permitir a expressão do polipeptídeo de (a) em cada célula transformada para formar uma estrutura de planta regenerável na ausência de citocinina exógena, em que nenhum calo é formado; e (c) permitir que a estrutura de planta regenerável de (b) amadureça em uma plântula por cerca de 14 a cerca de 60 dias; e (d) permitir que a plântula de (c) cresça em uma planta. Em vários aspectos, a estrutura de planta regenerável é produzida dentro de cerca de 0 a 7 dias ou cerca de 0 a 14 dias de transformação da célula. Em vários aspectos, a germinação compreende transferir a estrutura de planta regenerável para um meio de maturação que compreende uma citocinina exógena e forma a planta transgênica. Em vários aspectos, a germinação é realizada na presença de citocinina exógena. Em vários aspectos, o construto de expressão compreende adicionalmente uma sequência de nucleotídeos que codifica uma recombinase específica a sítio selecionado dentre FLP, Cre, SSV1, lambda Int, phi C31 Int, HK022, R, Gin, Tn1721, CinH, ParA, Tn5053, Bxb1, TP907-1 ou U153. Em vários aspectos, a sequência de nucleotídeos que codifica uma recombinase específica a sítio é operacionalmente ligada a um promotor constitutivo, um promotor induzível ou um promotor regulado em desenvolvimento. Em vários aspectos, o promotor induzível é GLB1, OLE, LTP2, HSP17.7, HSP26, HSP18A ou XVE. Em vários aspectos, a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é operacionalmente ligada a um promotor selecionado dentre um promotor induzível, um promotor regulado em desenvolvimento e um promotor constitutivo. Em vários aspectos, o promotor constitutivo é selecionado dentre UBI, LLDAV, EVCV, DMMV, BSV (AY) PRO, CYMV PRO FL, UBIZM PRO, SI-UB3 PRO, SB-UBI PRO (ALT1), USB1ZM PRO, ZM-GOS2 PRO, ZM-H1B PRO (1,2 KB), IN2-2, NOS, a versão -135 de 35S e ZM-ADF PRO (ALT2); o promotor induzível é selecionado dentre GLB1, OLE, LTP2, AXIG1 DR5, HSP17.7, HSP26, HSP18A ou XVE; e o promotor regulado em desenvolvimento é selecionado dentre PLTP, PLTP1, PLTP2, PLTP3, LGL, LEA-14A ou LEA- D34. Em vários aspectos, o explante é derivado de uma monocotiledônea ou uma dicotiledônea. Em vários aspectos, fornece-se uma semente da planta produzida pelo método.
[0023] Em um aspecto adicional, a presente revelação fornece métodos para produzir uma planta transgênica, que compreende (a) transformar uma célula de um explante com um construto de expressão que compreende (i) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo homeobox WUS/WOX; ou (ii) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA; ou (iii) uma combinação de (i) e (ii); e (b) permitir a expressão do polipeptídeo de (a) em cada célula transformada para formar uma estrutura de planta regenerável na ausência de citocinina exógena, em que nenhum calo é formado; e (c) germinar a estrutura de planta regenerável para formar a planta transgênica. Em vários aspectos, o construto de expressão compreende tanto a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX quanto a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA. Em vários aspectos, o construto de expressão compreende a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX. Em vários aspectos, o construto de expressão compreende a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA. Em vários aspectos, a expressão da sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX e/ou a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2 ocorre menos de 1 dia, menos de 2 dias, menos de 5 dias, menos de 7 dias ou menos de cerca de 14 dias após iniciação da transformação. Em vários aspectos, a germinação é realizada na presença de citocinina exógena. Em vários aspectos, o construto de expressão compreende adicionalmente uma sequência de nucleotídeos que codifica uma recombinase específica a sítio. Em vários aspectos, a recombinase específica a sítio é FLP, Cre, SSV1, lambda Int, phi C31 Int, HK022, R, Gin, Tn1721, CinH, ParA, Tn5053, Bxb1, TP907-1 ou U153. Em vários aspectos, a recombinase específica a sítio é um peptídeo de fusão desestabilizado. Em vários aspectos, o peptídeo de fusão desestabilizado é TETR(L17G)~CRE ou ESR(L17G)~CRE. Em vários aspectos, a sequência de nucleotídeos que codifica uma recombinase específica a sítio é operacionalmente ligada a um promotor constitutivo, um promotor induzível ou um promotor regulado em desenvolvimento. Em vários aspectos, o promotor induzível é GLB1, OLE, LTP2, HSP17.7, HSP26 ou HSP18A. Em vários aspectos, o promotor induzível é um promotor quimicamente induzível. Em vários aspectos, o promotor quimicamente induzível é XVE. Em vários aspectos, o promotor quimicamente induzível é reprimido por TETR, ESR ou CR, e a não repressão ocorre mediante a adição de ligantes relacionados a tetraciclina ou sulfonilureia. Em vários aspectos, o repressor é TETR e o ligante relacionado a tetraciclina é doxiciclina ou anidrotetraciclina. Em vários aspectos, o repressor é ESR e o ligante de sulfonilureia é etametsulfurona, clorsulfurona, metsulfurona-metila, sulfometurona metila, clorimurona etila, nicosulfurona, primisulfurona, tribenurona, sulfosulfurona, trifloxisulfurona, foramsulfurona, iodosulfurona, prosulfurona, tifensulfurona, rimsulfurona, mesosulfurona ou halosulfurona. Em vários aspectos, a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é operacionalmente ligada a um promotor constitutivo. Em vários aspectos, o promotor constitutivo é UBI, LLDAV, EVCV, DMMV, BSV (AY) PRO, CYMV PRO FL, UBIZM PRO, SI- UB3 PRO, SB-UBI PRO (ALT1), USB1ZM PRO, ZM-GOS2 PRO, ZM-H1B PRO (1,2 KB), IN2-2, NOS, a versão -135 de 35S ou ZM-ADF PRO (ALT2). Em vários aspectos, a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é operacionalmente ligada a um promotor induzível ou um promotor regulado em desenvolvimento. Em vários aspectos, a sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA é operacionalmente ligada a um promotor induzível ou um promotor regulado em desenvolvimento. Em vários aspectos, o promotor regulado em desenvolvimento é um promotor PLTP. Em vários aspectos, o promotor PLTP é derivado de uma monocotiledônea. Em vários aspectos, a monocotiledônea é cevada, milho, painço, aveias, arroz, centeio, Setaria sp., sorgo, cana de açúcar, painço amarelo, triticale, relva ou trigo. Em vários aspectos, a monocotiledônea é milho, sorgo, arroz ou Setaria sp. Em vários aspectos, a monocotiledônea é milho, sorgo ou arroz. Em vários aspectos, a monocotiledônea é milho. Em vários aspectos, o promotor PLTP é derivado de uma dicotiledônea. Em vários aspectos, a dicotiledônea é couve, couve-flor, brócolis, planta de mostarda, repolho, ervilha, cravo-da-índia, alfafa, feijão-fava, tomate, mandioca, feijão-soja, canola, alfafa, girassol, cártamo, tabaco, Arabidopsis ou algodão. Em vários aspectos, o promotor PLTP compreende qualquer uma dentre SEQ ID NO: 1 a 2 ou 55 a 61. Em vários aspectos, o promotor PLTP compreende qualquer uma dentre SEQ ID NO: 1 ou 2. Em vários aspectos, o promotor induzível é um promotor induzível de auxina. Em vários aspectos, o promotor induzível de auxina é um AXIG1. Em vários aspectos, o promotor AXIG1 compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 39. Em vários aspectos, o promotor compreende um elemento de resposta de auxina. Em vários aspectos, o promotor contém um ou mais motivos intensificadores de DR5. Em vários aspectos, o promotor é um promotor constitutivo fraco modificado por repressão e não repressão. Em vários aspectos, uma ou mais sequências de operador no promotor foram posicionadas perto ou sobrepondo o TATA box e/ou o sítio de início de transcrição. Em vários aspectos, o promotor é NOS, AXIG1, ZM-GOS2, CC-UBI1-PRO ou ZM-ADF4-PRO. Em vários aspectos, o promotor é um promotor DR5 que compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 40. Em vários aspectos, o promotor é um promotor não reprimível. Em vários aspectos, o promotor não reprimível é TETR, ESR ou CR. Em vários aspectos, o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é um polipeptídeo WUS1, WUS2, WUS3, WOX2A, WOX4, WOX5 ou WOX9. Em vários aspectos, a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é um nucleotídeo de monocotiledônea. Em vários aspectos, a monocotiledônea é cevada, milho, painço, aveias, arroz, centeio, Setaria sp., sorgo, cana de açúcar, painço amarelo, triticale, relva ou trigo. Em vários aspectos, a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é um nucleotídeo de dicotiledônea. Em vários aspectos, a dicotiledônea é couve, couve-flor, brócolis, planta de mostarda, repolho, ervilha, cravo-da-índia, alfafa, feijão-fava, tomate, mandioca, feijão-soja, canola, alfafa, girassol, cártamo, tabaco, Arabidopsis ou algodão. Em vários aspectos, a sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo homeobox WUS/WOX codifica uma sequência de aminoácidos que compreende qualquer uma dentre SEQ ID NOs:4, 6, 8, 10, 12, 14 ou 16. Em vários aspectos, a sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo homeobox WUS/WOX compreende qualquer uma dentre SEQ ID NOs:3, 5, 7, 9, 11, 13 ou 15. Em vários aspectos, o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é um polipeptídeo WUS1. Em vários aspectos, o polipeptídeo WUS1 é um polipeptídeo WUS1 de milho, sorgo, arroz ou Setaria sp. Em vários aspectos, o polipeptídeo WUS1 é um polipeptídeo WUS1 de milho ou arroz. Em vários aspectos, o polipeptídeo WUS1 é um polipeptídeo WUS1 de milho. Em vários aspectos, o polipeptídeo WUS1 compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4. Em vários aspectos, o polipeptídeo WUS1 é codificado por uma sequência de nucleotídeos que compreende SEQ ID NO: 3. Em vários aspectos, o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é um polipeptídeo WUS2. Em vários aspectos, o polipeptídeo WUS2 é um polipeptídeo WUS2 de milho, sorgo, arroz ou Setaria sp. Em vários aspectos, o polipeptídeo WUS2 é um polipeptídeo WUS2 de milho ou arroz. Em vários aspectos, o polipeptídeo WUS2 é um polipeptídeo WUS2 de milho. Em vários aspectos, o polipeptídeo WUS2 compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:6. Em vários aspectos, o polipeptídeo WUS2 é codificado por uma sequência de nucleotídeos que compreende SEQ ID NO: 5. Em vários aspectos, o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é um polipeptídeo WUS3. Em vários aspectos, o polipeptídeo WUS3 é um polipeptídeo WUS3 de milho, sorgo, arroz ou Setaria. Em vários aspectos, o polipeptídeo WUS3 é um polipeptídeo WUS3 de milho ou arroz. Em vários aspectos, o polipeptídeo WUS3 é um polipeptídeo WUS3 de milho. Em vários aspectos, o polipeptídeo WUS3 compreende a sequência de aminos de SEQ ID NO:8. Em vários aspectos, o polipeptídeo WUS3 é codificado por uma sequência de nucleotídeos que compreende SEQ ID NO:7. Em vários aspectos, o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é um polipeptídeo WOX5. Em vários aspectos, o polipeptídeo WOX5 é um polipeptídeo WOX5A. Em vários aspectos, o polipeptídeo WOX5 é um polipeptídeo WOX5 de milho, sorgo, arroz ou Setaria. Em vários aspectos, o polipeptídeo WOX5 é um polipeptídeo WOX5 de milho ou arroz. Em vários aspectos, o polipeptídeo WOX5 é um polipeptídeo WOX5 de milho. Em vários aspectos, o polipeptídeo WOX5 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14. Em vários aspectos, o polipeptídeo WOX5 é codificado por uma sequência de nucleotídeos que compreende SEQ ID NO: 13. Em vários aspectos, o polipeptídeo que compreende os dois domínios de ligação de AP2-DNA é um polipeptídeo ODP2, BBM2, BMN2 ou BMN3. Em vários aspectos, o polipeptídeo que compreende os dois domínios de ligação de AP2-DNA é um polipeptídeo de monocotiledônea. Em vários aspectos, a monocotiledônea é cevada, milho, painço, aveias, arroz, centeio, Setaria sp., sorgo, cana de açúcar, painço amarelo, triticale, relva ou trigo. Em vários aspectos, a monocotiledônea é milho, sorgo, arroz ou Setaria sp. Em vários aspectos, a monocotiledônea é milho ou arroz. Em vários aspectos, a monocotiledônea é milho. Em vários aspectos, o polipeptídeo que compreende os dois domínios de ligação de AP2-DNA é um polipeptídeo de dicotiledônea. Em vários aspectos, a dicotiledônea é couve, couve-flor, brócolis, planta de mostarda, repolho, ervilha, cravo-da-índia, alfafa, feijão-fava, tomate, mandioca, feijão-soja, canola, alfafa, girassol, cártamo, tabaco, Arabidopsis ou algodão. Em vários aspectos, o polipeptídeo que compreende os dois domínios de ligação de AP2-DNA compreende uma sequência de aminoácidos de qualquer uma dentre SEQ ID NO: 18, 20, 63, 65 ou 67. Em vários aspectos, o polipeptídeo que compreende os dois domínios de ligação de AP2-DNA é codificado por uma sequência de nucleotídeos que compreende qualquer uma dentre SEQ ID NO: 17, 19, 21, 62, 64, 66 ou 68. Em vários aspectos, o polipeptídeo que compreende os dois domínios de ligação de AP2-DNA é um polipeptídeo ODP2. Em vários aspectos, o polipeptídeo ODP2 é um polipeptídeo de monocotiledônea. Em vários aspectos, a monocotiledônea é cevada, milho, painço, aveias, arroz, centeio, Setaria sp., sorgo, cana de açúcar, painço amarelo, triticale, relva ou trigo. Em vários aspectos, a monocotiledônea é milho, arroz ou Setaria sp. Em vários aspectos, a monocotiledônea é milho ou arroz. Em vários aspectos, o ODP2 é um polipeptídeo de dicotiledônea. Em vários aspectos, a dicotiledônea é couve, couve-flor, brócolis, planta de mostarda, repolho, ervilha, cravo-da-índia, alfafa, feijão-fava, tomate, mandioca, feijão-soja, canola, alfafa, girassol, cártamo, tabaco, Arabidopsis ou algodão. Em vários aspectos, o polipeptídeo ODP2 compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma dentre SEQ ID NO: 18, 63, 65 ou 67. Em vários aspectos, o polipeptídeo ODP2 é codificado por uma sequência de nucleotídeos que compreende a sequência de qualquer uma dentre SEQ ID NO: 17, 21, 62, 64, 66, ou 68. Em vários aspectos, o polipeptídeo que compreende os dois domínios de ligação de AP2-DNA é um polipeptídeo BBM2. Em vários aspectos, o polipeptídeo BBM2 é um polipeptídeo de monocotiledônea. Em vários aspectos, a monocotiledônea é cevada, milho, painço, aveias, arroz, centeio, Setaria sp., sorgo, cana de açúcar, painço amarelo, triticale, relva ou trigo. Em vários aspectos, a monocotiledônea é milho, cana de açúcar, arroz ou Setaria sp. Em vários aspectos, a monocotiledônea é milho ou arroz. Em vários aspectos, a monocotiledônea é milho. Em vários aspectos, o polipeptídeo BBM2 é um polipeptídeo de dicotiledônea. Em vários aspectos, a dicotiledônea é couve, couve-flor, brócolis, planta de mostarda, repolho, ervilha, cravo-da-índia, alfafa, feijão-fava, tomate, mandioca, feijão-soja, canola, alfafa, girassol, cártamo, tabaco, Arabidopsis ou algodão. Em vários aspectos, o polipeptídeo BBM2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20. Em vários aspectos, o polipeptídeo BBM2 é codificado por uma sequência de nucleotídeos que compreende a sequência de SEQ ID NO: 19. Em vários aspectos, o explante é derivado de uma monocotiledônea. Em vários aspectos, a monocotiledônea é cevada, milho, painço, aveias, arroz, centeio, Setaria sp., sorgo, cana de açúcar, painço amarelo, triticale, relva ou trigo. Em vários aspectos, o explante é derivado de uma dicotiledônea. Em vários aspectos, a dicotiledônea é couve, couve-flor, brócolis, planta de mostarda, repolho, ervilha, cravo- da-índia, alfafa, feijão-fava, tomate, mandioca, feijão-soja, canola, alfafa, girassol, cártamo, tabaco, Arabidopsis ou algodão. Em vários aspectos, a estrutura de planta regenerável é formada dentre cerca de 0 a cerca de 7 dias de transformação da célula ou dentro de cerca de 0 a cerca de 14 dias de transformação da célula e a planta transgênica é formada em cerca de 14 dias de transformação da célula a cerca de 60 dias de transformação da célula. Em vários aspectos, o método é realizado na ausência de meio de enraizamento. Em vários aspectos, o método é realizado na presença de meio de enraizamento. Em vários aspectos, o explante é um embrião imaturo. Em vários aspectos, o embrião imaturo é um embrião imaturo de 1 a 5 mm. Em vários aspectos, o embrião imaturo é um embrião imaturo de 3,5 a 5 mm. Em vários aspectos, a citocinina exógena é usada durante a germinação após cerca de 7 dias de transformação da célula ou após cerca de 14 dias de transformação da célula. Em vários aspectos, a expressão de um polipeptídeo de (a) é transiente. Em vários aspectos, fornece-se uma semente da planta produzida pelo método.
[0024] Em um aspecto adicional, a presente revelação fornece métodos para produzir uma planta transgênica que compreende (a) transformar uma célula de um explante com um construto de expressão que compreende (i) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo homeobox WUS/WOX; ou (ii) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA; ou (iii) uma combinação dos mesmos; (b) permitir a expressão de um polipeptídeo de (a) em cada célula transformada para formar uma estrutura de planta regenerável na ausência de citocinina exógena, em que nenhum calo é formado; e (c) germinar a estrutura de planta regenerável para formar a planta transgênica; em que o polipeptídeo homeobox WUS/WOX compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma dentre SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14 ou 16; ou em que o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é codificado pela sequência de nucleotídeos de qualquer uma dentre SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13 ou 15; e em que o polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma dentre SEQ ID NO: 18, 20, 63, 65 ou 67; ou em que o polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA é codificado pela sequência de nucleotídeos de qualquer uma dentre SEQ ID NO: 17, 19, 21, 62, 64, 66 ou 68. Em vários aspectos, o construto de expressão compreende tanto a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX quanto a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA. Em vários aspectos, o construto de expressão compreende a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX. Em vários aspectos, o construto de expressão compreende a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA. Em vários aspectos, a expressão da sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX e/ou a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2 ocorre menos de 1 dia, menos de 2 dias, menos de 5 dias, menos de 7 dias ou menos de cerca de 14 dias após iniciação da transformação. Em vários aspectos, o construto de expressão compreende adicionalmente uma sequência de nucleotídeos que codifica uma recombinase específica a sítio. Em vários aspectos, a recombinase específica a sítio é FLP, Cre, SSV1, lambda Int, phi C31 Int, HK022, R, Gin, Tn1721, CinH, ParA, Tn5053, Bxb1, TP907-1 ou U153. Em vários aspectos, a recombinase específica a sítio é um peptídeo de fusão desestabilizado. Em vários aspectos, o peptídeo de fusão desestabilizado é TETR(L17G)~CRE ou ESR(L17G)~CRE. Em vários aspectos, a sequência de nucleotídeos que codifica uma recombinase específica a sítio é operacionalmente ligada a um promotor constitutivo, um promotor induzível ou um promotor regulado em desenvolvimento. Em vários aspectos, o promotor induzível é GLB1, OLE, LTP2, HSP17.7, HSP26 ou HSP18A. Em vários aspectos, o promotor induzível é um promotor quimicamente induzível. Em vários aspectos, o promotor quimicamente induzível é XVE. Em vários aspectos, o promotor quimicamente induzível é reprimido por TETR, ESR ou CR, e a não repressão ocorre mediante a adição de ligantes relacionados a tetraciclina ou sulfonilureia. Em vários aspectos, o repressor é TETR e o ligante relacionado a tetraciclina é doxiciclina ou anidrotetraciclina. Em vários aspectos, o repressor é ESR e o ligante de sulfonilureia é etametsulfurona, clorsulfurona, metsulfurona-metila, sulfometurona metila, clorimurona etila, nicosulfurona, primisulfurona, tribenurona, sulfosulfurona, trifloxisulfurona, foramsulfurona, iodosulfurona, prosulfurona, tifensulfurona, rimsulfurona, mesosulfurona ou halosulfurona. Em vários aspectos, a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é operacionalmente ligada a um promotor constitutivo. Em vários aspectos, o promotor constitutivo é UBI, LLDAV, EVCV, DMMV, BSV (AY) PRO, CYMV PRO FL, UBIZM PRO, SI- UB3 PRO, SB-UBI PRO (ALT1), USB1ZM PRO, ZM-GOS2 PRO, ZM-H1B PRO (1,2 KB), IN2-2, NOS, a versão -135 de 35S ou ZM-ADF PRO (ALT2). Em vários aspectos, a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é operacionalmente ligada a um promotor induzível ou um promotor regulado em desenvolvimento. Em vários aspectos, a sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA é operacionalmente ligada a um promotor induzível ou um promotor regulado em desenvolvimento. Em vários aspectos, o promotor regulado em desenvolvimento é um promotor PLTP. Em vários aspectos, o promotor PLTP é derivado de uma monocotiledônea. Em vários aspectos, a monocotiledônea é cevada, milho, painço, aveias, arroz, centeio, Setaria sp., sorgo, cana de açúcar, painço amarelo, triticale, relva ou trigo. Em vários aspectos, a monocotiledônea é milho, sorgo, arroz ou Setaria sp. Em vários aspectos, a monocotiledônea é milho, sorgo ou arroz. Em vários aspectos, a monocotiledônea é milho. Em vários aspectos, o promotor PLTP é derivado de uma dicotiledônea. Em vários aspectos, a dicotiledônea é couve, couve-flor, brócolis, planta de mostarda, repolho, ervilha, cravo-da-índia, alfafa, feijão-fava, tomate, mandioca, feijão-soja, canola, alfafa, girassol, cártamo, tabaco, Arabidopsis ou algodão. Em vários aspectos, o promotor PLTP compreende qualquer uma dentre SEQ ID NO: 1 a 2 ou 55 a 61. Em vários aspectos, o promotor PLTP compreende qualquer uma dentre SEQ ID NO: 1 ou 2. Em vários aspectos, o promotor induzível é um promotor induzível de auxina. Em vários aspectos, o promotor induzível de auxina é um AXIG1. Em vários aspectos, o promotor AXIG1 compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 39. Em vários aspectos, o promotor compreende um elemento de resposta de auxina. Em vários aspectos, o promotor contém um ou mais motivos intensificadores de DR5. Em vários aspectos, o promotor é um promotor constitutivo fraco modificado por repressão e não repressão. Em vários aspectos, uma ou mais sequências de operador no promotor foram posicionadas perto ou sobrepondo o TATA box e/ou o sítio de início de transcrição. Em vários aspectos, o promotor é NOS, AXIG1, ZM-GOS2, CC-UBI1-PRO ou ZM-ADF4-PRO. Em vários aspectos, o promotor é um promotor DR5 que compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 40. Em vários aspectos, o promotor é um promotor não reprimível. Em vários aspectos, o promotor não reprimível é TETR, ESR ou CR. Em vários aspectos, o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é SEQ ID NO: 4. Em vários aspectos, o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é codificado por SEQ ID NO: 3. Em vários aspectos, o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é SEQ ID NO:6. Em vários aspectos, o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é codificado por SEQ ID NO: 5. Em vários aspectos, o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é SEQ ID NO:8. Em vários aspectos, o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é codificado por SEQ ID NO:7. Em vários aspectos, o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é SEQ ID NO: 14. Em vários aspectos, o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é codificado por SEQ ID NO: 13. Em vários aspectos, o polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA é SEQ ID NO: 20. Em vários aspectos, o polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA é codificado por SEQ ID NO: 19. Em vários aspectos, o explante é derivado de uma monocotiledônea. Em vários aspectos, a monocotiledônea é cevada, milho, painço, aveias, arroz, centeio, Setaria sp., sorgo, cana de açúcar, painço amarelo, triticale, relva ou trigo. Em vários aspectos, o explante é derivado de uma dicotiledônea. Em vários aspectos, a dicotiledônea é couve, couve- flor, brócolis, planta de mostarda, repolho, ervilha, cravo-da- índia, alfafa, feijão-fava, tomate, mandioca, feijão-soja, canola, alfafa, girassol, cártamo, tabaco, Arabidopsis ou algodão. Em vários aspectos, a estrutura de planta regenerável é formada dentre cerca de 0 a cerca de 7 dias de transformação da célula ou dentro de cerca de 0 a cerca de 14 dias de transformação da célula e a planta transgênica é formada em cerca de 14 dias de transformação da célula a cerca de 60 dias de transformação da célula. Em vários aspectos, o método é realizado na ausência de meio de enraizamento. Em vários aspectos, o método é realizado na presença de meio de enraizamento. Em vários aspectos, o explante é um embrião imaturo. Em vários aspectos, o embrião imaturo é um embrião imaturo de 1 a 5 mm. Em vários aspectos, o embrião imaturo é um embrião imaturo de 3,5 a 5 mm. Em vários aspectos, a citocinina exógena é usada durante a germinação após cerca de 7 dias de transformação da célula ou após cerca de 14 dias de transformação da célula. Em vários aspectos, a expressão de um polipeptídeo de (a) é transiente. Em vários aspectos, fornece-se uma semente da planta produzida pelo método.
[0025] Em um aspecto adicional, a presente revelação fornece métodos para produzir uma planta transgênica que compreende (a) transformar uma célula de um explante com um construto de expressão que compreende (i) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo WUS2; ou (ii) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo ODP2; ou (iii) uma combinação dos mesmos; (b) permitir a expressão de um polipeptídeo de (a) em cada célula transformada para formar uma estrutura de planta regenerável na ausência de citocinina exógena, em que nenhum calo é formado; e (c) germinar a estrutura de planta regenerável para formar a planta transgênica; em que o polipeptídeo WUS2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4; ou em que o polipeptídeo WUS2 é codificado pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 3; e em que o polipeptídeo ODP2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18; ou em que o polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA é codificado pela sequência de nucleotídeos de qualquer uma dentre SEQ ID NO: 17 ou 21. Em vários aspectos, o construto de expressão compreende tanto a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX quanto a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA. Em vários aspectos, o construto de expressão compreende a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX. Em vários aspectos, o construto de expressão compreende a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA. Em vários aspectos, a expressão da sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX e/ou a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2 ocorre menos de 1 dia, menos de 2 dias, menos de 5 dias, menos de 7 dias ou menos de cerca de 14 dias após iniciação da transformação. Em vários aspectos, a germinação é realizada na presença de citocinina exógena. Em vários aspectos, o construto de expressão compreende adicionalmente uma sequência de nucleotídeos que codifica uma recombinase específica a sítio. Em vários aspectos, a recombinase específica a sítio é FLP, Cre, SSV1, lambda Int, phi C31 Int, HK022, R, Gin, Tn1721, CinH, ParA, Tn5053, Bxb1, TP907-1 ou U153. Em vários aspectos, a recombinase específica a sítio é um peptídeo de fusão desestabilizado. Em vários aspectos, o peptídeo de fusão desestabilizado é TETR(L17G)~CRE ou ESR(L17G)~CRE. Em vários aspectos, a sequência de nucleotídeos que codifica uma recombinase específica a sítio é operacionalmente ligada a um promotor constitutivo, um promotor induzível ou um promotor regulado em desenvolvimento. Em vários aspectos, o promotor induzível é GLB1, OLE, LTP2, HSP17.7, HSP26 ou HSP18A. Em vários aspectos, o promotor induzível é um promotor quimicamente induzível. Em vários aspectos, o promotor quimicamente induzível é XVE. Em vários aspectos, o promotor quimicamente induzível é reprimido por TETR, ESR ou CR, e a não repressão ocorre mediante a adição de ligantes relacionados a tetraciclina ou sulfonilureia. Em vários aspectos, o repressor é TETR e o ligante relacionado a tetraciclina é doxiciclina ou anidrotetraciclina. Em vários aspectos, o repressor é ESR e o ligante de sulfonilureia é etametsulfurona, clorsulfurona, metsulfurona-metila, sulfometurona metila, clorimurona etila, nicosulfurona, primisulfurona, tribenurona, sulfosulfurona, trifloxisulfurona, foramsulfurona, iodosulfurona, prosulfurona, tifensulfurona, rimsulfurona, mesosulfurona ou halosulfurona. Em vários aspectos, a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é operacionalmente ligada a um promotor constitutivo. Em vários aspectos, o promotor constitutivo é UBI, LLDAV, EVCV, DMMV, BSV (AY) PRO, CYMV PRO FL, UBIZM PRO, SI- UB3 PRO, SB-UBI PRO (ALT1), USB1ZM PRO, ZM-GOS2 PRO, ZM-H1B PRO (1,2 KB), IN2-2, NOS, a versão -135 de 35S ou ZM-ADF PRO (ALT2). Em vários aspectos, a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é operacionalmente ligada a um promotor induzível ou um promotor regulado em desenvolvimento. Em vários aspectos, a sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA é operacionalmente ligada a um promotor induzível ou um promotor regulado em desenvolvimento. Em vários aspectos, o promotor regulado em desenvolvimento é um promotor PLTP. Em vários aspectos, o promotor PLTP é derivado de uma monocotiledônea. Em vários aspectos, a monocotiledônea é cevada, milho, painço, aveias, arroz, centeio, Setaria sp., sorgo, cana de açúcar, painço amarelo, triticale, relva ou trigo. Em vários aspectos, a monocotiledônea é milho, sorgo, arroz ou Setaria sp. Em vários aspectos, a monocotiledônea é milho, sorgo ou arroz. Em vários aspectos, a monocotiledônea é milho. Em vários aspectos, o promotor PLTP é derivado de uma dicotiledônea. Em vários aspectos, a dicotiledônea é couve, couve-flor, brócolis, planta de mostarda, repolho, ervilha, cravo-da-índia, alfafa, feijão-fava, tomate, mandioca, feijão-soja, canola, alfafa, girassol, cártamo, tabaco, Arabidopsis ou algodão. Em vários aspectos, o promotor PLTP compreende qualquer uma dentre SEQ ID NO: 1 a 2 ou 55 a 61. Em vários aspectos, o promotor PLTP compreende qualquer uma dentre SEQ ID NO: 1 ou 2. Em vários aspectos, o promotor induzível é um promotor induzível de auxina. Em vários aspectos, o promotor induzível de auxina é um AXIG1. Em vários aspectos, o promotor AXIG1 compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 39. Em vários aspectos, o promotor compreende um elemento de resposta de auxina. Em vários aspectos, o promotor contém um ou mais motivos intensificadores de DR5. Em vários aspectos, o promotor é um promotor constitutivo fraco modificado por repressão e não repressão. Em vários aspectos, uma ou mais sequências de operador no promotor foram posicionadas perto ou sobrepondo o TATA box e/ou o sítio de início de transcrição. Em vários aspectos, o promotor é NOS, AXIG1, ZM-GOS2, CC-UBI1-PRO ou ZM-ADF4-PRO. Em vários aspectos, o promotor é um promotor DR5 que compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 40. Em vários aspectos, o promotor é um promotor não reprimível. Em vários aspectos, o promotor não reprimível é TETR, ESR ou CR. Em vários aspectos, o explante é derivado de uma monocotiledônea. Em vários aspectos, a monocotiledônea é cevada, milho, painço, aveias, arroz, centeio, Setaria sp., sorgo, cana de açúcar, painço amarelo, triticale, relva ou trigo. Em vários aspectos, o explante é derivado de uma dicotiledônea. Em vários aspectos, a dicotiledônea é couve, couve-flor, brócolis, planta de mostarda, repolho, ervilha, cravo-da-índia, alfafa, feijão-fava, tomate, mandioca, feijão-soja, canola, alfafa, girassol, cártamo, tabaco, Arabidopsis ou algodão. Em vários aspectos, a estrutura de planta regenerável é formada dentre cerca de 0 a cerca de 7 dias de transformação da célula ou dentro de cerca de 0 a cerca de 14 dias de transformação da célula e a planta transgênica é formada em cerca de 14 dias de transformação da célula a cerca de 60 dias de transformação da célula. Em vários aspectos, o método é realizado na ausência de meio de enraizamento. Em vários aspectos, o método é realizado na presença de meio de enraizamento. Em vários aspectos, o explante é um embrião imaturo. Em vários aspectos, o embrião imaturo é um embrião imaturo de 1 a 5 mm. Em vários aspectos, o embrião imaturo é um embrião imaturo de 3,5 a 5 mm. Em vários aspectos, a citocinina exógena é usada durante a germinação após cerca de 7 dias de transformação da célula ou após cerca de 14 dias de transformação da célula. Em vários aspectos, a expressão de um polipeptídeo de (a) é transiente. Em vários aspectos, fornece-se uma semente da planta produzida pelo método.
[0026] Em um aspecto adicional, a presente revelação fornece métodos para produzir uma planta transgênica, que compreende (a) transformar uma célula de um explante com um construto de expressão que compreende (i) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo homeobox WUS/WOX; e (b) permitir a expressão do polipeptídeo de (a) em cada célula transformada para formar uma estrutura de planta regenerável na ausência de citocinina exógena, em que nenhum calo é formado; e (c) germinar a estrutura de planta regenerável para formar a planta transgênica. Em vários aspectos, a expressão da sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX ocorre menos de 1 dia, menos de 2 dias, menos de 5 dias, menos de 7 dias ou menos de cerca de 14 dias após iniciação da transformação. Em vários aspectos, a germinação é realizada na presença de citocinina exógena. Em vários aspectos, o construto de expressão compreende adicionalmente uma sequência de nucleotídeos que codifica uma recombinase específica a sítio. Em vários aspectos, a recombinase específica a sítio é FLP, Cre, SSV1, lambda Int, phi C31 Int, HK022, R, Gin, Tn1721, CinH, ParA, Tn5053, Bxb1, TP907-1 ou U153. Em vários aspectos, a recombinase específica a sítio é um peptídeo de fusão desestabilizado. Em vários aspectos, o peptídeo de fusão desestabilizado é TETR(L17G)~CRE ou ESR(L17G)~CRE. Em vários aspectos, a sequência de nucleotídeos que codifica uma recombinase específica a sítio é operacionalmente ligada a um promotor constitutivo, um promotor induzível ou um promotor regulado em desenvolvimento. Em vários aspectos, o promotor induzível é GLB1, OLE, LTP2, HSP17.7, HSP26 ou HSP18A. Em vários aspectos, o promotor induzível é um promotor quimicamente induzível. Em vários aspectos, o promotor quimicamente induzível é XVE. Em vários aspectos, o promotor quimicamente induzível é reprimido por TETR, ESR ou CR, e a não repressão ocorre mediante a adição de ligantes relacionados a tetraciclina ou sulfonilureia. Em vários aspectos, o repressor é TETR e o ligante relacionado a tetraciclina é doxiciclina ou anidrotetraciclina. Em vários aspectos, o repressor é ESR e o ligante de sulfonilureia é etametsulfurona, clorsulfurona, metsulfurona- metila, sulfometurona metila, clorimurona etila, nicosulfurona, primisulfurona, tribenurona, sulfosulfurona, trifloxisulfurona, foramsulfurona, iodosulfurona, prosulfurona, tifensulfurona, rimsulfurona, mesosulfurona ou halosulfurona. Em vários aspectos, a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é operacionalmente ligada a um promotor constitutivo. Em vários aspectos, o promotor constitutivo é UBI, LLDAV, EVCV, DMMV, BSV (AY) PRO, CYMV PRO FL, UBIZM PRO, SI-UB3 PRO, SB-UBI PRO (ALT1), USB1ZM PRO, ZM-GOS2 PRO, ZM-H1B PRO (1,2 KB), IN2-2, NOS, a versão -135 de 35S ou ZM-ADF PRO (ALT2). Em vários aspectos, a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é operacionalmente ligada a um promotor induzível ou um promotor regulado em desenvolvimento. Em vários aspectos, o promotor regulado em desenvolvimento é um promotor PLTP. Em vários aspectos, o promotor PLTP é derivado de uma monocotiledônea. Em vários aspectos, a monocotiledônea é cevada, milho, painço, aveias, arroz, centeio, Setaria sp., sorgo, cana de açúcar, painço amarelo, triticale, relva ou trigo. Em vários aspectos, a monocotiledônea é milho, sorgo, arroz ou Setaria sp. Em vários aspectos, a monocotiledônea é milho, sorgo ou arroz. Em vários aspectos, a monocotiledônea é milho. Em vários aspectos, o promotor PLTP é derivado de uma dicotiledônea. Em vários aspectos, a dicotiledônea é couve, couve-flor, brócolis, planta de mostarda, repolho, ervilha, cravo-da-índia, alfafa, feijão-fava, tomate, mandioca, feijão-soja, canola, alfafa, girassol, cártamo, tabaco, Arabidopsis ou algodão. Em vários aspectos, o promotor PLTP compreende qualquer uma dentre SEQ ID NO: 1 a 2 ou 55 a 61. Em vários aspectos, o promotor PLTP compreende qualquer uma dentre SEQ ID NO: 1 ou 2. Em vários aspectos, o promotor induzível é um promotor induzível de auxina. Em vários aspectos, o promotor induzível de auxina é um AXIG1. Em vários aspectos, o promotor AXIG1 compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 39. Em vários aspectos, o promotor compreende um elemento de resposta de auxina. Em vários aspectos, o promotor contém um ou mais motivos intensificadores de DR5. Em vários aspectos, o promotor é um promotor constitutivo fraco modificado por repressão e não repressão. Em vários aspectos, uma ou mais sequências de operador no promotor foram posicionadas perto ou sobrepondo o TATA box e/ou o sítio de início de transcrição. Em vários aspectos, o promotor é NOS, AXIG1, ZM-GOS2, CC-UBI1-PRO ou ZM-ADF4-PRO. Em vários aspectos, o promotor é um promotor DR5 que compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 40. Em vários aspectos, o promotor é um promotor não reprimível. Em vários aspectos, o promotor não reprimível é TETR, ESR ou CR. Em vários aspectos, o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é um polipeptídeo WUS1, WUS2, WUS3, WOX2A, WOX4, WOX5 ou WOX9. Em vários aspectos, a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é um nucleotídeo de monocotiledônea. Em vários aspectos, a monocotiledônea é cevada, milho, painço, aveias, arroz, centeio, Setaria sp., sorgo, cana de açúcar, painço amarelo, triticale, relva ou trigo. Em vários aspectos, a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é um nucleotídeo de dicotiledônea. Em vários aspectos, a dicotiledônea é couve, couve-flor, brócolis, planta de mostarda, repolho, ervilha, cravo-da-índia, alfafa, feijão-fava, tomate, mandioca, feijão-soja, canola, alfafa, girassol, cártamo, tabaco, Arabidopsis ou algodão. Em vários aspectos, a sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo homeobox WUS/WOX codifica uma sequência de aminoácidos que compreende qualquer uma dentre SEQ ID NOs:4, 6, 8, 10, 12, 14 ou 16. Em vários aspectos, a sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo homeobox WUS/WOX compreende qualquer uma dentre SEQ ID NOs:3, 5, 7, 9, 11, 13 ou 15. Em vários aspectos, o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é um polipeptídeo WUS1. Em vários aspectos, o polipeptídeo WUS1 é um polipeptídeo WUS1 de milho, sorgo, arroz ou Setaria sp. Em vários aspectos, o polipeptídeo WUS1 é um polipeptídeo WUS1 de milho ou arroz. Em vários aspectos, o polipeptídeo WUS1 é um polipeptídeo WUS1 de milho. Em vários aspectos, o polipeptídeo WUS1 compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4. Em vários aspectos, o polipeptídeo WUS1 é codificado por uma sequência de nucleotídeos que compreende SEQ ID NO: 3. Em vários aspectos, o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é um polipeptídeo WUS2. Em vários aspectos, o polipeptídeo WUS2 é um polipeptídeo WUS2 de milho, sorgo, arroz ou Setaria sp. Em vários aspectos, o polipeptídeo WUS2 é um polipeptídeo WUS2 de milho ou arroz. Em vários aspectos, o polipeptídeo WUS2 é um polipeptídeo WUS2 de milho. Em vários aspectos, o polipeptídeo WUS2 compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:6. Em vários aspectos, o polipeptídeo WUS2 é codificado por uma sequência de nucleotídeos que compreende SEQ ID NO: 5. Em vários aspectos, o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é um polipeptídeo WUS3. Em vários aspectos, o polipeptídeo WUS3 é um polipeptídeo WUS3 de milho, sorgo, arroz ou Setaria. Em vários aspectos, o polipeptídeo WUS3 é um polipeptídeo WUS3 de milho ou arroz. Em vários aspectos, o polipeptídeo WUS3 é um polipeptídeo WUS3 de milho. Em vários aspectos, o polipeptídeo WUS3 compreende a sequência de aminos de SEQ ID NO:8. Em vários aspectos, o polipeptídeo WUS3 é codificado por uma sequência de nucleotídeos que compreende SEQ ID NO:7. Em vários aspectos, o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é um polipeptídeo WOX5. Em vários aspectos, o polipeptídeo WOX5 é um polipeptídeo WOX5A. Em vários aspectos, o polipeptídeo WOX5 é um polipeptídeo WOX5 de milho, sorgo, arroz ou Setaria. Em vários aspectos, o polipeptídeo WOX5 é um polipeptídeo WOX5 de milho ou arroz. Em vários aspectos, o polipeptídeo WOX5 é um polipeptídeo WOX5 de milho. Em vários aspectos, o polipeptídeo WOX5 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14. Em vários aspectos, o polipeptídeo WOX5 é codificado por uma sequência de nucleotídeos que compreende SEQ ID NO: 13. Em vários aspectos, o explante é derivado de uma monocotiledônea. Em vários aspectos, a monocotiledônea é cevada, milho, painço, aveias, arroz, centeio, Setaria sp., sorgo, cana de açúcar, painço amarelo, triticale, relva ou trigo. Em vários aspectos, o explante é derivado de uma dicotiledônea. Em vários aspectos, a dicotiledônea é couve, couve-flor, brócolis, planta de mostarda, repolho, ervilha, cravo-da-índia, alfafa, feijão-fava, tomate, mandioca, feijão-soja, canola, alfafa, girassol, cártamo, tabaco, Arabidopsis ou algodão. Em vários aspectos, a estrutura de planta regenerável é formada dentre cerca de 0 a cerca de 7 dias de transformação da célula ou dentro de cerca de 0 a cerca de 14 dias de transformação da célula e a planta transgênica é formada em cerca de 14 dias de transformação da célula a cerca de 60 dias de transformação da célula. Em vários aspectos, o método é realizado na ausência de meio de enraizamento. Em vários aspectos, o método é realizado na presença de meio de enraizamento. Em vários aspectos, o explante é um embrião imaturo. Em vários aspectos, o embrião imaturo é um embrião imaturo de 1 a 5 mm. Em vários aspectos, o embrião imaturo é um embrião imaturo de 3,5 a 5 mm. Em vários aspectos, a citocinina exógena é usada durante a germinação após cerca de 7 dias de transformação da célula ou após cerca de 14 dias de transformação da célula. Em vários aspectos, a expressão de um polipeptídeo de (a) é transiente. Em vários aspectos, fornece-se uma semente da planta produzida pelo método.
