CN113939594A - 用于植物细胞的细胞重编程的胚发生因子 - Google Patents

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Abstract

通过将植物细胞用细胞重编程因子处理来改变细胞命运和发育。诱导胚发生的胚发生因子基因和/或形态发育基因用作细胞重编程因子，特别地包含多肽或编码基因产物的多核苷酸用于从配子生成双单倍体或单倍体植物。通过使分离的细胞与外源的纯化的重组的诱导胚发生的胚发生因子基因产物和/或形态发育基因多肽接触来处理玉蜀黍小孢子，导致胚发生。当用包括调节元件和结构基因的基因构建体转化时，玉蜀黍植物的配子发育为胚状体，所述调节元件和结构基因能够以级联方式发挥作用以改变植物细胞的细胞命运。从基因构建体表达的胚发生因子蛋白和/或形态发育蛋白用于非原位处理方法和用于植物原位细胞重编程。

Description

用于植物细胞的细胞重编程的胚发生因子
技术领域
本公开涉及植物分子生物学领域，更特别地，本公开涉及用于生产非转化植物和转化植物的快速、高效方法。
相关申请的交叉引用
本申请要求美国临时专利申请号62/835500(2019年4月18日提交)和美国临时专利申请号62/947786(2019年12月13日提交)的权益，将这二者特此通过援引以其全文并入本文。
以电子方式递交的序列表的引用
该序列表的官方副本经由EFS-Web作为ASCII格式的序列表以电子方式提交，文件名为“20200417_8046-WO-PCT_ST25”，创建于2020年4月17日，且具有1,984,864字节大小，并与本说明书同时提交。包含在所述ASCII格式的文件中的序列表是本说明书的一部分并且通过引用以其整体并入本文。
背景技术
植物育种计划通过筛选许多植物以鉴定具有所需特征的个体来鉴定新品种。典型地，理想地跨多年和多种环境培养和评估来自杂交的大量子代，以选择具有最需要的特征的植物。
典型的育种方法使两种亲本植物杂交，并且子代1杂交体(F1杂交体)是第一杂交世代。当来自不同杂合组的两种亲本株(典型地近交株)杂交时，观察到商业F1杂交体中的杂交体活力。杂交体活力(由于组合了其亲本的遗传贡献而产生的任何生物品质的改善的或增加的功能)对于商业玉蜀黍种子生产是重要的。商业杂交性能的改善需要持续开发新的近交亲本系。
玉蜀黍近交系开发方法可以使用母本(产生雌性特征的)双单倍体生产，其中从第一代杂交产生的植物的雌穗(已经用来自所谓的“单倍体诱导”系的花粉受精)受精后，选择母本单倍体胚。与继承母本和父本基因组二者的拷贝相反，用单倍体诱导株的花粉对雌花进行授粉导致仅含有单倍体母本基因组的胚珠水平升高，因此产生母本单倍体胚。雌花内的胚珠是减数分裂的产物，并且每个母本胚珠都是独特的减数分裂重组单倍体基因组，从而允许使用包括染色体加倍处理在内的体外组织培养方法分离和处理未成熟的母本单倍体胚，以使得快速生成母本双单倍体重组群体成为可能。通过用来自玉蜀黍单倍体诱导物系的花粉对目标植物受精产生的许多玉蜀黍母本单倍体胚无法再生为可育的、双单倍体植物，并且如果有的话，也很少有体外组织培养和小植株再生方法会从一个单倍体胚繁殖出多个可育植物。因此，需要改善生产来自玉蜀黍中母本配子双单倍体的双单倍体植物的方法。
大多数玉蜀黍近交株对小孢子分离、体外组织培养和小植株再生方法产生父本(产雄性特征的)配子双单倍体具有顽拗性。因此，还需要产生来自玉蜀黍中的父本配子双单倍体的双单倍体植物的方法。
因此，植物育种者还将受益于开发重组近交系群体的方法，所述重组近交系不需要大量授粉控制方法或不需要延长将自体受精系繁殖为等基因态所需的时间。
发明内容
在一方面，提供了一种生成植物胚的方法，所述方法包括(a)通过向植物细胞提供细胞重编程剂以得到所述植物细胞中的胚发生细胞命运来获得胚发生细胞，细胞重编程剂是选自由以下组成的组的细胞重编程多肽(i)形态发育基因多肽；或(ii)胚发生因子多肽；或(iii)失活的CRISPR-Cas核酸酶翻译融合多肽，(i)和(ii)的组合；(i)和(iii)的组合；(ii)和(iii)的组合；以及(b)从所述植物细胞产生所述植物胚。
在一方面，所述植物细胞是配子细胞。在一方面，所述配子细胞是母本配子细胞。在另一方面，所述配子细胞是父本配子细胞。
在一方面，所述细胞重编程剂不是由配子细胞中稳定整合的重组DNA构建体产生的。在另一方面，所述细胞重编程剂是由配子细胞中稳定整合的重组DNA构建体产生的。
在一方面，所述形态发育基因多肽选自由以下组成的组(i)WUS/WOX同源盒多肽；(ii)Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽；(iii)LEC1多肽；(iv)(i)和(ii)的组合；以及(v)(i)和(iii)的组合。
在一方面，所述细胞重编程多肽进一步包含细胞穿透肽(CPP)。
在一方面，所述细胞重编程多肽进一步包含分泌信号肽(SSP)。
在一方面，所述细胞重编程因子存在于组织培养基中。
在一方面，所述方法包括将所述小孢子与胚发生诱导悬浮饲养细胞培养物(embryogenesis inducing suspension feeder cell culture)共培养，其中所述胚发生诱导悬浮饲养细胞培养物表达胚发生诱导多肽，或在所述培养基中将所述小孢子与所述细胞重编程因子共培养。
在一方面，所述胚发生因子多肽选自由以下组成的组(i)转录因子bHLH30样多肽；(ii)杂交D型周期蛋白多肽；(iii)促分裂原活化的激酶蛋白多肽；(iv)植物脂质转移多肽；(v)周期蛋白δ-2多肽；(vi)oberon样蛋白样多肽；
(vii)多核苷酸腺苷转移酶多肽；(viii)GATA锌指多肽；(ix)同源盒-亮氨酸拉链多肽；(x)水解酶多肽；(xi)端粒酶逆转录酶多肽；(xii)锌指多肽；(xiii)GRAS家族转录因子多肽；(xiv)mlo防御基因同源物多肽；(xv)3-酮脂酰辅酶A合酶11样多肽；(xvi)植物硫酸肽多肽；以及
(i)以及同时包含任意两种或更多种胚发生因子多肽的组合。
在一方面，所述细胞重编程多肽是选自由由周期蛋白依赖性激酶(CDK)组成的细胞周期调节因子的组的细胞周期调节因子多肽。
在一方面，细胞重编程多肽选自由以下组成的组：(i)胚发生因子多肽和(ii)细胞周期调节因子多肽；(iii)形态发育基因多肽；(iv)(i)和(ii)的组合；(ii)和(iii)的组合；或(i)和(ii)和(iii)的组合。
在一方面，所述方法进一步包括培养单倍体植物胚。在一方面，所述方法包括使单倍体植物胚与染色体加倍剂接触，持续足以产生双单倍体植物胚的时间段。在一方面，所述方法其中所述小孢子获自玉蜀黍、水稻、高粱、芸苔属(brassica)、大豆、小麦和棉花。
在一方面，提供了一种生成单倍体植物胚的方法，所述方法包括(a)提供包含表达盒的植物，其中所述表达盒包含单倍体诱导表达盒，其中所述表达盒包含可操作地连接到编码形态发育基因和胚发生因子和/或细胞周期调节因子多肽的多核苷酸的卵细胞偏好性调节元件；(b)将(a)的植物作为母本与表达颜色标记的父本杂交；(c)分离雌性单倍体胚；(d)使所述单倍体胚与染色体加倍剂接触；以及(e)从所述双单倍体产生双单倍体植物。
在一方面，提供了一种用于改善玉蜀黍单倍体诱导物的单倍体诱导的方法，所述方法包括(a)为单倍体诱导物植物提供表达盒，其中所述表达盒包含单倍体诱导表达盒，其中所述表达盒包含可操作地连接到编码形态发育基因和/或胚发生因子和/或细胞周期调节因子多肽的多核苷酸的卵细胞偏好性或花粉细胞偏好性调节元件；(b)将(a)的植物与雌性杂交(c)从母本中分离单倍体胚；(d)使所述单倍体胚与染色体加倍剂接触；以及(e)从所述双单倍体产生双单倍体植物。
在一方面，提供了一种生成单倍体植物胚的方法，所述方法包括(a)提供包含表达盒的植物，其中所述表达盒包含dCas9细胞重编程表达盒，其中所述表达盒包含可操作地连接到编码失活的Cas9翻译融合多肽的多核苷酸的卵细胞偏好性或花粉细胞偏好性调节元件；(b)将(a)的植物作为母本与表达颜色标记的父本杂交；(c)分离雌性单倍体胚；(d)使所述单倍体胚与染色体加倍剂接触；以及(e)从所述双单倍体产生双单倍体植物。
在一方面，提供了一种生成单倍体植物胚的方法，所述方法包括(a)提供包含表达盒的植物，其中所述表达盒包含可操作地连接到编码细胞重编程多肽的多核苷酸的绒毡层细胞偏好性调节元件；(b)将(a)的植物与野生型近交植物杂交以提供F1杂交体；(c)从(b)的F1杂交体回收胚发生型小孢子；以及(d)从所述胚发生型小孢子产生所述单倍体植物胚。
在一方面，所述细胞重编程多肽是形态发育多肽。在一方面，所述细胞重编程多肽是胚发生因子多肽。在一方面，所述细胞重编程多肽是细胞周期调节因子多肽。
在一方面，所述细胞重编程多肽选自由以下组成的组：(i)胚发生因子多肽和(ii)细胞周期调节因子多肽；以及(iii)形态发育基因多肽；(iv)(i)和(ii)的组合；(ii)和(iii)的组合；或(i)和(ii)和(iii)的组合。
在一方面，所述形态发育多肽选自由以下组成的组(i)WUS/WOX同源盒多肽；(ii)Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽；(iii)LEC1多肽。
在一方面，所述方法进一步包括通过位点特异性核酸酶修饰基因组DNA。在一方面，所述表达盒进一步包含编码位点特异性核酸酶的多核苷酸。在一方面，所述位点特异性核酸酶选自由锌指核酸酶、大范围核酸酶、TALEN和CRISPR-Cas内切核酸酶组成的组。在一方面，所述CRISPR-Cas核酸酶是aCas9、Cpf1、或Casα核酸酶。在一方面，在小孢子胚发生期间，通过Cas内切核酸酶进行基因组DNA的修饰。在一方面，DNA的所述修饰是插入、缺失或取代突变。在一方面，从表达盒中表达所述Cas内切核酸酶，所述Cas内切核酸酶进一步包含细胞穿透肽。在一方面，所述方法进一步包括提供从所述表达盒表达的指导RNA。在一方面，通过向所述胚发生型小孢子外源地提供指导RNA和Cas内切核酸酶作为核糖核蛋白复合物进行DNA的所述修饰。在一方面，所述植物对于所述表达盒是纯合的。
在一方面，所述表达盒进一步包含信号肽。在一方面，所述表达盒进一步包含细胞穿透肽(CPP)。在一方面，所述方法进一步包括使所述单倍体植物胚与染色体加倍剂接触，持续足以产生双单倍体植物胚的时间段。在一方面，所述植物是玉蜀黍、水稻、高粱、芸苔属、大豆、小麦或棉花。在一方面，所述方法进一步包括从所述双单倍体植物胚再生双单倍体植物。
在一方面，提供了一种生成双单倍体植物的方法，所述方法包括(a)提供包含表达盒的植物，其中所述表达盒包含可操作地连接到编码胚发生诱导多肽的多核苷酸的胚乳细胞偏好性调节元件；(b)将(a)的植物与野生型F1杂交体杂交；(c)从(b)的杂交回收单倍体胚；(d)使所述单倍体胚与染色体加倍剂接触，持续足以产生双单倍体胚的时间段；以及(e)从(d)的双单倍体胚再生所述双单倍体植物。在一方面，所述胚发生诱导多肽是形态发育多肽。在一方面，所述形态发育多肽选自由以下组成的组(i)WUS/WOX同源盒多肽；(ii)Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽；(iii)LEC1多肽；(iv)(i)和(ii)的组合；以及(v)(i)和(iii)的组合。在一方面，所述表达盒进一步包含编码基因编辑核酸酶的多核苷酸。在一方面，所述方法进一步包括通过位点特异性核酸酶修饰基因组DNA。在一方面，所述表达盒进一步包含编码位点特异性核酸酶的多核苷酸。在一方面，所述位点特异性核酸酶选自由锌指核酸酶、大范围核酸酶、TALEN和CRISPR-Cas内切核酸酶组成的组。在一方面，所述CRISPR-Cas核酸酶是Cas9或Cpf1核酸酶。在一方面，在单倍体胚胚发生期间，通过Cas内切核酸酶进行基因组DNA的修饰。在一方面，DNA的所述修饰是插入、缺失或取代突变。在一方面，从表达盒中表达所述Cas内切核酸酶，所述Cas内切核酸酶进一步包含细胞穿透肽。在一方面，所述方法进一步包括提供从所述表达盒表达的指导RNA。在一方面，通过向所述胚发生的单倍体胚外源地提供指导RNA和Cas内切核酸酶作为核糖核蛋白复合物进行DNA的所述修饰。在一方面，所述植物对于所述表达盒是纯合的。在一方面，所述表达盒进一步包含信号肽。在一方面，所述表达盒进一步包含细胞穿透肽(CPP)。在一方面，所述表达盒进一步包含编码可操作地连接到调节元件的颜色标记或荧光标记的多核苷酸。在一方面，回收所述单倍体胚包括针对所述颜色标记、所述荧光标记或所述调节元件的存在或不存在进行筛选。在一方面，所述筛选在用于自动荧光检测的细胞活力和细胞分选微流控设备中发生，以鉴定、分选和选择包含所述表达盒的单倍体胚与不包含所述表达盒的单倍体胚。
在一方面，提供了一种胚发生型小孢子，所述胚发生型小孢子与对照小孢子相比包含增加量的胚发生诱导多肽，其中在所述小孢子中不产生所述多肽。在一方面，提供了一种从胚发生型小孢子产生的胚状体或胚发生的组织。在一方面，提供了一种胚发生型小孢子，所述胚发生型小孢子包含异源细胞重编程剂，其中在所述小孢子中不产生所述异源细胞重编程剂。在一方面，所述细胞重编程剂选自由以下组成的组：(i)胚发生诱导多肽；或(ii)胚发生诱导化合物；或(iii)(i)和(ii)的组合。在一方面，所述胚发生诱导多肽选自由以下组成的组(i)WUS/WOX同源盒多肽；(ii)Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽；(iii)LEC1多肽；(iv)(i)和(ii)的组合；以及(v)(i)和(iii)的组合。在一方面，所述胚发生诱导化合物是氯化血红素或激酶抑制剂或其组合。在一方面，所述胚发生型小孢子能够产生单倍体胚。在一方面，所述胚发生型小孢子是玉蜀黍胚发生型小孢子。在一方面，所述胚发生型小孢子来自水稻、高粱、芸苔属、大豆、小麦或棉花。在一方面，提供了一种包含表达盒的植物细胞，其中所述表达盒包含绒毡层细胞偏好性调节元件，所述绒毡层细胞偏好性调节元件可操作地连接到编码胚发生诱导多肽的多核苷酸，并且其中所述胚发生诱导多肽能够被分泌或转运到小孢子中。在一方面，所述胚发生诱导多肽包含细胞穿透肽。在一方面，所述胚发生诱导多肽是选自由以下组成的组的形态发育多肽：(i)WUS/WOX同源盒多肽；(ii)Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽；(iii)LEC1多肽；(iv)(i)和(ii)的组合；以及(v)(i)和(iii)的组合。在一方面，提供了一种包含表达盒的植物细胞，其中所述表达盒包含胚乳细胞偏好性调节元件，所述胚乳细胞偏好性调节元件可操作地连接到编码胚发生诱导多肽的多核苷酸，并且其中所述胚发生诱导多肽在胚乳细胞、胚周区(ESR)、基底胚乳转移层(BETL)或其组合中产生，并且能够被分泌或转运到胚细胞中。在一方面，提供了一种包含所述植物细胞和所述胚细胞的植物细胞群体，其中所述胚细胞包含分泌或转运的胚发生诱导多肽。在一方面，所述胚发生诱导多肽是选自由以下组成的组的形态发育多肽：(i)WUS/WOX同源盒多肽；(ii)Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽；(iii)LEC1多肽；(iv)(i)和(ii)的组合；以及(v)(i)和(iii)的组合。
1.一种生成非转基因双单倍体植物的方法，所述方法包括：
(a)通过向小孢子提供选自由以下组成的组的细胞重编程剂来获得胚发生型小孢子：
i)细胞重编程多肽；
ii)细胞重编程多核苷酸；
iii)i)和ii)的组合；
(b)从所述胚发生型小孢子产生单倍体植物胚；
(c)使所述单倍体胚与染色体加倍剂接触，持续足以产生双单倍体胚的时间段；以及
(d)从(c)的所述双单倍体胚再生双单倍体植物。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞重编程多肽选自由以下组成的组：
(a)形态发育多肽；
(b)胚发生因子多肽；
(c)合成的转录因子多肽；
(d)(a)和(b)的组合；
(e)(a)和(c)的组合；
(f)(b)和(c)的组合；以及
(g)(a)、(b)和(c)的组合。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述形态发育多肽选自由以下组成的组：
(a)功能性WUS/WOX多肽；
(b)Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽；
(c)LEC1多肽；
(d)(a)和(b)的组合；
(e)(a)和(c)的组合；以及
(f)(b)和(c)的组合。
4.如权利要求2所述的方法，其中所述胚发生因子多肽包含：
(a)与SEQ ID NO：17至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
(b)与SEQ ID NO：18至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
(c)与SEQ ID NO：19至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
(d)与SEQ ID NO：20至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
(e)与SEQ ID NO：21至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
(f)与SEQ ID NO：22至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
(g)与SEQ ID NO：23至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
(h)与SEQ ID NO：24至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
5.如权利要求2所述的方法，其中所述合成的转录因子多肽选自由以下组成的组：
(a)dCas9-翻译融合蛋白；
(b)dCasα-翻译融合蛋白；以及
(c)(a)和(b)的组合。
6.如权利要求1所述的方法，其中通过使所述小孢子与所述细胞重编程多肽接触来进行提供所述细胞重编程多肽。
7.如权利要求1、2或6中任一项所述的方法，其中所述细胞重编程多肽进一步包含细胞穿透肽(CPP)。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述细胞穿透肽(CPP)选自由以下组成的组：
(a)蛋白质转导结构域CPP，
(b)两亲性肽CPP，
(c)合成的阳离子聚组氨酸多肽CPP，
(d)合成的阳离子聚赖氨酸多肽CPP，
(e)合成的阳离子聚精氨酸多肽CPP，
(f)树状聚阳离子CPP，
(g)血管内皮钙粘蛋白CPP，
(h)转运素(transportan)CPP，
(i)HIV-1 TAT CPP的单体或二聚体，
(j)穿透素(penetratin)CPP，
(k)合成的阳离子高精氨酸寡肽CPP，和
(l)γ-玉米醇溶蛋白CPP。
9.如权利要求1所述的方法，所述方法进一步包括分离和培养所述双单倍体胚。
10.一种通过如权利要求1或9所述的方法产生的双单倍体植物。
11.如权利要求5所述的方法，其中所述细胞重编程多肽包含具有细胞重编程活性的dCas9-翻译融合蛋白，所述方法包括：
(a)将包含选自下组的氨基酸序列的多肽引入细胞：dCas9-染色质修饰性翻译融合蛋白，其包含：
i)与SEQ ID NO：78至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
ii)与SEQ ID NO：79至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
iii)与SEQ ID NO：80至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
iv)与SEQ ID NO：81至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
v)与SEQ ID NO：82至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
(b)将所述多肽与包含选自下组的氨基酸序列的多肽组合引入细胞：翻译融合蛋白，其包含含有以下的dCas9-转录激活物融合蛋白：
i)灭活的Spy Cas9(编码多肽SEQ ID NO：84的多核苷酸SEQ ID NO：83).和
ii)拟南芥属(Arabidopsis)CBF1蛋白(编码多肽SEQ ID NO：86的多核苷酸SEQ IDNO：85)的转录激活物结构域，或
iii)VP64结构域(编码多肽SEQ ID NO：245的多核苷酸SEQ ID NO：244)的转录激活物结构域；
(c)将所述多肽与包含选自下组的氨基酸序列的多肽组合引入细胞：翻译融合蛋白，其包含含有以下的dCas9-转录阻遏物融合蛋白：
i)如表16中所示的转录阻遏物基序；
ii)如表17中所示的转录阻遏物结构域。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述dCas9-翻译融合蛋白与至少一种选自由以下组成的组的指导RNA(gRNA)组合：
(a)与编码功能性WUS/WOX多肽的基因座具有序列同源性的gRNA；
(b)与编码Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽的基因座具有序列同源性的gRNA；
(c)与编码LEC1多肽的基因座具有序列同源性的gRNA；
(d)与编码胚发生因子多肽的基因座具有序列同源性的gRNA；
(e)与编码C2H2型锌指蛋白的基因座具有序列同源性的gRNA；
(f)与编码MADS-盒转录因子蛋白的基因座具有序列同源性的gRNA；
(g)与编码多梳组(PcG)蛋白或其亚基的基因座具有序列同源性的gRNA；以及
(h)与编码CHD3染色质重塑因子或其亚基的基因座具有序列同源性的gRNA，从而形成核糖核蛋白复合物，所述核糖核蛋白复合物包含促进细胞重编程的蛋白质(编码多肽17至32的多核苷酸)。
13.如权利要求12所述的方法，其中编码胚发生因子多肽的基因座是选自由以下组成的组的核苷酸序列：
(a)SEQ ID NO：1-16中的至少一个；
(b)与SEQ ID NO：1-16中的至少一个至少95％相同的核苷酸序列；以及
(c)与SEQ ID NO：1-16中的至少一个至少70％相同的核苷酸序列。
14.如权利要求12所述的方法，其中针对基因座设计gRNA包括：
(a)选择位于编码gRNA靶位点的基因座侧翼的DNA序列，包括所述基因座上游或下游高达10,000个核苷酸的近端调节区，或
(b)选择位于编码gRNA靶位点的基因座侧翼的DNA序列，包括所述基因座上游或下游超过10,000个核苷酸的顺式调节元件，或
(c)(a)和(b)和(c)的方法，或其任何组合。
15.如权利要求11-12所述的方法，其中使用多核苷酸将dCas9翻译融合多肽引入细胞，其包括：
(a)将含有dCas9-翻译融合蛋白质表达盒和指导RNA表达盒的双链或单链DNA多核苷酸附接到粒子上用于引入并递送到细胞中；
(b)将含有dCas9-翻译融合蛋白质表达盒的双链或单链DNA多核苷酸和作为RNA分子的至少一种单一gRNA附接到粒子上用于引入并递送到细胞中；
(c)将含有dCas9翻译融合蛋白的RNA多核苷酸和含有指导RNA表达盒的双链或单链DNA多核苷酸附接到粒子上用于引入并递送到细胞中；
(d)将含有dCas9翻译融合蛋白的RNA多核苷酸和作为RNA分子的至少一种单一gRNA附接到粒子上用于引入并递送到细胞中。
16.如权利要求11-12所述的方法，其中使用多肽将所述dCas9翻译融合蛋白引入植物细胞，其包括：
(a)将含有dCas9翻译融合蛋白的多肽和含有指导RNA表达盒的双链或单链DNA多核苷酸附接到粒子上用于引入并递送到细胞中；
(b)将含有dCas9翻译融合蛋白的多肽和作为RNA分子的至少一种单一gRNA附接到粒子上用于引入并递送到细胞中。
17.如权利要求15所述的方法，其中将所述dCas9翻译融合蛋白与细胞穿透肽融合，所述细胞穿透肽包含：
(a)玉蜀黍(Z.mays)knotted1 CPP(SEQ ID NO：49)，
(b)粟酒酵母(Saccharomyces pombe)TP10 CPP(SEQ ID NO：51)，
(c)白色念珠菌(Candida albicans)Zebra CPP(SEQ ID NO：53)，
(d)PEP1 CPP(SEQ ID NO：55)，
(e)HIV-1 TAT CPP(SEQ ID NO：57)，和
(f)γ-玉米醇溶蛋白细胞穿透肽(SEQ ID NO：59)。
18.如权利要求11-17所述的方法，其中所述方法包括将植物细胞暴露于与一种或多种gRNA复合的两种或更多种dCas9翻译融合蛋白以从经处理的细胞获得植物。
19.一种生成非转基因双单倍体植物的方法，所述方法包括：
(a)表达与编码细胞重编程多肽的多核苷酸可操作地连接的绒毡层细胞偏好性调节元件，
(b)分泌所表达的细胞重编程多肽并将所述多肽转运到小孢子中，
(c)获得响应于所述细胞重编程多肽的胚发生型小孢子，
(d)从所述胚发生型小孢子产生所述单倍体植物胚，
(e)使所述单倍体胚与染色体加倍剂接触，持续足以产生双单倍体胚的时间段；以及
(f)从(e)的所述双单倍体胚再生所述双单倍体植物。
20.如权利要求19所述的植物细胞，其中所述细胞重编程多肽包含细胞穿透肽。
21.如权利要求19所述的植物细胞，其中所述细胞重编程多肽是选自下组的形态发育多肽，该组包含：
(g)WUS/WOX同源盒多肽；
(h)Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽；
(i)LEC1多肽；
(j)(a)和(b)的组合；以及
(k)(a)和(c)的组合。
22.如权利要求19所述的植物细胞，其中所述胚发生因子多肽包含：
(a)与SEQ ID NO：17至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
(b)与SEQ ID NO：18至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
(c)与SEQ ID NO：19至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
(d)与SEQ ID NO：20至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
(e)与SEQ ID NO：21至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
(f)与SEQ ID NO：22至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
(g)与SEQ ID NO：23至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
(h)与SEQ ID NO：24至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
23.如权利要求20所述的方法，其中所述细胞重编程多肽包含分泌信号肽。
24.如权利要求20所述的方法，其中细胞重编程多肽包含细胞重编程-糖皮质激素受体翻译融合多肽。
25.如权利要求24所述的方法，其中通过将配体外部应用到体外组织培养基中而有条件地将融合的细胞重编程-糖皮质激素受体多肽定位到细胞核，从而控制所述蛋白质活性。
26.如权利要求2所述的方法，其中同时向细胞提供一种或多种细胞重编程多肽、和一种或多种细胞周期调节蛋白。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述细胞周期调节蛋白是选自下组的周期蛋白依赖性激酶，该组包含：
(a)与SEQ ID NO：114至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
(b)与SEQ ID NO：115至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
(c)(a)和(b)的组合。
28.一种获得经基因组修饰的双单倍体植物的方法，所述方法包括：
(a)获得具有待编辑的玉蜀黍植物基因组DNA的第一植物，所述第一植物用包含以下的表达盒转化：
i.形态发育基因，或
ii.胚发生因子，或
iii.基因组修饰组分，或
iv.CRE切除组分，或
v.(i)和(ii)和(iii)和(iv)，或其任何组合；
(b)获得第二植物，其中所述第二植物包含标记基因；
(c)用来自所述第二植物的花粉给所述第一植物授粉；
(d)选择至少一个通过授粉步骤(c)产生的单倍体后代，其中所述单倍体后代包含所述第一植物的基因组但不包含所述第二植物的基因组，并且所述第一植物的基因组已被基因编辑组分修饰。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述基因编辑组分使用DNA修饰酶，所述DNA修饰酶是选自下组的定点核酸酶，该组包含：大范围核酸酶(MN)、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活物样效应物核酸酶(TALEN)、Cas9核酸酶、Casα核酸酶、Cpf1核酸酶、dCas9-FokI、dCpf1-FokI、嵌合Cas9-胞苷脱氨酶、嵌合Cas9腺嘌呤脱氨酶、嵌合FEN1-Fok1、Mega-TAL、切口酶Cas9(nCas9)、嵌合dCas9-非-FokI核酸酶、和dCpf1-非-FokI核酸酶。
30.如权利要求28所述的方法，其中所述标记基因选自下组，该组包含：GUS、PMI、PAT、GFP、RFP、CFP、C1、CRC、R-nj、R1-scm和花青苷色素。
31.如权利要求28所述的方法，其中所述经编辑的单倍体后代用染色体加倍剂处理，从而产生经编辑的双单倍体后代。
32.如权利要求31所述的方法，所述染色体加倍剂是秋水仙碱、拿草特、滴停平(dithipyr)、氟乐灵或另一种已知的抗微管剂。
33.如权利要求32所述的方法，所述方法进一步包括分离和培养所述双单倍体植物胚。
34.如权利要求29所述的方法，其中为包含DNA修饰酶的核糖核蛋白复合物提供至少一种指导RNA分子。
35.一种生成双单倍体植物的方法，所述方法包括：
(a)向单倍体细胞提供遗传染色体加倍蛋白；
(b)使所述单倍体细胞与遗传染色体加倍蛋白接触，持续足以产生双单倍体细胞的时间段；
(c)获得双单倍体细胞；
(d)从(c)的双单倍体细胞再生双单倍体植物。
36.如权利要求35所述的方法，其中所述遗传染色体加倍剂是遗传染色体加倍多肽。
37.如权利要求36所述的方法，其中所述遗传染色体加倍多肽选自包含以下的组：
(a)与SEQ ID NO：141至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
(b)与SEQ ID NO：197至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
(c)与SEQ ID NO：198至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
(d)与SEQ ID NO：199至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
(e)与SEQ ID NO：200至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
(f)(a)和(b)的组合，或
(g)(a)和(c)的组合，或
(h)(a)和(d)的组合，或
(i)(a)和(e)的组合。
38.如权利要求36所述的方法，其中处理单倍体细胞包括：
(a)用含有表达遗传染色体加倍多肽的农杆菌(Agrobacterium)的溶液处理单倍体细胞；
(b)使所述遗传染色体加倍多肽从所述农杆菌易位到植物细胞；
(c)从所述农杆菌回收所述植物细胞，从而结束所述处理；
(d)获得双单倍体后代。
39.如权利要求36所述的方法，其中所述遗传染色体加倍包含导致有丝分裂纺锤体不稳定的蛋白质。
40.如权利要求39所述的方法，其中所述导致不稳定的蛋白质在有丝分裂过程中干扰子染色单体的分离。
41.如权利要求40所述的方法，其中干扰活性损害微管聚合。
42.如权利要求41所述的方法，其中通过提供微管蛋白来干扰微管聚合。
43.如权利要求42所述的方法，其中所提供的微管蛋白具有改变的活性。
44.如权利要求43所述的方法，其中干扰微管聚合的所述改变的活性损害α-β-微管蛋白异二聚体活性。
45.如权利要求44所述的方法，其中使用突变的亚基损害微管蛋白亚基的活性，所述突变的亚基包含失去：
(a)提供负责核苷酸水解的T7环的亚基的C末端结构域；
(b)提供核苷酸结合位点的亚基的N末端结构域；
(c)H8螺旋；
(d)T5环；
(e)B9片；
(f)H7螺旋；
(g)GDP(β-微管蛋白)；或
(h)(a)至(g)的任何两种或更多种的组合。
46.如权利要求45所述的方法，其中所述突变的亚基损害鸟嘌呤核苷酸结合位点和/或GTP酶活性。
47.如权利要求46所述的方法，其中微管蛋白保守位点[SAG]-G-G-T-G-[SA]-G(SEQ ID NO：423)发生突变。
48.如权利要求36所述的方法，其中所述遗传染色体加倍剂包含降解有丝分裂周期蛋白，导致包含G1-S-G2期的核内周期。
49.如权利要求48所述的方法，其中促进核内复制包括向单倍体细胞提供细胞周期开关蛋白。
50.如权利要求49所述的方法，其中细胞周期开关蛋白选自包含以下的组：
(a)与SEQ ID NO：197至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
(b)与SEQ ID NO：198至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
(c)与SEQ ID NO：199至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
(d)与SEQ ID NO：200至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
51.如权利要求28所述的方法，其中植物包含与启动子可操作地连接的异源多核苷酸，其中所述多核苷酸编码一种或多种多肽，当所述多核苷酸在植物细胞中表达时，所述一种或多种多肽使植物卵细胞变为胚发生型的。
52.如权利要求51所述的方法，其中所述异源多核苷酸被稳定地掺入到所述植物的基因组中。
53.如权利要求52所述的方法，其中所述植物具有增加水平的选自下组的多肽，该组包含：
(a)与SEQ ID NO：111至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
(b)与SEQ ID NO：21至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
(c)与SEQ ID NO：112至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
(d)与SEQ ID NO：113至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
(e)与SEQ ID NO：114至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
(f)与SEQ ID NO：115至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
(g)与SEQ ID NO：116至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
(h)与SEQ ID NO：117至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
(i)(d)和(h)的组合。
54.如权利要求53所述的方法，其中所述植物在所述卵细胞中具有升高的重编程水平，促进响应于所述多肽的胚发生细胞命运。
55.如权利要求54所述的方法，其中所述重编程使卵细胞变成孤雌生殖，并且其中所述孤雌生殖的卵细胞仅含有母本基因组(1n)。
56.如权利要求55所述的方法，其中所述植物具有包含升高的母本单倍体诱导水平的表型。
57.如权利要求51所述的方法，其中所述启动子是组织偏好性启动子。
58.如权利要求57所述的方法，其中所述组织偏好性启动子导致所述一种或多种多肽在所述卵细胞中表达。
59.如权利要求28所述的方法，其中使用包括以下的方法从经基因组修饰的单倍体胚繁殖克隆的双单倍体植物：
(a)使经基因组修饰的细胞与包含含有形态发生基因表达盒的T-DNA的细菌菌株接触；
(b)在第二经基因组修饰的细胞中引发生长响应；以及
(c)从第二经基因组修饰的植物细胞再生克隆的经基因组修饰的植物；
(d)使所述克隆的经基因组修饰的植物与染色体加倍剂接触，持续足以产生双单倍体胚的时间段；以及
(e)再生所述克隆的经基因组修饰的植物。
60.一种提高玉蜀黍单倍体诱导物系的单倍体诱导能力的方法，所述方法包括：
(a)获得用单倍体诱导表达盒转化的具有已知单倍体诱导能力的玉蜀黍植物，所述单倍体诱导表达盒包含：
i.已知的形态发育基因，或
ii胚发生因子，或
iii.(i)和(ii)的组合；
(b)获得供体植物，其中所述供体植物提供供体雌穗；
(c)用来自转化的单倍体诱导物的花粉给所述供体雌穗的雌穗授粉；
(d)选择至少一个通过授粉步骤(c)产生的单倍体后代，其中所述单倍体后代包含供体植物的基因组，但不包含转化的单倍体诱导物植物的基因组；
(e)使所述单倍体胚与染色体加倍剂接触，持续足以产生双单倍体胚的时间段；以及
(f)从(e)的所述双单倍体胚再生所述双单倍体植物。
61.如权利要求59所述的方法，其中可转化的玉蜀黍植物选自和/或衍生自包含系Stock6、RWK、RWZ、UH400的组。
62.一种用于产生单倍体植物胚的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)提供包含细胞重编程剂的小孢子或花粉；
(b)用所述小孢子或花粉给要制备单倍体胚的植物的胚囊细胞，特别是卵细胞授粉；
(c)允许所述小孢子或花粉在所述胚囊细胞，特别是所述卵细胞中或附近释放所述细胞重编程剂，以改善用于获得单倍体植物胚的方法。
63.如权利要求2所述的方法，其中所述细胞重编程多肽包含催化失活的Casα(dCasα)内切核酸酶，所述内切核酸酶包含与SEQ ID NO：219-226之一至少85％至100％相同的氨基酸序列具有细胞重编程活性的翻译融合蛋白，所述方法包括：
(a)将包含选自下组的氨基酸序列的多肽引入细胞：dCasα染色质修饰性翻译融合蛋白，其包含：
i)与SEQ ID NO：67至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
ii)与SEQ ID NO：68至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
iii)与SEQ ID NO：69至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
iv)与SEQ ID NO：70至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
v)与SEQ ID NO：71至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
vi)与SEQ ID NO：72至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
(b)将所述多肽与包含选自下组的氨基酸序列的多肽组合引入细胞：翻译融合蛋白，其包含含有以下的dCasα-转录激活物融合蛋白：
i)如表14中所示的灭活的Casα，以及；
ii)拟南芥属CBF1蛋白(编码多肽SEQ ID NO：86的多核苷酸SEQ ID NO：85)的转录激活物结构域，或
iii)VP64结构域(编码多肽SEQ ID NO：245的多核苷酸SEQ ID NO：244)的转录激活物结构域；
(c)将所述多肽与包含选自下组的氨基酸序列的多肽组合引入细胞：翻译融合蛋白，其包含由以下组成的dCasα转录阻遏物融合蛋白：
i)如表16中所示的转录阻遏物基序；
ii)如表17中所示的转录阻遏物结构域。
64.将如权利要求63所述的蛋白质与至少一种指导RNA(gRNA)组合，从而建立核糖核蛋白复合物，其包含
(a)设计与跟编码WUS蛋白的基因座具有同一性的序列具有同源性的gRNA序列，所述WUS蛋白促进细胞重编程；
(b)设计与跟编码BBM蛋白的基因座具有同一性的序列具有同源性的gRNA序列，所述BBM蛋白促进细胞重编程；
(c)设计与跟编码LEC1蛋白的基因座具有同一性的序列具有同源性的gRNA序列，所述LEC1蛋白促进细胞重编程；
