CN116456824A - 孤雌生殖因子及其使用方法 - Google Patents

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J·A·T·雷恩德斯
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Abstract

孤雌生殖是无性生殖的一种自然形式，其中在不通过精子受精的情况下发生胚的生长和发育。将肽用作孤雌生殖因子，特别地包含编码基因产物的多肽或多核苷酸，这些基因产物用于从雌配子生成双单倍体或单倍体植物。

Description

孤雌生殖因子及其使用方法
技术领域
本公开涉及植物分子生物学和植物育种领域。
相关申请的交叉引用
本申请要求于2020年10月21日提交的美国临时申请号63/094,763和于2020年10月21日提交的美国临时申请号63/094,774的优先权，这两件临时申请据此通过引用以其全文并入本文。
以电子方式递交的序列表的引用
该序列表的官方副本经由EFS-Web作为ASCII格式的序列表以电子方式提交，文件名为20211020_8527-WO-PCT_ST25，创建于2021年10月20日，且具有2,906,173字节大小，并与本说明书同时提交。包含在所述ASCII格式的文件中的序列表是本说明书的一部分并且通过引用以其整体并入本文。
背景技术
植物育种计划通过筛选许多植物以鉴定具有所需特征的个体来鉴定新品种。典型地，理想地跨多年和多种环境培养和评估来自杂交的大量子代，以选择具有最需要的特征的植物。
典型的育种方法使两种亲本植物杂交，并且子代1杂交体(F1杂交体)是第一杂交(F1)世代。当来自不同杂合组的两种亲本株(典型地近交株)杂交时，观察到商业F1杂交体中的杂交体活力。杂交体活力(由于组合了其亲本的遗传贡献而产生的任何生物品质的改善的或增加的功能)对于商业玉蜀黍种子生产是重要的。商业杂交性能的改善需要持续开发新的近交亲本系。
玉蜀黍近交系开发方法可以使用母本(产生雌性特征的)双单倍体生产，其中从第一代杂交产生的植物的雌穗(已经用来自所谓的“单倍体诱导”系的花粉受精)受精后，选择母本单倍体胚。与继承母本和父本基因组二者的拷贝相反，用单倍体诱导株的花粉对雌花进行授粉导致仅含有单倍体母本基因组的胚珠水平升高，因此产生母本单倍体胚。雌花内的胚珠是减数分裂的产物，并且每个母本胚珠都是独特的减数分裂重组单倍体基因组，从而允许使用包括染色体加倍处理在内的体外组织培养方法分离和处理未成熟的母本单倍体胚，以使得快速生成母本双单倍体重组群体成为可能。通过用来自玉蜀黍单倍体诱导物系的花粉对目标植物受精产生的许多玉蜀黍母本单倍体胚无法再生为可育的、双单倍体植物，并且如果有的话，也很少有体外组织培养和小植株再生方法会从一个单倍体胚繁殖出多个可育植物。因此，需要改善生产来自玉蜀黍中母本配子双单倍体的双单倍体植物的方法。
因此，植物育种者还将受益于开发重组近交系群体的方法，所述重组近交系不需要大量授粉控制方法或不需要延长将自体受精系繁殖为等基因态所需的时间。
发明内容
本公开提供了生产双单倍体植物的方法，其包括：a)向植物细胞提供表达盒，该表达盒包含i)孤雌生殖形态发育基因；和ii)可操作地连接到卵细胞启动子的孤雌生殖因子；b)再生含有该表达盒的T0植物；c)用花粉对该T0植物进行授粉；d)从该T0植物的孤雌生殖母本配子体获得单倍体胚；以及e)从该单倍体胚再生单倍体植物。在一方面，表达盒进一步包含iii)可操作地连接到卵细胞启动子的遗传染色体加倍剂，其中仅具有母本染色体的孤雌生殖母本配子体为二倍化的；f)从二倍化的孤雌生殖母本配子体获得二倍体胚；以及g)从该二倍体胚再生双单倍体植物。在一方面，方法进一步包括h)使单倍体胚与染色体加倍剂接触，持续足以生成双单倍体胚的时间段；以及i)从该双单倍体胚再生双单倍体植物。在一方面，染色体加倍剂选自表1。在一方面，方法进一步包括k)使单倍体植物与染色体加倍剂接触，持续足以生成双单倍体植物的时间段。在一方面，染色体加倍剂选自表1。在一方面，表达盒进一步包含iv)调节孤雌生殖形态发育基因、孤雌生殖因子、或孤雌生殖形态发育基因和孤雌生殖因子两者、和/或孤雌生殖的内源性阻遏子的表达以提供T0植物的母本孤雌生殖配子体的工具。在一方面，表达盒进一步包含v)可操作地连接到胚发生启动子的CRE重组酶，其中表达盒侧翼为loxP识别位点并且其中表达盒被切除。在一方面，孤雌生殖形态发育基因包含编码Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽的核苷酸序列。在一方面，编码Babyboom(BBM)多肽的所述核苷酸序列选自由BBM、BBM2、BMN2和BMN3组成的组，或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽是ODP2。在一方面，孤雌生殖形态发育基因选自：a)编码选自SEQID NO：11-20、162或164中的任一者的Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽的核苷酸序列；或b)编码与SEQ ID NO：11-20、162或164中的任一者具有至少95％序列同一性的Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽的核苷酸序列；或c)编码与SEQ ID NO：11-20、162或164中的任一者具有至少85％序列同一性的Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽的核苷酸序列。在一方面，孤雌生殖因子选自表13。在一方面，调节孤雌生殖形态发育基因、孤雌生殖因子、或孤雌生殖形态发育基因和孤雌生殖因子两者、和/或孤雌生殖的内源性阻遏子的表达的工具是对该孤雌生殖形态发育基因、该孤雌生殖因子、或该孤雌生殖形态发育基因和该孤雌生殖因子两者、和/或孤雌生殖的该内源性阻遏子的表达进行修饰、控制或稳定的翻译融合蛋白，其中该翻译融合蛋白上调和/或下调该孤雌生殖形态发育基因、该孤雌生殖因子、或该孤雌生殖形态发育基因和该孤雌生殖因子两者、和/或孤雌生殖的该内源性阻遏子的表达。在一方面，花粉来自单倍体诱导物或非单倍体诱导物。在一方面，单倍体诱导物或非单倍体诱导物包含标记基因。在一方面，标记基因选自选择性标记、报告基因、可见内源性形态标记及其组合。在一方面，选择性标记选自由以下组成的组：GUS、PMI、PAT及其组合。在一方面，报告基因选自由以下组成的组：GFP、RFP、CFP及其组合。在一方面，可见内源性形态标记选自由以下组成的组：B1、R-nj、R1-scm、花青素色素及其组合。在一方面，从二倍化的孤雌生殖母本配子体获得二倍体胚进一步包括从二倍化的孤雌生殖T0植物获得双单倍体胚，其中该双单倍体胚缺乏标记基因。在一方面，从二倍化的孤雌生殖母本配子体获得二倍体胚进一步包括获得具有缺乏标记基因的二倍化母本胚的成熟种子以及使该成熟种子萌发以获得双单倍体植物。在一方面，遗传染色体加倍剂包含编码周期蛋白基因家族成员的核苷酸序列。在一方面，周期蛋白基因家族成员选自表18或为Dz470(SEQ ID NO：110)。在一方面，卵细胞启动子选自表11或表12。在一方面，卵细胞启动子进一步包含选自表9的EME。在一方面，卵细胞启动子进一步包含选自表10的增强子。在一方面，表达盒进一步包含基因组修饰组分。在一方面，基因编辑组分使用DNA修饰酶，该DNA修饰酶是选自由以下组成的组的定点核酸酶：大范围核酸酶(MN)、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活物样效应物核酸酶(TALEN)、Cas9核酸酶、Casa核酸酶、Cpf1核酸酶、dCas9-FokI、dCpf1-FokI、嵌合Cas9-胞苷脱氨酶、嵌合Cas9腺嘌呤脱氨酶、嵌合FEN1-Fok1、Mega-TAL、切口酶Cas9(nCas9)、嵌合dCas9-非-FokI核酸酶、和dCpf1-非-FokI核酸酶。