[0027] Em um aspecto adicional, a presente revelação fornece métodos para produzir uma planta transgênica, que compreende (a) transformar uma célula de um explante com um construto de expressão que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA; e (b) permitir a expressão do polipeptídeo de (a) em cada célula transformada para formar uma estrutura de planta regenerável na ausência de citocinina exógena, em que nenhum calo é formado; e (c) germinar a estrutura de planta regenerável para formar a planta transgênica. Em vários aspectos, a expressão da sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2 ocorre menos de 1 dia, menos de 2 dias, menos de 5 dias, menos de 7 dias, ou menos de cerca de 14 dias após iniciação da transformação. Em vários aspectos, o construto de expressão compreende adicionalmente uma sequência de nucleotídeos que codifica uma recombinase específica a sítio. Em vários aspectos, a germinação é realizada na presença de citocinina exógena. Em vários aspectos, a recombinase específica a sítio é FLP, Cre, SSV1, lambda Int, phi C31 Int, HK022, R, Gin, Tn1721, CinH, ParA, Tn5053, Bxb1, TP907-1 ou U153. Em vários aspectos, a recombinase específica a sítio é um peptídeo de fusão desestabilizado. Em vários aspectos, o peptídeo de fusão desestabilizado é TETR(L17G)~CRE ou ESR(L17G)~CRE. Em vários aspectos, a sequência de nucleotídeos que codifica uma recombinase específica a sítio é operacionalmente ligada a um promotor constitutivo, um promotor induzível ou um promotor regulado em desenvolvimento. Em vários aspectos, o promotor induzível é GLB1, OLE, LTP2, HSP17.7, HSP26 ou HSP18A. Em vários aspectos, o promotor induzível é um promotor quimicamente induzível. Em vários aspectos, o promotor quimicamente induzível é XVE. Em vários aspectos, o promotor quimicamente induzível é reprimido por TETR, ESR ou CR, e a não repressão ocorre mediante a adição de ligantes relacionados a tetraciclina ou sulfonilureia. Em vários aspectos, o repressor é TETR e o ligante relacionado a tetraciclina é doxiciclina ou anidrotetraciclina. Em vários aspectos, o repressor é ESR e o ligante de sulfonilureia é etametsulfurona, clorsulfurona, metsulfurona- metila, sulfometurona metila, clorimurona etila, nicosulfurona, primisulfurona, tribenurona, sulfosulfurona, trifloxisulfurona, foramsulfurona, iodosulfurona, prosulfurona, tifensulfurona, rimsulfurona, mesosulfurona ou halosulfurona. Em vários aspectos, a sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA é operacionalmente ligada a um promotor induzível ou um promotor regulado em desenvolvimento. Em vários aspectos, o promotor regulado em desenvolvimento é um promotor PLTP. Em vários aspectos, o promotor PLTP é derivado de uma monocotiledônea. Em vários aspectos, a monocotiledônea é cevada, milho, painço, aveias, arroz, centeio, Setaria sp., sorgo, cana de açúcar, painço amarelo, triticale, relva ou trigo. Em vários aspectos, a monocotiledônea é milho, sorgo, arroz ou Setaria sp. Em vários aspectos, a monocotiledônea é milho, sorgo ou arroz. Em vários aspectos, a monocotiledônea é milho. Em vários aspectos, o promotor PLTP é derivado de uma dicotiledônea. Em vários aspectos, a dicotiledônea é couve, couve-flor, brócolis, planta de mostarda, repolho, ervilha, cravo-da-índia, alfafa, feijão-fava, tomate, mandioca, feijão-soja, canola, alfafa, girassol, cártamo, tabaco, Arabidopsis ou algodão. Em vários aspectos, o promotor PLTP compreende qualquer uma dentre SEQ ID NO: 1 a 2 ou 55 a 61. Em vários aspectos, o promotor PLTP compreende qualquer uma dentre SEQ ID NO: 1 ou 2. Em vários aspectos, o polipeptídeo que compreende os dois domínios de ligação de AP2-DNA é um polipeptídeo ODP2, BBM2, BMN2 ou BMN3. Em vários aspectos, o polipeptídeo que compreende os dois domínios de ligação de AP2-DNA é um polipeptídeo de monocotiledônea. Em vários aspectos, a monocotiledônea é cevada, milho, painço, aveias, arroz, centeio, Setaria sp., sorgo, cana de açúcar, painço amarelo, triticale, relva ou trigo. Em vários aspectos, a monocotiledônea é milho, sorgo, arroz ou Setaria sp. Em vários aspectos, a monocotiledônea é milho ou arroz. Em vários aspectos, a monocotiledônea é milho. Em vários aspectos, o polipeptídeo que compreende os dois domínios de ligação de AP2-DNA é um polipeptídeo de dicotiledônea. Em vários aspectos, a dicotiledônea é couve, couve-flor, brócolis, planta de mostarda, repolho, ervilha, cravo-da-índia, alfafa, feijão-fava, tomate, mandioca, feijão-soja, canola, alfafa, girassol, cártamo, tabaco, Arabidopsis ou algodão. Em vários aspectos, o polipeptídeo que compreende os dois domínios de ligação de AP2-DNA compreende uma sequência de aminoácidos de qualquer uma dentre SEQ ID NO: 18, 20, 63, 65 ou 67. Em vários aspectos, o polipeptídeo que compreende os dois domínios de ligação de AP2-DNA é codificado por uma sequência de nucleotídeos que compreende qualquer uma dentre SEQ ID NO: 17, 19, 21, 62, 64, 66 ou 68. Em vários aspectos, o polipeptídeo que compreende os dois domínios de ligação de AP2-DNA é um polipeptídeo ODP2. Em vários aspectos, o polipeptídeo ODP2 é um polipeptídeo de monocotiledônea. Em vários aspectos, a monocotiledônea é cevada, milho, painço, aveias, arroz, centeio, Setaria sp., sorgo, cana de açúcar, painço amarelo, triticale, relva ou trigo. Em vários aspectos, a monocotiledônea é milho, arroz ou Setaria sp. Em vários aspectos, a monocotiledônea é milho ou arroz. Em vários aspectos, o ODP2 é um polipeptídeo de dicotiledônea. Em vários aspectos, a dicotiledônea é couve, couve-flor, brócolis, planta de mostarda, repolho, ervilha, cravo-da-índia, alfafa, feijão-fava, tomate, mandioca, feijão-soja, canola, alfafa, girassol, cártamo, tabaco, Arabidopsis ou algodão. Em vários aspectos, o polipeptídeo ODP2 compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma dentre SEQ ID NO: 18, 63, 65 ou 67. Em vários aspectos, o polipeptídeo ODP2 é codificado por uma sequência de nucleotídeos que compreende a sequência de qualquer uma dentre SEQ ID NO: 17, 21, 62, 64, 66, ou 68. Em vários aspectos, o polipeptídeo que compreende os dois domínios de ligação de AP2-DNA é um polipeptídeo BBM2. Em vários aspectos, o polipeptídeo BBM2 é um polipeptídeo de monocotiledônea. Em vários aspectos, a monocotiledônea é cevada, milho, painço, aveias, arroz, centeio, Setaria sp., sorgo, cana de açúcar, painço amarelo, triticale, relva ou trigo. Em vários aspectos, a monocotiledônea é milho, cana de açúcar, arroz ou Setaria sp. Em vários aspectos, a monocotiledônea é milho ou arroz. Em vários aspectos, a monocotiledônea é milho. Em vários aspectos, o polipeptídeo BBM2 é um polipeptídeo de dicotiledônea. Em vários aspectos, a dicotiledônea é couve, couve-flor, brócolis, planta de mostarda, repolho, ervilha, cravo-da-índia, alfafa, feijão-fava, tomate, mandioca, feijão-soja, canola, alfafa, girassol, cártamo, tabaco, Arabidopsis ou algodão. Em vários aspectos, o polipeptídeo BBM2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20. Em vários aspectos, o polipeptídeo BBM2 é codificado por uma sequência de nucleotídeos que compreende a sequência de SEQ ID NO: 19. Em vários aspectos, o explante é derivado de uma monocotiledônea. Em vários aspectos, a monocotiledônea é cevada, milho, painço, aveias, arroz, centeio, Setaria sp., sorgo, cana de açúcar, painço amarelo, triticale, relva ou trigo. Em vários aspectos, o explante é derivado de uma dicotiledônea. Em vários aspectos, a dicotiledônea é couve, couve-flor, brócolis, planta de mostarda, repolho, ervilha, cravo- da-índia, alfafa, feijão-fava, tomate, mandioca, feijão-soja, canola, alfafa, girassol, cártamo, tabaco, Arabidopsis ou algodão. Em vários aspectos, a estrutura de planta regenerável é formada dentre cerca de 0 a cerca de 7 dias de transformação da célula ou dentro de cerca de 0 a cerca de 14 dias de transformação da célula e a planta transgênica é formada em cerca de 14 dias de transformação da célula a cerca de 60 dias de transformação da célula. Em vários aspectos, o método é realizado na ausência de meio de enraizamento. Em vários aspectos, o método é realizado na presença de meio de enraizamento. Em vários aspectos, o explante é um embrião imaturo. Em vários aspectos, o embrião imaturo é um embrião imaturo de 1 a 5 mm. Em vários aspectos, o embrião imaturo é um embrião imaturo de 3,5 a 5 mm. Em vários aspectos, a citocinina exógena é usada durante a germinação após cerca de 7 dias de transformação da célula ou após cerca de 14 dias de transformação da célula. Em vários aspectos, a expressão de um polipeptídeo de (a) é transiente. Em vários aspectos, fornece-se uma semente da planta produzida pelo método.
[0028] Em um aspecto adicional, a presente revelação fornece métodos para produzir uma planta transgênica, que compreende (a) transformar uma célula de um explante com um construto de expressão que compreende (i) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo homeobox WUS/WOX; e (ii) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA; e (b) permitir a expressão do polipeptídeo de (a) em cada célula transformada para formar uma estrutura de planta regenerável na ausência de citocinina exógena, em que nenhum calo é formado; e (c) germinar a estrutura de planta regenerável para formar a planta transgênica. Em um aspecto, a expressão da sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX e a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2 ocorre menos de 1 dia, menos de 2 dias, menos de 5 dias, menos de 7 dias ou menos de cerca de 14 dias após iniciação da transformação. Em vários aspectos, a germinação é realizada na presença de citocinina exógena. Em vários aspectos, o construto de expressão compreende adicionalmente uma sequência de nucleotídeos que codifica uma recombinase específica a sítio. Em vários aspectos, a recombinase específica a sítio é FLP, Cre, SSV1, lambda Int, phi C31 Int, HK022, R, Gin, Tn1721, CinH, ParA, Tn5053, Bxb1, TP907-1 ou U153. Em vários aspectos, a recombinase específica a sítio é um peptídeo de fusão desestabilizado. Em vários aspectos, o peptídeo de fusão desestabilizado é TETR(L17G)~CRE ou ESR(L17G)~CRE. Em vários aspectos, a sequência de nucleotídeos que codifica uma recombinase específica a sítio é operacionalmente ligada a um promotor constitutivo, um promotor induzível ou um promotor regulado em desenvolvimento. Em vários aspectos, o promotor induzível é GLB1, OLE, LTP2, HSP17.7, HSP26 ou HSP18A. Em vários aspectos, o promotor induzível é um promotor quimicamente induzível. Em vários aspectos, o promotor quimicamente induzível é XVE. Em vários aspectos, o promotor quimicamente induzível é reprimido por TETR, ESR ou CR, e a não repressão ocorre mediante a adição de ligantes relacionados a tetraciclina ou sulfonilureia. Em vários aspectos, o repressor é TETR e o ligante relacionado a tetraciclina é doxiciclina ou anidrotetraciclina. Em vários aspectos, o repressor é ESR e o ligante de sulfonilureia é etametsulfurona, clorsulfurona, metsulfurona-metila, sulfometurona metila, clorimurona etila, nicosulfurona, primisulfurona, tribenurona, sulfosulfurona, trifloxisulfurona, foramsulfurona, iodosulfurona, prosulfurona, tifensulfurona, rimsulfurona, mesosulfurona ou halosulfurona. Em vários aspectos, a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é operacionalmente ligada a um promotor constitutivo. Em vários aspectos, o promotor constitutivo é UBI, LLDAV, EVCV, DMMV, BSV (AY) PRO, CYMV PRO FL, UBIZM PRO, SI- UB3 PRO, SB-UBI PRO (ALT1), USB1ZM PRO, ZM-GOS2 PRO, ZM-H1B PRO (1,2 KB), IN2-2, NOS, a versão -135 de 35S ou ZM-ADF PRO (ALT2). Em vários aspectos, a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é operacionalmente ligada a um promotor induzível ou um promotor regulado em desenvolvimento. Em vários aspectos, a sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA é operacionalmente ligada a um promotor induzível ou um promotor regulado em desenvolvimento. Em vários aspectos, o promotor regulado em desenvolvimento é um promotor PLTP. Em vários aspectos, o promotor PLTP é derivado de uma monocotiledônea. Em vários aspectos, a monocotiledônea é cevada, milho, painço, aveias, arroz, centeio, Setaria sp., sorgo, cana de açúcar, painço amarelo, triticale, relva ou trigo. Em vários aspectos, a monocotiledônea é milho, sorgo, arroz ou Setaria sp. Em vários aspectos, a monocotiledônea é milho, sorgo ou arroz. Em vários aspectos, a monocotiledônea é milho. Em vários aspectos, o promotor PLTP é derivado de uma dicotiledônea. Em vários aspectos, a dicotiledônea é couve, couve-flor, brócolis, planta de mostarda, repolho, ervilha, cravo-da-índia, alfafa, feijão-fava, tomate, mandioca, feijão-soja, canola, alfafa, girassol, cártamo, tabaco, Arabidopsis ou algodão. Em vários aspectos, o promotor PLTP compreende qualquer uma dentre SEQ ID NO: 1 a 2 ou 55 a 61. Em vários aspectos, o promotor PLTP compreende qualquer uma dentre SEQ ID NO: 1 ou 2. Em vários aspectos, o promotor induzível é um promotor induzível de auxina. Em vários aspectos, o promotor induzível de auxina é um AXIG1. Em vários aspectos, o promotor AXIG1 compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 39. Em vários aspectos, o promotor compreende um elemento de resposta de auxina. Em vários aspectos, o promotor contém um ou mais motivos intensificadores de DR5. Em vários aspectos, o promotor é um promotor constitutivo fraco modificado por repressão e não repressão. Em vários aspectos, uma ou mais sequências de operador no promotor foram posicionadas perto ou sobrepondo o TATA box e/ou o sítio de início de transcrição. Em vários aspectos, o promotor é NOS, AXIG1, ZM-GOS2, CC-UBI1-PRO ou ZM-ADF4-PRO. Em vários aspectos, o promotor é um promotor DR5 que compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 40. Em vários aspectos, o promotor é um promotor não reprimível. Em vários aspectos, o promotor não reprimível é TETR, ESR ou CR. Em vários aspectos, o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é um polipeptídeo WUS1, WUS2, WUS3, WOX2A, WOX4, WOX5 ou WOX9. Em vários aspectos, a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é um nucleotídeo de monocotiledônea. Em vários aspectos, a monocotiledônea é cevada, milho, painço, aveias, arroz, centeio, Setaria sp., sorgo, cana de açúcar, painço amarelo, triticale, relva ou trigo. Em vários aspectos, a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é um nucleotídeo de dicotiledônea. Em vários aspectos, a dicotiledônea é couve, couve-flor, brócolis, planta de mostarda, repolho, ervilha, cravo-da-índia, alfafa, feijão-fava, tomate, mandioca, feijão-soja, canola, alfafa, girassol, cártamo, tabaco, Arabidopsis ou algodão. Em vários aspectos, a sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo homeobox WUS/WOX codifica uma sequência de aminoácidos que compreende qualquer uma dentre SEQ ID NOs:4, 6, 8, 10, 12, 14 ou 16. Em vários aspectos, a sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo homeobox WUS/WOX compreende qualquer uma dentre SEQ ID NOs:3, 5, 7, 9, 11, 13 ou 15. Em vários aspectos, o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é um polipeptídeo WUS1. Em vários aspectos, o polipeptídeo WUS1 é um polipeptídeo WUS1 de milho, sorgo, arroz ou Setaria sp. Em vários aspectos, o polipeptídeo WUS1 é um polipeptídeo WUS1 de milho ou arroz. Em vários aspectos, o polipeptídeo WUS1 é um polipeptídeo WUS1 de milho. Em vários aspectos, o polipeptídeo WUS1 compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4. Em vários aspectos, o polipeptídeo WUS1 é codificado por uma sequência de nucleotídeos que compreende SEQ ID NO: 3. Em vários aspectos, o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é um polipeptídeo WUS2. Em vários aspectos, o polipeptídeo WUS2 é um polipeptídeo WUS2 de milho, sorgo, arroz ou Setaria sp. Em vários aspectos, o polipeptídeo WUS2 é um polipeptídeo WUS2 de milho ou arroz. Em vários aspectos, o polipeptídeo WUS2 é um polipeptídeo WUS2 de milho. Em vários aspectos, o polipeptídeo WUS2 compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:6. Em vários aspectos, o polipeptídeo WUS2 é codificado por uma sequência de nucleotídeos que compreende SEQ ID NO: 5. Em vários aspectos, o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é um polipeptídeo WUS3. Em vários aspectos, o polipeptídeo WUS3 é um polipeptídeo WUS3 de milho, sorgo, arroz ou Setaria. Em vários aspectos, o polipeptídeo WUS3 é um polipeptídeo WUS3 de milho ou arroz. Em vários aspectos, o polipeptídeo WUS3 é um polipeptídeo WUS3 de milho. Em vários aspectos, o polipeptídeo WUS3 compreende a sequência de aminos de SEQ ID NO:8. Em vários aspectos, o polipeptídeo WUS3 é codificado por uma sequência de nucleotídeos que compreende SEQ ID NO:7. Em vários aspectos, o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é um polipeptídeo WOX5. Em vários aspectos, o polipeptídeo WOX5 é um polipeptídeo WOX5A. Em vários aspectos, o polipeptídeo WOX5 é um polipeptídeo WOX5 de milho, sorgo, arroz ou Setaria. Em vários aspectos, o polipeptídeo WOX5 é um polipeptídeo WOX5 de milho ou arroz. Em vários aspectos, o polipeptídeo WOX5 é um polipeptídeo WOX5 de milho. Em vários aspectos, o polipeptídeo WOX5 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14. Em vários aspectos, o polipeptídeo WOX5 é codificado por uma sequência de nucleotídeos que compreende SEQ ID NO: 13. Em vários aspectos, o polipeptídeo que compreende os dois domínios de ligação de AP2-DNA é um polipeptídeo ODP2, BBM2, BMN2 ou BMN3. Em vários aspectos, o polipeptídeo que compreende os dois domínios de ligação de AP2-DNA é um polipeptídeo de monocotiledônea. Em vários aspectos, a monocotiledônea é cevada, milho, painço, aveias, arroz, centeio, Setaria sp., sorgo, cana de açúcar, painço amarelo, triticale, relva ou trigo. Em vários aspectos, a monocotiledônea é milho, sorgo, arroz ou Setaria sp. Em vários aspectos, a monocotiledônea é milho ou arroz. Em vários aspectos, a monocotiledônea é milho. Em vários aspectos, o polipeptídeo que compreende os dois domínios de ligação de AP2-DNA é um polipeptídeo de dicotiledônea. Em vários aspectos, a dicotiledônea é couve, couve-flor, brócolis, planta de mostarda, repolho, ervilha, cravo-da-índia, alfafa, feijão-fava, tomate, mandioca, feijão-soja, canola, alfafa, girassol, cártamo, tabaco, Arabidopsis ou algodão. Em vários aspectos, o polipeptídeo que compreende os dois domínios de ligação de AP2-DNA compreende uma sequência de aminoácidos de qualquer uma dentre SEQ ID NO: 18, 20, 63, 65 ou 67. Em vários aspectos, o polipeptídeo que compreende os dois domínios de ligação de AP2-DNA é codificado por uma sequência de nucleotídeos que compreende qualquer uma dentre SEQ ID NO: 17, 19, 21, 62, 64, 66 ou 68. Em vários aspectos, o polipeptídeo que compreende os dois domínios de ligação de AP2-DNA é um polipeptídeo ODP2. Em vários aspectos, o polipeptídeo ODP2 é um polipeptídeo de monocotiledônea. Em vários aspectos, a monocotiledônea é cevada, milho, painço, aveias, arroz, centeio, Setaria sp., sorgo, cana de açúcar, painço amarelo, triticale, relva ou trigo. Em vários aspectos, a monocotiledônea é milho, arroz ou Setaria sp. Em vários aspectos, a monocotiledônea é milho ou arroz. Em vários aspectos, o ODP2 é um polipeptídeo de dicotiledônea. Em vários aspectos, a dicotiledônea é couve, couve-flor, brócolis, planta de mostarda, repolho, ervilha, cravo-da-índia, alfafa, feijão-fava, tomate, mandioca, feijão-soja, canola, alfafa, girassol, cártamo, tabaco, Arabidopsis ou algodão. Em vários aspectos, o polipeptídeo ODP2 compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma dentre SEQ ID NO: 18, 63, 65 ou 67. Em vários aspectos, o polipeptídeo ODP2 é codificado por uma sequência de nucleotídeos que compreende a sequência de qualquer uma dentre SEQ ID NO: 17, 21, 62, 64, 66, ou 68. Em vários aspectos, o polipeptídeo que compreende os dois domínios de ligação de AP2-DNA é um polipeptídeo BBM2. Em vários aspectos, o polipeptídeo BBM2 é um polipeptídeo de monocotiledônea. Em vários aspectos, a monocotiledônea é cevada, milho, painço, aveias, arroz, centeio, Setaria sp., sorgo, cana de açúcar, painço amarelo, triticale, relva ou trigo. Em vários aspectos, a monocotiledônea é milho, cana de açúcar, arroz ou Setaria sp. Em vários aspectos, a monocotiledônea é milho ou arroz. Em vários aspectos, a monocotiledônea é milho. Em vários aspectos, o polipeptídeo BBM2 é um polipeptídeo de dicotiledônea. Em vários aspectos, a dicotiledônea é couve, couve-flor, brócolis, planta de mostarda, repolho, ervilha, cravo-da-índia, alfafa, feijão-fava, tomate, mandioca, feijão-soja, canola, alfafa, girassol, cártamo, tabaco, Arabidopsis ou algodão. Em vários aspectos, o polipeptídeo BBM2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20. Em vários aspectos, o polipeptídeo BBM2 é codificado por uma sequência de nucleotídeos que compreende a sequência de SEQ ID NO: 19. Em vários aspectos, o explante é derivado de uma monocotiledônea. Em vários aspectos, a monocotiledônea é cevada, milho, painço, aveias, arroz, centeio, Setaria sp., sorgo, cana de açúcar, painço amarelo, triticale, relva ou trigo. Em vários aspectos, o explante é derivado de uma dicotiledônea. Em vários aspectos, a dicotiledônea é couve, couve-flor, brócolis, planta de mostarda, repolho, ervilha, cravo- da-índia, alfafa, feijão-fava, tomate, mandioca, feijão-soja, canola, alfafa, girassol, cártamo, tabaco, Arabidopsis ou algodão. Em vários aspectos, a estrutura de planta regenerável é formada dentre cerca de 0 a cerca de 7 dias de transformação da célula ou dentro de cerca de 0 a cerca de 14 dias de transformação da célula e a planta transgênica é formada em cerca de 14 dias de transformação da célula a cerca de 60 dias de transformação da célula. Em vários aspectos, o método é realizado na ausência de meio de enraizamento. Em vários aspectos, o método é realizado na presença de meio de enraizamento. Em vários aspectos, o explante é um embrião imaturo. Em vários aspectos, o embrião imaturo é um embrião imaturo de 1 a 5 mm. Em vários aspectos, o embrião imaturo é um embrião imaturo de 3,5 a 5 mm. Em vários aspectos, a citocinina exógena é usada durante a germinação após cerca de 7 dias de transformação da célula ou após cerca de 14 dias de transformação da célula. Em vários aspectos, a expressão de um polipeptídeo de (a) é transiente. Em vários aspectos, fornece-se uma semente da planta produzida pelo método.
[0029] Em um aspecto adicional, a presente revelação fornece métodos para produzir uma planta transgênica, que compreende (a) transformar uma célula de um explante com um construto de expressão que compreende (i) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo homeobox WUS/WOX; ou (ii) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA; ou (iii) uma combinação de (i) e (ii); e (b) permitir a expressão do polipeptídeo de (a) em cada célula transformada para formar uma estrutura de planta regenerável na ausência de citocinina exógena, em que nenhum calo é formado; e (c) germinar a estrutura de planta regenerável de (b) para formar a planta transgênica em cerca de 14 dias a cerca de 60 dias. Em vários aspectos, o construto de expressão compreende tanto a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX quanto a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA. Em vários aspectos, o construto de expressão compreende a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX. Em vários aspectos, o construto de expressão compreende a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA. Em vários aspectos, a expressão da sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX e/ou a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2 ocorre menos de 1 dia, menos de 2 dias, menos de 5 dias, menos de 7 dias ou menos de cerca de 14 dias após iniciação da transformação. Em vários aspectos, a germinação é realizada na presença de citocinina exógena. Em vários aspectos, o construto de expressão compreende adicionalmente uma sequência de nucleotídeos que codifica uma recombinase específica a sítio. Em vários aspectos, a recombinase específica a sítio é FLP, Cre, SSV1, lambda Int, phi C31 Int, HK022, R, Gin, Tn1721, CinH, ParA, Tn5053, Bxb1, TP907-1 ou U153. Em vários aspectos, a recombinase específica a sítio é um peptídeo de fusão desestabilizado. Em vários aspectos, o peptídeo de fusão desestabilizado é TETR(L17G)~CRE ou ESR(L17G)~CRE. Em vários aspectos, a sequência de nucleotídeos que codifica uma recombinase específica a sítio é operacionalmente ligada a um promotor constitutivo, um promotor induzível ou um promotor regulado em desenvolvimento. Em vários aspectos, o promotor induzível é GLB1, OLE, LTP2, HSP17.7, HSP26 ou HSP18A. Em vários aspectos, o promotor induzível é um promotor quimicamente induzível. Em vários aspectos, o promotor quimicamente induzível é XVE. Em vários aspectos, o promotor quimicamente induzível é reprimido por TETR, ESR ou CR, e a não repressão ocorre mediante a adição de ligantes relacionados a tetraciclina ou sulfonilureia. Em vários aspectos, o repressor é TETR e o ligante relacionado a tetraciclina é doxiciclina ou anidrotetraciclina. Em vários aspectos, o repressor é ESR e o ligante de sulfonilureia é etametsulfurona, clorsulfurona, metsulfurona-metila, sulfometurona metila, clorimurona etila, nicosulfurona, primisulfurona, tribenurona, sulfosulfurona, trifloxisulfurona, foramsulfurona, iodosulfurona, prosulfurona, tifensulfurona, rimsulfurona, mesosulfurona ou halosulfurona. Em vários aspectos, a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é operacionalmente ligada a um promotor constitutivo. Em vários aspectos, o promotor constitutivo é UBI, LLDAV, EVCV, DMMV, BSV (AY) PRO, CYMV PRO FL, UBIZM PRO, SI- UB3 PRO, SB-UBI PRO (ALT1), USB1ZM PRO, ZM-GOS2 PRO, ZM-H1B PRO (1,2 KB), IN2-2, NOS, a versão -135 de 35S ou ZM-ADF PRO (ALT2). Em vários aspectos, a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é operacionalmente ligada a um promotor induzível ou um promotor regulado em desenvolvimento. Em vários aspectos, a sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA é operacionalmente ligada a um promotor induzível ou um promotor regulado em desenvolvimento. Em vários aspectos, o promotor regulado em desenvolvimento é um promotor PLTP. Em vários aspectos, o promotor PLTP é derivado de uma monocotiledônea. Em vários aspectos, a monocotiledônea é cevada, milho, painço, aveias, arroz, centeio, Setaria sp., sorgo, cana de açúcar, painço amarelo, triticale, relva ou trigo. Em vários aspectos, a monocotiledônea é milho, sorgo, arroz ou Setaria sp. Em vários aspectos, a monocotiledônea é milho, sorgo ou arroz. Em vários aspectos, a monocotiledônea é milho. Em vários aspectos, o promotor PLTP é derivado de uma dicotiledônea. Em vários aspectos, a dicotiledônea é couve, couve-flor, brócolis, planta de mostarda, repolho, ervilha, cravo-da-índia, alfafa, feijão-fava, tomate, mandioca, feijão-soja, canola, alfafa, girassol, cártamo, tabaco, Arabidopsis ou algodão. Em vários aspectos, o promotor PLTP compreende qualquer uma dentre SEQ ID NO: 1 a 2 ou 55 a 61. Em vários aspectos, o promotor PLTP compreende qualquer uma dentre SEQ ID NO: 1 ou 2. Em vários aspectos, o promotor induzível é um promotor induzível de auxina. Em vários aspectos, o promotor induzível de auxina é um AXIG1. Em vários aspectos, o promotor AXIG1 compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 39. Em vários aspectos, o promotor compreende um elemento de resposta de auxina. Em vários aspectos, o promotor contém um ou mais motivos intensificadores de DR5. Em vários aspectos, o promotor é um promotor constitutivo fraco modificado por repressão e não repressão. Em vários aspectos, uma ou mais sequências de operador no promotor foram posicionadas perto ou sobrepondo o TATA box e/ou o sítio de início de transcrição. Em vários aspectos, o promotor é NOS, AXIG1, ZM-GOS2, CC-UBI1-PRO ou ZM-ADF4-PRO. Em vários aspectos, o promotor é um promotor DR5 que compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 40. Em vários aspectos, o promotor é um promotor não reprimível. Em vários aspectos, o promotor não reprimível é TETR, ESR ou CR. Em vários aspectos, o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é um polipeptídeo WUS1, WUS2, WUS3, WOX2A, WOX4, WOX5 ou WOX9. Em vários aspectos, a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é um nucleotídeo de monocotiledônea. Em vários aspectos, a monocotiledônea é cevada, milho, painço, aveias, arroz, centeio, Setaria sp., sorgo, cana de açúcar, painço amarelo, triticale, relva ou trigo. Em vários aspectos, a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é um nucleotídeo de dicotiledônea. Em vários aspectos, a dicotiledônea é couve, couve-flor, brócolis, planta de mostarda, repolho, ervilha, cravo-da-índia, alfafa, feijão-fava, tomate, mandioca, feijão-soja, canola, alfafa, girassol, cártamo, tabaco, Arabidopsis ou algodão. Em vários aspectos, a sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo homeobox WUS/WOX codifica uma sequência de aminoácidos que compreende qualquer uma dentre SEQ ID NOs:4, 6, 8, 10, 12, 14 ou 16. Em vários aspectos, a sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo homeobox WUS/WOX compreende qualquer uma dentre SEQ ID NOs:3, 5, 7, 9, 11, 13 ou 15. Em vários aspectos, o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é um polipeptídeo WUS1. Em vários aspectos, o polipeptídeo WUS1 é um polipeptídeo WUS1 de milho, sorgo, arroz ou Setaria sp. Em vários aspectos, o polipeptídeo WUS1 é um polipeptídeo WUS1 de milho ou arroz. Em vários aspectos, o polipeptídeo WUS1 é um polipeptídeo WUS1 de milho. Em vários aspectos, o polipeptídeo WUS1 compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4. Em vários aspectos, o polipeptídeo WUS1 é codificado por uma sequência de nucleotídeos que compreende SEQ ID NO: 3. Em vários aspectos, o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é um polipeptídeo WUS2. Em vários aspectos, o polipeptídeo WUS2 é um polipeptídeo WUS2 de milho, sorgo, arroz ou Setaria sp. Em vários aspectos, o polipeptídeo WUS2 é um polipeptídeo WUS2 de milho ou arroz. Em vários aspectos, o polipeptídeo WUS2 é um polipeptídeo WUS2 de milho. Em vários aspectos, o polipeptídeo WUS2 compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:6. Em vários aspectos, o polipeptídeo WUS2 é codificado por uma sequência de nucleotídeos que compreende SEQ ID NO: 5. Em vários aspectos, o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é um polipeptídeo WUS3. Em vários aspectos, o polipeptídeo WUS3 é um polipeptídeo WUS3 de milho, sorgo, arroz ou Setaria. Em vários aspectos, o polipeptídeo WUS3 é um polipeptídeo WUS3 de milho ou arroz. Em vários aspectos, o polipeptídeo WUS3 é um polipeptídeo WUS3 de milho. Em vários aspectos, o polipeptídeo WUS3 compreende a sequência de aminos de SEQ ID NO:8. Em vários aspectos, o polipeptídeo WUS3 é codificado por uma sequência de nucleotídeos que compreende SEQ ID NO:7. Em vários aspectos, o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é um polipeptídeo WOX5. Em vários aspectos, o polipeptídeo WOX5 é um polipeptídeo WOX5A. Em vários aspectos, o polipeptídeo WOX5 é um polipeptídeo WOX5 de milho, sorgo, arroz ou Setaria. Em vários aspectos, o polipeptídeo WOX5 é um polipeptídeo WOX5 de milho ou arroz. Em vários aspectos, o polipeptídeo WOX5 é um polipeptídeo WOX5 de milho. Em vários aspectos, o polipeptídeo WOX5 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14. Em vários aspectos, o polipeptídeo WOX5 é codificado por uma sequência de nucleotídeos que compreende SEQ ID NO: 13. Em vários aspectos, o polipeptídeo que compreende os dois domínios de ligação de AP2-DNA é um polipeptídeo ODP2, BBM2, BMN2 ou BMN3. Em vários aspectos, o polipeptídeo que compreende os dois domínios de ligação de AP2-DNA é um polipeptídeo de monocotiledônea. Em vários aspectos, a monocotiledônea é cevada, milho, painço, aveias, arroz, centeio, Setaria sp., sorgo, cana de açúcar, painço amarelo, triticale, relva ou trigo. Em vários aspectos, a monocotiledônea é milho, sorgo, arroz ou Setaria sp. Em vários aspectos, a monocotiledônea é milho ou arroz. Em vários aspectos, a monocotiledônea é milho. Em vários aspectos, o polipeptídeo que compreende os dois domínios de ligação de AP2-DNA é um polipeptídeo de dicotiledônea. Em vários aspectos, a dicotiledônea é couve, couve-flor, brócolis, planta de mostarda, repolho, ervilha, cravo-da-índia, alfafa, feijão-fava, tomate, mandioca, feijão-soja, canola, alfafa, girassol, cártamo, tabaco, Arabidopsis ou algodão. Em vários aspectos, o polipeptídeo que compreende os dois domínios de ligação de AP2-DNA compreende uma sequência de aminoácidos de qualquer uma dentre SEQ ID NO: 18, 20, 63, 65 ou 67. Em vários aspectos, o polipeptídeo que compreende os dois domínios de ligação de AP2-DNA é codificado por uma sequência de nucleotídeos que compreende qualquer uma dentre SEQ ID NO: 17, 19, 21, 62, 64, 66 ou 68. Em vários aspectos, o polipeptídeo que compreende os dois domínios de ligação de AP2-DNA é um polipeptídeo ODP2. Em vários aspectos, o polipeptídeo ODP2 é um polipeptídeo de monocotiledônea. Em vários aspectos, a monocotiledônea é cevada, milho, painço, aveias, arroz, centeio, Setaria sp., sorgo, cana de açúcar, painço amarelo, triticale, relva ou trigo. Em vários aspectos, a monocotiledônea é milho, arroz ou Setaria sp. Em vários aspectos, a monocotiledônea é milho ou arroz. Em vários aspectos, o ODP2 é um polipeptídeo de dicotiledônea. Em vários aspectos, a dicotiledônea é couve, couve-flor, brócolis, planta de mostarda, repolho, ervilha, cravo-da-índia, alfafa, feijão-fava, tomate, mandioca, feijão-soja, canola, alfafa, girassol, cártamo, tabaco, Arabidopsis ou algodão. Em vários aspectos, o polipeptídeo ODP2 compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma dentre SEQ ID NO: 18, 63, 65 ou 67. Em vários aspectos, o polipeptídeo ODP2 é codificado por uma sequência de nucleotídeos que compreende a sequência de qualquer uma dentre SEQ ID NO: 17, 21, 62, 64, 66, ou 68. Em vários aspectos, o polipeptídeo que compreende os dois domínios de ligação de AP2-DNA é um polipeptídeo BBM2. Em vários aspectos, o polipeptídeo BBM2 é um polipeptídeo de monocotiledônea. Em vários aspectos, a monocotiledônea é cevada, milho, painço, aveias, arroz, centeio, Setaria sp., sorgo, cana de açúcar, painço amarelo, triticale, relva ou trigo. Em vários aspectos, a monocotiledônea é milho, cana de açúcar, arroz ou Setaria sp. Em vários aspectos, a monocotiledônea é milho ou arroz. Em vários aspectos, a monocotiledônea é milho. Em vários aspectos, o polipeptídeo BBM2 é um polipeptídeo de dicotiledônea. Em vários aspectos, a dicotiledônea é couve, couve-flor, brócolis, planta de mostarda, repolho, ervilha, cravo-da-índia, alfafa, feijão-fava, tomate, mandioca, feijão-soja, canola, alfafa, girassol, cártamo, tabaco, Arabidopsis ou algodão. Em vários aspectos, o polipeptídeo BBM2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20. Em vários aspectos, o polipeptídeo BBM2 é codificado por uma sequência de nucleotídeos que compreende a sequência de SEQ ID NO: 19. Em vários aspectos, o explante é derivado de uma monocotiledônea. Em vários aspectos, a monocotiledônea é cevada, milho, painço, aveias, arroz, centeio, Setaria sp., sorgo, cana de açúcar, painço amarelo, triticale, relva ou trigo. Em vários aspectos, o explante é derivado de uma dicotiledônea. Em vários aspectos, a dicotiledônea é couve, couve-flor, brócolis, planta de mostarda, repolho, ervilha, cravo- da-índia, alfafa, feijão-fava, tomate, mandioca, feijão-soja, canola, alfafa, girassol, cártamo, tabaco, Arabidopsis ou algodão. Em vários aspectos, a estrutura de planta regenerável é formada dentro de cerca de 0 a cerca de 7 dias de transformação da célula ou dentro de cerca de 0 a cerca de 14 dias de transformação da célula. Em vários aspectos, o método é realizado na ausência de meio de enraizamento. Em vários aspectos, o método é realizado na presença de meio de enraizamento. Em vários aspectos, o explante é um embrião imaturo. Em vários aspectos, o embrião imaturo é um embrião imaturo de 1 a 5 mm. Em vários aspectos, o embrião imaturo é um embrião imaturo de 3,5 a 5 mm. Em vários aspectos, a citocinina exógena é usada durante a germinação após cerca de 7 dias de transformação da célula ou após cerca de 14 dias de transformação da célula. Em vários aspectos, a expressão de um polipeptídeo de (a) é transiente. Em vários aspectos, fornece-se uma semente da planta produzida pelo método.
[0030] Em um aspecto adicional, a presente revelação fornece métodos para produzir uma planta transgênica que compreende (a) transformar uma célula de um explante com um construto de expressão que compreende (i) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo homeobox WUS/WOX; ou (ii) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA; ou (iii) uma combinação de (i) e (ii); e (b) permitir a expressão do polipeptídeo de (a) em cada célula transformada para formar uma estrutura de planta regenerável na ausência de citocinina exógena, em que nenhum calo é formado, e em que a estrutura de planta regenerável é formada dentro de cerca de 0 a 7 dias ou cerca de 0 a 14 dias de transformação da célula; e (c) germinar a estrutura de planta regenerável de (b) para formar a planta transgênica em cerca de 14 dias a cerca de 60 dias. Em vários aspectos, o construto de expressão compreende tanto a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX quanto a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA. Em vários aspectos, o construto de expressão compreende a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX. Em vários aspectos, o construto de expressão compreende a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA. Em vários aspectos, a expressão da sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX e/ou a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2 ocorre menos de 1 dia, menos de 2 dias, menos de 5 dias, menos de 7 dias ou menos de cerca de 14 dias após iniciação da transformação. Em vários aspectos, a germinação é realizada na presença de citocinina exógena. Em vários aspectos, o construto de expressão compreende adicionalmente uma sequência de nucleotídeos que codifica uma recombinase específica a sítio. Em vários aspectos, a recombinase específica a sítio é FLP, Cre, SSV1, lambda Int, phi C31 Int, HK022, R, Gin, Tn1721, CinH, ParA, Tn5053, Bxb1, TP907-1 ou U153. Em vários aspectos, a recombinase específica a sítio é um peptídeo de fusão desestabilizado. Em vários aspectos, o peptídeo de fusão desestabilizado é TETR(L17G)~CRE ou ESR(L17G)~CRE. Em vários aspectos, a sequência de nucleotídeos que codifica uma recombinase específica a sítio é operacionalmente ligada a um promotor constitutivo, um promotor induzível ou um promotor regulado em desenvolvimento. Em vários aspectos, o promotor induzível é GLB1, OLE, LTP2, HSP17.7, HSP26 ou HSP18A. Em vários aspectos, o promotor induzível é um promotor quimicamente induzível. Em vários aspectos, o promotor quimicamente induzível é XVE. Em vários aspectos, o promotor quimicamente induzível é reprimido por TETR, ESR ou CR, e a não repressão ocorre mediante a adição de ligantes relacionados a tetraciclina ou sulfonilureia. Em vários aspectos, o repressor é TETR e o ligante relacionado a tetraciclina é doxiciclina ou anidrotetraciclina. Em vários aspectos, o repressor é ESR e o ligante de sulfonilureia é etametsulfurona, clorsulfurona, metsulfurona- metila, sulfometurona metila, clorimurona etila, nicosulfurona, primisulfurona, tribenurona, sulfosulfurona, trifloxisulfurona, foramsulfurona, iodosulfurona, prosulfurona, tifensulfurona, rimsulfurona, mesosulfurona ou halosulfurona. Em vários aspectos, a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é operacionalmente ligada a um promotor constitutivo. Em vários aspectos, o promotor constitutivo é UBI, LLDAV, EVCV, DMMV, BSV (AY) PRO, CYMV PRO FL, UBIZM PRO, SI-UB3 PRO, SB-UBI PRO (ALT1), USB1ZM PRO, ZM-GOS2 PRO, ZM-H1B PRO (1,2 KB), IN2-2, NOS, a versão -135 de 35S ou ZM-ADF PRO (ALT2). Em vários aspectos, a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é operacionalmente ligada a um promotor induzível ou um promotor regulado em desenvolvimento. Em vários aspectos, a sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA é operacionalmente ligada a um promotor induzível ou um promotor regulado em desenvolvimento. Em vários aspectos, o promotor regulado em desenvolvimento é um promotor PLTP. Em vários aspectos, o promotor PLTP é derivado de uma monocotiledônea. Em vários aspectos, a monocotiledônea é cevada, milho, painço, aveias, arroz, centeio, Setaria sp., sorgo, cana de açúcar, painço amarelo, triticale, relva ou trigo. Em vários aspectos, a monocotiledônea é milho, sorgo, arroz ou Setaria sp. Em vários aspectos, a monocotiledônea é milho, sorgo ou arroz. Em vários aspectos, a monocotiledônea é milho. Em vários aspectos, o promotor PLTP é derivado de uma dicotiledônea. Em vários aspectos, a dicotiledônea é couve, couve-flor, brócolis, planta de mostarda, repolho, ervilha, cravo-da-índia, alfafa, feijão-fava, tomate, mandioca, feijão-soja, canola, alfafa, girassol, cártamo, tabaco, Arabidopsis ou algodão. Em vários aspectos, o promotor PLTP compreende qualquer uma dentre SEQ ID NO: 1 a 2 ou 55 a 61. Em vários aspectos, o promotor PLTP compreende qualquer uma dentre SEQ ID NO: 1 ou 2. Em vários aspectos, o promotor induzível é um promotor induzível de auxina. Em vários aspectos, o promotor induzível de auxina é um AXIG1. Em vários aspectos, o promotor AXIG1 compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 39. Em vários aspectos, o promotor compreende um elemento de resposta de auxina. Em vários aspectos, o promotor contém um ou mais motivos intensificadores de DR5. Em vários aspectos, o promotor é um promotor constitutivo fraco modificado por repressão e não repressão. Em vários aspectos, uma ou mais sequências de operador no promotor foram posicionadas perto ou sobrepondo o TATA box e/ou o sítio de início de transcrição. Em vários aspectos, o promotor é NOS, AXIG1, ZM-GOS2, CC-UBI1-PRO ou ZM-ADF4-PRO. Em vários aspectos, o promotor é um promotor DR5 que compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 40. Em vários aspectos, o promotor é um promotor não reprimível. Em vários aspectos, o promotor não reprimível é TETR, ESR ou CR. Em vários aspectos, o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é um polipeptídeo WUS1, WUS2, WUS3, WOX2A, WOX4, WOX5 ou WOX9. Em vários aspectos, a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é um nucleotídeo de monocotiledônea. Em vários aspectos, a monocotiledônea é cevada, milho, painço, aveias, arroz, centeio, Setaria sp., sorgo, cana de açúcar, painço amarelo, triticale, relva ou trigo. Em vários aspectos, a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é um nucleotídeo de dicotiledônea. Em vários aspectos, a dicotiledônea é couve, couve- flor, brócolis, planta de mostarda, repolho, ervilha, cravo-da- índia, alfafa, feijão-fava, tomate, mandioca, feijão-soja, canola, alfafa, girassol, cártamo, tabaco, Arabidopsis ou algodão. Em vários aspectos, a sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo homeobox WUS/WOX codifica uma sequência de aminoácidos que compreende qualquer uma dentre SEQ ID NOs:4, 6, 8, 10, 12, 14 ou 16. Em vários aspectos, a sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo homeobox WUS/WOX compreende qualquer uma dentre SEQ ID NOs:3, 5, 7, 9, 11, 13 ou 15. Em vários aspectos, o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é um polipeptídeo WUS1. Em vários aspectos, o polipeptídeo WUS1 é um polipeptídeo WUS1 de milho, sorgo, arroz ou Setaria sp. Em vários aspectos, o polipeptídeo WUS1 é um polipeptídeo WUS1 de milho ou arroz. Em vários aspectos, o polipeptídeo WUS1 é um polipeptídeo WUS1 de milho. Em vários aspectos, o polipeptídeo WUS1 compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4. Em vários aspectos, o polipeptídeo WUS1 é codificado por uma sequência de nucleotídeos que compreende SEQ ID NO: 3. Em vários aspectos, o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é um polipeptídeo WUS2. Em vários aspectos, o polipeptídeo WUS2 é um polipeptídeo WUS2 de milho, sorgo, arroz ou Setaria sp. Em vários aspectos, o polipeptídeo WUS2 é um polipeptídeo WUS2 de milho ou arroz. Em vários aspectos, o polipeptídeo WUS2 é um polipeptídeo WUS2 de milho. Em vários aspectos, o polipeptídeo WUS2 compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:6. Em vários aspectos, o polipeptídeo WUS2 é codificado por uma sequência de nucleotídeos que compreende SEQ ID NO: 5. Em vários aspectos, o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é um polipeptídeo WUS3. Em vários aspectos, o polipeptídeo WUS3 é um polipeptídeo WUS3 de milho, sorgo, arroz ou Setaria. Em vários aspectos, o polipeptídeo WUS3 é um polipeptídeo WUS3 de milho ou arroz. Em vários aspectos, o polipeptídeo WUS3 é um polipeptídeo WUS3 de milho. Em vários aspectos, o polipeptídeo WUS3 compreende a sequência de aminos de SEQ ID NO:8. Em vários aspectos, o polipeptídeo WUS3 é codificado por uma sequência de nucleotídeos que compreende SEQ ID NO:7. Em vários aspectos, o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é um polipeptídeo WOX5. Em vários aspectos, o polipeptídeo WOX5 é um polipeptídeo WOX5A. Em vários aspectos, o polipeptídeo WOX5 é um polipeptídeo WOX5 de milho, sorgo, arroz ou Setaria. Em vários aspectos, o polipeptídeo WOX5 é um polipeptídeo WOX5 de milho ou arroz. Em vários aspectos, o polipeptídeo WOX5 é um polipeptídeo WOX5 de milho. Em vários aspectos, o polipeptídeo WOX5 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14. Em vários aspectos, o polipeptídeo WOX5 é codificado por uma sequência de nucleotídeos que compreende SEQ ID NO: 13. Em vários aspectos, o polipeptídeo que compreende os dois domínios de ligação de AP2-DNA é um polipeptídeo ODP2, BBM2, BMN2 ou BMN3. Em vários aspectos, o polipeptídeo que compreende os dois domínios de ligação de AP2-DNA é um polipeptídeo de monocotiledônea. Em vários aspectos, a monocotiledônea é cevada, milho, painço, aveias, arroz, centeio, Setaria sp., sorgo, cana de açúcar, painço amarelo, triticale, relva ou trigo. Em vários aspectos, a monocotiledônea é milho, sorgo, arroz ou Setaria sp. Em vários aspectos, a monocotiledônea é milho ou arroz. Em vários aspectos, a monocotiledônea é milho. Em vários aspectos, o polipeptídeo que compreende os dois domínios de ligação de AP2-DNA é um polipeptídeo de dicotiledônea. Em vários aspectos, a dicotiledônea é couve, couve-flor, brócolis, planta de mostarda, repolho, ervilha, cravo-da-índia, alfafa, feijão-fava, tomate, mandioca, feijão-soja, canola, alfafa, girassol, cártamo, tabaco, Arabidopsis ou algodão. Em vários aspectos, o polipeptídeo que compreende os dois domínios de ligação de AP2-DNA compreende uma sequência de aminoácidos de qualquer uma dentre SEQ ID NO: 18, 20, 63, 65 ou 67. Em vários aspectos, o polipeptídeo que compreende os dois domínios de ligação de AP2-DNA é codificado por uma sequência de nucleotídeos que compreende qualquer uma dentre SEQ ID NO: 17, 19, 21, 62, 64, 66 ou 68. Em vários aspectos, o polipeptídeo que compreende os dois domínios de ligação de AP2-DNA é um polipeptídeo ODP2. Em vários aspectos, o polipeptídeo ODP2 é um polipeptídeo de monocotiledônea. Em vários aspectos, a monocotiledônea é cevada, milho, painço, aveias, arroz, centeio, Setaria sp., sorgo, cana de açúcar, painço amarelo, triticale, relva ou trigo. Em vários aspectos, a monocotiledônea é milho, arroz ou Setaria sp. Em vários aspectos, a monocotiledônea é milho ou arroz. Em vários aspectos, o ODP2 é um polipeptídeo de dicotiledônea. Em vários aspectos, a dicotiledônea é couve, couve-flor, brócolis, planta de mostarda, repolho, ervilha, cravo-da-índia, alfafa, feijão-fava, tomate, mandioca, feijão-soja, canola, alfafa, girassol, cártamo, tabaco, Arabidopsis ou algodão. Em vários aspectos, o polipeptídeo ODP2 compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma dentre SEQ ID NO: 18, 63, 65 ou 67. Em vários aspectos, o polipeptídeo ODP2 é codificado por uma sequência de nucleotídeos que compreende a sequência de qualquer uma dentre SEQ ID NO: 17, 21, 62, 64, 66, ou 68. Em vários aspectos, o polipeptídeo que compreende os dois domínios de ligação de AP2-DNA é um polipeptídeo BBM2. Em vários aspectos, o polipeptídeo BBM2 é um polipeptídeo de monocotiledônea. Em vários aspectos, a monocotiledônea é cevada, milho, painço, aveias, arroz, centeio, Setaria sp., sorgo, cana de açúcar, painço amarelo, triticale, relva ou trigo. Em vários aspectos, a monocotiledônea é milho, cana de açúcar, arroz ou Setaria sp. Em vários aspectos, a monocotiledônea é milho ou arroz. Em vários aspectos, a monocotiledônea é milho. Em vários aspectos, o polipeptídeo BBM2 é um polipeptídeo de dicotiledônea. Em vários aspectos, a dicotiledônea é couve, couve-flor, brócolis, planta de mostarda, repolho, ervilha, cravo-da-índia, alfafa, feijão-fava, tomate, mandioca, feijão-soja, canola, alfafa, girassol, cártamo, tabaco, Arabidopsis ou algodão. Em vários aspectos, o polipeptídeo BBM2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20. Em vários aspectos, o polipeptídeo BBM2 é codificado por uma sequência de nucleotídeos que compreende a sequência de SEQ ID NO: 19. Em vários aspectos, o explante é derivado de uma monocotiledônea. Em vários aspectos, a monocotiledônea é cevada, milho, painço, aveias, arroz, centeio, Setaria sp., sorgo, cana de açúcar, painço amarelo, triticale, relva ou trigo. Em vários aspectos, o explante é derivado de uma dicotiledônea. Em vários aspectos, a dicotiledônea é couve, couve-flor, brócolis, planta de mostarda, repolho, ervilha, cravo- da-índia, alfafa, feijão-fava, tomate, mandioca, feijão-soja, canola, alfafa, girassol, cártamo, tabaco, Arabidopsis ou algodão. Em vários aspectos, o método é realizado na ausência de meio de enraizamento. Em vários aspectos, o método é realizado na presença de meio de enraizamento. Em vários aspectos, o explante é um embrião imaturo. Em vários aspectos, o embrião imaturo é um embrião imaturo de 1 a 5 mm. Em vários aspectos, o embrião imaturo é um embrião imaturo de 3,5 a 5 mm. Em vários aspectos, a citocinina exógena é usada durante a germinação após cerca de 7 dias de transformação da célula ou após cerca de 14 dias de transformação da célula. Em vários aspectos, a expressão de um polipeptídeo de (a) é transiente. Em vários aspectos, fornece-se uma semente da planta produzida pelo método.