(d)设计与跟编码胚发生因子蛋白的基因座(编码多肽SEQ ID NO：17至32的多核苷酸SEQ ID NO：1至16)具有同一性的序列具有同源性的gRNA序列，所述胚发生因子蛋白促进细胞重编程；
(e)设计与跟编码C2H2型锌指蛋白的基因座具有同一性的序列具有同源性的gRNA序列，所述C2H2型锌指蛋白阻遏细胞重编程因子；
(f)设计与跟编码MADS-盒转录因子蛋白的基因座具有同一性的序列具有同源性的gRNA序列，所述MADS-盒转录因子蛋白阻遏细胞重编程因子；
(g)设计与跟编码多梳组(PcG)蛋白或其亚基的基因座具有同一性的序列具有同源性的gRNA序列，所述多梳组(PcG)蛋白或其亚基阻遏细胞重编程；
(h)设计与跟编码CHD3染色质重塑因子或其亚基的基因座具有同一性的序列具有同源性的gRNA序列，所述CHD3染色质重塑因子或其亚基阻遏细胞重编程。
65.如权利要求64所述的方法，其中针对基因座设计gRNA包括：
(a)选择位于编码gRNA靶位点的基因座侧翼的DNA序列，包括所述基因座上游或下游高达10,000个核苷酸的近端调节区，或
(b)选择位于编码gRNA靶位点的基因座侧翼的DNA序列，包括所述基因座上游或下游超过10,000个核苷酸的顺式调节元件，或
(c)(a)和(b)和(c)的方法，或其任何组合。
66.如权利要求63所述的方法，其中使用多核苷酸将dCasα翻译融合多肽引入细胞，其包括：
(a)将含有dCasα翻译融合蛋白质表达盒和指导RNA表达盒的双链或单链DNA多核苷酸附接到粒子上用于引入并递送到细胞中，或
(b)将含有dCasα翻译融合蛋白质表达盒的双链或单链DNA多核苷酸和作为RNA分子的至少一种单一gRNA附接到粒子上用于引入并递送到细胞中，或
(c)将含有dCasα翻译融合蛋白的RNA多核苷酸和含有指导RNA表达盒的双链或单链DNA多核苷酸附接到粒子上用于引入并递送到细胞中，或
(d)将含有dCasα翻译融合蛋白的RNA多核苷酸和作为RNA分子的至少一种单一gRNA附接到粒子上用于引入并递送到细胞中。
67.如权利要求63所述的方法，其中使用多肽将所述dCasα翻译融合蛋白引入植物细胞，其包括：
(a)将含有dCasα翻译融合蛋白的多肽和含有指导RNA表达盒的双链或单链DNA多核苷酸附接到粒子上用于引入并递送到细胞中；
(b)将含有dCasα翻译融合蛋白的多肽和作为RNA分子的至少一种单一gRNA附接到粒子上用于引入并递送到细胞中。
68.如权利要求67所述的方法，其中将所述dCasα翻译融合蛋白与细胞穿透肽融合，所述细胞穿透肽包含：
(a)玉蜀黍knotted1 CPP(SEQ ID NO：49)，
(b)粟酒酵母TP10CPP(SEQ ID NO：51)，
(c)白色念珠菌Zebra CPP(SEQ ID NO：53)，
(d)PEP1 CPP(SEQ ID NO：55)，
(e)HIV-1 TAT CPP(SEQ ID NO：57)，和
(f)γ-玉米醇溶蛋白细胞穿透肽(SEQ ID NO：59)。
69.如权利要求63-69所述的方法，其中所述处理包括将植物细胞暴露于与一种或多种gRNA复合的两种或更多种dCasα和/或dCas9翻译融合蛋白以从经处理的细胞获得植物。
70.一种用于获得转基因植物的方法，所述方法包括：
(a)用包含至少一种编码胚发生因子多肽的多核苷酸的表达盒转化植物细胞以获得转化的植物组织；
(b)从由所述多核苷酸表达的蛋白质接触的组织的细胞再生转化的植物；以及
(c)选择存在基因组修饰的遗传工程化的植物。
71.如权利要求71所述的方法，其中所述胚发生因子多肽包含：
(a)与SEQ ID NO：17至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
(b)与SEQ ID NO：18至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
(c)与SEQ ID NO：19至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
(d)与SEQ ID NO：20至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
(e)与SEQ ID NO：21至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
(f)与SEQ ID NO：22至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
(g)与SEQ ID NO：23至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
(h)与SEQ ID NO：24至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
72.一种用于对靶基因进行基因座特异性基因调节的方法，所述方法包括：
(a)向细胞提供链特异性RNA转录物，其中所述链特异性RNA转录物含有与DNA调节元件同源的序列；
(b)使所述链特异性RNA转录物结合至RNA结合蛋白；以及(c)转换基因调节表达状态，其中所述DNA调节元件取决于转录方向可以用作增强子或阻遏子；
(d)改善所述经处理的细胞的细胞重编程；
(e)从所述经处理的细胞再生植物。
73.一种用于改善植物细胞中细胞重编程的方法，所述方法包括向细胞提供与蛋白质结合的RNA分子，从而降低所述蛋白质的酶活性。
74.如权利要求75所述的方法，其中所述RNA分子是非编码RNA。
75.如权利要求76所述的方法，其中所述非编码RNA与响应元件具有序列同源性。
76.如权利要求76所述的方法，其中所述响应元件是三胸复合体(trithorax)响应元件
77.如权利要求76所述的方法，其中所述RNA分子可以是
78.如权利要求76所述的方法，其中所述RNA分子以链特异性方式转录。
79.如权利要求75所述的方法，其中所述蛋白质是多梳组复合物的亚基。
80.如权利要求81所述的方法，其中多梳组复合物活性降低导致基因沉默减少。
9.)如权利要求8所述的方法，其中基因沉默的减少是由沉默的组蛋白修饰的损失，例如组蛋白3上赖氨酸27的三甲基化(H3K27me3)的损失引起的。
81.一种获得双单倍体植物的方法，所述方法包括：
(a)获得用表达盒转化的第一植物，所述表达盒包含：
i.形态发育基因，或
ii胚发生因子，或
iii.(i)和(ii)，或其任何组合；
(b)获得第二植物，其中所述第二植物包含标记基因；
(c)用来自所述第二植物的花粉给所述第一植物授粉；
(d)选择至少一个通过授粉步骤(c)产生的单倍体后代，其中所述单倍体后代包含第一植物的基因组，但不包含所述第二植物的基因组。
82.如权利要求81所述的方法，其中所述标记基因选自下组，该组包含：GUS、PMI、PAT、GFP、RFP、CFP、C1、CRC、R-nj、R1-scm和花青苷色素。
83.如权利要求81所述的方法，其中所述单倍体后代用染色体加倍剂处理，从而产生经编辑的双单倍体后代。
84.如权利要求83所述的方法，所述染色体加倍剂是秋水仙碱、拿草特、滴停平(dithipyr)、氟乐灵或另一种已知的抗微管剂。
85.如权利要求83所述的方法，所述方法进一步包括分离和培养所述双单倍体植物胚。
附图说明
图1显示了14天后体细胞胚发生诱导的相对功效。体细胞胚发生的相对功效显示为相对于对照质粒感染，在用实验质粒感染后第14天表现出体细胞胚发生发育的响应胚的百分比变化(％；y轴)。显示了对于胚发生因子1-16中的每一个，体细胞胚发生的相对功效。
图2A显示了响应于质粒(其共表达DZ470周期蛋白基因和周期蛋白依赖性激酶基因(CDKA1或CDKA3)与WUSCHEL基因组合)的未成熟玉蜀黍胚的体细胞胚发生的功效(％响应；y轴)。图2B显示了响应于质粒(其共表达DZ470周期蛋白基因和周期蛋白依赖性激酶基因(CDKA1或CDKA3)与ODP2/BBM基因组合)的未成熟玉蜀黍胚的体细胞胚发生的功效(％响应；y轴)。
图3是使用细胞重编程处理(其激活产雄性特征的小孢子胚发生)的改善的小孢子胚发生的示意图。显示了导致小孢子发育的小孢子发生步骤。本公开的方法描述了向植物细胞提供细胞重编程剂从而改变细胞命运的方法，例如首先通过对雄穗应用低温应激预处理，其中细胞命运不再能够进行小配子发生发育，并且其次，通过应用细胞重编程处理。细胞重编程处理导致改善的产雄性特征的小孢子胚发生响应，其特征在于细胞增殖为多细胞结构，然后是胚样结构，然后是小孢子衍生的胚状体，并且然后是胚状体萌发和再生后的小孢子衍生的植物。本公开的方法可以使用染色体加倍处理，例如可以将染色体加倍处理应用于小孢子衍生的小植株，以获得小孢子衍生的双单倍体植物。
图4A-图4E显示了与未处理的对照(NTC)相比，各种DNA粒子轰击处理的相对功效。图4A显示了响应于用含有以下的表达载体进行粒子轰击的胚样结构(ELS)生产力的比率：i)WUS2和ODP2/BBM多核苷酸(标记的DG，(SEQ ID NO：210))，ii)无gRNA的dCas9-CBF1A多核苷酸(标记的dCas9，(SEQ ID NO：85))，iii)靶向WUS和BBM基因组位点的gRNA分子(无dCas9-CBF1A多核苷酸)(标记的gRNA，PHP89615(SEQ ID NO：201)，PHP89613(SEQ ID NO：203)，PHP89611(SEQ ID NO：205)，和RV038531(SEQ ID NO：206))，iv)靶向WUS和BBM基因组位点的gRNA分子和dCas9-CBF1A表达质粒的组合(标记的RNP)，以及v)未标记的金粒子(标记的金)。所有上述处理均相对于未处理的对照(NTC)细胞归一化。阴影线条和实心条代表实验的两(2)个重复。图4B和图4C显示了响应以下而发育的胚状体的图像：iv)靶向WUS和BBM基因组位点的RNP处理(图4B和图4C分别为5mm和3mm比例尺)。图4D显示了响应于iii)使用新鲜分离的小孢子的gRNA处理的小孢子胚样结构(ELS)(线1＝0.9mm)。图4E显示了响应于iii)使用14天小孢子培养物的gRNA处理而发育的胚状体(0.5mm比例尺)。
图5A-图5D显示了响应于靶向WUS和BBM基因组位点的dCas9-HAT1 RNP处理的胚状体发育。显示了小孢子衍生细胞的细胞重编程响应。(图5A)(4mm比例尺)轰击后14天的无轰击对照处理，(图5B)(6mm比例尺)轰击后14天的dCas9-HAT1 RNP处理，(图5C)轰击后28天的无轰击对照处理(在100mm直径的培养皿内成像)，和(图5D)轰击后28天的dCas9-HAT1 RNP处理(在100mm直径的培养皿内成像)。
图6A显示使用与卵细胞启动子(ZmRKD2卵细胞启动子或卵细胞Pv-卵细胞PRO(TR1)卵细胞启动子)可操作地连接的截短的BBM(BBM404)基因(分别地，产生ZmRKD2pro：：BBM404表达盒或Pv-卵细胞PRO(TR1)pro：：BBM404表达盒(分别地，SEQ ID NO：119和SEQ IDNO：120)进行母本单倍体诱导的方法的示意图。图6B显示了在用ZmRKD2pro：：BBM404或Pv-EGG CELL PRO(TR1)pro：：BBM404表达盒转化后缺乏父本基因组的CFP阴性胚的百分比(父本基因组缺失％；y轴)。
图7显示了使用含有颜色标记的非单倍体诱导物作为花粉供体的同时单倍体诱导和基因组修饰的示意图。
图8A-图8F显示了从图7中描述的单倍体诱导杂交分离的对于两(2)个独立事件而言的二倍体和单倍体胚的照片图像。图8A和图8B显示了在明场照明下两(2)个独立事件的二倍体胚和单倍体胚中的CFP和RFP表达。图8C和图8D显示了在荧光照明下两(2)个独立事件的二倍体胚和单倍体胚中的CFP和RFP表达。图8E和图8F显示了在荧光照明下两(2)个独立事件的二倍体胚和单倍体胚中的CFP和RFP表达。在图8C和图8D中，通过鉴定两(2)个独立事件的缺CFP的胚来显示单倍体检测。在图8E和图8F中通过鉴定两(2)个独立事件的缺CFP和缺RFP的胚来显示具有推定的CRE切除事件的单倍体。
具体实施方式
将在下文中参考附图更全面地描述本文的公开内容，其中示出了一些但不是所有的可能的方面。实际上，公开内容能以许多不同的形式体现，并且不应被解释为局限于本文所阐述的方面；而是提供这些方面，使得本公开能满足适用的法律要求。
所公开的方法和组合物所涉及的领域中的技术人员将考虑到，本文所公开的许多修改和其他方面具有以下描述和相关附图中呈现的传授的益处。因此，应当理解，这些公开内容不限于所公开的特定方面，并且修改和其他方面旨在包括在所附权利要求的范围内。尽管本文中采用了具体的术语，但这些术语仅在一般性和描述性意义上使用而并非用于限制目的。
也应当了解本文所用的术语仅是为了描述特定方面而不旨在进行限制。如在说明书和权利要求中所使用的，术语“包含”可以包括“由......组成”的方面。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与所公开的方法和组合物所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。在本说明书和下面的权利要求中，将参考本文中所定义的若干术语。
如本文所使用的，单数形式“一种(a)”、“一种(an)”以及“所述”包括复数个指示物，除非上下文中另外明确指明。因此，例如，提及“细胞”包括多个这样的细胞，并且提及“蛋白质”包括本领域技术人员已知的一种或多种蛋白质及其等效物，等等。本文所用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义，除非另有明确说明。
本说明书中提到的所有专利、出版物和专利申请指示了本公开所属领域技术人员的水平。将所有专利、出版物和专利申请通过引用以其整体并入本文，其程度就像明确且个别指出通过引用将每一篇个别专利、出版物或专利申请以其整体并入一样。
在植物中，生殖系细胞(种系)通过在孢子发生过程中产生孢子母细胞，在每个后代中提供遗传信息的跨代遗传。例如，孢子发生提供了发育雌性配子的大孢子母细胞、分别产生胚和胚乳的卵细胞和中央细胞；或发育雄性配子的小孢子母细胞，产生四个单倍体小孢子，其中每个小孢子进一步发育成成熟的花粉粒。种系细胞独特作用的一个关键方面是提供未来的后代接收的遗传信息，其中一半的遗传贡献来自雌性配子，并且一半的遗传贡献来自雄性配子。卵细胞与一个精子细胞受精形成二倍体合子，而第二精子细胞与中央细胞的两个极核融合形成三倍体胚乳。胚乳是胚的终末营养组织，但对种系没有贡献。受精后，合子产生胚，这一过程被称为合子胚发生，是有性生殖的特征。新形成的胚经历这样的胚发生发育程序，所述胚发生发育程序包含受遗传决定子和表观遗传重编程影响的潜在调节程序，导致从胚发生细胞状态到获得分化的一种或多种细胞命运，最终产生具有其所有分化组织的植物。
本公开的方法可以改变上述植物有性生殖的此类发育程序。此类方法作为用于农业用途的植物生殖方法是有价值的。例如，关于从孢子体命运转变为生殖命运或将获得的细胞状态从分化细胞状态回复到胚发生细胞状态(例如种系或多能细胞状态)的机制特别令人感兴趣。本公开提供了使用细胞重编程技术下的分子机制的方法，所述技术可用于农业用途和作物改良。
细胞重编程是指提供刺激以改变经处理的细胞的细胞命运的方法。细胞重编程通常包括将分化的、更特化的细胞回复为诱导多能干细胞状态。此类方法还可包括转分化，定义为将除干细胞以外的细胞转化为第二细胞类型。
如本文所用，“重编程”(“reprogram”或“reprograming”或“reprogramed”)是使成熟的特化细胞回复或敏化为诱导多能干细胞或能够进一步发育为胚或胚样结构的胚/胚发生状态的细胞的过程。在被“重编程”的细胞群体中，预期并非所有细胞都被“重编程”至相同的程度或至相同的胚/胚发生状态。通常预期处于重编程的多种状态的细胞的混合或细胞的镶嵌。与尚未暴露于本文提供的方法和组合物的细胞相比，预期本文提供的方法和组合物可增加重编程的并且处于所需胚/胚发生状态的细胞的比率或百分比。重编程还指生殖细胞发育的重建。当胚发生诱导多肽和/或小分子化合物与植物细胞接触使得植物细胞胚发生时，可发生重编程。本公开的方法提供了使单倍体植物细胞与胚发生诱导剂(如例如，多肽和/或小分子化合物)接触，以重编程细胞命运并且使细胞变为胚发生的。可替代地，可以在植物细胞中引入和表达编码胚发生诱导多肽的多核苷酸，其中所述胚发生诱导多肽影响周围/邻近的细胞，从而使那些周围/相邻细胞变为胚发生的。可以在原位或非原位重编程细胞。
如本文所用，“细胞重编程因子”或“胚发生诱导剂”包括但不限于在细胞命运重编程中独立或协同地发挥功能(包括例如，小孢子胚发生诱导)的小分子、化合物、胚发生因子基因产物和形态发育基因胚发生诱导基因产物。当细胞与小分子接触时，认为这些重编程分子活化在接触的细胞中引发胚发生响应的细胞内的内源基因的表达。
如本文所用，“细胞重编程处理”是本文公开的在接触的细胞中引发胚发生响应的任何处理。
在细胞分离或细胞提取用于实验和/或在外部环境中完成测量之前，对于在生物的组织内部的植物细胞，使用细胞重编程剂(胚发生诱导多肽或胚发生诱导化合物)或细胞重编程处理称为“原位”处理或处理方法。
细胞重编程影响细胞命运，并可能导致各种类型的细胞命运变化。一种细胞命运是成为全能的细胞，其特征是可以形成孢子体和胚外细胞(例如植物中的胚乳细胞)的细胞。另一种细胞命运是成为多潜能的细胞，其特征是可以产生包含孢子体的所有细胞类型(不包括胚外细胞)的细胞。能够直接器官发生的胚发生细胞可以被认为是多能的。另一种细胞命运的特征在于成为多能的细胞，其定义为可以发育成多于一种细胞类型但比多潜能细胞(例如经历间接器官发生的植物细胞)更有限的细胞。重编程还可以指消除分化的或更特化的细胞状态的表观遗传标记特征，并重建胚发生细胞状态的表观遗传标记特征。
本公开包含使用胚发生因子作为细胞重编程剂进行细胞重编程以产生非转基因或转基因植物的方法。这些胚发生因子可以与形态发生基因组合使用。
本公开还包含通过用异源蛋白作为细胞重编程剂处理细胞来进行细胞重编程以产生非转基因植物或转基因植物的方法，所述细胞重编程剂包括与指导RNA复合的异源蛋白，能够改变编码胚发生因子的内源基因座的基因调节。用作细胞重编程剂的异源蛋白也可以与用于将异源蛋白/gRNA复合物募集到编码形态发生基因的基因座的gRNA组合，用于将异源蛋白/gRNA复合物募集到编码胚发生因子的内源基因座。
本公开提供了通过单独使用胚发生因子或与形态发生基因组合使用在野生型细胞中快速诱导体细胞胚发生来产生转基因植物的方法。这些方法可用于植物育种程序，并且特别是作物植物育种程序。
本公开还提供了通过将小孢子与纯化的蛋白质例如胚发生因子基因产物蛋白在化学处理或没有化学处理的情况下共培养来产生非转基因小孢子衍生的双单倍体群体的方法。
本公开还提供了提高玉蜀黍母本双单倍体系统的生产力的方法，具体地通过提高每个取样的单倍体胚的单倍体植物的再生。
如本文所用，“无性生殖”意指没有配子融合的生殖。
如本文所用，“中央细胞”意指产生胚乳的雌性配子。
如本文所用，“卵细胞”意指产生胚的雌性配子。
如本文所用，“大孢子母细胞”意指发育成雌配子体的细胞，也称为大孢子母细胞或功能性大孢子(FMS)。
如本文所用，“小孢子母细胞(microspore mother cell)”意指发育成雄配子体的细胞，也称为小孢子母细胞(microsporocyte)。
如本文所用，“配子发生”意指来自孢子的配子体的发育。
如本文所用，“孤雌生殖”意指从未受精的卵细胞形成胚。
如本文所用，“假受精”意指从中央细胞受精依赖地形成胚乳。
如本文所用，“有性生殖”意指其中雌性(卵)和雄性(精子)配子融合形成合子的生殖方式。
如本文所用，“体细胞胚发生”意指在没有配子和种子形成情况下从孢子体细胞形成胚。
如本文所用，“孢子发生”意指从孢子母细胞形成孢子。
如本文所用，“孢子母细胞”意指生殖谱系的第一个细胞，由植物雌性和雄性生殖组织中的孢子体细胞形成。
如本文所用，“营养繁殖”意指其中形成新植物而不形成胚的繁殖形式。
如本文所用，术语“胚”意指胚及其子代、未成熟和成熟的胚、未成熟的合子胚、合子胚、体细胞胚、胚性愈伤组织以及衍生自成熟穗来源种子的胚。胚是能够萌发形成植物的结构。
如本文所用，“单倍体”意指具有单组染色体(基因组)并且减少的染色体数目(n)等于配子中的染色体数目的植物或植物细胞。
如本文所用，术语“1n”或“1n细胞”意指含有单组染色体的细胞，通常是减数分裂的产物。1n细胞的实例包括配子，例如精细胞、卵细胞或通过有丝分裂从配子衍生的组织，例如1n胚或1n植物。在植物通常是二倍体而配子是单倍体的玉蜀黍中，这种配子衍生的胚或植物被称为单倍体胚和单倍体植物。
如本文所用，“二倍体”意指具有两组(基因组)染色体，并且染色体数目(2n)等于合子中的染色体数目的植物或植物细胞。
如本文所用，术语“2n”或“2n细胞”意指含有两组染色体的细胞。2n细胞的实例包括合子、由合子的有丝分裂产生的胚、或由2n胚的萌发产生的植物。
如本文所用，“单倍体植物”意指具有单组染色体(基因组)并且减少的染色体数目(n)等于配子中的染色体数目的植物。
如本文所用，术语“二倍体植物”意指具有两组(基因组)染色体，并且染色体数目(2n)等于合子中的染色体数目的植物。
如本文所用，“双单倍体”意指单倍体细胞为具有单个基因组(雄性或雌性)的细胞。
如本文所用，“花药”是含有附着于丝状体的小孢子囊的雄蕊的一部分。在被子植物(开花植物)中，所述小孢子囊产生小孢子母细胞(microsporocyte)(也称为小孢子母细胞(microspore mother cell))，所述小孢子母细胞然后通过减数分裂产生四个小孢子。小孢子通过有丝分裂进行分裂，产生花粉粒。
如本文所用，“子房室”是在小配子发生期间含有雄性配子的花药内的隔室。
术语“小配子发生”是植物生殖中的过程，其中小配子体(本文中称为“小孢子”)发育为三细胞花粉粒。
如本文所用，“小孢子囊(microsporangium)”或复数“小孢子囊(microsporangia)”是产生孢子的孢子囊，所述孢子产生雄性配子体。在几乎所有陆地植物中，孢子囊都是减数分裂的位点，并且产生遗传上不同的单倍体孢子。
术语“小孢子胚发生”意指在小孢子中，将引起或诱导小孢子处于胚发生状态的产雄性特征的胚发生进行活化。
术语“小孢子衍生的胚”或“小孢子衍生的胚状体”意指衍生自具有经历胚发生的细胞的细胞命运和发育特征的小孢子的一个或多个细胞。胚或胚状体是能够在体外萌发以产生小植株的有组织的结构。
术语“产雄性特征的”意指孤雄生殖的诱导，其中胚仅含有单倍体或二倍体细胞的父本染色体(单性生殖)。
如本文所用，“单倍体”植物具有单组染色体(基因组)，并且单倍体植物中减少的染色体数目(n)等于配子中的染色体数目。
如本文所用，“二倍体”植物具有两组(基因组)染色体，并且染色体数目(2n)等于合子中的染色体数目。
如本文所用，“双单倍体”或“双单倍体植物或细胞”是通过对单倍体染色体组进行加倍而发育的。从双单倍体植物(自交任何代数)获得的植物或种子仍然可以被鉴定为双单倍体植物。双单倍体植物被认为是纯合植物。如果植物是可育的，则其是双单倍体，即使植物的整个营养部分不是由具有加倍染色体组的细胞组成。例如，如果植物含有活的配子，即使其是嵌合的，也会被认为是双单倍体植物。
如本文所用，“双单倍体胚”是具有一个或多个细胞的胚，所述细胞含有之后可以生长为双单倍体植物的2组纯合染色体。
如本文所用，术语“克隆”意指遗传上、表观遗传上和形态学上相同的多个繁殖的植物细胞或植物。
如本文所用，术语“配子”意指由减数分裂产生的1n生殖细胞如精子细胞、卵细胞或胚珠细胞。
如本文所用，术语“单倍体胚”意指配子衍生的体细胞结构。
如本文所用，术语“体细胞结构”意指组织、器官或生物体。
如本文所用，术语“体细胞”是非配子的细胞。体细胞、组织或植物可以是单倍体、二倍体、三倍体、四倍体、六倍体等。整组染色体被称为1n(单倍体)，其中单组染色体中发现的染色体数被称为单倍体数(x)。例如，在二倍体植物玉蜀黍(Zea mays)中，2n＝2x＝20个总染色体，而在二倍体稻亚洲栽培水稻(Oryza sativa)中，2n＝2x＝24个总染色体。在三倍体植物例如香蕉中，2n＝3x＝33个总染色体。在六倍体小麦普通小麦(Triticum aestivum)中，2n＝6x＝42。倍性水平也可在相同物种内的栽培种之间变化，例如在甘蔗白甘蔗(Saccharum officinarum)中，其中2n＝10x＝80个染色体，但商业甘蔗品种的范围为100至130个染色体。
如本文所用，术语“培养基”包括呈液态、气态或固态的化合物。
如本文所用，术语“可选择标记”意指当在转化/转染细胞中表达时赋予对选择剂如抗生素、除草剂和对未转化/未转染细胞有毒的其他化合物的抗性的转基因。
如本文所用，术语“EAR”意指“乙烯响应元件结合因子相关的两亲性阻遏物基序”，其具有作为转录因子内转录阻遏信号的LLxLxL、DNLxxP、LxLxPP、R/KLFGV或TLLLFR的一般共有序列。在DNA结合蛋白(例如转录因子、dCAS9或LEXA(作为实例))上添加EAR型阻遏物元件，赋予融合蛋白转录阻遏功能(Kagale，S.，和Rozwadowski，K.2010.Plant Signalingand Behavior[植物信号与行为]5：691-694)。
如本文所用，术语“转录因子”意指通过与启动子的DNA序列结合以及上调或下调表达来控制特定基因的转录速率的蛋白质。转录因子(也是形态发生基因)的实例包括AP2/EREBP家族的成员(包括BBM(ODP2)、多血(plethora)和aintegumenta亚家族、CAAT-盒结合蛋白(如LEC1和HAP3)以及MYB的成员、bHLH、NAC、MADS、bZIP和WRKY家族。
如本文所用，术语“合成的转录因子”是指包含至少两个结构域(自然界中非天然存在的识别结构域和调节结构域)的分子。
如本文所用，术语“表达盒”意指由编码和非编码序列组成的载体DNA的独特组分，所述编码和非编码序列包括在转化/转染细胞中控制表达的5’和3’调节序列。
如本文所用，术语“编码序列”意指由编码蛋白质的氨基酸的起始密码子和终止密码子界定的DNA序列部分。
如本文所用，术语“非编码序列”意指进行转录以产生信使RNA但不编码蛋白质的氨基酸的DNA序列部分，例如5’非翻译区，内含子和3’非翻译区。非编码序列也可以指RNA分子，例如微RNA、干扰RNA或RNA发夹，其当表达时可以下调内源基因或其他转基因的表达。
如本文所用，术语“调节序列”意指能够增加或减少基因表达的核酸分子区段。调节序列包括启动子、终止子、增强子元件、沉默元件、5’UTR和3’UTR(非翻译区)。
如本文所用，术语“转移盒”意指T-DNA，其包含侧翼为右边界和左边界的一个或多个表达盒。
如本文所用，术语“T-DNA”意指插入宿主植物细胞的基因组中的Ti质粒的一部分。
如本文所用，术语“胚发生因子”意指当表达时增强细胞重编程的基因，所述基因可促进体细胞衍生结构的改善的形成。更精确地，胚发生因子的异位表达刺激器官发生结构(例如来自胚发生愈伤组织的结构)的从头形成，这可以改善胚的形成。这种刺激的从头胚发生形成发生在表达胚发生因子的细胞中或在邻近的细胞中。胚发生因子基因可以是调节其他基因表达的转录因子，或影响植物组织中激素水平的基因，或影响植物细胞中影响细胞重编程的酶的基因，其中的任何一种均可以刺激胚发生的变化。如本文所用，术语“胚发生因子”意指胚发生因子基因和/或由胚发生因子基因表达的充当细胞重编程剂的蛋白质。
胚发生因子涉及植物代谢、器官发育、干细胞发育、细胞生长刺激、器官发生、体细胞胚发生的起始、体细胞胚成熟的加速、顶端分生组织的起始和/或发育、芽分生组织的起始和/或发育、或其组合。
胚发生因子的鉴定和/或用于改变编码胚发生因子(其导致细胞重编程的诱导)的基因的调节的方法，特别是在顽拗性细胞类型或顽拗性物种或顽拗性基因型的细胞中，是植物育种方法的有用技术。本方法可用于通过以下方式的植物育种方法(包括植物转化方法、双单倍体植物生产方法或其组合)：使用胚发生因子作为细胞重编程剂，以及使用包括用异源蛋白处理细胞以调节细胞基因组中编码胚发生因子的内源基因座的方法。
本文公开的胚发生因子涉及刺激体外胚发生，其特征在于胚在植物体外发育，例如从与胚发生因子接触的小孢子刺激体外胚发生。
在一方面，本文公开的胚发生因子涉及刺激体内胚发生，其特征在于胚在原位发育，例如从与胚发生因子接触的卵细胞刺激体内胚发生。在一方面，本文公开的胚发生因子涉及刺激来自其他植物组织的细胞中的胚发生，所述其他植物组织包括但不限于原生质体、叶、下胚轴或可用于孢子体胚发生方法的任何其他植物外植体。
在一方面，本公开提供了一种用于产生单倍体植物的方法，所述方法包括在有性生殖植物的卵细胞中表达胚发生因子，导致与亲本相比含有一半数量的染色体的后代的百分比增加。
在一方面，本公开提供了一种用于生产单倍体植物的方法，所述方法包括(a)用含有质粒的细菌菌株感染植物细胞，所述质粒包含含有简并Cas9融合蛋白基因的转移DNA和与编码胚发生因子基因的基因座具有序列同一性的指导RNA，和(b)在细胞中表达简并Cas9融合蛋白以刺激细胞重编程，导致获得胚发生细胞命运，和(c)从经处理的细胞再生植物。在一方面，经处理的细胞是与亲本相比具有相同染色体数目的孢子体细胞。在一方面，经处理的细胞是与亲本相比具有一半染色体数目的配子体细胞。
在一方面，本公开提供了一种使用无性生殖生产植物的方法。无配子生殖是开花植物的一种生殖方式，其特征是胚囊中的二倍体细胞在未受精的情况下发育成胚。孤雌生殖是无配子生殖的一种形式，并且在更广泛的意义上可以包括由单倍体配子体细胞(例如由大孢子发生产生的卵细胞，或由小孢子发生产生的小孢子)从头胚发生形成。
在一方面，本公开提供了一种方法，(a)用含有质粒的细菌菌株感染植物细胞，所述质粒包含含有胚发生因子基因的转移DNA，所述胚发生因子基因可操作地连接到大孢子发生之前或期间有活性的调节元件，(b)在卵细胞中没有有性受精的情况下再生后代以产生无融合生殖克隆。
特别是对于植物细胞和玉蜀黍小孢子，本公开提供了改善朝向胚发生的细胞重编程发育命运的方法，所述方法包括改善由细胞分开和分离技术引起的应激适应过程。在一方面，提供了抑制小孢子内的原生质体发育成淀粉质体的方法、或使淀粉质体去分化为原生质体或促进在玉蜀黍小孢子内的自噬的方法。
本公开提供了产生重组近交系的群体的高效且有效的方法，所述方法包括但不限于在植物细胞中启动胚发生以使得能够产生双单倍体重组群体的方法。本公开还提供了在配子或单倍体细胞发育期间，在非转化细胞中，并且特别是在配子或单倍体细胞中，实现细胞重编程和胚发生生长刺激的方法。本公开提供了通过使细胞、组织或器官与能够重编程细胞、组织或器官(其中在细胞、组织或器官中诱导胚发生)的细胞重编程因子(包括胚发生因子)接触，在植物的细胞、组织或器官中促进小孢子胚发生的方法，所述细胞重编程因子如例如，胚发生诱导化合物。
本公开提供了通过将小孢子与纯化的蛋白质例如胚发生因子基因产物共培养来重编程小孢子的方法。在另一方面，提供了通过在表达胚发生因子基因产物的细胞的存在下共培养小孢子来重编程小孢子的方法。与胚发生诱导细胞重编程剂共培养(接触)的时间段将根据所处理的小孢子的顽固性而变化。例如，在一方面，小孢子胚发生是通过孢粉素涂层内多细胞结构(MCS)的存在和/或小孢子外壁的破裂和/或胚样结构(ELS)的存在所证明。在一方面，将小孢子与胚发生诱导细胞重编程剂共培养，直到观察到某些特征，如MCS和/或ELS。可替代地，其他表型和/或基因型标记也用于确定经处理的小孢子胚发生状态或细胞重编程状态。通常，少于1小时、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、31天、32天、33天、34天、35天、36天、37天、38天、39天、40天、41天、42天、43天、44天、45天、46天、47天、48天、49天、50天、51天、52天、53天、54天、55天、56天、57天、58天、59天或60天或更长的时间段的共同培养足以使培养的小孢子形成MCS和/或ELS。基于本公开提供的指导，基于胚发生诱导剂的类型和浓度来优化诱导胚发生的孵育或培养时间段。本公开还提供了通过以下方式生成小孢子衍生的双单倍体群体的方法：在半合转基因条件下，使用本文所述方法来促进从由两个不同株的遗传杂交生成的子代植物(例如第一代F1杂交体或可替代地在更靠后的子代中或回交后代中)的组织或器官的小孢子胚发生。
本公开提供了出于生成小孢子衍生的双单倍体群体的目的，促进从第一代F1杂交体的组织或器官的小孢子胚发生的方法，所述第一代F1杂交体是通过将F1胚本身转化到直接在半合转基因条件下再生的所述F1杂交体衍生而来。在另外的方面，使产生和/或处理的小孢子和/或小孢子衍生的细胞与染色体加倍剂接触，以促进小孢子衍生的胚状体的二倍体化。
可用于与形态发育基因组合的胚发生因子涉及植物代谢、器官发育、干细胞发育、细胞生长刺激、器官发生、体细胞胚发生的起始、体细胞胚成熟的加速、顶端分生组织的起始和/或发育、芽分生组织的起始和/或发育、或其组合，以改善细胞重编程。当胚发生因子与形态发育基因共表达时，提供了获得植物的改善方法。
本公开提供了用于改善细胞重编程和产生转基因事件的方法，所述方法包括(a)用含有质粒的细菌菌株感染植物细胞，所述质粒包含含有胚发生因子基因和/或形态发生基因的转移DNA和(b)再生转基因事件。胚发生因子基因选自本文公开的胚发生因子基因中的任何一种。形态发生基因选自(i)编码功能性WUS/WOX多肽的核苷酸序列，或(ii)编码Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽的核苷酸序列，或(iii)(i)和(ii)的组合。
本公开提供了通过使细胞、组织或器官与能够重编程细胞、组织或器官(其中在细胞、组织或器官中诱导胚发生)的细胞重编程因子(包括胚发生因子)接触，在植物的细胞、组织或器官中促进小孢子胚发生的方法，所述细胞重编程因子如例如，诱导外源形态发育基因蛋白产物的胚发生因子和/或胚发生诱导化合物。
还提供了在配子或单倍体细胞发育期间，在非转化细胞中，并且特别是在配子或单倍体细胞中，通过以下方式生成小孢子衍生的双单倍体群体的方法：在植物组织或器官中异位表达诱导胚发生的胚发生因子的融合蛋白基因产物和易位信号融合蛋白基因产物和/或胚发生诱导形态发育基因的融合蛋白基因产物和易位信号融合蛋白基因产物，从而实现细胞重编程和胚发生生长刺激。在另一方面，本公开提供了在配子或单倍体细胞发育期间，在非转化细胞中，并且特别是在配子或单倍体细胞中，通过以下方式在植物组织或器官中产生小孢子衍生的双单倍体群体的方法：使用与易位信号肽和荧光蛋白可操作连接的诱导胚发生的胚发生因子基因和/或与易位信号肽和荧光蛋白可操作连接的胚发生诱导形态发育基因并且基于存在或不存在诱导胚发生的胚发生因子基因/易位信号肽/荧光蛋白融合物和/或形态发育基因/易位信号肽/荧光蛋白融合物进行选择，从而实现细胞重编程和胚发生生长刺激。本公开提供了通过将小孢子与纯化的蛋白质例如胚发生因子基因产物和/或形态发育基因胚发生诱导基因产物共培养来重编程小孢子的方法。在另一方面，提供了通过在表达胚发生因子基因产物和/或形态发育基因胚发生诱导基因产物的细胞的存在下共培养小孢子来重编程小孢子的方法。
本公开提供了从母本单倍体胚的细胞衍生的小植株的克隆繁殖的方法，所述母本单倍体胚是通过在植物组织或器官中异位表达具有或不具有易位信号肽的胚发生因子和/或具有或不具有易位信号的形态发育基因产生的。还提供了从母本单倍体胚的细胞衍生的多个基因编辑小植株的克隆繁殖的方法，所述母本单倍体胚是通过以下方式产生的：在植物组织或器官中异位表达具有或不具有易位信号肽的胚发生因子，和/或异位表达具有或不具有易位信号肽的形态发育基因，其与具有或不具有易位信号肽的核酸酶基因的基因产物融合。
本公开还提供了在母本衍生的单倍体胚细胞中，使用转化的单倍体诱导物系促进胚乳细胞中胚发生和基因编辑的方法，所述转化的单倍体诱导物系表达具有或不具有易位信号的胚发生因子的诱导胚发生的基因产物和具有或不具有受精易位信号肽的核酸酶基因和/或具有或不具有易位信号肽的形态发育基因和具有或不具有受精易位信号肽的核酸酶基因。在另外的方面，使处理的母本单倍体胚和/或胚衍生的细胞与染色体加倍剂接触，以促进母本衍生的体细胞胚的二倍体化和再生。
如本文所用，术语“形态发生基因”或“形态发育基因”意指基因，所述基因当异位表达时刺激可产生植物的体细胞衍生结构的形成。更精确地，形态发生基因的异位表达刺激了可以产生植物的体细胞胚或器官发生结构(例如芽分生组织)的从头形成。这种刺激的从头形成发生在表达形态发生基因的细胞中或在邻近的细胞中。形态发生基因可以是调节其他基因表达的转录因子，或影响植物组织中激素水平的基因，两者均可刺激形态发生变化。可以将形态发生基因稳定地掺入植物的基因组中或可以瞬时表达。如本文所用，术语“形态发生因子”意指形态发生基因和/或由形态发生基因表达的蛋白质。
涉及植物代谢、器官发育、干细胞发育、细胞生长刺激、器官发生、再生、体细胞胚发生起始、加速体细胞胚成熟、顶端分生组织的起始和/或发育、芽分生组织的起始和/或发育、芽的起始和/或发育或其组合的形态发生基因(如WUS/WOX基因(WUS1、WUS2、WUS3、WOX2A、WOX4、WOX5或WOX9)，参见美国专利7,348,468和7,256,322及美国专利申请公开2017/0121722和2007/0271628；Laux等人(1996)Development[发育]122：87-96；以及Mayer等人(1998)Cell[细胞]95：805-815；van der Graaff等人，2009，Genome Biology[基因组生物学]10：248；Dolzblasz等人.2016.Mol.Plant[分子植物学]19：1028-39)可用于本公开的方法中。预期WUS/WOX的调节可调节植物和/或植物组织表型，包括植物代谢、器官发育、干细胞发育、细胞生长刺激、器官发生、再生、体细胞胚发生的起始、体细胞胚成熟的加速、顶端分生组织的起始和/或发育、芽分生组织的起始和/或发育、芽的起始和/或发育、或其组合。拟南芥属WUS的表达可以在营养组织中诱导干细胞，其可以分化为体细胞胚(Zuo，等人(2002)Plant J[植物杂志]30：349-359)。在这方面也有意义的是MYB118基因(参见美国专利7,148,402)、MYB115基因(参见Wang等人(2008)Cell Research[细胞研究]224-235)、BABYBOOM基因(BBM；参见Boutilier等人(2002)Plant Cell[植物细胞]14：1737-1749)或CLAVATA基因(例如，参见美国专利7,179,963)。可用于本公开的形态发生基因包括但不限于功能性WUS/WOX基因。
WUS/WOX同源盒多肽的形态发生多核苷酸序列和氨基酸序列可用于所公开的方法。如本文所定义，“功能性WUS/WOX核苷酸”或“功能性WUS/WOX基因”是编码含有同源盒DNA结合结构域、WUS盒和EAR阻遏物结构域的蛋白质的任何多核苷酸(Ikeda等人，2009 PlantCell[植物细胞]21：3493-3505)。如R0driguez等人，2016PNAS www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1607673113所证明的，去除留在同源盒DNA结合结构域，WUS盒和EAR阻遏物结构域后面的二聚化序列产生功能性WUS/WOX多肽。WUSCHEL蛋白(以下称为WUS)在含有多能干细胞池的顶端分生组织的起始和维持中起关键作用(Endrizzi等人，(1996)PlantJournal[植物杂志]10：967-979；Laux等人，(1996)Development[发育]122：87-96；以及Mayer等人，(1998)Cell[细胞]95：805-815)。WUS基因的拟南芥属植物突变体含有被错误指定并且似乎经历分化的干细胞。WUS编码一种可能作为转录调节子的同源结构域蛋白(Mayer等人，(1998)Cell[细胞]95：805-815)。拟南芥属芽分生组织的干细胞群体被认为通过促进器官起始的CLAVATA(CLV)基因与干细胞特性所需的WUS基因之间的调节环来维持，其中CLV基因在转录水平上阻遏WUS，并且WUS表达足以诱导分生组织细胞特性和干细胞标记CLV3的表达(Brand等人，(2000)Science[科学]289：617-619；Schoof等人，(2000)Cell[细胞]100：635-644)。WUS在拟南芥中的组成型表达已显示可导致叶片的不定芽增殖(原位)(Laux，T.，Talk Presented at the XVI International Botanical CongressMeeting[在第十六届国际植物大会上发表的演讲]，1999年8月1-7日，密苏里州圣路易斯(St.Louis，Mo.))。
在一方面，可用于本公开的方法的功能性WUS/WOX同源盒多肽是WUS1、WUS2、WUS3、WOX2A、WOX4、WOX5、WOX5A或WOX9多肽(参见，美国专利7,348,468和7,256,322以及美国专利申请公开号2017/0121722和2007/0271628，将其通过援引以其全文并入本文以及van derGraaff等人，2009，Genome Biology[基因组生物学]10：248)。可用于本公开的方法的功能性WUS/WOX同源盒多肽可获自或衍生自任何植物。下表1中列出了可用于本公开的方法中的编码含有同源盒DNA结合结构域、WUS盒和EAR阻遏物结构域的蛋白质的功能性WUS/WOX核苷酸。
表1.