本公开提供了一种生产经基因组编辑的双单倍体植物的方法，该方法包括：a)向母本配子体提供表达盒，该表达盒包含i)孤雌生殖形态发育基因；和ii)可操作地连接到卵细胞启动子的孤雌生殖因子；b)再生含有该表达盒的To植物；c)用花粉对该T0植物进行授粉；d)从该T0植物的孤雌生殖母本配子体获得单倍体胚；以及e)从该单倍体胚再生单倍体植物。本公开提供了表达盒，该表达盒进一步包含iii)可操作地连接到卵细胞启动子的遗传染色体加倍剂，其中仅具有母本染色体的孤雌生殖母本配子体为二倍化的；f)从二倍化的孤雌生殖母本配子体获得二倍体胚；以及g)从该二倍体胚再生双单倍体植物。在一方面，方法进一步包括h)使单倍体胚与染色体加倍剂接触，持续足以生成双单倍体胚的时间段；以及i)从该双单倍体胚再生双单倍体植物。在一方面，染色体加倍剂选自表1。在一方面，方法进一步包括k)使单倍体植物与染色体加倍剂接触，持续足以生成双单倍体植物的时间段。在一方面，染色体加倍剂选自表1。在一方面，表达盒进一步包含iv)调节孤雌生殖形态发育基因、孤雌生殖因子、或孤雌生殖形态发育基因和孤雌生殖因子两者、和/或孤雌生殖的内源性阻遏子的表达以提供T0植物的母本孤雌生殖配子体的工具。在一方面，表达盒进一步包含v)基因组修饰组分。在一方面，表达盒进一步包含vi)可操作地连接到胚发生启动子的CRE重组酶，其中表达盒侧翼为loxP识别位点并且其中表达盒被切除。在一方面，孤雌生殖形态发育基因包含编码Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽的核苷酸序列。在一方面，编码Babyboom(BBM)多肽的所述核苷酸序列选自由BBM、BBM2、BMN2和BMN3组成的组，或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽是ODP2。在一方面，孤雌生殖形态发育基因选自：a)编码选自SEQ ID NO：11-20、162或164中的任一者的Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽的核苷酸序列；或b)编码与SEQ ID NO：11-20、162或164中的任一者具有至少95％序列同一性的Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽的核苷酸序列；或c)编码与SEQ ID NO：11-20、162或164中的任一者具有至少85％序列同一性的Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽的核苷酸序列。在一方面，孤雌生殖因子选自表13。在一方面，调节孤雌生殖形态发育基因、孤雌生殖因子、或孤雌生殖形态发育基因和孤雌生殖因子两者、和/或孤雌生殖的内源性阻遏子的表达的工具是对该孤雌生殖形态发育基因、该孤雌生殖因子、或该孤雌生殖形态发育基因和该孤雌生殖因子两者、和/或孤雌生殖的该内源性阻遏子的表达进行修饰、控制或稳定的翻译融合蛋白，其中该翻译融合蛋白上调和/或下调该孤雌生殖形态发育基因、该孤雌生殖因子、或该孤雌生殖形态发育基因和该孤雌生殖因子两者、和/或孤雌生殖的该内源性阻遏子的表达。在一方面，花粉来自单倍体诱导物或非单倍体诱导物。在一方面，单倍体诱导物或非单倍体诱导物包含标记基因。在一方面，标记基因选自选择性标记、报告基因、可见内源性形态标记及其组合。在一方面，选择性标记选自由以下组成的组：GUS、PMI、PAT及其组合。在一方面，报告基因选自由以下组成的组：GFP、RFP、CFP及其组合。在一方面，可见内源性形态标记选自由以下组成的组：B1、R-nj、R1-scm、花青素色素及其组合。在一方面，其中从二倍化的孤雌生殖母本配子体获得二倍体胚进一步包括从二倍化的孤雌生殖T0植物获得双单倍体胚，其中该双单倍体胚缺乏标记基因。在一方面，从二倍化的孤雌生殖母本配子体获得二倍体胚进一步包括获得具有缺乏标记基因的二倍化母本胚的成熟种子以及使该成熟种子萌发以获得双单倍体植物。在一方面，遗传染色体加倍剂包含编码周期蛋白基因家族成员的核苷酸序列。在一方面，周期蛋白基因家族成员选自表18或为Dz470(SEQ ID NO：110)。在一方面，卵细胞启动子选自表11或表12。在一方面，卵细胞启动子进一步包含选自表9的EME。在一方面，卵细胞启动子进一步包含选自表10的增强子。在一方面，基因编辑组分使用DNA修饰酶，该DNA修饰酶是选自由以下组成的组的定点核酸酶：大范围核酸酶(MN)、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活物样效应物核酸酶(TALEN)、Cas9核酸酶、Casα核酸酶、Cpf1核酸酶、dCas9-FokI、dCpf1-FokI、嵌合Cas9-胞苷脱氨酶、嵌合Cas9腺嘌呤脱氨酶、嵌合FEN1-Fok1、Mega-TAL、切口酶Cas9(nCas9)、嵌合dCas9-非-FokI核酸酶、和dCpf1-非-FokI核酸酶。
本公开提供了生产双单倍体植物的方法，其包括：a)向植物细胞提供表达盒，该表达盒包含i)可操作地连接到卵细胞启动子的孤雌生殖形态发育基因或孤雌生殖因子；和ii)可操作地连接到卵细胞启动子的遗传染色体加倍剂；b)再生含有该表达盒的T0植物；其中该T0植物的母本配子体通过孤雌生殖形态发育基因或孤雌生殖因子而成为孤雌生殖的，以提供母本孤雌生殖配子体，并且其中仅具有母本染色体的母本孤雌生殖配子体为二倍化的；c)用花粉对该T0植物进行授粉；d)从二倍化的孤雌生殖母本配子体T0植物获得二倍体胚；以及e)从该二倍体胚再生双单倍体植物。在一方面，表达盒进一步包含iii)调节孤雌生殖形态发育基因或孤雌生殖因子和/或孤雌生殖的内源性阻遏子的表达的工具，其中使母本配子体成为孤雌生殖的。在一方面，表达盒进一步包含iv)可操作地连接到胚发生启动子的CRE重组酶，其中表达盒侧翼为loxP识别位点并且其中表达盒被切除。在一方面，孤雌生殖形态发育基因包含编码Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽的核苷酸序列。在一方面，编码Babyboom(BBM)多肽的所述核苷酸序列选自由BBM、BBM2、BMN2和BMN3组成的组，或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽是ODP2。在一方面，孤雌生殖形态发育基因选自：a)编码选自SEQ ID NO：11-20、162或164中的任一者的Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽的核苷酸序列；或b)编码与SEQ ID NO：11-20、162或164中的任一者具有至少95％序列同一性的Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽的核苷酸序列；或c)编码与SEQID NO：11-20、162或164中的任一者具有至少85％序列同一性的Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽的核苷酸序列。在一方面，孤雌生殖因子选自表13。在一方面，调节孤雌生殖形态发育基因或孤雌生殖因子和/或孤雌生殖的内源性阻遏子的表达的工具是对孤雌生殖形态发育基因或孤雌生殖因子的表达进行修饰、控制或稳定的翻译融合蛋白，其中该翻译融合蛋白上调和/或下调孤雌生殖形态发育基因或孤雌生殖因子和/或孤雌生殖的内源性阻遏子的表达。在一方面，花粉来自单倍体诱导物或非单倍体诱导物。在一方面，单倍体诱导物或非单倍体诱导物包含标记基因。在一方面，标记基因选自选择性标记、报告基因、可见内源性形态标记及其组合。