[0031] Em um aspecto, a presente revelação fornece adicionalmente kits que compreendem (a) um construto de expressão que compreende (i) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo homeobox WUS/WOX; ou (ii) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA; ou (iii) uma combinação de (i) e (ii); e (b) instruções para obter uma estrutura regenerável de planta na ausência de citocinina exógena, em que nenhum calo é formado. Em vários aspectos, o kit fornece instruções para obter uma planta transformada dentro de cerca de 14 dias a cerca de 60 dias. Em vários aspectos, o kit fornece instruções para obter uma planta a partir de um explante transformado com o uso do kit.
[0032] Em um aspecto, a presente revelação fornece adicionalmente kits que compreendem (a) um construto de expressão que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo homeobox WUS/WOX; e (b) instruções para obter uma estrutura regenerável de planta na ausência de citocinina exógena, em que nenhum calo é formado. Em vários aspectos, o kit fornece instruções para obter uma planta transformada dentro de cerca de 14 dias a cerca de 60 dias. Em vários aspectos, o kit fornece instruções para obter uma planta a partir de um explante transformado com o uso do kit.
[0033] Em um aspecto, a presente revelação fornece adicionalmente kits que compreendem (a) um construto de expressão que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA; ou (iii) uma combinação de (i) e (ii); e (b) instruções para obter uma estrutura regenerável de planta na ausência de citocinina exógena, em que nenhum calo é formado. Em vários aspectos, o kit fornece instruções para obter uma planta transformada dentro de cerca de 14 dias a cerca de 60 dias. Em vários aspectos, o kit fornece instruções para obter uma planta a partir de um explante transformado com o uso do kit.
[0034] Em um aspecto adicional, a presente revelação fornece uma semente da planta produzida a partir dos métodos revelada no presente documento.
[0035] O arquivo de patente ou pedido contém pelo menos um desenho executado em cor. As cópias desta patente ou publicação de pedido de patente com desenho (ou desenhos) com cor serão fornecidas pelo Escritório mediante solicitação e pagamento da taxa necessária.
[0036] A Figura 1 mostra uma imagem representativa de um embrião imaturo tratado com o uso dos métodos revelados (consulte o Exemplo 5). As setas indicam embriões formados recentemente representativos na superfície que segue o tratamento.
[0037] A Figura 2 mostra uma imagem representativa de um embrião imaturo tratado com o uso dos métodos revelados (consulte o Exemplo 5). A imagem mostra embriões fluorescentes na superfície que segue o tratamento.
[0038] A Figura 3 mostra uma imagem representativa de múltiplos embriões somáticos maduros derivados de um único embrião imaturo zigótico original obtido com o uso dos métodos revelados (consulte o Exemplo 7) após crescimento no meio de maturação por 13 dias.
[0039] A Figura 4 mostra uma imagem representativa de plantas obtidas a partir de 45 embriões imaturos zigóticos originalmente transformados com o uso dos métodos revelados (consulte o Exemplo 7).
[0040] A Figura 5 mostra brotos de germinação precoce derivados de embriões somáticos rapidamente formados duas semanas após a infecção por Agrobacterium de embriões imaturos da variedade de trigo Pioneer elite Spring HC0456D.
[0041] A Figura 6 mostra uma imagem representativa de divisões anticlínicas precoces na superfície do escutelo (setas) de um embrião zigótico imaturo dois dias após a transfecção por Agrobacterium.
[0042] A Figura 7 mostra uma imagem representativa de um embrião somático globular pequeno formando-se na superfície do escutelo a partir de um embrião zigótico imaturo transfectado dois dias após a transfecção por Agrobacterium.
[0043] A Figura 8 mostra uma imagem representativa de um embrião somático globular maior formando-se na superfície do escutelo a partir do embrião zigótico imaturo transfectado dois dias após a transfecção por Agrobacterium.
[0044] A Figura 9 mostra uma imagem representativa de um embrião somático de estágio de transição que se formou na superfície do escutelo a partir do embrião zigótico imaturo transfectado quatro dias após a transfecção por Agrobacterium, mostrando a superfície suave do embrião somático e a falta de conexões vasculares com o embrião zigótico subjacente.
[0045] A Figura 10 mostra uma imagem representativa de múltiplos embriões somáticos de estágio de transição que se formaram na superfície do escutelo a partir do embrião zigótico imaturo transfectado quatro dias após a transfecção por Agrobacterium, demonstrando que os embriões somáticos em muita proximidade foram derivados da superfície do embrião zigótico subjacente e não através da embriogênese somática secundária.
[0046] A Figura 11 mostra uma imagem de ampliação maior representativa que demostra o alto índice mitótico dentro dos embriões somáticos em desenvolvimento, conforme indicado pelas estruturas de metafase e anáfase observadas em múltiplas células dentro do campo de visão (conforme indicado pelas setas).
[0047] A Figura 12 mostra um embrião imaturo de milho 10 dias após ser transformado com um T-DNA contendo AXIG1 PRO::WUS2 com PLTP PRO::BBM. Vários embriões somáticos, alguns dos quais se fundiram à medida que se desenvolveram, e uma folha em desenvolvimento precoce são observados crescendo a partir da superfície do escutelo. Após manchamento por 20 minutos com Óleo Vermelho O, e lavagem dupla em 70% de isoproponol, os lipídios que se acumularam durante o desenvolvimento de embrião somático mancados de vermelho (setas pretas), enquanto a folha em desenvolvimento (etiquetada com uma seta branca) e o escutelo zigótico originalmente transformado (etiquetado com uma seta branca) acumulou pouquíssimas manchas indicando o típico nível mais baixo de deposição lipídica nesses tecidos.
[0048] A Figura 13 mostra uma micrografia de luz de células de embrião somático após o embrião ser pressionado entre uma lamínula e uma lâmina e, então, manchada com Óleo Vermelho O. as gotículas de lipídio de manchamento com Vermelho (conforme exemplificado pelas setas pretas) foram claramente observadas dispersas dentro das células.
[0049] A Figura 14 mostra a quantificação de transcrição Illumina para um gene EF1A de soja constitutivamente expresso que é expresso através de todos os tecidos vegetais amostrados.
[0050] A Figura 15 mostra quantificação de transcrição Illumina para o gene LTP3 específico a embrião/semente, sendo que os respectivos níveis de transcrição são indicativos de atividade de promotor em vários órgãos de planta e diferentes estágios de desenvolvimento.
[0051] A Figura 16 mostra a resposta de transformação conforme medida pela frequência de cotiledôneas imaturas tratadas que produziram embriões somáticos após transformação mediada por Agrobacterium para introduzir um T-DNA contendo um cassete de expressão com o gene WUS de Arabidopsis atrás de cinco promotores; promotor Gm-Fitocromo P450 (P450 PRO); promotor Gm-Glicosil Hidrolase (GH PRO); promotor de proteína de Gm-Homeodomínio/domínio Start (HSD PRO); promotor Gm-LTP3 (LTP3 PRO); promotor Gm- Estrictosidina Sintase Tipo 1(SSL1 PRO); o controle negativo sem expressão de WUS (NEG CON). Para cada promotor, as extremidades superior e inferior da caixa indicam o quartil superior e inferior para a distribuição dos dados, enquanto a linha dentro da caixa representa a mediana. Para o P450 PRO apenas duas réplicas foram incluídas nessa análise e, então, nenhuma mediana foi calculada.
[0052] A Figura 17A mostra uma micrografia de luz e a Figura 17B mostra a imagem epifluorescente correspondente de embriões somáticos que foram movidos para o meio de maturação para concluir o desenvolvimento do embrião (mostrado no meio de maturação 35 dias após a cotiledônea imatura subjacente ser transformada com um T-DNA contendo Gm-LTP3 PRO::At-WUS). A seta aponta para uma das cotiledôneas somáticas fluorescentes vermelhas; as barras de escala representam 2 mm de comprimento.
[0053] As revelações no presente documento serão descritas mais completamente doravante com referência aos desenhos anexos, em que alguns, porém não todos, os aspectos possíveis são mostrados. De fato, as revelações podem ser incorporadas em muitas formas diferentes e não devem ser interpretadas como limitadas aos aspectos apresentados no presente documento; em vez disso, esses aspectos são fornecidos de modo que esta invenção satisfaça os requisitos legais aplicáveis.
[0054] Muitas modificações e outros aspectos revelados no presente documento serão percebidos por um versado na técnica a qual as composições e métodos revelados pertencem que têm o benefício dos ensinamentos apresentados nas descrições a seguir e nos desenhos associados. Portanto, deve-se entender que as invenções não devem ser limitadas aos aspectos específicos revelados e que modificações e outros aspectos são concebidos como estando incluídos dentro do escopo das reivindicações anexas. Embora termos específicos sejam empregados no presente documento, os mesmos são usados em um sentido genérico e descritivo apenas e não com propósitos de limitação.
[0055] Deve-se entender também que a terminologia usada no presente documento se destina a descrever somente aspectos específicos e não pretende ser limitativa. Conforme usado no relatório descritivo e nas reivindicações, o termo "que compreende" pode incluir o aspecto de "que consiste em". A menos que sejam definidos de outro modo, todos os termos técnicos e científicos usados no presente documento têm o mesmo significado como comumente entendido por uma pessoa com habilidade comum na técnica à qual as composições e os métodos revelados pertencem. Neste relatório descritivo e nas reivindicações a seguir, será feita referência a diversos termos que serão definidos no presente documento.
[0056] A presente revelação compreende métodos e composições para produzir uma planta transgênica que compreende (a) transformar uma célula de um explante com um construto de expressão que compreende: (i) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo homeobox WUS/WOX; (ii) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA; ou (iii) uma combinação de (i) e (ii); e (b) permitir a expressão do polipeptídeo de (a) em cada célula transformada para formar uma estrutura de planta regenerável na ausência de citocinina exógena, em que nenhum calo é formado; e (c) germinar a estrutura de planta regenerável para formar a planta transgênica. A estrutura de planta regenerável é produzida dentro de cerca de 0 a 7 dias ou cerca de 0 a 14 dias de transformação. Em um aspecto, a germinação compreende transferir a estrutura de planta regenerável para um meio de maturação que compreende uma citocinina exógena e forma a planta transgênica. Em um aspecto, a sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo homeobox WUS/WOX tem capacidade de estimular a formação de uma estrutura de planta regenerável. Em um aspecto, a sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA tem capacidade de estimular a formação de uma estrutura de planta regenerável.
[0057] Em um aspecto, a expressão do polipeptídeo de (a) em cada célula transformada do método é controlada. A expressão controlada é pulsada por um período de tempo específico. O controle de expressão do polipeptídeo de (a) pode ser obtido por meio de uma variedade de métodos conforme revelado no presente documento abaixo.
[0058] Deve-se compreender que os métodos da presente revelação produzem estruturas de planta regenerável únicas que se formam diretamente a partir de uma única célula sobre, ou dentro, o explante que foi transformado, sem proliferação de célula ou tecido derivada de única célula interveniente que ocorre antes da iniciação da estrutura de planta regenerável. Em contrapartida, os métodos descritos anteriormente da transformação e regeneração conhecidos na técnica envolvem proliferação de célula ou tecido derivada de única célula interveniente, que compreendem tipos de padrões de crescimento denominados como calo, calo não diferenciados, calo embriogênico e calo organogênico. Em vários aspectos, o termo "calo" se refere a um nódulo de célula não diferenciado sob crescimento descontrolado. Um calo pode ser obtido cultivando-se uma célula diferenciada de um tecido vegetal em um meio que contém um regulador de crescimento de planta como auxina (por exemplo, 2,4-D) ou citoquinina (em que o meio com citoquinina é denominado como meio de diferenciação). Exemplos de auxinas que podem ser adicionados ao meio de cultura de tecido para estimular a embriogênese incluem as auxinas de ocorrência natural como ácido indol-3-acético (IAA), ácido cloroindol-3-acético (CL-IAA), ácido 2-fenilacético (PAA), ácido indol-3-propiônico (IPA) e ácido indol-3-butérico (IBA), além de auxinas sintéticas como ácido 1-naftalenoacético (NAA), ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) e ácido 2,4,5- triclorofenoxiacético (2,4,5-T). Exemplos de citoquininas que podem ser adicionados ao meio de cultura de tecido para estimular morfogênese (e, em particular, desenvolvimento de maristema e broto) incluem benzilaminopurina (BAP), zeatina, cinetina, tidiazurona (TDZ), meta-topolina e metóxi-topolinas. Auxinas e citoquininas que são adicionadas ao meio de cultura de tecido são exógenas. Deve-se compreender adicionalmente que os métodos anteriormente descritos de transformação e regeneração conhecidos na técnica envolvem proliferação de tecido ou derivada de célula pequena, que compreendem tipos de padrões de crescimento referidos como proliferação de maristema, que abrange formação de maristema de novo (Gordon Kamm et al. (2007) Development 134: 3.539 a 3.548), formação de múltiplos brotos (Zhong et al. (1992) Planta 187:483 a 489) e cultura de tecido verde (Cho et al. (1998) Plant Sci 138:229 a 244; Cho et al. (2004) Plant Cell Rep 22:483 a 489), todos requerem citoquinina no meio (por exemplo, US8395020B2; US8581035B2).
[0059] Nos métodos revelados, vários explantes podem ser usados, incluindo embriões imaturos, embriões zigóticos de 1 a 5 mm, embriões de 3 a 5 mm, e embriões derivados de semente derivada de espiga madura, bases de folha, folhas de plantas maduras, pontas de folha, influorescências imaturas, panícula, espiga imatura e sedas. Em vários aspectos, o explante derivado de planta usado para transformação inclui embriões imaturos, embriões zigóticos de 1 a 5 mm e embriões de 3,5 a 5 mm. Em um aspecto, os embriões usados nos métodos revelados podem ser derivados de semente derivada de espiga madura, bases de folha, folhas de plantas maduras, pontas de folha, influorescências imaturas, panícula, espiga imatura e sedas.
[0060] A estrutura de planta regenerável é definida como uma estrutura multicelular com capacidade de formar uma planta fértil totalmente funcional, como, mas sem limitação, embriões somáticos, calo embriogênico, maristemas somáticos e/ou calo organogênico.
[0061] O embrião somático é definido como uma estrutura multicelular que progride através de estágios de desenvolvimento que são semelhantes ao desenvolvimento de um embrião zigótico, incluindo formação de embriões de estágio globular e de transição, formação de um eixo geométrico do embrião e um escutelo, e acúmulo de lipídios e amido. Os únicos embriões somáticos derivados de um embrião zigótico germinam para produzir únicas plantas não quiméricas, que podem derivar originalmente de uma única célula.
[0062] O calo embriogênico é definido como um a mistura friável ou não friável de células não diferenciadas ou particularmente não diferenciadas que subtendem proliferar embriões somáticos primários e secundários com capacidade de regenerar plantas férteis maduras.
[0063] O maristema somático é definido como uma estrutura multicelular que é semelhante ao maristema apical que é parte de um embrião derivado de semente, caracterizado como tendo um domo apical não diferenciado flanqueado por folha primordial e subtendido por iniciais vasculares, sendo que o domo apical origina uma planta vegetativa acima do solo. Tais maristemas somáticos podem formar agrupamentos únicos ou fundidos de meristemas.
[0064] O calo organogênico é definido como uma mistura compacta de estruturas de plantas em crescimento diferenciadas, incluindo, mas sem limitação, meristemas apicais, meristemas radiculares, folhas e raízes.
[0065] A germinação é o crescimento de uma estrutura regenerável para formar uma plântula que continua a crescer para produzir uma planta.
[0066] Uma planta transgênica é definida como uma planta madura, fértil que contém um transgene.
[0067] O explante usado nos métodos pode ser derivado de uma monocotiledônea, incluindo, mas sem limitação, cevada, milho, painço, aveias, arroz, centeio, Setaria sp., sorgo, cana de açúcar, painço amarelo, triticale, relva ou trigo. Alternativamente, o explante usado nos métodos revelados pode ser derivado de uma dicotiledônea, incluindo, mas sem limitação, couve, couve-flor, brócolis, planta de mostarda, repolho, ervilha, cravo-da-índia, alfafa, feijão-fava, tomate, mandioca, feijão-soja, canola, alfafa, girassol, cártamo, tabaco, Arabidopsis ou algodão.
[0068] Em outro aspecto, o explante usado nos métodos revelados pode ser derivado de uma planta que é um membro da família Poaceae. Os exemplos não limitantes de plantas adequadas das quais um explante da revelação pode ser derivado incluem culturas de grãos, incluindo, mas sem limitação, cevada, milho (milho), aveias, arroz, cevada, sorgo, trigo, painço, triticale; culturas de folhas e caules, incluindo, mas sem limitação, bambu, grama do marram, poa dos prados, juncos, azevém, cana de açúcar; gramados, gramíneas ornamentais, e outras gramíneas como painço amarelo e relva.
[0069] Em um aspecto adicional, o explante usado nos métodos revelados pode ser derivado de qualquer planta, incluindo plantas maiores, por exemplo, classes de Angiospermae e Gymnospermae. As plantas das subclasses da Dicotylodenae e da Monocotyledonae são adequadas. As espécies adequadas podem vir da família Acanthaceae, Alliaceae, Alstroemeriaceae, Amaryllidaceae, Apocynaceae, Arecaceae, Asteraceae, Berberidaceae, Bixaceae, Brassicaceae, Bromeliaceae, Cannabaceae, Caryophyllaceae, Cephalotaxaceae, Chenopodiaceae, Colchicaceae, Cucurbitaceae, Dioscoreaceae, Ephedraceae, Erythroxylaceae, Euphorbiaceae, Fabaceae, Lamiaceae, Linaceae, Lycopodiaceae, Malvaceae, Melanthiaceae, Musaceae, Myrtaceae, Nyssaceae, Papaveraceae, Pinaceae, Plantaginaceae, Poaceae, Rosaceae, Rubiaceae, Salicaceae, Sapindaceae, Solanaceae, Taxaceae, Theaceae e Vitaceae.
[0070] As espécies adequadas das quais o explante usado nos métodos revelados pode ser derivado incluem membros do gênero Abelmoschus, Abies, Acer, Agrostis, Allium, Alstroemeria, Ananas, Andrographis, Andropogon, Artemisia, Arundo, Atropa, Berberis, Beta, Bixa, Brassica, Calendula, Camellia, Camptotheca, Cannabis, Capsicum, Carthamus, Catharanthus, Cephalotaxus, Chrysanthemum, Cinchona, Citrullus, Coffea, Colchicum, Coleus, Cucumis, Cucurbita, Cynodon, Datura, Dianthus, Digitalis, Dioscorea, Elaeis, Ephedra, Erianthus, Erythroxylum, Eucalyptus, Festuca, Fragaria, Galanthus, Glycine, Gossypium, Helianthus, Hevea, Hordeum, Hyoscyamus, Jatropha, Lactuca, Linum, Lolium, Lupinus, Lycopersicon, Lycopodium, Manihot, Medicago, Mentha, Miscanthus, Musa, Nicotiana, Oryza, Panicum, Papaver, Parthenium, Pennisetum, Petunia, Phalaris, Phleum, Pinus, Poa, Poinsettia, Populus, Rauwolfia, Ricinus, Rosa, Saccharum, Salix, Sanguinaria, Scopolia, Secale, Solanum, Sorghum, Spartina, Spinacea, Tanacetum, Taxus, Theobroma, Triticosecale, Triticum, Uniola, Veratrum, Vinca, Vitis e Zea.
[0071] Em outro aspecto, o explante usado nos métodos revelados pode ser derivado de uma planta que é importante ou interessante para agricultura, horticultura, biomassa para a produção de moléculas de combustível líquido e outros produtos químicos e/ou silvicultura. Os exemplos não limitantes incluem, por exemplo, Panicum virgatum (painço amarelo), Sorghum bicolor (sorgo, milho- zaburro), Miscanthus giganteus (miscanto), Saccharum sp. (cana de açúcar), Populus balsamifera (álamo-trémulo), Zea mays (milho), Glycine max (feijão-soja), Brassica napus (canola), Triticum aestivum (trigo), Gossypium hirsutum (algodão), Oryza sativa (arroz), Helianthus annuus (girassol), Medicago sativa (alfafa), Beta vulgaris (beterraba sacarina), Pennisetum glaucum (milheto), Panicum spp., Sorghum spp., Miscanthus spp., Saccharum spp., Erianthus spp., Populus spp., Andropogon gerardii (vetiver grande), Pennisetum purpureum (capim-elefante), Phalaris arundinacea (capim- amarelo), Cynodon dactylon (capim-das-bermudas), Festuca arundinacea (festuca-alta), Spartina pectinata (cordilheira de pradaria), Arundo donax (cana-do-reino), Secale cereale (centeio), Salix spp. (epilóbio), Eucalyptus spp. (eucalipto), Triticosecale spp. (triticum - trigo X centeio), Bambu, Carthamus tinctorius (cártamo), Jatropha curcas (jatropha), Ricinus communis (rícino), Elaeis guineensis (palma), Linum usitatissimum (linhaça), Brassica juncea, Manihot esculenta (mandioca), Lycopersicon esculentum (tomate), Lactuca sativa (alface), Musa paradisiaca (banana), Solanum tuberosum (batata), Brassica oleracea (brócolis, couve-flor, couve-de-bruxelas), Camellia sinensis (chá), Fragaria ananassa (morango), Theobroma cacao (cacau), Coffea arabica (café), Vitis vinifera (uva), Ananas comosus (abacaxi), Capsicum annum (jalapeno), Allium cepa (cebola), Cucumis melo (melão), Cucumis sativus (pepino), Cucurbita maxima (abóbora), Cucurbita moschata (abóbora), Spinacea oleracea (espinafre), Citrullus lanatus (melancia), Abelmoschus esculentus (quiabo), Solanum melongena (beringela), Papaver somniferum (papoula do ópio), Papaver orientale, Taxus baccata, Taxus brevifolia, Artemisia annua, Cannabis sativa, Camptotheca acuminate, Catharanthus roseus, Vinca rosea, Cinchona officinalis, Colchicum autumnale, Veratrum californica., Digitalis lanata, Digitalis purpurea, Dioscorea spp., Andrographis paniculata, Atropa belladonna, Datura stomonium, Berberis spp., Cephalotaxus spp., Ephedra sinica, Ephedra spp., Erythroxylum coca, Galanthus wornorii, Scopolia spp., Lycopodium serratum (=Huperzia serrata), Lycopodium spp., Rauwolfia serpentina, Rauwolfia spp., Sanguinaria canadensis, Hyoscyamus spp., Calendula officinalis, Chrysanthemum parthenium, Coleus forskohlii, Tanacetum parthenium, Parthenium argentatum (guayule), Hevea spp. (borracha), Mentha spicata (menta), Mentha piperita (menta), Bixa orellana, Alstroemeria spp., Rosa spp. (rosa), Dianthus caryophyllus (cravo), Petunia spp. (petúnia), Poinsettia pulcherrima (poinsétia), Nicotiana tabacum (tabaco), Lupinus albus (tremoço), Uniola paniculata (aveia), bentgrass (Agrostis spp.), Populus tremuloides (faia), Pinus spp. (pinheiro), Abies spp. (abeto), Acer spp. (bordo), Hordeum vulgare (cevada), Poa pratensis (cabelo-de-cão), Lolium spp. (azevém), Phleum pratense (erva-dos-prados) e coníferas. São de interesse plantas cultivadas para produção de energia, assim chamadas culturas de energia, tais como culturas de energia à base de celulose como Panicum virgatum (painço amarelo), Sorghum bicolor (sorgo, milho-zaburro), Miscanthus giganteus (miscanto), Saccharum sp. (cana de açúcar), Populus balsamifera (álamo-trémulo), Andropogon gerardii (vetiver grande), Pennisetum purpureum (capim-elefante), Phalaris arundinacea (capim- amarelo), Cynodon dactylon (capim-das-bermudas), Festuca arundinacea (festuca-alta), Spartina pectinata (cordilheira de pradaria), Medicago sativa (alfafa), Arundo donax (cana-do-reino), Secale cereale (centeio), Salix spp. (epilóbio), Eucalyptus spp. (eucalipto), Triticosecale spp. (triticum - trigo X centeio) e Bambu; e culturas de energia à base de amido como Zea mays (milho) e Manihot esculenta (mandioca); e culturas de energia à base de sacarose como Saccharum sp. (cana de açúcar) e Beta vulgaris (beterraba sacarina); e culturas de energia produtoras de biodiesel como Glycine max (feijão-soja), Brassica napus (canola), Helianthus annuus (girassol), Carthamus tinctorius (cártamo), Jatropha curcas (jatropha), Ricinus communis (rícino), Elaeis guineensis (palma), Linum usitatissimum (linhaça) e Brassica juncea.
[0072] Conforme usado no presente documento, uma "planta de fonte de energia renovável de biomassa" significa ter ou produzir material (bruto ou processado) que compreende energia solar armazenada que pode ser convertida em energia elétrica, combustíveis líquidos e outros produtos químicos úteis. Em termos gerais, tais plantas compreendem culturas de energia dedicadas assim como plantas agrícolas e lenhosas. Os exemplos de plantas de fonte de energia renovável de biomassa incluem: Panicum virgatum (painço amarelo), Sorghum bicolor (sorgo, milho-zaburro), Miscanthus giganteus (miscanto), Saccharum sp. (cana de açúcar), Populus balsamifera (álamo-trémulo), Andropogon gerardii (vetiver grande), Pennisetum purpureum (capim-elefante), Phalaris arundinacea (capim-amarelo), Cynodon dactylon (capim-das-bermudas), Festuca arundinacea (festuca-alta), Spartina pectinata (cordilheira de pradaria), Medicago sativa (alfafa), Arundo donax (cana-do-reino), Secale cereale (centeio), Salix spp. (epilóbio), Eucalyptus spp. (eucalipto), Triticosecale spp. (triticum - trigo X centeio), Bambu, Zea mays (milho) e Manihot esculenta (mandioca), Saccharum sp. (cana de açúcar) e Beta vulgaris (beterraba sacarina), Glycine max (feijão-soja), Brassica napus (canola), Helianthus annuus (girassol), Carthamus tinctorius (cártamo), Jatropha curcas (jatropha), Ricinus communis (rícino), Elaeis guineensis (palma), Linum usitatissimum (linhaça) e Brassica juncea.
[0073] Em um aspecto, o construto de expressão compreende tanto uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo homeobox WUS/WOX quanto uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA. Em vários aspectos, a expressão de uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo homeobox WUS/WOX e uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2 ocorre por menos de 1 dia, menos de 2 dias, menos de 5 dias, menos de 7 dias ou menos de 14 dias após iniciação da transformação.
[0074] Em um aspecto, o construto de expressão compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo homeobox WUS/WOX. Em vários aspectos, a expressão de uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo homeobox WUS/WOX ocorre por menos de 1 dia, menos de 2 dias, menos de 5 dias, menos de 7 dias ou menos de 14 dias após iniciação da transformação.
[0075] Em um aspecto, o construto de expressão compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA. Em vários aspectos, a expressão de uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2 ocorre por menos de 1 dia, menos de 2 dias, menos de 5 dias, menos de 7 dias, ou menos de 14 dias após iniciação da transformação.
[0076] Em um aspecto, a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX; a sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA; ou ambas as sequências de nucleotídeos podem ser direcionadas para a excisão por uma recombinase específica a sítio. Desse modo, a expressão da sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX; a sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA; ou ambas as sequências de nucleotídeos podem ser controladas por excisão em uma pós-transformação de tempo desejada. Compreende-se que quando uma recombinase específica a sítio é usada para controlar a expressão da sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX; a sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA; ou ambas as sequências de nucleotídeos no construto de expressão, o construto de expressão compreende sítios de excisão específicos a sítio adequados que flanqueiam as sequências de polinucleotídeos a serem excisadas, por exemplo, sítios Cre lox se Cre recombinase for utilizada. Não é necessário que a recombinase específica a sítio seja colocalizada no construto de expressão que compreende a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX; a sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA; ou ambas as sequências de nucleotídeos. No entanto, em um aspecto, o construto de expressão compreende adicionalmente uma sequência de nucleotídeos que codifica uma recombinase específica a sítio.
[0077] A recombinase específica a sítio usada para controlar a expressão da sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX; a sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA; ou ambas as sequências de polinucleotídeos, pode ser escolhida a partir de uma variedade de recombinases específicas a sítio adequadas. Por exemplos, em vários aspectos, a recombinase específica a sítio é FLP, Cre, SSV1, lambda Int, phi C31 Int, HK022, R, Gin, Tn1721, CinH, ParA, Tn5053, Bxb1, TP907-1 ou U153. A recombinase específica a sítio pode ser um peptídeo de fusão desestabilizado. O peptídeo de fusão desestabilizado pode ser TETR(G17A)~CRE ou ESR(G17A)~CRE.
[0078] Em um aspecto, a sequência de nucleotídeos que codifica uma recombinase específica a sítio é operacionalmente ligada a um promotor constitutivo, um promotor induzível ou um promotor regulado em desenvolvimento. Os promotores regulados em desenvolvimento adequados incluem, GLB1, OLE, e Proteína de Transferência de Lipídio2 (LTP2) (Kalla et al., 1994. Plant J. 6:849 a 860 e US5525716). Os promotores induzíveis adequados incluem promotores de choque térmico ambientalmente induzíveis incluindo HSP17.7, HSP26 ou HSP18A. Alternativamente, o promotor induzível operacionalmente ligado à recombinase específica a sítio pode ser um promotor quimicamente induzível, por exemplo, o promotor XVE.
[0079] Em um aspecto, o promotor quimicamente induzível operacionalmente ligado à recombinase específica a sítio é XVE. O promotor quimicamente induzível pode ser reprimido pelo repressor de tetraciclina (TETR), pelo repressor de etametsulfurona (ESR) ou pelo repressor de clorsulfurona (CR) e a não repressão ocorre mediante a adição de ligantes relacionados a tetraciclina ou sulfonilureia. O repressor pode ser TETR e o ligante relacionado a tetraciclina é doxiciclina ou anidrotetraciclina. (Gatz, C., Frohberg, C. e Wendenburg, R. (1992) Stringent repression and homogeneous de-repression by tetracycline of a modified CaMV 35S promoter in intact transgenic tobacco plants, Plant J. 2, 397 a 404). Alternativamente, o repressor pode ser ESR e o ligante de sulfonilureia é etametsulfurona, clorsulfurona, metsulfurona- metila, sulfometurona metila, clorimurona etila, nicosulfurona, primisulfurona, tribenurona, sulfosulfurona, trifloxisulfurona, foramsulfurona, iodosulfurona, prosulfurona, tifensulfurona, rimsulfurona, mesosulfurona, ou halosulfurona (US20110287936 incorporado ao presente documento a título de referência em sua totalidade).
[0080] Em um aspecto, quando o construto de expressão compreender sítio de excisão de recombinase específica a sítio, a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX; a sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA; ou ambas as sequências de nucleotídeos podem ser operacionalmente ligadas a um promotor induzível de auxina, um promotor regulado em desenvolvimento ou um promotor constitutivo. Os promotores constitutivos exemplificativos úteis nesse contexto incluem UBI, LLDAV, EVCV, DMMV, BSV (AY) PRO, CYMV PRO FL, UBIZM PRO, SI-UB3 PRO, SB-UBI PRO (ALT1), USB1ZM PRO, ZM-GOS2 PRO, ZM-H1B PRO (1,2 KB), IN2-2, NOS, a versão -135 de 35S PRO (ou versões mais longas do promotor 35S e ZM-ADF PRO (ALT2). Os promotores induzíveis de auxina exemplificativas úteis nesse contexto incluem AXIG1 e DR5. Os promotores regulados em desenvolvimento exemplificativos úteis nesse contexto incluem PLTP, PLTP1, PLTP2, PLTP3, LGL, LEA-14A e LEA-D34.
[0081] A duração adequada para expressão da sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo homeobox WUS/WOX; a sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA; ou ambas as sequências de nucleotídeos podem ser obtidas com o uso de um promotor regulado em desenvolvimento, por exemplo, um promotor como uma Proteína de Transferência de Fosfolipídio (PLTP). Os promotores PLTP incluem PLTP, PLTP1, PLTP2 e PLTP3 conforme descrito adicionalmente abaixo. Em um aspecto específico, o promotor PLTP compreende qualquer uma dentre SEQ ID NO: 1 a 2 e 55 a 61. O promotor PLTP usado pode ser um promotor PLTP de Zea mays ou Sorghum bicolor como aquele de SEQ ID NO: 1 ou 2 (Pedido Provisório n° US 62/271230 incorporado no presente documento a título de referência em sua totalidade). Outros promotores regulados em desenvolvimento adequados que podem ser usados com os métodos da presente revelação incluem os promotores derivados de genes que codificam a proteína de frutose-1,6-bisfosfatase, proteína Rossmann-Fold de ligação a NAD(P), proteína do tipo proteína associada a membrana plasmática adipócita, proteína de domínio de ferro-enxofre Rieske [2Fe-2S], proteína de redução de cloro respiratória 6, D-glicerato 3-quinase, proteína do tipo cloro plástico, proteína de ligação a-b de clorofila 7, proteína do tipo cloro plástico, proteína reprimível ultravioleta B, proteína da família de heme ligação Soul, proteína psi-N de subunidade central de reação a Fotossitema I e proteína de desidrogenase/redutase de cadeia curta. Os promotores podem ser derivados dos genes que codificam as proteínas anteriormente mencionadas em plantas monocotiledôneas, como milho, arroz ou sorgo. Os promotores regulados em desenvolvimento adequados úteis nos métodos da presente revelação incluem aqueles mostrados na SEQ ID NOs: 1 a 2, 28 a 40, 55 a 61, 81 a 83 e 86 a 88 e 106.
[0082] Em um aspecto, a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX; a sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA; ou ambas as sequências de polinucleotídeos podem ser operacionalmente ligadas a um promotor induzível de auxina. Em vários aspectos, o promotor induzível de auxina pode ser AXIG1. Em particular, o promotor induzível de auxina pode ser SEQ ID NO:39. O promotor também pode compreender um ou mais elementos de resposta de auxina. Em um aspecto adicional, o promotor pode compreender um ou mais motivos de DR5. Em particular, o promotor pode ser SEQ ID NO:40.
[0083] Em um aspecto, o promotor é um promotor constitutivo fraco modificado por repressão e não repressão. Em um aspecto adicional, o promotor constitutivo fraco modificado para repressão e não repressão compreende uma ou mais sequências de operador no promotor que foi posicionado perto ou sobrepondo TATA box e/ou o sítio de início de transcrição. Por exemplo, promotores adequados desse tipo incluem, mas sem limitação, os promotores NOS, IN2-2, a versão -135 de 35S, CC-UBI1-PRO e ZM-ADF4-PRO.
[0084] Em um aspecto, a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX; a sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA; ou ambas as sequências de nucleotídeos podem ser operacionalmente ligadas a um promotor regulado em desenvolvimento. Os promotores regulados em desenvolvimento adequados incluem promotores derivados dos genes de planta para Frutose-1,6- bisfosfatase, Proteína Rossmann-Fold de ligação de NAD(P), Proteína do tipo proteína associada a membrana plasmática de adipócito, Proteína de domínio de ferro-enxofre Rieske [2Fe-2S], Proteína de redução de cloro respiratória 6, D-glicerato 3-quinase, proteína do tipo cloro plástico, Proteína de ligação a-b de clorofila 7, proteína do tipo cloro plástico, Proteína reprimível ultravioleta B, Proteína da família de heme ligação Soul, Proteína psi-N de subunidade central de reação a Fotossitema I e Proteína de desidrogenase/redutase de cadeia curta. Em vários aspectos, esses promotores são derivados dos genes correspondentes em monocotiledôneas como milho, arroz e semelhantes. Alternativamente, esses promotores podem ser derivados dos genes correspondentes em dicotiledôneas. Em aspectos específicos, os promotores regulados em desenvolvimento compreendem uma dentre SEQ ID NOS: 1 a 2, 28 a 40, 55 a 61, 81 a 83 e 86 a 88 e 106.
[0085] Em um aspecto, a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX; a sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA; ou ambas as sequências de nucleotídeos podem ser operacionalmente ligadas a um promotor não reprimível. Os promotores não reprimíveis úteis incluem 35S:Top3, NOS::Top, NOS:Top2, UBI:Top3, BSV:Top3, AXIG1:Top, IN2-2:Top e DR5:Top (em que Top é a abreviação da sequência de operador de 18 bases para os quais qualquer um dentre TETR, ESR ou CR se ligam para reprimir a expressão).
[0086] Em um aspecto, a presente revelação fornece métodos de transformação que permitem a seleção de crescimento positivo. Um versado na técnica pode observar que os métodos de transformação de planta convencionais contaram predominantemente com os esquemas de seleção negativa, em que um antibiótico ou herbicida (um agente seletivo negativo) é usado para inibir ou exterminar célula ou tecidos não transformados, e as células ou tecidos transgênicos continuam a crescer devido à expressão de um gene resistente. Em contrapartida, os métodos da presente revelação podem ser usados sem aplicação de um agente seletivo negativo. Desse modo, embora as células do tipo selvagem possam crescer desimpedidas, por comparação as células que contêm os cassetes de expressão WUS2 e ODP2 revelados podem ser prontamente identificadas devido a sua taxa de crescimento acelerada em relação ao tecido do tipo selvagem circundante. Além de simplesmente observar o rápido crescimento, os métodos da presente revelação fornecem células transgênicas que contêm os cassetes de expressão WUS2 e ODP2 que exibem morfogênese mais rápida, manifestados como formação de estrutura de planta regenerável, em relação às células não transformadas. Consequentemente, tal crescimento diferencial e desenvolvimento morfogênico podem ser usados para distinguir facilmente as estruturas de planta regenerável transgênica do tecido não transformado circundante, cujo processo é denominado no presente documento como "seleção de crescimento positiva".
[0087] Em vários aspectos, os métodos da presente revelação podem ser realizados sem o uso de um meio de enraizamento. Alternativamente, em um aspecto, os métodos da presente revelação podem ser realizados com o uso de um meio de enraizamento. Conforme usado no presente documento, "meio de enraizamento" ou "meio de enraizamento seletivo" se refere a um meio de cultura de tecido que compreende sal basal, fontes de carbono, vitaminas, minerais e fito- hormônios vegetais. Em um aspecto, os fito-hormônios vegetais podem ser fornecidos em concentrações ou razões variantes, em que os tecidos radiculares se desenvolvem e se proliferam a partir das células colocadas no meio de enraizamento seletivo. Em um aspecto, o meio de enraizamento seletivo contém glufosinato, imazapir, etametsulfurona, manose ou outros agentes seletivos. Em um aspecto, o meio de enraizamento seletivo contém auxina e citoquinina, citoquinina sozinha ou nenhum fito-hormônio vegetal.
[0088] Em um aspecto, os métodos da presente revelação são revelados sem usar uma citoquinina durante a formação de estrutura de planta regenerável e/ou durante a germinação. Em um aspecto adicional, os métodos da presente revelação podem ser realizados sem o uso de uma citoquinina entre a transformação e pelo menos cerca de 7 dias após iniciação da transformação. Em um aspecto adicional, os métodos da presente revelação podem ser realizados sem o uso de uma citoquinina entre a transformação e pelo menos cerca de 14 dias após iniciação da transformação.
[0089] Em um aspecto, a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX; a sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA; ou cada sequência de nucleotídeos é operacionalmente ligada a um promotor PLTP. Os promotores PLTP incluem PLTP, PLTP1, PLTP2 e PLTP3. O promotor PLTP pode ser derivado de uma monocotiledônea, incluindo, mas sem limitação, milho, cevada, aveias, centeio, cana de açúcar, painço, sorgo, trigo, Setaria sp. ou arroz. Em um aspecto adicional, o promotor PLTP é um promotor PLTP de milho, arroz ou Setaria sp. Em um aspecto específico, o promotor PLTP compreende SEQ ID NO: 1 a 2 e 55 a 61. Em um aspecto específico, o promotor PLTP é um promotor PLTP de milho ou arroz. Em um aspecto adicional, o promotor PLTP é um promotor PLTP de milho. Em um aspecto adicional, o promotor PLTP é um promotor PLTP de arroz. Em um aspecto, o promotor PLTP compreende SEQ ID NO: 1 ou 2. O promotor PLTP também pode ser derivado de uma dicotiledônea, incluindo, mas sem limitação, couve, couve-flor, brócolis, planta de mostarda, repolho, ervilha, cravo-da-índia, alfafa, feijão-fava, tomate, mandioca, feijão-soja, canola, alfafa, girassol, cártamo, tabaco, Arabidopsis ou algodão. Outros promotores regulados em desenvolvimento úteis nesse contexto incluem LGL, LEA-14A e LEA-D34. Em um aspecto específico, outros promotores úteis nos presentes métodos incluem qualquer uma dentre SEQ ID NO: 28 a 40, 81 a 83, 86 a 88 e 106.
[0090] Em um aspecto, a presente revelação compreende métodos para produzir uma planta transgênica que compreende (a) transformar uma célula de um explante com um construto de expressão que compreende: (i) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo homeobox WUS/WOX; (ii) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA; ou (iii) uma combinação dos mesmos; e (b) permitir a expressão de um polipeptídeo de (a) em cada célula transformada para formar uma estrutura de planta regenerável na ausência de citocinina exógena, em que nenhum calo é formado; e (c) germinar a estrutura de planta regenerável para formar a planta transgênica; em que o polipeptídeo homeobox WUS/WOX compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma dentre SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14 ou 16; ou em que o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é codificado pela sequência de nucleotídeos de qualquer uma dentre SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13 ou 15; e em que o polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma dentre SEQ ID NO: 18, 20, 63, 65 ou 67; ou em que o polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA é codificado pela sequência de nucleotídeos de qualquer uma dentre SEQ ID NO: 17, 19, 21, 62, 64, 66 ou 68.
[0091] A estrutura de planta regenerável é produzida dentro de cerca de 0 a 7 dias ou cerca de 0 a 14 dias de transformação. Em um aspecto, a germinação compreende transferir a estrutura de planta regenerável para um meio de maturação que compreende uma citocinina exógena e forma a planta transgênica. Em um aspecto, a sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo homeobox WUS/WOX tem capacidade de estimular a formação de uma estrutura de planta regenerável. Em um aspecto, a sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA tem capacidade de estimular a formação de uma estrutura de planta regenerável.
[0092] Em um aspecto, a presente revelação compreende métodos para produzir uma planta transgênica que compreende (a) transformar uma célula de um explante com um construto de expressão que compreende: (i) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo WUS2; (ii) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo ODP2; ou (iii) uma combinação dos mesmos; e (b) permitir a expressão de um polipeptídeo de (a) em cada célula transformada para formar uma estrutura de planta regenerável na ausência de citocinina exógena, em que nenhum calo é formado; e (c) germinar a estrutura de planta regenerável para formar a planta transgênica; em que o polipeptídeo WUS2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; ou em que o polipeptídeo WUS2 é codificado pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 3; e em que o polipeptídeo ODP2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, 63, 65 ou 67; ou em que o polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA é codificado pela sequência de nucleotídeos de qualquer uma dentre SEQ ID NO: 17, 21, 62, 64, 66 ou 68.
[0093] Em um adicional, a presente revelação compreende métodos para produzir uma planta transgênica, que compreende (a) transformar uma célula de um explante com um construto de expressão que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo homeobox WUS/WOX; e (b) permitir a expressão do polipeptídeo de (a) em cada célula transformada para formar uma estrutura de planta regenerável na ausência de citocinina exógena, em que nenhum calo é formado; e (c) germinar a estrutura de planta regenerável para formar a planta transgênica.