Figure BDA0003306116500000461
Figure BDA0003306116500000471
Figure BDA0003306116500000481
可用于本公开的其他形态发生基因包括但不限于LEC1(通过援引以其全文并入本文的美国专利6,825,397，Lotan等人，1998，Cell[细胞193：1195-1205)、LEC2(Stone等人，2008，PNAS[美国科学院院报]105：3151-3156；Belide等人，2013，Plant Cell Tiss.OrganCult[植物细胞组织与器官培养]113：543-553)、KN1/STM(Sinha等人，1993.Genes Dev[基因与发育]7：787-795)、农杆菌的IPT基因(Ebinuma和Komamine，2001，In vitro Cell.DevBiol-Plant[体外细胞发育生物学-植物]37：103-113)、MONOPTEROS-δ(Ckurshumova等人，2014，New Phytol.[新植物学家]204：556-566)、农杆菌AV-6b基因(Wabiko和Minemura1996，Plant Physiol.[植物生理学]112：939-951)、农杆菌IAA-h和IAA-m基因的组合(Endo等人，2002，Plant Cell Rep.[植物细胞报道]，20：923-928)、拟南芥属SERK基因(Hecht等人，2001，Plant Physiol.[植物生理学]127：803-816)、拟南芥属AGL15基因(Harding等人，2003，Plant Physiol.[植物生理学]133：653-663)、FUSCA基因(Castle和Meinke，PlantCell[植物细胞]6：25-41)和PICKLE基因(Ogas等人，1999，PNAS[美国科学院院报]96：13839-13844)。
本公开还包括通过本文所披露的任何方法或组合物获得的植物。本公开还包括来自通过本文所公开的任何方法或组合物获得的植物的种子。如本文所用，术语“植物”是指整株植物、植物器官(例如叶、茎、根等)、植物组织、植物细胞、植物部分、种子、繁殖体、胚及其子代。如本文所用，术语“植物”是指整株植物、植物器官(例如叶、茎、根等)、植物组织、植物细胞、植物部分、种子、繁殖体、胚及其子代。植物细胞可以是分化的或未分化的(例如愈伤组织、未分化的愈伤组织、未成熟和成熟的胚、未成熟的合子胚、未成熟的子叶、胚轴、悬浮培养细胞、原生质体、叶、叶细胞、根细胞、韧皮部细胞和花粉)。植物细胞包括但不限于来自以下的细胞：种子、悬浮培养物、外植体、未成熟胚、胚、合子胚、体细胞胚、胚发生愈伤组织、分生组织、体细胞分生组织、器官发生性愈伤组织、原生质体、衍生自成熟的穗衍生种子的胚、叶基、来自成熟植物的叶、叶尖、未成熟花序、雄穗、未成熟穗、长须、子叶、未成熟子叶、分生组织区域、愈伤组织、来自叶的细胞、来自茎的细胞、来自根的细胞、来自芽的细胞、配子体、孢子体、花粉、小孢子、多细胞结构(MCS)和胚样结构(ELS)。植物部分包括分化和未分化的组织，包括但不限于根、茎、芽、叶、花粉、种子、肿瘤组织和各种形式的培养中的细胞(例如单细胞、原生质体、胚和愈伤组织)。植物组织可以是在植物中或在植物器官、组织或细胞培养物中。籽粒意指由商业种植者出于栽培或繁殖物种之外的目的所生产的成熟种子。再生植物的后代、变体和突变体也被包括在本公开的范围内，只要这些后代、变体和突变体是衍生自使用本文公开的方法和组合物制造的再生植物的和/或包含本文公开的引入的多核苷酸。
如本文使用的，术语“经转化的植物”和“转基因植物”是指在其基因组内包含异源多核苷酸的植物。通常，异源多核苷酸稳定整合于转基因或转化的植物基因组内，这样使得多核苷酸得以传递至连续世代。异源多核苷酸可以单独地或作为重组DNA构建体的部分整合进基因组中。应当理解的是，如本文所用，术语“转基因的”包括其基因型已经通过异源核酸的存在而改变的任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，包括最初如此改变的那些转基因以及通过有性杂交或无性繁殖从初始转基因产生的那些。转基因植物定义为含有转基因的成熟可育植物。
通过以下来产生转基因“事件”：用包含核酸表达盒的异源DNA构建体转化植物细胞，所述核酸表达盒包含目的基因；再生由所转移的基因插入所述植物的基因组中所产生的植物群体；并且选择表征为插入特定基因组位置的植物。事件在表型上表征为插入的基因的表达。在遗传水平上，事件是植物遗传组成的一部分。术语“事件”也指转化株和另一个植物之间有性杂交所产生的子代，其中所述子代包含异源DNA。
本公开的组合物和方法可应用于宽范围的植物物种，包括双子叶植物和单子叶植物。可以根据本文公开的方法处理的植物的代表性实例包括但不限于小麦、棉花、向日葵、红花、烟草、拟南芥属、大麦、燕麦、水稻、玉蜀黍、黑小麦、高粱、黑麦、粟、亚麻、甘蔗、香蕉、木薯、菜豆、豇豆、番茄、土豆、甜菜、葡萄、桉属(Eucalyptus)、小麦草(wheat grass)、草皮草、苜蓿、三叶草、大豆、花生、柑橘、番木瓜、狗尾草属物种(Setaria sp)、可可、黄瓜、苹果、辣椒属(Capsicum)、竹、瓜、观赏植物(包括商业花园和鳞茎花卉物种)、果树、蔬菜物种、芸苔属物种以及种间杂交体。在优选的实施例中，将本公开的组合物和方法应用于玉蜀黍植物。
本公开的方法涉及将多肽、多核苷酸(即，DNA或RNA)或核苷酸构建体(即，DNA或RNA)引入植物中。如本文所用，“引入”意在指以使得多核苷酸、多肽或核苷酸构建体得以进入植物细胞内部的方式，将多核苷酸、多肽或核苷酸构建体呈送给植物。本公开的方法不取决于用于将多核苷酸、多肽或核苷酸构建体引入植物中的特定方法，只要所述多核苷酸、多肽或核苷酸构建体得以进入所述植物的至少一个细胞的内部即可。将多核苷酸、多肽或核苷酸构建体引入植物的方法是本领域已知的，所述方法包括但不限于稳定转化法、瞬时转化法和病毒介导法。
如本文所用，“稳定转化”是其中引入到植物中的多核苷酸或核苷酸构建体整合到植物的基因组中并能由其子代继承的转化。“瞬时转化”意指将多核苷酸或核苷酸构建体引入所述植物中并且不整合到所述植物的基因组中，或者将多肽引入植物中。此外，在某些实施例中，“瞬时”可以表示在细胞中存在胚发生诱导剂，其中这种试剂已经被外源性地应用或从邻近细胞分泌或从染色体外位置(例如，质粒或另一种独立复制来源)产生，或者不是由相同细胞内的稳定整合的重组DNA构建体产生。
如本文所用，“接触”、“与......接触”或“与......进行接触”意指“直接接触”或“间接接触”。例如，将细胞置于细胞可以与任何本文公开的胚发生诱导物质接触的条件下，所述胚发生诱导物质包括但不限于诱导胚发生的胚发生因子、形态发育基因、小分子或加倍剂。允许此类物质存在于细胞存活的环境(例如，培养基或在细胞中表达或邻近细胞中表达)中并且可以在细胞上起作用。例如，包含加倍剂的培养基可以与单倍体细胞直接接触，或者包含加倍剂的培养基可以通过滤纸、植物组织或其他细胞与单倍体细胞分开，因此加倍剂穿过滤纸或细胞被转移到单倍体细胞中。
如本文所用，术语“双亲本杂交”是两种遗传上不同的植物的杂交受精以获得后代的第一杂交世代和/或之后的任何连续杂交世代。如本文所用，双亲本杂交包括作为后代的任何杂交世代的子代的后代，包括将后代与其亲本系之一或遗传上类似于其亲本的个体杂交受精，以获得称为“回交”的具有与亲本更接近的遗传同一性的，和/或其后的任何连续回交世代。
本文提供的方法依赖于使用细菌介导的和/或生物射弹介导的基因转移以产生可再生的植物细胞。可用于本公开的方法中的细菌株包括但不限于卸甲农杆菌(Agrobacteria)、苍白杆菌属(Ochrobactrum)细菌或根瘤菌科(Rhizobiaceae)细菌(通过援引以其全文并入本文的美国专利号9,365,859)。粒子轰击(Finer和McMullen，1991，InVitro Cell Dev.Biol.-Plant[体内细胞发育生物学-植物]27：175-182)、农杆菌介导的转化(Jia等人，2015，Int J.Mol.Sci.[国际分子科学杂志]16：18552-18543；US 2017/0121722，通过援引以其全文并入本文)或苍白杆菌属介导的转化(US 2018/0216123，通过援引以其全文并入本文)的标准方案可用于本公开的方法和组合物。用于将异源基因引入植物的多种方法是已知的，并且可用于将多核苷酸插入植物宿主中，所述方法包括生物和物理植物转化方案。参见例如，Miki等人，“Procedures for Introducing Foreign DNAinto Plants[用于将外源DNA引入植物的程序]，”Methods in Plant Molecular Biologyand Biotechnology[植物分子生物学和生物技术的方法]，Glick和Thompson，编辑(CRCPress，Inc.[CRC出版公司]，Boca Raton[波卡拉顿]，第67-88页(1993)。所选择的方法随宿主植物变化并且包括化学转染方法(如磷酸钙)、微生物介导的基因转移(如农杆菌(Horsch，等人，(1985)Science[科学]227：1229-31)、苍白杆菌属(US2018/0216123))、电穿孔、显微注射和生物射弹轰击。用于植物细胞或组织转化和转基因植物再生的表达盒和载体以及体外培养方法是已知的并且可用的。参见例如，Gruber，等人，“Vectors for PlantTransformation[用于植物转化的载体]，”Methods in Plant Molecular Biology andBiotechnology[植物分子生物学和生物技术的方法]，同上，第89-119页。
转化方案以及将核苷酸序列引入植物中的方案，可根据要靶向转化的植物或者植物细胞的类型(即单子叶植物或者双子叶植物)而变化。将核苷酸序列引入到植物细胞中并随后插入到植物基因组中的合适方法包括显微注射(Crossway，等人，(1986)Biotechniques[生物技术]4：320-334)、电穿孔(Riggs，等人，(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]83：5602-5606)、农杆菌介导的转化(Townsend，等人，美国专利号5,563,055和Zhao，等人，美国专利号5,981,840)、苍白杆菌属介导的转化(US 2018/0216123)、直接基因转移(Paszkowski，等人，(1984)EMBOJ[欧洲分子生物学学会杂志]3：2717-2722)以及弹道粒子加速(参见例如，美国专利号4,945,050；5,879,918；5,886,244；5,932,782；Tomes等人，(1995)，在Plant Cell，Tissue，and OrganCulture：Fundamental Methods[植物细胞、组织和器官培养：基本方法]，Gamborg和Phillips编辑(Springer-Verlag，Berlin[德国柏林施普林格出版公司])；McCabe等人(1988)Biotechnology[生物技术]6：923-926)；以及Lec1转化法(WO 00/28058)。还参见Weissinger等人，(1988)Ann.Rev.Genet.[遗传学年鉴]22：421-477；Sanford等人，(1987)Particulate Science and Technology[微粒科学与技术]5：27-37(洋葱)；Christou等人，(1988)Plant Physiol.[植物生理学]87：671-674(大豆)；McCabe等人，(1988)Bio/Technology[生物/技术]6：923-926(大豆)；Finer和McMullen，(1991)In Vitro CellDev.Biol.[体外细胞与发育生物学]27P：175-182(大豆)；Singh等人，(1998)Theor.Appl.Genet.[理论与应用遗传学]96：319-324(大豆)；Datta等人，(1990)Biotechnology[生物技术]8：736-740(水稻)；Klein等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]85：4305-4309(玉蜀黍)；Klein等人，(1988)Biotechnology[生物技术]6：559-563(玉蜀黍)；美国专利号5,240,855、5,322,783、和5,324,646；Klein等人，(1988)Plant Physiol.[植物生理学]91：440-444(玉蜀黍)；Fromm等人，(1990)Biotechnology[生物技术]8：833-839(玉蜀黍)；Hooykaas-Van Slogteren等人，(1984)Nature[自然](伦敦)311：763-764；美国专利号5,736,369(谷类)；Bytebier等人，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]84：5345-5349(百合科)；De Wet等人，(1985)在The Experimental Manipulation of Ovule Tissues[卵巢组织的实验操作]中，Chapman等人编辑(纽约朗文出版社(Longman，New York))，第197-209页(花粉)；Kaeppler等人，(1990)Plant Cell Reports[植物细胞报告]9：415-418和Kaeppler等人，(1992)Theor.Appl.Genet.[理论与应用遗传学]84：560-566(晶须介导的转化)；D′Halluin等人，(1992)Plant Cell[植物细胞]4：1495-1505(电穿孔)；Li等人，(1993)Plant Cell Reports[植物细胞报告]12：250-255以及Christou和Ford(1995)Annals of Botany[植物学年鉴]75：407-413(水稻)；Ishida等人，(1996)Nature Biotechnology[自然生物技术]14：745-750(经由根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的玉蜀黍)，将其全部通过援引以其全文并入本文。在U.S.2017/0121722中也发现了用于快速植物转化的方法和组合物，通过援引以其全文并入本文。在美国专利申请序列号15/765,521中发现了可用于植物转化的载体，通过援引以其全文并入本文。
收获雄穗的方法(包括灭菌方法)以及雄穗预处理(例如温度预处理)在本领域中是已知的，并且将根据预期的雄穗用途而变化。具体地，在选择雄穗用于小孢子培养之前，必须使小孢子进入到适当的阶段，通常在单核阶段到双核阶段之间。典型地，对于在适当阶段具有花药和小孢子的雄穗，将这些雄穗解离，并且将每个雄穗单独地包裹在例如铝箔中。
在降低的温度环境中，小孢子的分离典型地发生在雄穗预处理之后以改善产雄性特征的响应。一种常用的技术是将箔包裹的雄穗放置在10℃下持续1到21天。另外，可以在甘露醇溶液(例如0.3M液体甘露醇加50mg/L抗坏血酸)中进行花药的预培养(美国专利5,322,789和美国专利5,445,961，通过援引以其全文并入本文)。
使用前，可以在40％高乐氏(Clorox)(稀释的8.25％次氯酸钠v/v)溶液(具有两滴吐温80)中对雄穗进行表面消毒约十五分钟，同时在往复振动器上轻轻搅动。然后在室温下将雄穗在无菌水中冲洗三次或更多次，并且置于大培养皿中且通常在无菌条件下保持无盖1-1.5小时，以在小孢子分离之前蒸发多余的水分。表面灭菌的另一种方法包括将从雄穗解离的小穗置于可渗透的篮子中，然后将其浸入40％高乐氏(稀释的8.25％次氯酸钠v/v)溶液(具有两滴吐温80)中十五分钟，然后如上所述进行冲洗。将小穗置于大培养皿中，通常保持无盖1-1.5小时，以在小孢子分离之前蒸发多余的水分。
玉蜀黍花药和小穗的分离程序包括但不限于玻璃棒浸渍法(Pescitelli，等人，(1990)Plant Cell Rep.[植物细胞报告]8：628-31)、共混方法、刀片组织切割方法(参见美国专利5,445,961，通过援引以其全文并入本文)、组织匀浆器方法(Gaillard，等人，(1991)Plant Cell Rep.[植物细胞报告]10：55-8)和组织研磨器方法(Mandaron等人，(1990)Theor Appl Genet[理论与应用遗传学]80：134-138)。
从周围的体细胞组织中分离小孢子后，通常在将小孢子与任何花药碎片分离后立即将所述小孢子置于新鲜分离培养基中。许多培养基组合物是本领域已知的。将小孢子从花药碎片中分离的常用的方法是使来自分离程序的共混的小孢子花药碎片浆料通过筛子(Pescitelli(1989)Plant Cell Rep.[植物细胞报告]7：673-6，Gaillard，等人，(1991)和美国专利5,445,961，通过援引以其全文并入本文)。可替代地，使小孢子花药碎片浆料通过几层粗棉布或筛网过滤器(Coumans，(1989)Plant Cell Rep.[植物细胞报告]7：618-21)。可以使用不连续密度离心方法或另外的过滤方法进行进一步的分离，所述方法包括但不限于使用蔗糖或Percoll梯度的方法(Coumans，(1989)、Pescitelli等人，(1990))。可替代地，可以使用最终的高蔗糖(0.44M)离心方法进一步分离在225g离心3分钟后在20％-50％范围内的Percoll梯度的20％-30％界面处捕获的细胞的选择(Gaillard，等人，(1991))。分离方法的进一步变化是本领域已知的(Vergne等人，(1991)In：Negrutiu I.(编辑)BioMethods.Birkhauser，Basel，Boston，Bedinger和Edgerton，(1990)Plant Physiol.[植物生理学]92：474-9，Gaillard，等人，(1991))，并且可以根据需要进行优化。
分离期间使用的具体的培养基，例如通常由6％蔗糖、50mg/L抗坏血酸、400mg/L脯氨酸、0.05mg/L生物素和10mg/L烟酸组成(参见Petolino和Genovesi(1994)The MaizeHandbook[玉蜀黍手册]，Freeling，M.，Walbot，V.(编辑)Springer-Verlag[施普林格出版社]，纽约)。用于培养玉蜀黍小孢子的各种其他培养基和溶液与用于其他谷物组织培养程序的那些相似，并且可以使用各种修饰(参见Genovesi和Magill，(1982)Plant Cell Rep.[植物细胞报告]1：257-60，Martin和Widholm，(1996)Plant Cell Rep.[植物细胞报告]15：781-85，Magnard等人，(2000)Plant Mol Biol[植物分子生物学]44：559-74，Testillano等人，(2002)Int J Dev Biol[国际发育生物学杂志]46：1035-47，Testillano等人，(2004)Chromosoma[染色体学]112：342-9，Shariatpanahi等人，(2006)Plant Cell Rep[植物细胞报告]25：1294-9，Shim等人，(2006)Protoplasma[原生质体学]228：79-86，Soriano等人，(2008)Plant Cell Rep[植物细胞报告]27：805-11，Cistue等人，(2009)Plant Cell Rep[植物细胞报告]28：727-35，Jacquard等人，(2009)Planta[植物]229：393-402，Jacquard等人，(2009)Plant Cell Rep[植物细胞报告]28：1329-39，Shim等人，(2009)Genome[基因组]52：166-74，Sanchez-Diaz等人，(2013)Plant Reprod[植物繁殖]26：287-96)。玉蜀黍培养基的共同特征通常包括使用具有相对较高糖浓度(6％-12％)的N6、NLN或YP基础盐配制品，所述配制品可具有包括三碘苯甲酸(triiodobenzoic acid)、各种植物激素和/或脯氨酸的组分。
本公开的组合物和方法包括通过使植物细胞与胚发生因子基因产物和/或形态发育基因胚发生诱导基因产物接触而从配子中产生双单倍体植物，所述胚发生因子基因产物和/或形态发育基因胚发生诱导基因产物可以在细胞中诱导细胞重编程并且活化胚发生。通过将分离的小孢子与胚发生因子基因产物和/或形态发育基因胚发生诱导基因产物接触，提供了用于产雄性特征的诱导的非原位细胞重编程方法。
任选地，本公开的非原位方法使用分离的小孢子与表达胚发生因子基因产物和/或形态发生基因产物的悬浮“饲养细胞”共培养，以进一步促进用以活化小孢子胚发生的细胞重编程。
任选地，本公开的非原位细胞重编程方法可以与从使用本文公开的原位细胞重编程方法产生的植物组织分离的小孢子组合并且与之一起使用。
本公开提供了一种用于通过转化玉蜀黍单倍体诱导物系以稳定整合并且表达异源表达盒来使母本单倍体胚再生的原位细胞重编程方法，所述异源表达盒编码刺激体细胞胚发生的形态发育多肽以及还编码包括用于基因编辑目的的基因的第二组分。两种组分都可以包含使用可操作地连接到在胚乳内表达的启动子的分泌信号肽的融合肽。报道基因或可选择标记基因也可以包括在本公开的表达盒中。本领域已知的合适报道基因的实例可以见于例如以下文献：Jefferson等人，(1991)Plant Molecular Biology Manual[植物分子生物学手册]，Gelvin等人编辑(Kluwer Academic Publishers[克吕韦尔学术出版集团])，第1-33页；DeWet等人，(1987)Mol.Cell.Biol.[分子细胞生物学]7：725-737；Goff等人，(1990)EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]9：2517-2522；Kain等人，(1995)BioTechniniques[生物技术]19：650-655；和Chiu等人，(1996)Current Biology[当代生物学]6：325-330，将其通过援引以其全文并入本文。
用于选择转化细胞或者组织的可选择标记基因可以包括赋予抗生素抗性或除草剂抗性的基因。合适的可选择标记基因的实例包括但不限于编码对以下具有抗性的基因：氯霉素(Herrera Estrella等人，(1983)EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]2：987-992)；甲氨蝶呤(Herrera Estrella等人，(1983)Nature[自然]303：209-213；Meijer等人，(1991)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]16：807-820)；潮霉素(Waldron等人，(1985)PlantMol.Biol.[植物分子生物学]5：103-108和Zhijian等人，(1995)Plant Science[植物科学]108：219-227)；链霉素(Jones等人，(1987)Mol.Gen.Genet.[分子遗传学和普通遗传学]210：86-91)；壮观霉素(Bretagne-Sagnard等人，(1996)Transgenic Res.[转基因研究]5：131-137)；博莱霉素(Hille等人，(1990)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]7：171-176)；磺酰胺(Guerineau等人(1990)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]15：127-36)；溴苯腈(Stalker等人，(1988)Science[科学]242：419-423)；草甘膦(Shaw等人，(1986)Science[科学]233：478-481和美国专利申请序列号10/004,357和10/427,692)；草丁膦(DeBlock等人，(1987)EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]6：2513-2518)，将其通过援引以其全文并入本文。
其他基因可被用于本公开的表达盒(也有助于转基因事件的恢复)且包括但不限于GUS(β-葡糖醛酸糖苷酶；Jefferson，(1987)Plant Mol.Biol.Rep.[植物分子生物学报告]5：387)、GFP(绿色荧光蛋白；Chalfie等人，(1994)Science[科学]263：802)、荧光素酶(Riggs等人，(1987)Nucleic AcidsRes.[核酸研究]15(19)：8115和Luehrsen等人，(1992)Methods Enzymol.[酶学方法]216：397-414)以及编码用于花青素生产的玉蜀黍基因(Ludwig等人，(1990)Science[科学]247：449)，将其通过援引以其全文并入本文。
本公开的方法还提供了以下的表达：第一组分，其包含在一个表达盒中可操作地连接到启动子的多个胚发生因子基因和/或形态发生基因，和第二组分，其包括可用于基因编辑目的的基因，包括但不限于：酿脓链球菌(CRISPR)CAS9或其他核酸酶蛋白(包括但不限于锌指核酸酶、大范围核酸酶或转录激活物样效应物核酸酶)。在转化的玉蜀黍单倍体诱导物系中使用第一组分以使靶植物的母本雌穗受精，这对改善双单倍体生产是有用的，而第二组分能够改善基因编辑的玉蜀黍双单倍体的再生。
本公开还提供了在分离和胚发生诱导方法(用于生成父本配子(产雄性特征的)或母本配子(产生雌性特征的)双单倍体群体)的任何部分之前、期间、之后或与之重叠，使单倍体细胞与一定量的染色体加倍剂接触的方法。
对于在生物的组织外部的植物细胞(例如已经分离用于实验和/或在外部环境中完成测量的所提取的细胞)，使用细胞重编程剂(胚发生诱导多肽或胚发生诱导化合物)或细胞重编程处理称为“非原位”处理或处理方法。
如本文所使用的“重组体”意指细胞或载体，其已经通过引入异源核酸或衍生自已经如此修饰的细胞而被修饰。因此，例如，重组细胞是表达未在天然(非重组)细胞中以相同形式或位置发现的基因的细胞、或以不同于天然(非重组)细胞的表达模式表达天然基因的细胞，例如，由于故意的人为干预，天然基因异常表达、表达不足、表达降低或根本不表达。如本文所用的术语“重组”不涵盖由于自然发生的事件(例如，自发突变、自然转化/转导/转位)(如在没有故意的人为干预的情况下发生的事件)而引起的细胞或载体的改变。
如本文所使用的，“重组表达盒”是以重组或合成方式产生的具有允许特定核酸在靶细胞中转录的一系列特定核酸元件的核酸构建体。重组表达盒可以整合在质粒、染色体、线粒体DNA、质体DNA、病毒或核酸片段中。典型地，表达载体的重组表达盒部分包括，除了其他序列之外，待转录的核酸和启动子。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物。所述术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。
如本文所用，可用于本公开的方法中的多肽可以用细胞穿透肽(本文称为“CPP”)进一步工程化。可用于本发明的方法中的CPP是一类短肽，其具有跨细胞膜易位并充当用于将蛋白质递送到植物细胞中的纳米载体的性质。示例性CPP家族包括但不限于衍生自蛋白质转导结构域、两亲性肽和合成阳离子多肽(例如聚赖氨酸、聚组氨酸和聚精氨酸)或树状聚阳离子分子的CPP。可用于本公开的方法中的示例性CPP包括但不限于肽血管内皮钙粘蛋白CPP、转运素CPP、HIV-1 TAT基本结构域CPP的单体和二聚体、穿透素CPP、合成的阳离子高精氨酸寡肽CPP(参见Eudes和Chugh.(2008)Plant SignalBehav.[植物信号行为]3：549-550)和γ玉米醇溶蛋白CPP(参见US8581036，通过援引以其全文并入本文)。本公开提供了使用γ-玉米醇溶蛋白CPP形态发育蛋白翻译融合蛋白以用于使γ-玉米醇溶蛋白连接的结构与植物细胞接触并且允许将γ-玉米醇溶蛋白连接的结构摄取到植物细胞中以改变植物细胞的细胞命运的方法。
术语“调节元件”是指具有基因调节活性的核酸分子，也就是能够影响可操作地连接的可转录多核苷酸的转录和/或翻译表达模式的核酸分子。因此，术语“基因调节活性”是指通过影响可操作地连接的可转录多核苷酸分子的转录和/或翻译，从而影响这种可操作地连接的可转录多核苷酸分子表达的能力。基因调节活性可为正向和/或负向，并且所述影响可通过其下列特性来表征：时间、空间、发育、组织、环境、生理、病理、细胞周期和/或化学响应，还可通过定量指示或定性指示来表征。
顺式调节元件是影响基因表达的调节元件。顺式调节元件是调节相邻基因转录的非编码DNA区域，通常为它们调节的基因附近的DNA序列。顺式调节元件通常通过编码赋予转录因子结合的DNA序列来调节基因转录。
如本文所用，“启动子”是示例性调节元件，并且通常是指能够控制编码序列或功能性RNA的表达的核苷酸序列。一般来讲，编码序列位于启动子序列的3′端。启动子序列包含近端元件和较远端上游元件，后一元件通常称为增强子。因此，“增强子”是可以刺激启动子活性的核苷酸序列，并且可以是启动子的固有元件或插入的异源元件，用来增强启动子的水平或组织特异性。启动子可以全部衍生自天然基因，或者可以由衍生自在自然界发现的不同启动子的不同元件构成，或者甚至包含合成的核苷酸区段。本领域技术人员应当理解，不同的调节元件可能引导基因在不同组织或细胞类型中、或在不同发育阶段、或者响应于不同环境条件的表达。
植物启动子是能够在植物细胞中起始转录的启动子。示例性的植物启动子包括但不限于，从植物、植物病毒和包含在植物细胞内表达的基因的细菌(如农杆菌属(Agrobacterium)或根瘤菌属(Rhizobium))中获得的启动子。实例是优先在某些组织(如叶、根、种子、纤维、木质部导管、管胞或厚壁组织)中启动转录的启动子。这样的启动子称为“组织偏好性”启动子。“细胞类型”特异性启动子主要驱动在一个或多个器官中的某些细胞类型(例如，根或叶中的维管细胞)中的表达。“诱导型”或“调节型”启动子是指在环境控制下的启动子。可通过诱导型启动子影响转录的环境条件的实例包括厌氧条件或光照的存在。另一类型的启动子是发育调节启动子，例如在花粉发育期间驱动表达的启动子。组织偏好性启动子、细胞类型特异性启动子、发育调节启动子和诱导型启动子是“非组成性”启动子类别的成员。“组成型”启动子是导致核酸片段在大多数环境条件和发育或细胞分化状态下在大多数时间在大多数细胞类型中表达的启动子。
“翻译前导序列”是指位于基因的启动子序列和编码序列之间的核苷酸序列。翻译前导序列存在于翻译起始序列的经完全处理的mRNA上游。翻译前导序列可以影响多种参数，包括初级转录物到mRNA的加工、mRNA稳定性和/或翻译效率。已经描述了翻译前导序列的实例(Turner和Foster，(1995)Mol.Biotechnol[分子生物技术]3：225-236)。
可用于本公开的方法中的启动子包括调节父本和/或母本胚发生的那些。对于父本胚发生，示例性启动子包括雄穗偏好性启动子、花药偏好性启动子和绒毡层偏好性启动子。组织特异性、组织偏好性或阶段特异性调节元件进一步包括花药特异性LAT52(Twell，等人，(1989)Mol.Gen.Genet.[当代遗传学]217：240-245)、小孢子特异性启动子(如apg基因启动子)(Twell，等人，(1993)Sex.Plant Reprod.[有性植物繁殖]6：217-224)、绒毡层特异性启动子(如TA29基因启动子(Mariani，等人.，(1990)Nature[自然]347：737；美国专利号6,372,967)、雄蕊特异性启动子(如MS26基因启动子、MS44基因启动子、MS45基因启动子、5126基因启动子、BS7基因启动子、PG47基因启动子(美国专利号5,412,085；美国专利号5,545,546；Zheng等人.，(1993)Plant J[植物杂志]3(2)：261-271)、SGB6基因启动子(美国专利号5,470,359)、G9基因启动子(美国专利号5,8937,850；美国专利号5,589,610)、SB200基因启动子(WO 2002/26789)等。在雄性生殖器官的细胞中有活性的组织偏好性启动子可特别用在本公开的方法中。
对于母本胚发生，示例性启动子包括种子偏好性启动子。“种子偏好性”启动子包括“种子特异性”启动子(在种子发育期间有活性的启动子如种子贮藏蛋白的启动子)以及“种子萌发”启动子(在种子萌发期间有活性的启动子)(参见Thompson等人(1989)BioEssays[生物测定]10：108，其通过援引并入本文)。种子偏好性启动子包括但不限于Cim1(细胞分裂素诱导的信号)启动子；cZ19B1(玉蜀黍19kDa玉米醇溶蛋白)启动子；和milps(肌醇-1-磷酸盐合酶)启动子(参见WO 00/11177和美国专利号6,225,529，通过援引以其全文并入本文)。可用于本公开的方法中的其他启动子包括但不限于胚乳特异性启动子，如γ-玉米醇溶蛋白启动子(Boronat等人(1986)Plant Science[植物科学]47：95-102)和胚特异性启动子，如球蛋白-1(Glob-1)启动子。对于单子叶植物，种子特异性启动子包括但不限于玉蜀黍15kDa启动子、22kDa玉米醇溶蛋白启动子、27kDa玉米醇溶蛋白启动子、γ-玉米醇溶蛋白启动子、糯质基因启动子(waxy promoter)、超甜基因1启动子(shrunken 1promoter)、超甜基因2启动子、球蛋白1启动子等。来自end1和end2基因的种子偏好性启动子(参见WO 00/12733)可用于本公开的方法中。可用于本公开的方法中的另外的种子偏好性启动子包括油质蛋白启动子(WO 00/0028058)、脂质转移蛋白(LTP)启动子(美国专利号5,525,716)、Lec1启动子、Jip1启动子和milps3启动子(参见WO 02/42424)。
如本文所用，“信号肽”或“分泌信号肽”序列是指与蛋白质转运系统相互作用并且易位或靶向蛋白质以递送至特定目的地的蛋白质区域。可用于本公开的方法中的信号肽或分泌信号肽的实例包括但不限于将蛋白质靶向植物细胞的细胞外基质的信号肽，如白花丹叶烟草(Nicotiana plumbaginifolia)延伸基因信号肽(DeLoose，等人，(1991)Gene[基因]99：95-100)；导致蛋白质分泌的信号肽，如PRIb信号肽(Lind，等人，(1992)PlantMol.Biol.[植物分子生物学]18：47-53)或大麦α淀粉酶(BAA)信号肽(Rahmatullah，等人，(1989)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]12：119)。
可用于本公开的方法中的分泌信号肽包括含有在双功能抑制剂/植物脂质转移蛋白/种子存储螺旋结构域蛋白(特征性地编码对二级结构重要的八个保守半胱氨酸残基)的超家族中发现的结构域的那些(包括但不限于脂质转移蛋白，如LILY-LIM2(Q43534)、高粱(XP_002445754)、大麦(BAK05897)、水稻-OSC4(BAD09233)、水稻-MEN-8(XP_006660357)和玉蜀黍-MZm3-3(NP_001105123)，它们可用于将雄性表达的植物特异性蛋白工程化)。将蛋白质从胚乳靶向到胚的分泌信号肽可用于使可用于本公开的方法中的雌性表达的翻译融合蛋白工程化。
如本文所用，“异源”是指源于外来物种，或者，如果源于同一物种的话，则是通过蓄意人为干预对其天然形式在组成和/或基因组基因座方面进行实质性修饰得到的核酸。例如，可操作地连接到异源结构基因的启动子，所述异源结构基因来自与衍生结构基因的物种不同的物种，或者，如果来自相同的物种，则其中一者或二者从其原始形式和/或基因组位置进行了实质性的修饰。
可以在用于在目的植物中表达的表达盒中提供可用于本公开的方法中的诱导胚发生的胚发生因子和/或形态发育基因。所述表达盒可以包括可操作地连接到本文公开的诱导胚发生的胚发生因子基因序列和/或形态发育基因序列的5′和3′调节序列。“可操作地连接”旨在表示两个或更多个元件之间的功能性连接。例如，目的多核苷酸和调节序列(即启动子)之间的可操作连接是允许目的多核苷酸表达的功能性连接。可操作地连接的元件可以是连续的或非连续的。当用来指两个蛋白质编码区域的连接(融合蛋白)时，可操作地连接意指所述编码区域处于相同的阅读框中。所述盒可以另外包含至少一个待共转化到生物体中的另外的基因。可替代地，一个或多个诱导胚发生的胚发生因子基因和/或一个或多个形态发育基因可以在多个表达盒上提供。这样的表达盒具有用于插入诱导胚发生的胚发生因子基因序列和/或形态发育基因序列的多个限制性位点，所述诱导胚发生的胚发生因子基因序列和/或形态发育基因序列将位于调节区(一个或多个启动子)的转录调节之下。表达盒可另外含有可选择标记基因。
如本文所用，嵌合信号肽-胚发生因子基因融合物和/或嵌合信号肽-形态发育基因融合物可以用在多肽C末端上的易位或核定位信号序列进一步工程化以促进改善的细胞重编程效率和胚发生诱导。本公开的方法提供了编码WUSCHEL蛋白的基因构建体，所述WUSCHEL蛋白与赋予分泌蛋白原位易位的衍生自细菌毒力蛋白的多肽融合。根癌农杆菌和毛根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)是植物病原体的实例，所述植物病原体可以以依赖于细菌毒力(Vir)蛋白质易位的方式将位于转移的DNA(T-DNA)上的由质粒编码的细菌基因转移到植物细胞中。CRE重组酶与VIR蛋白多肽(具体是VirE2或VirF肽序列)之间的融合物的易位，直接证明了由Vir肽赋予的将蛋白质易位到植物细胞中的作用(Vergunst等人，(2000)Science[科学]290：979-82)。此外，示出毛根农杆菌GALLS蛋白的C末端27个氨基酸在蛋白质转运和核定位中起作用(Hodges等人，(2006)J.Bacteriol.[细菌学杂志]188：8222-30)。使用编码易位或核定位信号的肽是本领域已知的(参见US 6800791，通过援引以其全文并入本文)。
可用于本公开的方法中的表达盒可以含有编码如下的多核苷酸：具有易位或核定位信号序列的Ms44信号肽-WUSCHEL融合物、或者类似的具有易位融合肽的Ms44信号肽-ODP2融合物，所述易位融合肽可以用细胞穿透肽(在本文中称为“CPP”)进一步工程化。可用于本发明的方法中的CPP是一类短肽，其具有跨细胞膜易位并充当用于将蛋白质递送到植物细胞中的纳米载体的性质。示例性CPP家族包括但不限于衍生自蛋白质转导结构域、两亲性肽和合成阳离子多肽(例如聚赖氨酸、聚组氨酸和聚精氨酸)或树状聚阳离子分子的CPP。可用于本公开的方法中的示例性CPP包括但不限于肽血管内皮钙粘蛋白CPP、转运素CPP、HIV-1 TAT基本结构域Cpp的单体和二聚体、穿透素CPP、合成的阳离子高精氨酸寡肽CPP(参见Eudes和Chugh.(2008)Plant Signal Behav.[植物信号行为]3：549-550)和γ玉米醇溶蛋白CPP(参见US 8581036，通过援引以其全文并入本文)。本公开提供了使用γ-玉米醇溶蛋白CPP形态发育蛋白翻译融合蛋白以用于使γ-玉米醇溶蛋白连接的结构与植物细胞接触并且允许将γ-玉米醇溶蛋白连接的结构摄取到植物细胞中以改变植物细胞的细胞命运的方法。还提供了用在本公开的方法中的工程化胚发生诱导形态发育蛋白，所述工程化胚发生诱导形态发育蛋白包含与ODP2蛋白融合的CPP，以用于与嵌合信号肽-WUSCHEL融合蛋白组合使用。使这些基因构建体工程化以向小孢子递送胚发生诱导形态发育蛋白并使小孢子和胚发生诱导形态发育蛋白接触，所述胚发生诱导形态发育蛋白包含与ODP2蛋白融合的CPP，以用于与可操作地连接到花药特异性启动子或更具体地绒毡层特异性启动子的嵌合信号肽-WUSCHEL融合蛋白组合使用。
如本文所用，也可以工程化此类基因构建体以向胚递送胚发生诱导形态发育蛋白并且使胚与胚发生诱导形态发育蛋白接触，所述胚更具体地为玉蜀黍单倍体胚。还提供了用在本公开的方法中的表达盒，所述表达盒包含与ODP2蛋白融合的CPP，以用于与嵌合信号肽-WUSCHEL融合蛋白可操作地组合使用，由此这些蛋白质是使用基因构建体被工程化，所述基因构建体被设计为具有可操作地连接到胚乳特异性启动子的嵌合胚乳或转移细胞层信号肽-WUSCHEL融合蛋白，以及编码胚乳或转移细胞层信号肽-ODP2-CPP融合肽的多核苷酸，以使表达的蛋白质从胚乳易位到胚。
本公开提供了如下方法，所述方法中染色体可以在小孢子阶段、胚阶段、成熟种子阶段、或在植物授粉和单倍体种子萌发前之间的任何时间加倍。可替代地，还可以发生自发加倍。
本公开的非原位方法通过使分离的小孢子与胚发生诱导形态发育蛋白接触来促进小孢子胚发生和细胞重编程。分离的小孢子可以与外源胚发生诱导形态发育蛋白特异性接触，以改善玉蜀黍小孢子胚发生。例如，如本文所公开的，非原位胚发生诱导形态发育蛋白处理细胞重编程方法使用异源表达系统以产生纯化的重组WUSCHEL蛋白。本公开的方法包括将所述蛋白质递送到植物细胞，例如使用转染试剂以进一步促进将外源WUSCHEL蛋白递送到分离的小孢子细胞。在一些方面，具有或不具有转染试剂的蛋白质递送方法可以包括在进一步促进将外源胚发生诱导形态发育蛋白递送到小孢子细胞中的试剂(如二甲基亚砜(DMSO)、佐剂、表面活性剂等)的存在下进行的电穿孔方法和/或声处理方法。
还提供了非原位方法，其包括使分离的小孢子与诸如小分子或化合物等试剂接触或用所述试剂处理，所述试剂实现细胞命运重编程并且刺激胚发生的细胞增殖。本公开提供了包括在补充有小分子或化合物的诱导培养基中共培养分离的小孢子的方法。在一些方面，在本公开的方法中使用蛋白质激酶的小分子抑制剂以对植物细胞进行细胞重编程。
本公开的方法还提供了将蛋白质递送细胞重编程方法与或不与转染试剂、与和不与电穿孔方法和/或声处理方法组合，其可以在上述试剂(如二甲基亚砜(DMSO)、佐剂、表面活性剂等)以及使用上述小分子或化合物进行细胞重编程处理的存在下进行，以改善植物细胞的细胞重编程。
本公开的方法还提供了非原位和/或原位方法可以随后包括与具有胚发生和细胞重编程特性的玉蜀黍悬浮“饲养细胞”接触的所分离的小孢子的共培养。特别地，所述方法包括在转基因玉蜀黍悬浮细胞培养物的存在下共培养所分离的小孢子，所述转基因玉蜀黍悬浮细胞培养物用表达胚发生诱导形态发育基因蛋白(如WUSCHEL蛋白和/或ODP2)的基因构建体转化。
在一方面，将饲养细胞工程化以表达编码参与生长刺激、胚发生、细胞重编程和/或细胞周期刺激的多肽的多核苷酸，以增加单倍体胚的频率、以增加小孢子衍生的胚的起始频率和/或以刺激和增加染色体加倍效率。可用于本公开的方法中的多核苷酸包括但不限于胚发生诱导形态发育基因和细胞周期基因，包括周期蛋白A、周期蛋白B、周期蛋白C、周期蛋白D、周期蛋白E、周期蛋白F、周期蛋白G和周期蛋白H；Pin1；E2F；Cdc25；RepA基因和类似的编码复制相关蛋白的植物病毒多核苷酸。参见美国专利公开号2002/0188965，通过援引以其全文并入本文。
在一方面，本公开提供了方法，所述方法包括在非转基因玉蜀黍悬浮细胞培养物(饲养细胞)的存在下(更具体地使用从具有响应性产雄性特征表型的基因型衍生的饲养细胞)共培养所分离的小孢子，所述饲养细胞如例如为ATCC40520或ATCC40519(参见US5306864 A，通过援引以其全文并入本文)、或非转基因的响应性近交系(如HF1(Martin和Widholm，(1996)))。
本公开的原位方法通过在组织或器官中或在邻近组织或器官中异位表达形态发育蛋白来促进从植物组织或器官的胚发生。提供时空表达和定位于植物的特定组织或器官的基因元件可用于本公开的方法中。
在一方面，在本公开的方法中采用的启动子是天然玉蜀黍Ms44启动子(SEQ IDNO：318)，所述天然玉蜀黍Ms44启动子导致利用了Ms44(花药特异性基因)的时空表达和定位特征特性，所述Ms44首次在通过单核小孢子发育中持续存在的减数分裂期间在绒毡层细胞中被检测到。
可用于本公开的方法中的信号肽是天然玉蜀黍Ms44信号肽(SEQ ID NO：320)。
在本公开中，将编码调节花药特异性Ms44信号肽(SEQ ID NO：320)的Ms44启动子(SEQ ID NO：318)的异源表达盒与编码WUSCHEL肽(SEQ ID NO：322)的多核苷酸融合，从而在小配子发生期间异位表达胚发生诱导形态发育基因。本公开的方法允许在绒毡层细胞中胚发生诱导形态发育基因蛋白的合成和加工，以分泌到子房室中，从而导致与小孢子接触和胚发生诱导形态发育蛋白的活性，以诱导细胞重编程并且活化小孢子胚发生。
如本文所用，“嵌合基因表达盒”是包含可操作地连接到转录起始区的编码序列的表达盒，所述转录起始区与所述编码序列异源，并且所述表达盒可以在转录的5′-3′方向上包括转录起始区域(即启动子)和翻译起始区、分泌信号肽、胚发生诱导形态发育基因序列、荧光蛋白序列以及在植物中起作用的转录和翻译终止区(即终止区)。
在一方面，可用于本公开的方法中的基因构建体包括编码以下的多核苷酸：Ms44启动子和与WUSCHEL蛋白融合的Ms44分泌信号肽，所述WUSCHEL蛋白还与C末端36个氨基酸VirF易位肽序列(SEQ ID NO：329)(本文称为“virFC36”)融合、或任选地与C末端127个氨基酸VirF易位肽序列(SEQ ID NO：331)(本文称为“virFC127”)融合、或任选地与来自毛根农杆菌GALLS蛋白的27个氨基酸易位信号肽(SEQ ID NO：333)(本文称为“GSC27”)融合，以促进增加的形态活性和细胞重编程。
在一方面，可用于本公开的方法中的具有胚发生诱导形态发育基因蛋白活性(细胞重编程和胚发生诱导活性)的基因构建体还可以包括胚发生诱导形态发育基因与细胞穿透肽的融合物，以增加以细胞非自主方式的细胞递送和活性(增加对周围/相邻细胞的胚发生诱导影响)。
在一方面，可用于本公开的方法中的具有胚发生诱导形态发育基因蛋白活性(细胞重编程和胚发生诱导活性)的基因构建体还可以包括胚发生诱导形态发育基因与基于糖皮质激素受体(GR)的融合蛋白系统的融合物(编码SEQ ID NO：364的SEQ ID NO：363)，以通过将动物激素类似物外部应用到体外组织培养物而将蛋白活性有条件地定位于细胞核。
可用于本公开的方法中的启动子包括ZmBETL9和5’非翻译区或者ZmBETL9样启动子和5’非翻译区(分别为SEQ ID NO：348和SEQ ID NO：351)，其与编码胚发生诱导形态发育基因(如WUSCHEL肽(SEQ ID NO：)或胚珠发育蛋白2(ODP2)(SEQ ID NO：335))的多核苷酸融合，从而在胚发生期间异位调节胚发生诱导形态发育基因表达。
胚乳分泌信号肽(如N末端ZmBETL9分泌信号肽或ZmBETL9样分泌信号肽(分别为SEQ ID NO：347和SEQ ID NO：350))可用于本公开的方法中，所述胚乳分泌信号肽与胚发生诱导形态发育基因蛋白融合，从而使蛋白质能在胚发生期间从胚乳易位到胚细胞。任选地，包含分泌信号肽和胚发生诱导形态发育基因蛋白的翻译融合蛋白可以与易位信号肽融合。在一方面，翻译融合蛋白可以包含细胞穿透肽。本文公开的方法实现在植物细胞中改善的胚发生和细胞重编程，这也改善了后续植物组织培养方法中的细胞响应。
本公开的原位细胞重编程方法改善了母本单倍体胚再生的生产力并且实现基因编辑以提供再生的经基因编辑的玉蜀黍双单倍体，其中所处理的细胞(但是为非转基因的)与衍生自三倍体胚乳细胞的胚发生诱导形态发育基因蛋白接触，所述三倍体胚乳细胞包含表达作为稳定转化体的性状的一个父本等位基因。
在一些方面，编码ZmBETL9启动子、5’非翻译区(SEQ ID O：348)和N末端ZmBETL9分泌信号肽(SEQ ID NO：346)或者ZmBETL9样启动子、5’非翻译区(SEQ ID NO：351)和N末端ZmBETL9样分泌信号肽(SEQ ID NO：349)的异源表达盒融合至编码胚发生诱导形态发育蛋白(如WUSCHEL肽(SEQ ID NO：322)或胚珠发育蛋白2(ODP2)肽(SEQ ID NO：335))的多核苷酸，用于本公开的方法，从而在胚发生期间异位调节胚发生诱导形态发育基因表达。
在一方面，单倍体细胞可以与一定量的染色体加倍剂接触以促进染色体加倍，然后从经处理的单倍体细胞再生纯合二倍体植物。在小孢子胚发生或胚成熟之前、期间或之后，可以使单倍体小孢子细胞与加倍剂接触。染色体加倍后，加倍的单倍体胚将含有2拷贝的由父本衍生的染色体。用于从单倍体胚获得双单倍体植物的方法的效率可以大于10％、20％、30％、50％、60％、70％、80％或90％。单倍体细胞与染色体加倍剂之间接触的持续时间可以变化。接触时间可以是从少于24小时(例如4-12小时)至约一周。接触的持续时间通常为从约8小时至2天。
染色体加倍的方法公开于Antoine-Michard，S.等人，Plant cell，tissue organcult.[植物细胞、组织器官培养]，荷兰科尔德雷赫特，Kluwer Academic Publishers[Kluwer学术出版社]，1997，48(3)：203-207；Kato，A.，Maize Genetics CooperationNewsletter[玉米遗传合作新闻通讯]1997，36-37；和Wan，Y.等人，TAG，1989，77：889-892.Wan，Y.等人，TAG，1991，81：205-211；将所公开的内容通过引用并入本文。典型的加倍方法涉及使细胞与秋水仙碱、抗微管剂或抗微管除草剂、拿草特、一氧化二氮或任何有丝分裂抑制剂接触，以产生纯合的双单倍体细胞。培养基中使用的秋水仙碱的量通常是0.01％-0.2％，或可以使用约0.05％的甲基胺草磷(APM)(5-225μM)。秋水仙碱的量可以是在约400-600mg/L的范围或约500mg/L。培养基中拿草特的量是约0.5-20μM。表2中包括有丝分裂抑制剂的实例。其他试剂可以与有丝分裂抑制剂一起使用以改善加倍效率。此类试剂包括二甲基亚砜(DMSO)、佐剂、表面活性剂等。
表2.化学染色体加倍剂
Figure BDA0003306116500000711
Figure BDA0003306116500000721
Figure BDA0003306116500000731
作为使用化学染色体加倍剂的替代方案，通过刺激细胞周期(和细胞分裂)或通过刺激核内复制来调节已知影响植物细胞周期(遗传染色体加倍蛋白)的基因的表达，可用于使胚中的染色体组加倍。通过调节刺激细胞周期细胞中关键控制点的基因的表达，可以实现植物细胞中倍性水平的增加。在本公开中，已经证明使用卵细胞启动子的BBM404的过表达增强了单倍体胚的形成，而BBM404和ZM-DZ470(玉蜀黍周期蛋白-D家族成员)的同时表达不仅导致单倍体胚形成而且也刺激了染色体数量的加倍。因此，在形成单倍体胚中添加过表达的周期蛋白-D似乎提供了适当水平的细胞周期刺激，从而导致1n单倍体染色体数量加倍至2n(二倍体)。预计可以使用其他已知刺激植物细胞周期(或细胞分裂)的植物基因，以在形成胚中产生类似的染色体数量加倍。其过表达刺激细胞周期的植物基因的实例包括烟草中的周期蛋白-A(Yu等人，2003)、烟草中的周期蛋白-D(Cockcroft等人，2000，Nature[自然]405：575-79；Schnittger等人，2002，PNAS[美国科学院院报]99：6410-6415；Dewitte等人，2003，Plant Cell[植物细胞]15：79-92)、拟南芥属中的E2FA(De Veylder等人，2002，EMBO J[欧洲分子生物学学会杂志]21：1360-1368)、拟南芥属中的E2FB(Magyar等人，2005，Plant Cell[植物细胞]17：2527-2541)。类似地，可以使用已知调节植物细胞周期机制的病毒基因的过度表达，例如当小麦矮化病毒RepA基因的过表达时刺激玉蜀黍中的细胞周期进展(G1/S转变)和细胞分裂时(Gordon-Kamm等人，2002，PNAS[美国科学院院报]99：11975-11980)。相反，当拟南芥属中的周期蛋白依赖性激酶抑制剂(ICK1/KRP)等基因下调时，已知其编码的产物抑制细胞周期的植物基因已经显示会导致细胞分裂增加(Cheng等人2013，Plant J[植物杂志]75：642-655)。因此，使用卵细胞特异性启动子驱动表达的KRP基因的下调预计与DZ470的过表达具有相似的效果，导致染色体加倍。下调基因(如KRP)的方法是本领域已知的，并且所述方法包括表达靶向KRP mRNA的人工微RNA，或表达通过gRNA靶向KRP启动子序列来靶向KRP启动子的dCas9-阻遏物融合物。最后，已知存在特异性影响核内复制过程的植物基因。当在本公开的方法中使用此类基因(如例如ccs52基因或Del1基因)时，预期ccs52的过表达将导致增加的倍性水平，如在紫花苜蓿(Medicago sativa)中观察到的(Cebolla等人，1999，EMBO J[欧洲分子生物学学会杂志]18：4476-4484)，并且Del1的下调将导致增加的倍性水平，如在拟南芥属中观察到的(Vlieghe等人，2005，Current Biol[当代生物学]15：59-63)。预期可在本文公开的方法中使用已知刺激细胞周期、G1/S转变或核内复制的其他基因以增加倍性水平。
用于在植物细胞中维持干细胞稳态的示例性途径是CLAVATA-WUSCHEL反馈信号传导途径，其中芽分生组织由多能干细胞维持。该途径协调维持干细胞增殖与分化。尽管首先在拟南芥属中发现，但该途径似乎在玉蜀黍、水稻和番茄等多种高等植物物种中是保守的(Somssich等人，2016.Development[发育1143：3238-3248)。所述途径包含促进干细胞的转录因子WUS和促进分化的肽CLAVATA3(CLV3)(Brand，U.，等人，2000.Science[科学]289：617-619)。虽然在多种高等植物物种中是保守的，但其他植物中也表明多种受体在调节干细胞和发育方面也发挥作用，例如水稻基因FON1(Suzaki，T，等人2006.Plant CellPhysiol.[植物细胞生理学]47：1591-1602)、玉蜀黍CLAVATA 2直系同源物粗雄穗矮杆1(THICK TASSEL DWARF1，TD1)和FASCIATED EAR2(FEA2)(Bommert，P.，等人，2005.Development[发育]132：1235-1245)、以及玉蜀黍CLV-型LRR受体样基因、FASCIATEDEAR3(FEA3)(Je，等人，2016.Nat.Genet.[自然-遗传学]48：785-791)。因此，此类物种特异性蛋白(其可以阻遏通过用形态发育蛋白处理细胞提供的诱导的细胞重编程)与本公开相关。
在另一个实例中，拟南芥花分生组织的发育调节已经表明，WUS的阻遏是由AGAMOUS(AG)蛋白的表达控制。在此，AG直接诱导KNUCKLES(KNU)(编码具有保守转录阻遏物基序的C2H2型锌指蛋白)的转录，所述C2H2型锌指蛋白阻遏WUS转录以消除干细胞活性，从而控制花分生组织的决定性(Sun.B，等人，2009.Gene Dev[基因与发育]23：1791-804)。对于这种花发育中干细胞调节的途径，协调干细胞维持和分化的一个关键方面不仅是时间表达模式(其中WUS活性激活AG活性，并且AG激活KNU转录)，而且还在于KNU基因座如何调节。值得注意的是，通过AG进行KNU转录需要去除KNU基因座处的阻遏性组蛋白修饰，例如去除组蛋白H3蛋白的第27个赖氨酸残基处的三甲基化(H3K27me3)。这样的阻遏标记以AG依赖性的方式被去除。对于本公开的方法，其中WUS活性在植物干细胞增殖中的转录反馈和表观遗传调节之间具有机理性关联，预期对正向激活的WUS阻遏物(例如KNU或其他此类阻遏蛋白)的靶向阻遏同样令人感兴趣。
可以预期，植物细胞中的异位WUS蛋白活性将正向调节信号通路响应以阻遏WUS活性。在此，编码用于阻遏WUS活性的所述蛋白质的遗传基因座被认为可用作本公开的方法的基因组靶位点。
还鉴定了几个其他作为胚发生负开关的遗传基因座。当PICKLE(PKL)功能丧失时，PKL基因编码CHD3染色质重塑因子和在根内异位发育的胚性状(Ogas J.，等人，1997.Science.[科学]277：91-94；Ogas J，等人，1999.Proc.Natl Acad.Sci.USA.[美国科学院院报]96：13839-13844)。在pkl幼苗中，LEC类基因被去阻遏，从而表明此类发育基因经由阻遏性染色质状态被沉默(Dean Rider，S.等人，2003.Plant J.[植物杂志]35：33-43)。该发现进一步得到结果的支持，所述结果显示在萌发过程中PKL的强表达和针对PKL依赖性基因的阻遏性H3K27me3修饰的建立(Henderson JT.等人，2004.Plant Physiol[植物生理学]134：995-1005；Zhang H.等人，2008.J Biol Chem[生物化学杂志]283：22637-22648)。
同样，三个VP1/ABI3-LIKE(VAL)基因的缺陷诱导幼苗中胚发生性状的表达，再次以异位LEC1激活为特征(Suzuki M.等人，2007.Plant Physiol[植物生理学]143：902-911)。VAL基因编码含有作为染色质重塑蛋白特征的PHD样和CW结构域、EAR转录阻遏物结构域和B3 DNA结合结构域的转录调节子(Suzuki M.等人，2007.Plant Physiol[植物生理学]143：902-911)。另外，据报道，几种多梳组蛋白和两种组蛋白脱乙酰基酶HDA6和HDA19对阻遏萌发后的胚性状至关重要(Makarevich，G.等人2006.EMBO Rep[欧洲分子生物学组织报告]7：947-952；Tanaka，M.等人2008.Plant Physiol[植物生理学]146：149-161)。在另一个实例中，PHERES1和FUSCA3被证明为潜在的PcG靶基因，因此，提出在植物发育的不同阶段不同的PcG复合物阻遏此类靶基因以促进分化(Makarevich，G.等人，2006.EMBO Rep.[欧洲分子生物学组织报告]7：947-52)。
阻遏物基序是本领域已知的，例如参见Kagale和Rozwadowski(Epigenetics.[表观遗传学]2011.6：141-146)。乙烯响应元件结合因子相关的两亲性阻遏(EAR)基序介导的转录阻遏在植物中是已知的，所述基序包括由LxLxL和DLNxxP的共有序列模式定义的EAR基序(参见Hiratsu等人，2003.Plant J.[植物杂志]35：177-192)。本公开感兴趣的是肽，所述肽包括两亲性阻遏物基序(在WO 2013/109754 A1和本文引用的所有参考文献中公开)和Dr1/DRAP1全局阻遏物复合物(参见US 7,288,695 B2和本文引用的所有参考文献)，所述Dr1/DRAP1全局阻遏物复合物包括Dr1基序(类似于在拟南芥MYBL2中发现的基序)(参见Matsui K，Umemura Y，Ohme-Takagi M.2008.Plant J.[植物杂志]55：954-967)。
本公开的原位方法提供了稳定的转基因“小孢子活化”亲本近交系，用于与第二野生型亲本近交系进行遗传杂交以产生第一代F1杂交体。
在一方面，本公开的方法使用此半合转基因F1杂交体，以用于生成不成熟的雄穗，所述不成熟的雄穗可以与含有发育的小孢子的花药一起生成小花。小孢子是减数分裂的产物，并且因此，由于减数分裂期间的染色体互换事件，每种雄性配子都具有从亲本沿着重组染色体继承的基因的独特组合。在减数分裂期间，在处于半合状态的单个基因座上的单一拷贝转基因可以以1∶1的比率分离，这导致一半配子为野生型，另一半配子具有遗传的转基因基因座。减数分裂后，野生型和转基因配子继续原位发育，其中所有发育的小孢子暴露于胚发生诱导形态发育基因蛋白，所述胚发生诱导形态发育基因蛋白是从孢子体的绒毡层细胞中分泌的，源自半合F1基因组中转基因的单拷贝的蛋白质翻译。从雄穗组织中分离小孢子后，本公开的方法在小配子发生期间诱导细胞重编程活性，以改善小孢子胚发生响应性和体外细胞重编程。使用标准方法选择非转基因小孢子衍生的胚状体。
在一方面，使两种不同的近交系进行异花受精，以产生在母本的受精雌穗中发育的第一代F1合子胚。每个F1合子胚具有两组(基因组)染色体，各自来自每个亲本。受精后，例如受精后8至16天，出于转化的目的，可以随后从母本雌穗中分离不成熟的F1合子胚，以将对诱导胚发生的细胞重编程因子进行编码的多核苷酸稳定整合到F1植物基因组中。以这种方式，可以选择在半合状态中具有单拷贝的诱导胚发生的细胞重编程基因构建体的F1植物，以对在花药中产生小孢子的雄穗组织取样。关于插入的诱导胚发生的细胞重编程转基因，小孢子在配子发生过程中将以1∶1的比率分离，导致一半配子为野生型，另一半配子具有遗传的诱导转基因胚发生的细胞重编程基因座。由此，本公开的方法允许从半合F1杂交体中选择具有改善的胚发生响应性的F2代野生型小孢子，以产生双单倍体群体。
在一方面，本公开的方法还提供了原位蛋白质递送。所述方法包括转化玉蜀黍单倍体诱导物系以稳定整合并且表达一个或多个异源表达盒，所述异源表达盒编码两种主要功能活性：一种活性包含用于诱导体细胞胚发生和细胞重编程的蛋白质，另一种活性包含用于基因编辑目的的蛋白质。两种组分均可操作地连接到胚乳内(特别是胚周区(ESR)和/或基底胚乳转移层(BETL))表达的一个或多个启动子。本公开的方法使用转化的单倍体诱导物系以用于使靶植物的母本雌穗受精，以产生具有改善的双单倍体小植株再生和/或改善的经基因编辑的双单倍体后代再生的单倍体胚。在这些方法中，包含来自三倍体胚乳细胞内父本等位基因的胚发生诱导形态发育基因蛋白的异源表达盒的表达导致使所述蛋白质使用胚乳转移细胞特有的分泌信号肽通过转移细胞而易位到单倍体胚中。一旦将拯救的单倍体胚进行体外培养，本发明的方法则提供了胚发生水平和小植株再生能力提高的母本单倍体胚。
sgRNA与基因内DNA杂交，可以具有调节作用并影响靶位点处的基因调节。该发现与双向表达的长非编码RNA(lncRNA)转录物所显示的调节作用一致，所述转录物可以沉默或激活基因。例如，显示来自果蝇(Drosophila)的退化(vestigial，vg)基因下游的多梳/三胸复合体响应元件(PRE/TRE)的RNA分子的转录影响基因调节，其中正向链转录物与vg阻遏相关并且反向链转录物与vg表达的激活有关(Herzog，等人.2014.Nat.Genet.[自然-遗传学]46：973-981)。更具体地，与多梳组复合物(PcG)的亚基结合的逆转录长非编码RNA(lncRNA)抑制了PcG组蛋白甲基转移酶活性，并将抑制性PcG复合物与vg基因座隔离，从而激活了vg基因表达。还相关的是可能发生PcG蛋白和RNA的混杂体外结合以及与哺乳动物PcG复合物结合的非特异性RNA抑制PcG活性(Davidovich，等人.2013.Nat.Struct.Mol.Biol.[自然结构分子生物学]20：1250-1257；Cifuentes-Rojas，等人2014.Mol.Cell[分子细胞]55：171-185)。这样的结合可以解释在本公开的细胞重编程方法中使用的sgRNA如何充当在基因组靶位点处控制基因调节的功能开关。
在植物细胞中，PcG活性的保守性是已知的并且与调节发育调节性基因相关，所述发育调节性基因包括在本公开的细胞重编程方法中使用的形态发生基因。在拟南芥属中，WUS基因座在PcG蛋白的募集导致建立的H3K27me3翻译后修饰后沉默，从而导致WUS基因阻遏(Liu，等人2011.Plant Cell[植物细胞]23：3654-3670)。在玉蜀黍中，沉积H3K27me3的PcG蛋白是保守的，并且据报道，与叶组织相比，在雄穗中沉积BBM基因座上的H3K27me3的水平升高(Makarevitch等人2013.The Plant Cell[植物细胞]，第25卷：780-793)，表明在分离和培养的玉蜀黍小孢子中，由PcG活性介导的BBM阻遏是可能的。
总的来说，这些结果表明，提供与编码形态发育基因的基因座具有序列同源性的RNA分子可以改善细胞重编程，例如通过在具有或不具有异源dCas9融合蛋白的活性情况下激活靶向基因的表达。如先前所示的PcG和RNA的混杂结合可以解释在本公开的方法中使用的sgRNA如何改善经处理的细胞中的细胞重编程，例如，通过抑制PcG活性，从而增加WUS和/或BBM表达。
用于产生单倍体诱导物系的方法是本领域已知的，例如通过异位表达含有AP2结构域的转录因子。例如，优选地使用Gordon-Kamm等人的方法(参见美国专利号7,579,529；其内容通过引用特此结合)。
另外，显示非洲狼尾草(Pennisetum squamulatum)AP2转录因子无孢子生殖特异性基因组区域(Apospory-Specific-Genomic-Region)BabyBoomLike(本文称为PsASGR-BBML)转基因在不受精的情况下诱导孤雌生殖和胚形成。在玉蜀黍中，用具有R1-navajo花青素颜色标记的花粉受精的具有PsASGR-BBML转基因的个体表现出单倍体胚生产(SteffenJG，等人2007.Plant J[植物杂志]51：281-292，US 2016/0304901 A1，将其通过援引以其全文并入本文)。最近，Khanday和Sundaresan的方法证明了类似的发现，例如在水稻中(参见WO 2018/098420 A1；其内容通过引用特此结合)。
SEQ ID NO：316-364的描述示于表3。
表3.