在一方面，选择性标记选自由以下组成的组：GUS、PMI、PAT及其组合。在一方面，报告基因选自由以下组成的组：GFP、RFP、CFP及其组合。在一方面，可见内源性形态标记选自由以下组成的组：B1、R-nj、R1-scm、花青素色素及其组合。在一方面，从二倍化的孤雌生殖母本配子体获得二倍体胚进一步包括从二倍化的孤雌生殖T0植物获得双单倍体胚，其中该双单倍体胚缺乏标记基因。在一方面，从二倍化的孤雌生殖母本配子体获得二倍体胚进一步包括获得具有缺乏标记基因的二倍化母本胚的成熟种子以及使该成熟种子萌发以获得双单倍体植物。在一方面，遗传染色体加倍剂包含编码周期蛋白基因家族成员的核苷酸序列。在一方面，周期蛋白基因家族成员选自表18或为Dz470(SEQ IDNO：110)。在一方面，卵细胞启动子选自表11或表12。在一方面，卵细胞启动子进一步包含选自表9的EME。在一方面，卵细胞启动子进一步包含选自表10的增强子。在一方面，表达盒进一步包含基因组修饰组分。在一方面，基因编辑组分使用DNA修饰酶，该DNA修饰酶是选自由以下组成的组的定点核酸酶：大范围核酸酶(MN)、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活物样效应物核酸酶(TALEN)、Cas9核酸酶、Casα核酸酶、Cpf1核酸酶、dCas9-FokI、dCpf1-FokI、嵌合Cas9-胞苷脱氨酶、嵌合Cas9腺嘌呤脱氨酶、嵌合FEN1-Fok1、Mega-TAL、切口酶Cas9(nCas9)、嵌合dCas9-非-FokI核酸酶、和dCpf1-非-FokI核酸酶。
本公开提供了生产双单倍体植物的方法，其包括：a)向植物细胞提供表达盒，该表达盒包含i)孤雌生殖形态发育基因；和ii)可操作地连接到卵细胞启动子的翻译融合蛋白；b)再生含有表达盒的T0植物；其中该T0植物的母本配子体通过孤雌生殖形态发育基因和/或翻译融合蛋白而成为孤雌生殖的，以提供母本孤雌生殖配子体；c)用花粉对该T0植物进行授粉；d)从孤雌生殖母本配子体获得单倍体胚；以及e)从该单倍体胚再生单倍体植物。在一方面，表达盒进一步包含iii)可操作地连接到卵细胞启动子的遗传染色体加倍剂，其中仅具有母本染色体的母本孤雌生殖配子体为二倍化的；f)从二倍化的孤雌生殖母本配子体获得二倍体胚；以及g)从该二倍体胚再生双单倍体植物。在一方面，方法进一步包括h)使单倍体胚与染色体加倍剂接触，持续足以生成双单倍体胚的时间段；以及j)从该双单倍体胚再生双单倍体植物。在一方面，染色体加倍剂选自表1。在一方面，方法进一步包括k)使单倍体植物与染色体加倍剂接触，持续足以生成双单倍体植物的时间段。在一方面，染色体加倍剂选自表1。在一方面，表达盒进一步包含v)可操作地连接到胚发生启动子的CRE重组酶，其中表达盒侧翼为loxP识别位点并且其中表达盒被切除。在一方面，翻译融合蛋白通过抑制孤雌生殖的内源性阻遏子来调节孤雌生殖形态发育基因的表达。在一方面，孤雌生殖形态发育基因包含编码Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽的核苷酸序列。在一方面，编码Babyboom(BBM)多肽的所述核苷酸序列选自由BBM、BBM2、BMN2和BMN3组成的组，或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽是ODP2。在一方面，孤雌生殖形态发育基因选自：a)编码选自SEQID NO：11-20、162或164中的任一者的Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽的核苷酸序列；或b)编码与SEQ ID NO：11-20、162或164中的任一者具有至少95％序列同一性的Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽的核苷酸序列；或c)编码与SEQ ID NO：11-20、162或164中的任一者具有至少85％序列同一性的Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽的核苷酸序列。在一方面，孤雌生殖形态发育基因的阻遏子选自表13。在一方面，花粉来自单倍体诱导物或非单倍体诱导物。在一方面，单倍体诱导物或非单倍体诱导物包含标记基因。在一方面，标记基因选自选择性标记、报告基因、可见内源性形态标记及其组合。在一方面，选择性标记选自由以下组成的组：GUS、PMI、PAT及其组合。在一方面，报告基因选自由以下组成的组：GFP、RFP、CFP及其组合。在一方面，可见内源性形态标记选自由以下组成的组：B1、R-nj、R1-scm、花青素色素及其组合。在一方面，从二倍化的孤雌生殖母本配子体获得二倍体胚进一步包括从二倍化的孤雌生殖T0植物获得双单倍体胚，其中该双单倍体胚缺乏标记基因。在一方面，从二倍化的孤雌生殖母本配子体获得二倍体胚进一步包括获得具有缺乏标记基因的二倍化母本胚的成熟种子以及使该成熟种子萌发以获得双单倍体植物。在一方面，遗传染色体加倍剂包含编码周期蛋白基因家族成员的核苷酸序列。在一方面，周期蛋白基因家族成员选自表18或为Dz470(SEQ ID NO：110)。在一方面，卵细胞启动子选自表11或表12。在一方面，卵细胞启动子进一步包含选自表9的EME。在一方面，卵细胞启动子进一步包含选自表10的增强子。在一方面，表达盒进一步包含基因组修饰组分。在一方面，基因编辑组分使用DNA修饰酶，该DNA修饰酶是选自由以下组成的组的定点核酸酶：大范围核酸酶(MN)、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活物样效应物核酸酶(TALEN)、Cas9核酸酶、Casα核酸酶、Cpf1核酸酶、dCas9-FokI、dCpf1-FokI、嵌合Cas9-胞苷脱氨酶、嵌合Cas9腺嘌呤脱氨酶、嵌合FEN1-Fok1、Mega-TAL、切口酶Cas9(nCas9)、嵌合dCas9-非-FokI核酸酶、和dCpf1-非-FokI核酸酶。
本公开提供了一种通过单倍体诱导进行基因组编辑的方法，该方法包括通过单倍体诱导物系提供一个或多个指导RNA，其中该单倍体诱导物系不包含稳定整合的指导RNA结合蛋白，并且使该单倍体诱导物系与第二植物杂交以产生单倍体母本细胞，其中该母本细胞含有指导RNA结合蛋白，该指导RNA结合蛋白能够与该一个或多个指导RNA形成复合物并且在母本细胞的基因组中引入一种或多种靶向基因组改变。在一方面，单倍体诱导物系和第二植物是能够远缘杂交或异型杂交的不同植物物种。在一方面，指导RNA结合蛋白是通过体外步骤外源性地提供的。在一方面，指导RNA结合蛋白是通过杂交稳定整合的株系提供的。
本公开提供了一种植物细胞，该植物细胞包含父本提供的指导RNA和由母本衍生的指导RNA结合蛋白，其中指导RNA是通过单倍体诱导物系提供的。在一方面，植物细胞通过染色体加倍而加倍。在一方面，将指导RNA多重化以靶向植物细胞的基因组中的多个位点。
本公开提供了一种在没有卵细胞受精的情况下从开花植物中的一个或多个配子体或孢子体细胞产生克隆无融合生殖植物的方法，该方法包括：a)用包含编码至少一种孤雌生殖因子的多核苷酸的表达盒转化植物细胞，该至少一种孤雌生殖因子与表13中所列的至少一种多肽具有至少85％的序列同一性，其中在没有卵细胞受精的情况下为所转化的植物细胞的配子体或孢子体细胞提供该至少一种孤雌生殖因子多肽的活性；b)使胚从该配子体或孢子体细胞发育；以及c)从该配子体或孢子体细胞衍生出子代植物，其中该子代植物含有来自所转化的植物细胞的染色体，从而在没有卵细胞受精的情况下实现开花植物的繁殖。在一方面，多核苷酸可操作地连接到能够调节孢子发生组织、内珠被、珠心和/或大孢子母细胞中的基因表达的调节元件。在一方面，胚由未减数植物细胞形成。在一方面，未减数植物细胞是卵细胞。在一方面，未减数植物细胞由体细胞形成。