[0094] Em um aspecto, a presente revelação compreende métodos para produzir uma planta transgênica, que compreende (a) transformar uma ou mais células de um explante com um construto de expressão que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA; e (b) permitir a expressão do polipeptídeo de (a) em cada célula transformada para formar uma estrutura de planta regenerável na ausência de citocinina exógena, em que nenhum calo é formado; e (c) germinar a estrutura de planta regenerável para formar a planta transgênica.
[0095] Em um aspecto, a presente revelação compreende métodos para produzir uma planta transformada, que compreende (a) transformar uma ou mais células de um explante com um construto de expressão que compreende (i) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo homeobox WUS/WOX; e (ii) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA; e (b) permitir a expressão dos polipeptídeos de (a) em cada célula transformada para formar uma estrutura de planta regenerável na ausência de citocinina exógena, em que nenhum calo é formado; e (c) germinar a estrutura de planta regenerável para formar a planta transgênica.
[0096] Em um aspecto, a presente revelação compreende métodos para produzir uma planta transformada que compreende (a) transformar uma célula de um explante com um construto de expressão que compreende: (i) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo homeobox WUS/WOX; (ii) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA; ou (iii) uma combinação de (i) e (ii); (b) permitir a expressão do polipeptídeo de (a) em cada célula transformada para formar uma estrutura de planta regenerável na ausência de citocinina exógena, em que nenhum calo é formado; e (c) germinar a estrutura de planta regenerável para formar a planta transgênica em cerca de 14 dias a cerca de 60 dias.
[0097] O termo "planta" se refere a plantas inteiras, órgãos de planta, tecidos de planta, sementes, células de planta, sementes e progênie da mesma. As células vegetais incluem, mas sem limitação, células de sementes, culturas de suspensão, embriões, regiões meristemáticas, tecido de calo, folhas, raízes, brotos, gametófitos, esporófitos, pólen e microesporos.
[0098] As partes de planta incluem tecidos diferenciados e não diferenciados que incluem, mas sem limitação, os seguintes: raízes, caules, brotos, folhas, pólen, sementes, tecido de tumor e várias formas de células e cultura (por exemplo, células individuais, protoplastos, embriões e tecido de calo). O tecido vegetal pode estar em uma planta ou em uma cultura celular, tecido ou órgão de planta.
[0099] A presente revelação também inclui plantas obtidas por meio de qualquer um dos métodos ou composições revelados no presente documento.
[0100] Em um aspecto, a presente revelação compreende métodos para produzir uma planta transgênica que compreende (a) transformar uma célula de um explante com um construto de expressão que compreende: (i) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo homeobox WUS/WOX; (ii) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA; ou (iii) uma combinação de (i) e (ii); (b) permitir a expressão do polipeptídeo de (a) em cada célula transformada para formar uma estrutura de planta regenerável na ausência de citocinina exógena, em que nenhum calo é formado; e (c) germinar a estrutura de planta regenerável para formar a planta transgênica em cerca de 14 dias a cerca de 60 dias.
[0101] A presente revelação também inclui sementes de uma planta obtidas por qualquer um dos métodos ou composições revelados no presente documento.
[0102] Em um aspecto, a presente revelação compreende kits que compreendem: (a) um construto de expressão que compreende (i) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo homeobox WUS/WOX; (ii) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA; ou (iii) uma combinação de (i) e (ii); e (b) instruções para obter uma estrutura de planta regenerável na ausência de citocinina exógena, em que nenhum calo é formado; e (c) instruções parar germinar a estrutura de planta regenerável para formar a planta transgênica.
[0103] Em um aspecto, a presente revelação compreende kits que compreendem (a) um construto de expressão que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo homeobox WUS/WOX; e (b) instruções para obter uma estrutura de planta regenerável na ausência de citocinina exógena, em que nenhum calo é formado; e (c) instruções parar germinar a estrutura de planta regenerável para formar a planta transgênica.
[0104] Em um aspecto, a presente revelação compreende kits que compreende (a) um construto de expressão que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA; e (b) instruções para obter uma estrutura de planta regenerável na ausência de citocinina exógena, em que nenhum calo é formado; e (c) instruções parar germinar a estrutura de planta regenerável para formar a planta transgênica.
[0105] Os kits revelados podem compreender adicionalmente instruções parar germinar a estrutura de planta regenerável para formar a planta transgênica dentro de cerca de 14 dias a cerca de 60 dias após a transformação do explante.
[0106] Os métodos da presente revelação compreendem sequências de polinucleotídeos e sequências de aminoácidos de polipeptídeos de Proteína de Desenvolvimento de Óvulo 2 (ODP2) e polipeptídeos relacionados, por exemplo, proteínas da família de proteína Babyboom (BBM). Em um aspecto, o polipeptídeo que compreende os dois domínios de ligação de AP2-DNA é um polipeptídeo ODP2, BBM2, BMN2 ou BMN3. Os polipeptídeos ODP2 da revelação contém dois domínios APETALA2 (AP2) preditos e são membros da família da proteína AP2 (Acesso PFAM PF00847). Os domínios AP2 do polipeptídeo ODP2 de milho estão localizados a partir de cerca de aminoácidos S273 a N343 e de cerca de S375 a R437 de SEQ ID NO:2). A família AP2 de fatores de transcrição putativa foi mostrada para regular uma ampla gama de processos de desenvolvimento e os membros da família são caracterizados pela presença de um domínio de ligação de AP2-DNA. Esse núcleo conservado é predito para formar uma hélice alfa anfipática que se liga ao DNA. O domínio AP2 foi identificado, primeiro, em APETALA2, uma proteína de Arabidopsis que regula a identidade de maristema, especificação de órgão floral, desenvolvimento de revestimento de semente e expressão de gene homeótico floral. O domínio AP2 foi encontrado, agora, em uma variedade de proteínas.
[0107] O polipeptídeos ODP2 da revelação compartilha homologia com diversos polipeptídeos dentro da família AP2, por exemplo, consulte a Figura 1 do documento US 8420893, que está incorporado ao presente documento a título de referência em sua totalidade, fornece um alinhamento dos polipeptídeos ODP2 de milho e arroz com oito outras proteínas que têm dois domínios AP2. Uma sequência de consenso de todas as proteínas que aparecem no alinhamento do documento US 8420893 também é fornecida na Figura 1 no mesmo.
[0108] O polipeptídeo que compreende os dois domínios de ligação de AP2-DNA pode ser derivado de uma monocotiledônea. Em vários aspectos, o polipeptídeo que compreende os dois domínios de ligação de AP2-DNA é derivado de cevada, milho, painço, aveias, arroz, centeio, Setaria sp., sorgo, cana de açúcar, painço amarelo, triticale, relva ou trigo. Em um aspecto, o polipeptídeo que compreende os dois domínios de ligação de AP2-DNA é derivado de milho, cevada, aveias, centeio, cana de açúcar, painço, sorgo, trigo, Setaria sp. ou arroz. Em um aspecto adicional, a monocotiledônea é milho, sorgo, arroz ou Setaria sp. Em ainda um aspecto adicional, a monocotiledônea é milho ou arroz. Em um aspecto adicional, a monocotiledônea é milho. Em um aspecto adicional, a monocotiledônea é arroz.
[0109] O polipeptídeo que compreende os dois domínios de ligação de AP2-DNA pode ser derivado de uma dicotiledônea. O polipeptídeo que compreende os dois domínios de ligação de AP2-DNA pode ser derivado de couve, couve-flor, brócolis, planta de mostarda, repolho, ervilha, cravo-da-índia, alfafa, feijão-fava, tomate, mandioca, feijão-soja, canola, alfafa, girassol, cártamo, tabaco, Arabidopsis ou algodão.
[0110] O polipeptídeo que compreende os dois domínios de ligação de AP2-DNA pode ser derivado de uma planta que é um membro da família Poaceae. Os exemplos não limitantes de plantas adequadas das quais dois domínios de ligação de AP2-DNA podem ser derivados incluem culturas de grãos, incluindo, mas sem limitação, cevada, milho (milho), aveias, arroz, cevada, sorgo, trigo, painço, triticale; culturas de folhas e caules, incluindo, mas sem limitação, bambu, grama do marram, poa dos prados, juncos, azevém, cana de açúcar; gramados, gramíneas ornamentais, e outras gramíneas como painço amarelo e relva.
[0111] Em um aspecto adicional, o polipeptídeo que compreende os dois domínios de ligação de AP2-DNA usado nos métodos revelados pode ser derivado de qualquer planta, incluindo plantas maiores, por exemplo, classes de Angiospermae e Gymnospermae. As plantas das subclasses da Dicotylodenae e da Monocotyledonae são adequadas. As espécies adequadas podem vir da família Acanthaceae, Alliaceae, Alstroemeriaceae, Amaryllidaceae, Apocynaceae, Arecaceae, Asteraceae, Berberidaceae, Bixaceae, Brassicaceae, Bromeliaceae, Cannabaceae, Caryophyllaceae, Cephalotaxaceae, Chenopodiaceae, Colchicaceae, Cucurbitaceae, Dioscoreaceae, Ephedraceae, Erythroxylaceae, Euphorbiaceae, Fabaceae, Lamiaceae, Linaceae, Lycopodiaceae, Malvaceae, Melanthiaceae, Musaceae, Myrtaceae, Nyssaceae, Papaveraceae, Pinaceae, Plantaginaceae, Poaceae, Rosaceae, Rubiaceae, Salicaceae, Sapindaceae, Solanaceae, Taxaceae, Theaceae e Vitaceae.
[0112] As espécies adequadas das quais o polipeptídeo que compreende os dois domínios de ligação de AP2-DNA usado nos métodos revelados pode ser derivado incluem membros do gênero Abelmoschus, Abies, Acer, Agrostis, Allium, Alstroemeria, Ananas, Andrographis, Andropogon, Artemisia, Arundo, Atropa, Berberis, Beta, Bixa, Brassica, Calendula, Camellia, Camptotheca, Cannabis, Capsicum, Carthamus, Catharanthus, Cephalotaxus, Chrysanthemum, Cinchona, Citrullus, Coffea, Colchicum, Coleus, Cucumis, Cucurbita, Cynodon, Datura, Dianthus, Digitalis, Dioscorea, Elaeis, Ephedra, Erianthus, Erythroxylum, Eucalyptus, Festuca, Fragaria, Galanthus, Glycine, Gossypium, Helianthus, Hevea, Hordeum, Hyoscyamus, Jatropha, Lactuca, Linum, Lolium, Lupinus, Lycopersicon, Lycopodium, Manihot, Medicago, Mentha, Miscanthus, Musa, Nicotiana, Oryza, Panicum, Papaver, Parthenium, Pennisetum, Petunia, Phalaris, Phleum, Pinus, Poa, Poinsettia, Populus, Rauwolfia, Ricinus, Rosa, Saccharum, Salix, Sanguinaria, Scopolia, Secale, Solanum, Sorghum, Spartina, Spinacea, Tanacetum, Taxus, Theobroma, Triticosecale, Triticum, Uniola, Veratrum, Vinca, Vitis e Zea.
[0113] Em outro aspecto, o polipeptídeo que compreende os dois domínios de ligação de AP2-DNA pode ser derivado de uma planta que é importante ou interessante para agricultura, horticultura, biomassa para a produção de moléculas de combustível líquido e outros produtos químicos e/ou silvicultura. Os exemplos não limitantes incluem, por exemplo, Panicum virgatum (painço amarelo), Sorghum bicolor (sorgo, milho-zaburro), Miscanthus giganteus (miscanto), Saccharum sp. (cana de açúcar), Populus balsamifera (álamo-trémulo), Zea mays (milho), Glycine max (feijão-soja), Brassica napus (canola), Triticum aestivum (trigo), Gossypium hirsutum (algodão), Oryza sativa (arroz), Helianthus annuus (girassol), Medicago sativa (alfafa), Beta vulgaris (beterraba sacarina), Pennisetum glaucum (milheto), Panicum spp., Sorghum spp., Miscanthus spp., Saccharum spp., Erianthus spp., Populus spp., Andropogon gerardii (vetiver grande), Pennisetum purpureum (capim-elefante), Phalaris arundinacea (capim-amarelo), Cynodon dactylon (capim-das-bermudas), Festuca arundinacea (festuca-alta), Spartina pectinata (cordilheira de pradaria), Arundo donax (cana-do-reino), Secale cereale (centeio), Salix spp. (epilóbio), Eucalyptus spp. (eucalipto), Triticosecale spp. (triticum - trigo X centeio), Bambu, Carthamus tinctorius (cártamo), Jatropha curcas (jatropha), Ricinus communis (rícino), Elaeis guineensis (palma), Linum usitatissimum (linhaça), Brassica juncea, Manihot esculenta (mandioca), Lycopersicon esculentum (tomate), Lactuca sativa (alface), Musa paradisiaca (banana), Solanum tuberosum (batata), Brassica oleracea (brócolis, couve-flor, couve-de-bruxelas), Camellia sinensis (chá), Fragaria ananassa (morango), Theobroma cacao (cacau), Coffea arabica (café), Vitis vinifera (uva), Ananas comosus (abacaxi), Capsicum annum (jalapeno), Allium cepa (cebola), Cucumis melo (melão), Cucumis sativus (pepino), Cucurbita maxima (abóbora), Cucurbita moschata (abóbora), Spinacea oleracea (espinafre), Citrullus lanatus (melancia), Abelmoschus esculentus (quiabo), Solanum melongena (beringela), Papaver somniferum (papoula do ópio), Papaver orientale, Taxus baccata, Taxus brevifolia, Artemisia annua, Cannabis sativa, Camptotheca acuminate, Catharanthus roseus, Vinca rosea, Cinchona officinalis, Colchicum autumnale, Veratrum californica., Digitalis lanata, Digitalis purpurea, Dioscorea spp., Andrographis paniculata, Atropa belladonna, Datura stomonium, Berberis spp., Cephalotaxus spp., Ephedra sinica, Ephedra spp., Erythroxylum coca, Galanthus wornorii, Scopolia spp., Lycopodium serratum (=Huperzia serrata), Lycopodium spp., Rauwolfia serpentina, Rauwolfia spp., Sanguinaria canadensis, Hyoscyamus spp., Calendula officinalis, Chrysanthemum parthenium, Coleus forskohlii, Tanacetum parthenium, Parthenium argentatum (guayule), Hevea spp. (borracha), Mentha spicata (menta), Mentha piperita (menta), Bixa orellana, Alstroemeria spp., Rosa spp. (rosa), Dianthus caryophyllus (cravo), Petunia spp. (petúnia), Poinsettia pulcherrima (poinsétia), Nicotiana tabacum (tabaco), Lupinus albus (tremoço), Uniola paniculata (aveia), bentgrass (Agrostis spp.), Populus tremuloides (faia), Pinus spp. (pinheiro), Abies spp. (abeto), Acer spp. (bordo), Hordeum vulgare (cevada), Poa pratensis (cabelo-de-cão), Lolium spp. (azevém), Phleum pratense (erva-dos-prados) e coníferas. São de interesse plantas cultivadas para produção de energia, assim chamadas culturas de energia, tais como culturas de energia à base de celulose como Panicum virgatum (painço amarelo), Sorghum bicolor (sorgo, milho-zaburro), Miscanthus giganteus (miscanto), Saccharum sp. (cana de açúcar), Populus balsamifera (álamo-trémulo), Andropogon gerardii (vetiver grande), Pennisetum purpureum (capim- elefante), Phalaris arundinacea (capim-amarelo), Cynodon dactylon (capim-das-bermudas), Festuca arundinacea (festuca-alta), Spartina pectinata (cordilheira de pradaria), Medicago sativa (alfafa), Arundo donax (cana-do-reino), Secale cereale (centeio), Salix spp. (epilóbio), Eucalyptus spp. (eucalipto), Triticosecale spp. (triticum - trigo X centeio) e Bambu; e culturas de energia à base de amido como Zea mays (milho) e Manihot esculenta (mandioca); e culturas de energia à base de sacarose como Saccharum sp. (cana de açúcar) e Beta vulgaris (beterraba sacarina); e culturas de energia produtoras de biodiesel como Glycine max (feijão-soja), Brassica napus (canola), Helianthus annuus (girassol), Carthamus tinctorius (cártamo), Jatropha curcas (jatropha), Ricinus communis (rícino), Elaeis guineensis (palma), Linum usitatissimum (linhaça) e Brassica juncea.
[0114] O polipeptídeo que compreende os dois domínios de ligação de AP2-DNA pode ser derivado de uma planta de fonte de energia renovável de biomassa. Exemplos de plantas de fonte de energia renovável de biomassa incluem aqueles descritos no presente documento acima.
[0115] Em particular, a presente revelação fornece moléculas de ácido nucleico isoladas que compreendem sequências de nucleotídeos que codificam as sequências de aminoácidos mostradas na SEQ ID NO: 18, 20, 63, 65 e 67. Adicionalmente fornecidos são polipeptídeos que têm uma sequência de aminoácidos codificada por uma molécula de ácido nucleico (SEQ ID NO: 17, 19, 21, 62, 64, 66 e 68) descrita no presente documento, e fragmentos e variantes da mesma.
[0116] Em um aspecto, o polipeptídeo que compreende os dois domínios de ligação de AP2-DNA é um polipeptídeo ODP2. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo ODP2 é derivado de um polipeptídeo de monocotiledônea. Em aspectos específicos, o polipeptídeo ODP2 é derivado de milho, cevada, aveias, centeio, cana de açúcar, painço, sorgo, trigo, Setaria sp. ou arroz. Em um aspecto, o polipeptídeo ODP2 é derivado de milho, arroz ou Setaria sp. Em um aspecto, o polipeptídeo ODP2 é derivado de milho ou arroz. Em um aspecto específico, o polipeptídeo ODP2 é derivado de milho. Em um aspecto específico, o polipeptídeo ODP2 é derivado de arroz. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo ODP2 é derivado de um polipeptídeo de dicotiledônea. Em aspectos específicos, o polipeptídeo ODP2 é derivado de couve, couve-flor, brócolis, planta de mostarda, repolho, ervilha, cravo-da-índia, alfafa, feijão-fava, tomate, mandioca, feijão-soja, canola, alfafa, girassol, cártamo, tabaco, Arabidopsis ou algodão. O polipeptídeo ODP2 expresso pelo construto de expressão dos métodos e composições revelados pode ser o polipeptídeo que compreende SEQ ID NO: 18, 63, 65 ou 67. O polipeptídeo ODP2 pode ser codificado pelo polinucleotídeo de SEQ ID NO: 17, 21, 62, 64, 66 ou 68.
[0117] Em um aspecto, o polipeptídeo que compreende os dois domínios de ligação de AP2-DNA é um polipeptídeo de BBM2. O polipeptídeo de BBM2 pode ser um polipeptídeo de monocotiledônea, incluindo, mas sem limitação, como monocotiledôneas como milho, cevada, aveias, centeio, cana de açúcar, painço, sorgo, trigo, Setaria sp. ou arroz. Em aspectos específicos, a monocotiledônea é milho, cana de açúcar, arroz ou Setaria sp. Em um aspecto adicional específico, a monocotiledônea é milho ou arroz. Em ainda um aspecto adicional específico, a monocotiledônea é milho. Alternativamente, o polipeptídeo de BBM2 pode ser um polipeptídeo de dicotiledônea, incluindo, mas sem limitação, em que a dicotiledônea é couve, couve- flor, brócolis, planta de mostarda, repolho, ervilha, cravo-da- índia, alfafa, feijão-fava, tomate, mandioca, feijão-soja, canola, alfafa, girassol, cártamo, tabaco, Arabidopsis ou algodão. Em um aspecto, o polipeptídeo BBM2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:20. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo BBM2 é codificado por uma sequência de nucleotídeos que compreende a sequência de SEQ ID NO:19.
[0118] A presente revelação abrange composições ODP2/BBM de ácido nucleico ou proteína isolado substancialmente purificado. Uma molécula de ácido nucleico ou proteína "isolada" ou "purificada", ou porção biologicamente ativa da mesma, é substancial ou essencialmente livre de componentes que normalmente acompanham ou interagem com a molécula de ácido nucleico ou proteína conforme encontrada em seu ambiente de ocorrência natural. Desse modo, uma molécula de ácido nucleico ou proteína isolada ou purificada é substancialmente livre de outro material celular ou meio de cultura quando produzida por meio de técnicas recombinantes ou substancialmente livre de precursores químicos ou outros produtos químicos quando quimicamente sintetizada. De modo ideal, um ácido nucleico "isolado" está livre de sequências (de modo ideal, sequências de codificação de proteína) que flanqueiam naturalmente o ácido nucleico (isto é, sequências localizadas nas extremidades 5‘ e 3‘ do ácido nucleico) no DNA genômico do organismo do qual o ácido nucleico é derivado. Por exemplo, em vários aspectos, a molécula de ácido nucleico isolada pode conter menos de cerca de 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb, ou 0,1 kb de sequências de nucleotídeos que flanqueiam naturalmente a molécula de ácido nucleico em DNA genômico da célula a partir da qual o ácido nucleico é derivado. A proteína que é substancialmente livre de material celular inclui preparações de proteína que têm menos que cerca de 30%, 20%, 10%, 5% ou 1% (em peso seco) de proteína contaminante. Quando a proteína da revelação ou uma porção biologicamente ativa da mesma for produzida de forma recombinante, de modo ideal, o meio de cultura representa menos que cerca de 30%, 20%, 10%, 5% ou 1% (em peso seco) de precursores químicos ou produtos químicos não proteicos de interesse.
[0119] Os fragmentos e variantes das sequências de nucleotídeos reveladas e proteínas codificadas pela mesma também são abrangidos pela presente revelação. Por "fragmento" é concebida uma porção da sequência de nucleotídeos ou uma porção da sequência de aminoácidos e, portanto, a proteína codificada pela mesma. Fragmentos de uma sequência de nucleotídeos pode codificar fragmentos de proteína que retêm a atividade biológica da proteína nativa e, portanto, têm atividade de ODP2. Alternativamente, os fragmentos de uma sequência de nucleotídeos úteis como sondas de hibridização, em geral, não codificam as proteínas em fragmento que retêm atividade biológica. Desse modo, os fragmentos de uma sequência de nucleotídeos podem variar de pelo menos cerca de 20 nucleotídeos, cerca de 50 nucleotídeos, cerca de 100 nucleotídeos e até a sequência de nucleotídeos de comprimento total que codifica as proteínas da revelação.
[0120] Por "atividade de ODP2" ou "atividade de Proteína de Desenvolvimento de Óvulo 2” pretende-se que seja o polipeptídeo ODP2 que tem pelo menos uma das atividades exemplificativas seguintes: aumenta a capacidade regenerativa de uma célula vegetal; torna a célula vegetal embriogênica; aumenta as eficiências de transformação de uma célula vegetal; altera o teor de óleo de uma célula vegetal; liga DNA; aumenta a tolerância à tensão abiótica; aumenta ou mantém o rendimento sob tensão abiótica; aumenta a formação de embrião assexual; altera o teor de amido; altera o tamanho do embrião ou ativa a transcrição. Os métodos para avaliar tal atividade são conhecidos na técnica e são descritos mais completamente abaixo.
[0121] Um fragmento de uma sequência de nucleotídeos ODP2/BBM que codifica uma porção biologicamente ativa de uma proteína ODP2/BBM da revelação codificará pelo menos 15, 25, 30, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 709 aminoácidos contíguos, ou até o número total de aminoácidos presentes em uma proteína ODP2/BBM de comprimento total da revelação. Fragmentos de uma sequência de nucleotídeos ODP2 que são úteis como sondas de hibridização ou iniciadores de PCR não precisam, em geral, codificar uma porção biologicamente ativa de uma proteína ODP2/BBM.
[0122] Desse modo, um fragmento de uma sequência de nucleotídeos ODP2/BBM pode codificar uma porção biologicamente ativa de uma proteína ODP2/BBM, ou o mesmo pode ser um fragmento que pode ser usado como uma sonda de hibridização ou iniciador de PCR com o uso de métodos revelados abaixo. Uma porção biologicamente ativa de uma proteína ODP2/BBM pode ser preparada isolando-se uma porção de uma das sequências de nucleotídeos ODP2/BBM da revelação, expressando- se a porção codificada da proteína ODP2/BBM (por exemplo, por meio de expressão recombinante in vitro), e avaliando-se a atividade da porção codificada da proteína ODP2/BBM. As moléculas de ácido nucleico que são fragmentos de uma sequência de nucleotídeos ODP2/BBM compreendem pelo menos 16, 20, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 800, 900, 1.000, 1.100, 1.200, 1.300 ou 1.400, 1.500, 1.600, 1.700, 1.800, 1.900, 2.000, 2.100, 2.200 nucleotídeos contíguos ou até o número de nucleotídeos presentes em uma sequência de nucleotídeos ODP2/BBM de comprimento total revelada no presente documento (por exemplo, SEQ ID NOS:17, 19 e 21).
[0123] "Variantes" destina-se a significar sequências substancialmente similares. Para polinucleotídeos, uma variante compreende uma deleção e/ou adição de um ou mais nucleotídeos em um ou mais sítios internos dentro do polinucleotídeo nativo e/ou uma substituição de um ou mais nucleotídeos em um ou mais sítios no polinucleotídeo nativo. Conforme usado no presente documento, um polinucleotídeo ou polipeptídeo "nativo" compreende uma sequência de nucleotídeo ou sequência de aminoácidos de ocorrência natural, respectivamente. Por polinucleotídeos, variantes conservadoras incluem aquelas sequências que, devido à degenerescência do código genético, codificam a sequência de aminoácidos de um dos polipeptídeos ODP2/BBM da revelação. Os polinucleotídeos ODP2/BBM2 variantes também incluem polinucleotídeos sinteticamente derivados, como aqueles gerados, por exemplo, com o uso de mutagênese dirigida a sítio, mas que ainda codificam uma proteína ODP2 da revelação. Geralmente, as variantes de um polinucleotídeo específico da revelação terão pelo menos cerca de 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com aquele polinucleotídeo específico conforme determinado por programas de alinhamento de sequência e parâmetros descritos em outro local no presente documento.
[0124] Proteína "variante" se destina a significar uma proteína derivada da proteína nativa por deleção ou adição de um ou mais aminoácidos em um ou mais sítios internos na proteína nativa e/ou substituição de um ou mais aminoácidos em um ou mais sítios na proteína nativa. Proteínas variantes abrangidas pela presente revelação são biologicamente ativas, ou seja, continuam a possuir a atividade biológica desejada da proteína nativa, ou seja, o polipeptídeo tem atividade de ODP2/BBM (isto é, modular a capacidade regenerativa de uma planta, tornar a planta embriogênica, aumentar a eficiência de transformação de uma planta, alterar o teor de óleo de uma planta, aumentar a proliferação de célula, aumentar a tolerância à tensão abiótica, aumentar ou manter o rendimento sob tensão abiótica, modificar o teor de amido, aumentar a formação de embrião assexual, ligar DNA ou regular transcrição) conforme descrito no presente documento. Tais variantes podem resultar, por exemplo, de polimorfismo genético ou de manipulação humana. As variantes biologicamente ativas de uma proteína nativa ODP2/BBM da revelação terão pelo menos cerca de 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais identidade de sequência com a sequência de aminoácidos para a proteína nativa conforme determinado pelos programas de alinhamento de sequência e parâmetros descritos em qualquer lugar no presente documento. Uma variante biologicamente ativa de uma proteína da revelação pode diferir daquela proteína por tão pouco quanto 1 a 15 resíduos de aminoácido, tão pouco quanto 1 a 10, como 6 a 10, tão pouco quanto 5, tão pouco quanto 4, 3, 2 ou até mesmo 1 resíduo de aminoácido.
[0125] As proteínas ODP2/BBM da revelação podem ser alteradas de vários modos incluindo substituições, deleções, truncamentos, fusões e inserções de aminoácidos. Métodos para tais manipulações são geralmente conhecidos na técnica. Por exemplo, as variantes de sequência de aminoácidos das proteínas ODP2 podem ser preparadas por meio de mutações no DNA. Métodos de mutagênese e alterações de sequências de nucleotídeos são bem conhecidos na técnica. Consulte, por exemplo, Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 82:488 a 492; Kunkel et al. (1987) Methods in Enzymol. 154:367 a 382; Patente n° US 4.873.192; Walker e Gaastra, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, Nova York) e as referências citadas na mesma. As diretrizes a respeito de substituições de aminoácido apropriadas que não afetam a atividade biológica da proteína de interesse podem ser encontradas no modelo de Dayhoff, et al., (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.), incorporado ao presente documento a título de referência. Podem ser ideais as substituições conservativas, como troca de um aminoácido por outro com propriedades semelhantes.
[0126] Os métodos da presente revelação compreendem sequências de polinucleotídeos e sequências de aminoácidos de polipeptídeos homeobox WUS/WOX. A proteína Wuschel, projetada doravante como WUS, desempenha um papel importante na iniciação e na manutenção do maristema apical, que contém um agrupamento de células-tronco pluripotentes (Endrizzi, et al., (1996) Plant Journal 10:967 a 979; Laux, et al., (1996) Development 122:87 a 96; e Mayer, et al., (1998) Cell 95:805 a 815). O mutante de plantas Arabidopsis para o gene WUS contém células-tronco que são especificadas erradas e que parecem sofrer diferenciação. WUS codifica uma proteína de homeodomínio nova que funciona, presumidamente, como um regulador de transcrição (Mayer, et al., (1998) Cell 95:805 a 815). Acredita-se que a população de célula-tronco de maristemas de broto de Arabidopsis seja mantida por um ciclo regulatório entre os genes CLAVATA (CLV) que promovem a iniciação de órgãos e o gene WUS que é necessário para a identidade de célula-tronco, com os genes CLV que reprimem WUS no nível de transcrição, e sendo que a expressão de WUS é suficiente para induzir a identidade celular de maristema e a expressão do marcador de célula-tronco CLV3 (Brand, et al., (2000) Science 289:617 a 619; Schoof, et al., (2000) Cell 100:635 a 644). A expressão constitutiva de WUS em Arabidopsis foi mostrada para levar à proliferação de broto adventícia de folhas (em planta) (Laux, T., Talk Presented at the XVI International Botanical Congress Meeting, 1 a 7 de agosto de 1999, St. Louis, Mo.).
[0127] Em um aspecto, o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é um polipeptídeo WUS1, WUS2, WUS3, WOX2A, WOX4, WOX5 ou WOX9 (van der Graaff et al., 2009, Genome Biology 10:248). O polipeptídeo homeobox WUS/WOX pode ser um polipeptídeo homeobox WUS/WOX de monocotiledônea. Em vários aspectos, o polipeptídeo homeobox WUS/WOX pode ser um polipeptídeo homeobox WUS/WOX de cevada, milho, painço, aveias, arroz, centeio, Setaria sp., sorgo, cana de açúcar, painço amarelo, triticale, relva ou trigo. Alternativamente, o polipeptídeo homeobox WUS/WOX pode ser um polipeptídeo homeobox WUS/WOX de dicotiledônea. Em particular, a presente revelação fornece moléculas de ácido nucleico isoladas que compreendem sequências de nucleotídeos que codificam as sequências de aminoácidos mostradas nas SEQ ID NOS: 4, 6, 8, 10, 12, 14 e 16. Adicionalmente fornecidos são polipeptídeos que têm uma sequência de aminoácidos codificada por uma molécula de ácido nucleico (SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13 e 15) descrita no presente documento, e fragmentos e variantes da mesma.
[0128] O polipeptídeo homeobox WUS/WOX pode ser derivado de uma planta que é um membro da família Poaceae. Os exemplos não limitantes de plantas adequadas das quais o polipeptídeo homeobox WUS/WOX pode ser derivado incluem culturas de grãos, incluindo, mas sem limitação, cevada, milho (milho), aveias, arroz, cevada, sorgo, trigo, painço, triticale; culturas de folhas e caules, incluindo, mas sem limitação, bambu, grama do marram, poa dos prados, juncos, azevém, cana de açúcar; gramados, gramíneas ornamentais, e outras gramíneas como painço amarelo e relva.
[0129] Em um aspecto adicional, o polipeptídeo homeobox WUS/WOX usado nos métodos revelados pode ser derivado de qualquer planta, incluindo plantas maiores, por exemplo, classes de Angiospermae e Gymnospermae. As plantas das subclasses da Dicotylodenae e da Monocotyledonae são adequadas. As espécies adequadas podem vir da família Acanthaceae, Alliaceae, Alstroemeriaceae, Amaryllidaceae, Apocynaceae, Arecaceae, Asteraceae, Berberidaceae, Bixaceae, Brassicaceae, Bromeliaceae, Cannabaceae, Caryophyllaceae, Cephalotaxaceae, Chenopodiaceae, Colchicaceae, Cucurbitaceae, Dioscoreaceae, Ephedraceae, Erythroxylaceae, Euphorbiaceae, Fabaceae, Lamiaceae, Linaceae, Lycopodiaceae, Malvaceae, Melanthiaceae, Musaceae, Myrtaceae, Nyssaceae, Papaveraceae, Pinaceae, Plantaginaceae, Poaceae, Rosaceae, Rubiaceae, Salicaceae, Sapindaceae, Solanaceae, Taxaceae, Theaceae e Vitaceae.
[0130] As espécies adequadas das quais o polipeptídeo homeobox WUS/WOX pode ser derivado incluem membros do gênero Abelmoschus, Abies, Acer, Agrostis, Allium, Alstroemeria, Ananas, Andrographis, Andropogon, Artemisia, Arundo, Atropa, Berberis, Beta, Bixa, Brassica, Calendula, Camellia, Camptotheca, Cannabis, Capsicum, Carthamus, Catharanthus, Cephalotaxus, Chrysanthemum, Cinchona, Citrullus, Coffea, Colchicum, Coleus, Cucumis, Cucurbita, Cynodon, Datura, Dianthus, Digitalis, Dioscorea, Elaeis, Ephedra, Erianthus, Erythroxylum, Eucalyptus, Festuca, Fragaria, Galanthus, Glycine, Gossypium, Helianthus, Hevea, Hordeum, Hyoscyamus, Jatropha, Lactuca, Linum, Lolium, Lupinus, Lycopersicon, Lycopodium, Manihot, Medicago, Mentha, Miscanthus, Musa, Nicotiana, Oryza, Panicum, Papaver, Parthenium, Pennisetum, Petunia, Phalaris, Phleum, Pinus, Poa, Poinsettia, Populus, Rauwolfia, Ricinus, Rosa, Saccharum, Salix, Sanguinaria, Scopolia, Secale, Solanum, Sorghum, Spartina, Spinacea, Tanacetum, Taxus, Theobroma, Triticosecale, Triticum, Uniola, Veratrum, Vinca, Vitis e Zea.
[0131] Em outro aspecto, o polipeptídeo homeobox WUS/WOX pode ser derivado de uma planta que é importante ou interessante para agricultura, horticultura, biomassa para a produção de moléculas de combustível líquido e outros produtos químicos e/ou silvicultura. Os exemplos não limitantes incluem, por exemplo, Panicum virgatum (painço amarelo), Sorghum bicolor (sorgo, milho-zaburro), Miscanthus giganteus (miscanto), Saccharum sp. (cana de açúcar), Populus balsamifera (álamo-trémulo), Zea mays (milho), Glycine max (feijão- soja), Brassica napus (canola), Triticum aestivum (trigo), Gossypium hirsutum (algodão), Oryza sativa (arroz), Helianthus annuus (girassol), Medicago sativa (alfafa), Beta vulgaris (beterraba sacarina), Pennisetum glaucum (milheto), Panicum spp., Sorghum spp., Miscanthus spp., Saccharum spp., Erianthus spp., Populus spp., Andropogon gerardii (vetiver grande), Pennisetum purpureum (capim- elefante), Phalaris arundinacea (capim-amarelo), Cynodon dactylon (capim-das-bermudas), Festuca arundinacea (festuca-alta), Spartina pectinata (cordilheira de pradaria), Arundo donax (cana-do-reino), Secale cereale (centeio), Salix spp. (epilóbio), Eucalyptus spp. (eucalipto), Triticosecale spp. (triticum - trigo X centeio), Bambu, Carthamus tinctorius (cártamo), Jatropha curcas (jatropha), Ricinus communis (rícino), Elaeis guineensis (palma), Linum usitatissimum (linhaça), Brassica juncea, Manihot esculenta (mandioca), Lycopersicon esculentum (tomate), Lactuca sativa (alface), Musa paradisiaca (banana), Solanum tuberosum (batata), Brassica oleracea (brócolis, couve-flor, couve-de-bruxelas), Camellia sinensis (chá), Fragaria ananassa (morango), Theobroma cacao (cacau), Coffea arabica (café), Vitis vinifera (uva), Ananas comosus (abacaxi), Capsicum annum (jalapeno), Allium cepa (cebola), Cucumis melo (melão), Cucumis sativus (pepino), Cucurbita maxima (abóbora), Cucurbita moschata (abóbora), Spinacea oleracea (espinafre), Citrullus lanatus (melancia), Abelmoschus esculentus (quiabo), Solanum melongena (beringela), Papaver somniferum (papoula do ópio), Papaver orientale, Taxus baccata, Taxus brevifolia, Artemisia annua, Cannabis sativa, Camptotheca acuminate, Catharanthus roseus, Vinca rosea, Cinchona officinalis, Colchicum autumnale, Veratrum californica., Digitalis lanata, Digitalis purpurea, Dioscorea spp., Andrographis paniculata, Atropa belladonna, Datura stomonium, Berberis spp., Cephalotaxus spp., Ephedra sinica, Ephedra spp., Erythroxylum coca, Galanthus wornorii, Scopolia spp., Lycopodium serratum (=Huperzia serrata), Lycopodium spp., Rauwolfia serpentina, Rauwolfia spp., Sanguinaria canadensis, Hyoscyamus spp., Calendula officinalis, Chrysanthemum parthenium, Coleus forskohlii, Tanacetum parthenium, Parthenium argentatum (guayule), Hevea spp. (borracha), Mentha spicata (menta), Mentha piperita (menta), Bixa orellana, Alstroemeria spp., Rosa spp. (rosa), Dianthus caryophyllus (cravo), Petunia spp. (petúnia), Poinsettia pulcherrima (poinsétia), Nicotiana tabacum (tabaco), Lupinus albus (tremoço), Uniola paniculata (aveia), bentgrass (Agrostis spp.), Populus tremuloides (faia), Pinus spp. (pinheiro), Abies spp. (abeto), Acer spp. (bordo), Hordeum vulgare (cevada), Poa pratensis (cabelo-de-cão), Lolium spp. (azevém), Phleum pratense (erva-dos-prados) e coníferas. São de interesse plantas cultivadas para produção de energia, assim chamadas culturas de energia, tais como culturas de energia à base de celulose como Panicum virgatum (painço amarelo), Sorghum bicolor (sorgo, milho-zaburro), Miscanthus giganteus (miscanto), Saccharum sp. (cana de açúcar), Populus balsamifera (álamo-trémulo), Andropogon gerardii (vetiver grande), Pennisetum purpureum (capim- elefante), Phalaris arundinacea (capim-amarelo), Cynodon dactylon (capim-das-bermudas), Festuca arundinacea (festuca-alta), Spartina pectinata (cordilheira de pradaria), Medicago sativa (alfafa), Arundo donax (cana-do-reino), Secale cereale (centeio), Salix spp. (epilóbio), Eucalyptus spp. (eucalipto), Triticosecale spp. (triticum - trigo X centeio) e Bambu; e culturas de energia à base de amido como Zea mays (milho) e Manihot esculenta (mandioca); e culturas de energia à base de sacarose como Saccharum sp. (cana de açúcar) e Beta vulgaris (beterraba sacarina); e culturas de energia produtoras de biodiesel como Glycine max (feijão-soja), Brassica napus (canola), Helianthus annuus (girassol), Carthamus tinctorius (cártamo), Jatropha curcas (jatropha), Ricinus communis (rícino), Elaeis guineensis (palma), Linum usitatissimum (linhaça) e Brassica juncea.
[0132] O polipeptídeo homeobox WUS/WOX pode ser derivado de uma fonte de energia renovável de biomassa. Exemplos de plantas de fonte de energia renovável de biomassa incluem aqueles descritos no presente documento acima.
[0133] O polipeptídeo homeobox WUS/WOX usado nos métodos e composições revelados podem ser um polipeptídeo WUS1. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS1 é um polipeptídeo WUS1 de milho, sorgo, arroz ou Setaria sp. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo WUS1 é um polipeptídeo WUS1 de milho ou arroz. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo WUS1 é um polipeptídeo WUS1 de milho. Em particular, o polipeptídeo WUS1 compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:4 ou o polipeptídeo WUS1 é codificado por uma sequência de nucleotídeos que compreende SEQ ID NO:3.
[0134] O polipeptídeo homeobox WUS/WOX usado nos métodos e composições revelados podem ser um polipeptídeo WUS2. Em vários aspectos, o polipeptídeo WUS2 é um polipeptídeo WUS de cevada, milho, painço, aveias, arroz, centeio, Setaria sp., sorgo, cana de açúcar, painço amarelo, triticale, relva ou trigo. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS2 é um polipeptídeo WUS2 de milho, sorgo, arroz ou Setaria sp. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo WUS2 é um polipeptídeo WUS2 de milho ou arroz. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo WUS2 é um polipeptídeo WUS2 de milho. Em particular, o polipeptídeo WUS2 compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:6 ou o polipeptídeo WUS2 é codificado por uma sequência de nucleotídeos que compreende SEQ ID NO:5.
[0135] O polipeptídeo homeobox WUS/WOX usado nos métodos e composições revelados podem ser um polipeptídeo WUS3. Em um aspecto, o polipeptídeo WUS3 é um polipeptídeo WUS3 de milho, sorgo, arroz ou Setaria sp. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo WUS3 é um polipeptídeo WUS3 de milho ou arroz. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo WUS3 é um polipeptídeo WUS3 de milho. Em particular, o polipeptídeo WUS3 compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:8 ou o polipeptídeo WUS3 é codificado por uma sequência de nucleotídeos que compreende SEQ ID NO:7.
[0136] O polipeptídeo homeobox WUS/WOX usado nos métodos e composições revelados podem ser um polipeptídeo WOX2A. Em um aspecto, o polipeptídeo WOX2A é um polipeptídeo WOX2A de milho, sorgo, arroz ou Setaria sp. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo WOX2A é um polipeptídeo WUS2A de milho ou arroz. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo WOX2A é um polipeptídeo WOX2A de milho. Em particular, o polipeptídeo WOX2A compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:10 ou o polipeptídeo WOX2A é codificado por uma sequência de nucleotídeos que compreende SEQ ID NO:9.
[0137] O polipeptídeo homeobox WUS/WOX usado nos métodos e composições revelados podem ser um polipeptídeo WOX4. Em um aspecto, o polipeptídeo WOX4 é um polipeptídeo WOX4 de milho, sorgo, arroz ou Setaria sp. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo WOX4 é um polipeptídeo WUS4 de milho ou arroz. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo WOX4 é um polipeptídeo WOX4 de milho. Em particular, o polipeptídeo WOX4 compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:12 ou o polipeptídeo WOX4 é codificado por uma sequência de nucleotídeos que compreende SEQ ID NO:11.
[0138] O polipeptídeo homeobox WUS/WOX usado nos métodos e composições revelados podem ser um polipeptídeo WOX5A. Em um aspecto, o polipeptídeo WOX5A é um polipeptídeo WOX5A de milho, sorgo, arroz ou Setaria sp. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo WOX5A é um polipeptídeo WUS5A de milho ou arroz. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo WOX5A é um polipeptídeo WOX5A de milho. Em particular, o polipeptídeo WOX5A compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:14 ou o polipeptídeo WOX5A é codificado por uma sequência de nucleotídeos que compreende SEQ ID NO:13.
[0139] O polipeptídeo homeobox WUS/WOX usado nos métodos e composições revelados podem ser um polipeptídeo WOX9. Em um aspecto, o polipeptídeo WOX9 é um polipeptídeo WOX9 de milho, sorgo, arroz ou Setaria sp. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo WOX9 é um polipeptídeo WUS9 de milho ou arroz. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo WOX9 é um polipeptídeo WOX9 de milho. Em particular, o polipeptídeo WOX9 compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:16 ou o polipeptídeo WOX9 é codificado por uma sequência de nucleotídeos que compreende SEQ ID NO:15.
[0140] A presente revelação abrange composições WUS/WOX de ácido nucleico ou proteína isolado substancialmente purificado. Os fragmentos e variantes das sequências de nucleotídeos WUS/WOX e proteínas codificadas pela mesma também são abrangidos pela presente revelação. Por "fragmento" é concebida uma porção da sequência de nucleotídeos ou uma porção da sequência de aminoácidos e, portanto, a proteína codificada pela mesma. Fragmentos de uma sequência de nucleotídeos pode codificar fragmentos de proteína que retêm a atividade biológica da proteína nativa e, portanto, têm atividade de WUS/WOX. Alternativamente, os fragmentos de uma sequência de nucleotídeos úteis como sondas de hibridização, em geral, não codificam as proteínas em fragmento que retêm atividade biológica. Desse modo, os fragmentos de uma sequência de nucleotídeos podem variar de pelo menos cerca de 20 nucleotídeos, cerca de 50 nucleotídeos, cerca de 100 nucleotídeos e até a sequência de nucleotídeos de comprimento total que codifica as proteínas da revelação.
[0141] Um fragmento de uma sequência de nucleotídeos WUS/WOX que codifica uma porção biologicamente ativa de uma proteína WUS/WOX da revelação codificará pelo menos 15, 25, 30, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 709 aminoácidos contíguos, ou até o número total de aminoácidos presentes em uma proteína WUS/WOX de comprimento total da revelação. Fragmentos de uma sequência de nucleotídeos WUS/WOX úteis como sondas de hibridização ou iniciadores de PCR não precisam, em geral, codificar uma porção biologicamente ativa de uma proteína WUS/WOX.
[0142] Desse modo, um fragmento de uma sequência de nucleotídeos WUS/WOX pode codificar uma porção biologicamente ativa de uma proteína WUS/WOX, ou o mesmo pode ser um fragmento que pode ser usado como uma sonda de hibridização ou iniciador de PCR com o uso de métodos revelados abaixo. Uma porção biologicamente ativa de uma proteína WUS/WOX pode ser preparada isolando-se uma porção de uma das sequências de nucleotídeos WUS/WOX da revelação, expressando-se a porção codificada da proteína WUS/WOX (por exemplo, por meio de expressão recombinante in vitro), e avaliando-se a atividade da porção codificada da proteína WUS/WOX. As moléculas de ácido nucleico que são fragmentos de uma sequência de nucleotídeos WUS/WOX compreendem pelo menos 16, 20, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 800, 900, 1.000, 1.100, 1.200, 1.300 ou 1.400, 1.500, 1.600, 1.700, 1.800, 1.900, 2.000, 2.100, 2.200 nucleotídeos contíguos ou até o número de nucleotídeos presentes em uma sequência de nucleotídeos WUS/WOX de comprimento total revelada no presente documento (por exemplo, SEQ ID NOS: 3, 5, 7, 9, 11, 13 e 15).