Figure BDA0003306116500000801
Figure BDA0003306116500000811
Figure BDA0003306116500000821
用于在植物基因组的具体位置靶向插入多核苷酸的方法是本领域已知的。利用位点特异性重组系统实现多核苷酸在所需的基因组位置处的插入。参见例如，WO 99/25821、WO 99/25854、WO 99/25840、WO 99/25855和WO 99/25853，将其通过援引以其全文并入本文。简而言之，侧翼为两个不相同重组位点的目标多核苷酸可包含在T-DNA转移盒中。将T-DNA转移盒引入植物中，该植物已经将靶位点稳定地掺入其基因组中，该靶位点侧翼为与转移盒的位点相对应的两个不相同的重组位点。提供适当的重组酶，并将所述转移盒整合到靶位点。由此，目的多核苷酸被整合在植物基因组中的具体染色体位置处。
所公开的方法可用于向外植体中引入多核苷酸，所述多核苷酸用于靶向源自植物细胞的植物的基因组中的特定位点以进行修饰。可以用所公开的方法引入的位点特异性修饰包括使用用于引入位点特异性修饰的任何方法产生的修饰，该方法包括但不限于通过使用基因修复寡核苷酸(例如美国公开2013/0019349)，或通过使用双链断裂技术，如TALEN、大范围核酸酶、锌指核酸酶、CRISPR-Cas等。例如，所公开的方法可以用于将CRISPR-Cas系统引入植物细胞或植物中，以用于以下目的：对植物或植物细胞的基因组中的靶序列进行基因组修饰，选择植物，缺失碱基或序列，基因编辑，以及将目的多核苷酸插入植物或植物细胞的基因组中。因此，所公开的方法可以与CRISPR-Cas系统一起使用以提供用于修饰或改变在植物、植物细胞或种子的基因组内的靶位点和目的核苷酸的有效系统。所述Cas内切核酸酶基因是植物优化的Cas9内切核酸酶，其中植物优化的Cas9内切核酸酶能够结合植物基因组的基因组靶序列并在其中产生双链断裂。
所述Cas内切核酸酶由指导核苷酸指导来识别特定靶位点处的双链断裂并且任选地将所述双链断裂引入细胞的基因组中。所述CRISPR-Cas系统提供用于修饰植物、植物细胞或种子的基因组内的靶位点的有效系统。进一步提供了使用指导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统的方法，以提供用于修饰细胞基因组内的靶位点和编辑细胞基因组中的核苷酸序列的有效系统。一旦鉴定出基因组靶位点，就可以采用多种方法来进一步修饰靶位点，这样使得它们包含多种目的多核苷酸。所公开的方法可以用于引入CRISPR-Cas系统，所述系统用于编辑细胞基因组中的核苷酸序列。待编辑的核苷酸序列(目的核苷酸序列)可以位于由Cas内切核酸酶识别的靶位点内部或外部。
CRISPR基因座(规律间隔成簇短回文重复序列)(又称SPIDR-间隔区散在同向重复序列)构成最近描述的DNA基因座的家族。CRISPR基因座由部分回文的短而高度保守的DNA重复序列(通常为24至40bp，重复从1至140次，也称为CRISPR重复序列)组成。重复序列(通常具有物种特异性)由恒定长度的可变序列(通常为20至58，依赖于CRISPR基因座(WO2007/025097，2007年3月1日公开))间隔。
Cas基因包括通常与侧翼CRISPR基因座偶合、相关或相近或相邻的基因。术语“Cas基因”和“CRISPR相关的(Cas)基因”在本文中可互换地使用。
在另一方面，Cas内切核酸酶基因可操作地连接到Cas密码子区域上游的SV40核靶向信号和Cas密码子区域下游的二分型VirD2核定位信号(Tinland等人，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]89：7442-6)。
关于Cas内切核酸酶，术语“功能片段”、“功能上等效的片段”和“功能等效片段”在本文中可互换使用。这些术语意指Cas内切核酸酶序列的一部分或子序列，其中产生双链断裂的能力被保留。
关于Cas内切核酸酶，术语“功能变体”、“功能上等效的变体”和“功能等效变体”在本文中可互换使用。这些术语意指Cas内切核酸酶的变体，其中产生双链断裂的能力被保留。这些片段和变体可以经由例如定点诱变和合成构建等方法来获得。
在一个方面，Cas内切核酸酶基因是可以识别N(12-30)NGG型的任何基因组序列并且原则上是可以靶向的植物密码子优化的酿脓链球菌Cas9基因。
内切核酸酶是切割多核苷酸链内的磷酸二酯键的酶，并且包括在特定位点切割DNA而不损害碱基的限制性内切核酸酶。限制性内切核酸酶包括I型、II型、III型、和IV型内切核酸酶，这些限制性内切核酸酶进一步包括亚型。在I型和III型系统中，甲基化酶和限制性酶活性二者均包含在单复合物中。内切核酸酶还包括大范围核酸酶，也称为归巢内切核酸酶(HE酶)，该酶相似于限制性内切核酸酶，在特定识别位点处结合并且切割，然而对于大范围核酸酶，这些识别位点通常更长，约18bp或更长(于2012年3月22日提交的专利申请PCT/US 12/30061)。基于保守序列基序，大范围核酸酶已被分为四个家族。这些基序参与金属离子的配位和磷酸二酯键的水解。大范围核酸酶的显著之处在于它们的长识别位点，并且还在于耐受其DNA底物中的一些序列多态性。对于大范围核酸酶的命名约定相似于对其他限制性内切核酸酶的约定。大范围核酸酶还分别表征为针对由独立的ORF、内含子、和内含肽编码的酶的前缀F-、I-、或PI-。在重组过程中的一个步骤涉及在识别位点处或在所述识别位点附近的多核苷酸切割。该切割活性可用于产生双链断裂。对于位点特异性重组酶和它们的识别位点的综述，参见，Sauer(1994)Curr Op Biotechnol[生物技术新见]5：521-7；以及Sadowski(1993)FASEB[美国实验生物学学会联合会杂志]7：760-7。在一些实例中，重组酶来自整合酶(Integrase)或解离酶(Resolvase)家族。TAL效应物核酸酶是一类新的序列特异性核酸酶，其可以被用于在植物或其他生物的基因组中特异性靶序列处造成双链断裂。(Miller，等人(2011)Nature Biotechnology[自然生物技术]29：143-148)。锌指核酸酶(ZFN)是由锌指DNA结合结构域和双链-断裂-诱导剂结构域组成的工程化双链断裂诱导剂。识别位点特异性由锌指结构域赋予，所述锌指结构域典型地包含两个、三个、或四个锌指，例如具有C2H2结构，然而其他锌指结构是已知的并且已经被工程化。锌指结构域适于设计特异性结合所选择的多核苷酸识别序列的多肽。ZFN包括连接至非特异性内切核酸酶结构域(例如来自Ms型内切核酸酶，例如Fokl的核酸酶结构域)的工程化DNA结合锌指结构域。另外的功能性可以融合到锌指结合结构域中，这些另外的功能性包括转录激活物结构域、转录阻遏物结构域、和甲基化酶。在一些实例中，核酸酶结构域的二聚化是切割活性所需的。每个锌指在靶DNA中识别三个连续的碱基对。例如，3指结构域识别9个连续核苷酸的序列，由于所述核酸酶的二聚化需要，因此两组锌指三联体用于结合18个核苷酸的识别序列。
本文所用的“死-CAS9”(dCAS9)用于提供转录阻遏物结构域。dCAS9已发生突变，因此无法再切割DNA。dCAS0在被gRNA引导至序列时仍然可以结合，也可以与阻遏物元件融合。如本文所述，融合至阻遏物元件的dCAS9缩写为dCAS9～REP，其中阻遏物元件(REP)可以是已在植物中表征的任何已知阻遏物基序。表达的指导RNA(gRNA)与dCAS9～REP蛋白结合，并靶向dCAS9-REP融合蛋白与启动子(T-DNA内的启动子)内特定的预定核苷酸序列的结合。例如，如果使用ZM-UBI PRO：：dCAS9～REP：：PINII TERM盒和U6-POL PRO：：gRNA：：U6 TERM盒将其表达在边界外，且gRNA被设计成指导dCAS9-REP蛋白以结合T-DNA内表达盒SB-UBIPRO：：moPAT：：PINII TERM中的SB-UBI启动子，任何整合了边界外序列的事件会是双丙氨膦敏感性的。仅整合T-DNA的转基因事件将表达moPAT，并且对双丙氨磷具有抗性。使用与阻遏物融合的dCAS9蛋白(与TETR或ESR相反)的优点是能够将这些阻遏物靶向T-DNA内的任何启动子。TETR和ESR仅限于同源操纵子结合序列。可替代地，可以使用与阻遏物结构域融合的合成的锌指核酸酶代替gRNA和dCAS9～REP(Urritia等人，2003，Genome Biol.[基因组生物学]4：231)，如上所述。
来自细菌的II型CRISPR/Cas系统采用crRNA和tracrRNA将Cas内切核酸酶指导至其DNA靶。该crRNA(CRISPR RNA)包含与双链DNA靶的一条链互补，并且与tracrRNA(反式激活CRISPR RNA)碱基配对形成RNA双链体的区域，所述RNA双链体引导Cas内切核酸酶切割DNA靶。如本文所用，术语“指导核苷酸”涉及两个RNA分子-包含可变靶向结构域的crRNA(CRISPR RNA)和tracrRNA的合成性融合。在一方面，所述指导核苷酸包含12至30个核苷酸序列的可变靶向结构域和可以与Cas内切核酸酶相互作用的RNA片段。
如本文所用，术语“指导多核苷酸”涉及可以与Cas内切核酸酶形成复合物的多核苷酸序列，并且使得Cas内切核酸酶能够识别并任选地切割DNA靶位点。指导多核苷酸可以是单分子或双分子。指导多核苷酸序列可以是RNA序列、DNA序列或其组合(RNA-DNA组合序列)。任选地，指导多核苷酸可以包含至少一种核苷酸、磷酸二酯键或连接修饰，例如但不限于锁核酸(LNA)、5-甲基dC、2，6-二氨基嘌呤、2′-氟代A、2′-氟代U、2′-O-甲基RNA、硫代磷酸酯键、与胆固醇分子的连接、与聚乙二醇分子的连接、与间隔子18(六乙二醇链)分子的连接、或导致环化的5′至3′共价连接。仅包含核糖核酸的指导多核苷酸也被称为“指导核苷酸”。
指导多核苷酸、VT结构域和/或CER结构域的核苷酸序列修饰可以选自但不限于由以下各项组成的组：5′帽、3′聚腺苷酸尾、核糖开关序列、稳定性控制序列、形成dsRNA双链体的序列、将指导多核苷酸靶向亚细胞位置的修饰或序列、提供跟踪的修饰或序列、提供蛋白质结合位点的修饰或序列、锁核酸(LNA)、5-甲基dC核苷酸、2，6-二氨基嘌呤核苷酸、2′-氟代A核苷酸、2′-氟代U核苷酸、2′-O-甲基RNA核苷酸、硫代磷酸酯键、与胆固醇分子的连接、与聚乙二醇分子的连接、与间隔子18分子的连接、5′至3′共价连接、或其任何组合。这些修饰可以产生至少一个另外的有益特征，其中该另外的有益特征选自下组：修改的或调节的稳定性、亚细胞靶向、跟踪、荧光标记、用于蛋白质或蛋白质复合物的结合位点、对互补靶序列的修改的结合亲和力、修改的细胞降解抗性和增加的细胞通透性。
在一个方面，该指导核苷酸和Cas内切核酸酶能够形成复合物，该复合物使得Cas内切核酸酶能够在DNA靶位点引入双链断裂。
在本公开的一方面中，可变靶结构域是12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸长度。
在本公开的一方面，指导核苷酸包含II型CRISPR/Cas系统中的可以与II型Cas内切核酸酶形成复合物的cRNA(或cRNA片段)和tracrRNA(或tracrRNA片段)，其中所述指导核苷酸/Cas内切核酸酶复合物可以将Cas内切核酸酶指导至植物基因组靶位点，使得Cas内切核酸酶能够将双链断裂引入基因组靶位点。可以使用本领域已知的任何方法(例如但不限于粒子轰击或局部应用)将指导核苷酸直接引入植物或植物细胞。
在一方面，还可以通过引入重组DNA分子间接地引入指导核苷酸，所述重组DNA分子包含可操作地连接到植物特异性启动子的相应指导DNA序列，所述植物特异性启动子能够在植物细胞中转录所述指导核苷酸。术语“相应指导DNA”包括与RNA分子相同的，但其中“T”取代RNA分子的每个“U”的DNA分子。
在一方面，经由粒子轰击或使用所公开的用于重组DNA构建体的农杆菌转化的方法来引入所述指导核苷酸，所述重组DNA构建体包含可操作地连接到植物U6聚合酶III启动子的相应指导DNA。
在一方面，指导RNA/Cas9内切核酸酶复合物的RNA是包含双链体crRNA-tracrRNA的双链体化的RNA。使用指导核苷酸对比双链体crRNA-tracrRNA的一个优点是，为了表达融合的指导核苷酸，仅需要制造一个表达盒。
术语“靶位点”、“靶序列”、“靶DNA”、“靶基因座”、“基因组靶位点”、“基因组靶序列”、以及“基因组靶基因座”在本文中可互换地使用，并且意指植物细胞的基因组(包括叶绿体DNA和线粒体DNA)中的多核苷酸序列，在所述多核苷酸序列处通过Cas内切核酸酶在植物细胞基因组中诱导双链断裂。靶位点可以是植物基因组中的内源性位点，或者可替代地，靶位点可以与植物异源，从而不是基因组中天然存在的，或者与其在自然界中存在的地方相比，靶位点可以发现于异源基因组位置中。
如本文所用，术语“内源性靶序列”和“天然靶序列”在本文中可互换地使用，从而意指对于植物的基因组是内源的或天然的靶序列，并且是在植物的基因组中靶序列的内源或天然位置处。
“人工靶位点”或“人工靶序列”在本文中可互换地使用，并且意指已经引入植物基因组中的靶序列。此类人工靶序列可以在序列上与植物的基因组中的内源性或天然靶序列相同，但是位于植物的基因组中的不同位置(即，非内源性的或非天然的位置)处。
“改变的靶位点”、“改变的靶序列”、“修饰的靶位点”和“修饰的靶序列”在本文中可互换地使用，并且是指如本文公开的靶序列：所述靶序列当与未改变的靶序列相比时包含至少一种改变。此类“改变”包括，例如：(i)至少一个核苷酸的替代、(ii)至少一个核苷酸的缺失、(iii)至少一个核苷酸的插入、或(iv)(i)-(iii)的任何组合。
在一方面，所公开的方法可用于向植物中引入用于植物中靶基因的基因抑制的多核苷酸。对于植物基因工程的几个方面来说，降低特定基因的活性(也称为基因沉默或基因抑制)是所希望的。许多基因沉默技术是本领域技术人员众所周知的，包括但不限于反义技术。
在一方面，所公开的方法可用于将用于将核苷酸序列靶向整合到植物中的多核苷酸引入植物中。例如，所公开的方法可以用于引入T-DNA表达盒以转化包含靶位点的植物，所述转移盒包含不相同重组位点侧翼的目的核苷酸序列。在一方面，靶位点包含至少一组与T-DNA表达盒上的那些相对应的不相同的重组位点。重组位点侧翼的核苷酸序列的交换通过重组酶进行。因此，所公开的方法可以用于引入T-DNA表达盒以靶向整合核苷酸序列，其中所述T-DNA表达盒的侧翼为由重组酶识别的不相同重组位点，所述重组酶识别并实现不相同重组位点处的重组。因此，所公开的方法和组合物可以用于提高含有不相同重组位点的植物的发育效率和发育速度。
因此，所公开的方法可以进一步包括用于将外源核苷酸定向、靶向整合到转化植物中的方法。在一方面，所公开的方法在基因靶向系统中使用新的重组位点，该基因靶向系统有利于将希望的基因和核苷酸序列定向靶向到先前引入到靶植物基因组中的相应重组位点。
在一方面，将侧翼有两个不相同重组位点的核苷酸序列引入到源自靶生物体基因组的外植体的一个或多个细胞中，从而建立用于插入目的核苷酸序列的靶位点。一旦建立了稳定的植物或培养组织，将侧翼有与侧翼靶位点的那些重组位点相对应的重组位点的第二构建体或目的核苷酸序列，在重组酶蛋白存在下引入稳定转化的植物或组织中。该过程导致靶位点和T-DNA表达盒的不相同重组位点之间的核苷酸序列的交换。
应认识到，以这种方式制备的转化植物可以包含多个靶位点；即多组不相同的重组位点。以这种方式，转化植物中的靶位点的多个操作是可获得的。转化植物中的靶位点是指已经插入到转化植物基因组中的并包含不相同重组位点的DNA序列。
用于所公开的方法中的重组位点的实例是已知的。在大多数天然存在的酿酒酵母菌株中发现的两微米质粒编码位点特异性重组酶，其促进两个反向重复之间的DNA的倒位。这种倒位在质粒拷贝数扩增中起着核心作用。
名为FLP蛋白的蛋白质催化位点特异性重组事件。最小重组位点(FRT)已被定义并且包含围绕不对称8-bp间隔子的两个反向的13个碱基对(bp)的重复序列。FLP蛋白切割所述重复序列和间隔子连接处的位点，并经由3′磷酸共价连接至DNA。位点特异性重组酶(如FLP)在特定靶序列处切割和再次连接DNA，这导致两个相同位点之间的精确限定的重组。为了起作用，系统需要重组位点和重组酶。不需要辅助因子。因此，整个系统可以插入到植物细胞中并在其中起作用。已显示酵母FLP\FRT位点特异性重组系统在植物中起作用。迄今为止，该系统已被用于切除不需要的DNA。参见Lyznik等人(1993)Nucleic Acids Res.[核酸研究]21：969-975。相比之下，本公开利用不相同的FRT用于植物基因组中核苷酸序列的交换、靶向、排列、插入和表达的控制。
在一方面，需要转化的、含有整合到其基因组中的靶位点的目的生物体，如来自植物的外植体。靶位点的特征在于侧翼有不相同的重组位点。另外需要靶向盒，其含有侧翼有与包含在转化生物体的靶位点中的那些位点相对应的不相同重组位点的核苷酸序列。需要识别不相同重组位点并催化位点特异性重组的重组酶。
应认识到，重组酶可以通过本领域已知的任何方式提供。即，通过瞬时表达或通过提供重组酶或重组酶蛋白质的信使RNA(mRNA)，可以在生物体或植物细胞中通过用能够在生物体中表达重组酶的表达盒转化生物体而提供。
“不相同重组位点”意指侧翼重组位点在序列上不相同并且不会重组，或在位点之间的重组将是最小化的。即，一个侧翼重组位点可以是FRT位点，而第二个重组位点可以是突变的FRT位点。本公开的方法中使用的不相同重组位点阻止或大大抑制两个侧翼重组位点之间的重组和其中所含的核苷酸序列的切除。因此，应认识到，可以在本公开中使用任何合适的不相同重组位点，包括FRT和突变FRT位点、FRT和lox位点、lox和突变lox位点、以及本领域已知的其他重组位点。
通过合适的不相同重组位点暗示，在活性重组酶存在下，两个不相同重组位点之间的序列切除(如果有的话)以显著低于核苷酸序列重组介导的交换靶向排列到植物基因组中的效率存在。因此，用于本公开的合适的不相同位点包括那些位点之间的重组效率低的位点；例如，其中效率小于约30％至约50％，优选小于约10％至约30％，更优选小于约5％至约10％。
如上所指出，靶向盒中的重组位点对应于转化植物的靶位点中的重组位点。即，如果转化植物的靶位点含有FRT和突变FRT的侧翼的不相同重组位点，则靶向盒将含有相同的FRT和突变FRT不相同的重组位点。
此外还应认识到，用于所公开的方法中的重组酶将取决于转化植物的靶位点中的和靶向盒中的重组位点。即，如果使用FRT位点，则需要FLP重组酶。以相同的方式，在使用lox位点的情况下，需要Cre重组酶。如果不相同重组位点包含FRT和lox位点两者，则植物细胞中将需要FLP和Cre重组酶两者。
该FLP重组酶是催化位点特异性反应的蛋白质，该蛋白质参与在DNA复制期间扩增酿酒酵母的两微米质粒的拷贝数。FLP蛋白质已被克隆并表达。参见例如，Cox(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.[美国国家科学院院刊]80：4223-4227。用于本公开的FLP重组酶可以是衍生自酵母属的酶。可能优选的是使用植物优选密码子合成重组酶，用于在目的植物中最佳表达。参见例如，1997年11月18日提交的、标题为“Novel Nucleic AcidSequence Encoding FLP Recombinase[编码FLP重组酶的新颖核酸序列]”的美国申请系列号08/972,258，通过引用结合在此。
该噬菌体重组酶Cre催化在两个lox位点之间的位点特异性重组。该Cre重组酶是本领域已知的。参见例如Guo等人(1997)Nature[自然]389：40-46；Abremski等人，(1984)J.Biol.Chem.[生物化学杂志]259：1509-1514；Chen等人(1996)Somat.Cell Mol.Genet.[体细胞与分子遗传学]22：477-488；以及Shaikh等人(1977)J.Biol.Chem.[生物化学杂志]272：5695-5702。将其全部通过引用并入本文。这样的Cre序列也可以使用植物优选密码子来合成。
在适当的情况下，可以对待插入植物基因组的核苷酸序列进行优化以增加转化植物中的表达。在本公开中使用哺乳动物、酵母或细菌基因的情况下，可以使用植物优选密码子来合成它们以改善表达。应认识到，为了在单子叶植物中表达，也可以使用单子叶植物优选密码子合成双子叶植物基因。本领域中可获得用于合成植物优选基因的方法。参见例如，美国专利号5,380,831、5,436,391，以及Murray等人(1989)Nucleic Acids Res.[核酸研究]17：477-498，这些文献通过引用并入文中。可以从目的植物中表达的蛋白质中更频繁使用的密码子确定植物优选密码子。应认识到，可以构建单子叶植物或双子叶植物优选序列以及特定植物物种的植物优选序列。参见例如，EPA 0359472；EPA 0385962；WO 91/16432；Perlak等人，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]88：3324-3328；以及Murray等人(1989)Nucleic Acids Res.[核酸研究]17：477-498。美国专利号5,380,831；美国专利号5,436,391；等，这些文献通过引用并入本文中。进一步认识到，该基因序列的所有或任何部分可以是优化的或合成的。即，还可以使用完全优化的或部分优化的序列。
已知另外的序列修饰增强细胞宿主中的基因表达并可用于本公开中。这些包括：消除编码假的聚腺苷酸化信号和外显子-内含子剪接位点信号的序列、转座子样重复序列、及可能不利于基因表达的其他经充分表征的序列。可将序列的G-C含量调整至通过参照宿主细胞中表达的已知基因而计算出的给定细胞宿主的平均水平。当可能时，修饰序列以避免出现可预见的发夹二级RNA结构。
本公开还包括新的FLP重组靶位点(FRT)。FRT已被鉴定为包含由八(8)个碱基间隔子隔开的两个13个碱基对重复序列的最小序列。只要这两个13碱基的重复序列被八个核苷酸分开，间隔区中的核苷酸就可以被核苷酸组合代替。似乎间隔区的实际核苷酸序列不是关键的；然而，对于本公开的实践，间隔区域中核苷酸的某些取代可能比其他取代更好地起作用。在链交换期间，八个碱基对间隔子参与DNA-DNA配对。该区域的不对称性决定了重组事件中位点对齐的方向，这将随后导致倒位或切除。如上所示，大部分间隔子可以被突变而不丧失功能。参见例如，Schlake和Bode(1994)Biochemistry[生物化学]33：12746-12751，通过引用结合在此。
新的FRT突变位点可用于实践所公开的方法。这样的突变位点可以通过基于PCR的诱变来构建。尽管突变FRT位点是已知的(参见WO 1999/025821的SEQ ID No 2、3、4和5)，但认识到其他突变FRT位点可用于实践本公开。本公开不限于使用特定的FRT或重组位点，而是可使用不相同的重组位点或FRT位点以将核苷酸序列在植物基因组中靶向插入和表达。因此，可以基于本公开构建和使用其他突变FRT位点。
如上所讨论的，在重组酶存在下，含有具有不相同重组位点的靶位点的基因组DNA与含有具有相应不相同重组位点的T-DNA表达盒的载体一起导致重组。将位于侧翼重组位点之间的T-DNA表达盒的核苷酸序列与位于侧翼重组位点之间的靶位点的核苷酸序列进行交换。以此方式，目的核苷酸序列可以精确地并入宿主的基因组中。
认识到可以实行本公开的许多变化。例如，可以构建具有多个不相同重组位点的靶位点。因此，多个基因或核苷酸序列可以在植物基因组中的精确位置处堆叠或排序。同样地，一旦已经在基因组内建立了靶位点，可以通过将此类位点并入T-DNA表达盒的核苷酸序列内并将位点转移至靶序列来引入另外的重组位点。因此，一旦已经建立了靶位点，就可能随后通过重组来添加位点或改变位点。
另一种变化包括提供与生物体中的靶位点可操作地连接的启动子或转录起始区。优选地，该启动子将位于第一个重组位点的5′。通过用包含编码区的T-DNA表达盒转化生物体，在T-DNA表达盒整合到靶位点时将发生编码区的表达。这方面提供了通过提供可选择标记序列作为编码序列来选择转化细胞(特别是植物细胞)的方法。
本系统的其他优点包括通过利用如上所讨论的T-DNA表达盒并且用简单的整合模式选择生物体来降低转基因或转移的DNA在生物体中整合的复杂性的能力。以相同的方式，可以通过比较几个转化事件来鉴定基因组内的优选位点。基因组内的优选位点包括不破坏必需序列的表达并提供转基因序列的充分表达的位点。
表观遗传学研究由基因表达修饰而不是遗传密码本身的改变引起的生物体变化，可以包括DNA修饰(例如5-甲基胞嘧啶(5mC)和5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)、翻译后组蛋白尾修饰、能量依赖性核小体重塑、以及局部染色质结构和染色体组织的长非编码RNA调节)的分析。
考虑到这些修饰可能对基因表达、发育和最终基因组稳定性具有影响，DNA和/或染色质的修饰是令人感兴趣的。组蛋白介导的染色质重塑的模式，即所谓的“组蛋白密码”，协调这种可以相互作用并有时由DNA甲基化模式协调的控制，这表明不同表观遗传机制的复杂相互作用共同协调基因组稳定性。
DNA的表观遗传修饰或组蛋白修饰可以通过催化特定修饰的酶(“写入因子”)、识别并结合修饰的蛋白质(“识别因子”)以及去除某些修饰的酶(“擦除因子”)来建立或去除。
Makarevitch等人先前证明了以组织特异性方式(具体地包括含有花药和小孢子的雄穗组织)与BABY BOOM的等位基因特异性一致的表观遗传调节的证据(Makarevitch等人，2013.Plant Cell[植物细胞].3月；25：780-793)。这些作者描绘了组蛋白H3赖氨酸27的三甲基化(H3K27me3)，所述H3K27me3是与基因沉默相关的组蛋白修饰，在植物和动物发育过程中在调节基因表达中起关键作用(还参见，Schuettengruber等人，2007；Berr等人，2011；Zheng和Chen，2011)。
H3K27me3由多梳组(PcG)蛋白催化，并且被认为调节此类发育过程。PcG基因的特征是使用突变体无法适当地维持黑腹果蝇中同源基因的基因表达的阻遏状态(Simon，1995)，并且PcG蛋白的子集可以形成参与催化组蛋白H3的赖氨酸甲基化的多梳抑制复合物(PRC2)。许多植物物种具有PRC2基因的直系同源物(在Hennig和Derkacheva，2009；Kohler和Hennig，2010；Zheng和Chen，2011中有综述)并且可能在植物中编码相同的功能(Schuberr等人，2006)。
玉蜀黍(maize，Zea mays)基因组编码三个E(z)同源物：Mez1、Mez2和Mez3(Springer等人，2002)。Mez1是与来自拟南芥属的卷叶(CURLY LEAF，CLF)基因最密切相关的印记基因(Haun等人，2007)。Mez2和Mez3彼此高度相似(92％核苷酸同一性)，位于玉蜀黍基因组的共线性区域，并且很可能是由玉蜀黍中古老的异源多倍体事件产生的旁系同源物(Springer等人，2002)。
Yu等人2008.鉴定了两种BRI1-EMS-阻遏物1(BRI1-EMS-SUPPRESSOR 1，BES1)相互作用蛋白(早花6(EARLY FLOWERING 6，ELF6)及其同源物相对早花6(ELATIVE OF EARLYFLOWERING 6，REF6))，即先前报道调节开花时间的含有Jumonji N/C(JmjN/C)结构域的蛋白质(参见Plant Cell[植物细胞]16：2601-13)。在使用GST下拉和BiFC(双分子荧光互补)实验确认BES1和ELF6/REF6蛋白相互作用后，这些作者进一步证明ELF6或REF6基因中的突变导致异常的BR相关表型，所述表型包括受损的细胞伸长和降低的BR靶基因的表达，从而证明BES1招募ELF6和REF6转录调节子来调节靶基因表达。
2011，Lu等人(参见Nat Genet.[自然遗传学]43：715-9)中进一步表征了REF6的功能活性。这些作者证明了在组蛋白3的赖氨酸27残基处特异性去甲基化的二甲基化和三甲基化翻译后修饰(这里分别称为H3K27me2和H3K27me3)的REF6的过表达，而使用标准方法没有报告其他组蛋白修饰。为了进一步表征H3K27me2和H3K27me3修饰的去甲基化如何影响基因调节，显示在拟南芥属幼苗中通常沉默的几个H3K27me3靶基因，例如MADS-盒花器官特征基因AP1(APETALA1)、AP3(APETALA3)、PI(PISTILLATA)、AG(AGAMOUS)和SEP3(SEPALLATA3)在用REF6过表达转基因构建体稳定转化的拟南芥属幼苗中异位激活。
结果表明，H3K27me3去甲基化的催化活性与活化性组蛋白修饰的沉积相偶联，可用于细胞重编程，导致从沉默或阻遏的调节状态产生活性转录。一类可用于沉积活化性组蛋白修饰的蛋白质是组蛋白乙酰转移酶(HAT)，即使用乙酰辅酶A(CoA)将乙酰基基团转移到底物上的酶。因此，预期组合此类H3K27me3去甲基化活性并以靶向、可编程方式建立组蛋白乙酰化修饰可用于植物细胞的细胞重编程。
组蛋白乙酰转移酶(HAT)乙酰化氨基末端组蛋白尾的赖氨酸残基，导致转录激活，并基于HAT结构域内的序列保守性分为至少四个不同的家族。
一般控制非阻遏(General Control Nonrepressed，Gcn5)相关的N-乙酰转移酶(GNAT)结构域催化乙酰基从CoA供体转移到受体的伯胺。GNAT蛋白共享由四个保守序列基序A-D组成的结构域[PMID：9175471，PMID：10940244]。乙酰转移酶/GNAT结构域以拓扑结构B1-H1-H2-B2-B3-B4-H3-B5-H4-B6形成六到七条β链(B)和4条螺旋(H)的结构保守折叠，然后是可能来自相同单体或由另一个[PMID：10940244，PMID：15581578]贡献的C末端链。基序D(B2-B3)、A(B4-H3)和B(B5-H4)统称为HAT核心[PMID：10940244，PMID：12527305，PMID：15581578]，而N末端基序C(B1-H1)较不保守。
MYST家族(以MOZ、Ybf2/Sas3、Sas2和Tip60蛋白命名)介导许多生物学功能，包括基因调节、DNA修复、细胞周期调节和发育[PMID：21132344]，并且可以乙酰化非组蛋白底物[PMID：19303850]。MYST型HAT结构域含有三个区域：除了分别带有C2HC型锌指和螺旋-转角-螺旋DNA结合基序的侧翼N末端和C末端区域外，还有与乙酰辅酶A辅因子结合和催化相关的中心区域。直接侧翼于催化核心的N末端和C末端片段可能在组蛋白底物结合[PMID：11106757，PMID：17925393]中发挥重要作用。
以下实例是通过说明的方式但不是通过限制的方式来提供的。
实例
本公开的多个方面在以下实例中被进一步定义，其中除非另有说明，否则份数和百分数以重量计，并且度数以摄氏度计。尽管这些实例说明了本公开的多个方面，但仅是通过说明的方式给出的。从以上的讨论和这些实例中，本领域的技术人员能够确定本公开的多个方面的本质特性，并且在不脱离本公开的精神和范围的情况下，可进行它们的各种变化和修改以使其适应各种用途和条件。因此，从上述说明书来看，除了本文所示出和描述的那些之外，各种修改对于本领域技术人员来说将是清楚的。此类修改也当视为落入所附权利要求的范围内。
实例1：质粒
可用于本公开的质粒的描述参见表4。
表4.
Figure BDA0003306116500000981
Figure BDA0003306116500000991
Figure BDA0003306116500001001
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Figure BDA0003306116500001061
Figure BDA0003306116500001071
实例2：培养基
可用于本公开的方法的用于转化，选择和再生的培养基形成的描述，参见表5。
表5.
Figure BDA0003306116500001072
Figure BDA0003306116500001081
表5.续
Figure BDA0003306116500001082
Figure BDA0003306116500001091
Figure BDA0003306116500001101
实例3：农杆菌介导的玉米转化
A.农杆菌母板的制备。
将带有二元供体载体的根癌农杆菌从-80℃冷冻等分试样划线到固体12R培养基上，并在黑暗中在28℃培养2-3天，以制备母板。
B.在固体培养基上生长农杆菌。
从母板上挑出单菌落或多菌落的农杆菌，并将其划线到含有810K培养基的第二平板上，并在黑暗中于28℃孵育过夜。将农杆菌感染培养基(700A；5ml)和100mM 3′-5′-二甲氧基-4′-羟基苯乙酮(乙酰丁香酮；5μL)添加到通风橱中的14mL锥形管中。将来自第二平板的约3个满环的农杆菌悬浮于试管中，然后将试管涡旋以形成均匀的悬浮液。将悬浮液(1ml)转移到分光光度计管中，并将悬浮液的光密度(550nm)调节至约0.35-1.0的读数。农杆菌浓度为约0.5至2.0×109cfu/mL。将最终的农杆菌悬浮液等分到2mL微量离心管中，每个管含有约1mL悬浮液。然后尽快使用悬浮液。
C.在液体培养基中生长农杆菌。
可替代地，可以通过在液体培养基中生长来制备农杆菌用于转化。感染前一天，用以下来准备125ml烧瓶：30ml 557A培养基(10.5g/l磷酸氢二钾、4.5g/l无水磷酸二氢钾、1g/l硫酸铵、0.5g/l脱水柠檬酸钠、10g/l蔗糖、1mM硫酸镁)和30μL壮观霉素(50mg/mL)和30μL乙酰丁香酮(20mg/mL)。将来自第二平板的半环农杆菌悬浮于烧瓶中，并置于设定为200rpm的轨道振荡器上，并在28℃下孵育过夜。将农杆菌培养物以5000rpm离心10分钟。去除上清液并添加具有乙酰丁香酮溶液的农杆菌感染培养基(700A)至沉淀。将农杆菌通过涡旋重悬，并将农杆菌悬浮液的光密度(550nm)调节至约0.35至1.0的读数。
D.玉蜀黍转化。
将玉蜀黍(Zea mays L.)栽培品种的穗在20％(v/v)漂白剂(5.25％次氯酸钠)加1滴Tween 20中进行表面灭菌15-20分钟，然后在无菌水中洗涤3次。从穗分离未成熟胚(IE)，并将其置于具有乙酰丁香酮溶液的2ml农杆菌700A感染培养基中。胚的最佳大小因近交系而异，但是对于用表6中列出的胚发生因子和/或WUS2和/或ODP2发育基因转化，可以使用广泛大小范围的未成熟胚大小。取出农杆菌感染培养基(700A)，将1ml农杆菌悬浮液加入胚中，并将试管涡旋5-10秒。使微量离心管在通风橱中孵育5分钟。将农杆菌悬浮液和胚倾倒在710I(或562V)共培养基(参见表5)上。使用无菌刮刀将留在管中的任何胚转移到平板上。抽取农杆菌悬浮液并将胚置于培养基的轴侧。将平板在黑暗中于21℃孵育1-3天进行共培养，然后将胚转移到静息培养基(605B培养基)中而不进行选择。
实例4：改善的玉米转化的方法
以下实验证明，与只含有与弱、组成型启动子可操作地连接的形态发育基因的T-DNA相比，含有与强、组织偏好性启动子可操作地连接的胚发生因子和与弱、组成型启动子可操作地连接的形态发育基因的T-DNA的递送改善了体细胞胚发生。
进行了两个系列的实验。每个系列都比较了两种质粒，所述两种质粒用于评估对经处理的未成熟胚的细胞重编程效果，如通过愈伤组织诱导和7至10天的时间段内的体细胞胚发生响应所测量的。
合成含有与强、组织偏好性启动子可操作地连接的分别编码每个胚发生因子多肽(SEQ ID NO：17-32)的每个胚发生因子DNA多核苷酸(SEQ ID NO：1-16)(参见表6)的表达盒，并用于实验处理。该胚发生表达盒用于如下所述的实验处理。合成含有与弱、组成型启动子可操作地连接的形态发育基因的表达盒，并与胚发生表达盒一起用于如下所述的实验处理。如下所述，还使用含有与相同的弱、组成型启动子可操作地连接的相同形态发育基因的序列的实验对照处理。
表6.