本公开提供了一种在没有卵细胞受精的情况下从开花植物中的一个或多个配子体或孢子体细胞产生克隆无融合生殖植物的方法，该方法包括：a)用表达盒转化植物细胞，该表达盒包含i)可操作地连接到孢予发生启动子的编码第一翻译融合蛋白的第一多核苷酸，其中配子体或孢子体细胞通过该第一翻译融合蛋白对内源性孤雌生殖形态发育基因的调节活性而成为孤雌生殖的；和/或ii)可操作地连接到孢子发生启动子的编码第二翻译融合蛋白的第二多核苷酸，其中配子体或孢子体细胞通过该第二翻译融合蛋白对孤雌生殖的内源性阻遏子和/或赋予减数分裂的基因的调节活性而成为孤雌生殖的；b)再生T0植物，其中该T0植物提供不减数、非重组配子；c)在没有卵细胞受精的情况下从不减数、非重组配子获得胚；以及d)从和该胚获得子代植物。在一方面，调节活性包括对内源性孤雌生殖形态发育基因、和/或孤雌生殖的内源性阻遏子、和/或赋予减数分裂的基因的表达进行修饰、控制或稳定，其中翻译融合蛋白上调和/或下调孤雌生殖形态发育基因、和/或孤雌生殖的内源性阻遏子、和/或赋予减数分裂的基因的表达。
本公开提供了一种生产无融合生殖植物的方法，该方法包括：a)用以下转化植物细胞：i)第一表达盒，其包含编码活化孤雌生殖的第一基因产物蛋白的多核苷酸，和ii)第二表达盒，其包含编码第二基因产物的多核苷酸，该第二基因产物抑制孤雌生殖的阻遏子和/或阻遏减数分裂所需的基因；b)再生T0植物，其中该T0植物的大孢子发生提供具有不减数(2n)、非重组基因组的母本配子体，该母本配子体在大孢子发生期间成为孤雌生殖的；c)从该T0植物的母本配子体获得孤雌生殖、不减数(2n)、非重组胚；以及d)从该胚获得克隆的、不减数(2n)、非重组植物。在一方面，活化孤雌生殖的基因产物蛋白包含：a)ODP2肽；或b)翻译融合蛋白，其中该融合蛋白包含i)赋予基因组靶位点结合特异性的识别结构域；和ii)在基因组靶位点处赋予增加的调节活性的调节结构域。在一方面，编码活化孤雌生殖的第一基因产物蛋白的多核苷酸选自：a)编码选自SEQ ID NO：11-20、162或164中的任一者的Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽的核苷酸序列；或b)编码与SEQ ID NO：11-20、162或164中的任一者具有至少95％序列同一性的Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽的核苷酸序列；或c)编码与SEQ ID NO：11-20、162或164中的任一者具有至少85％序列同一性的Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽的核苷酸序列。在一方面，翻译融合蛋白具有包含Cas内切核酸酶的识别结构域。在一方面，Cas内切核酸酶是选自表21的Cas-α内切核酸酶。在一方面，翻译融合蛋白具有包含转录激活因子和/或染色质修饰结构域的调节结构域。在一方面，转录激活因子和/或染色质修饰结构域是选自表19的序列。在一方面，植物细胞在编码抑制孤雌生殖和/或作为减数分裂所需的基因产物的基因产物的基因座处包含功能丧失。在一方面，包含编码抑制孤雌生殖的阻遏子和/或阻遏减数分裂所需的基因的第二基因产物的多核苷酸的第二表达盒包含翻译融合蛋白，该翻译融合蛋白包含：a)赋予基因组靶位点结合特异性的识别结构域；和b)在基因组靶位点处赋予降低的调节活性的调节结构域。在一方面，通过获得在编码选自表13的基因的基因座处的突变来提供在编码孤雌生殖的阻遏子的基因座处的功能丧失。在一方面，通过以下方式提供在编码减数分裂所需的基因产物的基因座处的功能丧失突变：a)在编码内源性Spo11基因的基因座处的突变；b)在编码内源性Rec8基因的基因座处的突变；c)在编码内源性OSD1-1A基因的基因座处的突变；d)在编码内源性OSD1-3A基因的基因座处的突变；以及f)前述的组合。在一方面，功能丧失突变包括表现出MiMe表型的MiMe基因型。在一方面，翻译融合蛋白具有包含Cas内切核酸酶的识别结构域。在一方面，Cas内切核酸酶是选自表21的Cas-α内切核酸酶。在一方面，翻译融合蛋白具有包含转录阻遏子和/或染色质修饰结构域的调节结构域。在一方面，转录阻遏子是选自表22的阻遏子。在一方面，染色质修饰结构域含有选自表24的SET结构域。在一方面，将再生的T0植物用来自花粉供体的花粉受精。在一方面，花粉供体具有父本标记基因。在一方面，父本标记基因选自选择性标记、报告基因、可见内源性形态标记及其组合。在一方面，选择性标记选自由以下组成的组：GUS、PMI、PAT及其组合。在一方面，报告基因选自由以下组成的组：GFP、RFP、CFP及其组合。在一方面，可见内源性形态标记选自由以下组成的组：B1、R-nj、R1-scm、花青素色素及其组合。在一方面，孤雌生殖、不减数(2n)、非重组胚缺乏标记基因。在一方面，使用以下方法选择所述孤雌生殖、不减数(2n)、非重组胚：a)手动选择法；b)自动选择法；以及c)前述的组合。在一方面，花粉具有形态标记。在一方面，花粉具有赋予雌性不育表型的突变。
本公开提供了一种生产三倍体胚乳的方法，该方法包括用来自花粉供体的花粉给无融合生殖植物进行授粉。在一方面，花粉供体具有父本标记基因。在一方面，父本标记基因选自选择性标记、报告基因、可见内源性形态标记及其组合。在一方面，选择性标记选自由以下组成的组：GUS、PMI、PAT及其组合。在一方面，报告基因选自由以下组成的组：GFP、RFP、CFP及其组合。在一方面，可见内源性形态标记选自由以下组成的组：B1、R-nj、R1-scm、花青素色素及其组合。在一方面，花粉具有形态标记。在一方面，花粉具有赋予雌性不育表型的突变。
附图说明
图1显示了在本公开中使用的单倍体孤雌生殖质粒(PHP94831、PHP92900、RV036687、RV036691、RV036689、RV036690、RV036688、RV036694、RV036693和RV036695)。由每个质粒(PHP)编码的ZM-ODP2(玉蜀黍(Zea mays)胚珠发育蛋白2)肽以图形形式表示。显示了与由PHP94831编码的全长ZM-ODP2肽相关的注释。特别地，在第一个氨基酸残基(1)和最后一个氨基酸残基(710)处标记出由PHP94831编码的ZM-ODP2肽。此外，标记出基序B(Ala60-Gal69)和基序A(Ile156-Pro171)的编码结构域以及两个保守的APETALA2(AP2)DNA结合结构域(DBD)。还显示了具有在位置266(垂直虚线)和位置669(垂直虚线)处的边界的肽片段。对于编码合成肽的每个质粒(见RV036687、RV036694、RV036693和RV036695)，显示了具有接头序列(水平虚线)的各种肽片段的翻译融合。编码具有独特N末端起始位置的各种肽片段的质粒用对应于全长ZM-ODP2肽中残基位置的数字进行标记(见RV036687(位置1)、RV036689(位置155)、RV036690(位置59)、RV036688(位置231))。
图2显示了被子植物的生殖方式的示意图。有性生殖基于减数分裂和双受精。减数分裂具有两次生殖细胞减数分裂：减数分裂I和减数分裂II。在第一次分裂(减数分裂I)期间，父本和母本染色体交叉，交换基因，然后染色体对分离成两个单倍体细胞，其中每个所得单倍体细胞仅含有一半染色体数目和两个染色单体对。第二次减数分裂(减数分裂II)分离姊妹染色单体，导致单倍体(1n)配子的形成。来自父本和母本的配子结合以形成遗传上独特的二倍体合子，该受精卵发育成杂交胚。双受精是被子植物特有的现象，其中每个花粉粒产生两个精子。一个精子细胞核与卵子融合以形成合子，另一个与雌配子体的中央细胞融合以形成胚乳。通常，第二个精子与中央细胞内的两个胚乳核融合(2n)，以产生三倍体(3n)胚乳。孤雌生殖不涉及配子的结合，并且在没有受精的情况下发生。在一些情况下，发生减数分裂，并且形成的单倍体配子例如通过孤雌生殖单倍体诱导的方法产生母本单倍体胚。此类母本单倍体胚可以变成二倍体，从而产生双单倍体植物。孤雌生殖是一种需要授粉的生殖方式，并且一个精子与中央细胞内的两个胚乳核融合以产生三倍体胚乳(本文称为假受精)，但在母本单倍体胚内没有父本染色质的雄性遗传。植物的无性生殖可通过避免减数分裂产生克隆的、不减数(2n)、非重组配子来实现。此类不减数配子在没有受精的情况下能够变成不减数胚。避免减数分裂，允许亲本植物产生胚，该胚可在没有受精的情况下产生在遗传上与自身相同的克隆植物。未经中央细胞受精的胚乳发育称为自发无融合生殖。