[0143] "Variantes" destina-se a significar sequências substancialmente similares. Por polinucleotídeos, variantes conservadoras incluem aquelas sequências que, devido à degenerescência do código genético, codificam a sequência de aminoácidos de um dos polipeptídeos WUS/WOX da revelação. Polinucleotídeos variantes também incluem polinucleotídeos derivados sinteticamente, como aqueles gerados, por exemplo, com o uso de mutagênese direcionada a sítio, mas que ainda codifica uma proteína WUS/WOX da revelação. Geralmente, as variantes de um polinucleotídeo específico da revelação terão pelo menos cerca de 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com aquele polinucleotídeo específico conforme determinado por programas de alinhamento de sequência e parâmetros descritos em outro lugar no presente documento.
[0144] Proteína "variante" se destina a significar uma proteína derivada da proteína nativa por deleção ou adição de um ou mais aminoácidos em um ou mais sítios internos na proteína nativa e/ou substituição de um ou mais aminoácidos em um ou mais sítios na proteína nativa. Proteínas variantes abrangidas pela presente revelação são biologicamente ativas, ou seja, continuam a possuir a atividade biológica desejada da proteína nativa, ou seja, o polipeptídeo tem atividade de WUS/WOX. Tais variantes podem resultar, por exemplo, de polimorfismo genético ou de manipulação humana. As variantes biologicamente ativas de uma proteína nativa WUS/WOX da revelação terão pelo menos cerca de 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais identidade de sequência com a sequência de aminoácidos para a proteína nativa conforme determinado pelos programas de alinhamento de sequência e parâmetros descritos em qualquer lugar no presente documento. Uma variante biologicamente ativa de uma proteína da revelação pode diferir daquela proteína por tão pouco quanto 1 a 15 resíduos de aminoácido, tão pouco quanto 1 a 10, como 6 a 10, tão pouco quanto 5, tão pouco quanto 4, 3, 2 ou até mesmo 1 resíduo de aminoácido.
[0145] As proteínas WUS/WOX da revelação podem ser alteradas de vários modos incluindo substituições, deleções, truncamentos e inserções de aminoácidos. Métodos para tais manipulações são geralmente conhecidos na técnica. Por exemplo, as variantes de sequência de aminoácidos das proteínas WUS/WOX podem ser preparadas por meio de mutações no DNA. Métodos de mutagênese e alterações de sequências de nucleotídeos são bem conhecidos na técnica. Consulte, por exemplo, Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 82:488 a 492; Kunkel et al. (1987) Methods in Enzymol. 154:367 a 382; Patente n° US 4.873.192; Walker e Gaastra, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, Nova York) e as referências citadas na mesma. As diretrizes a respeito de substituições de aminoácido apropriadas que não afetam a atividade biológica da proteína de interesse podem ser encontradas no modelo de Dayhoff, et al., (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.), incorporado ao presente documento a título de referência. Podem ser ideais as substituições conservativas, como troca de um aminoácido por outro com propriedades semelhantes.
[0146] Os métodos e a composição da revelação podem utilizar uma variedade de métodos de transformação conforme adequado. Ou seja, os protocolos de transformação, assim como protocolos para introduzir sequências de nucleotídeo em plantas, podem variar dependendo do tipo de planta ou célula de planta, isto é, monocotiledônea ou dicotiledônea, direcionado para transformação. Os métodos adequados de introdução de sequências de nucleotídeos em células de planta e subsequente inserção no genoma de planta incluem microinjeção (Crossway et al. (1986) Biotechniques 4:320 a 334), eletroporação (Riggs et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 83:5.602 a 5.606, transformação mediada por Agrobacterium (Townsend et al., Patente n° US 5.563.055; Zhao et al., Patente n° US 5.981.840), transferência de gene direta (Paszkowski et al. (1984) EMBO J. 3:2.717 a 2.722) e aceleração de partícula balística (consulte, por exemplo, Sanford et al., Patente n° US 4.945.050; Tomes et al., Patente n° US 5.879.918; Tomes et al., Patente n° US 5.886.244; Bidney et al., Patente n° US 5.932.782; Tomes et al. (1995) "Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment", em Plant Cell, Tissue e Organ Culture: Fundamental Methods, editores Gamborg e Phillips (Springer-Verlag, Berlim); e McCabe et al. (1988) Biotechnology 6:923 a 926). Consulte também Weissinger et al. (1988) Ann. Rev. Genet. 22:421 a 477; Sanford et al. (1987) Particulate Science and Technology 5:27 a 37 (cebola); Christou et al. (1988) Plant Physiol. 87:671 a 674 (feijão- soja); McCabe et al. (1988) Bio/Technology 6:923 a 926 (feijão- soja); Finer e McMullen (1991) In Vitro Cell Dev. Biol. 27P:175 a 182 (feijão-soja); Singh et al. (1998) Theor. Appl. Genet. 96:319 a 324 (feijão-soja); Datta et al. (1990) Biotechnology 8:736 a 740 (arroz); Klein et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 85:4.305 a 4.309 (milho); Klein et al. (1988) Biotechnology 6:559 a 563 (milho); Tomes, Patente n° US 5.240.855; Buising et al., Patente nos US 5.322.783 e 5.324.646; Tomes et al. (1995) "Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment," em Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, editores Gamborg (Springer-Verlag, Berlim) (milho); Klein et al. (1988) Plant Physiol. 91:440 a 444 (milho); Fromm et al. (1990) Biotechnology 8:833 a 839 (milho); Hooykaas-Van Slogteren et al. (1984) Nature (Londres) 311:763 a 764; Bowen et al., Patente n° US 5.736.369 (cereais); Bytebier et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 84:5.345 a 5.349 (Liliaceae); De Wet et al. (1985) em The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, editores Chapman et al. (Longman, Nova York), páginas 197 a 209 (polén); Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Reports 9:415 a 418 e Kaeppler et al. (1992) Theor. Appl. Genet. 84:560 a 566 (transformação mediada por utilização de fibras); D'Halluin et al. (1992) Plant Cell 4:1.495 a 1.505 (eletroporação); Li et al. (1993) Plant Cell Reports 12:250 a 255 e Christou e Ford (1995) Annals of Botany 75:407 a 413 (arroz); Osjoda et al. (1996) Nature Biotechnology 14:745 a 750 (milho por meio de Agrobacterium tumefaciens); todos os quais são incorporados ao presente documento a título de referência.
[0147] Os métodos e a composição da presente revelação podem ser usados para a transformação de quaisquer espécies de planta, incluindo, mas sem limitação, monocotiledôneas e dicotiledôneas. Os exemplos de espécies de planta de interesse incluem, mas sem limitação, milho (Zea mays), Brassica sp. (por exemplo, B. napus, B. rapa, B. juncea), particularmente aquelas espécies de Brassica úteis como fontes de óleo de semente, alfafa (Medicago sativa), arroz (Oryza sativa), centeio (Secale cereale), sorgo (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), milhete (por exemplo, milhete-pérola (Pennisetum glaucum), milho miúdo (Panicum miliaceum), milho painço (Setaria italica), capim-pé-de-galinha-gigante (Eleusine coracana)), girassol (Helianthus annuus), cártamo (Carthamus tinctorius), trigo (Triticum aestivum), soja (Glycine max), tabaco (Nicotiana tabacum), batata (Solanum tuberosum), amendoins (Arachis hypogaea), algodão (Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum), batata doce (Ipomoea batatus), mandioca (Manihot esculenta), café (Coffea spp.), coco (Cocos nucifera), abacaxi (Ananas comosus), árvores de citrinos (Citrus spp.), cacau (Theobroma cacao), chá (Camellia sinensis), banana (Musa spp.), abacate (Persea americana), figueira (Ficus casica), goiaba (Psidium guajava), manga (Mangifera indica), oliveira (Olea europaea), papaia (Carica papaya), caju (Anacardium occidentale), macadâmia (Macadamia integrifolia), amêndoa (Prunus amygdalus), beterraba sacarina (Beta vulgaris), cana-de-açúcar (Saccharum spp.), aveia, cevada, plantas ornamentais e coníferas.
[0148] Os vegetais incluem tomates (Lycopersicon esculentum), alface (por exemplo, Lactuca sativa), feijões verdes (Phaseolus vulgaris), feijões-de-lima (Phaseolus limensis), ervilhas (Lathyrus spp.) e membros do gênero Cucumis, como pepino (C. sativus), cantalupo (C. cantalupensis) e melão (C. melo). As plantas ornamentais incluem azaleia (Rhododendron spp.), hortência (Macrophylla hydrangea), hibisco (Hibiscus rosasanensis), rosas (Rosa spp.), tulipas (Tulipa spp.), narcisos (Narcissus spp.), petúnias (Petunia hybrida), cravo (Dianthus caryophyllus), poinsétia (Euphorbia pulcherrima) e crisântemo.
[0149] As coníferas que podem ser empregadas na prática da presente revelação incluem, por exemplo, pinheiros, como pinheiro (Pinus taeda), pinheiro-americano (Pinus elliotii), pinheiro ponderosa (Pinus ponderosa), pinheiro de lodgepole (Pinus contorta) e pinheiro-de-Monterey (Pinus radiata); pinheiro-do-oregon (Pseudotsuga menziesii); cicuta oriental ou do Canadá (Tsuga canadensis); cicuta ocidental (Tsuga heterophylla); cicuta de montanha (Tsuga mertensiana); lariço americano ou lariço (Larix occidentalis); abeto Sitka (Picea glauca); sequóia (Sequoia sempervirens); abetos verdadeiros, como abeto (Abies amabilis) e abeto balsâmico (Abies balsamea); e cedros, como cedro vermelho ocidental (Thuja plicata) e cedro amarelo do Alasca (Chamaecyparis nootkatensis). As espécies de eucalipto podem ser empregadas na prática da presente revelação, incluindo E. grandis (e seus híbridos, como "urograndis"), E. globulus, E. camaldulensis, E. tereticornis, E.viminalis, E. nitens, E. saligna e E. urophylla. De modo ideal, as plantas da presente revelação são plantas de cultura (por exemplo, milho, alfafa, girassol, Brassica, feijão-soja, algodão, cártamo, amendoim, sorgo, trigo, painço, tabaco, etc.), de modo mais ideal, plantas de milho e feijão-soja, de modo ainda mais ideal, plantas de milho.
[0150] As plantas de interesse específico incluem plantas de grãos que fornecem sementes de interesse, plantas de semente oleaginosa e plantas leguminosas. As sementes de interesse incluem sementes de grãos, como milho, trigo, cevada, arroz, sorgo, centeio, etc. As plantas de semente oleaginosa incluem algodão, feijão-soja, cártamo, girassol, Brassica, milho, alfafa, palma, coco, etc. As plantas leguminosas incluem, mas sem limitação, feijões e ervilhas. Feijões incluem, mas sem limitação, guar, alfarrobeira, feno-grego, feijão-soja, feijões-de-jardim, caupi, feijão mungo, feijão-de- lima, feijão-fava, lentilhas e grão-de-bico.
[0151] Um marcador selecionável compreende um segmento de DNA que permite que um indivíduo identifique ou selecione em favor ou contra uma molécula ou uma célula que contém o mesmo, frequentemente sob condições específicas. Esses marcadores podem codificar uma atividade, tal como, mas sem limitação, a produção de RNA, peptídeo ou proteína, ou podem fornecer um sítio de ligação a RNA, peptídeos, proteínas, composições ou compostos inorgânicos e orgânicos e semelhantes. Os exemplos de marcadores selecionáveis incluem, mas sem limitação, segmentos de DNA que compreendem sítios de enzimas de restrição; segmentos de DNA que codificam produtos que fornecem resistência contra compostos tóxicos de outra forma (por exemplo, antibióticos como espectinomicina, ampicilina, canamicina, tetraciclina, Basta, neomicina fosfotransferase II (NEO) e higromicina fosfotransferase (HPT)); segmentos de DNA que codificam produtos que carecem, de outra forma, na célula recipiente (por exemplo, genes de tRNA, marcadores auxotróficos); segmentos de DNA que codificam produtos que podem ser prontamente identificados (por exemplo, marcadores fenotípicos, como β-galactosidase, GUS; proteínas fluorescentes, como proteína fluorescente verde (GFP), ciano (CFP), amarela (YFP), vermelha (RFP), e proteínas de superfície de célula); a geração de novos sítios de iniciador para PCR (por exemplo, a justaposição de duas sequências de DNA não previamente justapostas), a inclusão de sequências de DNA não atuadas ou atuadas por uma endonuclease de restrição ou outra enzima de modificação de DNA, produto químico, etc.; e, a inclusão de sequências de DNA exigidas para uma modificação específica (por exemplo, metilação) que permite a sua identificação.
[0152] Os marcadores selecionáveis adicionais incluem genes que conferem resistência aos compostos herbicidas, como glifosato, sulfonilureias, amônio glufosinato, bromoxinila, imidazolinonas e 2,4-diclorofenoxiacetato (2,4-D). Consultar, em geral, Yarranton, (1992) Curr. Opin. Biotech. 3:506 a 511; Christopherson, et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 89:6.314 a 6.318; Yao, et al., (1992) Cell 71:63 a 72; Reznikoff, (1992) Mol. Microbiol. 6:2.419 a 2.422; Barkley et al. (1980) em The Operon, páginas 177 a 220; Hu et al. (1987) Cell 48:555 a 566; Brown et al. (1987) Cell 49:603 a 612; Figge et al. (1988) Cell 52:713 a 722; Deuschle et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 86:5.400 a 5.404; Fuerst et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 86:2.549 a 2.553; Deuschle et al. (1990) Science 248:480 a 483; Gossen (1993) Ph.D. Thesis, University of Heidelberg; Reines et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 90:1.917 a 1.921; Labow et al. (1990) Mol. Cell. Biol. 10:3.343 a 3.356; Zambretti et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 89:3.952 a 3.956; Baim et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 88:5.072 a 5.076; Wyborski et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19:4.647 a 4.653; Hillen e Wissman (1989) Topics Mol. Struc. Biol. 10:143 a 162; Degenkolb et al. (1991) Antimicrob. Agents Chemother. 35:1.591 a 1.595; Kleinschnidt et al. (1988) Biochemistry 27:1.094 a 1.104; Bonin (1993) Ph.D. Thesis, University of Heidelberg; Gossen et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 89:5.547 a 5.551; Oliva et al., (1992) Antimicrob Agents Chemother 36:913 a 919; Hlavka et al., (1985) Handbook of Experimental Pharmacology, Volume 78 (Springer-Verlag, Berlin); Gill et al., (1988) Nature 334:721 a 724. Tais revelações são incorporadas ao presente documento a título de referência. A lista acima de marcadores selecionáveis não é destinada a ser limitante. Qualquer marcador selecionável pode ser usado nos métodos e composições.
[0153] Devido à cronologia da embriogênese somática e maturação do embrião para o método descrito ser, então, truncada, o regime de seleção deve ocorrer, consequentemente, de modo rápido a fim de eliminar efetivamente os embriões não transgênicos e as plantas T0 germinadas resultantes. Como resultado, dependendo da severidade do agente seletivo na cronologia curta, a porcentagem de "escapes" recuperados (ou plantas T0 regeneradas que são do tipo selvagem) aumenta. Para eliminar escapes, a seleção tradicional in vitro de eventos transgênicos em cereais ocorreu em uma cronologia de 1,5 a 3 meses com múltiplas subculturas no meio de seleção que é necessário para acumular tecido de calo para regeneração (Gordon-Kamm et al., 1990, Plant Cell 2:603 a 618; Negrotto et al., 2000, Plant Cell Reports; Zhao et al., 2001, Mol. Breed. 8, 323 a 333; Wu et al., 2014, In Vitro Cell. Dev. Biol. 50:9 a 18; consulte Kan Wang, 2014, Agrobacterium Protocols, Volume 1, terceira edição, Springer-Verlag, Nova York para revisão). A presente revelação elimina muito desse seleção de longa duração eliminando-se cultura de calo e, em vez disso, progredindo-se diretamente através da rápida embriogênese e germinação em plantas T0 independentes (sendo que cada uma representa um evento de integração separado), exigindo agentes seletivos que funcionem rapidamente.
[0154] Determinados marcadores selecionáveis úteis no presente método incluem, mas sem limitação, o gene HRA de milho (Lee et al., 1988, EMBO J 7:1.241 a 1.248) que confere resistência às sulfonilureias e imidazolinonas, o gene GAT que confere resistência ao glifosato (Castle et al., 2004, Science 304:1.151 a 1.154), genes que conferem resistência à espectinomicina como o gene aadA (Svab et al., 1990, Plant Mol Biol. 14:197 a 205) e o gene bar que confere resistência ao amônio glufosinato (White et al., 1990, Nucl. Acids Res. 25:1.062), e PAT (ou moPAT para milho, consulte Rasco-Gaunt et al., 2003, Plant Cell Rep.21:569 a 576) e o gene PMI que permite o crescimento em meio que contém manose (Negrotto et al., 2000, Plant Cell Rep. 22:684 a 690) são muito úteis para a rápida seleção durante o breve tempo transcorrido abrangido pela embriogênese somática e maturação embrionária do método. No entanto, dependendo do marcador selecionável usado e da cultura, da consanguinidade ou variedade que é transformada, a porcentagem de escapes do tipo selvagem pode variar. Em milho e sorgo, o gene HRA é eficaz na redução da frequência de escapes do tipo selvagem.
[0155] A presente revelação fornece composições e métodos inovadores para produzir plantas transgênicas com eficiência e velocidade aumentadas. Os métodos e composições revelados podem compreender adicionalmente polinucleotídeos que fornecem traços e características aprimorados.
[0156] Conforme usado no presente documento, "traço" se refere a uma característica fisiológica, morfológica, bioquímica ou física de uma planta ou material de planta específico ou célula. Em alguns casos, essa característica é visível ao olho humano, como a semente ou o tamanho da planta, ou pode ser medida por meio de técnicas bioquímicas, como detecção da proteína, amido ou teor de óleo de semente ou folhas, ou por meio da observação de um processo metabólico ou fisiológico, por exemplo, medindo-se a admissão de dióxido de carbono, ou por meio da observação do nível de expressão de um gene ou genes, por exemplo, empregando-se a análise Northern, RT-PCR, ensaios de expressão de gene em microarranjo ou sistemas de expressão de gene repórter, ou por meio de observações agrícolas como tolerância à tensão, rendimento ou tolerância ao patógeno. Um "traço intensificado" conforme usado na descrição dos aspectos da presente revelação inclui eficiência de uso da água ou tolerância à seca aprimorada ou intensificada, tolerância à tensão osmótica, tolerância à tensão em alta salinidade, tolerância à tensão em calor, tolerância ao frio intensificada, incluindo tolerância à germinação em frio, rendimento aumentado, eficiência de uso de nitrogênio intensificado, crescimento e desenvolvimento da planta precoce, crescimento e desenvolvimento da planta tardio, proteína da semente intensificada e produção de óleo de semente intensificada.
[0157] Qualquer polinucleotídeo de interesse pode ser usado nos métodos da revelação. Várias alterações no fenótipo são de interesse incluindo a modificação da composição de ácido graxo em uma planta, alteração do teor de aminoácido, teor de amido ou teor de carboidrato de uma planta, alteração de um mecanismo de defesa de patógeno da planta, afetar o tamanho de núcleo, carregamento de sacarose, e semelhantes. O gene de interesse também pode estar envolvido na regulação do influxo de nutrientes, e na regulação de expressão de gene fitato particularmente aos níveis de fitato inferiores na semente. Esses resultados podem ser obtidos fornecendo-se a expressão de produtos heterólogos ou expressão aumentada de produtos endógenos em plantas. Alternativamente, os resultados podem ser obtidos fornecendo-se uma redução de expressão de um ou mais produtos endógenos, particularmente, enzimas ou cofatores na planta. Essas mudanças resultam em uma mudança em fenótipo da planta transformada.
[0158] Os genes de interesse são reflexivos dos mercados comerciais e interesses daqueles envolvidos no desenvolvimento da cultura. As culturas e mercados de interesse mudam, e à medida que nações em desenvolvimento abrem os mercados mundiais, novas culturas e tecnologias surgirão também. Além disso, à medida que a compreensão de traços e características agrônomas, tais como rendimento e heterose, aumenta, a escolha de genes para transformação mudará consequentemente. Categorias gerais de genes de interesse incluem, por exemplo, aqueles genes envolvidos em informações, tais como dedos de zinco, aqueles envolvidos em comunicação, tais como as quinases, e aqueles envolvidos em manutenção, tais como proteínas de choque térmico. As categorias específicas de transgenes, por exemplo, incluem traços importantes de codificação de genes para a agronomia, resistência a inseto, resistência à doença, resistência à herbicida, esterilidade, características de grão e produtos comerciais. Os genes de interesse incluem, em geral, aqueles envolvidos em óleo, amido, carboidrato ou metabolismo de nutriente assim como aqueles que afetam o tamanho de núcleo, carregamento de sacarose e semelhantes.
[0159] Os polinucleotídeos introduzidos em um explante por meio dos métodos e composições revelados podem ser operacionalmente ligados a um promotor adequado. “Promotor" significa uma região de DNA que está a montante do início da transcrição e está envolvido no reconhecimento e ligação de RNA polimerase e outras proteínas para iniciar a transcrição, seja incluindo ou não o 5' UTR. Um "promotor de planta" é um promotor com capacidade de iniciar a transcrição em células de planta independentemente de ser ou não de sua origem ser uma célula vegetal. Promotores de planta exemplificativos incluem, mas sem limitação, aqueles que são obtidos a partir de plantas, vírus de planta e bactérias que compreendem genes expressos em células de planta como de Agrobacterium ou Rhizobium. Exemplos de promotores sob controle de desenvolvimento incluem promotores que iniciam a transcrição, de preferência, em determinados tecidos, como folhas, raízes ou sementes. Tais promotores são denominados como "preferenciais para tecido". Os promotores que iniciam a transcrição apenas em determinados tecidos são denominados como "específicos a tecido". Um promotor específico a "tipo de célula" aciona, principalmente, a expressão em determinados tipos de célula em um ou mais órgãos, por exemplo, células vasculares em raízes ou folhas. Um promotor "induzível" ou "reprimível" pode ser um promotor que está sob controle ambiental ou exógeno. Exemplos de condições ambientais que podem afetar a transcrição por meio de promotores induzíveis incluem condições anaeróbicas ou determinados produtos químicos ou a presença de luz. Alternativamente, o controle exógeno de um promotor induzível ou reprimível pode ser afetado fornecendo-se um produto químico adequado ou outro agente que, por meio de interação com polipeptídeos-alvo, resulta em indução ou repressão do promotor. Promotores específicos a tecido, preferenciais para tecido, específicos a tipo de célula e induzíveis constituem a classe de promotores “não constitutivos”. Um promotor "constitutivo” é um promotor que é ativo sob a maioria das condições. Conforme usado no presente documento, "orientação antissenso" inclui referência a uma sequência de polinucleotídeos que é operacionalmente ligada a um promotor em uma orientação em que o padrão antissenso é transcrito. A cadeia antissenso é suficientemente complementar a um produto de transcrição endógena, de modo que a tradução do produto de transcrição endógena seja frequentemente inibida. “Operacionalmente ligado" se refere à associação de dois ou mais fragmentos de ácido nucleico em um único fragmento de ácido nucleico para que a função de um seja afetada pelo outro. Por exemplo, um promotor é operacionalmente ligado com uma sequência de codificação quando tem capacidade de afetar a expressão daquela sequência de codificação (isto é, que a sequência de codificação está sob o controle de transcrição do promotor). As sequências de codificação podem ser operacionalmente ligadas às sequências reguladoras em uma orientação senso ou antissenso.
[0160] Traços importantes no campo de agronomia, tais como teor de óleo, amido e proteína podem ser geneticamente alterados além do uso de métodos tradicionais de melhoramento. As modificações incluem aumentar o teor de ácido oleico, óleos saturados e insaturados, aumentar níveis de lisina e enxofre, fornecer aminoácidos essenciais e também a modificação e amido. As modificações de proteína de hordotionina são descritas em Patentes nos US 5.703.049, 5.885.801, 5.885.802 e 5.990.389, incorporadas ao presente documento a título de referência. Um outro exemplo é proteína da semente rica em lisina e/ou enxofre codificada pela albumina 2S do feijão-soja descrita na Patente US n° 5.850.016, e o inibidor de quimotripsina da cevada, descrito em Williamson et al. (1987) Eur. J. Biochem. 165:99 a 106, cujas revelações são incorporadas ao presente documento a título de referência.
[0161] Derivados das sequências de codificação podem ser produzidos por meio de mutagênese direcionada a sítio para aumentar o nível de aminoácidos pré-selecionados no polipeptídeo codificado. Por exemplo, as proteínas de planta rica em metionina como da semente de girassol (Lilley et al. (1989) Proceedings of the World Congress on Vegetable Protein Utilization in Human Foods and Animal Feedstuffs, editor Applewhite (American Oil Chemists Society, Champaign, Ill.), páginas 497 a 502; incorporado ao presente documento a título de referência); milho (Pedersen et al. (1986) J. Biol. Chem. 261:6.279; Kirihara et al. (1988) Gene 71:359; ambos os quais são incorporados ao presente documento a título de referência); e arroz (Musumura et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:123, incorporado ao presente documento a título de referência) poderiam ser usadas. Outros genes agronoquimicamente importantes codificam látex, Floury 2, fatores crescimento, fatores de armazenamento de semente e fatores de transcrição.
[0162] Os genes de resistência a inseto podem codificar resistência a pragas que têm grande perda de rendimento, tais como lagarta da raiz, lagarta-rosca, broca europeia do milho e semelhantes. Tais genes incluem, por exemplo, genes de proteína tóxicos de Bacillus thuringiensis (Patentes nos US 5.366.892; US 5.747.450; US 5.736.514; US 5.723.756; US 5.593.881; e Geiser et al. (1986) Gene 48:109); e semelhantes.
[0163] Os genes que codificam traços de resistência à doença incluem genes de desintoxicação, tais como contra fumonisina (Patente n° 5.792.931); genes de resistência à avirulência (avr) e doença (R) (Jones et al. (1994) Science 266:789; Martin et al. (1993) Science 262:1.432; e Mindrinos et al. (1994) Cell 78:1089); e semelhantes.
[0164] Os traços de resistência a herbicidas pode incluir genes que codificam a resistência para herbicidas que atuam para inibir a ação de acetolactato sintase (ALS), em particular os herbicidas do tipo sulfonilureia (por exemplo, o gene de acetolactato sintase (ALS) que contém mutações que levam a tal resistência, em particular, as mutações S4 e/ou Hra), genes que codificam a resistência a herbicidas que atuam para inibir a ação de glutamina sintase, como fosfinotricina ou basta (por exemplo, o gene bar), glifosato (por exemplo, o gene EPSPS e o gene GAT; consultar, por exemplo, a Publicação n° U.S. 20040082770 e WO 03/092360) ou outros tais genes conhecidos na técnica. O gene bar codifica a resistência ao basta herbicida, o gene nptII codifica a resistência aos antibióticos canamicina e geneticina, e os mutantes de gene ALS codificam a resistência ao herbicida clorsulfurona.
[0165] Os genes de esterilidade também podem ser codificados em um cassete de expressão e fornecem uma alternativa para despaniculação física. Exemplos de genes usados em tais modos incluem genes preferenciais a tecido de macho e genes com fenótipos de esterilidade de macho como QM, descrito na Patente n° US 5.583.210. Outros genes incluem quinases e aqueles compostos de codificação tóxicos ao desenvolvimento gametofítico de macho ou fêmea.
[0166] A qualidade do grão é refletida nos traços como níveis e tipos de óleos, saturado e insaturado, qualidade e quantidade de aminoácidos essenciais e níveis de celulose. Em milho, as proteínas de hordotionina modificadas são descritas nas Patentes nos US 5.703.049, 5.885.801, 5.885.802 e 5.990.389.
[0167] Os traços comerciais também podem ser codificados em um gene ou genes que podem aumentar, por exemplo, o amido para a produção de etanol ou fornecer a expressão de proteínas. Outro uso comercial importante de plantas transformadas é a produção de polímeros e bioplásticos, como os descritos na Patente n° US 5.602.321. Os genes, como β-Cetotiolase, PHBase (poli- hidroxiburirato sintase) e acetoacetil-CoA redutase (consultar Schubert et al. (1988) J. Bacteriol. 170:5.837 a 5.847) facilitam a expressão de poli-hidroxialcanoatos (PHAs).
[0168] Os produtos exógenos incluem enzimas e produtos vegetais assim como aqueles de outras fontes incluindo procariontes e outros eucariontes. Tais produtos incluem enzimas, cofatores, hormônios e semelhantes. O nível de proteínas, particularmente proteínas modificadas que têm distribuição de aminoácidos aprimorada para aprimorar o valor de nutrientes da planta, pode ser aumentado. Isso é alcançado pela expressão de tais proteínas que têm teor de aminoácidos acentuado.
[0169] Em um aspecto, os traços agronômicos adicionais de interesse que podem ser introduzidos em explantes com eficiência e velocidade aumentadas são tais traços com rendimento aumentado ou outro traço que forneça valor de planta aumentado, incluindo, por exemplo, qualidade de semente aprimorada. São de interesse específico os traços que fornecem eficiência de uso da água ou tolerância à seca aprimorada ou intensificada, tolerância à tensão osmótica, tolerância à tensão em alta salinidade, tolerância à tensão em calor, tolerância ao frio intensificada, incluindo tolerância à germinação em frio, rendimento aumentado, eficiência de uso de nitrogênio intensificado, crescimento e desenvolvimento da planta precoce, crescimento e desenvolvimento da planta tardio, proteína da semente intensificada e produção de óleo de semente intensificada.
[0170] Muitos traços agronômicos podem afetar o "rendimento", incluindo, mas sem limitação, altura da planta, quantidade de vagens, posição da vagem na planta, quantidade de internódios, incidência de pedaços da vagem, tamanho de grão, eficiência da nodulação e fixação de nitrogênio, eficiência de assimilação de nutriente, resistência à tensão biótica e abiótica, assimilação de carbono, arquitetura da planta, resistência ao acamamento, germinação de semente em percentual, vigor da semente e traços juvenis. Outros traços que podem afetar o rendimento incluem, eficiência da germinação (incluindo germinação em condições de tensão), taxa de crescimento (incluindo taxa de crescimento em condições de tensão), quantidade de espigas, quantidade de semente por espiga, tamanho da semente, composição da semente (amido, óleo, proteína) e características do enchimento da semente. Também é de interesse a geração de plantas transgênicas que demonstram propriedades fenotípicas desejáveis que podem ou não conferir um aumento no rendimento da planta geral. Tais propriedades incluem morfologia de planta aumenta, fisiologia de planta ou componentes aprimorados da semente madura colhida da planta transgênica.
[0171] “Rendimento aumentado" de uma planta transgênica da presente revelação pode ser evidenciado e medido de vários modos, incluindo peso em teste, quantidade de semente por planta, peso da semente, quantidade de semente por unidade de área (isto é sementes ou peso das sementes por acre), alqueires por acre, toneladas por acre, quilo por hectare. Por exemplo, o rendimento do milho pode ser medido como a produção de núcleos de milho envolvidos por unidade de área de produção, por exemplo, em alqueires por acre ou toneladas métricas por hectare, frequentemente relatados com base em umidade ajustada, por exemplo, em 15,5% de umidade. O rendimento aumentado pode resultar da utilização aprimorada de compostos bioquímicos chave, como nitrogênio, fósforo e carboidrato, ou de tolerância aprimorada às tensões ambientais, como frio, calor, seca, sal e ataque de pragas ou patógenos. O DNA recombinante de intensificação de traço também pode ser usado para fornecer plantas transgênicas que têm crescimento e desenvolvimento aprimorado e, por fim, rendimento aumentado, como resultado da expressão modificada de reguladores de crescimento da planta ou modificação de ciclo da célula ou trajetórias de fotossíntese.
[0172] Muitos traços agronômicos podem afetar o "rendimento", incluindo, mas sem limitação, altura da planta, quantidade de vagens, posição da vagem na planta, quantidade de internódios, incidência de pedaços da vagem, tamanho de grão, eficiência da nodulação e fixação de nitrogênio, eficiência de assimilação de nutriente, resistência à tensão biótica e abiótica, assimilação de carbono, arquitetura da planta, resistência ao acamamento, germinação de semente em percentual, vigor da semente e traços juvenis. Outros traços que podem afetar o rendimento incluem, eficiência da germinação (incluindo germinação em condições de tensão), taxa de crescimento (incluindo taxa de crescimento em condições de tensão), quantidade de espigas, quantidade de semente por espiga, tamanho da semente, composição da semente (amido, óleo, proteína) e características do enchimento da semente. Também é de interesse a geração de plantas transgênicas que demonstram propriedades fenotípicas desejáveis que podem ou não conferir um aumento no rendimento da planta geral. Tais propriedades incluem morfologia de planta aumenta, fisiologia de planta ou componentes aprimorados da semente madura colhida da planta transgênica.
[0173] Em um aspecto, os métodos e composições revelados podem ser usados para introdução em plantas, com eficiência e velocidade aumentadas, polinucleotídeos úteis para supressão de gene de um gene-alvo em uma planta. A redução da atividade de genes específicos (também conhecidos como silenciamento de gene ou supressão de gene) é desejável por diversos aspectos de engenharia genética em plantas. Muitas técnicas para silenciamento de gene são bem conhecidas por uma pessoa versada na técnica, incluindo, mas sem limitação, tecnologia antissenso (consulte, por exemplo, Sheehy et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 85:8.805 a 8.809; e Patentes nos US 5.107.065; 5.453.566; e 5.759.829); cossupressão (por exemplo, Taylor (1997) Plant Cell 9:1.245; Jorgensen (1990) Trends Biotech. 8(12):340 a 344; Flavell (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 91:3.490 a 3.496; Finnegan et al. (1994) Bio/Technology 12: 883 a 888; e Neuhuber et al. (1994) Mol. Gen. Genet. 244:230 a 241); interferência de RNA (Napoli et al. (1990) Plant Cell 2:279 a 289; Patente n° US 5.034.323; Sharp (1999) Genes Dev. 13:139 a 141; Zamore et al. (2000) Cell 101:25 a 33; Javier (2003) Nature 425:257 a 263; e, Montgomery et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 95:15.502 a 15.507), silenciamento de gene induzido por vírus (Burton, et al. (2000) Plant Cell 12:691 a 705; e Baulcombe (1999) Curr. Op. Plant Bio. 2:109 a 113); ribozimas específicas a RNA-alvo (Haseloff et al. (1988) Nature 334: 585 a 591); estruturas de grampo (Smith et al. (2000) Nature 407:319 a 320; WO 99/53050; WO 02/00904; e WO 98/53083); ribozimas (Steinecke et al. (1992) EMBO J. 11:1.525; Patente n° US 4.987.071; e, Perriman et al. (1993) Antisense Res. Dev. 3:253); modificação direcionada mediada por oligonucleotídeo (por exemplo, WO 03/076574 e WO 99/25853); moléculas direcionadas por dedo de Zn (por exemplo, WO 01/52620; WO 03/048345; e WO 00/42219); micro RNAs artificiais (US8106180; Schwab et al. (2006) Plant Cell 18:1.121 a 1.133); e outros métodos ou combinações dos métodos acima conhecidos por aqueles com habilidade na técnica.
[0174] Em um aspecto, os métodos e composições revelados podem ser usados para introdução em plantas, com eficiência e velocidade aumentadas, polinucleotídeos úteis para direcionar um sítio específico para modificação no genoma de uma planta. As modificações específicas a sítio que podem ser introduzidas com os métodos e composições revelados incluem aquelas produzidas com o uso de qualquer método para introduzir modificação específica a sítio, incluindo, mas sem limitação, através do uso de oligonucleotídeos de reparo de gene (por exemplo, Publicação US 2013/0019349), ou através do uso de tecnologias de ruptura de filamento duplo como TALENs, meganucleases, nucleases de dedo de zinco, CRISPR-Cas, e semelhantes. Por exemplo, os métodos e composições revelados podem ser usados para introduzir um sistema CRISPR-Cas em plantas, com o propósito de modificação de genoma de uma sequência-alvo no genoma de uma planta ou célula de planta, para selecionar plantas, deletar uma base ou uma sequência, para edição de gene e para inserir um polinucleotídeo de interesse no genoma de uma planta. Desse modo, os métodos e composições revelados podem ser usados juntamente com um sistema CRISPR-Cas para fornecer um sistema eficaz para modificar ou alterar sítios-alvo e nucleotídeos de interesse dentro do genoma de uma planta, célula de planta ou semente.
[0175] Em um aspecto, a presente revelação compreende métodos e composições para produzir uma planta transgênica, em que o método compreende introduzir um polinucleotídeo de interesse em um sítio- alvo no genoma de uma célula de planta, sendo que o método compreende (a) transformar uma ou mais células de um explante com um construto de expressão que compreende: (i) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo homeobox WUS/WOX; (ii) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA; ou (iii) uma combinação de (i) e (ii); e (b) permitir a expressão do polipeptídeo de (a) em cada célula transformada para formar uma estrutura de planta regenerável, na ausência de citoquinina, em que nenhum calo é formado; e em que a transformação compreende adicionalmente um primeiro construto de expressão com capacidade de expressar um nucleotídeo-guia e um segundo construto de DNA recombinante com capacidade de expressar uma endonuclease Cas, em que o nucleotídeo-guia e a endonuclease Cas têm capacidade de formar um complexo que possibilita que a endonuclease Cas introduza uma ruptura de filamento duplo no sítio- alvo. Alternativamente, o construto de expressão que compreende a sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo homeobox WUS/WOX e/ou sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA também pode compreender uma sequência de nucleotídeos com capacidade de expressar o nucleotídeo-guia e uma sequência de nucleotídeos com capacidade de expressar a endonuclease Cas.
[0176] Em um aspecto, o gene endonuclease Cas é uma endonuclease Cas9 otimizada para planta, em que a endonuclease Cas9 otimizada para planta tem capacidade de se ligar e criar uma ruptura de filamento duplo em uma sequência-alvo genômica do genoma de planta.
[0177] A endonuclease Cas é guiada pelo nucleotídeo-guia para reconhecer e, opcionalmente, introduzir uma ruptura de filamento duplo em um sítio-alvo específico no genoma de uma célula. O sistema CRISPR-Cas fornece um sistema eficaz para modificar sítios-alvo dentro do genoma de uma planta, célula de planta ou semente. São adicionalmente fornecidos métodos e composições que empregam um sistema de polinucleotídeo-guia/endonuclease Cas para fornecer um sistema eficaz para modificar sítios-alvo dentro do genoma de uma célula e para editar uma sequência de nucleotídeos no genoma de uma célula. Uma vez que um sítio-alvo genômico seja identificado, uma variedade de métodos pode ser empregue para modificar adicionalmente os sítios-alvo de modo que os mesmos contenham uma variedade de polinucleotídeos de interesse. As composições e métodos reveladas podem ser usadas para introduzir um sistema CRISPR-Cas para editar uma sequência de nucleotídeos no genoma de uma célula. A sequência de nucleotídeos a ser editada (a sequência de nucleotídeos de interesse) pode estar localizada dentro ou fora de um sítio-alvo que é reconhecido por uma endonuclease Cas.
[0178] Os loci de CRISPR (Repetições Palindrômicas Curtas Intercaladas Regularmente Agrupadas) (também conhecidos como SPIDRs- SPacer Repetições Diretas Intercaladas) constituem uma família de loci de DNA recentemente descrita. Os loci de CRISPR consistem em repetições de DNA curtas e altamente conservadas (tipicamente 24 a 40 bp, repetidas de 1 a 140 vezes-também denominadas repetições CRISPR) que são parcialmente palindrômicas. As sequências repetidas (normalmente específicas a uma espécie) são Intercaladas por meio de sequências variáveis de comprimento constante (tipicamente 20 a 58 dependendo do locus de CRISPR (WO2007/025097 publicado em 01 de março de 2007).
[0179] Os loci de CRISPR foram, primeiro, reconhecidos em E. coli (Ishino et al. (1987) J. Bacterial. 169:5.429 a 5.433; Nakata et al. (1989) J. Bacterial. 171 :3.553 a 3.556). Repetições de sequência curta intercalada semelhantes foram identificadas em Haloferax mediterranei, Streptococcus pyogenes, Anabaena e Mycobacterium tuberculosis (Groenen et al. (1993) Mol. Microbiol. 10:1.057 a 1.065; Hoe et al. (1999) Emerg. Infect. Dis. 5:254 a 263; Masepohl et al. (1996) Biochim. Biophys. Acta 1307:26 a 30; Mojica et al. (1995) Mol. Microbiol. 17:85 a 93). Os loci de CRISPR diferem de outros SSRs pela estrutura das repetições, que foram denominadas repetições regularmente espaçadas curtas (SRSRs) (Janssen et al. (2002) OMICS J. Integ. Biol. 6:23 a 33; Mojica et al. (2000) Mol. Microbiol. 36:244 a 246). As repetições são elementos curtos que ocorrem em agrupamentos, que são sempre regularmente espaçados por sequências variáveis de comprimento constante (Mojica et al. (2000) Mol. Microbiol. 36:244 a 246).
[0180] O gene Cas inclui um gene que é geralmente acoplado, associado ou que está próximo ou na vizinhança de loci de CRISPR flanqueadoras. Os termos "gene Cas" e "gene (Cas) associado a CRISPR" são usados intercambiavelmente no presente documento. Uma revisão abrangente da família da proteína Cas é apresentada em Haft et al. (2005) Computational Biology, PLoS Comput Biol 1 (6): e60. doi:10.1371 / journal.pcbi.0010060.
[0181] Além das quatro famílias de genes inicialmente descritas, 41 famílias de genes (Cas) associado a CRISPR foram descritas no documento WO/2015/026883, que é incorporado no presente documento a título de referência. Essa referência mostra que os sistemas CRISPR pertencem a diferentes classes, com diferentes padrões de repetição, conjuntos de genes e variações de espécies. O número de genes Cas em um dado locus CRISPR pode variar entre espécies. A endonuclease Cas se refere a uma proteína Cas codificada por um gene Cas, em que a proteína Cas tem capacidade de introduzir uma ruptura de filamento duplo em uma sendo que de DNA. A endonuclease Cas é orientada pelo polinucleotídeo-guia para reconhecer e, opcionalmente, introduzir uma ruptura de filamento duplo em um sítio-alvo específico no genoma de uma célula. Conforme usado no presente documento, o termo "sistema de polinucleotídeo-guia/endonuclease Cas” inclui um complexo de uma endonuclease Cas e um polinucleotídeo-guia que tem capacidade de introduzir uma ruptura de filamento duplo em uma sequência-alvo de DNA. A endonuclease Cas desenrola o dúplex de DNA em estreita proximidade do sítio-alvo genômico e cliva ambos os filamentos de DNA mediante o reconhecimento de uma sequência-alvo por um nucleotídeo-guia, mas apenas se o motivo adjacente a protoespaçador (PAM) correto for aproximadamente orientado na extremidade 3' da sequência-alvo (consulte Figura 2A e Figura 2B do documento WO/2015/026883, publicado em 26 de fevereiro de 2015).
[0182] Em um aspecto, o gene de endonuclease Cas é uma endonuclease Cas9, como, mas sem limitação, genes Cas9 listados em SEQ ID NOs: 462, 474, 489, 494, 499, 505 e 518 do documento WO2007/025097, publicado em 01 de março de 2007, e incorporado ao presente documento a título de referência. Em um outro aspecto, o gene de endonuclease Cas é endonuclease Cas9 otimizada para planta, milho ou feijão-soja como, mas sem limitação aquelas mostradas na Figura 1A do documento WO/2015/026883. Em um outro aspecto, o gene de endonuclease Cas é ligado operacionalmente a um sinal de direcionamento nuclear de SV40 a montante da região de códon de Cas e um sinal de localização nuclear de VirD2 bipartido (Tinland et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 89:7.442 a 7.446) a jusante da região de códon de Cas.
[0183] Em um aspecto, o gene de endonuclease Cas é um gene de endonuclease Cas9 da SEQ ID NO:1, 124, 212, 213, 214, 215, 216, 193 ou nucleotídeos 2.037 a 6.329 de SEQ ID NO:5, ou qualquer fragmento funcional ou variante do mesmo, do documento WO/2015/026883.
[0184] Os termos “fragmento funcional", "fragmento que é funcionalmente equivalente" e "fragmento funcionalmente equivalente" são usados intercambiavelmente no presente documento. Esses termos se referem a uma porção ou subsequência da sequência de endonuclease Cas da presente revelação em que a capacidade para criar uma ruptura de filamento duplo é retida.
[0185] Os termos "variante funcional", "variante que é funcionalmente equivalente" e "variante funcionalmente equivalente" são usados intercambiavelmente no presente documento. Esses termos se referem a uma variante da endonuclease Cas da presente revelação em que a habilidade de criar uma ruptura de filamento duplo é mantida. Os fragmentos e as variantes podem ser obtidos por meio de métodos, tais como mutagênese dirigida a sítio e construção sintética.
[0186] Em um aspecto, o gene de endonuclease Cas é um códon de planta otimizado gene Cas9 de Streptococcus pyogenes que pode reconhecer qualquer sequência genômica da forma N(12-30)NGG pode, em princípio, ser direcionada.