Figure BDA0003306116500001121
在第一系列的实验中，第一质粒用作实验处理并含有三个表达盒，所述表达盒包含：i.)ZM-PLTP PRO：：ZM-PLT 5UTR：：(克隆位点；用于插入每个胚发生因子)：：OS-T28TERM，ii.)NOS PRO：：ZM-WUS2：：PINII TERM，和iii.)UBIZM PRO：：UBIZM 5UTR：：UBIZMINTRON 1：：DS-RED2：：PINII TERM。对于表6中所示的每个胚发生因子，每个合成的基因片段都包括编码相容限制性位点的侧翼序列，通常是BamHI和KpnI识别基序。这些限制性位点允许将每个胚发生因子(SEQ ID NOS：1-16)定向克隆到与上文i.)中描述的PLTP调节元件可操作地连接的表达盒的克隆位点中。提供了示例性序列，包括编码以下的多核苷酸：ZM-PLTP PRO：：ZM-PLT 5UTR(SEQ ID NO：33)、OS-T28 TERM(SEQ ID NO：34)、表达盒NOS PRO：：ZM-WUS2：：PINII TERM(SEQ ID NO：35)、以及表达盒UBIZM PRO：：UBIZM 5UTR：：UBIZMINTRON 1：：DS-RED2：：PINII TERM(SEQ ID NO：36)。
用作实验对照处理的质粒RV010564(SEQ ID NO：37)含有包含以下组分的T-DNA；RB+NOS PRO：：WUS2：：PINII TERM+UBIZM PRO：：UBIZM 5UTR：：UBIZM INTRON1：：ZS-YELLOWN1：：PINII TERM+UBIZM PRO：：UBIZM 5UTR：：UBIZM INTRON1：：PMI：：PINII TERM+OS-ACTINPRO：：OS-ACTIN INTRON1：：MO-PAT：：CAMV35TERM+LB。
使用RV010564(SEQ ID NO：37)的实验对照处理不足以在经处理的植物细胞中产生高水平的体细胞胚发生。该实验对照处理表达盒被设计为允许经处理的细胞仅处于做好准备或重编程接近至足以用于胚发生的平衡，但不足以独立地诱导胚发生。因此，使用组织偏好性PLTP启动子调节每个胚发生因子的表达因此预期可用于评估相对于使用实验对照处理观察到的基线的细胞重编程响应。
使用类似的策略，使用含有三个表达盒的第二质粒作为实验处理进行第二系列实验，所述表达盒包含：i.)ZM-PLTP PRO：：ZM-PLT 5UTR：：(克隆位点；用于转移编码胚发生因子的多核苷酸；参见SEQ ID NO：1-16)：：OS-T28 TERM，ii.)UBIZM PRO：：UBIZM 5UTR：：UBIZM INTRON 1：：ZM-ODP2：：PINII TERM，和iii.)UBIZM PRO：：UBIZM 5UTR：：UBIZMINTRON 1：：DS-RED2：：PINII TERM。示例性序列包括编码以下的多核苷酸：ZM-PLTP PRO：：ZM-PLT 5UTR(SEQ ID NO：33)、OS-T28 TERM(SEQ ID NO：34)、UBIZM PRO：：UBIZM 5UTR：：UBIZM INTRON 1：：ZM-ODP2：：PINII TERM(SEQ ID NO：38)、以及UBIZM PRO：：UBIZM 5UTR：：DS-RED2：：PINII TERM(SEQ ID NO：36)。
使用上述两个质粒实体，通过转化从同一供体雌穗中分离的胚(平均长度为1.8mm)来评估表6中所示的每个胚发生因子，从而说明供体雌穗质量的变化。将分离的胚分为两组，其中每组通过针对每个系列的实验处理或实验对照处理进行处理，其中相对于一个系列中的WUSCHEL多肽进行比较，并相对于第二系列中的胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽进行比较。
简而言之，在室温下使用700A培养基孵育5分钟后，在黑暗条件下于21℃使用共培养(710I或562V)培养基培养受感染的胚24小时来进行组织培养。将经处理的胚于28℃在黑暗条件下转移到静息(605B)培养基中持续7至11天。
体细胞胚发生的相对功效是通过对感染后7天表现出愈伤组织诱导表型的响应胚的百分比和感染后14天响应于实验处理和实验对照处理的进一步体细胞胚发生发育进行评分来计算的。将用响应于实验处理的重编程细胞命运进行评分的胚百分比的比率除以用响应于实验对照处理的重编程细胞命运进行评分的胚百分比，以计算针对每个胚发生因子的体细胞胚发生诱导的相对功效(显示为单独的EF+WUS/WUS或单独的EF+BBM/BBM；参见图1)。还使用落射荧光显微镜评估了增殖细胞内DsRED蛋白质表达的共表达，以确认含有每种胚发生因子的T-DNA的存在。
细胞重编程响应是通过观察在第14天用实验处理处理的胚相对于用实验对照处理处理的胚的愈伤组织诱导、落射荧光报告基因表达水平和体细胞胚发生响应来测量的，如图1所示。
这些结果表明几种胚发生因子，具体是dpzm02g056660.1.1(胚发生因子1；编码SEQ ID NO：17的SEQ ID NO：1)、dpzm03g050950.1.1(胚发生因子4；编码SEQ ID NO：20的SEQ ID NO：4)、dpzm07g031470.1.1(胚发生因子5；编码SEQ ID NO：21的SEQ ID NO：5)和dpzm09g039270.1.1(胚发生因子11；编码SEQ ID NO：27的SEQ ID NO：11)，各自与形态发生基因WUS2和ODP2/BBM相互作用。对于其余的胚发生因子，各自与形态发生基因WUS2或ODP2/BBM相互作用。然而，预期针对这些实验中使用的表达盒中的任何一个的调节元件的改变将导致响应的改变。具体而言，预期促进较高基因活性的调节元件将导致体细胞胚发生响应增加，相反，预期较弱的调节元件将导致体细胞胚发生响应降低。
表6中列出的胚发生因子可用于激活植物细胞中的胚发生响应，并用作细胞重编程因子，如由响应于实验处理而产生的高胚发生的愈伤组织所证明的。本文显示的结果表明，这些胚发生因子与形态发生基因的共表达可用于细胞重编程和获得胚发生细胞命运。因此预期这些胚发生因子可用于提高玉蜀黍的转化效率。
例如，预期质粒(其包含：第一表达盒i)(其含有编码CRE/lox重组系统的多核苷酸，所述多核苷酸侧翼于形态发生基因/胚发生因子(EF)/CRE共表达盒，其中CRE可操作地连接到干燥诱导型RAB17启动子，允许切除形态发生基因/EF/CRE共表达盒)，和第二表达盒ii)(其含有编码目的基因的多核苷酸，例如UBI1ZM PRO+UBI1ZM 5UTR+UBI1ZM INTRON1+DS-RED2+PINII TERM(SEQ ID NO：99)))可用于提高用第二表达盒转化的转基因植物(例如表达DS-RED2的转基因植物)的转化效率和再生。应当理解，在形态发生基因/EF/CRE共表达盒中可以使用一种或多种形态发生基因。
实例5：调节细胞周期活性以进一步改善体细胞胚发生的方法
使用包含T-DNA的实验处理的递送获得了细胞重编程和胚发生细胞命运获得方面的进一步改善，所述T-DNA含有(a)与弱、组成型启动子可操作地连接的形态发育基因、(b)与强、组织偏好性启动子可操作地连接的胚发生因子、和(c)与强、组织偏好性启动子可操作地连接的周期蛋白依赖性激酶。与包含T-DNA的实验对照处理相比，该实验处理显示出改善的体细胞胚发生，所述T-DNA含有(a)与弱、组成型启动子可操作地连接的相同的形态发育基因和(b)与强、组织偏好性启动子可操作地连接的相同的胚发生因子。
构建了一系列质粒并用于递送含有以下的T-DNA：(a)与弱、组成型启动子可操作地连接的WUS2或ODP2形态发育基因，(b)与强、组织偏好性启动子可操作地连接的胚发生因子dpzm07g031470.1.1，本文也称为“DZ470”，其注释为周期蛋白δ-2蛋白(胚发生因子5，编码SEQ ID NO：21的SEQ ID NO：5)以及(c)由与强、组织偏好性启动子可操作地连接的基因dpzm01g001860.1.1或dpzm04g074910.1.2编码的周期蛋白依赖性激酶，在本文中分别称为CDKA1或CDKA3(参见表7)。
表7：用于调节细胞周期活性的质粒
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Figure BDA0003306116500001171
Figure BDA0003306116500001181
与实验对照处理相比，测试响应于实验处理的细胞重编程和体细胞胚发生的活化的实验如上所述进行。将每个载体提供细胞重编程和获得胚发生细胞命运的功效与以下进行比较：使用两种形态发育基因之一(例如SEQ ID NO：37(仅WUS)或SEQ ID NO：41(仅BBM))的实验对照处理，以及使用两种形态发育基因(例如SEQ ID NO：45(WUS+BBM))的阳性对照处理。
这些结果表明，当与发育基因(WUS)(图2A)或发育基因(BBM)(图2B)和周期蛋白依赖性激酶(CDKA1或CDKA3)(分别为SEQ ID NO：114和SEQ ID NO：115)共表达时，由胚发生因子“DZ470”(dpzm07g031470.1.1；多核苷酸SEQ ID NO：5，编码多肽SEQ ID NO：21)赋予的体细胞胚发生水平进一步提高。
如图2A所示，CDKA1与WUS形态发生基因组合更有效地将细胞转变为更具胚发生性，而如图2B中所示的CDKA3与ODP2(BBM)形态发生基因组合更有效地将细胞转变为更具胚发生性。
实例6：使用外源蛋白作为细胞重编程剂的父本双单倍体方法
以下实验证明通过将野生型小孢子与用作细胞重编程剂的外源多肽接触来改善小孢子胚发生。
例如，在体外组织培养之前、期间或之后，将野生型小孢子与用作细胞重编程剂的外源多肽接触。具体地，包含SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：16的胚发生因子分别用于产生包含SEQ ID NO：17至SEQ ID NO：32的多肽。然后在体外组织培养之前、期间或之后使SEQ IDNO：17至SEQ ID NO：32的多肽与小孢子接触。预期将SEQ ID NO：17至SEQ ID NO：32的多肽与小孢子接触将促进经处理的小孢子的细胞重编程，从而产生胚发生型小孢子。
预期对SEQ ID NO：17至SEQ ID NO：32的多肽的修饰将进一步增强小孢子细胞重编程，导致增强的小孢子胚发生。预期SEQ ID NO：17至SEQ ID NO：32的翻译融合肽(其中所述肽在肽的N末端或C末端融合至多组氨酸基序(his标签)，例如编码SEQ ID NO：47的SEQID NO：46的那些)，将进一步增加小孢子细胞重编程。此外，预期通过用SEQ ID NO：17至SEQID NO：32的his标签翻译融合肽处理分离的小孢子将进一步增强小孢子细胞重编程，所述his标签翻译融合肽已通过在多肽的N末端或C末端添加细胞穿透肽(CPP)进一步修饰，从而产生具有以下特性的胚发生因子-his标签-细胞穿透翻译融合肽，所述特性包括但不限于(a)细胞重编程活性、(b)充当重组蛋白的金属结合位点的His-标签、和/或(c)促进改善的细胞递送的细胞穿透肽，从而改善翻译融合肽向分离的玉蜀黍小孢子中的易位，导致改善的细胞重编程和/或小孢子胚发生。
可用于本公开的方法中的细胞穿透肽(CCP)包括但不限于：玉蜀黍knotted1 CPP(ZM-KNT1 CPP；编码SEQ ID NO：49的SEQ ID NO：48)、粟酒酵母TP10 CPP(SP-TP10 CPP；编码SEQ ID NO：51的SEQ ID NO：50)、白色念珠菌Zebra CPP(CA-Zebra CPP；编码SEQ ID NO：53的SEQ ID NO：52)、PEP1 CPP(PEP1 CPP；编码SEQ ID NO：55的SEQ ID NO：54)、HIV-1 TATCPP(HIV-1 TAT CPP；编码SEQ ID NO：57的SEQ ID NO：56)和γ-玉米醇溶蛋白细胞穿透肽(GZ CPP；编码SEQ ID NO：59的SEQ ID NO：58)(参见US 8581036，通过援引以其全文并入本文)。预期将此类his标签-CPP肽递送到植物细胞(例如分离的小孢子)中将改善细胞重编程，从而改善非转基因植物的再生。
如图3中所示，从玉蜀黍花药中提取的单核小孢子将不经进一步处理就会转变为具有小配子发生的特征的花粉有丝分裂I，并发育成成熟的花粉粒。本公开的方法通过用包含胚发生因子-his标签-CPP的翻译融合肽处理分离的小孢子来诱导细胞重编程。
预期通过用包含与形态发生多肽组合的胚发生因子-his标签-CPP的翻译融合肽处理小孢子，可以进一步增强小孢子的细胞重编程。特别地，包含胚发生因子-his标签-CPP的翻译融合肽可以与选自由以下组成的组的形态发生多肽组合：(i)功能性WUS/WOX多肽(例如，多肽SEQ ID NO：322)；(ii)Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽((例如，多肽SEQ ID NO：335)；(iii)LEC1多肽；(iv)(i)和(ii)的组合；以及(v)(i)和(iii)的组合。
预期可以通过以下来实现小孢子胚发生的进一步增强：制备包含如上所述针对胚发生因子的形态发生多肽-his标签-CPP的翻译融合肽，并且然后用包含胚发生因子-his标签-CPP的翻译融合肽和包含形态发生多肽-his标签-CPP的翻译融合肽的组合处理小孢子，从而导致改善的小孢子细胞重编程。
可用于本公开的方法的形态发育基因的翻译融合肽包括但不限于BBM404-FLAG-KNOTTED-1CPP(包含6XHis标签融合至截短的ODP2/BBM肽融合至FLAG表位融合至KNOTTED-1细胞穿透肽(编码多肽序列SEQ ID NO：123的多核苷酸序列SEQ ID NO：122))和WUS-HISTAG-GZCPP(包含6XHis标签融合至WUSCHEL肽融合至γ-玉米醇溶蛋白细胞穿透肽(CPP)(编码多肽序列SEQ ID NO：362的多核苷酸序列SEQ ID NO：361))。
预期可以通过以下实现小孢子胚发生的进一步增强：用包含胚发生因子-his标签-CPP的翻译融合肽和/或包含形态发生多肽-his标签-CPP的组合和/或上述公开的翻译融合肽中的任何一种处理小孢子，从而导致改善的小孢子细胞重编程。
为了获得上述针对胚发生因子的翻译融合肽(胚发生因子-his标签-CPP)和/或形态发生多肽的翻译融合肽(形态发生多肽-his标签-CPP)，构建了具有编码每个这样的翻译融合多肽的表达盒的DNA质粒。DNA质粒可以是蛋白质表达载体，其通过将编码此类翻译融合多肽的每一种的DNA多核苷酸转移到自我复制基因元件如表达载体(例如pDAB135006载体(SEQ ID NO：60))而构建。pDAB135006载体(SEQ ID NO：60)具有以下特征(a)T7启动子和烟草花叶病毒5’前导序列(ω)、(b)NcoI和KpnI克隆位点，用于转移编码翻译融合多肽的多核苷酸、(c)3’UTR，(d)Fl复制起点(Fl ori)、和(d)杀稻瘟素S抗性基因(bla)。
使用这样的蛋白质表达载体表达翻译融合多肽，并且将表达的重组蛋白用于细胞重编程处理的外源应用，如图3中所示。本公开的方法包括使用衍生自烟草栽培变种嫩黄2(Nicotiana tabacum L.cv.Bright Yellow 2，BY-2)烟草细胞的体外翻译系统。简而言之，制备来自空泡化的BY-2原生质体的裂解物(包括去除细胞核和未破坏的细胞)，并将裂解物于-80℃以1mL等分试样冷冻，从而使来自蛋白质表达载体的转录和翻译相偶联。
收获雄穗的方法(包括灭菌方法)和雄穗预处理(例如温度预处理)将根据预期的雄穗用途而变化。在选择雄穗用于小孢子培养之前，必须使小孢子进入到适当的阶段，通常在单核阶段到双核阶段之间。典型地，对于在适当阶段具有小孢子的雄穗，将这些雄穗解离，并且将每个雄穗单独地包裹在铝箔中。在降低的温度环境中，小孢子的分离典型地发生在雄穗预处理之后以改善产雄性特征的响应。一种常用的技术是将箔包裹的雄穗放置在10℃下持续1到21天。另外，花药可以在甘露醇溶液(例如0.3M液体甘露醇加50mg/L抗坏血酸)中预培养。
使用前，在30％高乐氏(稀释的8.25％次氯酸钠v/v)溶液加两滴吐温80中对雄穗进行表面消毒约十五分钟，同时在往复振动器上轻轻搅动。然后在室温下将雄穗在无菌水中冲洗三次或更多次，并且置于大培养皿中且通常在无菌条件下保持无盖1-1.5小时，以在小孢子分离之前蒸发多余的水分。可替代地，将小花与雄穗分离并置于可渗透的篮子中，然后将其浸入30％高乐氏(稀释的8.25％次氯酸钠v/v)溶液加两滴吐温80中十五分钟，然后如上所述进行冲洗。将小穗置于大培养皿中，通常保持无盖1-1.5小时，以在小孢子分离之前蒸发多余的水分。
可以通过多种方法从玉蜀黍花药和小花中分离小孢子，所述方法包括但不限于玻璃棒浸渍法、共混方法、刀片组织切割方法、组织匀浆器方法和组织研磨方法。
从周围的体细胞组织中分离小孢子后，在将小孢子与任何花药碎片分离后典型地立即纯化小孢子将其置于新鲜分离培养基中。将小孢子与花药碎片分离的常用的方法是使来自分离程序的共混的小孢子花药碎片浆料通过筛子。可替代地，使小孢子花药碎片浆料通过几层粗棉布或筛网过滤器。可以使用不连续密度离心方法或另外的过滤方法进行进一步的分离，所述方法包括但不限于使用蔗糖或Percoll梯度的方法。在使用Percoll梯度的方法中，可以使用最终的高蔗糖(0.44M)离心方法进一步分离在225g离心3分钟后在20％-30％界面处捕获的细胞(20％-50％细胞范围内)。上述分离方法中的任一种都可以根据需要进行优化。
小孢子分离期间使用的培养基，通常由6％蔗糖、50mg/L抗坏血酸、400mg/L脯氨酸、0.05mg/L生物素和10mg/L烟酸组成。用于培养玉蜀黍小孢子的其他培养基和溶液与用于其他谷物组织培养程序的那些相似，并且可以使用各种培养基修饰。玉蜀黍培养基的共同特征通常包括使用具有维生素(N6)的Chu N6基础培养基、NLN基础培养基(NLN)、或具有相对较高糖浓度(6％-12％)的YP基础培养基(YP)配制品，并且可具有包括三碘苯甲酸(triiodobenzoic acid)、各种植物激素和/或脯氨酸的成分。
预期用本实例6中公开的细胞重编程处理(单独和/或以本实例6中公开的组合和/或与实例5中公开的细胞重编程处理组合)处理小孢子将改善细胞重编程。预期这些处理和处理组合在小孢子内将引起孤雌生殖响应，如图3所示，并将小孢子的细胞命运从小配子发生改变为产雄性特征的小孢子胚发生响应。还预期使用选自SEQ ID NO：17至SEQ ID NO：32的多肽的多种胚发生因子与本实例6中公开的细胞重编程处理组合将进一步改善小孢子细胞重编程。
在以上公开的细胞重编程处理中的任何一种之后，如图3中所示，可以将小孢子衍生的单倍体小植株转移到具有染色体加倍(或有丝分裂抑制剂)剂的静息培养基中，以产生双单倍体植物。例如，将小植株用浓度为0.1-1.0g/ml的秋水仙碱处理24小时，以通过干扰微管组织而使分裂细胞的有丝分裂停滞在中期，然后转移到没有染色体加倍剂的静息培养基，随后于28℃在黑暗条件下孵育，并且然后在不进行选择情况下转移到成熟培养基中。可替代地，基于经处理的小孢子产生的小孢子衍生的胚或胚状体的形态发育，将小孢子衍生的胚状体用染色体加倍剂处理24小时，然后转移到无染色体加倍的静息培养基中，随后于28℃在黑暗条件下孵育，并且然后在不进行选择情况下转移到成熟培养基中。
实例7：dCas9技术作为细胞重编程剂的父本双单倍体方法
本公开的细胞重编程方法包括用异源蛋白(包括与指导RNA复合的异源蛋白)处理具有靶基因座的细胞，所述指导RNA与靶基因座杂交并改变靶基因座处的基因调节，导致所述细胞的细胞重编程。可用于本公开的细胞重编程方法的靶基因座包括编码表6中所列胚发生因子的那些基因座和/或编码形态发育基因(包括但不限于ODP2/BBM、WUS或LEC1形态发生基因及其组合)的基因座。
预期使用募集到靶基因座区域的dCas9翻译融合蛋白/gRNA复合物可以实现细胞命运重编程。例如，预期来自植物组织的细胞，例如叶细胞，其中靶基因座处的基因未表达，在用对靶基因座处的基因特异的dCas9翻译融合蛋白/gRNA复合物处理后可以被转录激活。
使用本公开的细胞重编程方法，预期改变配子细胞(例如单核小孢子或卵细胞)中内源基因座的基因调节状态将导致细胞的基因激活和重编程，从而赋予经处理的细胞改善的胚发生表型。本公开的细胞重编程方法使用RNA指导的CRISPR-Cas9系统以杂交至编码靶基因座或序列的DNA，由此改变至少一种基因产物的表达。靶基因座或目的序列包括但不限于表6中列出的胚发生因子和形态发育基因。可用于本公开的细胞重编程方法中的RNA指导的CRISPR-Cas9系统包括异源蛋白的设计，所述异源蛋白包含简并的、也称为失活的Cas9蛋白(dCas9)，其用作与调节结构域(例如用于改变靶基因座或序列的表达的转录激活物结构域、转录阻遏物结构域和/或染色质修饰结构域)融合的识别结构域。
使用指导RNA(gRNA)将dCas9融合蛋白募集到编码表6中列出的胚发生因子中的每一个和/或形态发育基因的内源基因座。一旦将核糖核苷酸复合物募集到靶基因座，通过改变至少一种基因产物的表达(包括但不限于组蛋白修饰的翻译后修饰)来实现细胞重编程，所述翻译后修饰包括但不限于(a)去除与阻遏基因表达相关的组蛋白修饰，(b)建立与促进基因表达相关的组蛋白修饰，和/或(c)募集与表达基因相关的转录机器，以及(a)、(b)和/或(c)的组合。至少一种基因产物的这种改变的表达将经处理的小孢子从小孢子细胞命运重编程为胚发生细胞命运，从而提高玉蜀黍父本双单倍体生产。
包含含有染色质修饰结构域(包括组蛋白去甲基化酶结构域)的dCas9翻译融合蛋白的异源蛋白，特别是赋予组蛋白去甲基化酶催化活性的赖氨酸去甲基化酶的Jumanji家族，本文称为dCAS9-jmj融合蛋白，可用于本公开的细胞重编程方法。包含与组蛋白乙酰转移酶(HAT)结构域(包括但不限于HAT结构域(特征为一般控制非阻遏(Gcn5)相关的N-乙酰转移酶(GNAT)结构域、MYST结构域、和/或B型催化亚基结构域，其中每个都已知赋予组蛋白乙酰转移酶催化活性))融合的失活Cas9(dCas9)蛋白的异源蛋白(本文中称为dCas9-HAT融合蛋白)也可用于本公开的细胞重编程方法。这些dCas9翻译融合蛋白在本公开的方法中用作细胞重编程剂。表8中示出了染色质修饰性结构域。含有表8的染色质修饰性结构域的dCas9翻译融合表达盒示于表9中。
表8.可用于dCas翻译融合蛋白的调节结构域
Figure BDA0003306116500001251
表9.可用作细胞重编程因子的dCas9翻译融合表达盒
Figure BDA0003306116500001252
Figure BDA0003306116500001261
与转录激活物结构域融合的失活的Cas9(dCas9)蛋白也可用于本公开的细胞重编程方法。可用于本公开的细胞重编程方法的一个这样的结构域来自拟南芥属CBF1蛋白。特别地，将Spy Cas9中的D10A和H840A突变(编码多肽SEQ ID NO：84的多核苷酸SEQ ID NO：83)与表达盒中拟南芥属CBF1蛋白的转录激活物组分(其可操作地连接到玉蜀黍UBIQUITIN启动子并使用PIN II终止子序列)融合(称为dCas9-CBF1A，编码多肽SEQ ID NO：86的多核苷酸SEQ ID NO：85)。可替代地，VP64结构域的转录激活物结构域(编码多肽SEQ ID NO：245的多核苷酸SEQ ID NO：244)是调节结构域的另一种选择，所述调节结构域可与dCas9融合，用于本公开的细胞重编程方法。
对于本实例7中描述的方法，可以使用两个RNA分子的非天然融合的RNA分子(包含可变靶向结构域(与跟tracrRNA杂交的tracr配对序列连接)的crRNA(CRISPR RNA)与tracrRNA(反式激活CRISPR RNA)融合)进行指导RNA分子递送。指导RNA(gRNA)可包含可与II型失活的Cas内切核酸酶形成复合物的II型CRISPR/Cas系统的crRNA或crRNA片段和tracrRNA或tracrRNA片段，其中所述gRNA/dCas9内切核酸酶复合物可以被引导至DNA靶点，使得dCas9内切核酸酶能够识别并结合DNA靶点，从而允许由上述一种或多种异源dCas9内切核酸酶融合蛋白赋予的功能活性以改变靶基因座的基因调节。
向细胞提供gRNA的方法包括但不限于将单链或双链多核苷酸分子(例如作为使用DNA质粒表达的gRNA产生的gRNA分子，或作为体外转录的gRNA，或作为使用固相RNA合成化学品产生的合成(sgRNA))引入细胞。
对于通过引入重组DNA分子递送入细胞的指导RNA，所述方法包括将编码指导RNA(或crRNA+tracrRNA)的异源核酸片段可操作地连接至能够转录指导RNA(crRNA+tracrRNA分子)的特定启动子。靶向WUS2启动子区域的指导RNA分子C5、C4、C3、C2和C1(分别为SEQ IDNO：87-91)可以可操作地连接到玉蜀黍RNA聚合酶III启动子(SEQ ID NO：92)，所述玉蜀黍RNA聚合酶III启动子允许转录具有精确定义、未修饰的5’末端和3’末端的RNA。可替代地，可以使用能够在细胞中转录指导RNA的任何启动子。
预期使用设计为同时靶向多个基因座的指导RNA分子可以进一步改善细胞重编程剂的细胞重编程。例如，使用能够结合编码胚发生因子(多核苷酸SEQ ID NO：1至16)的靶位点和植物基因组中编码的形态发育基因的gRNA分子的方法可以改善玉蜀黍小孢子的细胞重编程，从而产生改善的父本双单倍体生产方法。
应当进一步理解，能够结合编码胚发生因子的基因座和/或编码形态发育基因的基因座的gRNA分子应包括侧翼于编码胚发生因子的基因座的区域和/或侧翼于编码形态发生因子的基因座的区域，包括基因座上游或下游高达10,000个核苷酸的近端调节区。另外，能够结合靶基因座的顺式调节区的gRNA分子也可用于本公开的细胞重编程方法中。
鉴于不同玉蜀黍品种或近交系的遗传多样性，预期不同的近交系在靶基因座处将具有不同的等位基因，其中不同的等位基因在所述基因座处具有DNA序列变异。因此，应当理解，等位基因特异性gRNA序列组合物将补充相应的DNA等位基因序列，从而在靶基因座处赋予最佳杂交。
多重基因靶向剂可用于本公开的细胞重编程方法。一种这样的多重基因靶向剂是Cas6，先前称为Csy4。Cas6可以在称为pre-crRNA的前体RNA分子(其含有生成成熟指导RNA的重复序列)内切割。包含crRNA和tracrRNA的成熟单指导RNA(gRNA)可以与dCas9蛋白缔合，形成gRNA-Cas9核糖核苷酸蛋白复合物(RNP)的可编程来源，允许将RNP募集到细胞中的多个靶标。如本文公开的用于将经处理的小孢子从小孢子细胞命运细胞重编程为胚发生细胞命运的目的细胞中的多个靶标包括但不限于编码胚发生因子基因座的靶基因座和/或编码形态发育的基因座的靶基因座。
本实例7的细胞重编程方法包括用异源蛋白细胞重编程剂处理细胞，所述异源蛋白细胞重编程剂包括与指导RNA复合的异源蛋白。异源蛋白细胞重编程剂改变细胞中编码靶位点的内源基因座处的基因调节。更具体地，异源蛋白细胞重编程剂是与引入细胞(例如分离的、野生型小孢子)的gRNA复合的dCas9翻译融合蛋白，其中经处理的小孢子从小孢子细胞命运重编程为胚发生细胞命运以获得小孢子衍生的单倍体植物。
A.使用DNA质粒粒子轰击的细胞重编程方法。
在本实例7中，使用粒子轰击将简并Cas9介导的细胞重编程剂递送到分离的玉蜀黍小孢子中。应当理解，可以使用不同的方法将简并的Cas9介导的细胞重编程剂递送到分离的玉蜀黍小孢子中。还可以理解，类似的方案可以用于处理其他植物的小孢子，包括(但不限于)：大豆、棉花、卡诺拉油菜、小麦、水稻、高粱或向日葵。单个质粒或多种质粒可用于每一粒子轰击。例如，可以共同轰击包括以下的多种质粒：1)包含简并Cas9-染色质重塑融合蛋白的表达盒的质粒，和2)包含一个或多个gRNA的表达盒的质粒，以及任选的3)包含报告基因盒的质粒。
为了测试dCAS9-染色质修饰性性翻译融合蛋白的功能活性，将不同的指导RNA的组合递送到分离的小孢子中，并监测由改善的细胞重编程引起的产雄性特征的小孢子胚发生响应。
含有与跟靶向内源WUS2的pol III启动子(SEQ ID NO：92)可操作地连接的gRNA分子C5、C4、C3、C2和C1(分别为SEQ ID NO：87-91)对应的单一gRNA表达盒(SEQ ID NO：201-206，参见表4)的DNA质粒与含有前述dCas9翻译融合蛋白，例如dCas9-CBF1A表达盒的DNA质粒共同轰击。
任选地，可以使用含有多重基因靶向剂的DNA质粒，例如含有表达盒的DNA质粒(SEQ ID NO：206)，所述表达盒包含编码以下的多核苷酸，1)玉蜀黍优化的Cas6/Csy4肽，2)能够靶向玉蜀黍内源性ODP2/BBM基因座的前体RNA分子，以及任选的3)ZsYELLOW颜色标记蛋白。
使用标准方法将本实例7中使用的DNA附接到金粒子上。粒子轰击使用PDS-1000/He系统(Bio-Rad，#166-2257)在真空下在-28英寸汞(in.Hg)下进行，其中氦气压力为650psi，并且目标距离为6cm。
任选地，可以进行改善瞬时表达的方法以提供增加的转录和表达，同时防止DNA的后续释放。一种这样的方法使用聚乙烯亚胺(PEI；西格玛公司(Sigma)#P3143)浓缩目的DNA质粒。PEI将DNA浓缩成带正电荷的聚合物DNA复合物，称为多聚物。进入细胞后，聚合物DNA复合物避免酸性溶酶体的能力导致多聚物转录活性增加。具体地，PEI的缓冲能力会导致溶酶体的渗透膨胀和破裂，从而改善细胞质中的DNA转录。在添加DNA之前，金粒子用PEI包被。
在轰击之前，将分离的小孢子置于组织培养板上，或者任选地，可以将细胞置于无菌聚碳酸酯膜(密理博西格玛公司(Millipore Sigma)，#ATTP02500)上，从而允许在轰击后转移。将被轰击的细胞在黑暗条件下于28℃孵育。14-28天后，将多细胞结构(MCS)转移到固化的289Q培养基中，并于28℃在黑暗条件下孵育直至小植株萌发。
使用包含编码以下的表达盒的DNA质粒：dCas9-CBF1A融合蛋白(SEQ ID NO：85)和靶向WUS2和BBM/ODP2基因组座位的gRNA分子PHP89615(SEQ ID NO：201)、PHP89613(SEQ IDNO：203)、PHP89611(SEQ ID NO：205)、和RV038531(SEQ ID NO：206)，如上所述使用瞬时表达DNA质粒进行粒子轰击。
用这些细胞重编程剂轰击新鲜分离的玉米小孢子改善了胚发生响应的起始，其特征在于增加的细胞增殖和响应型小孢子子集中外壁的孢粉素破裂。另外的胚发生响应进展的特征是多细胞结构(MCS)进一步发育为胚样结构(ELS)的转变。没有观察到向能够在体外萌发以产生小植株的有组织的结构的转变。
将分离的玉米小孢子培养约14天以产生多细胞结构(MCS)。用这些细胞重编程剂轰击这些MCS还表现出改善的胚发生响应的起始，其特征在于增加的细胞增殖和响应型小孢子子集中外壁的孢粉素破裂。另外的胚发生响应进展的特征在于经处理的MCS进一步发育为胚样结构(ELS)的转变，所述胚样结构然后转变为胚状体，所述胚状体是能够在体外萌发以获得小植株的有组织的结构(图4B-图4E)。
在这些实验处理之后证明了如图4A中示出的胚发生响应。当细胞用含有编码WUS2和ODP2/BBM蛋白的多核苷酸的表达载体(标记为DG，SEQ ID NO：210)或含有编码dCas9-CBF1A多核苷酸的多核苷酸的表达载体(标记为dCas9，SEQ ID NO：85)轰击时，以及当细胞用未标记的金粒子(标记的金)轰击时，与未处理的对照(NTC)处理相比，实验处理(DG、dCas9、gRNA、RNP和金)的胚样结构(ELS)生产力的比率在一些重复中在胚发生响应方面显示轻微改善。总体而言，DG、dCas9和金的这些结果表明细胞重编程响应相对不变。如图4A中所示，在gRNA和RNP实验处理后证明了胚发生响应。
如图4A中所示(标记的gRNA)，使用含有靶向WUS2基因组位点的gRNA分子的DNA载体，观察到响应于轰击(即用PHP89615(SEQ ID NO：201)、PHP89613(SEQ ID NO：203)、PHP89611(SEQ ID NO：205)、和RV038531(SEQ ID NO：206)轰击)的改善的细胞重编程。在用含有靶向WUS2基因组基因座的gRNA分子PHP89615(SEQ ID NO：201)、PHP89613(SEQ ID NO：203)和PHP89611(SEQ ID NO：205)的DNA质粒轰击新鲜分离的玉米小孢子后观察到胚发生响应。然而，该发育的胚样结构(ELS)，其长度超过0.9mm(图4C)，随着时间的推移无法维持持续的胚样发育。
在用含有编码dCas9-CBF1A多核苷酸的多核苷酸(SEQ ID NO：85)的表达载体和靶向WUS2和BBM基因组位点的gRNA分子共同轰击(即用PHP89615(SEQ ID NO：201)、PHP89613(SEQ ID NO：203)、PHP89611(SEQ ID NO：205)、和RV038531(SEQ ID NO：206)共同轰击)细胞后，还观察到了改善的小孢子胚发生响应。如图4A中所示(标记的RNP)是包含全功能dCas9核糖核蛋白复合物处理(其设计为靶向WUS2和BBM/ODP2基因组位点)的瞬时表达处理。在轰击14天内观察到响应于RNP处理的胚状体发育速率，如图4B中所示，表明改善的细胞重编程响应。
当轰击衍生自培养约14天的玉米小孢子的多细胞结构时，与使用新鲜分离的玉米小孢子观察到的响应相比，观察到ELS生产力增加了约2倍。
预期将PEI-DNA复合物递送到培养约14天的玉米小孢子中将导致改善的小孢子胚发生响应。
进行了另外的实验以评估细胞重编程响应并进一步表征对使用合成的gRNA分子(具有或不具有dCas9-CBF1A多核苷酸(SEQ ID NO：85))轰击的小孢子胚发生响应。
B.使用DNA质粒和sgRNA粒子共同轰击的细胞重编程方法。
针对WUS2、ODP2/BBM和LEC1的靶基因座(分别为SEQ ID NO：207-209)设计并合成了sgRNA分子。如上所述，这些sgRNA分子中的每一个都附接到金粒子上并被轰击到细胞中。相对于未处理的小孢子细胞，在用WUS2和ODP2/BBM sgRNA分子轰击的小孢子中观察到改善的细胞重编程响应(图4D)。在含有dCas9-CBF1A多核苷酸的瞬时表达载体不存在的情况下将sgRNA单独轰击到小孢子中。这些结果显示，将细胞与单独的sgRNA接触改善了细胞重编程。这些结果显示，RNA(包括但不限于作为来自遗传响应元件的链特异性转录物产生的RNA)作为关键功能开关，通过使DNA响应元件充当增强子或使用相反链RNA分子时的阻遏子来促进植物细胞中的细胞重编程。C.使用核糖核苷酸蛋白复合物的细胞重编程方法。
粒子轰击用于将RNP复合的细胞重编程剂递送至植物细胞。
可以使用蛋白质表达系统来表达简并Cas9翻译融合蛋白(例如如上所述通过将编码如表9中所述的dCas9蛋白融合物的多核苷酸序列转移到蛋白质表达载体中，例如pDAB135006载体(SEQ ID NO：60))。可以进行标准蛋白质表达方法以表达然后纯化重组蛋白，例如表9中的dCas9融合蛋白(SEQ ID NO：78-82)，任选地与dCas9转录激活物(例如表达自编码与SEQ ID NO：86融合的SEQ ID NO：84的多核苷酸的多肽)组合使用。可以使用其他蛋白质表达载体和蛋白质表达系统。
dCas9-CBF1a多肽由编码与His-MBP-标签融合的SEQ ID NO：84和SEQ ID NO：86的蛋白质表达盒表达并使用大肠杆菌(E.coli)表达系统纯化。首先，将表达构建体转化到大肠杆菌BL21(DE3)或ArcticExpress(DE3)菌株中，并在补充有选择剂(例如氨苄青霉素(100μg/ml))的LB肉汤中培养培养物。培养至OD600为0.5后，温度降至16℃，并用IPTG(0.5mM)或阿拉伯糖(0.2％(w/v))诱导表达。16小时后，将细胞沉淀并重新悬浮在上样缓冲液(20Tris-HCl，pH 8.0，25℃，1.5M NaCl，5mM 2-巯基乙醇，10mM咪唑，2mM PMSF，5％(v/v)甘油)中并通过超声破碎。通过离心去除细胞碎片。将上清液加载到带Ni2+电荷的HiTrap螯合HP柱(通用医疗健康公司(GE Healthcare))上，并在20mM Tris-HCl(pH 8.0，25℃)、0.5MNaCl、5mM 2-巯基乙醇缓冲液中以增加咪唑浓度(从10到500mM)的线性梯度洗脱。将含有dCas9-CBF1a多肽的级分合并，并且随后装载到HiTrap heparin HP柱(通用医疗健康公司)上，使用线性递增浓度梯度的NaCl(从0.1M至1.5M)用于洗脱。将含有dCas9-CBF1a蛋白的下一个级分池化，并通过在4℃下与TEV蛋白酶孵育过夜来切割标签。为了去除切割的His-MBP标签和TEV蛋白酶，将反应混合物加载到HiTrap肝素HP 5柱(通用医疗健康公司)上，使用增加NaCl浓度(从0.1到1.5M)的线性梯度进行洗脱。接下来，将来自HiTrap柱的洗脱液加载到MBPTrap柱(通用医疗健康公司)上，并收集流过的dCas9-CBF1a多肽。然后将收集的级分在20mM Tris-HCl(25℃、pH 8.0)、500mM NaCl、2mM DTT和50％(v/v)甘油中透析，并储存在-20℃直至使用。
简而言之，RNP复合的细胞重编程剂的RNP装配是通过将Riboguard RNA酶抑制剂(1μL；Lucigen公司(Lucigen)#RG90925)、10X反应缓冲液3.1(2.0μL；新英格兰生物实验室公司(New England Biolabs)#B7200S)、1μL的dCas9-CBF1a融合蛋白来(5μg蛋白质/μL)、用于靶向基因组WUS2、ODP2/BBM和LEC1基因座的gRNA分子(1.5μg/gRNA)(分别为SEQ ID NO：207-209)和无核酸酶水(赛默飞世尔科技(Thermo Fisher scientific)#AM9932)组合到20μL终体积、无RNA酶的微量离心管中进行的。将RNP装配混合物于室温孵育约15分钟，然后将管置于冰上。将预混合的RNP装配与经超声处理的金粒子(30μL；6μg/μl)组合并轻轻混合，然后在冰上孵育约10分钟。
通过以下装载载体盘：将RNP复合的细胞重编程剂/金悬浮液以10,000rpm离心60秒，去除上清液，并通过短时间超声处理(约10秒)伴随吸移至充分混合将沉淀重悬在50μl无RNA酶的H2O中，每个盘分配10μL体积。然后如前所述进行粒子轰击。
另外，制备RNP复合的细胞重编程剂，过滤除菌，并在室温孵育约15分钟，并且然后直接添加到玉蜀黍小孢子细胞(新鲜分离的小孢子或用70μm细胞过滤器(赛默飞世尔科技，#22-363-548)过滤并洗涤的培养14天的小孢子)中。在将细胞与RNP复合的细胞重编程剂接触并孵育后，将经处理的细胞转移到组织培养板中，用如上所述的未标记的超声处理的金粒子进行轰击。
小孢子细胞对使用本文描述的DNA质粒的细胞重编程的改善的小孢子胚发生响应显示在图4A-图4E中。鉴于那些结果，预期向小孢子衍生的细胞提供RNP复合的细胞重编程剂将通过改变细胞的初始细胞命运成为胚发生细胞命运以提供小孢子衍生的胚状体来改善细胞重编程。当该衍生自小孢子的胚状体用染色体加倍剂处理时，预期将产生玉蜀黍父本双单倍体植物。
D.使用组合dCas9技术作为细胞重编程剂的细胞重编程方法
评估了细胞重编程剂组合的细胞重编程效果。用包含dCas9转录激活物和dCas9组蛋白乙酰转移酶融合蛋白的质粒组合共同轰击细胞，并评估细胞重编程效果。这些细胞重编程剂的共同轰击改变了基因组靶位点处染色质的翻译后修饰，同时促进了基因组靶位点处的转录上调。此类在小孢子衍生细胞中赋予细胞重编程的组合活性有望进一步改善产雄性特征的、小孢子胚发生响应，从而改善顽拗性玉蜀黍基因型中父本双单倍体的产生。
根据上述方法，使用以下质粒：1)第一DNA质粒，dCas9-CBF1A质粒，其具有编码dCas9-CBF1A翻译融合蛋白的多核苷酸(编码多肽SEQ ID NO：86的多核苷酸SEQ ID NO：85)(第一转录上调处理)；2)第二DNA质粒，dCas9-VP64质粒，其具有与VP64结构域的转录激活物组分(编码多肽SEQ ID NO：245的多核苷酸SEQ ID NO：244)融合的编码dCas9-VP64翻译融合蛋白的多核苷酸(dCas9序列(编码多肽SEQ ID NO：84的多核苷酸SEQ ID NO：83))(第二转录上调处理)；和3)第三DNA质粒，dCas9-HAT2质粒，其具有编码dCas9组蛋白乙酰转移酶2翻译融合蛋白的多核苷酸(SEQ ID NO：76)(染色质修饰处理(通过与活性基因表达相关的组蛋白乙酰化修饰水平的提高来富集靶基因座))。
在第一轰击载体盘上使用以下处理：1)轰击dCas9-CBF1A质粒的第一处理；2)轰击dCas9-VP64质粒的第二处理；3)共同轰击dCas9-CBF1A质粒和dCas9-HAT2质粒的第三处理；4)共同轰击dCas9-VP64质粒和dCas9-HAT2质粒的第四处理；和5)用作对照的第五处理，其未接受轰击处理。处理1-4中的每一个进一步包含在第二轰击载体盘上，为用于轰击的金粒子提供等量的DNA质粒PHP89613(SEQ ID NO：203)、PHP89611(SEQ ID NO：205)、和RV038531(SEQ ID NO：206)以靶向WUS2和ODP2/BBM基因组靶位点。如上所述，使用70微米的细胞过滤器收集于28℃在黑暗条件下培养14天的小孢子衍生细胞，洗涤，并转移到组织培养基板上。如上所述，用两个载体盘轰击14天龄细胞的每个平板。然后将平板在黑暗条件下于28℃培养8天，然后相对于无处理对照对每次处理的响应细胞的存在进行评分。
与未处理对照相比，来自仅使用dCas9-CBF1A质粒的第一处理的经处理的细胞在响应细胞方面表现出71％的改善。与未处理对照相比，来自仅使用dCas9-VP64的第二处理的经处理的细胞在响应细胞方面表现出8％的改善。来自使用组合的dCas9-CBF1A质粒和dCas9-HAT2质粒的第三处理的经处理的细胞产生的响应细胞等于无处理对照中的响应细胞。相对于无处理对照，来自使用组合的dCas9-VP64质粒和dCas9-HAT2质粒的第四处理的经处理的细胞表现出50％改善的响应细胞。
这些结果表明，来自顽拗性基因型的玉蜀黍小孢子培养物的组合处理可能需要优化所谓的“合成转录因子”和此处使用的dCas9翻译融合蛋白的组合，以提供小孢子衍生的胚状体。预期包含dCas9组蛋白去甲基化酶、dCas9组蛋白乙酰转移酶和dCas9转录激活物或其任何组合的质粒组合将进一步在具有初始、非胚发生调节状态的植物细胞中改善朝向胚发生细胞命运的细胞重编程。还预期某些表现出不同程度的细胞重编程(例如响应雄穗预处理或体外细胞培养期间引发的小孢子胚发生响应)的基因型和/或细胞以依赖于细胞命运重编程的时间或持续时间的方式可能需要不同的细胞重编程剂活性。
还预期响应于用gRNA分子的组合处理细胞来实现改善的细胞重编程。例如，其中不同的gRNA分子能够将dCas9翻译融合蛋白活性募集到多个靶基因座，例如编码表6中描述的胚发生因子和/或形态发生基因的基因座。
预期用一个具有多个表达盒的多核苷酸(例如包含编码dCas9-转录激活物翻译融合蛋白的第一表达盒的多核苷酸、编码dCas9组蛋白乙酰转移酶翻译融合蛋白的第二表达盒和能够提供一个或多个gRNA分子的第三表达盒)的DNA质粒轰击和/或接触小孢子，将提供细胞重编程的进一步改善。与每个经处理的细胞可以成功地与多个DNA质粒(其中每个质粒具有一种活性)接触的可能性相比，预期该改善将导致每个经处理的细胞与一个具有三种活性的质粒接触的频率增加。
E.获得小孢子衍生的双单倍体的染色体加倍方法
对于该实例7的任何一种方法，可以将胚发生型小孢子衍生的细胞(其萌发成植物)转移到含有染色体加倍(或有丝分裂抑制剂)剂的培养基中以产生双单倍体植物。例如，可以使用浓度为0.1-1.0g/ml的秋水仙碱进行处理，所述处理通过干扰微管组织而使分裂细胞的有丝分裂停滞在中期。
实例8：使用细胞重编程剂的改善的细胞摄取的父本双单倍体方法
本公开的方法通过使植物细胞与包含如上所述融合至细胞穿透肽(CPP)基序的dCAS9翻译融合蛋白的异源蛋白接触来提高玉蜀黍父本单倍体植物生产的功效。使用上述蛋白质表达方法纯化融合蛋白并如上所述将所述融合蛋白募集至靶基因座。
为了改善本文公开的细胞重编程肽的细胞递送和/或细胞摄取，本公开的方法进一步包括使用含有细胞穿透肽(CPP)(通常在蛋白质的N末端或C末端)的翻译融合肽。可用于本公开的细胞重编程方法用于改善细胞重编程多肽向植物细胞(例如分离的小孢子)的递送和/或摄取的细胞穿透肽包括但不限于，CPP(例如玉蜀黍knotted1 CPP(ZM-KNT1 CPP；SEQ ID NO：48和SEQ ID NO：49))、粟酒酵母TP10 CPP(SP-TP10 CPP；SEQ ID NO：50和SEQID NO：51)、白色念珠菌Zebra CPP(CA-Zebra CPP；SEQ ID NO：52和SEQ ID NO：53)、PEP1CPP(PEP1 CPP；SEQ ID NO：54和SEQ ID NO：55)、HIV-1 TAT CPP(HIV-1 TAT CPP；SEQ IDNO：56和SEQ ID NO：57)、以及γ-玉米醇溶蛋白细胞穿透肽(GZ CPP；SEQ ID NO：58和SEQID NO：59)。