图3A显示了农杆菌属(Agrobacterium)介导的F1未成熟胚转化的示意图，该未成熟胚获自亲本1(P1)与亲本2(P2)的双亲本杂交，其中用孤雌生殖因子(PF)转化的F1胚生长为成熟植物并且用作T0穗供体。每个半合子T0植物的雌配子内单倍体孤雌生殖构建体的预期分离比为50％野生型雌配子和50％含有单倍体孤雌生殖构建体的转基因雌配子。用来自花粉供体(诸如具有形态标记例如CFP颜色标记的非单倍体诱导物植物)的花粉对T0穗供体进行授粉。单倍体胚缺乏形态标记，并且易于与二倍体胚分离。
图3B显示了响应于图1中所示的分别由质粒PHP94831、PHP92900、RV036694、RV036693、RV036695、RV036687、RV036688、RV036689、RV036690和RV036691编码的ODP2变体的卵细胞表达的母本单倍体诱导率。显示了由各质粒(x轴)编码的每个ODP2变体的平均单倍体诱导频率(y轴)和观察到的标准偏差(误差条)。显示的平均单倍体诱导水平与用编码天然ZM-ODP2肽的质粒PHP94831所观察到的平均单倍体诱导水平显著不同(星号；双侧学生t检验(α＝0.05)，p＜0.05)。
图4A显示了农杆菌属介导的F1未成熟胚转化的示意图，该未成熟胚获自亲本3(P3)与亲本4(P4)的双亲本杂交，其中用孤雌生殖因子转化的F1胚生长为成熟植物并且用作T0穗供体。每个半合子T0植物的雌配子内单倍体孤雌生殖构建体的预期分离比为50％野生型雌配子和50％含有单倍体孤雌生殖构建体的转基因雌配子。用来自花粉供体(诸如具有形态标记例如CFP颜色标记的非单倍体诱导物植物)的花粉对T0穗供体进行授粉。单倍体胚缺乏形态标记，并且易于与二倍体胚分离。
图4B显示了响应于图1中所示的分别由质粒PHP94831、PHP92900、RV036694、RV036693、RV036695、RV036687、RV036688、RV036689、RV036690和RV036691编码的ODP2变体的卵细胞表达的母本单倍体诱导率。显示了由各质粒(x轴)编码的每个ODP2变体的平均单倍体诱导频率(y轴)和观察到的标准偏差(误差条)。显示的平均单倍体诱导水平与用编码天然ZM-ODP2肽的质粒PHP94831所观察到的平均单倍体诱导水平显著不同(星号；双侧学生t检验(α＝0.05)，p＜0.05)。
图5显示了农杆菌属介导的F1未成熟胚转化的示意图，该未成熟胚获自亲本5(P5)与亲本6(P6)的双亲本杂交，其中用孤雌生殖因子转化的F1胚生长为成熟植物并且用作T0穗供体。每个半合子T0植物的雌配子内单倍体孤雌生殖构建体的预期分离比为50％野生型雌配子和50％含有单倍体孤雌生殖构建体的转基因雌配子。用来自花粉供体(诸如具有形态标记例如R1-scm等位基因的单倍体诱导物植物)的花粉对T0穗供体进行授粉。单倍体胚缺乏形态标记，并且易于与二倍体胚分离。
图6显示了可用于基因组修饰和母本单倍体诱导的方法的示意图。将缺乏向母本细胞提供指导RNA的能力的用赋予孤雌生殖单倍体诱导和基因组修饰活性的构建体转化的转基因植物用作穗供体，用获自能够提供至少一个gRNA分子的转基因单倍体诱导物系的花粉对该穗供体进行授粉。穗供体是衍生自转化的植物细胞(例如包含可用于育种目的的第一子代(F1)杂交基因组的植物细胞)的植物。转化的植物具有含有多核苷酸的构建体，该多核苷酸编码：i)孤雌生殖形态发生基因，诸如BBM，其可操作地连接到卵细胞启动子，诸如卵细胞PV-EGG CELL PRO(TR1)启动子，导致PV-EGG CELL PRO：：BBM表达；ii)核酸酶基因，诸如Cas9或Cas-α核酸酶，其可操作地连接到启动子，诸如玉蜀黍泛素启动子(ZmUBI)，分别得到ZmUBIpro：：Cas 9或ZmUBIpro：：Cas-α表达盒；以及iii)重组酶基因，诸如Cre重组酶，其可操作地连接到胚发生启动子。花粉供体是衍生自转化来自单倍体诱导物系的植物细胞的转基因植物。例如，作为诸如Stock 6或其任何衍生物的诱导物的单倍体诱导物系，或具有马铃薯糖蛋白样磷脂酶A2基因功能丧失的植物细胞。花粉供体植物具有含有编码i)至少一种gRNA分子和ii)父本标记基因的多核苷酸的构建体。该图还显示了用转基因单倍体诱导物系(标记为“单倍体诱导杂交”，虚线箭头)的花粉对穗供体受精的活性，其中将花粉供体的gRNA提供给母本细胞，从而能够获得衍生自基因组修饰的母本配子体的经基因组修饰的双单倍体植物。
具体实施方式
在下文中参考附图更全面地描述本文的公开内容，其中示出了一些但不是所有的可能的方面。实际上，公开内容能以许多不同的形式体现，并且不应被解释为局限于本文所阐述的方面；而是提供这些方面，使得本公开能满足适用的法律要求。
所公开的方法和组合物所涉及的领域中的技术人员将考虑到，本文所公开的许多修改和其他方面具有以下描述和相关附图中呈现的传授的益处。因此，应当理解，这些公开内容不限于所公开的特定方面，并且修改和其他方面旨在包括在所附权利要求的范围内。尽管本文中采用了特定术语，但这些术语仅在一般性和描述性意义上使用而并非用于限制目的。
也应当了解本文所用的术语仅是为了描述特定方面而不旨在进行限制。如在说明书和权利要求中所使用的，术语“包含”可以包括“由......组成”的方面。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与所公开的方法和组合物所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。在本说明书和下面的权利要求中，参考本文中所定义的若干术语。
如本文所使用的，单数形式“一种(a)”、“一种(an)”以及“该(the)”包括复数个指示物，除非上下文中另外明确指明。因此，例如，提及“细胞”包括多个这样的细胞，并且提及“蛋白质”包括本领域技术人员已知的一种或多种蛋白质及其等效物，等等。本文所用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义，除非另有明确说明。
本说明书中提到的所有专利、出版物和专利申请指示了本公开所属领域技术人员的水平。将所有专利、出版物和专利申请通过引用以其全文并入本文，其程度就像明确且个别指出通过引用将每一篇个别专利、出版物或专利申请以其全文并入一样。
在植物中，生殖系细胞(种系)通过在孢子发生期间产生孢子母细胞，在每个后代中提供遗传信息的跨代遗传。例如，孢子发生提供了发育雌配子的大孢子母细胞、分别产生胚和胚乳的卵细胞和中央细胞；或发育雄配子的小孢子母细胞，产生四个单倍体小孢子，其中每个小孢子进一步发育成成熟的花粉粒。种系细胞独特作用的一个关键方面是提供未来的后代接收的遗传信息，其中一半的遗传贡献来自雌配子，并且一半的遗传贡献来自雄配子。卵细胞与一个精子细胞受精形成二倍体合子，而第二精子细胞与中央细胞的两个极核融合形成三倍体胚乳。胚乳是胚的终末营养组织，但对种系没有贡献。受精后，合子产生胚，这一过程被称为合子胚发生，是有性生殖的特征。新形成的胚经历这样的胚发生发育程序，所述胚发生发育程序包含受遗传决定子和表观遗传重编程影响的潜在调节程序，导致从胚发生细胞状态到获得分化的一种或多种细胞命运，最终产生具有其所有分化组织的植物。