[0187] As endonucleases são enzimas que clivam a ligação de fosfodiéster em uma cadeia de polinucleotídeos, e incluem endonucleases de restrição que clivam o DNA em sítios específicos sem danificar as bases. As endonucleases de restrição incluem endonucleases do Tipo I, Tipo II, Tipo III e Tipo IV, que incluem, ainda, subtipos. Nos sistemas do Tipo I e Tipo III, as atividades tanto de metilase quanto de restrição estão contidas num complexo único. As endonucleases também incluem meganucleases, também conhecidas como endonucleases direcionadas (do tipo homing) (HEases) que, como as endonucleases de restrição, se ligam e cortam em um sítios de reconhecimento específico, no entanto, os sítios de reconhecimento para as meganucleases são tipicamente mais longos, cerca de 18 bp ou mais (Pedido de patente PCT/US 12/30061 depositado em 22 de março de 2012). As meganucleases foram classificadas em quatro famílias com base em motivos de sequência conservados, as famílias são as famílias de LAGLIDADG, GIY-YIG, H-N-H e His-Cys box. Esses motivos participam na coordenação de íons metálicos e hidrólise de ligações fosfodiéster. Meganucleases são notáveis em seus sítios de reconhecimento longo e para tolerar alguns polimorfismos de sequência em seus substratos de DNA. A convenção de nomenclatura para meganuclease é similar à convenção para outra endonuclease de restrição. As meganucleases também são caracterizadas por prefixo F-, I- ou PI- para enzimas codificadas por ORFs, íntrons e inteínas independentes, respectivamente. Uma etapa no processo de recombinação envolve clivagem polinucleotídica no ou próxima ao sítio de reconhecimento. Essa atividade de clivagem pode ser usada para produzir uma ruptura de filamento duplo. Para revisões de recombinases específicas a sítio e seus sítios de reconhecimento, consulte, Sauer (1994) Curr Op Biotechnol 5:521 a 527; e Sadowski (1993) FASEB 7:760 a 767. Em alguns exemplos, a recombinase é das famílias Integrase ou Resolvase. As nucleases de efetor TAL são uma nova classe de nucleases sequência-específicas que pode ser usada para realizar quebras de filamento duplo em sequências alvo específicas no genoma de uma planta ou outro organismo. (Miller, et al. (2011) Nature Biotechnology 29:143 a 148). As nucleases de dedo de zinco (ZFNs) são agente de indução de ruptura de filamento duplo manipulados compreendidos de um domínio de ligação ao DNA de dedo de zinco e um domínio de agente de indução de ruptura de filamento duplo. A especificidade de sítio de reconhecimento é conferida pelo domínio de dedo de zinco, que compreende, tipicamente, dois, três ou quatro dedos de zinco, por exemplo, que tem uma estrutura C2H2, no entanto, outras estruturas de dedo de zinco são conhecidas e foram modificadas. Os domínios de dedo de zinco são propícios para projetar polipeptídeos que se ligam especificamente a uma sequência de reconhecimento de polinucleotídeo selecionada. ZFNs incluem um domínio de dedo de zinco de ligação de DNA manipulado ligado a um domínio de endonuclease não específico, por exemplo, domínio de nuclease de uma endonuclease Tipo Ms como Fokl. As funcionalidades adicionas podem ser fundidas ao domínio de ligação de dedo de zinco, incluindo domínios de ativador de transcrição, domínios de repressor de transcrição e metilases. Em alguns exemplos, a dimerização de domínio de nuclease é exigida para a atividade de clivagem. Cada dedo de zinco reconhece três pares pares-base consecutivos no DNA alvo. Por exemplo, um domínio de 3 dedos reconheceu uma sequência de 9 nucleotídeos contíguos, com uma exigência de dimerização da nuclease, dois conjuntos de tripletos de dedo de zinco são usados para ligar uma sequência de reconhecimento de 18 nucleotídeos.
[0188] As bactérias e arqueias evoluíram defesas imunes adaptativas denominadas repetições palindrômicas curtas regularmente Intercaladas agrupadas (CRISPR)/sistemas (Cas) associados a CRISPR que usam RNA curto para direcionar a degradação de ácidos nucleicos estranhos ((documento WO2007/025097 publicado em 01 de março de 2007). O sistema CRISPR tipo II/Cas de bactérias emprega um crRNA e tracrRNA para orientar a endonuclease Cas para o seu alvo de DNA. O crRNA (CRISPR RNA) contém a região complementar a um filamento do DNA-alvo de filamento duplo e pares-base com o tracrRNA (CRISPR RNA de transativação) que formam um dúplex de RNA que orienta a endonuclease Cas a clivar o DNA-alvo.
[0189] Conforme usado no presente documento, o termo "nucleotídeo-guia" se refere a uma fusão sintética de duas moléculas de RNA, um crRNA (RNA de CRISPR) que compreende um domínio de direcionamento variante e um tracrRNA. Em um aspecto, o nucleotídeo- guia compreende um domínio de direcionamento variável de 12 a 30 sequências de nucleotídeos e um fragmento de RNA que pode interagir com uma endonuclease Cas.
[0190] Conforme usado no presente documento, o termo "polinucleotídeo-guia", se refere a uma sequência de polinucleotídeos que pode formar um complexo com uma endonuclease Cas e possibilita que a endonuclease Cas reconheça e, opcionalmente, clive um sítio-alvo de DNA. O polinucleotídeo-guia pode ser uma molécula única ou uma molécula dupla. A sequência de polinucleotídeos-guia pode ser uma sequência de RNA, uma sequência de DNA ou uma combinação das mesmas (uma sequência de combinação de RNA-DNA). Opcionalmente, o polinucleotídeo-guia pode compreender pelo menos um nucleotídeo, ligação fosfodiéster ou modificação de ligação como, mas sem limitação, Ácido Nucleico Bloqueado (LNA), 5- metil dC, 2,6-diaminopurina, 2'-Fluoro A, 2'-Fluoro U, 2'-O-Metil RNA, ligação de fosforotioato, ligação a uma molécula de colesterol, ligação a uma molécula de polietileno glicol, ligação a uma molécula de espaçador 18 (cadeia de hexaetileno glicol), ou ligação covalente 5' a 3’ que resulta em circularização. Um polinucleotídeo-guia que compreende somente ácidos ribonucleicos também é denominado como um "nucleotídeo-guia".
[0191] O polinucleotídeo-guia pode ser uma molécula dupla (também denominada como polinucleotídeo-guia dúplex) que compreende um primeiro domínio de sequência de nucleotídeos (denominado como domínio de Direcionamento Variável ou domínio de VT) que é complementar a uma sequência de nucleotídeos em um DNA-alvo e um segundo domínio de sequência de nucleotídeos (denominado como domínio de reconhecimento de endonuclease Cas ou domínio de CER) que interage com um polipeptídeo de endonuclease Cas. O domínio CER do polinucleotídeo-guia de molécula dupla compreende duas moléculas separadas que são hibridizadas ao longo de uma região de complementariedade. As duas moléculas separadas podem ser RNA, DNA e/ou sequências de combinação de RNA-DNA. Em um aspecto, a molécula de crNucleotídeo do polinucleotídeo-guia dúplex, que compreende um domínio de VT ligado a um domínio de CER, é denominada como "crDNA" (quando composto de uma extensão contígua de nucleotídeos de DNA) ou "crRNA" (quando composto de uma extensão contígua de nucleotídeos de RNA), ou "crDNA-RNA" (quando composto de uma combinação de nucleotídeos de DNA e RNA). O crNucleotídeo pode compreender um fragmento do cRNA de ocorrência natural em Bactérias e Archaea. Em um aspecto, o tamanho do fragmento do cRNA de ocorrência natural em Bactérias e Arqueas está presente em um crNucleotídeo revelado no presente documento pode variar de, mas sem limitação, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais nucleotídeos.
[0192] Em um aspecto, a segunda molécula do polinucleotídeo-guia dúplex que compreende um domínio de CER é denominada como "tracrRNA" (quando composta de uma extensão contínua de nucleotídeos de RNA) ou "tracrDNA" (quando composto de uma extensão contínua de nucleotídeos de DNA) ou "tracrDNA-RNA" (quando composto de uma combinação de DNA e nucleotídeos de RNA. Em um aspecto, o RNA que orienta o complexo de endonuclease Cas9 e RNA, é um RNA duplexado que compreende um crRNA-tracrRNA dúplex.
[0193] O polinucleotídeo-guia pode também ser uma molécula única que compreende um primeiro domínio de sequência de nucleotídeos (denominado como domínio de Direcionamento Variável ou domínio de VT) que é complementar a uma sequência de nucleotídeos em um DNA- alvo e um segundo domínio de nucleotídeo (denominado como domínio de reconhecimento de endonuclease Cas ou domínio de CER) que interage com um polipeptídeo de endonuclease Cas. Por “domínio” significa que uma extensão contígua de nucleotídeos pode ser uma sequência de RNA, DNA e/ou combinação de RNA-DNA. O domínio de VT e/ou o domínio de CER de um polinucleotídeo-guia único pode compreender uma sequência de RNA, uma sequência de DNA ou uma sequência de combinação de RNA- DNA. Em um aspecto, o polinucleotídeo-guia único compreende um crNucleotídeo (que compreende um domínio de VT ligado a um domínio de CER) ligado a um tracrNucleotídeo (que compreende um domínio de CER), em que a ligação é uma sequência de nucleotídeos que compreende uma sequência de RNA, uma sequência de DNA ou uma sequência de combinação de RNA-DNA. O polinucleotídeo-guia único que é compreendido de sequências do crNucleotídeo e do tracrNucleotídeo pode ser denominado como "nucleotídeo-guia único" (quando composto de uma extensão contígua de nucleotídeos de RNA) ou "DNA-guia único” (quando composto de uma extensão contígua de nucleotídeos de DNA) ou "nucleotídeo-DNA-guia único" (quando composto de uma combinação de nucleotídeos de RNA e DNA). Em um aspecto da revelação, o nucleotídeo-guia único compreende um fragmento de cRNA ou cRNA e um fragmento de tracrRNA ou tracrRNA do sistema CRISPR/Cas tipo II que pode formar um complexo com uma endonuclease Cas tipo II, em que o complexo de nucleotídeo-guia e endonuclease Cas pode direcionar a endonuclease Cas para um sítio-alvo genômico da planta, possibilitando que a endonuclease Cas introduza uma ruptura de filamento duplo no sítio-alvo genômico. Um aspecto de uso de um polinucleotídeo-guia único em função de um polinucleotídeo-guia de dúplex é que apenas um cassete de expressão precisa ser feito para expressar o polinucleotídeo-guia único.
[0194] O termo “domínio de direcionamento variável" ou "domínio VT" é usado intercambiavelmente no presente documento e inclui uma sequência de nucleotídeos que é complementar a um filamento (sequência de nucleotídeos) de um sítio-alvo de DNA de filamento duplo. A % de complementação entre o primeiro domínio de sequência de nucleotídeos (domínio de VT ) e a sequência-alvo pode ser pelo menos 50%, 51 %, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61 %, 62%, 63%, 63%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71 %, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%. O domínio-alvo variável pode ser pelo menos 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos de comprimento. Em um aspecto, o domínio de direcionamento variável compreende uma extensão contígua de 12 a 30 nucleotídeos. O domínio de direcionamento variável pode ser composto de uma sequência de DNA, uma sequência de RNA, uma sequência de DNA modificada, uma sequência de RNA modificada ou qualquer combinação das mesmas.
[0195] O termo "domínio de reconhecimento de endonuclease Cas" ou "domínio CER" de um polinucleotídeo-guia é usado intercambiavelmente no presente documento e inclui uma sequência de nucleotídeos (como um segundo domínio de sequência de nucleotídeos de um polinucleotídeo-guia), que interage com um polipeptídeo de endonuclease Cas. O domínio CER pode ser composto de uma sequência de DNA, uma sequência de RNA, uma sequência de DNA modificada, uma sequência de RNA modificada (consultar, por exemplo, as modificações descritas no presente documento), ou qualquer combinação dos mesmos.
[0196] A sequência de nucleotídeos que liga o crNucleotídeo e o tracrNucleotídeo de um polinucleotídeo-guia único pode compreender uma sequência de RNA, uma sequência de DNA ou uma sequência de combinação de RNA-DNA. Em um aspecto, a sequência de nucleotídeos que liga o crNucleotídeo e o tracrNucleotídeo de um único polinucleotídeo-guia pode ter pelo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 , 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71 , 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 78, 79, 80, 81 , 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100 nucleotídeos de comprimento. Em um outro aspecto, a sequência de nucleotídeos que liga o crNucleotídeo e o tracrNucleotídeo de um polinucleotídeo-guia único pode compreender uma sequência de tetralaço, como, mas sem limitação, uma sequência de tetralaço GAAA.
[0197] A modificação de sequência de nucleotídeos do polinucleotídeo-guia, do domínio de VT e/ou do domínio de CER pode ser selecionada, mas sem limitação, a partir do grupo que consiste em um cap 5’, uma cauda poliadenilada de 3’, uma sequência de riboswitch, uma sequência de controle de estabilidade, uma sequência que forma um dúplex de dsRNA, uma modificação ou sequência que direciona o polinucleotídeo-guia para uma localização subcelular, uma modificação ou sequência que fornece rastreamento, uma modificação ou sequência que fornece um sítio de ligação para proteínas, um Ácido Nucleico Bloqueado (LNA), um nucleotídeo 5-metil dC, um nucleotídeo 2,6-Diaminopurina, um nucleotídeo 2’-Flúor A, um nucleotídeo 2’-Flúor U; um nucleotídeo de RNA 2’-O-Metil, uma ligação fosforotioato, uma ligação a uma molécula de colesterol, uma ligação a uma molécula de polietileno glicol, uma ligação a uma molécula de espaçador 18, uma ligação covalente 5’ a 3’ ou qualquer combinação das mesmas. Essas modificações podem resultar em pelo menos um recurso benéfico adicional, em que o recurso benéfico adicional é selecionado dentre o grupo de uma estabilidade modificada ou regulada, um direcionamento subcelular, rastreamento, uma identificação fluorescente, um sítio de ligação para uma proteína ou complexo de proteína, afinidade de ligação modificada a uma sequência-alvo complementar, resistência modificada à degradação celular e permeabilidade celular aumentada.
[0198] Em um aspecto, o nucleotídeo-guia e a endonuclease Cas têm capacidade de formar um complexo que possibilita que a endonuclease Cas introduza uma ruptura de filamento duplo em um DNA sítio-alvo.
[0199] Em um aspecto da revelação, o domínio-alvo variável tem 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos de comprimento.
[0200] Em um aspecto da revelação, o nucleotídeo-guia compreende um fragmento de cRNA ou cRNA e um fragmento de tracrRNA ou tracrRNA do sistema CRISPR/Cas tipo II que pode formar um complexo com uma endonuclease Cas tipo II, em que o complexo de nucleotídeo-guia e endonuclease Cas pode direcionar a endonuclease Cas para um sítio- alvo genômico da planta, possibilitando que a endonuclease Cas introduza uma ruptura de filamento duplo no sítio-alvo genômico. Em um aspecto, o nucleotídeo-guia pode ser introduzido em uma planta ou célula de planta diretamente com o uso de qualquer método conhecido na técnica como, mas sem limitação, aplicações de bombardeio de partícula ou tópicas.
[0201] Em um aspecto, o nucleotídeo-guia pode ser introduzido indiretamente introduzindo-se uma molécula de DNA recombinante que compreende a sequência de DNA-guia correspondente operacionalmente ligada a um promotor específico a planta que tem capacidade de transcrever o nucleotídeo-guia na célula de planta. O termo “DNA- guia correspondente” inclui uma molécula de DNA que é idêntica à molécula de RNA, mas tem um “T” substituído para cada “U” da molécula de RNA.
[0202] Em um aspecto, o nucleotídeo-guia é introduzido por meio de bombardeio de partícula ou uso dos métodos e composições revelados para transformação por Agrobacterium de um construto de DNA recombinante que compreende o DNA-guia correspondente operacionalmente ligado a um promotor de U6 polimerase III de planta.
[0203] Em um aspecto, o RNA que orienta o complexo de RNA e endonuclease Cas9 é um RNA duplexado que compreende um dúplex de crRNA-tracrRNA. Uma vantagem de usar um nucleotídeo-guia em função de um crRNA-tracrRNA duplexado é que apenas um cassete de expressão precisa expressar o nucleotídeo-guia fundido.
[0204] Os termos "sítio-alvo,” "sequência-alvo", "DNA-alvo", "locus-alvo", "sítio-alvo genômico", "sequência-alvo genômica", e " locus-alvo genômico" são usados intercambiavelmente no presente documento e se refere a uma sequência de polinucleotídeos no genoma (incluindo DNA cloro plástico e mitocondrial) de uma célula de planta em que uma ruptura de filamento duplo é induzida no genoma da célula de planta por meio de uma endonuclease Cas. O sítio-alvo pode ser um sítio endógeno no genoma de planta ou, alternativamente, o sítio- alvo pode ser heterólogo à planta e, assim, não ocorrer naturalmente no genoma, ou o sítio-alvo pode ser encontrado em uma localização genômica heteróloga em comparação ao local a mesma ocorre na natureza.
[0205] Conforme usado no presente documento, os termos "sequência-alvo endógena” e "sequência-alvo nativa" são usados intercambiavelmente no presente documento para se referir a uma sequência-alvo que é endógena ou nativa ao genoma de uma planta e está na posição endógena ou nativa daquela sequência-alvo no genoma da planta. Em um aspecto, o sítio-alvo pode ser semelhante a um sítio de reconhecimento de DNA ou sítio-alvo que é especificamente reconhecido e/ou ligado por uma ruptura de filamento duplo que induz o agente como uma endonuclease LIG3-4 (publicação de patente US 2009-0133152 A1 (publicado em 21 de maio de 2009) ou uma meganuclease MS26++ (pedido de patente US 13/526912 depositado em 19 de junho de 2012).
[0206] Um “sítio-alvo artificial” ou uma “sequência-alvo artificial” são usados intercambiavelmente no presente documento e se referem a uma sequência-alvo que foi introduzida no genoma de uma planta. Tal sequência-alvo artificial pode ser idêntica em sequência a uma sequência-alvo endógena ou nativa no genoma de uma planta, mas pode estar localizada em uma posição diferente (isto é, uma posição não endógena ou não nativa) no genoma de uma planta.
[0207] Um “sítio-alvo alterado”, uma “sequência-alvo alterada”, “sítio-alvo modificado” e “sequência-alvo modificada” são usados intercambiavelmente no presente documento e se referem a uma sequência-alvo, conforme revelada no presente documento, que compreende pelo menos uma alteração quando comparada a uma sequência-alvo não alterada. Tais “alterações” incluem, por exemplo: (i) substituição de pelo menos um nucleotídeo, (ii) uma deleção de pelo menos um nucleotídeo, (iii) uma inserção de pelo menos um nucleotídeo, ou (iv) qualquer combinação de (i) a (iii).
[0208] Em um aspecto, os métodos e composições revelados podem ser usados para introdução em plantas, com eficiência e velocidade aumentadas, de polinucleotídeos úteis para a integração direcionada de sequências de nucleotídeos em uma planta. Por exemplo, os métodos e composições revelados podem ser usados para introduzir cassetes de transferência que compreendem sequências de nucleotídeos de interesse flanqueadas por sítios de recombinação não idênticos que são usados para transformar uma planta que compreende um sítio-alvo. Em um aspecto, o sítio-alvo contém pelo menos um conjunto de sítios de recombinação não idênticos que correspondem àqueles no cassete de transferência. A troca das sequências de nucleotídeos flanqueadas pelos sítios de recombinação é efetuada por uma recombinase. Desse modo, os métodos e composições revelados podem ser usados para a introdução de cassetes de transferência para integração direcionada de sequências de nucleotídeos, em que os cassetes de transferência que são flanqueados por sítios de recombinação não idênticos reconhecidos por uma recombinase que reconhece e implanta a recombinação nos sítios de recombinação não idênticos. Consequentemente, os métodos e composição revelados podem ser usados para aprimorar a eficiência e velocidade de desenvolvimento de plantas, derivado de estruturas de planta regenerável, contendo sítios de recombinação não idênticos.
[0209] Em um aspecto, a presente revelação compreende métodos e composições para produzir uma planta transgênica, em que o método compreende introduzir um polinucleotídeo de interesse em um sítio- alvo no genoma de uma célula de planta, sendo que o método compreende (a) transformar uma ou mais células de um explante com um construto de expressão que compreende: (i) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo homeobox WUS/WOX; (ii) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA; ou (iii) uma combinação de (i) e (ii); e (b) permitir a expressão do polipeptídeo de (a) em cada célula transformada para formar uma estrutura de planta regenerável na ausência de citoquinina, em que nenhum calo é formado; em que a transformação compreende adicionalmente transformar uma célula de um explante com um cassete de transferência que compreende uma sequência de nucleotídeos de interesse flanqueada por meio de sítios de recombinação não idênticos; e em que o explante é derivado de uma planta com um genoma que compreende um sítio-alvo flanqueado por sítios de recombinação não idênticos que correspondem aos sítios de flanqueamento do cassete de transferência. O método pode compreender adicionalmente fornecer uma recombinase que reconhece e implanta a recombinação nos sítios de recombinação não idênticos, sendo que a recombinase é fornecida a uma ou mais células do explante, uma estrutura de planta regenerável, uma plântula derivada da estrutura de planta regenerável, ou uma planta derivada de uma plântula derivada de uma estrutura de planta regenerável.
[0210] Desse modo, fornecem-se os métodos e composições revelados podem compreender adicionalmente composições e métodos para a integração direcionada em relação à direção de nucleotídeos exógenos para uma planta transformada. Em um aspecto, os métodos revelados usam sítios de recombinação novos em um sistema de direcionamento de gene que facilita o direcionamento direcional de genes e sequências de nucleotídeos desejados para os sítios de recombinação correspondentes introduzidos anteriormente no genoma-alvo de planta.
[0211] Em um aspecto, uma sequência de nucleotídeos flanqueada por dois sítios de recombinação não idênticos é introduzida em uma ou mais células de um explante derivadas do genoma-alvo do organismo que estabelece um sítio-alvo para inserção de sequências de nucleotídeos de interesse. Uma vez que uma planta estável ou tecido cultivado é estabelecido, um segundo construto ou sequência de nucleotídeos de interesse, flanqueado por sítios de recombinação correspondentes como aqueles que flanqueiam o sítio-alvo, é introduzido na planta estavelmente transformada ou tecidos na presença de uma proteína recombinase. Esse processo resulta em troca das sequências de nucleotídeos entre os sítios de recombinação não idênticos do sítio-alvo e do cassete de transferência.
[0212] Reconhece-se que a planta transformada preparada dessa maneira pode compreender múltiplos sítios-alvo; isto é, conjuntos de sítios de recombinação não idênticos. Dessa maneira, múltiplas manipulações do sítio-alvo na planta transformada estão disponíveis. Por sítio-alvo na planta transformada é pretendida uma sequência de DNA que foi inserida no genoma da planta transformada e compreende sítios de recombinação não idênticos.
[0213] Exemplos de sítios de recombinação para uso no método revelado são conhecidos na técnica e incluem sítios de FRT (Consulte, por exemplo, Schlake e Bode (1994) Biochemistry 33: 12.746 a 12.751; Huang et al. (1991) Nucleic Acids Research 19: 443 a 448; Paul D. Sadowski (1995) In Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology, volume 51, páginas 53 a 91; Michael M. Cox (1989) In Mobile DNA, Berg e Howe (editores) American Society of Microbiology, Washington D. C., páginas 116 a 670; Dixon et al. (1995) 18: 449 a 458; Umlauf e Cox (1988) The EMBO Journal 7: 1.845 a 1.852; Buchholz et al. (1996) Nucleic Acids Research 24: 3.118 a 3.119; Kilby et al. (1993) Trends Genet. 9: 413 a 421: Rossant e Geagy (1995) Nat. Med. 1: 592 a 594; Albert et al. (1995) The Plant J. 7: 649 a 659: Bayley et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18: 353 a 361; Odell et al. (1990) Mol. Gen. Genet. 223: 369 a 378; e Dale e Ow (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 88: 10.558 a 105.620; todos os quais estão incorporados ao presente documento a título de referência.) ; Lox (Albert et al. (1995) Plant J. 7: 649 a 659; Qui et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 91: 1.706 a 1.710; Stuurman et al. (1996) Plant Mol. Biol. 32: 901 a 913; Odell et al. (1990) Mol. Gen. Gevet. 223: 369 a 378; Dale et al. (1990) Gene 91: 79 a 85; e Bayley et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18: 353 a 361). O plasmídeo de dois mícrons encontrado na maioria das cepas de ocorrência natural de Saccharomyces cerevisiae, codifica uma recombinase específica a sítio que promove uma inversão do DNA entre duas repetições invertidas. Essa inversão desempenha um papel central na amplificação de número de cópias de plasmídeo.
[0214] A proteína, designada proteína FLP, catalisa os eventos de recombinação específicos a sítio. O sítio de recombinação mínimo (FRT) foi definido e contém duas repetições de par de 13 bases (bp) invertidas circundando um espaçador de 8 bp assimétrico. A proteína FLP cliva o sítio nas junção das repetições e do espaçador e é covalentemente ligado ao DNA por meio de um 3’ fosfato. As recombinases específicas a sítio como FLP clivam e religam o DNA em sequências-alvo específicas, resultando em uma recombinação precisamente definida entre dois sítios idênticos. Para funcionar, o sistema precisa dos sítios de recombinação e da recombinase. Nenhum fator auxiliar é necessário. Desse modo, todo sistema pode ser inserido em células de planta e funcionar nas mesmas. O sistema de recombinação específico a sítio FLP\FRT de levedura foi mostrado para funcionar em plantas. Até o momento, o sistema foi utilizado para a excisão de DNA indesejado. Consulte, Lyznik et at. (1993) Nucleic Acid Res. 21: 969 a 975. Em contrapartida, a presente revelação utiliza FRTs não idênticos para a troca, direcionamento, disposição, inserção e controle de expressão de sequências de nucleotídeos no genoma de planta.
[0215] Em um aspecto, um organismo transformado de interesse, como um explante de uma planta, que contém um sítio-alvo integrado em seu genoma é necessário. O sítio-alvo é caracterizado por ser flanqueado por sítios de recombinação não idênticos. Um cassete de direcionamento é adicionalmente necessário contendo uma sequência de nucleotídeos flanqueada por sítios de recombinação não idênticos correspondentes como aqueles sítios contidos no sítio-alvo do organismo transformado. Uma recombinase que reconhece os sítios de recombinação não idênticos e catalisa a recombinação específica a sítio é necessária.
[0216] Reconhece-se que a recombinase pode ser fornecida por quaisquer meios conhecidos na técnica. Ou seja, isso pode ser fornecido no organismo ou célula de planta transformando-se o organismo com um cassete de expressão com capacidade de expressar a recombinase no organismo, por meio de expressão transiente, ou fornecendo-se RNA mensageiro (mRNA) para a recombinase ou a proteína recombinase.
[0217] Por "sítios de recombinação não idênticos" pretende-se que os sítios de recombinação de flanqueamento não sejam idênticos em sequência e não irão recombinar ou a recombinação entre os sítios será mínima. Ou seja, um sítio de recombinação de flanqueamento pode ser um sítio de FRT em que o segundo sítio de recombinação pode ser um sítio de FRT submetido à mutação. Os sítios de recombinação não idênticos usados nos métodos da revelação previnem ou suprimem enormemente a recombinação entre os dois sítios de recombinação de flanqueamento e a excisão da sequência de nucleotídeos contida nos mesmos. Consequentemente, reconhece-se que quaisquer sítios de recombinação não idênticos adequados podem ser utilizados na revelação, incluindo sítios de FRT e FRT mutante sites, FRT e sítios lox, lox e sítios lox mutantes, assim como outros sítios de recombinação conhecidos na técnica.
[0218] Por sítio de recombinação não idêntico adequado implica que, na presença de recombinase ativa, ocorre a excisão de sequências entre dois sítios de recombinação não idênticos, caso haja, com uma eficiência consideravelmente menor que a disposição de direcionamento de troca mediada de modo recombinante de sequências de nucleotídeos no genoma de planta. Desse modo, os sítios não idênticos adequados para uso na revelação incluem aqueles sítios em que a eficiência de recombinação entre os sítios é baixa; por exemplo, em que a eficiência é menor que cerca de 30 a cerca de 50%, de preferência menor que cerca de 10 a cerca de 30%, com mais preferência menor que cerca de 5 a cerca de 10%.
[0219] Conforme notado acima, os sítios de recombinação no cassete de direcionamento correspondem àqueles no sítio-alvo da planta transformada. Ou seja, se o sítio-alvo da planta transformada contiver sítios de recombinação não idênticos de flanqueamento de FRT e um FRT mutante, o cassete de direcionamento conterá os mesmos sítios de recombinação não idênticos de FRT e FRT mutante.
[0220] Reconhece-se, adicionalmente, que a recombinase, que é usada nos métodos revelados, dependerá dos sítios de recombinação no sítio-alvo da planta transformada e do cassete de direcionamento. Ou seja, os sítios de FRT são utilizados, a FLP recombinase será necessária. Da mesma maneira, quando os sítios lox forem utilizados, a Cre recombinase é necessária. Se os sítios de recombinação não idênticos compreenderem tanto um FRT quanto um sítio lox, tanto o FLP quanto a Cre recombinase serão necessários na célula de planta.
[0221] A FLP recombinase é uma proteína que catalisa uma reação específica a sítio que está envolvida na amplificação do número de cópias do plasmídeo de dois mícrons de S. cerevisiae durante a replicação de DNA. A proteína FLP foi clonada e expressa. Consulte, por exemplo, Cox (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 80: 4.223 a 4.227. A FLP recombinase para uso na revelação pode ser aquela derivada do gênero Saccharomyces. Pode ser preferencial sintetizar a recombinase com o uso de códons preferenciais para planta para expressão ideal em uma planta de interesse. Consulte, por exemplo, Pedido de n° de série n° US 08/972.258 depositado em 18 de novembro de 1997, intitulado "Novel Nucleic Acid Sequence Encoding FLP Recombinase", incorporado ao presente documento a título de referência.
[0222] A recombinase Cre de bacteriófago catalisa a recombinação específica a sítio entre dois sítios lox. A Cre recombinase é conhecida na técnica. Consulte, por exemplo, Guo et al. (1997) Nature 389: 40 a 46; Abremski et al. (1984) J. Biol. Chem. 259: 1.509 a 1.514; Chen et al. (1996) Somat. Cell Mol. Genet. 22: 477 a 488; e Shaikh et al. (1977) J. Biol. Chem. 272: 5.695 a 5.702. Todos os quais estão incorporados ao presente documento a título de referência. Tal sequência Cre também pode ser sintetizada com o uso de códons preferenciais para planta.
[0223] Quando adequado, as sequências de nucleotídeos a ser inseridas no genoma de planta podem ser otimizadas para a expressão aumentada na planta transformada. Quando os genes de mamíferos, levedura ou bactérias forem usados na revelação, os mesmos podem ser sintetizados com ou uso de códons preferenciais para planta para expressão aprimorada. Reconhece-se que para a expressão em monocotiledôneas, os genes de dicotiledônea também podem ser sintetizados com o uso de códons preferenciais para monocotiledônea. Os métodos estão disponíveis na técnica para sintetizar genes preferenciais para plantas. Consulte, por exemplo, Patentes nos US 5.380.831, 5.436.391 e Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17 : 477 a 498, incorporado ao presente documento a título de referência. Os códons preferenciais para planta podem ser determinados a partir dos códons utilizados mais frequentemente nas proteínas expressas na planta de interesse. Reconhece-se que as sequências preferenciais para monocotiledônea ou dicotiledônea podem ser construídas assim como sequências preferenciais para planta para espécies de planta específicas. Consulte, por exemplo, EPA 0359472; EPA 0385962; WO 91/16432; Perlak et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 88: 3.324 a 3.328; e Murray et al. (1989) Nucleic Acids Research, 17 : 477 a 498. Patente n° US 5.380.831; Patente n° US 5.436.391; e semelhantes, incorporados ao presente documento a título de referência. É adicionalmente reconhecido que toda ou qualquer parte da sequência de gene pode ser otimizada ou sintética. Ou seja, as sequências otimizadas ou parcialmente otimizadas também podem ser usadas.
[0224] As modificações de sequência adicionais são conhecidas por intensificar a expressão de gene em um hospedeiro celular e podem ser usadas na revelação. As mesmas incluem a eliminação de sequências codificadoras de sinais de poliadenilação espúria, sinais de sítio de união de éxon-íntron, repetições semelhantes a transpósons e outras tais sequências bem caracterizadas que podem ser prejudiciais para a expressão de gene. O teor de G-C da sequência pode ser ajustado para níveis médios para um determinado hospedeiro celular, tal como calculado por referência a genes conhecidos expressos na célula hospedeira. Quando possível, a sequência é modificada para evitar estruturas de RNA secundárias em grampo previstas.
[0225] A presente revelação também abrange sítios-alvo de recombinação (FRT) de FLP novos. O FRT foi identificado como uma sequência mínima que compreende duas repetições de 13 pares-base, separadas por um espaçador de 8 bases, conforme segue: 5'- GAAGTTCCTATTC [TCTAGAAA] GTATAGGAACTTC3' em que os nucleotídeos dentro dos colchetes indicam a região do espaçador. Os nucleotídeos na região do espaçador podem ser substituídos por uma combinação de nucleotídeos, tão longa contanto que as duas repetições de 13 bases sejam separadas por oito nucleotídeos. Parece que a sequência de nucleotídeos real do espaçador não é crítica; no entanto, para a prática da revelação, algumas substituições dos nucleotídeos na região do espaçador podem funcionar melhor que outras. O espaçador de oito pares-base está envolvido no emparelhamento de DNA-DNA durante a troca de filamento. A assimetria da região determina a direção do alinhamento de sítio no evento de recombinação, que levará subsequentemente à inversão ou à excisão. conforme indicado acima, a maior parte do espaçador pode ser submetida à mutação sem uma perda de função. Consulte, por exemplo, Schlake e Bode (1994) Biochemistry 33: 12.746 a 12.751, incorporado ao presente documento a título de referência.
[0226] Os sítios mutantes de FRT novos podem ser usados na prática dos métodos revelados. Tais sítios mutantes podem ser construídos por meio de mutagênese baseada em PCR. Embora os sítios de FRT mutante sejam conhecidos (consulte SEQ ID Nos 2, 3, 4 e 5 do documento WO/1999/025821, publicado em 27 de maio de 1999), reconhece-se que outros sítios de FRT mutante podem ser usados na prático da revelação. A presente revelação não é o uso de um sítio de FRT ou recombinação específico, mas, ao invés disso, sítios de recombinação não idênticos ou sítios de FRT podem ser utilizados para a inserção direcionada e expressão de sequências de nucleotídeos em um genoma de planta. Desse modo, outros sítios de FRT mutante podem ser construídos e utilizados com base na presente revelação.
[0227] Conforme discutido acima, juntando-se o DNA genômico que contém um sítio-alvo com sítios de recombinação não idênticos com um vetor que contém um cassete de transferência com sítios de recombinação não idênticos correspondentes, na presença da recombinase, resulta na recombinação. A sequência de nucleotídeos do cassete de transferência localizado entre os sítios de recombinação de flanqueamento é trocada com a sequência de nucleotídeos do sítio-alvo localizada entre os sítios de recombinação de flanqueamento. Dessa maneira, as sequências de nucleotídeos de interesse podem ser precisamente incorporadas no genoma do hospedeiro.
[0228] Reconhece-se que muitas variações da revelação podem ser praticadas. Por exemplo, os sítios-alvo podem ser construídos tendo múltiplos sítios de recombinação não idênticos. Desse modo, múltiplos genes ou sequências de nucleotídeos podem ser empilhados ou ordenados em locais precisos no genoma de planta. Igualmente, uma vez que um sítio-alvo foi estabelecido dentro do genoma, sítios de recombinação adicionais podem ser introduzidos incorporando-se tais sítios na sequência de nucleotídeos do cassete de transferência e a transferência dos sítios na sequência-alvo. Desse modo, uma vez que um sítio-alvo foi estabelecido, é possível adicionar, subsequentemente, sítios ou alterar sítios através de recombinação.
[0229] Uma outra variação inclui fornecer um promotor ou região de iniciação de transcrição operacionalmente ligada ao sítio-alvo em um organismo. De preferência, o promotor estará em 5' do primeiro sítio de recombinação. Transformando-se o organismo com um cassete de transferência que compreende uma região de codificação, a expressão da região de codificação ocorrerá mediante a integração do cassete de transferência no sítio-alvo. Esses aspecto fornece um método para selecionar células transformadas, particularmente células de planta, fornecendo-se uma sequência de marcador selecionável como a sequência de codificação.
[0230] Outras vantagens do presente sistema incluem a habilidade de reduzir a complexidade de integração de transgenes ou DNA transferido em um organismo utilizando-se cassetes de transferência conforme discutido acima e selecionando-se organismos com padrões de integração simples. Da mesma maneira, os sítios preferenciais no genoma podem ser identificados comparando-se diversos eventos de transformação. Um sítio preferencial dentro do genoma inclui um que não interrompe a expressão de sequências essenciais e fornece expressão adequada da sequência de transgene.
[0231] Os métodos revelados também fornecem os meios para combinar múltiplos cassetes em um local dentro do genoma. Sítios de recombinação podem ser adicionados ou deletados em sítios-alvo dentro do genoma.
[0232] Quaisquer meios conhecidos na técnica para unir os três componentes do sistema podem ser usados na revelação. Por exemplo, uma planta pode ser estavelmente transformada para abrigar o sítio- alvo em seu genoma. A recombinase pode ser transientemente expressa ou fornecida. Alternativamente, uma sequência de nucleotídeos que tem capacidade de expressar a recombinase pode ser estavelmente integrada no genoma da planta. Na presença do sítio-alvo correspondente e da recombinase, o cassete de transferência, flanqueado por sítios de recombinação não idênticos correspondentes, é inserido no genoma da planta transformada.
[0233] Alternativamente, os componentes do sistema podem ser unidos cruzando-se sexualmente as plantas transformadas. Nesse aspecto, uma planta transformada, originária um, contendo um sítio- alvo integrado em seu genoma pode ser cruzada sexualmente com uma segunda planta, originária dois, que foi geneticamente transformada com um cassete de transferência que contém sítios de recombinação não idênticos de flanqueamento, que correspondem àqueles na planta um. Qualquer uma dentre planta um ou planta dois contém dentro de seu genoma uma sequência de nucleotídeos que expressa a recombinase. A recombinase pode estar sob o controle de um promotor constitutivo ou induzível.
[0234] Os promotores induzíveis incluem aqueles descritos no presente documento acima, assim como, promotores induzíveis por calor, promotores responsivos a estradiol, promotores induzíveis por produtos químicos, e semelhantes. Os promotores induzíveis por patógeno incluem aqueles provenientes de proteínas relacionadas à patogênese (proteínas PR), que são induzidas em seguida à infecção por um patógeno; por exemplo, proteínas PR, proteínas SAR, beta-1,3- glucanase, quitinase, etc. Consultar, por exemplo, Redolfi, et al., (1983) Neth. J. Plant Pathol. 89: 245 a 254; Uknes et al. (1992) The Plant Cell 4: 645 a 656; e Van Loon (1985) Plant Mol. Virol. 4: 111 a 116. Dessa maneira, a expressão de recombinase e subsequente atividade nos sítios de recombinação podem ser controladas.
[0235] Os promotores constitutivo para uso na expressão de genes em plantas são conhecidos na técnica. Tais promotores incluem, mas sem limitação, promotor 35S do vírus mosaico da couve-flor (Depicker et al. (1982) Mol. Appl. Genet. 1: 561 a 573; Odell et al. (1985) Nature 313: 810 a 812), promotor de ubiquitina (Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18: 675 a 689), promotores dos genes como ribulose bisfosfato carboxilase (De Almeida et al. (1989) Mol. Gen. Genet. 218: 78 a 98), actina (McElroy et al. (1990) Plant J. 2: 163 a 171), histona, DnaJ (Baszczynski et al. (1997) Maydica 42: 189 a 201), e semelhantes.
[0236] As composições e métodos revelados são úteis no direcionamento da integração de sequências de nucleotídeos transferidas para um sítio cromossômico específico. A sequência de nucleotídeos pode codificar qualquer sequência de nucleotídeos de interesse. Os genes de interesse específicos incluem aqueles que fornecem um recurso funcional analisável prontamente para a célula e/ou organismo hospedeiro, como genes de marcados, assim como outros genes que alteram o fenótipo das células recipientes, e semelhantes. Desse modo, os genes que afetam o crescimento da planta, a altura, a suscetibilidade à doença, insetos, valor nutritivo, e semelhantes, podem ser utilizados na revelação. A sequência de nucleotídeos também pode codificar uma sequências “antissenso” para desativar ou modificar a expressão de gene.
[0237] Reconhece-se que as sequências de nucleotídeos serão utilizadas em uma unidade ou cassete de expressão funcional. Por unidade ou cassete de expressão funcional pretende-se que a sequência de nucleotídeos de interesse com um promotor funcional e, na maioria dos casos, uma região de terminação. Há vários modos de obter a unidade de expressão funcional dentro da prática da revelação. Em um aspecto da revelação, o ácido nucleico de interesse é transferido ou inserido no genoma como uma unidade de expressão funcional.
[0238] Alternativamente, a sequência de nucleotídeos pode ser inserida em um sítio dentro do genoma que é 3' para uma região de promotor. Nesse último caso, a inserção da sequência de codificação 3' na região de promotor é tal que uma unidade de expressão funcional é obtida mediante integração. Por questão de conveniência, para expressão em plantas, o ácido nucleico que codifica sítios-alvo e os cassetes de transferência, incluindo as sequências de nucleotídeos de interesse, pode estar contido nos cassetes de expressão. O cassete de expressão compreenderá uma região de iniciação de transcrição, ou promotor, operacionalmente ligado ao ácido nucleico que codifica o peptídeo de interesse. Tal cassete de expressão é dotado de uma pluralidade de sítios de restrição para inserção do gene ou genes de interesse para estar sob a regulação de transcrição das regiões reguladoras.
[0239] A região de iniciação de transcrição, o promotor, pode ser nativo ou homólogo ou externo ou heterólgo ao hospedeiro, ou poderia ser a sequência natural ou uma sequência sintética. Por externo pretende-se que a região de iniciação de transcrição não é encontrada no hospedeiro de tipo selvagem em que a região de iniciação de transcrição é introduzida. Um promotor nativo ou heterólogo pode ser usado em relação à sequência de codificação de interesse.
[0240] O cassete de transcrição incluirá na direção de transcrição 5'-3', uma região de iniciação de transcrição e tradução, uma sequência de DNA de interesse, e uma região de terminação de transcrição e tradução funcional em plantas. A região de terminação pode ser nativa com a região de iniciação de transcrição, pode ser nativa com a sequência de DNA de interesse, ou pode ser derivada de uma outra fonte. As regiões de terminação convenientes estão disponíveis junto ao gene de inibidor de proteinase da batata (PinII) ou sequências de plasmídeo de Ti de A. tumefaciens, como as regiões de terminação nopalina sintase, octopina sintase e opalina sintase. Consulte também, Guerineau et al., (1991) Mol. Gen. Genet. 262: 141 a 144; Proudfoot (1991) Cell 64: 671 a 674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5: 141 a 149; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2: 1.261 a 1.272; Munroe et al. (1990) Gene 91: 151 a 158; Ballas et al. 1989) Nucleic Acids Res. 17 : 7.891 a 7.903; Joshi et al. (1987) Nucleic Acid Res. 15: 9.627 a 9.639.
[0241] Os cassetes de expressão podem adicionalmente conter sequências líder 5' na construção do cassete de expressão. Tais sequências líderes podem atuar para intensificar a tradução. Os líderes de tradução são conhecidos na técnica e incluem: líderes de picornavírus, por exemplo, líder de EMCV (região de não codificação 5’ de encefalomiocardite) (Elroy-Stein, O., Fuerst, T. R., e Moss, B. (1989) PNAS EUA, 86: 6.126 a 6.130); líderes de potivírus, por exemplo, líder de TEV (Vírus Etch do Tabaco) (Allison et al. (1986); líder de MDMV (Vírus Mosaico Anão de Milho); Virology, 154: 9 a 20), e proteína de ligação de cadeia pesada de imunoglobulina humana (BiP), (Macejak, D. G., e P. Sarnow (1991) Nature, 353: 90 a 94; líder não traduzido de MARNA de proteína de revestimento do vírus mosaico da alfafa (AMV RNA 4), (Jobling, S. A., e Gehrke, L., (1987) Nature, 325: 622 a 625; líder do vírus mosaico do tabaco (TMV), (Gallie et al. (1989) Molecular Biology of RNA, páginas 237 a 256, Gallie et al. (1987) Nucl. Acids Res. 15: 3.257 a 3.273; líder de vírus de mancha clorótica do milho (MCMV) (Lornmel, S. A. et al. (1991) Virology, 81: 382 a 385). Consulte também, Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiology, 84: 965 a 968; e sequências não traduzidas 5' de milho endógenas. Outros métodos conhecidos para intensificar a tradução também podem ser utilizados, por exemplo, íntrons, e semelhantes.
[0242] Os cassetes de expressão podem conter um ou mais de um gene ou sequência de ácidos nucleicos a ser transferido ou expresso na planta transformada. Desse modo, cada sequência de ácidos nucleicos será operacionalmente ligada a sequências reguladoras 5' e 3'. Alternativamente, múltiplos cassetes de expressão podem ser fornecidos.
[0243] Os plasmídeos que compreendem T-DNA descrito na Tabela 1 foram usados nos experimentos descritos no presente documento abaixo. Os plasmídeos listados na Tabela 1 abrigar um T-DNA que contém os componentes indicados.Tabela 1. Componentes de Plasmídeo.
[0244] Vários meios são referidos nos Exemplos para uso na transformação e cultura de célula. As composições de meios são descritas abaixo nas Tabelas 2 a 9.Tabela 2. Meios de cultura para transformação de sorgo.
ameios PHI-I, PHI-T, PHI-U, PHI-V, PHI-X, e PHI-Z de Zhao et al. 2000 bestoque de vitaminas de MS: 0,1 g/l de ácido nicotínico, 0,1 g/l de piridoxina HCl, 0,02 g/l de tiamina HCl, 0,4 g/l de glicina. Tabela 3. Composição de meio de infecção por líquido de trigo WI 4.Tabela 4. Composição de meio de cocultivação de trigo WC nº 10.
Tabela 5. Composição de meio de cultura de Tecido Verde do trigo DBC4.
Tabela 6. Composição de meio de indução de Tecido Verde do trigo DBC6.Tabela 7. Composição de meio de regeneração de trigo MSA.Tabela 8. Composição de meio de regeneração de trigo MSB.Tabela 9. Formações de meios para transformação, seleção e regeneração de milho.
Tabela 9, continuação.
[0245] Antes do bombardeamento, 10 a 12 embriões imaturos de DAP foram isolados das espigas dos consanguíneos Pioneer PH184C e colocados em meio de cultura mais 16% de sacarose por três horas para plasmolizar as células escutelárias.
[0246] Quatro plasmídeos foram tipicamente usados para cada bombardeamento de partícula; 1) o plasmídeo doador (100 ng/μl) contendo o cassete doador flanqueado por FRT para Troca de Cassete Mediada por Recombinase, 2) um plasmídeo (2,5 ng/μl) contendo o cassete de expressão UBI PRO::FLPm::PinII, 3) um plasmídeo (10 ng/μl) contendo o cassete de expressão UBI PRO::ODP2::PinII, e 4) um plasmídeo (5 ng/ul) contendo o cassete de expressão UBI::WUS2::PinII. Para fixar o DNA a 0,6 μm de partículas de ouro, os quatro plasmídeos foram misturados adicionando-se 10 μl de cada plasmídeo juntos em um tubo de microcentrífuga de baixa aglutinação (Sorenson Bioscience 39640T) por um total de 40 μl. A essa suspensão, 50 μl de 0,6 μm de partículas de ouro (30 μg/μl) e 1,0 μl de Transit 20/20 (n° de Cat. MIR5404, Mirus Bio LLC) foram adicionados, e a suspensão foi colocada em um agitador giratório por 10 minutos. A suspensão foi centrifugada a 10.000 RPM (~9.400 x g) e o sobrenadante foi descartado. As partículas de ouro foram ressuspensas em 120 μl de 100% de etanol, brevemente sonicadas em baixa potência e 10 μl foram pipetadas em cada inseto. Os insetos foram, então, secos ao ar para remover todo o etanol restante. O bombardeamento de partícula foi realizado com o uso de um Biolistics PDF-1000, a 71,12 cm (28 polegadas) de Mercúrio com um disco de ruptura 200 PSI.