上述任何细胞重编程组分的递送通过使用CPP介导的蛋白质递送来改善，因此是一种潜在地减轻与上述粒子轰击方法相关的任何风险的替代方法。预期在本公开的细胞重编程方法中使用CCP将通过改变非胚发生野生型小孢子的初始细胞命运来改善细胞重编程。例如，通过向具有初始非胚发生调节状态的小孢子提供CPP-dCas9组蛋白去甲基化酶、CPP-dCas9组蛋白乙酰转移酶、CPP-dCas9转录激活物、或其任何组合，预期将改善细胞的细胞重编程，从而获得非遗传工程化的小孢子衍生的植物。可以分析此类经处理的小孢子细胞的形态变化，并且可以使用标准方法在体外培养此类胚发生细胞。
还预期使用gRNA分子的组合可以实现改善的细胞重编程，其中每个gRNA导致CPP-dCas9翻译融合蛋白与独特的、独立的基因组靶位点(例如与表6中所述的DNA序列和/或形态发生基因序列具有序列同源性的内源基因座)结合。预期这种与多个基因座的同时结合导致改变多个靶基因座的基因调节状态，从而提高小孢子衍生的单倍体植物(特别是对于优良玉蜀黍近交株)的获得，否则其通常是无响应和非胚发生的。当这样的细胞用染色体加倍剂处理时，预期会导致产生非基因工程化的玉蜀黍双单倍体植物。
实例9：使用胚发生因子提高玉蜀黍父本双单倍体生产力的方法
以下实验证明了含有化学诱导型表达盒(其含有表6中所述的胚发生因子和/或形态发育基因)的T-DNA的递送，从而改善了小孢子胚发生。
比较了两个质粒RV028329(胚发生对照质粒)和RV028330(实验质粒)。两种质粒都含有表达WUS和ODP2肽的表达盒，所述表达盒可操作地连接到化学诱导型的调节元件。这些质粒都含有具有以下主要特征元件的相同表达盒；(a)WUSCHEL表达盒；TET OP1+NOS PRO(ALT1)+ZM-WUS2+PINII TERM(SEQ ID NO：93)，(b)ODP2表达盒；UBI1ZM PRO(TR2)+(3X)TETOP1+UBI1ZM 5UTR+SB-UBI INTRON1+ZM-ODP2+PINII TERM(SEQ ID NO：94)，(c)磺酰脲响应性阻遏物表达盒；UBI1ZM PRO+UBI1ZM 5UTR+UBI1ZM INTRON1+ESR(L15-20)+PINII TERM(SEQ ID NO：95)，(d)可选择标记表达盒；SB-ALS PRO+ZM-ALS(HRA)(TR1)+PINII TERM(SEQID NO：96)，和(e)含有侧翼于WUS2/ODP2共表达盒(SEQ ID NO：97)的CRE/lox重组系统的表达盒，其中CRE可操作地连接到启动子，允许在转化后切除WUS2/ODP2/CRE盒，从而允许仅含有表达盒(a)至(d)的转基因植物再生。
使用RV028330(实验质粒)转化的植物将另外含有编码基因dpzm07g031470.1.1(本文称为(ZM-CYCD2)，即CAMV35S PRO+(3X)TET OP1+OMEGA 5UTR+ADH1 INTRON1+ZM-CYCD2+PINII TERM(SEQ ID NO：98))的编码序列的表达盒。
两种质粒都包括作为磺酰脲响应性阻遏蛋白(其与由包含磺酰脲类化合物的配体控制的操纵基因序列结合)的多肽。在没有磺酰脲配体的情况下，阻遏蛋白与操纵基因特异性结合。在向表达磺酰脲响应性阻遏蛋白的转基因细胞提供磺酰脲类化合物后，磺酰脲与阻遏蛋白结合形成复合物，所述复合物修饰阻遏蛋白与操纵基因的结合特性，并导致操纵基因序列的去阻遏。以这种方式，“化学开关介导的表达”系统用于测试表6中每个胚发生因子(例如包含SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16的多核苷酸)的作用。可以将每个多核苷酸转移到如SEQ ID NO：98所示的表达盒中，其中所使用的特定胚发生因子对应于胚发生因子dpzm07g031470.1.1(ZM-CYCD2)(多核苷酸SEQ ID NO：5；多肽SEQID NO：21)。
如上所述通过农杆菌介导的转化产生含有质粒RV028329或RV028330的转基因植物。在农杆菌介导的转化、体细胞胚成熟和再生后，通过qPCR分析T0植物以鉴定含有任一质粒的单拷贝、半合子个体。种植此类植物并使用野生型花粉使长须受精以产生种子，其中大约一半的种子是半合子T1种子，一半是野生型T1种子。
如上所述，使用分离的小孢子进行T0雄穗的初始事件表征。为了诱导形态发育基因表达，培养的小孢子细胞用胺苯磺隆(例如0.1至1ppm)处理。初步结果表明，使用表6中公开的胚发生因子使玉蜀黍父本加倍单倍体生产力，并且在响应于胺苯磺隆处理的基因激活后，改善了形态发生基因。
鉴于每个独特的T0事件一个雄穗的样品量，不可能进一步表征这一代的胚发生效应。将使用后代进一步评估响应于胚发生因子与形态发育基因的共表达的小孢子胚发生的改善。预期将表6中公开的任何胚发生因子与形态发生基因共表达将进一步提高经处理的小孢子中小孢子胚发生响应的频率。还预期此类改善的响应可包括改善响应细胞的数量或数目，以及改善小孢子衍生的胚的质量，包括但不限于改善的细胞组织、形态学胚发生发育和/或可用于获得可育的双单倍体植物的小植株再生。
实例10：使用改善的植物原位细胞重编程方法的父本双单倍体方法
以下实验证明与含有以下的质粒接触可以改善非转基因的、小孢子衍生的单倍体植物的获得：i)编码表6中公开的胚发生因子的表达盒、ii)形态发育基因和iii)及其组合。
在本公开的细胞重编程方法中，质粒被递送并稳定整合到植物细胞的DNA中。所使用的整合DNA包含设计为在小孢子分离之前改善植物原位小孢子胚发生的表达盒。
对于这些实验，测试了两种质粒设计。第一质粒含有表达盒，所述表达盒含有编码Ms44信号肽序列(SEQ ID NO：320)的多核苷酸(SEQ ID NO：319)融合至编码与糖皮质激素受体(GR)(SEQ ID NO 364)融合的WUSCHEL多肽的多核苷酸(SEQ ID NO：363)和Ms44终止子序列(SEQ ID NO：327)，可操作地连接到玉蜀黍Ms44启动子(SEQ ID NO：318)。
第二质粒含有表达盒，所述表达盒含有编码Ms44信号肽序列(SEQ ID NO：320)的多核苷酸(SEQ ID NO：319)融合至编码与糖皮质激素受体(GR)(SEQ ID NO：364)融合的WUSCHEL多肽的多核苷酸(SEQ ID NO：363)；多顺反子接头(“T2A”；编码SEQ ID NO：102的SEQ ID NO：101)；包含编码胚发生因子的DNA序列的翻译融合蛋白，所述DNA序列选自表6中所示DNA序列的任一种；由具有使用以下细胞穿透肽中任一种的C末端融合物的SEQ ID NO：1-16组成，所述细胞穿透肽包括但不限于：玉蜀黍knotted1 CPP(ZM-KNT1 CPP；编码SEQ IDNO：49的SEQ ID NO：48)、粟酒酵母TP10 CPP(SP-TP10 CPP；编码SEQ ID NO：51的SEQ IDNO：50)、白色念珠菌Zebra CPP(CA-Zebra CPP；编码SEQ ID NO：53的SEQ ID NO：52)、PEP1CPP(PEP1 CPP；编码SEQ ID NO：55的SEQ ID NO：54)、HIV-1 TAT CPP(HIV-1 TAT CPP；编码SEQ ID NO：57的SEQ ID NO：56)、以及γ-玉米醇溶蛋白细胞穿透肽(GZ CPP；编码SEQ IDNO：59的SEQ ID NO：58)(参见US 8581036，通过援引以其全文并入本文)；以及Ms44终止子序列(SEQ ID NO：327)，可操作地连接到玉蜀黍Ms44启动子(“ZM-Ms44 PRO”；SEQ ID NO：318)。
每个构建体促进蛋白质表达和表达的蛋白质从绒毡层细胞到花药的子房室的转运，从而允许递送和摄取到小孢子细胞中。在本公开的细胞重编程方法中，在将WUSCHEL-GR融合蛋白摄取到小孢子中后，在体外组织培养期间通过外部应用动物激素类似物将蛋白质有条件地定位于细胞核，从而导致细胞重编程的受控诱导。对于使用含有WUSCHEL-GR融合蛋白和胚发生因子CPP融合蛋白的第二质粒的方法，通过将动物激素类似物外部应用到体外组织培养物中来将WUSCHEL-GR融合蛋白有条件地定位于细胞核，而胚发生因子CPP融合蛋白可以是组成型活性的。
通过杂交两个近交亲本系产生F1杂种胚，其中一个亲本是母本(穗供体)，第二个亲本是父本(花粉供体)。使用标准方法，两种植物品种可以以防止任何异型杂交以产生F1杂种胚的方式进行杂交受精。当两个亲本在所有全基因组基因座处均是纯合的时，预期所得胚在所有全基因组基因座处将是杂合的。本公开的方法收集未成熟的F1杂交胚用于如下所述的处理。
在当前实例中，使用上述两种质粒之一转化未成熟的F1杂种胚，其中每个质粒被掺入农杆菌转化载体中。使用标准方案进行农杆菌介导的转化。可替代地，可以使用基因枪(biolistic)转化方法或任何其他标准方法将转化载体引入植物细胞中。
每个构建体转化和选择半合的经转化的植物后，植物生长、分阶段，并且当花药含有单核小孢子时，收获雄穗。优选地，雄穗可以在大约8℃至10℃用低温应激处理预处理14天。从T0半合雄穗中分离出小孢子，并将细胞在9％蔗糖诱导培养基中培养。
可替代地，可以转化、再生野生型胚并且可以繁殖单拷贝半合子植物以允许获得存在纯合转基因构建体的后代。这样的纯合品系可用作与第二品系的遗传杂交中的亲本，以产生半合F1杂交体。
无论如上所述直接转化未成熟的F1杂种胚，还是在遗传杂交中优先创建和使用纯合转基因品系，本公开的方法都提供了来自转化亲本的转基因拷贝，所述拷贝可用于表达细胞重编程剂。
一种这样的药剂是WUS-GR翻译融合蛋白，其活性取决于糖皮质激素(例如合成类固醇激素地塞米松)的存在。在没有地塞米松的情况下，WUS-GR翻译融合蛋白是失活的并位于细胞质中。在地塞米松存在的情况下，激素结合允许WUS-GR翻译融合蛋白进入细胞核，从而允许融合蛋白激活小孢子胚发生。
在当前实例中，通过将WUS-GR翻译融合蛋白与含有如表6所述的可用于细胞重编程的胚发生因子的表达盒赋予的蛋白活性相组合，例如通过表达胚发生因子-CPP翻译融合蛋白进一步改善了活化胚发生。因此，该方法使得经处理的细胞核中一种或多种细胞重编程剂的同时活性成为可能。细胞核中的活性允许响应于至少两种细胞重编程剂的同时活性的细胞重编程。
将通过本文公开的任何方法产生的单倍体小孢子与一定量的染色体加倍剂接触，以促进染色体加倍并且从经处理的单倍体小孢子再生纯合二倍体植物。可以在小孢子胚发生、胚成熟或植物再生之前、期间或之后，使单倍体小孢子细胞与加倍剂接触。各种化学品，例如表2中所列的那些，具有染色体加倍特性，例如浓度为0.1-1.0g/ml的秋水仙碱。
预期细胞重编程效率将响应于使用细胞重编程剂的植物原位表达的方法而提高。特别地，预期使用第二质粒将进一步提高细胞重编程效率，其中相对于形态发生基因翻译融合蛋白(例如WUS-GR翻译融合蛋白)的单一活性，分离的小孢子在植物原位与形态发生基因翻译融合蛋白(例如WUS-GR翻译融合蛋白)和胚发生因子-CPP翻译融合蛋白(例如表6中公开的胚发生因子中的任何一种)接触，向细胞核提供两种细胞重编程剂的同时活性。
还预期形态发育基因的组合可以与一种或可能多种胚发生因子共表达，其中与使用较少细胞重编程剂的植物原位细胞重编程方法相比，当使用多种胚发生因子时响应得到进一步改善。
实例11：提高单倍体诱导系的母本双单倍体诱导频率的方法
本公开的方法涉及通过转化诱导系以使其表达能够改善母本单倍体胚中胚发生的细胞编程剂来改善单倍体诱导物系。所转化的单倍体诱导系被用作两种植物之间杂交中的亲本。在用来自转化的单倍体诱导物系的花粉授粉期间，通过在受精之前、期间或之后表达来自父本等位基因的细胞编程剂以及对胚囊细胞特别是卵细胞进行授粉来表达细胞编程剂以提高母本单倍体的产生。胚囊细胞(特别是卵细胞)中或附近的细胞重编程剂的活性刺激胚发生，从而提高母本单倍体的产生。这些实验证明使用母本(产生雌性特征的)双单倍体生产方法提高了产生玉蜀黍双单倍体的生产力。
使用母本(产生雌性特征的)双单倍体生产的玉蜀黍近交系开发方法用来自所谓的“单倍体诱导”系的花粉使植物(例如第一代杂交的植物或其后代)的雌穗受精。相对于遗传母本和父本基因组的拷贝，通过用单倍体诱导株(供体花粉)的花粉对雌花(供体雌穗)授粉进行单倍体诱导杂交导致仅含有单倍体母本基因组的胚珠水平升高。这样的母本单倍体胚是减数分裂的产物，每个母本胚珠都是独特的减数分裂重组单倍体基因组。可以使用包括染色体加倍处理的体外组织培养方法分离和处理这样的未成熟的母本单倍体胚，以产生母本双单倍体重组群体。
从单倍体诱导杂交中分离的母本单倍体胚可能无法再生为可育的双单倍体植物。关于增加从诱导的单倍体胚再生可育、双单倍体植物的频率，本公开的方法提高了适用于玉蜀黍中母本配子双单倍体的双单倍体植物的生产，包括增加诱导的单倍体胚数量的方法，以及提高诱导的单倍体胚质量的方法。
本公开的方法还提供向单倍体诱导杂交的母本亲本的植物原位蛋白质递送方法，所述方法包括转化玉蜀黍单倍体诱导物系以稳定整合和表达异源表达盒，当该转化的单倍体诱导物系与母本亲本杂交时提供改善的细胞重编程。因此，本公开的方法可以提高母本单倍体胚的数量或数目，以及提高母本单倍体胚的质量，包括但不限于体外生长的改善和/或对染色体加倍方法(如秋水仙碱处理)的响应的改善。
在这些实验中，比较了两种质粒。在本实验中，使用了质粒#1(对照质粒)，所述质粒含有具有以下特征元件的表达盒；(a)UBI1ZM PRO+UBI1ZM 5UTR+UBI1ZM INTRON1+DS-RED2+PINII TERM(SEQ ID NO：99)和(b)含有侧翼于WUS2/ODP2共表达盒(SEQ ID NO：97)的CRE/lox重组系统的表达盒，其中CRE可操作地连接到启动子，允许在转化后切除WUS2/ODP2/CRE盒，从而允许仅含有对照质粒(质粒#1)的表达盒(a)的转基因植物再生。使用了质粒#2(实验质粒)，所述质粒含有具有以下特征元件的表达盒；(a)UBI1ZM PRO+UBI1ZM 5UTR+UBI1ZM INTRON1+DS-RED2+PINII TERM(SEQ ID NO：99)，(b)Pv-EGG CELL PRO(TR1)+ZM-CYCD2+PINII TERM(SEQ ID NO：100)，其中该表达盒含有胚发生因子的编码序列dpzm07g031470.1.1.(SEQ ID：5)，以及(c)含有侧翼于WUS2/ODP2共表达盒(SEQ ID NO：97)的CRE/lox重组系统的表达盒，其中CRE可操作地连接到启动子，允许在转化后切除WUS2/ODP2/CRE盒，从而允许仅含有实验质粒(质粒#2)的表达盒(a)和(b)的转基因植物再生。
可替代地，本公开的方法可以使用多基因共表达的策略，所述策略使用在真核细胞翻译过程中介导多肽的“切割”的“自切割”2A肽，例如多顺反子接头“T2A”(编码SEQ IDNO：102的SEQ ID NO：101)。含有表6中显示的胚发生因子中的任何一种的多核苷酸的组合(SEQ ID NO：1-16)(其中一个多核苷酸使用T2A多顺反子接头序列与第二多核苷酸融合)可用于本公开的细胞重编程方法。本公开的细胞重编程方法还可以包括包含表6中所示的(SEQ ID NO：1-16)多于任何两种选定胚发生因子的组合的多核苷酸，其中T2A多顺反子接头序列插入在每个编码序列之间。
如上所示，还证明当编码胚发生因子dpzm07g031470.1.1的DNA SEQ ID NO：5与周期蛋白依赖性激酶(例如CDKA1或CDKA3)共表达时，实现了细胞重编程的改善的功效。当这些组合在WUS或BBM/ODP2蛋白情况下表达时，以上显示了进一步的改善，从而证明使用胚发生因子与形态发育基因的组合可以实现改善的细胞重编程。从一个表达盒表达多种蛋白质的细胞重编程方法可用于本公开的方法，例如，包括但不限于表10中所示的示例性序列的组合。
表10.用于改善母本双单倍体诱导的细胞重编程因子组合
Figure BDA0003306116500001451
本公开的方法使用具有表达盒的细胞重编程质粒，所述表达盒具有包含dCas9翻译融合蛋白细胞重编程因子(例如表9中所示的融合蛋白(SEQ ID NO：73-77))的多核苷酸，和一种或多种gRNA(例如本文所述的gRNA)，以实现细胞重编程。表达盒可以与组织偏好性启动子或诱导型启动子可操作地连接。
对于这些实验，转化玉蜀黍植物或任何单倍体诱导物系，所述玉蜀黍植物选自和/或衍生自由以下组成的组：Stock 6、RWK、RWS、UH400、AX5707RS和NP2222-matl。单倍体诱导物系可以含有荧光报告表达构建体(例如绿色、黄色或红色荧光报告基因)，所述荧光报告表达构建体允许在早期发育阶段的胚中进行荧光检测，和/或花青素基因的等位基因(例如R1-scm等位基因)，所述花青素基因的等位基因在早期发育阶段的胚中表达。总之，这两种标记基因允许分别基于这些报告基因产物的存在或不存在来鉴定二倍体和单倍体胚。
使用上述方法产生转化的单倍体诱导物植物，包括包含表达盒的转化方法，所述表达盒含有侧翼于WUS2/ODP2共表达盒(SEQ ID NO：97)的CRE/lox重组系统，其中CRE可操作地连接到启动子，允许在转化后切除WUS2/ODP2/CRE盒，从而允许使用示例性序列再生仅含有表达盒的转基因植物，所述示例性序列包括但不限于表10中所述的SEQ ID NO：103-110的多核苷酸，所述多核苷酸预期将提供卵细胞胚发生蛋白活性。可用于向卵细胞提供胚发生蛋白活性的典型启动子包括玉蜀黍油质蛋白启动子或玉蜀黍LEC1启动子，或其他卵细胞启动子，例如Pv-EGG CELL PRO(TR1)启动子(参见表10)。
在当前实例中，含有表10中描述的表达盒的转基因植物被再生，并通过qPCR分析T0植物，以鉴定含有每种质粒的单拷贝、半合子个体。被确定为单拷贝、半合子植物的T0植物被繁殖并用作单倍体诱导杂交的单倍体诱导物。使这些转化的单拷贝、半合的诱导植物生长并用作花粉供体来使雌性植物的供体雌穗受精。
在抽丝前将母本植物的穗进行芽套袋，以避免任何外来花粉污染。用从转化的父本植物(转化的单倍体诱导物植物)花药中收集的有活力的花粉粒对母本植物的植物上的穗丝进行授粉。在授粉后约9-14天，收获未成熟的穗。将穗在30％高乐氏漂白剂加上0.5％微量洗涤剂中表面消毒20分钟，并用无菌水冲洗两次。
基于诱导系中一种或多种可见标记基因的鉴定来分离单倍体胚。例如，如果诱导物含有与启动子可操作地连接的荧光报告基因或花青素生物合成基因，该启动子允许基因在早期发育阶段在胚中表达。通过使用这种可见标记，可以从具有DS-RED2或花青素表达的二倍体胚中鉴定没有DS-RED2或花青素表达的单倍体胚。
使用解剖刀分离单倍体玉蜀黍胚并置于含有秋水仙碱的培养基上。大约24小时后，将胚转移到不含秋水仙碱的培养基中，并且置于黑暗中。大约6-10天后，可以将每一小植株转移到光培养室。大约7-14天后，将小植株转移到含有盆栽土壤的平地上，并且在生长室中生长1周，并随后在温室中生长另外的1-2周，然后转移到盆中并生长至成熟。这些植物将是双单倍体植物的异质群体。这些可育的双单倍体玉蜀黍植物可以通过自体受精或异型杂交进行繁殖，并对后代进行评估以用于育种目的。
实现本公开的方法的可替代方式是将每个表达盒可操作地连接至在小孢子和/或花粉发育期间有活性的启动子调节元件。例如，玉蜀黍启动子PG47(SEQ ID NO：118)或PG67是在小孢子和/或花粉发育期间有活性的启动子。以这种方式，使用包括但不限于表10中描述的SEQ ID NO：103-110的多核苷酸的示例性序列的表达盒可以直接向卵细胞提供胚发生蛋白活性。
当使用单倍体诱导物或用质粒#1(仅DS-RED2表达)转化的单倍体诱导物时，预期在授粉后每个雌穗中的单倍体胚将以约5％-12％的频率产生。
当使用含有多核苷酸的质粒#2时(所述多核苷酸包含表6中胚发生因子(SEQ IDNO：1-16；分别编码多肽SEQ ID NO：17-32)中的任何一种)，预期单倍体诱导频率提高。另外，鉴于由胚发生因子dpzm07g031470.1.1(多核苷酸SEQ ID NO：5，多肽SEQ ID NO：21)赋予的胚发生水平提高，当与周期蛋白依赖性激酶(CDKA1或CDKA3)共表达时(参见图2A和图2B)，预期在本方法中表达这样的组合将改善单倍体诱导。例如，相对于质粒#1，表达形态发育基因预期导致改善的结果，表达形态发育基因和周期蛋白预期导致进一步改善的结果，同时表达形态发育基因和周期蛋白和周期蛋白依赖性激酶预期导致又进一步改善的结果。
还预期向卵囊细胞(例如卵细胞)提供包含与一种或多种gRNA复合的dCas9翻译融合蛋白的dCas9激活物RNP的活性(能够表达编码形态发育基因和/或新的胚发生因子的基因座)可以改善母本单倍体诱导。
进一步预期表达的胚发生因子的组合可导致单倍体诱导水平的增加，其中活性作为由多核苷酸表达的蛋白质提供或由dCas9介导的包含母本单倍体基因组的DNA的上调产生。表达的胚发生因子的此类组合可能与形态发育基因共表达或者可能不与形态发育基因共表达。预期所述方法还可导致体外单倍体胚培养响应的改善，包括再生双单倍体植物繁殖成功的改善。
本文描述的方法可以使用与在雄配子中具有活性的启动子调节元件可操作地连接的表达盒向卵细胞提供直接的蛋白质递送。此类方法也预期导致单倍体诱导频率的提高和/或繁殖成功的提高。
总之，这些方法可以增强母本单倍体胚的数量和/或质量。
实例12：提高母本单倍体诱导的方法
本公开的方法通过转化非单倍体诱导物系以使其表达能够改善母本单倍体胚中胚发生的细胞编程剂来提供单倍体诱导物系。转化系被用作两种植物之间杂交中的亲本。在雌性配子发生过程中，发生细胞编程剂的表达并且细胞重编程剂在胚囊细胞(特别是卵细胞)中或附近的活性刺激胚发生。胚乳形成(假受精或假受精胚乳)可能需要用野生型花粉受精。这些实验证明使用母本(产生雌性特征的)双单倍体生产方法提高了产生玉蜀黍双单倍体的生产。
提供了在雌性配子发育过程中使用编码AP2转录因子与其他蛋白质活性组合的表达盒来进一步改善单倍体诱导的方法。
对于这种AP2结构域转录因子方法，采用如上所述农杆菌介导的稳定植物转化。例如，引入植物的ODP2/BBM核苷酸序列处于在单倍体细胞或组织中有活性的组织特异性启动子的控制下或在雌性配子发育过程中有活性的启动子的控制下。可替代地，ODP2/BBM核苷酸序列在诱导型启动子的控制下，并且诱导物的应用允许ODP2/BBM序列在其中表达。可替代地，所用的启动子可以是诱导型和组织优选的。例如，启动子可以是单倍体组织特异性的和可诱导的。
在植物卵细胞中表达的启动子可用于调节ODP2/BBM表达以促进母本单倍体诱导，导致与亲本相比具有一半染色体数目的单倍体子代百分比。示例性启动子包括但不限于AT-DD5、AT-DD31、AT-DD65或更优选ZM-DD45启动子。另外，可以使用与编码ODP2/BBM蛋白的多核苷酸和来自玉蜀黍卵细胞基因的3′UTR可操作地连接的玉蜀黍卵细胞启动子。
A.响应于由截短的BBM激活的孤雌生殖的母本单倍体诱导
在本公开的方法中，两种质粒与ODP2/BBM肽一起使用，所述肽可操作地连接到卵细胞ZmRKD2启动子或Pv-EGG CELL PRO(TR1)启动子，产生ZmRKD2pro：：BBM404和Pv-EGGCELL PRO(TR1)pro：：BBM404表达盒(分别为SEQ ID NO：119和SEQ ID NO：120)。每个表达盒表达截短的ODP2/BBM肽，例如ODP2/BBM肽羧基末端区域的404个氨基酸残基(“BBM404”；SEQID NO：121)。使用上述方法产生转化的非单倍体诱导物植物，所述方法包括包含表达盒的转化方法，所述表达盒含有侧翼于WUS2/ODP2共表达盒(SEQ ID NO：97)的CRE/lox重组系统，其中CRE可操作地连接到启动子，允许在转化后切除WUS2/ODP2/CRE盒。使含有ZmRKD2pro：：BBM404或Pv-EGG CELL PRO(TR1)pro：：BBM404表达盒的再生转基因植物生长，以评估卵细胞中ODP2/BBM蛋白在细胞重编程和母本单倍体诱导方面的活性(参见图6B)。
在抽丝前将转基因母本植物的穗进行芽套袋，以避免任何外来花粉污染。用从组成型表达青色荧光蛋白(CFP)颜色标记的雄性非单倍体诱导亲本植物的花药中收集的有活力的花粉粒对母本植物的植物上的穗丝进行授粉。在授粉后约9-14天，收获未成熟的穗。将穗在30％高乐氏漂白剂加上0.5％微量洗涤剂中表面消毒20分钟，并用无菌水冲洗两次。
与表达CFP的二倍体胚相比，基于不存在可见的CFP表达来分离单倍体胚。使用表达ODP2/BBM的半合子T0/F2中的单倍体胚的数目除以分离的胚的总数，对每个独特事件的CFP阴性胚的百分比(％)进行评分。每个质粒总共使用了12个独特的单拷贝事件，导致总共有大约2,750个分离的胚/质粒。
出于倍性分析的目的，培养CFP阴性胚、再生小植株、取样叶组织、分离细胞核，并使用标准流式细胞术方法确定每株小植株的倍性水平。
另外，本公开的方法可以使用多顺反子接头(“T2A”；编码SEQ ID NO：102的SEQ IDNO：101)来生成一系列表达盒，其中多核苷酸编码ODP2/BBM肽(“BBM404”，SEQ ID NO：121)和胚发生因子(多核苷酸SEQ ID NO：1-16；分别编码多肽SEQ ID NO：17-32)中的任一个。本公开的方法还可以包含表达盒，其中共表达形态发育基因、本文公开的胚发生因子中的任一个和任选的周期蛋白依赖性激酶的组合，包括其任何组合。还预期这些构建体可用于本公开的方法中。
在本公开的方法中，这两种质粒各自可操作地连接到植物卵细胞中表达的启动子。可替代地，可用于本公开的方法是将每个表达盒可操作地连接至小孢子和/或花粉发育期间有活性的启动子调节元件。例如，玉蜀黍启动子PG47(SEQ ID NO：118)、PG67、或其他在小孢子和/或花粉发育期间有活性的此类花粉特异性启动子。使用包括但不限于表10中描述的SEQ ID NO：103-110的多核苷酸的示例性序列的表达盒，可以直接向卵细胞提供蛋白活性。
对两种质粒(各自包含可操作地连接到卵细胞ZmRKD2启动子或Pv-EGG CELL PRO(TR1)启动子的ODP2/BBM肽)的评估表现出不同水平的单倍体诱导。例如，响应ZmRKD2pro：：BBM404表达盒和Pv-EGG CELL PRO(TR1)pro：：BBM404表达盒的CFP阴性单倍体胚的百分比分别平均为0.3％和14.9％(图6B)。该结果证明了每个相应启动子对单倍体诱导的影响，例如，预期启动子强度的可能变化和/或时空基因调节活性的差异将进一步改善单倍体诱导。
为了确认CFP阴性植物确实是单倍体植物，对再生植物进行取样并收集叶组织用于使用标准流式细胞术方法进行倍性分析。这些结果显示，CFP阴性植物确实是单倍体。另外，对几个个体进行了DNA基因分型，并且跨每条染色体分离等位基因的遗传模式与这些植物衍生自母本单倍体胚一致。
预期通过异位表达表6中公开的胚发生因子，在具有或不具有形态发育基因的组合蛋白活性情况下，母本单倍体诱导频率将进一步提高。
可替代地，预期使用在雄配子细胞中具有活性的启动子异位表达细胞重编程剂的此类组合(表6中公开的胚发生因子，具有或不具有形态发生基因)可以直接在胚囊细胞(如卵细胞)中或附近产生蛋白活性，以触发允许获得单倍体植物胚的胚发生。
B.响应于由全长BBM激活的孤雌生殖的母本单倍体诱导
响应于由全长BBM/ODP2蛋白激活的孤雌生殖评估了母本单倍体诱导。在该实验中，收集如上所述、使用相同的双亲本杂交的F1胚并用质粒PHP94831(SEQ ID NO：416)转化。使用表达全长BBM/ODP2蛋白而非截短版本的质粒PHP94831来确定对母本单倍体诱导的影响(如果有的话)。否则本文执行的方法遵循上述步骤，包括将CFP阴性胚作为单倍体胚进行评分。
响应于可操作地连接到上述PV-EGG CELL PRO(TR1)启动子的全长BBM/ODP2的表达，使用从13个独特的单拷贝事件收集的穗观察到CFP阴性的母本单倍体诱导平均水平为28.7％。这些采样事件的单倍体诱导范围变化从13％至35％单倍体诱导水平。这些结果表明，与截短的BBM/ODP2蛋白活性的表达相比，全长BBM/ODP2活性改善了响应于孤雌生殖的母本单倍体诱导。
C.响应于由截短的BBM和细胞周期调节因子激活的孤雌生殖的母本单倍体诱导
评估了响应于含有组合基因活性的表达盒的母本单倍体诱导。本公开的方法可以使用多顺反子接头(“T2A”；编码SEQ ID NO：102的SEQ ID NO：101)来生成一系列表达盒，其中多核苷酸编码第一肽(例如ODP2/BBM肽(“BBM404”，SEQ ID NO：121))和第二肽(例如胚发生因子(多核苷酸SEQ ID NO：1-16；分别为多肽SEQ ID NO：17-32)。如上所示，本公开的方法还可以包括多顺反子表达盒，其中共表达胚发生因子和形态发育基因以及任选的周期蛋白依赖性激酶的组合，包括其任何组合。表11中描述了表达盒的实例。
表11：使用截短的BBM/ODP2的单倍体诱导表达盒
Figure BDA0003306116500001521
在该实验中，BBM403+Dz470表达盒(SEQ ID NO：127)被取代为质粒PHP94831的全长BBM/ODP2表达盒，并且该构建体用于如上所述的植物转化。在该实验中，使用相同双亲本杂交的F1胚被收集、转化并在温室条件下生长至成熟。
在抽丝前将转基因母本植物的穗进行芽套袋，以避免任何外来花粉污染。用从组成型表达青色荧光蛋白(CFP)颜色标记的雄性非单倍体诱导亲本植物的花药中收集的有活力的花粉粒对母本植物的植物上的穗丝进行授粉。在授粉后约18天，收获未成熟的穗。将穗在30％高乐氏漂白剂加上0.5％微量洗涤剂中表面消毒20分钟，并用无菌水冲洗两次。
与表达CFP的二倍体胚相比，基于不存在可见的CFP表达来分离单倍体胚。使用表达ODP2/BBM的半合子T0/F2中的单倍体胚的数目除以分离的胚的总数，对CFP阴性胚的百分比(％)/独特事件/构建体进行评分。如上所述进行倍性分析。
如上所述，用BBM404表达盒(SEQ ID NO：126)转化导致14.9％的母本单倍体诱导水平。在含有BBM403+Dz470表达盒(SEQ ID NO：127)的总共10个独特的单拷贝事件中，CFP阴性胚平均为18.2％/事件，响应于与BBM404肽共表达的Dz470基因活性的活性，增加22％。这种截短的BBM肽提供了与上述相似(其中使用了全长BBM肽)的体细胞胚发生响应。还预期Dz470与全长BBM肽的共表达将进一步提高原位母本单倍体诱导水平。
在该实验中，响应于BBM403+Dz470表达盒获得了89个CFP阴性胚，并使用流式细胞术方法分析了倍性水平。该分析的结果表明，正如预期的那样，89个CFP阴性胚中的73个(82％)确实是单倍体，而89个CFP阴性胚中的其余16个(18％)具有与二倍体化母本单倍体胚一致的倍性水平。该结果表明，那16个胚响应于由Dz470赋予的细胞周期活性，具有加倍的染色体。预计这些材料的进一步基因分型将证实16个胚中的每一个都是衍生自未受精卵细胞的双单倍体，所述未受精卵细胞是减数分裂的产物，并且无需化学染色体加倍处理即可获得。
预期BBM403+Dz470+CDKA1表达盒(SEQ ID NO：128)在使用时将进一步改善母本单倍体诱导，并且预期还将提供响应细胞周期活性的植物原位染色体加倍频率。预期影响植物细胞周期的其他基因也将提供植物原位染色体加倍。
虽然上述使用的表达盒编码BBM肽，但预期可以使用其他细胞重编程剂，例如WUS或玉蜀黍LEC1转录因子1基因(LEC1；SEQ ID NO：124，SEQ ID 125)，包括设计使用多顺反子接头(“T2A”；编码SEQ ID NO：102的SEQ ID NO：101)的多基因表达盒。此外，预期上述组合还可与表6中公开的胚发生因子一起使用。
实例13：获得基因组修饰的母本双单倍体植物的方法
本公开的方法通过转化非单倍体诱导物系以使其表达能够改善未受精卵细胞的胚发生以获得母本单倍体胚的细胞编程剂并通过提供母本单倍体胚的基因编辑来提供新颖单倍体诱导物系。本文使用的基因编辑组分可以以组织特异性方式(例如使用在卵细胞中有活性的启动子)进行调节，从而在配子发生过程中赋予同时单倍体诱导和基因编辑。可替代地，基因编辑组分可以组成型表达，从而在经编辑的基因组DNA分子情况下赋予胚的单倍体诱导。
在这些实验中，植物是从用T-DNA转化的未成熟胚获得的，所述T-DNA含有三种组分，所述三种组分包含：1)单倍体诱导组分，其中植物经由孤雌生殖产生单倍体胚；2)基因修饰组分，其中获得的单倍体胚具有基因组修饰，例如基因缺失、取代或经由同源定向DNA修复(HDR)的基因靶向事件；以及3)可用于基因切除的CRE重组酶组分，其中获得的具有基因组修饰的单倍体胚由于CRE介导的切除而切除了这些基因修饰组分。
A.用于母本单倍体胚的同时基因编辑的植物原位方法
在当前实验中，使用含有能够再生T0植物的T-DNA的质粒RV034409(SEQ ID NO：400)进行基因组修饰，所述T-DNA具有i)单倍体诱导性状盒，如本文所述，使用全长BBM/ODP2多肽，ii)含有DsRED标记基因的Cas9基因编辑表达盒，和iii)CRE表达盒(参见图7)。RV034409含有表达功能性Cas9蛋白的多核苷酸和用于切割ZM-NAC7的两个靶位点的两个gRNA(SEQ ID NO：130)。在不添加外源DNA的情况下，预期任何一个gRNA靶位点处的双链断裂(DSB)，因此预期会引起突变或小缺失，称为SDN-1方法。预期在两个gRNA靶位点处通过Cas9蛋白的双链断裂可能会导致随后的DNA修复，例如非同源末端连接，这体现了两个gRNA的“退出”，称为SDN-2方法。
出于育种目的，可能需要去除某些性状活性以保持最佳农艺性状表现，例如去除将用于育种目的的双单倍体系中的单倍体诱导和/或基因组修饰表达盒。CRE/lox系统用于切除侧翼为loxP位点的表达盒(SEQ ID NO：147)。该方法允许从单倍体诱导和基因组修饰表达盒表达，从而赋予同时母本单倍体胚诱导和基因组修饰连同CRE重组酶介导的切除。CRE重组酶可操作地连接到组织偏好性启动子(PV-EGG CELL PRO(TR1))。
为了获得具有赋予同时单倍体诱导、基因组修饰和CRE介导的切除能力的整合T-DNA的高质量T0植物，使用标准方法使用农杆菌菌株LBA4404 THY-转化由两个近交亲本系杂交产生的玉蜀黍F1杂交体的未成熟胚(参见图7)。
使用农杆菌混合物进行转化。在该实验中，使用包含以下的混合物：含有单倍体诱导物表达盒、基因组修饰表达盒和CRE切除盒的(v/v)90％农杆菌菌株“RV034409”和含有形态发生基因表达盒的10％“RV020636”。具有质粒RV020636的农杆菌菌株用于获得具有来自质粒RV034409的整合T-DNA的单拷贝的转基因植物，其中具有来自质粒RV020636的T-DNA的植物很少(如果有的话)。可替代地，质粒PHP87078可用于代替RV020636。
在每个胚共感染后，体细胞胚发生响应RV020636活性而被激活，并且如上所述培养体细胞胚，包括染色体加倍步骤。大约6-10天后，任何增殖组织和体细胞胚被解剖和传代培养，其中解剖组织的每一部分被转移到成熟培养基(289Q)中，在26℃-28℃在黑暗条件下进行体外培养。约6-10天后，将传代培养的组织转移到26℃的光培养室中，直到长出具有良好根的健康小植株。约7-14天后，将小植株转移到含有盆栽土壤的平地中并在生长室中生长1周，随后在温室中再生长1-2周，然后移植到盆中的土壤中并在温室条件下生长。
为了鉴定含有所需单倍体诱导/基因组修饰/CRE表达盒且不含RV020636质粒序列的T0植物，对每株植物进行叶组织取样并使用PCR诊断方法进行评估。观察到所有植物缺乏任何RV020636质粒序列，并选择单拷贝RV034409事件。
选择的T0植物生长至成熟并用作与来自玉蜀黍近交系的花粉受精的雌穗供体，所述玉蜀黍近交系是具有(CFP)标记基因的非单倍体诱导物。也可以使用表达其他标记基因(例如GUS、PMI、PAT、GFP、CFP、B1、C1、R-nj和/或提供花青苷色素活性的基因)的其他非单倍体诱导物系。非单倍体诱导物玉蜀黍近交系也可能具有野生型马铃薯糖蛋白样磷脂酶A2基因。
基于来自父本CFP阴性胚缺乏CFP标记基因对单倍体胚进行评分，以测量响应于由RV034409T-DNA提供给未受精卵细胞的孤雌生殖基因活性的母本单倍体诱导。
从11个独立事件中对总共2163个拯救胚进行取样，134个胚为CFP阴性，表明单倍体诱导频率为6.2％(参见图8)。在134个胚中，获得了总共86株植物，其中这些植物中的56株被评分为DsRED阴性，表明获得的植物的近三分之二已成功进行CRE介导的RV034409T-DNA的切除。
使用标准方法在NAC7靶位点对来自这56株植物的DNA进行分离、测序和分析。在CFP阴性和DsRED阴性的56株单倍体植物中，37株具有NAC7靶位点突变。因此，相对于获得的86株双单倍体植物，这些结果表明获得的DH群体中的43％具有所需的靶向基因组修饰。
此类植物将进行自体受精，并预期产生缺乏单倍体诱导/基因组修饰/CRE表达性状的后代。将检查后代以评估NAC7靶位点处突变的种系遗传。
预计使用与形态发育基因共表达的胚发生因子可以进一步提高这些单倍体诱导水平。还预期本文公开的细胞重编程剂的组合将进一步增加单倍体诱导。
本文显示的结果提供了改善的能力和灵活性，在相对更短的时间内并利用最少的资源在特定DH育种群体中产生特定突变。
预期可以使用编码其他核酸酶的多核苷酸进行本公开的方法。预期包含使用定点核酸酶的方法的设计选择将适用于本公开的方法，所述定点核酸酶选自由以下组成的组：大范围核酸酶(MN)、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活物样效应物核酸酶(TALEN)、Cas9核酸酶、Cpf1核酸酶、dCas9-FokI、dCpf1-FokI、嵌合Cas9-胞苷脱氨酶、嵌合Cas9腺嘌呤脱氨酶、嵌合FEN1-Fok1、Mega-TAL、切口酶Cas9(nCas9)、嵌合dCas9非-FokI核酸酶、dCpf1-非-FokI核酸酶、以及新颖CRISPR-Cas-α。
例如，预期使用同源定向修复(HDR)用于将供体模板插入双链断裂(DSB)靶位点的方法可以用于本公开的方法中。SDN-3方法举例说明了基因靶向并且是基因组DNA中靶位点的DSB，伴随含有基因或其他遗传物质序列的模板，所述模板被转移到DSB靶位点并使用细胞的自然修复过程进行修复。
预期基因靶向方法将用于本公开的方法中。本公开描述了用于基因靶向的两种表达盒，第一种使用具有“性状”DNA的锌指核酸酶(ZFN)，在该实例中芳氧基链烷酸酯双加氧酶1(AAD-1)基因在同源重组到基因间基因组靶标中后用于赋予2，4-D除草剂耐受性，第二种使用Cas9介导的基因靶向方法获得具有新霉素磷酸转移酶II(nptII)选择标记基因的植物。
预期ZFN介导的SDN-3方法将用于本公开的方法中。对于ZFN介导的SDN-3方法，DSB靶位点是“事件32”。ZFN介导的SDN3表达盒(SEQ ID NO：131)的特征包含T-DNA，其中第一表达盒含有编码具有E32靶位点特异性的增强型锌指核酸酶(E32 eZFN)的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地连接到胚-特异性启动子ZmEC启动子(SEQ ID NO：405)或组成型启动子Zm泛素启动子(“ZmUBI PRO”，SEQ ID NO：131)。第二表达盒含有编码芳氧基链烷酸酯双加氧酶1(AAD-1)蛋白的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地连接到组成型启动子(ZmUBI PRO)，所述启动子侧翼是E32同源臂，所述同源臂侧翼是E32 eZFN靶切割位点的DNA识别序列，其中该盒破坏可操作地连接到玉蜀黍球蛋白-1(ZmGlob1)启动子的玉蜀黍B-Peru(ZmB-Peru)花青素生物合成基因(ZmUBI PRO：：ZmB-Peru：：AtuNOS 3′UTR)。通过E32 eZFN活性切除供体模板(/ZmUBI PRO：：AAD-1：：ZmLIP 3′UTR/)后，ZmB-Peru花青素生物合成将发生，在供体模板被切除的细胞中产生视觉形态颜色标记。导致基因组E32靶位点处双链断裂、随后经由同源定向修复对ZmUBI PRO：：AAD-1：：ZmLIP 3′UTR进行同源重组的E32 eZFN活性将赋予2，4-D除草剂耐受性(一种可用于在体外使用正选择评估基因靶向频率的性状)。
对于Cas9介导的SDN-3方法，使用含有以下的PHP97131质粒(SEQ ID NO：132)：具有编码全长BBM/ODP2蛋白的多核苷酸的单倍体诱导表达盒，所述多核苷酸可操作地连接到PV-EGG CELL PRO(TR1)启动子；可操作地连接到ZM-EXP31554启动子的SV40 NLS-Cas9-VIRD2融合蛋白；可操作地连接到玉蜀黍RNA聚合酶III启动子序列上的gRNA表达盒，其是产生玉蜀黍染色体1靶位点的双链断裂所需的；可操作地连接至组成型启动子的DsRED荧光蛋白；可操作地连接到PV-EGG CELL PRO(TR1)启动子的玉蜀黍优化的CRE重组酶蛋白；以及具有编码新霉素磷酸转移酶II(nptII)可选择标记基因的多核苷酸的基因靶向供体模板，所述多核苷酸可操作地连接到侧翼是同源臂的组成型启动子(ZmUBI PRO)。LoxP位点侧翼于上述表达盒，以允许间插多核苷酸的CRE介导的切除。
在当前的实验中，预期Cas9活性会导致染色体1靶位点处的双链断裂，随后是经由同源定向修复对ZmUBI PRO：：NPT：PIN II终止子进行同源重组，从而赋予卡那霉素耐受性。DsRED表达或其不表达用于评估CRE介导的切除频率。可以在体外对卡那霉素进行阳性选择以评估基因靶向频率。
如上所述转化未成熟的胚。简而言之，使用农杆菌菌株LBA4404THY-转化由两个近交亲本系杂交产生的玉蜀黍F1杂交体的未成熟胚(参见图7)。使用农杆菌混合物进行转化。在该实验中，使用包含以下的混合物：含有单倍体诱导物表达盒、基因组修饰表达盒和CRE切除盒的(v/v)90％农杆菌菌株“PHP97131”和含有形态发生基因表达盒的10％“RV020636”。具有质粒RV020636的农杆菌菌株用于获得具有来自质粒PHP97131的整合T-DNA的单拷贝的转基因植物，其中具有来自质粒RV020636的T-DNA的植物很少(如果有的话)。可替代地，质粒PHP87078可用于代替RV020636。
使超过240株具有来自质粒PHP97131的单拷贝T-DNA的T0植物生长至成熟，所述T-DNA同时赋予单倍体诱导、基因组修饰和CRE介导的切除能力。用作雌穗供体(母本)的F1/T0植物用来自与两个F1杂交体亲本不同的玉蜀黍近交系(特别是含有CFP颜色标记的非单倍体诱导物系)的花粉受精。受精后大约14-18天，收获含有未成熟胚的供体雌穗，收集未成熟胚并评分。鉴于不存在父本CFP颜色标记，CFP阴性胚是母本单倍体胚。也是DsRED阴性的CFP阴性胚具有基因组修饰表达盒的卵细胞表达。选择、培养这些CFP阴性/DsRED阴性胚并将再生的小植株移植到土壤中。
使用标准方法对叶材料进行取样用于DNA分离，所述DNA分离用于分子分析。进行了对跨接合点的PCR扩增的诊断分析，以测量供体模板的HDR介导的基因插入。
这些结果表明，240株植物中有4株对两个侧翼接合点中的至少一个具有HDR介导的修复证据，表明切除的供体模板在DSB靶位点整合的证据。选择这4株植物的DNA进行进一步的下一代测序工作，以进一步表征整合到DSB位点的T-DNA的组成。预期将从遗传稳定整合的基因靶向事件的此类植物获得后代，其中编码性状基因的T-DNA已整合到所需的基因组靶位点。
如上所示，本公开的方法提供了具有基因编辑的母本单倍体植物。预期表6中描述的胚发生因子中的任一种都可用于进一步提高单倍体诱导/基因编辑水平。
B.经基因组修饰的单倍体胚的体外克隆繁殖方法
一旦生长到成熟，用作雌穗供体的F1/T0植物用来自野生型的非单倍体诱导的CFP阳性父本近交系克隆植物的花粉受精，所述植物可以从经处理的单倍体胚获得，其中本公开的方法提供衍生自基因组修饰的单倍体胚的克隆植物的繁殖。
例如，授粉后大约9-14天，收获具有单倍体胚(优选大小为1.7mm至1.9mm)的供体雌穗。可以使用含有质粒RV020636的农杆菌处理分离的胚。该质粒具有“3XENH-3XEME-WUS”表达盒(FMV ENH：PSCV ENH：MMV ENH：ZM-(3XEME)-PLTP PRO：：ZM-WUS2：：IN2-1TERM；SEQID NO：134)。使用包括以下的方法获得克隆植物：向第一植物细胞提供形态发生基因表达盒；在第二植物细胞中引发生长响应，其中所述第二植物细胞不含有所述形态发生基因表达盒；以及从所述第二植物细胞再生所述克隆植物。通常，预期克隆双单倍体将缺少来自质粒RV020636的多核苷酸。预期这样的胚发生活性可以提供给第二细胞，其中使用其他标准方法，例如使用基因枪粒子轰击将质粒RV020636提供给第一细胞。还预期可以使用其他质粒，例如PHP87078质粒(SEQ ID：133)。