孤雌生殖是无性生殖的一种自然形式，其中雌配子(胚)的生长和发育无需通过精子受精即可发生。通过孤雌生殖产生的雌配子可以为单倍体或二倍体。
本公开的方法可以改变上述植物有性和无性生殖的此类发育程序。此类方法作为用于农业用途的植物生殖方法是有价值的。本公开提供了使用孤雌生殖诱导技术下的分子机制的方法，这些技术可用于农业用途和作物改良。
孤雌生殖诱导是指一种向细胞提供刺激的方法，该细胞可提高母本单倍体诱导水平。将Apetala2(AP2)变体肽用作孤雌生殖因子(PF)，特别地包含编码基因产物的多肽或多核苷酸，这些基因产物用于从雌配子生成双单倍体或单倍体植物。与孤雌生殖因子基因产物接触的玉蜀黍雌配子体导致提高的母本单倍体诱导水平。具体地，当用包括能够改变植物细胞的细胞命运的调节元件和结构基因的遗传构建体转化植物时，玉蜀黍植物的配子发育成单倍体植物。进一步，当用包括能够改变植物细胞的细胞命运和细胞周期调节的调节元件和结构基因的遗传构建体转化植物时，玉蜀黍植物的配子可发育成二倍体植物。在本公开的方法中，包括从遗传构建体表达的细胞周期调节蛋白的孤雌生殖因子蛋白用于改变体内细胞命运和倍性水平。
如本文所用，“孤雌生殖因子”或“PF”包括但不限于提高母本单倍体诱导和无性生殖水平的基因产物，其中在卵细胞中表达时，雌配子(胚)的生长和发育在不经精子受精的情况下发生。
如本文所用，“孤雌生殖处理”是本文所公开的在接触的细胞中引发孤雌生殖响应的任何处理。
本公开包括用于诱导孤雌生殖以产生母本单倍体的方法。这些孤雌生殖因子可以与形态发育基因和/或胚发生因子组合使用。
如本文所用，“无性生殖”意指没有配子融合的生殖。
如本文所用，“中央细胞”意指产生胚乳的雌配子。
如本文所用，“卵细胞”意指产生胚的雌配子。
如本文所用，“大孢子母细胞(megaspore mother cell)”意指发育成雌配子体的细胞，也称为大孢子母细胞(megasporocyte)或功能性大孢子(FMS)。
如本文所用，“小孢子母细胞(microspore mother cell)”意指发育成雄配子体的细胞，也称为小孢子母细胞(microsporocyte)。
如本文所用，“配子发生”意指来自孢子的配子体的发育。
如本文所用，“孤雌生殖”意指从未受精的卵细胞形成胚。
如本文所用，“假受精”意指从中央细胞受精依赖地形成胚乳。
如本文所用，“有性生殖”意指其中雌性(卵)和雄性(精子)配子融合形成合子的生殖方式。
如本文所用，“体细胞胚发生”意指在没有配子和种子形成情况下从孢子体细胞形成胚。
如本文所用，“孢子发生”意指从孢子母细胞形成孢子。
如本文所用，“孢子母细胞”意指生殖谱系的第一个细胞，由植物雌性和雄性生殖组织中的孢子体细胞形成。
如本文所用，“营养生殖”意指其中形成新植物而不形成胚的生殖形式。
如本文所用，术语“胚”意指胚及其子代、未成熟和成熟的胚、未成熟的合子胚、合子胚、体细胞胚、胚性愈伤组织以及衍生自成熟穗来源种子的胚。胚是能够萌发形成植物的结构。
如本文所用，“单倍体”意指具有单组染色体(基因组)并且减少的染色体数目(n)等于配子中的染色体数目的植物或植物细胞。
如本文所用，术语“1n”或“1n细胞”意指含有单组染色体的细胞，通常是减数分裂的产物。1n细胞的实例包括配子，例如精细胞、卵细胞或通过有丝分裂衍生自配子的组织，例如1n胚或1n植物。在植物通常是二倍体而配子是单倍体的玉蜀黍中，这种配子衍生的胚或植物被称为单倍体胚和单倍体植物。
如本文所用，“二倍体”意指具有两组(基因组)染色体，并且染色体数目(2n)等于合子中的染色体数目的植物或植物细胞。
如本文所用，术语“2n”或“2n细胞”意指含有两组染色体的细胞。2n细胞的实例包括合子、由合子的有丝分裂产生的胚、或由2n胚的萌发产生的植物。
如本文所用，“单倍体植物”意指具有单组染色体(基因组)并且减少的染色体数目(n)等于配子中的染色体数目的植物。
如本文所用，术语“二倍体植物”意指具有两组(基因组)染色体，并且染色体数目(2n)等于合子中的染色体数目的植物。
如本文所用，“双单倍体”或“双单倍体植物或细胞”是通过对单倍体染色体组(雄性或雌性)进行加倍而发育的。从双单倍体植物(自交任何代数)获得的植物或种子仍然可以被鉴定为双单倍体植物。双单倍体植物被认为是纯合植物。如果植物是可育的，则其是双单倍体，即使植物的整个营养部分不是由具有加倍染色体组的细胞组成。例如，如果植物含有活的配子，即使其是嵌合的，也会被认为是双单倍体植物。
如本文所用，“双单倍体胚”是具有一个或多个细胞的胚，所述细胞含有之后可以生长为双单倍体植物的2组纯合染色体。
如本文所用，术语“克隆”意指遗传上、表观遗传上和形态学上相同的多个繁殖的植物细胞或植物。
如本文所用，术语“配子”意指由减数分裂产生的1n生殖细胞如精子细胞、卵细胞或胚珠细胞。
如本文所用，术语“单倍体胚”意指配子衍生的体细胞结构。
如本文所用，术语“体细胞结构”意指组织、器官或生物体。
如本文所用，术语“体细胞”是非配子的细胞。体细胞、组织或植物可以是单倍体、二倍体、三倍体、四倍体、六倍体等。整组染色体被称为1n(单倍体)，其中单组染色体中发现的染色体数被称为单倍体数(x)。例如，在二倍体植物玉蜀黍中，2n＝2x＝20个总染色体，而在二倍体稻亚洲栽培稻(Oryza sativa)中，2n＝2x＝24个总染色体。在三倍体植物例如香蕉中，2n＝3x＝33个总染色体。在六倍体小麦普通小麦(Triticum aestivum)))中，2n＝6x＝42。倍性水平也可在相同物种内的栽培种之间变化，例如在甘蔗白甘蔗(Saccharumoificinarum)中，其中2n＝10x＝80个染色体，但商业甘蔗品种的范围为100至130个染色体。
如本文所用，术语“调节”是指对目的多核苷酸的表达或表达强度进行修饰、控制或稳定，包括但不限于上调或下调。
如本文所用，术语“调节剂”是指对目的多核苷酸的表达或表达强度(包括但不限于目的多核苷酸的上调或下调)进行修饰、控制或稳定的多核苷酸。
如本文所用，术语“培养基”包括呈液态、气态或固态的化合物。
如本文所用，术语“可选择标记”意指当在转化/转染细胞中表达时赋予对选择剂如抗生素、除草剂和对未转化/未转染细胞有毒的其他化合物的抗性的转基因。
如本文所用，术语“EAR”意指“乙烯响应元件结合因子相关的两亲性阻遏基序”，其具有作为转录因子内转录阻遏信号的LLxLxL、DNLxxP、LxLxPP、R/KLFGV或TLLLFR的一般共有序列。在DNA结合蛋白(例如转录因子、dCAS9或LEXA(作为实例))上添加EAR型阻遏子元件，赋予融合蛋白转录阻遏功能(Kagale，S.，和Rozwadowski，K.2010.Plant Signalingand Behavior[植物信号与行为]5：691-694)。
如本文所用，术语“转录因子”意指通过与启动子的DNA序列结合以及上调或下调表达来控制特定基因的转录速率的蛋白质。转录因子(也是形态发育基因)的实例包括AP2/EREBP家族的成员(包括Babyboom(BBM)和胚珠发育蛋白2(ODP2)基因以及变体、多血(plethora)和aintegumenta亚家族、CAAT-盒结合蛋白(诸如LEC1和HAP3)、以及MYB、bHLH、NAC、MADS、bZIP和WRKY家族的成员。在一方面，ZM-ODP2(SEQ ID NO：1和11)、Os-ODP2(OsANT(亚洲栽培稻ANT，Genbank登录号AP003313)(编码SEQ ID NO：162的SEQ ID NO：161))和Os-ODP2(亚洲栽培稻BMN，Genbank登录号AY062180)(编码SEQ ID NO：164的SEQ ID NO：163)在本公开的方法中用作形态发育基因。
如本文所用，术语“合成的转录因子”是指包含至少两个结构域(自然界中非天然存在的识别结构域和调节结构域)的分子。
如本文所用，术语“表达盒”意指由编码和非编码序列组成的载体DNA的独特组分，该编码和非编码序列包括在转化/转染细胞中控制表达的5′和3′调节序列。