[0247] Agrobacterium tumefaciens que acolhe um vetor de doador binário foi retirada de uma alíquota congelada a -80 °C para meio 12V sólido e cultivada a 28 °C no escuro por 2 a 3 dias para produzir uma placa mestre.
[0248] Uma única colônia ou várias colônias de Agrobacterium foram colhidas da placa mestre e retiradas para uma segunda placa que contém 810 I de meio e incubadas a 28 °C no escuro por 1 a 2 dias. O meio de infecção por Agrobacterium (700 meio; 5 ml) e 100 mM de 3'-5'-Dimetoxi-4'-hidroxiacetofenona (acetossiringona; 5 μl)foram adicionados a um tubo cônico de 14 ml em uma capela. Cerca de 3 ciclos completos de Agrobacterium da segunda placa foram suspensos no tubo e o tubo foi, então, submetido a vórtice para produzir uma suspensão uniforme. A suspensão (1 ml) foi transferida para um tubo de espectrofotômetro e a densidade óptica (550 nm) da suspensão foi ajustada para uma leitura de cerca de 0,35 a 2,0. A concentração de Agrobacterium era aproximadamente 0,5 a 2,0 x 109 cfu/ml. A suspensão final de Agrobacterium foi colocada em alíquotas em tubo de microcentrífuga de 2 ml, sendo que cada um contém cerca de 1 ml da suspensão. As suspensões foram, então, usadas assim que possível.
[0249] Alternativamente, Agrobacterium pode ser preparada para transformação por meio de crescimento em meio líquido. Um dia antes da infecção, um frasco de 125 ml foi preparado com 30 ml de meio 557A (10,5 g/l de fosfato de potássio dibásico, 4,5 g/l de fosfato de potássio monobásico anidro, 1 g/l de sulfato de amônio, 0,5 g/l de desidrato de citrato de sódio, 10 g/l de sacarose, 1 mM de sulfato de magnésio) e 30 μl de espectinomicina (50 mg/ml) e 30 μl de acetossiringona (20 mg/ml). Um meio ciclo de Agrobacterium de uma segunda placa foi suspenso nos frascos e colocado em um agitador orbital definido em 200 rpm e incubado a 28 °C da noite para o dia. A cultura de Agrobacterium foi centrifugada a 5.000 rpm por 10 min. O sobrenadante foi removido e o meio de infecção por Agrobacterium com solução de acetossiringona foi adicionado. As bactérias foram ressuspensas por vórtice e a densidade óptica (550 nm) de suspensão de Agrobacterium foi ajustada para uma leitura de cerca de 0,35 a 2,0.
[0250] As espigas de um cultivar de milho (Zea mays L.) foram esterilizadas em superfície por 15 a 20 min em 20% (v/v) de alvejante (5,25% de hipocloreto de sódio) mais 1 gota de Tween 20 seguido por 3 lavagens em água estéril. Os embriões imaturos (IEs) foram isolados das espigas e foram colocados em 2 ml do meio de infecção por Agrobacterium com solução de acetossiringona. O tamanho ideal dos embriões varia com base no consanguíneo, mas para transformação com WUS2 e ODP2 uma ampla faixa de tamanho de tamanhos de embrião imaturo poderia ser usada. A solução foi extraída e 1 ml de suspensão de Agrobacterium foi adicionada aos embriões e o tubo submetido a vórtice por 5 a 10 s. O tubo de microcentrífuga foi permitido a permanecer por 5 min na capela. A suspensão de Agrobacterium e embriões foram despejados no meio de cocultivação 710I (consulte a Tabela 9). Quaisquer embriões deixados no tubo foram transferidos para a placa com o uso de uma espátula estéril. A suspensão de Agrobacterium foi extraída e os embriões foram colocados com o eixo geométrico virado para baixo nos meios. A placa foi vedada com filme Parafilm M® (plástica flexível resistente à umidade, disponível na Bemis Company, Inc., 1 Neenah Center 4o andar, caixa postal 669, Neenah, WI 54957) e incubada no escuro a 21 °C por 1 a 3 dias de cocultivação.
[0251] Os embriões foram transferidos para o meio de repouso (meio 605T) sem seleção. De três a 7 dias depois, os mesmos foram transferidos para o meio de maturação (meio 289Q) complementado com um agente seletivo.
[0252] O experimento a seguir demonstrou que a expressão de ODP2 e WUS2 imediatamente após a infecção por Agrobacterium resultou em embriogênese somática direta. A. O promotor PLTP que aciona ODP2 e o promotor NOS que aciona a expressão de WUS2 resultou em formação de embrião somático rápida e direta.
[0253] Os embriões imaturos (2 a 2,5 mm de comprimento) foram colhidos do consanguíneo de milho Pioneer PH184C aproximadamente 11 dias polinização, e foram infectados com cepa de Agrobacterium AGL1 que contém um T-DNA com a composição seguinte; RB + NOS PRO::Top2::ZM-WUS2::IN2-1 TERM + ZM-PLTP PRO::ZM-ODP2::OS-T28 TERM + GZ-W64A TERM + UBI PRO::UBI1ZM INTRON::ESR::SB-SAG12 TERM + SB- ALS PRO:: HRA::SB-PEPC1 TERM + LTP2 PRO::ZS-YELLOW::PINII TERM-LB, conforme descrito no Exemplo 3. Para o PLTP PRO, consulte SEQ ID NO. 1. Agrobacterium foi cultivada em meio líquido até uma densidade óptica de 0,5 (em 520 nm) e os embriões imaturos (53, 52 e 56 embriões das três espigas separadas) foram incubados na suspensão de Agrobacterium por 5 minutos antes da remoção do líquido a ser colocado no meio 710I sólido.
[0254] Após 24 horas, os embriões foram removidos para o meio 605T para começar a seleção contra a Agrobacterium. Após 6 dias, vários embriões somáticos pequenos foram observados na superfície de cada um dos 124 embriões imaturos tratados. Cada embrião imaturo continha vários embriões somáticos individuais distintos, sendo que muitos são sustentados em suspensores claramente definidos. Os embriões representativos produzidos pela expressão de ODP2 e WUS 2 são mostrados na Figura 1 e na Figura 2, por exemplo, consulte as setas que apontam para os embriões recentemente formados na Figura 1. Os embriões fluorescentes recentemente formados também são vistos na Figura 2. A imagem na Figura 1 foi capturada 4 dias após o começo da infeção por Agrobacterium, com o uso de um estereomicroscópio com iluminação de cima. O comprimento geral do embrião zigótico é aproximadamente 1,5 mm. Os embriões mostrados na Figura 2 foram transformados com os cassetes de expressão AXIG1::WUS2:: IN2 e PLTP::ODP2::OS-T28, juntamente com um cassete de expressão UBI PRO::ZS-GREEN::PINII. A imagem mostra embriões fluorescentes que crescem na superfície escutelária do embrião zigótico originalmente transformado seguindo o tratamento com o uso dos métodos revelados. Essa imagem foi capturada 4 dias após o começo da infecção por Agrobacterium, com o uso de um estereomicroscópio com fixações de epifluorescência e um conjunto de filtro Leica GFP padrão. O comprimento geral do embrião zigótico é aproximadamente 1,5 mm.
[0255] Sete dias após a infecção por Agro, os embriões foram transferidos para o meio de maturação (meio 289Q com 0,1 mg/l de imazapir), com o uso do herbicida imidazolinona para selecionar embriões transgênicos. Após 14 dias no meio de maturação, os embriões maduros foram movidos para o meio de enraizamento (meio 13158H; meio 13158 mais 25 mg/l de cefotaxima) e pedaços de folha foram amostrados para análise PCR. Dos 53 embriões derivados da primeira espiga, 12 plantas resistentes a herbicida foram analisadas com o uso de análise PCR e enviadas para a estufa entre 32 a 34 dias após o começo do experimento, que foi começado quando a transformação por Agrobacterium foi iniciada. As plantas foram amostradas por PCR tirando-se duas amostras de cada planta, uma de cada uma das duas folhas opostas (dos lados opostos da planta) para confirmar que as plantas não eram quiméricas. Os resultados de PCR para cada par de amostras de todas as plantas indicaram que nenhuma planta quimérica foi produzida, e que as plantas T0 eram transgênicas em termos de homogeneidade. B. Comparando-se nenhuma seleção de herbicida, nenhuma seleção de herbicida com a adição de aminoácidos de cadeia ramificada ou seleção com imazapir.
[0256] Duas réplicas desse experimento foram realizadas, com apenas as diferenças entre as duas réplicas sendo o número de embriões imaturos de partida e os números de embriões (ou plantas) que seguem para os estágio sucessivos do experimento. Para ambas as réplicas, os embriões imaturos do consanguíneo Pioneer PH184C foram infectadas com cepa de Agrobacterium AGL1 (THY-) que contém o seguinte T-DNA (de PHP77833); RB + NOS PRO::Top2::ZM-WUS2::IN2-1 TERM + ZM-PLTP PRO::ZM-ODP2::OS-T28 TERM + GZ-W64A TERM + UBI PRO:UBI1ZM INTRON:ESR::SB-SAG12 TERM + SB-ALS PRO:: HRA::SB-PEPC1 TERM + LTP2 PRO::ZS-YELLOW::PINII TERM-LB. Após uma infecção de 5 minutos na suspensão líquida de Agrobacterium, os embriões imaturos foram transferidos para o meio de cultura sólido (meios 270I) da noite para o dia. No dia seguinte, os embriões foram movidos para um dos três meios, 605T; 605T com 0,1 mg/l de etametsulfurona (que também contém o herbicida imazapir (0,1 mg/l) para seleção) mais aminoácidos de cadeia ramificada (abreviados como "AA", contendo 100 mM de leucina, isoleucina ou valina); ou 605T com 0,1 mg/l de etametsulfurona (que também contém o herbicida imazapir (0,1 mg/l) para seleção) sem aminoácidos de cadeia ramificada. Os embriões foram movidos para o meio de maturação 12 dias depois, com embriões do meio 605T sendo transferidos para o meio 289Q com 0,1 mg/l de imazapir (seleção durante maturação), embriões do meio 605T com 0,1 mg/l de etametsulfurona com AA sendo transferidos para o meio 289Q (seleção precoce, mas sem seleção durante maturação), e embriões do meio 605T com 0,1 mg/l de etametsulfurona movendo-se para o meio 289Q (seleção precoce). Dezesseis dias depois, os embriões com embriões somáticos saudáveis foram movidos para o meio de regeneração 272V.
[0257] Para a primeira réplica desse experimento, 206 embriões foram tratados com Agrobacterium e um dia depois 106, 67, ou 33 embriões foram movidos para o meio 605T (nenhuma seleção para a primeira semana), meio 605T com 0,1 mg/l de etametsulfurona com AA (seleção precoce com AA) ou meio 605T com 0,1 mg/l de etametsulfurona (seleção precoce sem AA), respectivamente. Para a próxima transferência, 45, 16 e 0 embriões foram movidos para seus respectivos meios de maturação. Para a transferência final para o meio de enraizamento, 18, 10 e 0 plântulas (eventos individuais) foram movidos. Desses eventos, 16 e 10 foram amostrados para PCR e 6 e 2 plantas foram consideradas cópia única para os transgenes integrados, com 0 e 2 escapes (plantas do tipo selvagem que sobreviveram ao processo de seleção) foram observados, respectivamente. Para essa réplica do experimento, o tempo total transcorrido da infecção por Agrobacterium para a estufa foi de 48 dias. Esses resultados indicaram que a seleção precoce sem seleção continuada na maturação do embrião permitiu que escapes do tipo selvagem sobrevivessem (juntamente com eventos transgênicos). No entanto, a seleção precoce sem aminoácidos de camada ramificada complementares parece ser estressante durante o estágio em que os embriões somáticos foram formados e, então, nenhum evento foi produzido. A seleção de partida no começo do estágio de maturação era a mais eficaz para a recuperação de evento sem escapes.
[0258] Para a segunda réplica, um total de 196 embriões foi tratado com Agrobacterium em líquido por 5 minutos e, então, cocultivado por um dia em meio 710I. Nesse ponto, 94, 66 ou 36 embriões foram movidos para o meio 605T, meio 605T com 0,1 mg/l de etametsulfurona com AA ou meio 605T com 0,1 mg/l de etametsulfurona, respectivamente. Doze dias depois, os 94 embriões em 605T foram divididos (47 cada) em qualquer um dentre meio 289Q com 0,1 mg/l de imazapir ou meio 289Q com 0,5 mg/l de imazapir. Os embriões de ambos dentre meio 605T com 0,1 mg/l de etametsulfurona com AA e meio 605T com 0,1 mg/l de etametsulfurona foram movidos para 289Q (sem seleção adicional). Após maturação, as plântulas saudáveis (eventos) foram transferidas para o meio de enraizamento 13158H, com 14, 11, 13 e 0 eventos sendo movidos dos quatro tratamentos de maturação acima, respectivamente. Por fim, 4, 5 e 2 plantas foram enviadas para a estufa para os três tratamentos dos quais os eventos foram recuperados, e apenas um evento de uma única cópia foi produzido a partir da seleção de 0,5 mg/l de imazapir durante a maturação. C. Comparando-se dois promotores, ZM-PLTP PRO::Top1 e o DR5 PRO::Top3, que aciona a expressão de ODP2.
[0259] Para ambos os tratamentos, os embriões imaturos do consanguíneo Pioneer PH184C foram colhidos, tratados com cepa de Agrobacterium AGL1 (THY-) contendo os respectivos plasmídeos, foram transferidos para o meio 605T após um dia no meio de cocultivação 710I com a Agrobacterium, foram cultivados no meio 605T por 10 dias, movidos para 13226D com 0,1 mg/l de etametsulfurona por dois dias e, então, transferidos para o meio de maturação (289Q com 0,1 mg/l de imazapir) por 13 dias. Após maturação, as plântulas (eventos) foram movidas para o meio de enraizamento (germinação) 13158 por dez dias (estágio de enraizamento). i. Promotor ZM-PLTP que aciona a expressão de ZM-ODP2.
[0260] Oitenta embriões imaturos foram tratados com Agrobacterium contendo PHP78157 (SEQ ID NO. 23). Inicialmente, todos os embriões imaturos tratados responderam produzindo-se rapidamente muitos embriões somáticos individuais na superfície de cada escutelo. No fim do estágio de enraizamento, 18 plântulas foram produzidas. Um subconjunto de dez plantas foi enviado para a estufa e amostrado para análise PCR (o tempo total transcorrido para a estufa foi de 46 dias). Desses dez, seis eram múltiplas cópias e/ou continham cadeia principal (BB) de plasmídeo, e havia 4 escapes. ii. Promotor DR5 que aciona a expressão de ODP2.
[0261] Setenta embriões imaturos foram tratados com Agrobacterium contendo PHP78156, acolhendo o T-DNA que contém o seguinte: RB + NOS PRO::Top2::WUS2::IN2-1 TERM + DR5 PRO:Top3:ODP2::OS-T28 TERM + GZ-W64A TERM + UBI PRO::ESR::SB-SAG12 TERM + SB-ALS PRO:: HRA::SB-PEPC1 TERM + LTP2 PRO::ZS-YELLOW::PINII TERM-LB (SEQ ID NO: 24).
[0262] Inicialmente, todos os embriões imaturos tratados responderam produzindo-se rapidamente muitos embriões somáticos individuais na superfície de cada escutelo. No fim do estágio de enraizamento, 18 plântulas foram produzidas. Um subconjunto de 12 plantas foi enviado para a estufa e amostrado para análise PCR (o tempo total transcorrido para a estufa foi de 46 dias). Dessas doze plantas analisadas por PCR, 6 eram múltiplas cópias/BB+, 4 eram cópias únicas e livres de cadeia principal (BB-), e houve 2 escapes.
[0263] A expressão de ODP2 sob o controle do promotor PLTP e a expressão de WUS2 sob o controle do promotor AXIG1 resultaram em recuperação de planta aprimorada, frequências altas de plantas enviadas para a estufa e frequência mais alta de eventos de cópia única.
[0264] Os embriões imaturos foram colhidos de dois consanguíneos de milho consanguíneos (HC69 e PH184C) e foram infectados com Agrobacterium (cepa LBA4404 THY-) que contêm PHP79023 (SEQ ID NO.: 25) ou PHP79024 (SEQ ID NO.: 26). Para consanguíneos HC69, 67 embriões imaturos foram transformados com PHP79024, por fim, produzindo 26 plantas que eram resistentes a 0,1 mg/l de imazapir (38,8% de frequência em relação ao número de embriões de partida). Em comparação, quando 65 embriões HC69 foram transformados com PHP79023, 10 plantas resistentes a herbicida foram enviadas para a estufa (15,4% de frequência). Além disso, as plantas produzidas com o uso de PHP79024 eram mais vigorosas e saudáveis na estufa. As plantas transgênicas de ambos os plasmídeos de partida foram enviadas para a estufa 33 dias após infecção com Agrobacterium.
[0265] Para consanguíneos PH184C, 64 embriões imaturos foram transformados com PHP79024, por fim, produzindo 30 plantas que eram resistentes a 0,1 mg/l de imazapir (46,8% de frequência em relação ao número de embriões de partida). Em comparação, quando 73 embriões PH184C foram transformados com PHP79023, 27 plantas resistentes a herbicida foram enviadas para a estufa (37% de frequência). Além disso, as plantas produzidas com o uso de PHP79024 eram mais vigorosas e saudáveis na estufa. As plantas transgênicas de ambos os plasmídeos de partida foram enviadas para a estufa 33 dias após infecção com Agrobacterium. Desse modo, para ambos os consanguíneos, com o uso do promotor DR5 para acionar a expressão de WUS2 (juntamente com PLTP PRO::ODP2) os embriões somáticos transgênicos rapidamente produzidos que poderiam ser germinados nas plantas T0 transgênicas, mas a combinação de AXIG1 PRO::WUS2 + PLTP PRO::ODP2 era ainda mais eficaz, mas em termos da frequência geral da produção de planta transgênica, mas também é termos de vigor e saúde de T0 na estufa.
[0266] A recuperação de plantas transgênicas independentes foi aprimorada pela separação de embriões somáticos do escutelo de suporte dos embriões imaturos zigóticos originais. Os embriões imaturos do consanguíneo Pioneer PHH5G foram transformados com o uso da cepa de Agrobacterium AGL1 (THY-) acolhendo o plasmídeo PHP79066 (SEQ ID NO.: 28) (consulte Tabela 1). Após cocultivação de 45 embriões imaturos com Agrobacterium no meio 710I por um dia, os embriões imaturos foram movidos para o meio de repouso (meio 605T) sem seleção por 12 dias. Os embriões foram movidos para o meio de maturação por 13 dias, e múltiplos embriões somáticos maduros foram claramente observados como sendo derivados de um único embrião imaturo zigótico original (Figura 3). Nesse ponto, os embriões foram removidos do meio sólido e colocados em uma cultura líquida (meio 289R). O tubo que contém o tecido de milho suspenso foi, então, submetido a vórtice em maior potência por 30 a 60 segundos, inspecionando-se visualmente a suspensão a cada 10 a 15 segundos até que parecesse que o tecido foi disperso. A suspensão líquida foi, então, despejada no meio de enraizamento sólido (meio 13158H com 0,1 mg/l de herbicida imazapir) e o líquido foi pipetado para fora da placa. A partir desse material, mais de 200 plantas foram produzidas (plantas representativas mostradas na Figura 4), que resultaram em uma média de 4,4 plantas que são recuperadas para cada embrião de partida que foi transformado. Das aproximadamente 200 plantas T0, 152 foram amostradas por análise PCR, todas foram transformadas com base nos resultados de PCR (sem escapes) e 43 plantas eram cópias únicas para os transgenes sem cadeia principal de Agro (28,3% de cópia única sem BB). Com base nessa frequência, o número total de plantas T0 recuperadas e o número de partida de embriões, a produção de eventos de T0 de qualidade usáveis (cópia única, sem cadeia principal) era acima de 100% com base no número de embriões de partida.
[0267] Os embriões imaturos foram colhidos dos consanguíneos Pioneer HC69 (293 embriões) e PH184C (241 embriões), e foram transformados com cepa de Agrobacterium AGL1 (THY-) que acolhe o plasmídeo PHP80334 (SEQ ID NO.: 42) que contém os elementos genéticos mostrados na Tabela 1. Após 5 minutos de exposição ao Agrobacterium em meio líquido 710I, os embriões foram colocados em placas em meio de ágar solidificado 710I para a cocultivação da noite para o dia. Após um dia de cocultivação, os embriões foram movidos para o meio de repouso (605T sem seleção) por 7 dias, transferidos para o meio de maturação (289Q com 0,1 mg/l de imazapir) por 14 dias e, então, foram movidos para o meio de enraizamento (germinação) por pelo menos 14 dias antes de mover as plantas para a estufa. Com base no número original de embriões transformados, 19,1% e 13,8% dos embriões originais produziram uma planta transgênica em HC69 e PH184C, respectivamente. Para determinar a frequência de excisão, sete reações de PCR foram realizadas para testar a ausência dos cassetes de expressão CRE, WUS2, ODP2, ZS-GREEN1 e ESR (isto é, todos os segmentos de polinucleotídeo que estavam originalmente entre os dois sítios LOXP no T-DNA) e a presença do cassete de expressão HRA. Os resultados de PCR revelaram que 21% das plantas de HC69 continham apenas o cassete de expressão HRA (que confere resistência ao herbicida imazapir) com o segmento entre os dois sítios LOXP originais que foram excisados. Desse modo, essas plantas não continham mais os cassetes de expressão CRE, WUS2, ODP2, ZS- GREEN1 AND ESR. Quando as plantas foram analisadas quanto a presença do cassete HRA com todos os outros cassetes tendo sido excisados, a frequência de excisão para PH184C era ainda maior do que para HC69, com 47% das plantas mostrando que a excisão perfeita e completa ocorreu.
[0268] Uma diferença foi observada na resposta de crescimento precoce quando o plasmídeo que continha UBI PRO::CRE foi comparado com construtos que não foram projetados para excisão. Em contrapartida aos construtos sem excisão que contêm AXIG1 PRO::WUS2 + PLTP PRO::ODP2, em que os embriões somáticos estavam visíveis em 6 dias após a infecção por Agrobacterium, não havia embriões somáticos fluorescentes observados no tratamento de UBI PRO::CRE durante esse intervalo. O promotor de ubiquitina (UBI PRO) é um promotor constitutivo muito forte que foi usado amplamente em muitos anos (Christensen e Quail, (1996) Transgenic Research 5:213 a 218). Devido a essa resistibilidade e ao padrão de expressão onipresente, antecipou-se que UBI PRO::CRE poderia começar a expressar imediatamente mediante ao fato de ser introduzido na célula, desse modo, antecipou-se que os cassetes de expressão de WUS e ODP2 poderiam ser excisados antes de terem capacidade de estimular a formação de embrião somático. Surpreendentemente, no entanto, quando os embriões zigóticos originais foram colocados no meio de maturação, observou-se que múltiplos embriões se formaram naquilo que era originalmente um único embrião zigótico. A maturação no herbicida imazapir era uma seleção muito restritiva contra o crescimento do tipo selvagem, e consistente com isso, os resultados de PCR confirmaram que as plantas resultantes eram transgênicas e que 60% das plantas T0 de cópia única analisadas por PCR mostraram a ocorrência da excisão perfeita de WUS, ODP2, CRE, ZS-GREEN1 e ESR. O T-DNA de PHP80334 contém os cassetes de expressão AXIG1 PRO::WUS2, PLTP PRO::ODP2, UBI PRO::CRE, UBI PRO::ZS-GREEN e ESR localizados nos sítios de recombinação loxP. Quando esse T-DNA foi introduzido nas células de embrião imaturo, nenhuma fluorescência verde foi observada indicando que ocorreu a excisão antes de a proteína de fluorescência verde poder acumular em níveis visíveis (tipicamente menos de 24 horas em um cassete de expressão UBI PRO::ZS-GREEN não excisado. Esses dados mostram que um pulso curto de WUS e ODP2 são eficazes para a formação de embrião somático de novo rápida e a germinação desses embriões somáticos para produzir plantas T0 transgênicas T0. B. Excisão mediada por GLB1::CRE.
[0269] Os embriões imaturos foram colhidos dos consanguíneos Pioneer PH184C, e foram transformados com a cepa Agrobacterium AGL1 (THY-) que acolhe o plasmídeo PHP80338 (SEQ ID NO.: 43) que contém os elementos genéticos mostrados na Tabela 1. Os métodos de transformação, seleção e germinação de planta foram os mesmos que aqueles descritos para o experimento de UBI PRO::CRE no Exemplo 8-A acima. A análise PCR de plantas T0 demonstraram que 58% das plantas de cópia única foram submetidas à excisão completa dos genes de desenvolvimento (ODP2 e WUS) e CRE. Os promotores de substituição conhecidos por acionar a expressão seja durante o desenvolvimento do embrião (LTP2, OLE, END-2) ou sendo estimulado por tensão (IN2- 1) também resultaram na excisão dos genes de desenvolvimento (ODP2, WUS2) e CRE antes da germinação para produzir plantas T0 transgênicas.
[0270] Em uma comparação de diferentes promotores que acionam a expressão de CRE, os embriões imaturos foram colhidos a partir do consanguíneo Pioneer HC69 ou PH184C e foram transformados com cepa de Agrobacterium LBA4404 (Thy-) que acolhe um plasmídeo que contém um T-DNA com os componentes seguintes: RB-loxP-AXIG1 PRO::WUS2::In2- 1 TERM + PLTP PRO::ODP2::PINII TERM + "X PRO"::CRE::OS-T28 TERM-loxP + SB-ALS PRO::ZM-HRA::PINII TERM, em que "X PRO" era o UBI PRO de milho, o WOX2a PRO, o IN2 PRO, o LTP2 PRO, o OLE PRO, o GLB1 PRO, o HSP17.7 PRO ou o HSP26 PRO que foram usados para acionar a excisão de WUS, ODP2 e CRE. Após 5 minutos de exposição ao Agrobacterium em meio líquido 710I, os embriões foram colocados em placas em meio de ágar solidificado 710I para a cocultivação da noite para o dia. Após a cocultivação de um dia, os embriões foram movidos para o meio de repouso (605T sem seleção) por 7 dias, transferidos para o meio de maturação (289Q com 0,1 mg/l de imazapir) por 14 dias e, então, foram movidos para o meio de enraizamento (germinação) por pelo menos 14 dias antes de mover as plantas para a estufa.Tabela 10. Frequências de transformação e excisão para promotores que acionam a expressão de CRE recombinase.
[0271] Conforme mostrado na Tabela 10, as eficiências de transformação foram medidas pelo número de plantas T0 recuperadas a partir de um dado número de embriões imaturos de partida e as frequências de excisão são mostradas para WUS2, ODP2 e CRE. A Tabela 10 também mostra o número de embriões imaturos que foram infectados com Agrobacterium, o número de plantas T0 produzidas, a frequência de transformação calculada [(n° de plantas T0/n° de embriões infectados) * 100] e a frequência final de excisão com base na análise PCR para a presença ou ausência de WUS, ODP2, CRE e HRA. Para consanguíneos PH184C, nenhuma excisão foi observada nos tratamentos de controle negativo em que o T-DNA continha WOX2a::CRE::PINII ou IN2::CRE::PINII (PHP80558 ou PHP80560, respectivamente). No entanto, para tratamentos em que o promotor que aciona CRE foi fortemente expresso em toda a planta (UBI), os mesmos foram expressos fortemente em embriões em desenvolvimento (LTP2, OLE, GLB1) ou fortemente induzidos por tratamento térmico (HSP17.7, HSP26), as frequências de excisão variaram entre 40 e 60%. Para o UBI PRO, a excisão de WUS2 e ODP2 foi rápida resultando em uma frequência de transformação reduzida (9%) e a frequência de excisão conforme medida nas plantas T0 era alta em 60%. Para os promotores expressos durante o desenvolvimento intermediário a tardio de embrião (LTP2, OLE e GLB1) as frequências de transformação eram mais altas do que para UBI (33, 26 e 22%, respectivamente) enquanto as frequências de excisão eram ligeiramente menores que para UBI (50, 40 e 47%, respectivamente). O tratamento em que o HSP17.7 foi usado para controlar a expressão de CRE produziu os melhores resultados gerais em ambas as categorias, produzindo a mais alta frequência de transformação (54%) e a mais alta frequência de excisão (67%). HSP26 produziu resultados que estavam na mesma faixa que os promotores de embrião, com frequências de transformação e excisão de 32% e 54%, respectivamente.
[0272] Quando os promotores de desenvolvimento de embrião foram usados para excisão, vários embriões somáticos foram observados nesses tratamentos (semelhantes aos experimentos em que nenhum componente de excisão estava presente) que indicou que a expressão foi atrasada até um último estágio de desenvolvimento do embrião, mas quando direcionado em termos de desenvolvimento, a expressão foi uniformemente forte em todos os embriões resultando na excisão eficaz de WUS2, ODP2 e CRE. Para promotores responsivos ao calor, a exposição ao calor (isto é, 42 °C por duas horas repetidas em três dias consecutivos) foi deferida até que os embriões fossem movidos para o meio de maturação, resultando em altos números de embriões somáticos que se formaram rapidamente após a transformação, seguido pela excisão eficaz posterior.
[0273] As espigas imaturas foram colhidas de PH184C e embriões imaturos com 2,0 mm foram extraídos dos núcleos no dia do tratamento por bombardeamento de partícula. Os embriões foram colocados em meio altamente osmótico (meio 13224B) por três horas antes do bombardeamento de partícula. Os embriões imaturos foram bombardeados com uma razão equimolar de plasmídeos contendo os cassetes de expressão seguintes: FRT1:PMI::PINII TERM:FRT87 + UBI PRO:UBI1ZM INTRON::MO-FLP::PINII TERM + ZM-PLTP PRO::ZM-ODP2::PINII TERM + ZM- AXIG1 PRO::ZM-WUS2::PINII TERM. Após bombardeamento de partícula, os embriões imaturos permaneceram no meio altamente osmótico da noite para o dia, e foram, então, transferidos para o meio de repouso (meio 13266K com 150 mg/l de G418) por 8 dias. Após o período de repouso, os embriões foram transferidos para o meio de maturação (meio 289O com 150 mg/l de G418) por 21 dias e, então, movidos para o meio de enraizamento (meio 272X com 150 mg/l de G418) por 14 a 17 dias (até que as raízes fossem grandes o suficiente para transplantar para o solo). No estágio de plântula, o tecido da folha foi amostrado para análise PCR para confirmar que os genes dentro dos sítios FRT1 e FRT87 de flanqueamento do locus-alvo original não estavam mais presentes e que os novos genes dentro do cassete doador se recombinaram no locus-alvo corretamente- e eventos de RMCE (Troca de Cassete Mediada por Recombinase) precisos foram identificados. Isso reduziu todo o ciclo de SSI, da transformação para ter plantas derivadas de RMCE precisas na estufa, por 43 a 50 dias, dependendo de quanto tempo era necessário para produzir raízes adequadas. Alternativamente, um método de SSI mediado por Agrobacterium foi desenvolvido com o uso de construtos com AXIG1 PRO::WUS2 + PLTP PTO::ODP2. Dois T-DNAs foram aplicados em dois experimentos separados; o primeiro T-DNA contendo cassetes de expressão PMI, WUS2, ODP2 e DsRED dentro dos sítios de recombinação FRT1 e FRT87 de flanqueamento (RB- UBI PRO:UBI1ZM INTRON::MO-FLP::PINII TERM + CaMV35S TERM + FRT1:PMI::PINII TERM + ZM-AXIG1 PRO::ZM-WUS2::IN2-1 TERM + ZM-PLTP PRO::ZM-ODP2::OS-T28 TERM + UBI PRO::UBI1ZM INTRON::DsRED: FRT87-LB) (RV003866) e o segundo T-DNA contendo apenas PMI e DsRED nos sítios FRT1 e FRT87 (RB- + ZM-AXIG1 PRO::ZM- WUS2::IN2-1 TERM + ZM-PLTP PRO::ZM-ODP2::OS-T28 TERM UBI PRO:UBI1ZM INTRON::MO-FLP::PINII TERM + CaMV35S TERM + FRT1:PMI::PINII TERM + UBI PRO::UBI1ZM INTRON::DsRED: FRT87-LB) (RV004886). Cada um dos T- DNAs foram aplicados por meio de transformação mediada por Agro em linhas-alvo com sítios de assentamento FRT1-FRT87 conforme descrito no Pedido Provisório n° US 62/296639, incorporado ao presente documento em sua totalidade a título de referência. Os eventos de RMCE precisos foram identificados com o uso de um ensaio PCR multiplex conforme descrito em #5907 USPSP e os dados são resumidos na Tabela 11. O uso de cassetes de expressão AXIG1 PRO::WUS2 + PLTP PTO::ODP2 para SSI por Agro reduziu todo o processo de SSI em várias semanas (pelo menos 3 a 4 semanas), em comparação com o método de transformação normal para gerar eventos de SSI.Tabela 11. Recuperação de eventos de RMCE em experimentos de SSI por Agro com o uso da expressão de WUS2 e ODP2.
[0274] O corte mediado por CAS9 do genoma de milho é usado para introduzir alterações de único códon ao gene ALS2 do milho. Para gerar alelos editados por ALS2, um fragmento de homologia de 794 bp é clonado em um vetor de plasmídeo e dois oligos de DNA de filamento único com 127 nucleotídeos são testados quanto ao modelo de reparo, contendo várias alterações de nucleotídeo em comparação com a sequência nativa. Os modelos de reparo de 794 bp incluem uma única alteração de nucleotídeo que direcionará a edição de sequências de DNA que correspondem à prolina na posição de aminoácido 165 que muda para uma serina (P165S), assim como três alterações adicionais na no sítio-alvo ALS-CR4 e sequência PAM. A modificação da sequência PAM dentro do modelo de reparo altera o códon de metionina (AUG) para isoleucina (AUU), que ocorre naturalmente no gene ALS1. Os meios usados para bombardeamento de partícula, seleção e regeneração são semelhantes àqueles usados no presente documento. Aproximadamente 1.000 embriões imaturos por tratamento são bombardeados com os dois modelos de reparo de plasmídeo único ou oligo, UBI PRO:UBI1ZM INTRON:CAS9::PINII, POLIII PRO::ALS~CR4 gRNA, UBI PRO:UBI1ZM INTRON:MOPAT~DSRED::PINII TERM, ZM-PLTP PRO::ZM- ODP2::PINII TERM e ZM-AXIG1 PRO::ZM-WUS2::PINII TERM. Após o bombardeamento de partícula, os embriões imaturos foram colocados nos meios contendo 3 mg/l de bialafos para selecionar embriões somáticos resistentes a herbicida. Após o período de repouso de 8 dias, os embriões foram transferidos para o meio de maturação com biolafos por 21 dias e, então, são movidos para o meio de enraizamento por 14 a 17 dias (até que as raízes fossem grandes o bastante para transplantar para o solo). Cinco semanas pós transformação, duzentas plântulas jovens independentes selecionadas aleatoriamente (por tratamento) crescendo em meios seletivos foram transferidas para meios de bialafos frescos em recipientes PlantConTM (recipientes plásticos estéreis que podem acomodar plantas com até 15,24 cm (6") de altura). As plântulas restantes (aproximadamente 800 por tratamento) foram transferidas para o meio sólido dentro de PlantCons™ (recipiente de cultura de tecido vegetal pré-esterilizado da MP Biomedicals LLC, 3 Hutton Center Drive, Suite 100, Santa Anna, CA 92707) contendo 100 ppm de clorosulfurona como seleção direta para um gene ALS2 editado. Um mês depois, 384 das plântulas aleatoriamente amostradas (sem seleção), e sete plântulas que sobreviveram à seleção de clorosulfurona foram amostradas para análise. Os alelos ALS2 editados foram detectados em 9 plântulas: duas derivadas das plântulas selecionadas aleatoriamente que crescem em bialafos e geradas com o uso do modelo de DNA de reparo de 794 bp, e as 7 restantes são derivadas de plântulas resistentes a clorosulfurona editadas com o uso de oligos com filamento único de 127 nt. A análise do gene ALS1 revelou apenas sequência do tipo selvagem, confirmando a alta especificidade do gRNA de ALS-CR4.
[0275] Todas as nove plantas que contêm alelos ALS2 editados foram enviadas para a estufa e amostradas para análise molecular e teste de progênie adicionais. A análise de sequência de DNA de alelos ALS2 confirma a presença da modificação de P165S assim como as outras alterações de nucleotídeo associadas aos respectivos modelos de reparo. A progênie de T1 e T2 de duas plantas T0 foi analisada para avaliar a herança dos alelos ALS2 editados. As plantas de progênie derivadas de cruzamentos com o uso de pólen de plantas Hi-II do tipo selvagem foram analisadas por sequenciamento e demonstraram transmissão sexual dos alelos editados observados na planta genitora com razão de segregação esperada de 1:1 (57:56 e 47:49, respectivamente). Para testar se a sequência de ALS editada conferiu resistência a herbicida, selecionou plantas T1 de segregação de quatro semanas de idade com alelos ALS2 editados e do tipo selvagem foram aspergidos com quatro concentrações diferentes de clorsulfurona (50, 100 (1x), 200 e 400 mg/litro). Três semanas após o tratamento, as plantas com um alelo editado mostraram fenótipo normal, enquanto as plantas com apenas alelos do tipo selvagem demonstraram sinais fortes de senescência. Além disso, os embriões isolados da semente derivada de plantas polinada com pólen HI-II do tipo selvagem foram germinados em meios com 100 ppm de clorsulfurona. Quatorze dias após germinação, as plantas com alelos editados mostraram altura normal e um sistema radicular bem desenvolvido, enquanto as plantas com alelos do tipo selvagem eram curtas e não desenvolveram raízes.
[0276] No experimento acima, quando os cassetes de expressão ODP2 e WUS2 (em dois plasmídeos separados) não estavam incluídos com os plasmídeos que contêm os modelos de reparo, Cas9, ALS-CR4 gRNA, e MoPAT-DsRED, nenhum evento foi recuperado após bombardeamento de partícula de 1.000 embriões imaturos e seleção em bialafos no consanguíneo Pioneer PHH5G (controle negativo). Em comparação, quando os plasmídeos que contêm PLTP PRO::ODP2::PINII e AXIG1 PRO::WUS2::PINII TERM foram adicionados à mistura de plasmídeo para preparação de partículas de ouro e bombardeamento de partícula, os eventos que contêm edições de gene mediadas por CAS/CRISPR para o gene ALS foram recuperados. Após bombardeamento de partícula de aproximadamente 1.000 embriões imaturos do consanguíneo Pioneer PHH5G, mais de 1.000 plântulas resistentes a bialafos foram recuperadas, e dessas, nove foram determinadas para conter edições do gene ALS2 genômico que confere resistência ao herbicida clorsulfurona.
[0277] A transformação de sorgo foi realizada com o uso de um protocolo mediado por Agrobacterium otimizado (Wu et al., 2014, In Vitro Cellular and Developmental Biology 50:8 a 14) sendo que os métodos são resumidos abaixo. A. Material e Processo de Transformação de Sorgo.
[0278] TX430, uma variedade de sorgo não tanino, foi usada nesse estudo. As temperaturas da estufa promediaram 29 °C durante o dia e 20 °C à noite com um fotoperíodo de 12 h d/noite e a iluminação complementar foi fornecida por uma razão de 3:1 de haleto de metal (1.000 W) e lâmpadas de sódio de alta pressão (1.000 W). Os componentes dos meios usados nesse estudo são listados na Tabela 2. O protocolo de transformação de linha de base é descrito em detalhes como "tratamento C" em Zhao et al. (Plant Mol. Biol. (2000) 44:789 a 798). Brevemente, os grãos imaturos de sorgo colhidos frescos foram esterilizados com 50% de alvejante e 0,1% de Tween-20 por 30 min sob vácuo e, então, enxaguado com água estéril três vezes. Os embriões foram submetidos às cinco etapas sequenciais seguintes: (1) infecção por Agrobacterium: os embriões foram incubados em uma suspensão de Agrobacterium (OD=1,0 a 550 nm) com meio PHI-I por 5 min; (2) cocultivação: os embriões foram cultivados em meio PHI-T seguindo a infecção por 3 d a 25 °C no escuro; (3) repouso: os embriões foram cultivados no meio PHI-T mais 100 mg/l de carbenicilina por 7 d a 28 °C no escuro; (4) seleção: os embriões foram cultivados em meio PHI-U por 2 semanas, seguido pela cultura em meio PHI-V pelo restante do processo de seleção a 28 °C no escuro, com o uso de intervalos de subcultura de 2 a 3 semanas; (5) regeneração: o calo foi cultivado em meio PHI-X por 2 a 3 semanas no escuro para estimular o desenvolvimento de broto, seguido pela cultura por 1 semana sob condições de 16 h de luz (40 a 120 μE m-2 s-1) e 8 h no escuro a 25 °C, e uma subcultura final em meio PHI-Z por 2 a 3 semanas sob luz (16 h, 40 a 120 μE m-2 s-1) para estimular o crescimento de raiz. As plântulas regeneradas foram transplantadas em solo e cresceram na estufa (Zhao et al. 2000). As plantas T0 foram autopolinizadas para produzir progênie T1 para análise adicional.
[0279] Em um outro experimento, os embriões foram submetidos às cinco etapas sequenciais seguintes: (1) infecção por Agrobacterium com PHP79023: os embriões foram incubados em uma suspensão de Agrobacterium (OD = 1,0 a 550 nm) com meio PHI-I por 5 min; (2) cocultivação: os embriões foram cultivados em meio PHI-T seguindo a infecção por 7 d a 25 °C no escuro; (3) seleção durante maturação: os embriões foram maturados em 289M com 0,1 mg/l de meio de imazapir por 4 semana, seguido pelo enraizamento em meio 13113A com 0,1 mg/l de imazapir (Meio 13113A contém sais de MS de alta resistibilidade e vitaminas, 0,05 g/l de mio-inositol, 20 g/l de sacarose e 3 g/l de fitagel, pH 5,6). As plântulas regeneradas foram transplantadas em solo e cresceram na estufa (Zhao et al. 2000). As plantas T0 foram autopolinizadas para produzir progênie T1 para análise adicional. B. Cepas de Agrobacterium e Vetores usados com Sorgo.
[0280] As cepas de Agrobacterium tumefaciens LBA4404 (Lazo et al. (1991) Biotechnology 9:963 a 967) foram usadas, contendo um primeiro plasmídeo que contém genes de Agrobacterium vir (Komari (1990) Plant Cell 9:303 a 306; Komari et al. (1996) Plant J 10:165 a 174) e um segundo plasmídeo (PHP80334) que contém um T-DNA com os componentes seguintes: RB + ZM-AXIG1 PRO::ZM-WUS2::IN2-1 TERM + ZM- PLTP PRO::ZM-ODP2::OS-T28 TERM + GZ-W64A TERM + UBI PRO:UBI1ZM INTRON:ESR::SB-SAG12 TERM + SB-ALS PRO:: HRA::SB-PEPC1 TERM + UBI PRO:UBI1ZM INTRON:ZS-GREEN1::PINII TERM:SB-ACTIN TERM-LB. Para comparação, uma outra Agrobacterium foi usada contendo um segundo plasmídeo com apenas um cassete de expressão UBI PRO:UBI1 ZM INTRON:PMI::PINII TERM no T-DNA (sem cassetes de expressão ZM-WUS2 ou ZM-ODP2) que representa o tratamento de controle nesse experimento. C. Resultados de Transformação de Sorgo.
[0281] A frequência de transformação geral era 20% quando o plasmídeo de controle foi usado, e das plantas T0 enviadas para a estufa e analisadas com o uso de qPCR, 40% eram de cópia única sem cadeia principal de Agrobacterium. Para o tratamento de controle, a duração do início da infecção por Agrobacterium até que as plantas T0 fossem enviadas para a estufa variou de 10 a 13 semanas.
[0282] A frequência de transformação geral era 32% quando o plasmídeo que contém o Zm-PLTP PRO::ZM-ODP2 + DR5 PRO::ZM-WUS2 (consulte PHP79023 na Tabela 1) foi usado, e das plantas T0 enviadas para a estufa e analisadas com o uso de qPCR, 42% eram de cópia única sem cadeia principal de Agrobacterium, procedendo diretamente para a formação de embrião somático dos embriões imaturos zigóticos originalmente infectados, seguindo pela maturação de embrião somático, germinação in vitro e formação de raiz. Com essa combinação de promotores e genes de desenvolvimento reduziu substancialmente o tempo de infecção por Agrobacterium para enviar plantas T0 para a estufa por aproximadamente metade em relação ao tratamento de controle.
[0283] Em um experimento adicional que usa o plasmídeo PHP82240 com um T-DNA que contém um cassete de expressão-LB DsRED constitutivo RB-ZM-AXIG1 PRO::ZM-WUS2::IN2-1 TERM + ZM-PLTP PRO::ZM-ODP2::OS-T28 TERM + SB-ALS PRO::ZM-HRA::PINII TERM +, foi demonstrado que a formação direta de embriões somáticos de sorgo foi aprimorada com o uso de PHP82240 com sete dias de cocultivação em meios 710I com 50mg/l de carbenicilina. Essa combinação de plasmídeo e a cocultivação de sete dias resultou na duplicação da frequência de transformação geral de 17,7% para um valor final de 38,9%, enquanto reduz o tempo da infecção por Agrobacterium para plantas T0 para a estufa por aproximadamente metade em relação ao tratamento de controle (reduzindo esse intervalo de tempo para 5 a 6 semanas de tempo total transcorrido).
[0284] Uma alíquota de cepa de Agrobacterium LBA4404 contendo o vector de interesse foi removida do armazenamento a -80 ° e retirada para o meio LB sólido que contém um agente seletivo (canamicina ou espectinomicina, dependendo de quais plasmídeos a cepa bacteriana contém). A Agrobacterium foi cultivada na placa de LB a 21 °C no escuro por 2 a 3 dias, em cujo tempo uma única colônia foi selecionada dentre a placa, retirada para uma placa de meio 810D que contém o agente seletivo e, então, incubada a 28 °C no escuro da noite para o dia. A cultura de Agrobacterium foi transferida da placa com o uso de uma espátula estéril e suspensa em meio de infecção de trigo de ~ 5 ml (WI4) com 400 uM de acetossiringona (AS). A densidade óptica (600 nm) da suspensão foi ajustada para cerca de 0,1 a 0,7 com o uso do mesmo meio.