预计单倍体胚是基于没有可见的CFP表达来鉴定的(CFP阳性胚被丢弃)。推定的经基因组修饰的胚是DsRED阴性，并且可以预期产生缺乏单倍体诱导/基因组修饰/CRE表达性状的后代。可以对产生1个或多个体细胞胚的单倍体胚(CFP阴性/DsRED阴性)进行解剖和传代培养。在解剖步骤之前、期间或之后，可以使用标准方法将衍生自经处理的单倍体细胞的外植体组织暴露于化学染色体加倍剂，例如表2中所列的那些，以获得克隆双单倍体植物。
C.使用预测选择个体
用于基因组选择的标准方法估计全基因组分子标记的影响，以计算无表型个体的基因组估计育种值(GEBV)。例如，通过使用测量全基因组基因座的等位基因状态的遗传标记数据用正则化方法计算预测来预测表型性能，GEBV可用作选择标准。创建遗传标记数据的方法是已知的，并且通过对每个DH系的组织取样、分离每个组织样本的DNA并对每个样本进行基因分型，可以确定全基因组基因座的等位基因遗传模式，以计算每个DH系的GEBV。
作为本公开的示例性方法，预期当质粒RV034409(SEQ ID NO：401)如上所述稳定转化到未成熟的杂交胚中并获得T0植物时，每株植物被认为是独特的、独立的事件。这些植物被用作雌性雌穗供体，其中雄性花粉供体是含有CFP颜色标记(CFP阳性)的非单倍体诱导物系。授粉后，在受精后大约10天收获每个供体雌穗，并使用标准方法拯救胚。任选地，拯救的胚可用于上述体外克隆繁殖处理。收获后，对胚存在/不存在CFP表达进行评分，并将CFP阴性胚评分为由质粒RV034409(SEQ ID NO：401)的单倍体诱导表达盒赋予的孤雌生殖产生的母本单倍体胚。还对胚存在/不存在DsRED表达进行评分，并且DsRED阴性胚被认为是发生CRE介导的切除的事件。可以进一步分析这些CFP阴性/DsRED阴性胚以证明靶向基因组修饰。可以对植物组织进行取样、DNA分离和基因分型，以使用标准方法使标记辅助选择和/或预测选择成为可能。
本公开的方法，当与使用预测的选择组合时，为植物育种程序提供了一套独特的技术，有助于在相对较短的时间内生成新颖遗传多样性，具有对每个生成的D0系(其也可以具有所需的基因组修饰)进行预测选择的能力，从而实现获得基因组修饰的母本双单倍体植物的富集群体的方法。预期本文公开的方法将有利地影响育种程序中的遗传增益率。
实例14：使用简并Cas9技术提高玉蜀黍母本双单倍体生产力的方法
本公开的方法描述了通过将表达盒引入植物基因组中来获得转基因单倍体植物，所述表达盒表达与植物细胞中的靶基因座结合的异源蛋白，其中所述异源蛋白包含灭活的Cas9(dCas9)翻译融合多肽。该方法用于将灭活的Cas9(dCas9)翻译融合多肽募集到植物基因组中的靶基因座，其中所述基因座编码形态发育基因或胚发生因子，或通过将灭活的Cas9(dCas9)翻译融合多肽募集至其靶标的任意组合。
本公开的方法包括对包含融合到染色质修饰结构域的简并的也称为失活的Cas9蛋白(dCas9)的异源蛋白的设计。使用指导RNA(gRNA)将dCas9融合蛋白募集到编码胚发生因子和/或形态发育基因的靶基因座。一旦将核糖核苷酸复合物募集到靶基因座，通过改变组蛋白修饰的翻译后修饰来实现细胞重编程，包括(a)去除与阻遏基因表达相关的组蛋白修饰，(b)建立与促进基因表达相关的组蛋白修饰，和/或(c)募集与表达靶基因座相关的转录机器。
本文描述的方法提供了可用于父本双单倍体方法中的dCas9技术。在这些实验中，通过激活单倍体卵细胞中的孤雌生殖导致母本双单倍体的产生，本公开的此类方法适用于未受精卵细胞中的细胞重编程活性。
例如，表9中的dCas9翻译融合蛋白可用于本公开的方法中，用于将包含SEQ IDNO：78至82的各种异源蛋白中的任一种的蛋白活性组合到卵细胞中以促进孤雌生殖，所述孤雌生殖是未受精情况下母本胚的生长和发育。对于适当的胚乳发育，预期可能需要受精，但胚不需要受精。因此，本公开提供了一种假受精方法，其中该母本单倍体诱导方法需要授粉但不涉及雄性遗传。
如上所述，染色质修饰性结构域的示例性序列示于表8和9中，当这些多核苷酸可操作地连接到玉蜀黍泛素启动子时，它们以非组织特异性方式表达。对于本公开的方法，其中希望在大配子发生期间在卵细胞中或附近表达异源蛋白，本文公开的方法可以使用卵细胞偏好性，或理想地，卵细胞特异性启动子。预期使用具有质粒的农杆菌(其含有T-DNA，所述T-DNA具有编码多个dCas9翻译融合物的多个表达盒)可能需要使用多个卵细胞启动子。由于这个原因，表12中提供了使用针对示例性dCas9翻译融合蛋白的三种不同卵细胞启动子的示例性多核苷酸序列。
表12.可用于植物原位单倍体诱导的dCas9翻译融合蛋白
Figure BDA0003306116500001631
Figure BDA0003306116500001641
Figure BDA0003306116500001651
Figure BDA0003306116500001661
此外，多基因表达盒可用于本公开的方法中并使用已知方法设计。例如，在编码待表达的每种所需dCas9翻译融合蛋白的每个多核苷酸之间如前所述使用多顺反子接头(“T2A”；编码SEQ ID NO：102的SEQ ID NO：101)可以允许多基因表达，其中表达盒可操作地连接到特定的卵细胞启动子。
为了举例说明本公开的细胞重编程方法，创建了六种不同的构建体。使用了两种不同的融合蛋白，本文称为“dCas9-CBF1A”和dCas9-HAT2，其中灭活的Cas9结构域分别与CBF1a结构域或HAT2结构域融合。对于每种融合蛋白，设计了具有不同数量的gRNA靶标的变体质粒，以评估响应于这些dCas9翻译融合蛋白的卵细胞活性(激活给定基因组靶位点)的单倍体诱导。
在第一质粒中，dCas9-CBF1A蛋白被设计为使用质粒PHP97202(参见表4；SEQ ID：410)靶向ODP2基因组靶位点。在第二质粒中，dCas9-CBF1A蛋白被设计为使用质粒PHP97330(参见表4；SEQ ID：411)靶向ODP2、WUS2和LEC1基因组靶位点。在第三质粒中，dCas9-CBF1A蛋白被设计为使用质粒PHP97566(参见表4；SEQ ID：412)靶向ODP2、WUS2、LEC1和CYCD2(参见表6，胚发生因子5，dpzm07g031470.1.1)基因组靶位点。在第四质粒中，dCas9-HAT2蛋白被设计为使用质粒PHP97203(参见表4；SEQ ID：413)靶向ODP2基因组靶位点。在第五质粒中，dCas9-HAT2蛋白被设计为使用质粒PHP97388(参见表4；SEQ ID：414)靶向ODP2、WUS2和LEC1基因组靶位点。在第六质粒中，dCas9-HAT2蛋白被设计为使用质粒PHP97331(参见表4；SEQ ID：415)靶向ODP2、WUS2、LEC1和CYCD2(参见表6，胚发生因子5，dpzm07g031470.1.1)基因组靶位点。具有2个或更多个gRNA的质粒被设计具有编码内切核糖核酸酶Csy4(Cas6f)的多核苷酸和前体RNA。crRNA生物合成是通过将前体RNA设计为含有间隔区(具有基序，允许前体RNA被酶促切割)来进行，从而产生能够同时靶向1个或多个靶位点的成熟的CRISPR衍生RNA(crRNA)。
应当理解，gRNA与此类基因座结合的目的区域包括但不限于近端启动子区域，例如转录起始位点(TSS)上游高达一万碱基的范围，通常至少一种gRNA靶向每个内源基因座的区域。还可以使用以下方法，所述方法使用gRNA与远端顺式调节元件结合，其中至少一种gRNA靶向顺式调节元件。
在这些实验中，使用本文公开的方法将每个质粒用于植物转化。在这些植物育种实验中，转化未成熟的F1胚以获得衍生自如本文所述的双亲本杂交的D0单倍体植物。可替代地，胚可以从任何其他双亲本杂交转化，例如来自回交的胚。
在农杆菌介导的转化、体细胞胚成熟和再生后，通过qPCR分析T0植物以鉴定含有所需的T-DNA的单拷贝、半合子个体。使此类植物生长并且将其用作雌穗供体(雌性)植物，其中供体雌穗用从组成型表达青色荧光蛋白(CFP)颜色标记的雄性非单倍体诱导亲本植物的花药中收集的有活力的花粉粒进行授粉。通过在授粉后大约9-18天从供体雌穗中分离胚来鉴定母本单倍体胚。
母本单倍体胚响应dCas9翻译融合物/gRNA表达盒赋予的细胞重编程活性而发育。从植物育种的角度来看，这些胚是最初的单倍体世代，其在加倍后将成为第一代双单倍体，也称为“D0”植物。
预期募集到卵细胞内源基因座的dCas9翻译融合蛋白/gRNA复合物的活性将重新编程卵细胞的命运，激活孤雌生殖，并允许母本胚在没有受精的情况下生长和发育。预期响应于激活ODP2、WUS2、LEC1和CYCD2的质粒(例如PHP97566、PHP97331)的单倍体诱导水平将超过激活ODP2、WUS2和LEC1的质粒(例如PHP97330、PHP97388)的单倍体诱导水平。此外，预期四种质粒(例如PHP97566、PHP97331、PHP97330、PHP97388)将超过单独激活ODP2的质粒(例如PHP97202、PHP97203)的单倍体诱导水平。
可以进行母本单倍体植物染色体加倍的方法，例如通过将单倍体胚转移到具有染色体加倍(或有丝分裂抑制剂)剂的培养基中以产生双单倍体植物。例如，浓度为0.1-1.0g/ml的秋水仙碱(其通过干扰微管组织导致使分裂细胞的有丝分裂停滞在中期)或染色体加倍剂(如表2中所列的那些)中的任何一种(使用标准方法)。
总之，这些方法为植物育种方法提供了进步，特别是从未受精卵细胞繁殖母本单倍体植物的方法，其中改变内源基因座的基因调节操作以改善细胞重编程。
预期配子细胞，更具体地如本文所述的雌性配子细胞中改善的细胞重编程方法可用于改善玉蜀黍母本双单倍体生产。预期本文公开的方法可用于其他作物和蔬菜育种系统。
本文公开的方法提供母本双单倍体生产的改善。例如，用于表达可操作地连接到卵细胞启动子的dCas9翻译融合蛋白(其可以同时激活多个基因座以重新编程未受精卵中的活性并激活单倍体卵细胞中的孤雌生殖)的方法是母本双单倍体生产方面的显著改善。预期目的基因座包含用于结合编码表6中描述的新颖胚发生因子的基因座和/或编码形态发生基因的基因座的gRNA分子的设计。
本公开的方法在母本单倍体胚的鉴定和选择方面提供改善，因为适当的胚乳发育所需的受精引入来自非单倍体诱导物的颜色标记，从而允许鉴定和选择母本单倍体胚。
本公开提供了一种使用含有染色质修饰性结构域的dCas9翻译融合蛋白，例如使用表12中所示的表达盒来调节卵细胞中的靶基因座的方法。预期靶基因激活以诱导孤雌生殖将响应于含有染色质修饰性结构域的dCas9翻译融合蛋白的活性而得到改善，从而靶位点基因座处的组蛋白修饰可以用与活性常染色质状态相关的组蛋白修饰进行翻译后修饰。因此，与单独的转录激活相比，预期该作用模式可以促进改善的细胞重编程活性。预期含有染色质修饰性结构域的dCas9翻译融合蛋白和含有转录激活物结构域的dCas9翻译融合蛋白(例如dCas9-CBF1A融合蛋白)的共表达可以进一步改善经处理的细胞中的细胞重编程(当那些组分一起有活性时)。
预期能够与编码具有促进孤雌生殖的活性的基因的多个座基因结合的dCas9翻译融合蛋白的组合使用以越来越不依赖基因型的方式改善单倍体诱导方法。这些方法在植物育种方法提供了改善，特别是从未受精卵细胞繁殖母本单倍体植物的方法，其中改变内源基因座的基因调节操作以改善细胞重编程。
实例15：使用胚乳介导的细胞重编程改善母本单倍体诱导的方法
本公开的方法提供使用胚乳介导的细胞重编程而改善的母本单倍体植物生产技术。
细胞重编程剂的代表性实例显示在表13中。可用于本公开方法的细胞重编程剂包括但不限于包含与胚发生因子(例如表6中描述的胚发生因子)和/或形态发育基因(例如WUS、BBM或LEC1)融合的ZM-BETL9 SSP的多核苷酸。使用胚乳介导的细胞重编程的母本单倍体诱导通过从整合到父本基因组中的T-DNA表达这些翻译融合蛋白的组合而得到改善。这些多基因表达盒在如表13所示的每个所需蛋白质的编码序列之间使用多顺反子接头(“T2A”；编码SEQ ID NO：102的SEQ ID NO：101)。对于本公开的多基因表达盒，提供了每种表达的蛋白质的组合。
表13.可用于胚乳介导的细胞重编程技术的表达盒
Figure BDA0003306116500001701
Figure BDA0003306116500001711
表13中公开的表达盒被整合到表达可选择标记(例如本文所述的CFP)的非单倍体诱导物中。这些非单倍体诱导物系用作本文所述的父本。预期这些胚乳介导的细胞重编程方法可与本文公开的其他方法组合以增加双单倍体产生。
在这些实验中，将目的表达盒(SEQ ID NO：179-186)转移到用于如本文所述的转化的质粒的T-DNA中。这样的T-DNA可以包括用于表达可选择标记的第二表达盒，例如UBI1ZM PRO+UBI1ZM 5UTR+UBI1ZM INTRON1+DS-RED2+PINII TERM(SEQ ID NO：99)，以及含有编码CRE/lox重组系统的多核苷酸的第三表达盒，所述多核苷酸侧翼于胚发生因子表达盒和/或形态发生基因表达盒，包括但不限于WUS2/ODP2共表达盒(SEQ ID NO：97)，其中CRE与启动子可操作地连接，允许在转化后切除WUS2/ODP2/CRE盒，从而允许仅含有第一和第二表达盒的转基因植物再生。
可替代地，可将可用于这些方法的第二表达盒设计为表达基因组修饰核酸酶。例如，表达盒可用于使用功能性Cas9核酸酶和指导RNA(UBIZM PRO：：CAS9(SP)(MO)+ZM-U6POLIII：：crRNA-tracRNA融合转录物，SEQ ID NO：130)的定点诱变(SDN)，其中该盒含有在NAC转录因子7(dpzm03g031130)基因座处靶向玉蜀黍基因组序列“GAAGGGGCTTCGGAGGAT”(ZM-NAC7-CR5)(SEQ ID NO：406)和“GTGATGCATCCGGACGGG”(ZM-NAC7-CR10)(SEQ ID NO：407)的双重指导物设计。对于充当基因组修饰剂的Cas9核酸酶，使用ZM-BETL9 SSP(多肽SEQ ID：347)的N末端融合物的翻译融合物用于产生异源融合蛋白，以促进蛋白质从胚乳细胞向胚细胞的转移。
在本公开的方法中，预期可以从整合到父本基因组中的T-DNA表达细胞重编程剂和基因组修饰剂的组合。因此，可以使用在每个所需蛋白质的编码序列之间使用多顺反子接头(“T2A”；编码SEQ ID NO：102的SEQ ID NO：101)的多基因表达盒。启动子，例如玉蜀黍基底胚乳转移层9启动子(“ZM-BETL9 PRO”；SEQ ID NO：348)可以可操作地连接到分泌信号肽(SSP)，例如玉蜀黍基底胚乳转移层9(“ZM-BETL9 SSP”，编码多肽SEQ ID NO：347的SEQID NO：346多核苷酸)，其与包含细胞重编程剂和基因组修饰剂的每个多肽融合。任何已知的与分泌信号肽(SSP)(例如多肽的N-末端)融合的基因组修饰核酸酶可用于本文公开的方法中。基因组修饰肽可包含与细胞穿透肽融合的C末端，所述细胞穿透肽包括不限于玉蜀黍knotted1 CPP(ZM-KNT1 CPP；编码SEQ ID NO：49的SEQ ID NO：48)、粟酒酵母TP10 CPP(SP-TP10CPP；编码SEQ ID NO：51的SEQ ID NO：50)、白色念珠菌Zebra CPP(CA-Zebra CPP；编码SEQ ID NO：53的SEQ ID NO：52)、PEP1 CPP(PEP1 CPP；编码SEQ ID NO：55的SEQ ID NO：54)、HIV-1 TAT CPP(HIV-1 TAT CPP；编码SEQ ID NO：57的SEQ ID NO：56)和γ-玉米醇溶蛋白细胞穿透肽(GZ CPP；编码SEQ ID NO：59的SEQ ID NO：58)。此类翻译融合物例示了以下蛋白质特性：(a)可以从表达蛋白质的细胞中分泌，(b)可以在细胞基因组中的靶位点处产生突变，和(c)可以改善蛋白质摄取和/或表达的蛋白质的递送。使用核酸酶(例如大范围核酸酶(MN)、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活物样效应物核酸酶(TALEN))(不使用指导RNA)的方法，可用于本文公开的方法中。
当使用包含编码组合的细胞重编程剂和基因组修饰剂的多核苷酸的多基因表达盒时，第三表达盒被设计为转录指导RNA分子并且包含处于可操作连接中的ZmU6启动子和指导RNA。可替代地，使用与指导RNA处于可操作连接中的其他启动子，例如胚乳偏好性启动子。此外，可以使用标准方法(包括但不限于生物射弹递送、电穿孔或农杆菌介导的递送)将合成指导RNA分子或合成指导RNA分子的组合外源地递送到具有预先整合的基因编辑性状的细胞中。
在农杆菌介导的转化、体细胞胚成熟和再生后，通过qPCR分析T0植物以鉴定含有所需的T-DNA的单拷贝、半合子个体。繁殖这些T0植物以获得用作花粉供体的种子储备。
一旦T0植物生长至成熟，就进行杂交方法。简而言之，转基因植物被用作父本植物，其具有第二植物(例如F1杂交体(P1 x P2)的供体雌穗。授粉后约9-14天，收获未成熟的穗，并使用标准方法分离未成熟的胚。在该阶段，每个二倍体胚都是三元杂交(例如(P1 xP2)x P3谱系)的结果，而每个母本单倍体胚都是具有(P1 x P2)谱系的独特遗传实体，其是相当于F1：2母配子的减数分裂产物。
在当前实例中，具有父本基因组遗传的二倍体胚将表达颜色标记，或可能表达其他由父本基因(例如生物合成基因)表达的形态标记。母本单倍体胚的选择可以基于不存在这样的父本基因活性(不存在颜色标记物的表达)来进行。这样的母本单倍体胚响应于由胚乳递送表达盒赋予的细胞重编程活性和/或基因组修饰活性而发育。
从植物育种的角度来看，这些胚是最初的单倍体世代，其在加倍后将成为第一代双单倍体，也称为“D0”植物。使用标准方法，单倍体胚预期萌发并产生一株植物。然而，会发生生产力损失，并且此类单倍体胚可能无法萌发，从而导致群体减少。在这些实验中，双单倍体植物再生频率得到改善。
具体的，在分离后，使用标准方法用农杆菌菌株LBA4404 THY-转化所有胚。使用农杆菌混合物进行转化。在该实验中，使用的混合物包含(v/v)90％农杆菌菌株(该菌株含有胚乳介导的细胞重编程单倍体诱导物表达盒和/或基因组修饰表达盒，和/或本实例15中描述的CRE切除盒)和含有形态发生基因表达盒的10％“RV020636”。使用具有质粒RV020636的农杆菌菌株获得具有来自质粒的整合T-DNA的单拷贝的转基因植物(该质粒含有胚乳介导的细胞重编程单倍体诱导物表达盒和/或基因组修饰表达盒，和/或CRE切除盒)，其中具有来自质粒RV020636的T-DNA的植物很少(如果有的话)。可替代地，质粒PHP87078可用于代替RV020636。
在每个胚共感染后，体细胞胚发生响应RV020636活性而被激活，并且如上所述培养体细胞胚，包括染色体加倍步骤。单倍体胚是基于没有可见的CFP表达来鉴定的(CFP阳性胚被丢弃)。大约6-10天后，任何增殖组织和体细胞胚被解剖和传代培养，其中解剖组织的每一部分被转移到成熟培养基(289Q)中，在26℃-28℃在黑暗条件下进行体外培养。约6-10天后，将传代培养的组织转移到26℃的光培养室中，直到长出具有良好根的健康小植株。约7-14天后，将小植株转移到含有盆栽土壤的平地中并在生长室中生长1周，随后在温室中再生长1-2周，然后移植到盆中的土壤中并在温室条件下生长。
为了鉴定含有所需单倍体诱导和/或基因组修饰和/或CRE表达盒且不含RV020636质粒序列的T0植物，对每株植物进行叶组织取样并使用PCR诊断方法进行评估。选择所有观察到缺乏任何RV020636质粒序列和质粒的单拷贝(其含有胚乳介导的细胞重编程单倍体诱导物表达盒和/或基因组修饰表达盒事件)的所有植物。
RV020636质粒具有“3XENH-3XEME-WUS”表达盒(FMV ENH：PSCV ENH：MMV ENH：ZM-(3XEME)-PLTP PRO：：ZM-WUS2：：IN2-1TERM；SEQ ID NO：134)，其可用于生产克隆双单倍体。回收的克隆双单倍体通常不包含带有来自质粒RV020636(SEQ ID NO：134)的“3XENH-3XEME-WUS”表达盒的T-DNA。
使用本公开的方法，预期将实现改善的细胞重编程，从而导致双单倍体植物产生水平的改善。
胚乳介导的细胞重编程的一个有用方面是赋予细胞重编程和/或基因组修饰的所需性状盒的表达从胚乳的父本等位基因表达。因此，这种用于单倍体诱导方法的方法的好处是可以将性状盒中编码的蛋白质的活性提供给单倍体细胞，而不需要将性状盒整合到单倍体细胞的基因组中。鉴于三倍体胚乳包含具有一个或多个整合性状盒的父本等位基因，并且胚乳是终末分化的组织(其对胚的种系遗传没有贡献)，因此该机制是可能的。
本文公开的方法在对可用于诱导植物细胞的细胞重编程的蛋白质的选择提供了增加的灵活性。因此预期本文公开的组合因子的活性可以改善细胞重编程，从而导致双单倍体育种方法的生产力增益改善。各种启动子和/或细胞重编程和/或基因组修饰活性的组合的使用进一步举例说明了本公开的方法如何提供用于植物育种的技术改善。设计方面进一步包括在异源蛋白质产生方面的选择，其中表达的翻译融合蛋白具有增强的特性，例如蛋白质分泌的增加和/或基因组修饰核酸酶的细胞递送的增加，这也是对植物育种有用的技术改善。
预期本文公开的表达盒在转化到已知的单倍体诱导物中或非单倍体诱导物中时，在实践本文公开的方法中提供另外的灵活性。预期这种灵活性将导致单倍体诱导频率的进一步改善和/或提高单倍体体外组织培养在繁殖成功方面的响应，包括所产生的D0植物的繁殖力，如通过其产生的D1种子的量来测量的。
预期基因组修饰蛋白从胚乳到胚细胞的蛋白质递送可以修饰作为非生殖细胞的细胞。在这种事件中，虽然这样的植物可能有体细胞突变，并且可能在该植物生命周期的孢子体阶段表现出表型变化，但这种突变不会在下一代遗传。因此预期在拯救使用这些胚乳递送方法处理的胚后，那些拯救的胚将对本文公开的克隆繁殖组织培养方法具有改善的响应。当使用本文公开的方法时，预期使用所公开的克隆繁殖方法向胚提供的体细胞胚发生刺激改善了再生在靶位点具有突变的单倍体植物的可能性。
实例16：使用灭活的Casα蛋白在植物细胞中进行靶向的基因激活
本公开描述了使用包含Cas内切核酸酶的翻译融合蛋白进行靶基因调节的方法。在这些实验中有用的Cas内切核酸酶基因在表14中示出。
表14.Casα内切核酸酶
Figure BDA0003306116500001761
Figure BDA0003306116500001771
表14中公开的Cas内切核酸酶的使用可以包括Cas多肽的修饰形式。Cas多肽的修饰形式可包括降低Cas蛋白的天然存在的核酸酶活性的氨基酸改变(例如，缺失、插入或取代)。例如，在一些情况下，Cas蛋白的修饰形式具有低于50％、低于40％、低于30％、低于20％、低于10％、低于5％、或低于1％的相应的野生型Cas多肽的核酸酶活性。在某些情况下，Cas多肽的修饰形式没有实质的核酸酶活性，被称为催化“失活的Cas”或“简并的Cas”或“灭活的Cas(dCas)”。失活的Cas/简并的/灭活的Cas包括灭活的Cas内切核酸酶(dCas)。
灭活的Cas内切核酸酶(dCas)可与指导RNA一起使用，以靶向具有用于每个Cas-αCRISPR-Cas系统的指导RNA和PAM序列的特征特性的特定DNA靶位点。
催化失活的Cas效应物蛋白可以与包含调节结构域的异源序列融合，从而产生充当细胞重编程因子的翻译融合蛋白。例如，包括但不限于，如本文公开的用于基因激活和/或染色质修饰性结构域的融合蛋白的用途，其中调节结构域诱导或修饰基因调节和/或诱导或修饰基因组靶位点处的基因染色质重塑活性。
A.父本单倍体诱导效用
在本公开中，靶基因激活的方法使用dCas-α7作为融合蛋白的示例性识别结构域(例如玉蜀黍优化的dCas-α7(DNA SEQ ID NO：227；编码蛋白SEQ ID NO：228))，与编码如表8中定义的染色质修饰结构域的多核苷酸融合，或与转录激活物组分融合，例如来自拟南芥属CBF1蛋白的结构域。表15示出了编码用于植物细胞中靶向基因激活的多肽的细胞重编程因子多核苷酸，所述多肽包含灭活的Cas-α7蛋白。
表15.dCas-α7细胞重编程因子
Figure BDA0003306116500001781
为了促进最佳表达和核定位(对于真核细胞)，可以对包含复合物的基因进行优化，然后通过标准方法将其作为DNA表达盒递送到细胞中。也可以将构成活性复合物必需的组分作为RNA(具有或不具有保护RNA免于降解的修饰)，或者作为加帽或无帽的mRNA或Cas蛋白指导多核苷酸复合物，或其如本文公开的任何组合进行递送。
提供了编码dCasα7-HAT1细胞重编程因子的示例性表达盒(SEQ ID NO：241；含有3X增强子(FMV、PCSV和MMV)+扩增启动子+扩增5’UTR+dCasα7外显子1+ST-LS1内含子2+dCasα7_外显子2(MO)_(TR1)+VIRD2 NLS(TR2)+30XQ-V2+接头+HAT1+接头+PIN II TERM的特征)可用于在玉米小孢子中瞬时表达以改善小孢子胚发生。这种编码dCasα7-HAT1细胞重编程因子的表达盒可以如本文所述使用。
在该实例中，还描述了重组表达和纯化灭活的Cas-α(dCasα)内切核酸酶的方法。如表15中所述的灭活的Cas-α翻译融合蛋白可以使用加标签的“独(solo)”蛋白表达质粒表达和纯化。首先，将表达构建体转化到大肠杆菌BL21(DE3)或ArcticExpress(DE3)菌株中，并在补充有选择剂(例如氨苄青霉素(100μg/ml))的LB肉汤中培养培养物。培养至OD600为0.5后，温度降至16℃，并用IPTG(0.5mM)或阿拉伯糖(0.2％(w/v))诱导表达。16小时后，将细胞沉淀并重新悬浮在上样缓冲液(20Tris-HCl，pH 8.0，25℃，1.5M NaCl，5mM 2-巯基乙醇，10mM咪唑，2mM PMSF，5％(v/v)甘油)中并通过超声破碎。通过离心去除细胞碎片。将上清液加载到带Ni2+电荷的HiTrap螯合HP柱(通用医疗健康公司)上，并在20Tris-HCl(pH8.0，25℃)、0.5M NaCl、5mM 2-巯基乙醇缓冲液中以增加咪唑浓度(从10到500mM)的线性梯度洗脱。将含有dCasα翻译融合蛋白的级分合并，并且随后装载到HiTrap heparin HP柱(通用医疗健康公司)上，使用线性递增浓度梯度的NaCl(从0.1M至1.5M)用于洗脱。将含有dCasα融合蛋白的下一个级分合并，并通过在4℃下与TEV蛋白酶孵育过夜来切割标签。为了去除切割的His-MBP标签和TEV蛋白酶，将反应混合物加载到HiTrap肝素HP5柱(通用医疗健康公司)上，使用增加NaCl浓度(从0.1到1.5M)的线性梯度进行洗脱。接下来，将来自HiTrap柱的洗脱液加载到MBPTrap柱(通用医疗健康公司)上，然后收集流过的dCasα融合蛋白。然后将收集的级分在20mM Tris-HCl(25℃、pH 8.0)、500mM NaCl、2mM DTT和50％(v/v)甘油中透析，并储存在-20℃。
这样的编码dCasα7-翻译融合蛋白细胞重编程因子的纯化的蛋白质可以如本文所述使用。
预期向植物细胞提供dCasα翻译融合蛋白活性将重编程细胞命运。更具体地，向玉蜀黍小孢子提供蛋白质活性可以实现细胞重编程，从而导致可用于获得父本单倍体植物的改善的小孢子胚发生。
还预期使用dCasα识别结构域允许提高gRNA设计方案的灵活性。例如，对仅使用dCas9融合蛋白的细胞重编程的依赖将gRNA设计限制为DNA序列靶位点，其中在靶位点之后紧跟“NGG”前间隔子邻近基序(PAM)。在本文公开的方法中，可以在本文公开的方法中设计和使用每个Casα蛋白的靶位点，所述靶位点包含紧跟在的相应前间隔子邻近基序(PAM)序列之后的DNA序列靶标。
本文公开的方法能够将dCas9-和dCasα-翻译融合蛋白组合以同时靶向同一遗传基因座上的不同DNA序列靶标，包括但不限于所得基因调节机制的组合以在经处理的细胞内同时发生。例如，预期可以实现组合赋予染色质修饰和转录激活的蛋白质活性。预期这种组合活性将改善经处理的细胞中的小孢子胚发生。
还预期用于表达、纯化和提供与合成的gRNA分子复合的dCasα-翻译融合蛋白的方法将实现改善的细胞摄取。本文所述的dCasα7肽是424个氨基酸残基。因此，预期这种较小肽的递送将导致对细胞摄取到植物细胞中的改善。
B.母本单倍体诱导效用
本公开的方法描述了通过将表达盒引入植物基因组中来获得转基因单倍体植物，所述表达盒表达与植物细胞中的靶基因座结合的异源蛋白，其中该异源蛋白包含灭活的Casα(dCasα)翻译融合物，例如使用表14中公开的Casα肽。该方法用于将灭活的Casα(dCasα)翻译融合多肽募集到植物基因组中的靶基因座，其中靶位点是编码胚发生因子和/或形态发育基因的遗传基因座，或通过募集灭活的Casα(dCasα)翻译融合多肽到这些靶位点的任意组合。
本公开的方法包括对异源蛋白质的设计，所述异源蛋白质包含与染色质修饰结构域融合的简并的，也称为灭活的Casα蛋白(dCasα)。使用指导RNA(gRNA)将dCasα融合蛋白募集到各自编码胚发生因子和/或形态发育基因的靶基因座。一旦将核糖核苷酸复合物募集到靶基因座，通过改变组蛋白修饰的翻译后修饰来实现细胞重编程，包括(a)去除与阻遏基因表达相关的组蛋白修饰，(b)建立与促进基因表达相关的组蛋白修饰，和/或(c)募集与表达靶基因座相关的转录机器。
在本公开中，提供了可用于母本双单倍体方法的dCas9技术。如本文所述，现有dCasα技术可用于本公开内容的方法中用于未受精卵细胞中的细胞重编程活性，从而产生可用于产生母本双单倍体的方法。
例如，编码表14中公开的任何dCasα蛋白的表达盒可用于本公开的方法中。更具体地，表达盒可用于本公开的方法中，所述表达盒包含编码含有dCasα识别域多肽的多核苷酸融合至包含激活物结构域(例如表8中所述)的多核苷酸。
可替代地，表达盒可用于本公开的方法中，所述表达盒包含编码dCasα识别结构域的多核苷酸融合至编码拟南芥属CBF1结构域的转录激活物组分的多核苷酸(编码多肽SEQID NO：243的多核苷酸SEQ ID NO：242)或编码转录激活物VP64组分的多核苷酸(编码多肽SEQ ID NO：245的多核苷酸SEQ ID NO：244)。
对于母本单倍体诱导，表达盒可用于本公开的方法中，所述表达盒包含编码dCasα翻译融合蛋白的多核苷酸，其与在卵细胞中表达的启动子可操作地连接以促进孤雌生殖(即未受精情况下母本胚的发育)。这些方法可能需要受精才能使胚乳适当发育，而孤雌生殖的母本单倍体胚则不需要受精。因此，在这方面，鉴于这种母本单倍体诱导方法需要不涉及雄性遗传的授粉，本公开被认为是假受精方法。
预期向卵细胞提供dCasα翻译融合蛋白将导致孤雌生殖母本单倍体诱导。本文公开的方法为gRNA设计提供了改善的灵活性，由此可以使用PAM位点而不是使用dCas9识别结构域时所需的“NGG”碱基对序列设计所需靶位点处的DNA序列。
还预期当使用多个PAM位点时，可以实现将赋予染色质修饰和转录激活的蛋白质活性组合，因此，当使用这种组合的蛋白质活性时，预期这种组合的活性将改善卵细胞孤雌生殖。
实例17：遗传染色体加倍的方法
本公开的方法描述了非化学染色体加倍的方法。
该方法包括通过瞬时允许单倍体基因组复制而不细胞分裂，通过遗传破坏典型的G1-S-G2-M细胞周期来获得双单倍体。所述方法解偶联标准的细胞周期调节，特别是其中进展到DNA合成阶段(S期)需要完成染色体分离(M期)的步骤。
这种方法通过允许染色质在没有有丝分裂的情况下复制来模拟自然发生的核内复制。用质粒RV020636处理的增殖细胞具有高有丝分裂指数。该方法同时使用非化学染色体加倍方法，通过在细胞重编程步骤期间瞬时表达蛋白质，本文称为遗传染色体加倍蛋白，以允许双单倍体的克隆产生。
一种选择是从超出T-DNA边界的Ti质粒共表达遗传染色体加倍蛋白，例如通过将编码该蛋白质的多核苷酸转移到Ti质粒中并将该多核苷酸可操作地连接到根癌农杆菌Ti质粒的毒力基因的启动子上。可用于本公开的此类启动子是virF启动子和virB启动子(分别为SEQ ID NO：403、SEQ ID NO：404)。瞬时表达可以通过控制农杆菌所需的条件来实现。例如，当使用缺乏胸苷酸合成酶活性的营养缺陷型农杆菌菌株LBA4404 THY时，生长培养基中胸腺嘧啶的缺失会降低农杆菌的活力，从而降低破坏G1-S-G2-M细胞周期调节的蛋白质的表达。
另一种选择是使用根癌农杆菌Ti质粒毒力基因启动子，它是乙酰丁香酮诱导的，并在体外组织培养步骤中根据需要改变乙酰丁香酮浓度，从而瞬时调节蛋白质表达。任选地，可以实施这两种方法的组合。
如上所述，本公开的方法允许通过遗传破坏典型的G1-S-G2-M细胞周期来获得双单倍体。该方法允许在没有细胞分裂的情况下瞬时复制基因组。在没有完成M期(其特征在于完成胞质分裂并产生两个子细胞)的情况下用于刺激基因组复制的示例性蛋白质是有丝分裂抑制剂细胞周期开关52蛋白(CCS52)。据信，CCS52可以通过降解有丝分裂周期蛋白来阻碍有丝分裂，导致包含G1-S-G2期的核内周期。因此，预期CCS52蛋白将用作遗传染色体加倍蛋白。
CCS52蛋白是参与有丝分裂周期蛋白降解的后期促进复合物激活剂(“APC”；也称为“细胞周期体”)的植物同源物，其中APC组分包含E3泛素连接酶，其通过26S蛋白酶体降解靶向的细胞周期蛋白。含有类似于ccs52的酵母蛋白的WD-重复序列的过表达触发了有丝分裂周期蛋白降解、细胞分裂停滞、核内复制和细胞扩大。
使用含有编码玉蜀黍FIZZY相关蛋白的多核苷酸序列的表达盒实现CCS52蛋白的瞬时表达，所述多核苷酸序列是例如玉蜀黍FIZZY相关的2样(多核苷酸SEQ ID NO：136，编码多肽SEQ ID NO：197)和/或不同的FIZZY相关同源物(多核苷酸SEQ ID NO：137-139；分别编码多肽SEQ ID NO：198-200)，可操作地连接到根癌农杆菌Ti质粒毒力基因的启动子，例如virF或virB启动子(分别为SEQ ID NO：403、SEQ ID NO：404)。当这种Ti质粒被转移到缺乏胸苷酸合成酶活性的营养缺陷型农杆菌菌株LBA4404 THY中时，则可以通过如上所述控制农杆菌所需的条件来实现瞬时表达。
遗传破坏经典G1-S-G2-M细胞周期的第二种遗传方法是瞬时表达抑制微管蛋白聚合的蛋白质，从而模拟用作染色体加倍剂的化学品的抗有丝分裂作用。
真核细胞表达几种微管蛋白，其中α-微管蛋白和β-微管蛋白是微管的主要组分。有丝分裂纺锤体的微管为在有丝分裂期间分离子染色单体提供了框架。微管由13根细丝组成，并且每根细丝都是横向缔合成管状结构的α-β-微管蛋白的端对端异二聚体。微管蛋白是GTP酶，其活性位点形成在亚基之间的界面处，使用来自两个亚基的必需氨基酸残基。此外，GTP酶活性只当2个或更多个亚基相缔合时发生，其中一个亚基的N末端结构域提供核苷酸结合位点，并且C末端结构域提供负责核苷酸水解的“T7环”。
本公开的方法破坏了微管聚合。例如，通过表达突变的β-微管蛋白亚基(特别是在提供核苷酸结合位点的亚基的N末端结构域中)，然后核苷酸水解被阻止。因此，突变的β-微管蛋白亚基充当“有毒”亚基或显性负突变，阻碍聚合物(+)端的聚合，从而抑制细丝聚合。因此，表达突变的微管蛋白亚基会导致细丝的动态不稳定性，从而导致抗有丝分裂作用模式可用作遗传染色体加倍剂。
可以使用编码突变的微管蛋白亚基的多核苷酸在从超过T-DNA边界的区域中的Ti质粒进行共表达突变的β-微管蛋白亚基，例如如上所述在使用RV020636的农杆菌处理步骤中。例如，描述了在保守位点产生错义突变的示例性方法，例如微管蛋白保守位点，Prosite登录号PS00227，其中使用多核苷酸编码错义突变，本文称为“β-微管蛋白-PS00227减”(多核苷酸SEQ ID NO：140；编码SEQ ID NO：141)。这样的多核苷酸可以可操作地连接到启动子，例如连接至SV40核定位信号序列的virF启动子或virB启动子(分别为SEQ ID NO：403、SEQ ID NO：404)。
可替代地，可以使用T-DNA边界内的多核苷酸进行表达遗传染色体加倍蛋白。例如，可以将包含编码一种或多种遗传染色体加倍蛋白的多核苷酸的表达盒转移到T-DNA中，其中在递送到植物细胞中后从T-DNA实现瞬时表达。提供了编码突变的β-微管蛋白“PS00227减”的此类表达盒的示例性序列(OS-ACTIN PRO：：OS-ACTIN INTRON1(MOD1)：：β-微管蛋白-PS00227减：：CAMV35S TERM；SEQ ID NO：142)。
使用这种遗传方法的相关益处是农杆菌菌株表达染色体加倍所需的遗传染色体加倍蛋白，并因此不需要将转基因或突变引入植物基因组，也不需要任何此类改变以在有丝分裂期间恢复至野生型有丝分裂纺锤体活动。因此，此类方法本质上是暂时的。另外，当使用连接至virB启动子的遗传染色体加倍蛋白时，根据需要在各种培养基中存在/不存在乙酰丁香酮可以改变基因表达水平，从而提供控制瞬时表达的另外的方法。
可以使用翻译融合来改善这种遗传方法，其中使用毒力基因易位因子与充当遗传染色体加倍蛋白的蛋白质的翻译融合来改善遗传染色体加倍方法的向植物细胞中的递送。如本文所述，编码充当遗传染色体加倍蛋白的蛋白质的翻译融合多肽通常在蛋白质的N-末端或C-末端与赋予分泌蛋白植物原位易位的衍生自细菌毒力蛋白的多肽融合。该方法促进了分泌的遗传染色体加倍蛋白向已用细胞重编程剂处理过的细胞的植物原位易位的改善。
本公开的方法提供了编码这种分泌的遗传染色体加倍蛋白的多核苷酸示例性序列。一个示例性序列是包含与根癌农杆菌VirF易位/核定位基序的C末端36个氨基酸融合的β-微管蛋白(PS00227减)肽的翻译融合蛋白(SEQ ID NO：144)的多核苷酸(SEQ ID NO：143)。第二个示例性序列是多核苷酸(SEQ ID NO：145)，其包含与毛根农杆菌GALLS蛋白易位/核定位基序的C末端27个氨基酸融合的β-微管蛋白(PS00227减)肽的翻译融合蛋白(编码SEQ ID NO：147的SEQ ID NO：146)。任一多核苷酸均可以可操作地连接到根癌农杆菌Ti质粒毒力基因的启动子，例如virF启动子或virB启动子(分别是SEQ ID：403、SEQ ID：404)。预期可以用类似方式使用编码其他遗传染色体加倍蛋白的多核苷酸，例如FIZZY相关多核苷酸(SEQ ID NO：136-139)来进行这种方法。
如本文所公开的，预期可以使用调节已知影响植物细胞周期的基因的表达的化学染色体加倍蛋白使单倍体胚加倍。预期使用本文公开的这种遗传染色体加倍方法将改善双单倍体产量。
实例18：条件性负选择方法
负选择系统可用于本文公开的任何方法中以针对转基因细胞或其产生的转基因植物进行选择，从而避免转基因“逃逸”(其是含有不需要的表达盒或T-DNA的转基因植物)的产生。本公开的方法描述了在植物细胞中使用条件性负选择方法，其导致某些含有不希望的表达盒或T-DNA的转化细胞死亡。
在这些条件性负选择方法中，首先使用不含无毒试剂的生长培养基培养细胞，从而允许转化细胞和非转化细胞都生长。其次，将细胞转移到含有无毒试剂的生长培养基中，从而促进针对转化细胞的选择和非转化细胞的选择性生长。
在本公开的方法中，将赋予条件负选择的基因，例如细菌胞嘧啶脱氨酶(codA)基因使用标准方法转移到质粒中。此处，将codA基因转移到作为本文公开的方法的产物的细胞、组织或植物中不需要的任何表达盒或T-DNA中。例如，质粒RV020636和/或PHP87078的T-DNA。
农杆菌转化如本文所述进行，不同之处在于在体外培养期间，将未经选择培养的细胞转移至有选择的成熟培养基，例如补充有5-氟胞嘧啶的289Q培养基。含有表达codA基因的不希望的T-DNA的细胞会将5-氟胞嘧啶代谢成有毒试剂并被针对选择，而未转化的细胞将不受5-氟胞嘧啶的影响，从而促进针对转基因“逃逸”的选择并促进所希望细胞的选择性生长。可以在组织培养期间的其他步骤实施条件性选择方法，例如在培养和/或解剖每个处理过的单倍体胚的增殖愈伤组织组织期间或之后。例如，条件性选择可以通过将解剖组织的每个部分转移到补充有5-氟胞嘧啶的成熟培养基(289Q)中然后在黑暗条件下于26℃-28℃培养来进行。
预期本公开的方法将产生从响应于农杆菌处理(例如，含有质粒RV020636和/或PHP87078的T-DNA和赋予条件性负选择的基因的农杆菌菌株)而繁殖的植物衍生的非转基因植物的频率升高。
实例19：使用灭活的Casα蛋白在植物细胞中进行靶向的基因抑制
这些方法包括可用于植物育种的方法，其中该方法包括阻遏细胞的初始细胞命运，从而改善植物细胞的细胞重编程和植物再生频率。本公开描述了使用包含Cas内切核酸酶的翻译融合蛋白进行靶基因阻遏的方法。还预期本文公开的阻遏物结构域可与其他修饰的Cas核酸酶融合，包括但不限于修饰的Cas9蛋白(编码SEQ ID NO：368的DNA SEQ ID NO：357)或Cpf1蛋白(编码SEQ ID NO：360的DNA SEQ ID NO：359)。
如本文所公开，多种方法(单独使用表6中所述的任何胚发生因子和/或与形态发育蛋白组合使用)增强植物细胞中的胚发生细胞重编程。在向细胞在具有或不具有形态发育蛋白的情况下提供胚发生因子的方法中，预期在具有或不具有形态发育蛋白情况下这样的胚发生因子的异位活性将引起细胞响应，例如响应以阻遏通过向细胞在具有或不具有形态发育蛋白的情况下提供胚发生因子刺激的诱导细胞重编程。提供了克服植物细胞阻遏细胞重编程的方法。
用于在植物细胞中维持干细胞稳态的示例性途径是CLAVATA-WUSCHEL反馈信号传导途径，其中芽分生组织由多能干细胞维持。该途径协调维持干细胞增殖与分化。该途径似乎在多种高等植物物种中是保守的。所述通路包括干细胞促进性转录因子WUS和分化促进性肽CLAVATA3(CLV3)多种受体在调节植物干细胞和发育中发挥作用，例如水稻基因FON1、玉蜀黍CLAVATA 2直系同源物粗雄穗矮杆1(THICK TASSEL DWARF1，TD1)和带化穗2(FASCIATED EAR2，FEA2)、以及玉蜀黍CLV型LRR受体样基因、带化穗3(FASCIATED EAR3，FEA3)。这些蛋白质可以阻遏通过用胚发生因子和/或形态发育蛋白处理细胞提供的诱导细胞重编程。预期调节这些阻遏蛋白质将增强本文公开的诱导细胞重编程的方法。
拟南芥花分生组织的发育调节表明WUS的阻遏受AGAMOUS(AG)蛋白表达的控制。AG直接诱导KNUCKLES(KNU)的转录，KNU编码具有保守转录阻遏物基序的C2H2型锌指蛋白，所述C2H2型锌指蛋白阻遏WUS转录以消除干细胞活性，从而控制花分生组织的决定性。对于这种花发育中干细胞调节的途径，协调干细胞维持和分化的一个关键方面不仅是时间表达模式(其中WUS活性激活AG活性，并且AG激活KNU转录)，而且还在于KNU基因座如何调节。通过AG进行KNU转录需要去除KNU基因座处的阻遏性组蛋白修饰，例如去除组蛋白H3蛋白的第27个赖氨酸残基处的三甲基化(H3K27me3)。这样的阻遏以AG依赖性的方式被去除。预期在本公开的方法中，其中WUS活性在植物干细胞增殖中的转录反馈和表观遗传调节之间具有机理性关联，预期对正向激活的WUS阻遏物(例如KNU或其他此类阻遏蛋白)的靶向阻遏将增强细胞重编程。
预期植物细胞中的异位WUS蛋白活性将正向调节信号通路响应以阻遏WUS活性。编码用于阻遏WUS活性的蛋白质的遗传基因座可用作本公开的方法的基因组靶位点。预期调节这些阻遏性蛋白质将增强本文公开的诱导细胞重编程的方法。
还鉴定了几个其他作为胚发生负开关的遗传基因座。PICKLE(PKL)基因编码CHD3染色质重塑因子和当PKL功能发生丧失时在根内异位发育的胚性状。在pkl幼苗中，LEC类基因被去阻遏，从而表明此类发育基因经由阻遏性染色质状态被沉默。
植物细胞使用保守的遗传和表观遗传途径来介导从胚发生到非胚发生阶段的发育转变，例如通过使用阻遏物和经由阻遏性染色质修饰的表观遗传沉默来维持分化的非胚发生状态。本公开的方法逆转这种阻遏性非胚发生状态，包括但不限于阻遏胚发生阻遏蛋白(例如CLV3、KNU或PKL)表达和/或去除编码有用的细胞重编程因子(例如表6中所述的形态发育基因和/或胚发生因子)的基因组靶位点处建立的阻遏性染色质修饰的方法。
预期调节阻遏蛋白将增强通过本文公开的方法获得的结果，包括但不限于改善小孢子胚发生的方法、改善孤雌生殖的方法、改善体细胞胚发生的方法和改善植物转化效率的方法。预期可以考虑多种可能的靶位点，其中基因组靶位点编码的产物特征在于促进细胞的初始细胞命运。本文公开的方法提供了处理细胞以将该细胞的初始细胞命运重编程为改变的胚发生细胞命运的改进的方法。在这些方法中有用的Cas内切核酸酶在表14中示出并且用于产生赋予靶向的基因阻遏的翻译融合蛋白。
更具体地，翻译融合阻遏蛋白的识别结构域可以使用Cas多肽的修饰形式，所述Cas多肽的修饰形式没有实质的核酸酶活性并且被称为催化“失活的Cas”或“简并的Cas”或“灭活的Cas(dCas)”。失活的Cas/简并的/灭活的Cas包括灭活的Cas内切核酸酶(dCas)。灭活的Cas内切核酸酶(dCas)可与指导RNA一起使用，以靶向本文所述的具有每个Cas-αCRISPR-Cas系统的指导RNA和PAM序列的特征特性的特定DNA靶位点。
对于本公开的方法，催化失活的Casα肽可以与包含调节结构域的异源序列融合，从而产生充当细胞重编程因子的翻译融合蛋白。例如，用于基因阻遏的融合蛋白，其中调节结构域含有阻遏物基序，该阻遏物基序具有阻遏基因组靶位点处的转录的能力。
在本公开的方法中有用的示例性基序示于表16中。
表16.