如本文所用，术语“编码序列”意指由编码蛋白质的氨基酸的起始密码子和终止密码子界定的DNA序列部分。
如本文所用，术语“非编码序列”意指进行转录以产生信使RNA但不编码蛋白质的氨基酸的DNA序列部分，例如5’非翻译区，内含子和3’非翻译区。非编码序列也可以指RNA分子，例如微RNA、干扰RNA或RNA发夹，其当表达时可以下调内源基因或其他转基因的表达。
如本文所用，术语“调节序列”意指能够增加或减少基因表达的核酸分子区段。调节序列包括启动子、终止子、增强子元件、沉默元件、5'UTR和3’UTR(非翻译区)。
如本文所用，术语“转移盒”意指T-DNA，其包含侧翼为右边界和左边界的一个或多个表达盒。
如本文所用，术语“T-DNA”意指插入宿主植物细胞的基因组中的Ti质粒的一部分。
如本文所用，术语“胚发生因子”意指当表达时增强体细胞衍生结构的改善的形成的基因。更精确地，胚发生因子的异位表达刺激器官发生结构(例如来自胚发生愈伤组织的结构)的从头形成，这可以改善胚的形成。这种刺激的从头胚发生形成发生在胚发生因子在其中被表达的细胞中，或者发生在相邻细胞中。胚发生因子基因可以是调节其他基因表达的转录因子，或为影响植物细胞中激素水平的基因，该胚发生因子基因可以刺激胚发生改变。
胚发生因子涉及植物代谢、器官发育、干细胞发育、细胞生长刺激、器官发生、体细胞胚发生的起始、体细胞胚成熟的加速、顶端分生组织的起始和/或发育、芽分生组织的起始和/或发育、或其组合。
在一方面，本公开提供了一种用于生产母本单倍体植物的方法，该方法包括在卵细胞中表达孤雌生殖因子，导致母本单倍体的百分比增加。
在一方面，本公开提供了一种使用无性生殖生产植物的方法。无配子生殖是开花植物的一种生殖方式，其特征是胚囊中的二倍体细胞在未受精的情况下发育成胚。孤雌生殖是无配子生殖的一种形式，并且在更广泛的意义上可以包括由单倍体配子体细胞(例如由大孢子发生产生的卵细胞)从头胚发生形成。
在一方面，本公开提供了一种方法：(a)用含有质粒的细菌菌株感染植物细胞，该质粒包含含有孤雌生殖因子基因的转移DNA，该孤雌生殖因子基因可操作地连接到在卵细胞中有活性的调节元件，以产生母本单倍体。
本公开提供了产生重组近交系的群体的高效且有效的方法，这些方法包括但不限于在植物细胞中启动孤雌生殖以使得能够产生双单倍体重组群体的方法。
可用于与形态发育基因组合的孤雌生殖因子涉及植物代谢、器官发育、干细胞发育、细胞生长刺激、器官发生、体细胞胚发生的起始、体细胞胚成熟的加速、顶端分生组织的起始和/或发育、芽分生组织的起始和/或发育、或其组合，以改善母本单倍体产生。当孤雌生殖因子与形态发育基因共表达时，提供了获得母本单倍体植物的改善方法。此外，孤雌生殖因子可以与形态发育基因和/或胚发生因子组合使用。
本公开提供了用于改善孤雌生殖件的方法，这些方法包括：(a)用含有质粒的细菌菌株感染植物细胞，该质粒包含含有孤雌生殖因子基因和/或形态发育基因的转移DNA；以及(b)再生母本单倍体。孤雌生殖因子基因选自本文所公开的任何孤雌生殖因子基因(见表5)，包括但不限于APETALA2/乙烯响应元件结合蛋白(AP2/EREBP)家族(包括BBM(ODP2)基因和变体。在一方面，Os-ODP2(OsANT(亚洲栽培稻ANT，Genbank登录号AP003313)(编码SEQ IDNO：162的SEQ ID NO：161))和Os-ODP2(亚洲栽培稻BMN，Genbank登录号AY062180)(编码SEQID NO：164的SEQ ID NO：163)在本公开的方法中用作孤雌生殖因子。孤雌生殖形态发育基因选自编码Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽的核苷酸序列。可用于本公开的方法的其他孤雌生殖因子基因也参见表13。本文所公开的孤雌生殖因子也可以与形态发育基因和/或胚发生因子组合使用。
如本文所用，术语“形态发育基因”或“形态发生基因”意指这样的基因，该基因当异位表达时刺激可产生植物的体细胞衍生结构的形成。更精确地，形态发生基因的异位表达刺激了可以产生植物的体细胞胚或器官发生结构(例如芽分生组织)的从头形成。这种刺激的从头形成发生在形态发生基因在其中被表达的细胞中，或者发生在相邻细胞中。形态发生基因可以是调节其他基因表达的转录因子，或为影响植物组织中激素水平的基因，两者都可以刺激形态发生改变。可以将形态发生基因稳定地掺入植物的基因组中或可以瞬时表达。如本文所用，术语“形态发生因子”意指形态发生基因和/或由形态发生基因表达的蛋白质。一些形态发育基因是孤雌生殖的。
形态发生基因涉及植物代谢、器官发育、干细胞发育、细胞生长刺激、器官发生、再生、体细胞胚发生起始、加速体细胞胚成熟、顶端分生组织的起始和/或发育、芽分生组织的起始和/或发育、芽的起始和/或发育、或它们的组合，比如WUS/WOX基因(WUS1、WUS2、WUS3、WOX2A、WOX4、WOX5或WOX9)，参见美国专利7,348,468和7,256,322以及美国专利申请公开2017/0121722和2007/0271628；Laux等人(1996)Development[发育]122：87-96；和Mayer等人(1998)Cell[细胞]95：805-815；van der Graaff等人，2009，Genome Biology[基因组生物学]10：248；Dolzblasz等人2016.Mol.Plant[分子植物]19：1028-39可用于本公开的方法中。预期WUS/WOX的调节可调节植物和/或植物组织表型，包括植物代谢、器官发育、干细胞发育、细胞生长刺激、器官发生、再生、体细胞胚发生的起始、体细胞胚成熟的加速、顶端分生组织的起始和/或发育、芽分生组织的起始和/或发育、芽的起始和/或发育、或其组合。拟南芥属(Arabidopsis)WUS的表达可以在营养组织中诱导干细胞，其可以分化为体细胞胚(Zuo，等人(2002)Plant J[植物杂志]30：349-359)。可用于本文所公开的方法中的其他基因包括但不限于MYB118基因(参见美国专利7,148,402)、MYB115基因(参见Wang等人(2008)Cell Research[细胞研究]224-235)、BABYBOOM基因(BBM；参见Boutilier等人(2002)PlantCell[植物细胞]14：1737-1749)、或CLAVATA基因(参见例如美国专利7,179,963)。可用于本公开的形态发生基因包括但不限于功能性WUS/WOX基因。
WUS/WOX同源盒多肽的形态发生多核苷酸序列和氨基酸序列可用于所公开的方法。如本文所定义，“功能性WUS/WOX核苷酸”或“功能性WUS/WOX基因”是编码含有同源盒DNA结合结构域、WUS盒和EAR阻遏子结构域的蛋白质的任何多核苷酸(Ikeda等人，2009PlantCell[植物细胞]21：3493-3505)。如Rodriguez等人，2016PNAS www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1607673113所证明的，去除留在同源盒DNA结合结构域，WUS盒和EAR阻遏子结构域后面的二聚化序列产生功能性WUS/WOX多肽。WUSCHEL蛋白(以下称为WUS)在含有多能干细胞池的顶端分生组织的起始和维持中起关键作用(Endrizzi等人(1996)P1antJournal[植物杂志]10：967-979；Laux等人(1996)Development[发育]122：87-96；和Mayer等人(1998)Cell[细胞]95：805-815)。WUS基因的拟南芥属植物突变体含有被错误指定并且似乎经历分化的干细胞。WUS编码一种可能作为转录调节子的同源结构域蛋白(Mayer等人，(1998)Cell[细胞]95：805-815)。拟南芥芽分生组织的干细胞群体被认为通过促进器官起始的CLAVATA(CLV)基因与干细胞特性所需的WUS基因之间的调节环来维持，其中CLV基因在转录水平上阻遏WUS，并且WUS表达足以诱导分生组织细胞特性和干细胞标志物CLV3的表达(Brand等人(2000)Science[科学]289：617-619；Schoof等人(2000)Cell[细胞]100：635-644)。WUS在拟南芥中的组成型表达已显示可导致叶片的不定芽增殖(原位)(Laux，T.，TalkPresented at the XVI International Botanical Congress Meeting[在第十六届国际植物大会上发表的演讲]，1999年8月1-7日，密苏里州圣路易斯(St.Louis，Mo.))。