[0285] Quatro a cinco picos que contêm sementes imaturas (com 1,4 a 2,3 mm de embriões) foram coletadas, e os embriões imaturos foram isolados das sementes imaturas. Os grãos de trigo eram a superfície esterilizada por 15 min em 20% (v/v) de alvejante (5,25% de hipocloreto de sódio) mais 1 gota de Tween 20, seguido por 2 a 3 lavagens em água estéril. O trigo do protocolo restante que inclui infecção com Agrobacterium, cocultivação, cultura durante o período de repouso, maturação de embrião somático e enraizamento, conforme descrito nos Exemplos 4 e 5 foram seguidos, incluindo a etapa de seleção em 0,1 mg/l de imazapir e maturação para produção de plantas de trigo T0 transgênicas. B. Resultados de Transformação de Trigo.
[0286] A cepa de Agrobacterium tumefaciens LBA4404 (Lazo et al. 1991, Biotechnology 9:963 a 967) foi usada, a qual continha um primeiro plasmídeo ajudante super binário (pVIR9, Pedido Provisório n° US 62/252229, incorporado ao presente documento em totalidade a título de referência) e um segundo plasmídeo (PHP79066), com os genes de desenvolvimento que contêm um T-DNA com os componentes seguintes: RB + ZM-AXIG1 PRO::ZM-WUS2::IN2-1 TERM + ZM-PLTP PRO::ZM- ODP2::OS-T28 TERM + SB-ALS PRO:: HRA::SB-PEPC1 TERM + LTP2 PRO::ZS- YELLOW1 N1::PINII TERM + LB. Para comparação, uma outra Agrobacterium foi usada contendo um segundo plasmídeo (PHP24600) com o T-DNA seguinte: RB + CAMV35S TERM: PAT: CAMVS PRO+ UBIZM PRO: DS- RED: PINII TERM + LB, que representaram o tratamento de controle nesse experimento.
[0287] Quando o plasmídeo de controle foi usado para transformar embriões imaturos de trigo a partir da variedade de trigo Pioneer elite Spring HC0456D, nenhuma estrutura regenerável foi observada nos primeiros 7 a 10 dias após infecção por Agrobacterium, enquanto os embriões imaturos que foram infectados com o construto de gene de desenvolvimento PHP79066 produziram estruturas regeneráveis de 7 a 10 dias pós-infecção com o uso de meio de cultura de milho descrito nos Exemplos 4 e 5. Os embriões infectados com o construto PHP79066 produziram estruturas do tipo planta dentro de 2 semanas (Figura 5), em comparação com o calo de proliferação observado para o construto de controle (não mostrado). As plântulas enraizadas foram recuperadas após transformação com PHP79066 dentro de 6 semanas pós- infecção.
[0288] Quando o plasmídeo que contém ZM-AXIG1 PRO::ZM-WUS2::IN2- 1 TERM + ZM-PLTP PRO::ZM-ODP2::OS-T28 TERM + SB-ALS PRO:: HRA::SB- PEPC1 TERM + LTP2:ZS-YELLOW::PINII TERM foi usado para transformação, a frequência de transformação geral era 64% (em comparação com 6% para o controle). Um subconjunto de quatro plantas foi analisado com o uso de qPCR, e três eram positivos tanto para o transgene WUS quanto para o ZS-YELLOW. Usando-se essa combinação de genes de desenvolvimento, as plantas T0 se regeneraram em 8 a 11 semanas pós-infecção, reduzindo o tempo de infecção por Agrobacterium para enviar plantas T0 para a estufa por duas a três semanas.
[0289] Após transformação de embriões imaturos do consanguíneo Pioneer PH184C com a cepa de Agrobacterium LBA4404 que acolhe um T- DNA contendo os cassetes de expressão ZM-AXIG1 PRO::ZM-WUS2::IN2-1I TERM + ZM-PLTP PRO::ZM-ODP2::PINII + UBI PRO: UBI1ZM INTRON:ZS- GREEN::PINII TERM, os embriões somáticos rapidamente se formaram na superfície do escutelo (isto é, dentro de 4 a 6 dias). Os embriões somáticos únicos diretamente formados foram observados em 2, 4, 7 e 12 dias após o começo da infecção por Agrobacterium. Em consanguíneos PH184C, quando a combinação de NOS PRO::ZM-WUS2::PINII TERM + ZM- PLTP::ODP2::PINII TERM foi usada, os embriões somáticos únicos foram observados como fixados ao escutelo do embrião zigótico originalmente transformado por um cabo fino de células que parecem recapitular o suspensor. À medida que o desenvolvimento do embrião continua, recursos morfológicos adicionais foram observados, os quais são normalmente observados em embriões zigóticos, incluindo formação de um anel coleoptilar distinto ao redor do maristema apical no início do desenvolvimento do maristema apical, e a formação do escutelo (que se torna branco e opaco) ao redor do eixo geométrico do embrião.
[0290] Para ilustrar ainda mais a morfologia dos embriões somáticos de formação rápida, os embriões zigóticos com embriões somáticos nascentes protuberantes foram amostrados em 2, 4, 6, e 7 dias após o começo da infecção por Agrobacterium, e foram anexados em 2,5% de glutaraldeído de grau de EM em 100 mM de tampão de fosfato (pH 7,0) em temperatura ambiente com rotação em 100 rpm por 4 horas. Após a lavagem com 100 mM de tampão de fosfato (pH 7,0) três vezes por 15 minutos cada, as amostras foram desidratadas de uma maneira em etapas; 1 a 2 horas em 70% de EtOH, 1 a 2 horas em 80% de EtOH, 1 a 2 horas em 95% de EtOH, 1 a 2 horas em 100% de EtOH e 2 horas em 100% de EtOH. O tecido foi, então, infiltrado com glicolmetacrilato Technovit 7100 ativado seguindo as recomendações do fabricante, por 2 horas, e novamente com Technovit 7100 ativado revitalizado da noite para o dia. As amostras de tecido infiltrado foram colocadas em moldes, e o Technovit 7100 foi polimerizado pela adição de 1 ml de Hardener II em 15 ml de Technovit 7100 ativado. Os moldes foram colocados sob vácuo interno em um dessecador à vácuo e deixado para polimerizar da noite para o dia. As seções de 2 μm semifinas foram colocadas em gotas de água em lâminas de vidro e secas em uma placa de aquecimento a 45 °C. As seções foram manchadas com reagente Schiff ácido (Sigma) de acordo com instruções e foram, então, contramanchadas com 0,5% de Naphthol Blue Black em 7% de solução de ácido acético por 5 minutos e lavadas novamente em água deionizada. As seções foram, então, montadas em Permount com tampas de cobertura de vidro e observadas.
[0291] A Figura 6 à Figura 11 mostram um curso temporal para embriões imaturos zigóticos HC69 em vários dias após infecção por Agrobacterium com LBA4404 com um T-DNA que continha o seguinte: RB- AXIG1 PRO::ZM-WUS2::IN2-1 TERM + ZM-PLTP PRO::ODP2::PINII TERM-LB. Uma das indicações mais anteriores de estímulo de crescimento localizado foi a observação de divisões anticlínicas em células na superfície do escutelo infectado (Figura 6), que foi a primeira ruptura visível nessa camada da superfície que normalmente se expande por meio de divisões perclínicas que acompanham o crescimento do embrião. As divisões celulares localizadas continuadas resultaram em pequenos agrupamentos de células que começaram a se projetar da superfície do embrião zigótico (Figure 6), e esse crescimento produziu rapidamente embriões globulares crescentemente grandes (Figura 8) e de globulares/de estágio de transição (Figura 8), que após apenas 4 dias pós-infecção continha até 700 a 800 células por embrião somático, e exibiram a típica camada epidérmica macia normalmente observada em pró-embriões, e sem conexões vasculares com o embrião zigótico subjacente. Muito embora os embriões somáticos em desenvolvimento fossem observados muito próximos (Figura 10) os mesmos representaram estruturas independentemente derivadas. Ao longo do crescimento dos embriões somáticos nos primeiros 6 a 7 dias pós-infecção por Agrobacterium, uma alta frequência de estruturas mitóticas (isto é, células claramente sob prófase, metafase, anáfase ou citocinese) foi observada (Figura 11) que era indicativo da taxa de crescimento extremamente rápida desses embriões somáticos. B. Manchamento para demonstrar acúmulo de lipídio nos embriões somáticos em desenvolvimento.
[0292] Os embriões somáticos em desenvolvimento diretamente formados na superfície escutelária de embrião zigótico imaturos após transformação mediada por Agrobacterium (com um T-DNA que contém AXIG1 PRO::ZM-WUS2::IN2-1 TERM + ZM-PLTP PRO::ODP2::PINII TERM) foram amostrados em 2, 4 e 7 dias após infecção por Agrobacterium, lavados por 5 minutos em 70% de isopropanol e, então, manchados por 20 minutos em uma solução a 0,5% de "óleo Vermelho O" em 70% de isopropanol, lavados por 2 minutos em isopropanol e, então, lavados duas vezes em água por 5 minutos cada (todos em temperatura ambiente). Em dois dias após infecção por Agrobacterium, pouquíssimo manchamento de lipídeo, conforme evidenciado pela cor vermelha que se forma no tecido, estava presente nos embriões imaturos zigóticos. Em quatro dias após o início da infecção por Agrobacterium, várias estruturas globulares (embriões somáticos recentemente formados) estavam claramente visíveis a partir da superfície do embrião zigótico originalmente formado, e esses novos embriões somáticos claramente manchados com vermelho indicam o acúmulo de lipídeos. Em sete dias, uma mistura de estruturas foi observada; algumas eram claramente embriões somáticos que continuaram a se desenvolver e mancharam de vermelho (setas pretas na Figura 12), e alguns embriões somáticos que estavam começando a diferenciar os meristemas e folhas que já estavam começando a perder o manchamento vermelho associado ao acúmulo de lipídeo (Figura 12). Também visto na Figura 12, o escutelo do embrião zigótico infectado por Agrobacterium original estava quase desprovido de lipídeo sob essas condições de cultivo.
[0293] Alternativamente, o lipídeo foi visualizado colocando-se um embrião somático entre uma lamínula e uma lâmina e aplicando-se pressão até que uma monocamada de células fosse extrudada. Após usar o método de manchamento por Óleo Vermelho O descrito acima, várias gotículas de óleo foram observadas dispersas nas células de embrião somático quando visualizadas sob o microscópio de luz (Figura 13).
[0294] O lipídeo pode ser detectado com ouso de produção de manchamento semelhantes em embriões somáticos seccionados. Os embriões somáticos únicos diretamente formados são amostrados em 2, 4, 8 e 12 dias após o começo da infecção por Agrobacterium, e são fixados, desidratados, infiltrados com plástico e seccionados conforme descrito acima. Para manchamento por lipídios, uma solução de "Óleo Vermelho O" a 0,5% em 60% de fosfato de trietila (aquoso) é preparada e filtrada. As seções de tecido na lâmina são enxaguadas brevemente com 60% de fosfato de trietila e, então, manchadas por 10 a 20 minutos em "Óleo Vermelho O". Após manchamento, as seções são enxaguadas novamente com fosfato de trietila por 1 a 2 segundos e, então, lavadas com água destilada e deionizada. As seções são, então, contramanchadas com 0,5% de Azul Celeste em 5% de sulfato de amônio férrico aquoso por 15 minutos e lavadas novamente com água DI. As seções são, então, montadas com o uso de meio de montagem aquoso e observadas. Nos embriões somáticos em desenvolvimento, os lipídios acumulados no escutelo parecem vermelhos, e em toda a seção (incluindo o escutelo e o eixo geométrico do embrião) os núcleos em cada célula serão manchados de azul.
[0295] Os embriões imaturos foram colhidos a partir de três consanguíneos Pioneer (PH184C, HC69 e PHH5G) e os embriões de cada consanguíneo foram uniformemente colocados em alíquotas para transformação com cepa de Agrobacterium LBA4404 contendo uma dentre os seguintes PHP79066 (SEQ ID NO: 27), PHP80912 (SEQ ID NO: 53) e PHP80913 (SEQ ID NO: 54; cada uma é descrita em detalhes na Tabela 1).
[0296] Após transformação mediada por Agrobacterium, os três consanguíneos diferentes responderam diferentemente às combinações de transgene diferentes (Tabela 12). Para o consanguíneo PH184C, 230 embriões imaturos foram infectados para cada tratamento, com 84, 10 e 100% dos embriões zigóticos originalmente infectados que produzem embriões somáticos na superfície escutelária quando se expressam AXIG1::WUS2 sozinho, PLTP::ODP2 sozinho, ou a combinação tanto de WUS2 quanto de ODP2, respectivamente. Após 7 dias, todos os embriões foram movidos para maturação e, então, os meios de germinação, com 68, 8 e 52 embriões que produzem plantas T0 para os três respectivos tratamentos (eficiências de transformação T0 de 30%, 3% e 23%, respectivamente). Para consanguíneos HC69, 80 embriões imaturos foram usados para cada tratamento, com embriões somáticos e sendo que as plantas T0 são efetivamente produzidas em todos os três tratamentos, produzindo frequências de planta T0 transgênica final (em relação ao número de embriões de partida) de 85%, 56% e 68% para os tratamentos de AXIG1::WUS2, PLTP::ODP2, ou os WUS2 + ODP2 combinados, respectivamente. Por fim, para o consanguíneo PHH5G, 168 embriões imaturos foram infectados para cada um dos três tratamentos, com frequências de planta T0 transgênica final (em relação ao número de embriões de partida) de 27%, 0% ou 48% para o tratamento de AXIG1::WUS2, PLTP::ODP2, ou os tratamentos de WUS2 + ODP2 combinados, respectivamente. Esses dados demonstraram que embora os consanguíneos exibiram diferentes respostas ao WUS sozinho, ao ODP2 sozinho ou à combinação, a expressão de fatores de transcrição individuais era efetiva na produção de embriões somáticos transgênicos e plantas T0. Tabela 12. Resposta de transformação em três consanguíneos após aplicação de WUS2 sozinho, ODP2 sozinho, ou da combinação de WUS2 com ODP2
[0297] Os embriões imaturos (9-11 DAP) de três genótipos (HC69, PHH5G e PH184C) foram infectados com PHP79066. Os embriões foram transferidos para meios de cocultivação (710I) por 1 a 3 dias, meios de repouso 605G (meios 605J + 2 mg/l de meropenem) por 7 dias e, então, para os meios de maturação 13329 (289O + 0,1 mg/l de imazapir). Após 3 a 4 semanas em meios de maturação, os brotos únicos fortes foram transferidos para EXcel Plugs (40/80) (International Horticulture Technologies, LLC, 2410 Airline Hwy, Hollister, CA, 95023) e aspergidos com Moisturin (WellPlant, Inc., 940 Spice Islands Drive, Sparks, NV, 89431). Os brotos foram cultivados sob Valoya (Valoya Oy, Lauttasaarentie 54A, 00200 Helsinki, Finlândia) luzes LED série R NS2 (220 a 305 μmol/m2 /s) a 27 °C por 2 a 3 semanas. Os plugues foram hidratados com 6N de sais e vitaminas mais 0,1 mg/l de imazapir a cada 2 a 3 dias conforme necessário. Após o estabelecimento de raízes, os plugues forem transferidos para a estufa de recebimento de T0 e cultivados por mais duas semanas. Na conclusão desse intervalo de tempo, os dados de sobrevivência foram coletados para cada um dos genótipos e são dados abaixo na Tabela 13. Tabela 13. Sobrevivência aprimorada de plantas T0 transferidas para a estufa. * Número total de brotos transferidos para plugues Excel. ** Número de plântulas que sobreviveram na conclusão do experimento, com porcentagem de sobrevivência dada em parênteses.
[0298] O promotor PLTP bicolor de Sorgo (SB-PLTP PRO) é fornecido como SEQ ID NO:2. Os embriões imaturos do consanguíneo Pioneer PH184C ou PHH5G foram transformados com a cepa de Agrobacterium LBA4404 que acolhe o plasmídeo RV012608 que contém um T-DNA (SEQ ID NO:95), RB + ZM-AXIG1 PRO::ZM-WUS2::IN2-1 TERM + SB-PLTP1 PRO::ZM-ODP2:: OS- T28 TERM + GZ-W64A TERM + UBI PRO:UBI1ZM INTRON:ESR::SB-SAG12 TERM + SB-ALS PRO:: HRA::SB-PEPC1 TERM + UBI PRO::ZS-GREEN1::PINII TERM:SB-ACTIN TERM-LB. Muitos embriões somáticos discretos se formaram na superfície dos embriões zigóticos consanguíneos após 4 a 6 dias em cultura. Esses embriões somáticos precoces eram claramente distintos entre si (isto é, com tecido não transgênico interveniente entre os embriões somáticos em formação) e foram confirmados como transgênicos com base na expressão da proteína de fluorescência verde. Quando esses embriões foram transferidos para o meio de maturação com 0,1 mg/l de imazapir, os embriões continuaram a se desenvolver, e quando transferidos para o meio de germinação, tanto o alongamento de broto quanto o de raiz ocorreram.
[0299] Uma lista de parálogos WUS/WOX (genes de membro da família e proteína codificada) e membros da família ODP2/BBM e seus números SEQ ID correspondentes são mostrados na Tabela 14 abaixo. Tabela 14. Sequências de WUS/WOX e ODP2/BBM
* "DNA" indica uma sequência de polinucleotídeos ou ácidos nucleicos; "PRT" indica uma sequência de polipeptídeos ou proteínas.
[0300] Para esses estudos descritos nas seções A, B e C abaixo, uma configuração de T-DNA única foi utilizada (SEQ ID NO:104), começando com o controle positivo seguinte: RB + ZM-AXIG1 PRO::ZM- WUS2::IN2-1 TERM + ZM-PLTP PRO::ZM-ODP2:: OS-T28 TERM + GZ-W64A TERM + UBI PRO:UBI1ZM INTRON:ESR::SB-SAG12 TERM + SB-ALS PRO:: HRA::SB- PEPC1 TERM + UBI PRO::ZS-GREEN1::PINII TERM:SB-ACTIN TERM-LB. Dentro do contexto desse T-DNA, todos os componentes da T-DNA permaneceram os mesmos exceto pelas três variáveis descritas abaixo. Na primeira variável, ZM-WUS2 (no plasmídeo de controle) foi substituído por qualquer um dentre ZM-WOX2A, ZM-WOX4, ZM-WOX5A, ou do WUS1 de sorgo (SB). Na segunda variável, ZM-PLTP PRO (do tratamento de controle) foi substituída pelos promotores de dois parálogos de milho (ZM- PLTP1 e ZM-PLTP2) ou dos três ortólogos Poaceae (Sorghum bicolor SB- PLTP1, Setaria italica SI-PLTP1 ou Oryza sativa OS-PLTP1). Quando o T-DNA de controle (todos os componentes de milho conforme mostrado acima) foi introduzido no escutelo de consanguíneos Pioneer PH1V5T, PH1V69 e PHH5G, aproximadamente metade da área de superfície escutelária foi coberta por embriões somáticos recentemente desenvolvidos após 7 dias. Essa resposta foi pontuada com um "2". Na extremidade superior do espectro de resposta, o escutelo foi completamente coberto por um gramado de embriões somáticos em desenvolvimento individuais 4 a 7 dias pós-infecção. Essa response foi dada uma pontuação relativa de "4" e todos os outros tratamentos foram classificados a partir de "0" (sem resposta) a "4" (a produção de embriões somáticos mais prolífica). Quando nenhum cassete de expressão WUS2 ou ODP2 foi introduzido, por exemplo, em PHP24600, SEQ ID NO:69), PH1V5T produziu um baixo nível de embriões somáticos (pontuação de 1), enquanto tanto PH1V69 quanto PHH5G não produziram resposta (pontuação de 0). A. Substituição de membros da família ZM-WOX ou um sorgo WUS1 para ZM-WUS2 produziu graus variantes de embriões somáticos rapidamente somáticos.
[0301] Nesse experimento, um plasmídeo de controle positivo, que contém o ZM-AXIG1 PRO::ZM-WUS2 + ZM-PLTP PRO::ZM-ODP2 no T-DNA (SEQ ID NO; 104) produziu uma resposta intermediária (pontuação de 2) em consanguíneos PH1V5T e PHH5G, enquanto produz uma pontuação mais baixa de "1" em consanguíneo PH1V69. Em comparação, quando três membros da família WOX de milho foram substituídos por ZM-WUS2, uma faixa de respostas de embriogênese somática foi observada (Tabela 15), variando de uma resposta de embrião somático maior de ZM-WOX2A, uma resposta baixa a nenhuma para ZM-WOX4 e uma resposta baixa para WOX5 (sequências de T-DNA fornecidas em SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:101 e SEQ ID NO:102, respectivamente). Muito embora WOX5 e WOX4 resultaram em menos embriões somáticos na superfície do embrião imaturo transformado, ainda havia uma resposta positiva para todos os três consanguíneos com WOX5 e um subconjunto de consanguíneos para WOX4. Para tratamentos que produziram uma resposta de baixo nível, o consanguíneo PH1V5T estava difícil de interpretar devido ao fato de que exibia baixos níveis de crescimento na ausência de cassetes de expressão WUS2 e ODP2. No entanto, para tais tratamentos os outros dois consanguíneos se tornaram muito mais informativos devido ao fato de que não exibiram crescimento antecedente e uma resposta de baixo nível (1) foi inequívoco. Tabela 15. Resposta de transformação de consanguíneo para diferentes homólogos WUS
[0302] ZM-WUS1 e ZM-WUS3 também foram comparados a ZM-WUS2 para estímulo de respostas de crescimento rápido após transformação. Nesse experimento, um plasmídeo que contém UBI::GFP::PINII TERM foi cobombardeado com o uso de um protocolo de bombardeamento de partícula padrão para milho (consulte Svitachev et al., 2015, Plant Physiology 169:931 a 945) em razões equimolares juntamente com um plasmídeo que contém UBI PRO::WUS1::PINII TERM, UBI PRO::WUS2::PINII TERM ou UBI PRO::WUS3::PINII TERM. Os embriões foram observados sob um microscópio de epifluorescência Leica Mzfl III com um filtro GFP. Após 7 dias, a superfície do escutelo que foi bombardeado foi coberta com estruturas multicelulares com rápido crescimento com fluorescência GFP no centro. Para todos os três parálogos WUS3, a taxa de crescimento era rápida, a resposta era extensiva através da superfície do escutelo bombardeado, e nenhuma diferença poderia ser discernida entre os três parálogos WUS. Com base nessa observação, espera-se que ZM-WUS1 e ZM-WUS3 produziriam um grau semelhante de rápida embriogênese somática como ZM-WUS2 quando colocado atrás do promotor AXIG1 e combinado em um T-DNA com ZM-PLTP PRO::ZM-ODP2 para transformação nos embriões imaturos de milho.
[0303] Um tratamento final nesse experimento foi para substituir o WUS1 de sorgo (SB) (sequência de T-DNA fornecida como SEQ ID NO:103) para o WUS2 de milho. Esse tratamento produziu a resposta de embrião somático mais rápida e prolífica de qualquer tratamento, com aproximadamente 80% dos embriões infectados sendo inteiramente cobertos com embriões somáticos. B. Substituição de promotores PLTP de parálogos de milho ou três ortólogos de Poaceae diferentes resultou em graus variantes de embriogênese somática rápida.
[0304] O uso de vários promotores “homólogos” produziu uma faixa de embriogênese somática rápida em três consanguíneos Pioneer diferentes (Tabela 16) em relação ao tratamento de controle (ZM-PLTP PRO), em que o controle produziu pontuações entre 1 e 2.Tabela 16. Resposta de transformação de consanguíneo para homólogos de promotor PLTP diferentes
[0305] Nesse experimento, o promotor ZM-PLTP1 produziu as mais altas pontuações de embriogênese somática em sete dias pós-infecção, que variou de 3 (aproximadamente 75% coberto com embriões somáticos em PH1V5T) a 4 (totalmente coberto em PH1V69 e PHH5G). ZM-PLTP2 também produziu resultados melhores que o controle, com uma pontuação uniforme de 3 através de todos os três consanguíneos. Para promotores PLTP1 de outros membros do Poaceae, os promotores de sorgo e arroz produziram uma resposta de nível intermediário (2) em dois consanguíneos e uma baixa resposta (1) em um consanguíneo, enquanto o promotor Setaria resultou em uma resposta de baixo nível em dois consanguíneos e uma resposta de nível intermediário em um consanguíneo. Todos os promotores PLTP testados resultaram em estímulo positivo de embriogênese somática após sete dias. C. ZM PLTP PRO::ZM-LEC1 em combinação com qualquer um dentre AXIG1::WUS2 ou PLTP::ODP2 resultou na rápida produção de embriões somáticos.
[0306] Nos experimentos anteriores foi demonstrado que UBI PRO::ZM-LEC1 estimulou as frequências de transformação no híbrido de milho transformável Hi-II (consulte Lowe et al., 2007, US 7.268.271).
[0307] Nesse experimento, ZM-PLTP::ZM-LEC1 foi substituído por qualquer um dentre AXIG1::WUS2 ou PLTP::ODP2 em um vetor de controle para avaliar o impacto na embriogênese somática rápida em três consanguíneos. As condições para infecção por Agrobacterium, cultura de tecido e pontuação para embriogênese em sete dias eram as mesmas que aquelas descritas nos exemplos anteriores. Embora ambas as novas combinações tenham produzido pontuações mais altas do que o controle, conforme pode ser visto na Tabela 17, AXIG1::WUS2 + PLTP::LEC1 resultou na mais forte resposta de embrião somático através de todos os três consanguíneos. Desse modo, PLTP::LEC1 em combinação com os cassetes de expressão WUS2 ou ODP2 foi eficaz no estímulo de rápida formação de embriões somáticos.Tabela 17. Resposta de transformação de consanguíneos para diferentes combinações com LEC1D. Uso de WUS e ODP2 de arroz em combinação ou Setaria WUS e ODP2 em combinação resultou na formação de embrião somático após transformação de embriões imaturos de milho.
[0308] Começando com um construto de milho contendo NOS PRO::ZM- WUS2::IN2 + UBI PRO::ZM-ODP2::PINII + UBI PRO::ZS-GREEN::PINII, os ortólogos para WUS2 e ODP2 identificados em Oryza sativa e Setaria italica foram sintetizados e substituídos pelos genes de milho no construto acima. Os embriões imaturos de consanguíneo PHH5G e PH184C foram transformados com o uso da cepa de Agrobacterium LBA4404 contendo PHP80911 (WUS2 e ODP2 de milho), PHP79530 (genes de arroz) ou PHP79531 (genes de milho painço). Após 14 dias no meio de cultura, os embriões imaturos foram examinados sob o microscópio de dissecação e o estéreo microscópio de epifluorescência e pontuados com o uso da escala de embriogênese somática (0 a 4), anteriormente descritos. Para o consanguíneo PH184C, as pontuações de embrião somático 14 dias após infecção por Agrobacterium eram 2, 2 e 1 (para os pares de genes de milho, painço e arroz, respectivamente). Para o consanguíneo PHH5G, as pontuações de embrião somático 14 dias após infecção por Agrobacterium eram 3, 3 e 2 (para os pares de genes de milho, painço e arroz, respectivamente). Esses embriões imaturos foram expostos à expressão de WUS2 e ODP2 por duas vezes a duração do tempo que foi o material nas seções 5A, 5B e 5C acima, que resultou em uma pontuação de embriogênese somática maior do que se os dados fossem coletados em 7 dias. As combinações dos genes WUS e ODP2 cognatos de cada espécie estimularam a formação de embrião somático. Na ausência de WUS2 ou ODP2, nenhuma formação de embrião somático foi observada em PHH5G.
[0309] Dentro do Poaceae, milho e arroz estão em extremidades opostas da filogenia com painço no meio. Com base nos resultados com as sequências divergentes descritas acima para WUS, ODP2 e PLTP, esse trabalho demonstrou que as combinações dos membros através das gramíneas podem ser efetivamente usadas para estimular rapidamente a embriogênese somática após a transformação.
[0310] A fim de identificar novos promotores que podem aprimorar os métodos de transformação com o uso do gene WUS de Arabidopsis, o uso desse gene foi revisto. Altos níveis de expressão para WUS de Arabidopsis (por exemplo, com o uso do EF1A PRO de feijão-soja) , expressaram imediatamente após a transformação mediada por Agrobacterium e por todo o crescimento de calo aumentado nas taxas de formação de evento. No entanto, continuando a expressar esse fator de transcrição nesse nível impediu a regeneração de evento. Possíveis soluções seriam extirpar esse gene antes da regeneração de plântulas e restringir a expressão ectópica de WUS de Arabidopsis na diferenciação e maturação de embriões somáticos. Com base nisso, novos promotores foram buscados que expressam em células cultivadas, embriões e sementes imaturas em desenvolvimento, com nenhuma ou pouquíssima expressão em outros tecidos vegetais. O promotor LTP3 de feijão-soja satisfez esses critérios, um gene de fosfolipídeo transferase de feijão-soja não identificado anteriormente. Conforme mostrado na Figura 14 e na Figura 15, quando comparada à expressão constitutiva do EF1A PRO (Figura 14), a expressão de LTP3 (Figura 15) foi i) forte no desenvolvimento de sementes imaturas e ii) fracas ou inexistentes em outras amostras e partes de uma planta, enquanto a expressão de EF1A foi observada em todos os tecidos.
[0311] A cepa de Agrobacterium AGL1, contendo um T-DNA com os cassetes de expressão GM-LTP3 PRO::AT-WUS::UBI14 TERM + GM-UBQ PRO::TAGRFP::UBQ3 TERM, foi usada para transformar a variedade de feijão-soja Pioneer PHY21. Quatro dias após a infecção por Agrobacterium ser iniciada, o tecido foi lavado com meio de cultura estéril para remover as bactérias em excesso. Nove dias após o tecido ter sido movido para o meio de maturação de embrião somático, e 22 dias após os embriões somáticos transgênicos estarem prontos para secarem. Nesse ponto, os embriões somáticos maduros bem formados eram vermelho fluorescente sob um estéreo microscópio epifluorescente com um conjunto de filtro RFP. Os embriões somáticos que se desenvolveram foram funcionais e germinados para produzir plantas saudáveis na estufa. Esse método rápido de produção de embriões somáticos e germinação para formar plantas reduziram o intervalo de tempo típico da infecção por Agrobacterium para mover plantas T0 transgênica para a estufa de quatro meses (para transformação de feijão-soja convencional) para dois meses.
[0312] Conforme mostrado no diagrama de plotagem em caixa na Figura 16 que exibe a distribuição de respostas de embriogênese somática de explantes de cotiledônea imatura 2 semanas após infecção por Agrobacterium, o uso do promotor LTP3 para acionar a expressão de At-WUS resultou em um aprimoramento substancial na embriogênese somática (em comparação com outros promotores testados, consulte Figura 16) ou com o controle negativo sem cassete de expressão de WUS (consulte Figura 16).
[0313] O aumento na resposta de embrião somático através da população de cotiledôneas imaturas infectadas também foi acompanhado pelo rápido desenvolvimento de embrião somático, que foi observado sob microscopia com luz para avaliar a morfologia (Figura 17A) e epifluorescência para observar a fluorescência vermelha (Figura 17B). Isso mostra os embriões somáticos de feijão-soja transgênicos maduros que estavam prontos para a dessecação e, consequentemente, germinação apenas 5 semanas após a infecção por Agrobacterium. Quando as cotiledôneas imaturas foram transformadas sem LTP3::At- WUS (tratamento de controle) os embriões somáticos maduros não foram apenas produzidos em uma frequência enormemente reduzida (consulte a Figura 16), mas a duração da infecção por Agrobacterium para um estágio comparável de maturidade de embrião somático exigia nove semanas de cultivo.
[0314] A fim de construir um vetor com expressão de HRA ativada por excisão, o gene HRA foi interrompido pelo Íntron ST-LS1 que contém um único sítio-alvo loxP no centro do íntron, e foi testado para demonstrar que o íntron que contém loxP funcionou adequadamente. Duas metades do cassete de expressão de HRA (divididas no sítio loxP) foram movidas para extremidades opostas do T-DNA com cada metade tendo seu próprio sítio loxP interno, que estavam próximo do centro da T-DNA do que as metades de HRA. Dentro dos dois sítios loxP estavam os cassetes de expressão AXIG1 PRO::WUS2::IN2 TERM, the PLTP PRO::ODP2::OS-T28 TERM, ZM-GLB1 PRO::CRE::pinII e o SB-UBI PRO::ZS-GREEN::OS-UBI TERM (consulte PHP81814 na Tabela 1, e SEQ ID NO:80).
[0315] Esse construto produziu uma alta frequência de rápida formação de embrião somático com excisão dos cassetes WUS/ODP2/CRE/ZS-GREEN combinados para ativar a expressão de HRA, e recuperação de plantas T0 de cópia única. Em um conjunto de experimentos um total combinado de 2.332 embriões imaturos (do consanguíneo PHH5G) foram usados para a transformação por cepa de Agrobacterium LBA4404 THY- carregando PHP81814. Dos embriões totais infectados, um total de 604 plantas T0 foram recuperados, e dessas 604 plantas T0 um total de 215 não continha mais os cassetes de expressão WUS2, ODP2, CRE e SZ-GREEN (totalmente excisados). Uma recuperação geral de eventos de qualidade de 9,2% (número de eventos perfeitos em relação ao número de embriões de partida) foi resultada.
[0316] Em um conjunto separado de três experimentos com consanguíneo HC69, 741 embriões imaturos foram transformados com Agrobacterium contendo PHP81814, e produziram 315 plantas T0 na estufa, das quais 30 eram cópia única para HRA com todos os outros genes excisados para uma frequência de eventos de qualidade de 4%.
[0317] Para esses experimentos, uma configuração de T-DNA única é usada, começando com a configuração de partida usada como um controle positivo: RB + ZM-AXIG1 PRO::ZM-WUS2::IN2-1 TERM + ZM-PLTP PRO::ZM-ODP2::OS-T28 TERM + GZ-W64A TERM + UBI PRO:UBI1ZM INTRON:ESR::SB-SAG12 TERM + SB-ALS PRO:: HRA::SB-PEPC1 TERM + UBI PRO::ZS-GREEN1::PINII TERM:SB-ACTIN TERM-LB. O controle positivo é comparado aos plasmídeos com promotores específicos a embrião que acionam a expressão de WUS2 e ODP2. O plasmídeo PHP24600 é usado como o controle negativo (nenhuma expressão de transgenes WUS2 e ODP2) para fornecer uma linha de base inferior para comparação.
[0318] Quando o promotor ZM-SRD PRO, o ZM-LGL PRO, o ZM-LEA14-A PRO ou os promotores ZM-LEA-D-34 (SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:82 e SEQ ID NO:83, respectivamente) são usados para substituir o ZM-AXIG1 PRO que aciona a expressão de WUS2 nesse construto, espera-se que as frequências de transformação aumentadas e o estímulo de rápida embriogênese somática sejam semelhantes àqueles observados com o vetor de controle positivo, sendo que ambos são substancialmente maiores que o tratamento de controle negativo (PHP24600). Igualmente, quando os promotores ZM-SRD PRO, ZM-LGL PRO, ZM-LEA14-A PRO ou ZM-LEA-D-34 forem usados para substituir a expressão de acionamento de ZM-PLTP PRO de ODP2 nesse construto, espera-se novamente que as frequências de transformação aumentadas e o estímulo de rápida embriogênese somática sejam semelhantes àquelas observadas com o vetor de controle positivo, sendo que ambos são substancialmente maiores que o tratamento de controle negativo (PHP24600).
[0319] Várias sequências são referenciadas na revelação. Os identificadores de sequência são encontrados abaixo na Tabela 18.Tabela 18.
* "DNA" indica uma sequência de polinucleotídeos ou ácidos nucleicos; "PRT" indica uma sequência de polipeptídeos ou proteínas.
[0320] Conforme usado no presente documento, as formas singulares "um", "uma", "o” e "a” incluem referentes plurais, a menos que o contexto dite claramente o contrário. Desse modo, por exemplo, a referência a "uma célula" inclui uma pluralidade de tais células e a referência "à proteína" inclui referência a uma ou mais proteínas e equivalentes das mesmas conhecidas por aqueles versados na técnica, e assim por diante. Todos os termos técnicos e científicos usados no presente documento têm o mesmo significado que o comumente entendido por uma pessoa de habilidade comum na técnica à qual esta revelação pertence, a menos que indicado de outro modo.
[0321] Todas as patentes, publicações e os pedidos de patente mencionados no relatório descritivo são indicativos do nível daqueles versados na técnica aos quais esta revelação pertence. Todas as patentes, publicações e os pedidos de patente são incorporados ao presente documento a título de referência em sua totalidade até o mesmo ponto como se cada patente, publicação e pedido de patente individual fosse específica e individualmente indicado como incorporados a título de referência em sua totalidade.
[0322] Embora a revelação supracitada tenha sido descrita em alguns detalhes a título de ilustração e exemplo com propósitos de clareza de entendimento, determinadas mudanças e modificações podem ser praticadas dentro do escopo das reivindicações anexas.
Claims (22)
1. Método para produzir uma planta transgênica CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: (a) transformar uma célula de um explante embrião imaturo com um construto de expressão que compreende: (i) uma sequência de nucleotídeos conforme estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13 ou 15 ou degenerados da mesma que codifica um polipeptídeo homeobox WUS/WOX que compreende a sequência de aminoácidos estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14 ou 16; ou (ii) uma sequência de nucleotídeos conforme estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NO: 17, 19, 62, 64 ou 66 ou degenerados da mesma que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA que compreende a sequência de aminoácidos estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NO: 18, 20, 63, 65, ou 67; ou (iii) uma combinação de (i) e (ii); (b) permitir a expressão do polipeptídeo de (a) em cada célula transformada para formar uma estrutura de planta regenerável na ausência de citocinina exógena, em que nenhum calo é formado e a estrutura de planta regenerável é formada dentro de 1 a 7 dias de transformação da célula ou 1 a 14 dias de transformação da célula; e (c) germinar a estrutura de planta regenerável para formar a planta transgênica.
2. Método para produzir uma planta transgênica CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: (a) transformar uma célula de um explante embrião imaturo com um construto de expressão que compreende: (i) uma sequência de nucleotídeos conforme estabelecida na SEQ ID NO: 3 ou degenerados das mesma que codifica um polipeptídeo WUS2 que compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecida na SEQ ID NO: 4; ou (ii) uma sequência de nucleotídeos conforme estabelecida na SEQ ID NO: 17 ou degenerados da mesma que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA que compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecida na SEQ ID NO: 18; ou (iii) uma combinação de (i) e (ii); (b) permitir a expressão de um polipeptídeo de (a) em cada célula transformada para formar uma estrutura de planta regenerável na ausência de citocinina exógena, em que nenhum calo é formado; e (c) germinar a estrutura de planta regenerável para formar a planta transgênica.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a planta transgênica é formada em 14 dias a 60 dias de transformação da célula.
4. Método, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de quea estrutura de planta regenerável é formada dentro de 1 a 7 dias ou 1 a 14 dias de transformação da célula.
5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, CARACTERIZADO pelo fato de que o construto de expressão compreende tanto a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX quanto à sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA.
6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, CARACTERIZADO pelo fato de que o construto de expressão compreende: (i) a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX; ou (ii) a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA.
7. Método, de acordo com reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que a expressão da sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX e a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2 ocorre dentro de menos de 1 dia, menos de 2 dias, menos de 5 dias, menos de 7 dias ou menos de 14 dias após iniciação de transformação.
8. Método, de acordo com reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de que a expressão da sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX ou a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2 ocorre dentro de menos de 1 dia, menos de 2 dias, menos de 5 dias, menos de 7 dias ou menos de 14 dias após iniciação de transformação.
9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 6, CARACTERIZADO pelo fato de que o construto de expressão compreende adicionalmente uma sequência de nucleotídeos que codifica uma recombinase específica a sítio operacionalmente ligada a um promotor constitutivo, um promotor induzível, ou um promotor regulado em desenvolvimento, em que a recombinase específica a sítio é selecionada a partir de FLP, Cre, SSV1, lambda Int, phi C31 Int, HK022, R, Gin, Tn1721, CinH, ParA, Tn5053, Bxb1, TP907-1 ou U153, ou em que a recombinase específica a sítio é um polipeptídeo de fusão desestabilizado, em que o polipeptídeo de fusão desestabilizado é TETR(L17G)~CRE ou ESR(L17G)~CRE.
10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6 ou 9, CARACTERIZADO pelo fato de que: (i) a sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é operacionalmente ligada a um promotor constitutivo, um promotor induzível ou um promotor regulado em desenvolvimento; ou (ii) a sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende dois domínios de ligação de AP2-DNA é operacionalmente ligada a um promotor constitutivo, um promotor induzível ou um promotor regulado em desenvolvimento.
11. Método, de acordo com a reivindicação 9 ou 10, CARACTERIZADO pelo fato de que: (A) o promotor constitutivo é selecionado dentre UBI, LLDAV, EVCV, DMMV, BSV (AY) PRO, CYMV PRO FL, UBIZM PRO, SI-UB3 PRO, SB-UBI PRO (ALT1), USB1ZM PRO, ZM-GOS2 PRO, ZM-H1B PRO (1,2 KB), IN2-2, NOS, a versão -135 de 35S ou ZM-ADF PRO (ALT2); (B) o promotor induzível é selecionado dentre AXIG1, DR5, XVE, GLB1, OLE, LTP2, HSP17.7, HSP26, HSP18A ou promotores ativados por tetraciclina, etametsulfurona ou clorsulfurona, em que: (i) o promotor induzível é um promotor quimicamente induzível, o qual é XVE; (ii) o promotor induzível é um promotor induzível de auxina; preferencialmente em que o promotor induzível de auxina é um AXIG1; mais preferencialmente em que o promotor AXIG1 compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 39; ou (iii) o promotor induzível compreende um elemento de resposta de auxina; (C) o promotor regulado em desenvolvimento é selecionado dentre PLTP, PLTP1, PLTP2, PLTP3, LGL, LEA-14A ou LEA-D34.
12. Método, de acordo com a reivindicação 9 ou 10, CARACTERIZADO pelo fato de que o promotor induzível é um promotor quimicamente induzível reprimido por TETR, ESR, ou CR, e a não repressão ocorre mediante a adição de ligantes relacionados a tetraciclina ou sulfonilureia, em que o repressor: (i) é TETR e o ligante relacionado a tetraciclina é doxiciclina ou anidrotetraciclina; ou (ii) é ESR e o ligante de sulfonilureia é etametsulfurona, clorsulfurona, metsulfurona-metila, sulfometurona metila, clorimurona etila, nicossulfurona, primissulfurona, tribenurona, sulfossulfurona, trifloxissulfurona, foransulfurona, iodossulfurona, prossulfurona, tifensulfurona, rinsulfurona, mesossulfurona ou halossulfurona;
13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 12, CARACTERIZADO pelo fato de que o promotor induzível contém um ou mais motivos intensificadores de DR5.
14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 13, CARACTERIZADO pelo fato de que: (A) o promotor é um promotor constitutivo fraco modificado para repressão e não repressão, em que: (i) uma ou mais sequências de operador no promotor foram posicionadas perto ou sobrepondo o TATA box; ou (ii) o promotor é selecionado dentre NOS, AXIG1, ZM-GOS2, CC-UBI1-PRO ou ZM-ADF4-PRO; (B) o promotor induzível é o promotor DR5 que compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 40; (C) o promotor é um promotor não reprimível, em que o promotor não reprimível é TETR, ESR ou CR.
15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 13, CARACTERIZADO pelo fato de que: (A) o promotor é um promotor constitutivo fraco modificado para repressão e não repressão, em que: (i) uma ou mais sequências de operador no promotor foram posicionadas perto ou sobrepondo o sítio de início de transcrição; ou (ii) o promotor é selecionado dentre NOS, AXIG1, ZM-GOS2, CC-UBI1-PRO ou ZM-ADF4-PRO; (B) o promotor induzível é o promotor DR5 que compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 40; (C) o promotor é um promotor não reprimível, em que o promotor não reprimível é TETR, ESR ou CR.
16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 ou 10, CARACTERIZADO pelo fato de que o promotor regulado em desenvolvimento é selecionado dentre PLTP, PLTP1, PLTP2 ou PLTP3, em que o promotor PLTP, PLTP1, PLTP2 ou PLTP3: (A) é derivado de: (i) uma monocotiledônea, em que a monocotiledônea é cevada, milho, painço, aveias, arroz, centeio, Setaria sp., sorgo, cana-de-açúcar, painço amarelo, triticale, relva ou trigo; ou (ii) uma dicotiledônea, em que a dicotiledônea é couve, couve-flor, brócolis, planta de mostarda, repolho, ervilha, cravo-da-índia, alfafa, feijão-fava, tomate, mandioca, soja, canola, girassol, cártamo, tabaco, Arabidopsis ou algodão; ou (B) compreende qualquer uma dentre SEQ ID NO: 1 a 2 ou 55 a 61, em que o promotor PLTP compreende qualquer uma dentre SEQ ID NO: 1 ou 2.
17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 3, CARACTERIZADO pelo fato de que: (A) o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é um polipeptídeo WUS1, em que o polipeptídeo WUS1: (i) compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; ou (ii) é codificado por uma sequência de nucleotídeos que compreende SEQ ID NO: 3; (B) o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é um polipeptídeo WUS2, em que o polipeptídeo WUS2: (i) compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:6; ou (ii) é codificado por uma sequência de nucleotídeos que compreende SEQ ID NO: 5; (C) o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é um polipeptídeo WUS3, em que o polipeptídeo WUS3: (i) compreende a sequência de amino de SEQ ID NO:8; ou (ii) é codificado por uma sequência de nucleotídeos que compreende SEQ ID NO:7; ou (D) o polipeptídeo homeobox WUS/WOX é um polipeptídeo WOX5, em que o polipeptídeo WOX5 é um polipeptídeo WOX5A, em que o polipeptídeo WOX5: (i) compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14; ou (ii) é codificado por uma sequência de nucleotídeos que compreende SEQ ID NO: 13.
18. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 3, CARACTERIZADO pelo fato de que o polipeptídeo que compreende os dois domínios de ligação de AP2-DNA: (i) compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20; ou (ii) é codificado por uma sequência de nucleotídeos que compreende a sequência de SEQ ID NO: 19.
19. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, sendo que o método é CARACTERIZADO pelo fato de que é realizado: (i) na ausência de meio de enraizamento; ou (ii) na presença do meio de enraizamento, em que a citocinina exógena é usada durante a germinação após 7 dias de transformação da célula ou após 14 dias de transformação da célula.
20. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, CARACTERIZADO pelo fato de que o explante é um embrião imaturo, em que o embrião imaturo é: (i) um embrião imaturo de 1 a 5 mm; ou (ii) um embrião imaturo de 3,5 a 5 mm, em que a citocinina exógena é usada durante a germinação após 7 dias de transformação da célula ou após 14 dias de transformação da célula.
21. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que a expressão de um polipeptídeo de (a) é transiente.
22. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, CARACTERIZADO pelo fato de que a germinação é realizada na presença de citocinina exógena.
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