Figure BDA0003306116500001891
本公开提供了处理具有体细胞的初始细胞命运特征的细胞的方法，从而导致非体细胞命运，从而导致改善细胞中多能干细胞命运的获得。
本公开提供了处理具有配子体发育途径特征的初始细胞命运特征的细胞的方法，从而导致非配子体细胞命运，并且进一步导致改善细胞中胚发生细胞命运的获得。本公开提供了扰乱产生成熟雌配子细胞的大配子发生的方法和扰乱产生成熟雄配子的小配子发生的方法。
预期本文公开的方法将改善处理的胚发生细胞的分裂和增殖的能力，并改善从此类处理的胚发生细胞的植物再生。
可用于本文公开的方法的多肽包含如表14中所示的Cas-α(α)内切核酸酶，其可以被修饰，其中识别结构域包含融合至上述任何阻遏物基序的dCasα核酸酶，从而产生dCasα阻遏物翻译融合。
可用于本文公开的方法中的dCasα-阻遏物翻译融合多肽可以与包含dCasα-阻遏物-gRNA核糖核蛋白复合物(RNP)的gRNA复合，其中gRNA允许与基因组靶位点结合。细胞中这种阻遏物RNP的活性可以允许与靶位点结合并改变基因表达，特别是阻遏基因表达。
如本文所公开，染色质修饰性结构域是用作能够靶向基因激活的细胞重编程剂的调节结构域。具有包含赋予转录基因沉默的染色质修饰性结构域的调节结构域的dCasα-阻遏蛋白翻译融合物可用于本文公开的方法中。此类染色质修饰性结构域包括但不限于可用于在基因组靶位点处建立或维持转录基因沉默的DNA甲基转移酶结构域和/或组蛋白甲基化结构域。
包含在WUSCHEL蛋白中包含的阻遏物基序的融合蛋白可用于本文公开的方法中。例如，在拟南芥WUSCHEL肽中发现的EAR样“LELRLN”(SEQ ID NO：408)阻遏物基序(即所谓的WUSCHEL盒结构域)、“TLPLFPTCG”(SEQ ID NO：398)(其也可包含所谓的WUSCHEL盒结构域)和酸性结构域“TLPLFPTCGDDDDDD”(SEQ ID NO：409)可用于本文公开的方法中。本文公开的方法可以通过募集辅助因子来阻遏分化途径，从而阻遏细胞的初始细胞命运，允许改善细胞重编程，并促进干细胞调节，从而导致被处理细胞的细胞命运改变。向细胞提供包含dCasα-WUS盒融合物的融合蛋白可用于促进细胞重编程，从而导致经处理的细胞的改善的胚发生响应。
为了举例说明使用dCasα阻遏物翻译融合蛋白，表17中示出了可用作包含阻遏物基序的调节结构域的序列。预期包含表16中所述的另外基序的多核苷酸序列也可以使用。
表17.
Figure BDA0003306116500001911
A.改善体细胞胚发生并获得稳定转化植物的方法
预期通过使用本文公开的方法在细胞处理之前、期间或之后向细胞提供与gRNA复合的dCasα阻遏物翻译融合多肽(构成dCasα-阻遏物-gRNA核糖核蛋白复合物(RNP))来实现体细胞胚发生的改善的诱导。
预期使用具有识别结构域(其包含表14中所述的修饰肽)和调节结构域(其包含含有表16和17中所述的基序或结构域的阻遏肽)的dCasα阻遏物翻译融合多肽将实现改善的细胞重编程。
可用于本文公开的方法中的阻遏靶位点可包括但不限于编码形态发育基因和/或胚发生因子的阻遏物的基因组基因座，例如编码本文所述肽的基因座。作为干细胞信号通路组分的阻遏靶位点(例如CLV3及其物种特异性蛋白，抑制WUSCHEL的C2H2型锌指蛋白，如KNUCKLES阻遏蛋白，以及MADS-盒转录因子，如AGAMOUS或物种特异性AGAMOUS样直系同源物)可用于本文公开的方法中。
可用于本文公开的方法中的阻遏靶位点可包括但不限于编码多梳组(PcG)蛋白或其亚基(作用是阻遏编码形态发育基因和/或胚发生因子的基因组基因座的表达)的基因组基因座。
可用于本文公开的方法中的阻遏靶位点可包括但不限于编码CHD3染色质重塑因子或其亚基(作用是阻遏编码形态发育基因和/或胚发生因子的基因组基因座的表达)的基因组基因座。
预期dCas-阻遏蛋白的活性将进一步改善获得稳定转化植物的频率，例如相对于当不使用这种dCas阻遏蛋白时获得稳定转化植物的频率，获得从最初具有非胚细胞命运的二倍体细胞再生的二倍体植物的频率。
B.改善小孢子胚发生并获得父本单倍体植物的方法
预期通过使用本文公开的方法在细胞处理之前、期间或之后向细胞提供与gRNA复合的dCasα阻遏物翻译融合多肽(构成dCasα-阻遏物-gRNA核糖核蛋白复合物(RNP))来实现小孢子胚发生的进一步改善。
预期使用具有识别结构域(其包含表14中所述的修饰肽)和调节结构域(其包含含有表16和17中所述的基序或结构域的阻遏肽)的dCasα阻遏物翻译融合多肽将实现改善的细胞重编程。
可用于本文公开的方法中的阻遏靶位点可包括但不限于编码形态发育基因和/或胚发生因子的阻遏物的基因组基因座，例如编码本文所述肽的基因座。作为小配子发生途径组分的阻遏靶位点(其包含编码赋予花粉粒发育成熟作用的蛋白质的基因组基因座)可用于本文公开的方法中。
在单倍体植物再生后，可以进行上述染色体加倍方法以获得父本双单倍体植物。
C.一种改善孤雌生殖并获得母本单倍体植物的方法
预期通过使用本文公开的方法在细胞处理之前、期间或之后向细胞提供与gRNA复合的dCasα阻遏物翻译融合多肽(构成dCasα-阻遏物-gRNA核糖核蛋白复合物(RNP))来实现孤雌生殖的进一步改善。
预期使用具有识别结构域(其包含表14中所述的修饰肽)和调节结构域(其包含含有表16和17中所述的基序或结构域的阻遏肽)的dCasα阻遏物翻译融合多肽将实现改善的细胞重编程。作为大配子发生途径组分的阻遏靶位点(其包含编码赋予卵细胞发育成熟作用的蛋白质的基因组基因座)可用于本文公开的方法中。
在单倍体植物再生后，可以进行上述染色体加倍方法以获得母本双单倍体植物。

Claims (86)

1.一种生成非转基因双单倍体植物的方法，所述方法包括：
a.通过向小孢子提供选自由以下组成的组的细胞重编程剂来获得胚发生型小孢子：
i.细胞重编程多肽；
ii细胞重编程多核苷酸；
iii.i)和ii)的组合；
b.从所述胚发生型小孢子产生单倍体植物胚；
c.使所述单倍体胚与染色体加倍剂接触，持续足以产生双单倍体胚的时间段；以及
d.从(c)的所述双单倍体胚再生双单倍体植物。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞重编程多肽选自由以下组成的组：
a.形态发育多肽；
b.胚发生因子多肽；
c.合成的转录因子多肽；
d.(a)和(b)的组合；
e.(a)和(c)的组合；
f.(b)和(c)的组合；以及
g.(a)、(b)和(c)的组合。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述形态发育多肽选自由以下组成的组：
a.功能性WUS/WOX多肽；
b.Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽：
c.LEC1多肽；
d.(a)和(b)的组合；
e.(a)和(c)的组合；以及
f.(b)和(c)的组合。
4.如权利要求2所述的方法，其中所述胚发生因子多肽包含：
a.与SEQ ID NO：17至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
b.与SEQ ID NO：18至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
c.与SEQ ID NO：19至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
d.与SEQ ID NO：20至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
e.与SEQ ID NO：21至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
f.与SEQ ID NO：22至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
g.与SEQ ID NO：23至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
h.与SEQ ID NO：24至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列。
5.如权利要求2所述的方法，其中所述合成的转录因子多肽选自由以下组成的组：
a.dCas9-翻译融合蛋白；
b.dCasα-翻译融合蛋白；以及
c.(a)和(b)的组合。
6.如权利要求1所述的方法，其中通过使所述小孢子与所述细胞重编程多肽接触来进行提供所述细胞重编程多肽。
7.如权利要求1、2或6中任一项所述的方法，其中所述细胞重编程多肽进一步包含细胞穿透肽(CPP)。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述细胞穿透肽(CPP)选自由以下组成的组：
a.蛋白质转导结构域CPP，
b.两亲性肽CPP，
c.合成的阳离子聚组氨酸多肽CPP，
d.合成的阳离子聚赖氨酸多肽CPP，
e.合成的阳离子聚精氨酸多肽CPP，
f.树状聚阳离子CPP，
g.血管内皮钙粘蛋白CPP，
h.转运素CPP，
i.HIV-1TAT CPP的单体或二聚体，
j.穿透素CPP，
k.合成的阳离子高精氨酸寡肽CPP，和
l.γ-玉米醇溶蛋白CPP。
9.如权利要求1所述的方法，所述方法进一步包括分离和培养所述双单倍体胚。
10.一种通过如权利要求1或9所述的方法产生的双单倍体植物。
11.如权利要求5所述的方法，其中所述细胞重编程多肽包含具有细胞重编程活性的dCas9-翻译融合蛋白，所述方法包括：
a.将包含选自下组的氨基酸序列的多肽引入细胞：dCas9-染色质修饰性翻译融合蛋白，其包含：
i.与SEQ ID NO：78至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
ii与SEQ ID NO：79至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
iii.与SEQ ID NO：80至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
iv.与SEQ ID NO：81至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
v.与SEQ ID NO：82至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
b.将所述多肽与包含选自下组的氨基酸序列的多肽组合引入细胞：翻译融合蛋白，其包含含有以下的dCas9-转录激活物融合蛋白：
i.灭活的Spy Cas9(编码多肽SEQ ID NO：84的多核苷酸SEQ ID NO：83)，和
ii拟南芥属(Arabidopsis)CBF1蛋白(编码多肽SEQ ID NO：86的多核苷酸SEQ ID NO：85)的转录激活物结构域，或
iii.VP64结构域(编码多肽SEQ ID NO：245的多核苷酸SEQ ID NO：244)的转录激活物结构域；
c.将所述多肽与包含选自下组的氨基酸序列的多肽组合引入细胞：翻译融合蛋白，其包含含有以下的dCas9-转录阻遏物融合蛋白：
i.如表16中所示的转录阻遏物基序；
ii如表17中所示的转录阻遏物结构域。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述dCas9-翻译融合蛋白与至少一种选自由以下组成的组的指导RNA(gRNA)组合：
a.与编码功能性WUS/WOX多肽的基因座具有序列同源性的gRNA；
b.与编码Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽的基因座具有序列同源性的gRNA；
c.与编码LEC1多肽的基因座具有序列同源性的gRNA；
d.与编码胚发生因子多肽的基因座具有序列同源性的gRNA；
e.与编码C2H2型锌指蛋白的基因座具有序列同源性的gRNA；
f.与编码MADS-盒转录因子蛋白的基因座具有序列同源性的gRNA；
g.与编码多梳组(PcG)蛋白或其亚基的基因座具有序列同源性的gRNA；以及
h.与编码CHD3染色质重塑因子或其亚基的基因座具有序列同源性的gRNA，从而形成核糖核蛋白复合物，所述核糖核蛋白复合物包含促进细胞重编程的蛋白质(编码多肽17至32的多核苷酸)。
13.如权利要求12所述的方法，其中编码胚发生因子多肽的基因座是选自由以下组成的组的核苷酸序列：
a.SEQ ID NO：1-16中的至少一个；
b.与SEQ ID NO：1-16中的至少一个至少95％相同的核苷酸序列；以及
c.与SEQ ID NO：1-16中的至少一个至少70％相同的核苷酸序列。
14.如权利要求12所述的方法，其中针对基因座设计gRNA包括：
a.选择位于编码gRNA靶位点的基因座侧翼的DNA序列，包括所述基因座上游或下游高达10,000个核苷酸的近端调节区，或
b.选择位于编码gRNA靶位点的基因座侧翼的DNA序列，包括所述基因座上游或下游超过10,000个核苷酸的顺式调节元件，或
c.(a)和(b)和(c)的方法，或其任何组合。
15.如权利要求11-12所述的方法，其中使用多核苷酸将dCas9翻译融合多肽引入细胞，其包括：
a.将含有dCas9-翻译融合蛋白质表达盒和指导RNA表达盒的双链或单链DNA多核苷酸附接到粒子上用于引入并递送到细胞中；
b.将含有dCas9-翻译融合蛋白质表达盒的双链或单链DNA多核苷酸和作为RNA分子的至少一种单一gRNA附接到粒子上用于引入并递送到细胞中；
c.将含有dCas9翻译融合蛋白的RNA多核苷酸和含有指导RNA表达盒的双链或单链DNA多核苷酸附接到粒子上用于引入并递送到细胞中；
d.将含有dCas9翻译融合蛋白的RNA多核苷酸和作为RNA分子的至少一种单一gRNA附接到粒子上用于引入并递送到细胞中。
16.如权利要求11-12所述的方法，其中使用多肽将所述dCas9翻译融合蛋白引入植物细胞，其包括：
a.将含有dCas9翻译融合蛋白的多肽和含有指导RNA表达盒的双链或单链DNA多核苷酸附接到粒子上用于引入并递送到细胞中；
b.将含有dCas9翻译融合蛋白的多肽和作为RNA分子的至少一种单一gRNA附接到粒子上用于引入并递送到细胞中。
17.如权利要求15所述的方法，其中将所述dCas9翻译融合蛋白与细胞穿透肽融合，所述细胞穿透肽包含：
a.玉蜀黍(Z.mays)knotted1 CPP(SEQ ID NO：49)，
b.粟酒酵母(Saccharomyces pombe)TP10 CPP(SEQ ID NO：51)，
c.白色念珠菌(Candida albicans)Zebra CPP(SEQ ID NO：53)，
d.PEP1 CPP(SEQ ID NO：55)，
e.HIV-1TAT CPP(SEQ ID NO：57)，和
f.γ-玉米醇溶蛋白细胞穿透肽(SEQ ID NO：59)。
18.如权利要求11-17所述的方法，其中所述方法包括将植物细胞暴露于与一种或多种gRNA复合的两种或更多种dCas9翻译融合蛋白以从经处理的细胞获得植物。
19.一种生成非转基因双单倍体植物的方法，所述方法包括：
(l)表达与编码细胞重编程多肽的多核苷酸可操作地连接的绒毡层细胞偏好性调节元件，
(m)分泌所表达的细胞重编程多肽并将所述多肽转运到小孢子中，
(n)获得响应于所述细胞重编程多肽的胚发生型小孢子，
(o)从所述胚发生型小孢子产生所述单倍体植物胚，
(p)使所述单倍体胚与染色体加倍剂接触，持续足以产生双单倍体胚的时间段；以及
(q)从(e)的所述双单倍体胚再生所述双单倍体植物。
20.如权利要求19所述的植物细胞，其中所述细胞重编程多肽包含细胞穿透肽。
21.如权利要求19所述的植物细胞，其中所述细胞重编程多肽是选自下组的形态发育多肽，该组包含：
(r)WUS/WOX同源盒多肽；
(s)Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽；
(t) LEC1多肽；
(u)(a)和(b)的组合；以及
(v)(a)和(c)的组合。
22.如权利要求19所述的植物细胞，其中所述胚发生因子多肽包含：
(i)与SEQ ID NO：17至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
(j)与SEQ ID NO：18至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
(k)与SEQ ID NO：19至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
(l)与SEQ ID NO：20至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
(m)与SEQ ID NO：21至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
(n)与SEQ ID NO：22至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
(o)与SEQ ID NO：23至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
(p)与SEQ ID NO：24至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列。
23.如权利要求20所述的方法，其中所述细胞重编程多肽包含分泌信号肽。
24.如权利要求20所述的方法，其中细胞重编程多肽包含细胞重编程-糖皮质激素受体翻译融合多肽。
25.如权利要求24所述的方法，其中通过将配体外部应用到体外组织培养基中而有条件地将融合的细胞重编程-糖皮质激素受体多肽定位到细胞核，从而控制所述蛋白质活性。
26.如权利要求2所述的方法，其中同时向细胞提供一种或多种细胞重编程多肽、和一种或多种细胞周期调节蛋白。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述细胞周期调节蛋白是选自下组的周期蛋白依赖性激酶，该组包含：
(d)与SEQ ID NO：114至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
(e)与SEQ ID NO：115至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
(f)(a)和(b)的组合。
28.一种获得经基因组修饰的双单倍体植物的方法，所述方法包括：
(e)获得具有待编辑的玉蜀黍植物基因组DNA的第一植物，所述第一植物用包含以下的表达盒转化：
i.形态发育基因，或
ii胚发生因子，或
iii.基因组修饰组分，或
iv.CRE切除组分，或
v.(i)和(ii)和(iii)和(iv)，或其任何组合；
(f)获得第二植物，其中所述第二植物包含标记基因；
(g)用来自所述第二植物的花粉给所述第一植物授粉；
(h)选择至少一个通过授粉步骤(c)产生的单倍体后代，其中所述单倍体后代包含所述第一植物的基因组但不包含所述第二植物的基因组，并且所述第一植物的基因组已被基因编辑组分修饰。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述基因编辑组分使用DNA修饰酶，所述DNA修饰酶是选自下组的定点核酸酶，该组包含：大范围核酸酶(MN)、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活物样效应物核酸酶(TALEN)、Cas9核酸酶、Casα核酸酶、Cpf1核酸酶、dCas9-FokI、dCpf1-FokI、嵌合Cas9-胞苷脱氨酶、嵌合Cas9腺嘌呤脱氨酶、嵌合FEN1-Fok1、Mega-TAL、切口酶Cas9(nCas9)、嵌合dCas9非-FokI核酸酶、和dCpf1-非-FokI核酸酶。
30.如权利要求28所述的方法，其中所述标记基因选自下组，该组包含：GUS、PMI、PAT、GFP、RFP、CFP、C1、CRC、R-nj、R1-scm和花青苷色素。
31.如权利要求28所述的方法，其中所述经编辑的单倍体后代用染色体加倍剂处理，从而产生经编辑的双单倍体后代。
32.如权利要求31所述的方法，所述染色体加倍剂是秋水仙碱、拿草特、滴停平、氟乐灵或另一种已知的抗微管剂。
33.如权利要求32所述的方法，所述方法进一步包括分离和培养所述双单倍体植物胚。
34.如权利要求29所述的方法，其中为包含DNA修饰酶的核糖核蛋白复合物提供至少一种指导RNA分子。
35.一种生成双单倍体植物的方法，所述方法包括：
(e)向单倍体细胞提供遗传染色体加倍蛋白；
(f)使所述单倍体细胞与遗传染色体加倍蛋白接触，持续足以产生双单倍体细胞的时间段；
(g)获得双单倍体细胞；
(h)从(c)的双单倍体细胞再生双单倍体植物。
36.如权利要求35所述的方法，其中所述遗传染色体加倍剂是遗传染色体加倍多肽。
37.如权利要求36所述的方法，其中所述遗传染色体加倍多肽选自包含以下的组：
(j)与SEQ ID NO：141至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
(k)与SEQ ID NO：197至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
(1)与SEQ ID NO：198至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
(m)与SEQ ID NO：199至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
(n)与SEQ ID NO：200至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
(o)(a)和(b)的组合，或
(p)(a)和(c)的组合，或
(q)(a)和(d)的组合，或
(r)(a)和(e)的组合。
38.如权利要求36所述的方法，其中处理单倍体细胞包括：
(e)用含有表达遗传染色体加倍多肽的农杆菌(Agrobacterium)的溶液处理单倍体细胞；
(f)使所述遗传染色体加倍多肽从所述农杆菌易位到植物细胞；
(g)从所述农杆菌回收所述植物细胞，从而结束所述处理；
(h)获得双单倍体后代。
39.如权利要求36所述的方法，其中所述遗传染色体加倍包含导致有丝分裂纺锤体不稳定的蛋白质。
40.如权利要求39所述的方法，其中所述导致不稳定的蛋白质在有丝分裂过程中干扰子染色单体的分离。
41.如权利要求40所述的方法，其中干扰活性损害微管聚合。
42.如权利要求41所述的方法，其中通过提供微管蛋白来干扰微管聚合。
43.如权利要求42所述的方法，其中所提供的微管蛋白具有改变的活性。
44.如权利要求43所述的方法，其中干扰微管聚合的所述改变的活性损害α-β-微管蛋白异二聚体活性。
45.如权利要求44所述的方法，其中使用突变的亚基损害微管蛋白亚基的活性，所述突变的亚基包含失去：
(i)提供负责核苷酸水解的T7环的亚基的C末端结构域；
(j)提供核苷酸结合位点的亚基的N末端结构域；
(k)H8螺旋；
(l)T5环；
(m)B9片；
(n)H7螺旋；
(o)GDP(β-微管蛋白)；或
(p)(a)至(g)的任何两种或更多种的组合。
46.如权利要求45所述的方法，其中所述突变的亚基损害鸟嘌呤核苷酸结合位点和/或GTP酶活性。
47.如权利要求46所述的方法，其中微管蛋白保守位点[SAG]-G-G-T-G-[SA]-G(SEQ IDNO：423)发生突变。
48.如权利要求36所述的方法，其中所述遗传染色体加倍剂包含降解有丝分裂周期蛋白，导致包含G1-S-G2期的核内周期。
49.如权利要求48所述的方法，其中促进核内复制包括向单倍体细胞提供细胞周期开关蛋白。
50.如权利要求49所述的方法，其中细胞周期开关蛋白选自包含以下的组：
(e)与SEQ ID NO：197至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
(f)与SEQ ID NO：198至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
(g)与SEQ ID NO：199至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
(h)与SEQ ID NO：200至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列。
51.如权利要求28所述的方法，其中植物包含与启动子可操作地连接的异源多核苷酸，其中所述多核苷酸编码一种或多种多肽，当所述多核苷酸在植物细胞中表达时，所述一种或多种多肽使植物卵细胞变为胚发生型的。
52.如权利要求51所述的方法，其中所述异源多核苷酸被稳定地掺入到所述植物的基因组中。
53.如权利要求52所述的方法，其中所述植物具有增加水平的选自下组的多肽，该组包含：
(j)与SEQ ID NO：111至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
(k)与SEQ ID NO：21至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
(l)与SEQ ID NO：112至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
(m)与SEQ ID NO：113至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
(n)与SEQ ID NO：114至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
(o)与SEQ ID NO：115至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
(p)与SEQ ID NO：116至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
(q)与SEQ ID NO：117至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
(r)(d)和(h)的组合。
54.如权利要求53所述的方法，其中所述植物在所述卵细胞中具有升高的重编程水平，促进响应于所述多肽的胚发生细胞命运。
55.如权利要求54所述的方法，其中所述重编程使卵细胞变成孤雌生殖，并且其中所述孤雌生殖的卵细胞仅含有母本基因组(1n)。
56.如权利要求55所述的方法，其中所述植物具有包含升高的母本单倍体诱导水平的表型。
57.如权利要求51所述的方法，其中所述启动子是组织偏好性启动子。
58.如权利要求57所述的方法，其中所述组织偏好性启动子导致所述一种或多种多肽在所述卵细胞中表达。
59.如权利要求28所述的方法，其中使用包括以下的方法从经基因组修饰的单倍体胚繁殖克隆的双单倍体植物：
a.使经基因组修饰的细胞与包含含有形态发生基因表达盒的T-DNA的细菌菌株接触；
b.在第二经基因组修饰的细胞中引发生长响应；以及
c.从第二经基因组修饰的植物细胞再生克隆的经基因组修饰的植物；
d.使所述克隆的经基因组修饰的植物与染色体加倍剂接触，持续足以产生双单倍体胚的时间段；以及
e.再生所述克隆的经基因组修饰的植物。
60.一种提高玉蜀黍单倍体诱导物系的单倍体诱导能力的方法，所述方法包括：
(g)获得用单倍体诱导表达盒转化的具有已知单倍体诱导能力的玉蜀黍植物，所述单倍体诱导表达盒包含：
iv.已知的形态发育基因，或
v.胚发生因子，或
vi.(i)和(ii)的组合；
(h)获得供体植物，其中所述供体植物提供供体雌穗；
(i)用来自转化的单倍体诱导物的花粉给所述供体雌穗的雌穗授粉；
(j)选择至少一个通过授粉步骤(c)产生的单倍体后代，其中所述单倍体后代包含供体植物的基因组，但不包含转化的单倍体诱导物植物的基因组；
(k)使所述单倍体胚与染色体加倍剂接触，持续足以产生双单倍体胚的时间段；以及
(l)从(e)的所述双单倍体胚再生所述双单倍体植物。
61.如权利要求59所述的方法，其中可转化的玉蜀黍植物选自和/或衍生自包含系Stock6、RWK、RWZ、UH400的组。
62.一种用于产生单倍体植物胚的方法，所述方法包括以下步骤：
a.提供包含细胞重编程剂的小孢子或花粉；
b.用所述小孢子或花粉给要制备单倍体胚的植物的胚囊细胞，特别是卵细胞授粉；
c.允许所述小孢子或花粉在所述胚囊细胞，特别是所述卵细胞中或附近释放所述细胞重编程剂，以改善用于获得单倍体植物胚的方法。
63.如权利要求2所述的方法，其中所述细胞重编程多肽包含催化失活的Casα(dCasα)内切核酸酶，所述内切核酸酶包含与SEQ ID NO：219-226之一至少85％至100％相同的氨基酸序列
具有细胞重编程活性的翻译融合蛋白，所述方法包括：
a.将包含选自下组的氨基酸序列的多肽引入细胞：dCasα染色质修饰性翻译融合蛋白，其包含：
i.与SEQ ID NO：67至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
ii与SEQ ID NO：68至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
iii.与SEQ ID NO：69至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
iv.与SEQ ID NO：70至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
v.与SEQ ID NO：71至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
vi.与SEQ ID NO：72至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
b.将所述多肽与包含选自下组的氨基酸序列的多肽组合引入细胞：翻译融合蛋白，其包含含有以下的dCasα-转录激活物融合蛋白：
i.如表14中所示的灭活的Casα，以及；
ii拟南芥属CBF1蛋白(编码多肽SEQ ID No：86的多核苷酸SEQ ID NO：85)的转录激活物结构域，或
iii.VP64结构域(编码多肽SEQ ID NO：245的多核苷酸SEQ ID NO：244)的转录激活物结构域；
c.将所述多肽与包含选自下组的氨基酸序列的多肽组合引入细胞：翻译融合蛋白，其包含由以下组成的dCasα转录阻遏物融合蛋白：
i.如表16中所示的转录阻遏物基序；
ii如表17中所示的转录阻遏物结构域。
64.将如权利要求63所述的蛋白质与至少一种指导RNA(gRNA)组合，从而建立核糖核蛋白复合物，其包含
a.设计与跟编码WUS蛋白的基因座具有同一性的序列具有同源性的gRNA序列，所述WUS蛋白促进细胞重编程；
b.设计与跟编码BBM蛋白的基因座具有同一性的序列具有同源性的gRNA序列，所述BBM蛋白促进细胞重编程；
c.设计与跟编码LEC1蛋白的基因座具有同一性的序列具有同源性的gRNA序列，所述LEC1蛋白促进细胞重编程；
d.设计与跟编码胚发生因子蛋白的基因座(编码多肽SEQ ID NO：17至32的多核苷酸SEQ ID NO：1至16)具有同一性的序列具有同源性的gRNA序列，所述胚发生因子蛋白促进细胞重编程；
e.设计与跟编码C2H2型锌指蛋白的基因座具有同一性的序列具有同源性的gRNA序列，所述C2H2型锌指蛋白阻遏细胞重编程因子；
f.设计与跟编码MADS-盒转录因子蛋白的基因座具有同一性的序列具有同源性的gRNA序列，所述MADS-盒转录因子蛋白阻遏细胞重编程因子；
g.设计与跟编码多梳组(PcG)蛋白或其亚基的基因座具有同一性的序列具有同源性的gRNA序列，所述多梳组(PcG)蛋白或其亚基阻遏细胞重编程；
h.设计与跟编码CHD3染色质重塑因子或其亚基的基因座具有同一性的序列具有同源性的gRNA序列，所述CHD3染色质重塑因子或其亚基阻遏细胞重编程。
65.如权利要求64所述的方法，其中针对基因座设计gRNA包括：
a.选择位于编码gRNA靶位点的基因座侧翼的DNA序列，包括所述基因座上游或下游高达10,000个核苷酸的近端调节区，或
b.选择位于编码gRNA靶位点的基因座侧翼的DNA序列，包括所述基因座上游或下游超过10,000个核苷酸的顺式调节元件，或
c.(a)和(b)和(c)的方法，或其任何组合。
66.如权利要求63所述的方法，其中使用多核苷酸将dCasα翻译融合多肽引入细胞，其包括：
a.将含有dCasα翻译融合蛋白质表达盒和指导RNA表达盒的双链或单链DNA多核苷酸附接到粒子上用于引入并递送到细胞中，或
b.将含有dCasα翻译融合蛋白质表达盒的双链或单链DNA多核苷酸和作为RNA分子的至少一种单一gRNA附接到粒子上用于引入并递送到细胞中，或
c.将含有dCasα翻译融合蛋白的RNA多核苷酸和含有指导RNA表达盒的双链或单链DNA多核苷酸附接到粒子上用于引入并递送到细胞中，或
d.将含有dCasα翻译融合蛋白的RNA多核苷酸和作为RNA分子的至少一种单一gRNA附接到粒子上用于引入并递送到细胞中。
67.如权利要求63所述的方法，其中使用多肽将所述dCasα翻译融合蛋白引入植物细胞，其包括：
a.将含有dCasα翻译融合蛋白的多肽和含有指导RNA表达盒的双链或单链DNA多核苷酸附接到粒子上用于引入并递送到细胞中；
b.将含有dCasα翻译融合蛋白的多肽和作为RNA分子的至少一种单一gRNA附接到粒子上用于引入并递送到细胞中。
68.如权利要求67所述的方法，其中将所述dCasα翻译融合蛋白与细胞穿透肽融合，所述细胞穿透肽包含：
a.玉蜀黍(Z.mays)knotted1 CPP(SEQ ID NO：49)，
b.粟酒酵母(Saccharomyces pombe)TP10CPP(SEQ ID NO：51)，
c.白色念珠菌(Candida albicans)Zebra CPP(SEQ ID NO：53)，
d.PEP1 CPP(SEQ ID NO：55).
e.HIV-1 TAT CPP(SEQ ID NO：57).和
f.γ-玉米醇溶蛋白细胞穿透肽(SEQ ID NO：59)。
69.如权利要求63-69所述的方法，其中所述处理包括将植物细胞暴露于与一种或多种gRNA复合的两种或更多种dCasα和/或dCas9翻译融合蛋白以从经处理的细胞获得植物。
70.一种用于获得转基因植物的方法，所述方法包括：
a.用包含至少一种编码胚发生因子多肽的多核苷酸的表达盒转化植物细胞以获得转化的植物组织；
b.从由所述多核苷酸表达的蛋白质接触的组织的细胞再生转化的植物；以及
c.选择存在基因组修饰的遗传工程化的植物。
71.如权利要求71所述的方法，其中所述胚发生因子多肽包含：
a.与SEQ ID NO：17至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
b.与SEQ ID NO：18至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
c.与SEQ ID NO：19至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
d.与SEQ ID NO：20至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
e.与SEQ ID NO：21至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
f.与SEQ ID NO：22至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
g.与SEQ ID NO：23至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列；
h.与SEQ ID NO：24至少70％(例如，至少80％、90％、95％或98％)相同的氨基酸序列。
72.一种用于对靶基因进行基因座特异性基因调节的方法，所述方法包括：
a.向细胞提供链特异性RNA转录物，其中所述链特异性RNA转录物含有与DNA调节元件同源的序列；
b.使所述链特异性RNA转录物结合至RNA结合蛋白；以及
c.转换基因调节表达状态，其中所述DNA调节元件取决于转录方向可以用作增强子或阻遏子；
d.改善所述经处理的细胞的细胞重编程；
e.从所述经处理的细胞再生植物。
73.一种用于改善植物细胞中细胞重编程的方法，所述方法包括向细胞提供与蛋白质结合的RNA分子，从而降低所述蛋白质的酶活性。
74.如权利要求75所述的方法，其中所述RNA分子是非编码RNA。
75.如权利要求76所述的方法，其中所述非编码RNA与响应元件具有序列同源性。
76.如权利要求76所述的方法，其中所述响应元件是三胸复合体响应元件。
77.如权利要求76所述的方法，其中所述RNA分子可以是。
78.如权利要求76所述的方法，其中所述RNA分子以链特异性方式转录。
79.如权利要求75所述的方法，其中所述蛋白质是多梳组复合物的亚基。
80.如权利要求81所述的方法，其中多梳组复合物活性降低导致基因沉默减少。
81.如权利要求8所述的方法，其中基因沉默的减少是由沉默的组蛋白修饰的损失，例如组蛋白3上赖氨酸27的三甲基化(H3K27me3)的损失引起的。
82.一种获得双单倍体植物的方法，所述方法包括：
(e)获得用表达盒转化的第一植物，所述表达盒包含：
iv.形态发育基因，或
v.胚发生因子，或
vi.(i)和(ii)，或其任何组合；
(f)获得第二植物，其中所述第二植物包含标记基因；
(g)用来自所述第二植物的花粉给所述第一植物授粉；
(h)选择至少一个通过授粉步骤(c)产生的单倍体后代，其中所述单倍体后代包含第一植物的基因组，但不包含所述第二植物的基因组。
83.如权利要求81所述的方法，其中所述标记基因选自下组，该组包含：GUS、PMI、PAT、GFP、RFP、CFP、C1、CRC、R-nj、R1-scm和花青苷色素。
84.如权利要求81所述的方法，其中所述单倍体后代用染色体加倍剂处理，从而产生经编辑的双单倍体后代。
85.如权利要求83所述的方法，所述染色体加倍剂是秋水仙碱、拿草特、滴停平、氟乐灵或另一种已知的抗微管剂。
86.如权利要求83所述的方法，所述方法进一步包括分离和培养所述双单倍体植物胚。
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