在一方面，可用于本公开的方法的功能性WUS/WOX同源盒多肽是WUS1、WUS2、WUS3、WOX2A、WOX4、WOX5、WOX5A或WOX9多肽(参见，美国专利7，348，468和7，256，322以及美国专利申请公开号2017/0121722和2007/0271628，将其通过援引以其全文并入本文以及van derGraaff等人，2009，Genome Biology[基因组生物学]10：248)。可用于本公开的方法中的功能性WUS/WOX同源盒多肽获自或衍生自任何植物。可用于本公开的方法中的编码含有同源盒DNA结合结构域、WUS盒和EAR阻遏子结构域的蛋白质的功能性WUS/WOX核苷酸公开于美国专利申请公开号2020/0270622中，该专利申请公开全文以引用方式并入本文。
可用于本公开的其他形态发生基因包括但不限于LEC1(将其通过引用以其整体并入本文的美国专利6,825,397；Lotan等人，1998，Cell[细胞]93：1195-1205)、LEC2(Stone等人，2008，PNAS[美国科学院院报1105：3151-3156；Belide等人，2013，Plant CellTiss.Organ Cult[植物细胞组织器官培养]113：543-553)、KN1/STM(Sinha等人，1993.Genes Dev[基因发育]7：787-795)、来自农杆菌属的IPT基因(Ebinuma和Komamine，2001，In vitro Cell.Dev Biol-Plant[体外细胞发育生物学-植物]37：103-113)、MONOPTEROS-DELTA(Ckurshumova等人，2014，New Phytol.[新植物学]204：556-566)、农杆菌属AV-6b基因(Wabiko和Minemura 1996，Plant Physiol.[植物生理学]112：939-951)、农杆菌属IAA--h和IAA-m基因的组合(Endo等人，2002，Plant Cell Rep.[植物细胞报告]，20：923-928)、拟南芥属SERK基因(Hecht等人，2001，Plant Physiol.[植物生理学]127：803-816)、拟南芥属AGL15基因(Harding等人，2003，Plant Physiol.[植物生理学]133：653-663)、FUSCA基因(Castle和Meinke，Plant Cell[植物细胞]6：25-41)和PICKLE基因(Ogas等人，1999，PNAS[美国科学院院报]96：13839-13844)。
本公开还包括通过本文所公开的任何方法或组合物获得的植物。本公开还包括来自通过本文所公开的任何方法或组合物获得的植物的种子。如本文所用，术语“植物”是指整株植物、植物器官(例如叶、茎、根等)、植物组织、植物细胞、植物部分、种子、繁殖体、胚及其子代。如本文所用，术语“植物”是指整株植物、植物器官(例如叶、茎、根等)、植物组织、植物细胞、植物部分、种子、繁殖体、胚及其子代。植物细胞为分化的或未分化的(例如，愈伤组织、未分化的愈伤组织、未成熟和成熟的胚、未成熟的合子胚、未成熟的子叶、胚轴、悬浮培养细胞、原生质体、叶、叶细胞、根细胞、韧皮部细胞和花粉)。植物细胞包括但不限于来自以下的细胞：种子、悬浮培养物、外植体、未成熟胚、胚、合子胚、体细胞胚、胚发生愈伤组织、分生组织、体细胞分生组织、器官发生性愈伤组织、原生质体、衍生自成熟的穗衍生种子的胚、叶基、来自成熟植物的叶、叶尖、未成熟花序、雄穗、未成熟穗、长须、子叶、未成熟子叶、分生组织区域、愈伤组织、来自叶的细胞、来自茎的细胞、来自根的细胞、来自芽的细胞、配子体、孢子体、花粉、小孢子、多细胞结构(MCS)和胚样结构(ELS)。植物部分包括分化和未分化的组织，包括但不限于根、茎、芽、叶、花粉、种子、肿瘤组织和各种形式的培养中的细胞(例如单细胞、原生质体、胚和愈伤组织)。植物组织可以是在植物中或在植物器官、组织或细胞培养物中。谷物旨在意指由商业种植者出于栽培或繁殖物种之外的目的所生产的成熟种子。再生植物的子代、变体和突变体也被包括在本公开的范围内，只要这些子代、变体和突变体是衍生自使用本文公开的方法和组合物制造的再生植物的和/或包含本文公开的引入的多核苷酸。
如本文使用的，术语“经转化的植物”和“转基因植物”是指在其基因组内包含异源多核苷酸的植物。通常，异源多核苷酸稳定整合于转基因或转化的植物基因组内，这样使得多核苷酸得以传递至连续世代。异源多核苷酸可以单独地或作为重组DNA构建体的部分整合进基因组中。应当理解的是，如本文所用，术语“转基因的”包括其基因型已经通过异源核酸的存在而改变的任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，包括最初如此改变的那些转基因以及通过有性杂交或无性繁殖从初始转基因产生的那些。转基因植物定义为含有转基因的成熟可育植物。
通过以下来产生转基因“事件”：用包含核酸表达盒的异源DNA构建体转化植物细胞，该核酸表达盒包含目的基因；再生由所转移的基因插入该植物的基因组中所产生的植物群体；并且选择表征为插入特定基因组位置的植物。事件在表型上表征为插入的基因的表达。在遗传水平上，事件是植物遗传组成的一部分。术语“事件”也指转化体和另一个植物之间有性杂交所产生的子代，其中该子代包含异源DNA。
本公开的组合物和方法可应用于宽范围的植物物种，包括双子叶植物和单子叶植物。根据本文所公开的方法处理的植物的代表性实例包括但不限于小麦、棉花、向日葵、红花、烟草、拟南芥属、大麦、燕麦、水稻、玉蜀黍、黑小麦、高梁、黑麦、粟、亚麻、甘蔗、香蕉、木薯、菜豆、豇豆、番茄、土豆、甜菜、葡萄、桉属(Eucalyptus)、小麦草(wheat grass)、草皮草、苜蓿、三叶草、大豆、花生、柑橘、番木瓜、狗尾草属物种(Setaria sp)、可可、黄瓜、苹果、辣椒属(Capsicum)、竹、瓜、观赏植物(包括商业花园和鳞茎花卉物种)、果树、蔬菜物种、芸苔属物种以及种间杂交体。在优选的实施例中，将本公开的组合物和方法应用于玉蜀黍植物。
本公开的方法涉及将多肽、多核苷酸(即，DNA或RNA)或核苷酸构建体(即，DNA或RNA)引入植物中。如本文所用，“引入”意在指以使得多核苷酸、多肽或核苷酸构建体得以进入植物细胞内部的方式，将多核苷酸、多肽或核苷酸构建体呈送给植物。本公开的方法不取决于用于将多核苷酸、多肽或核苷酸构建体引入植物中的特定方法，只要所述多核苷酸、多肽或核苷酸构建体得以进入所述植物的至少一个细胞的内部即可。将多核苷酸、多肽或核苷酸构建体引入植物的方法包括但不限于稳定转化法、瞬时转化法和病毒介导法。
如本文所用，“稳定转化”是其中引入到植物中的多核苷酸或核苷酸构建体整合到植物的基因组中并能由其子代继承的转化。“瞬时转化”意指将多核苷酸或核苷酸构建体引入所述植物中并且不整合到所述植物的基因组中，或者将多肽引入植物中。此外，在某些实施例中，“瞬时”可以表示在细胞中存在孤雌生殖诱导剂，其中这种试剂已经被外源性地应用或从邻近细胞分泌或从染色体外位置(例如，质粒或另一种独立复制来源)产生，或者不是由相同细胞内的稳定整合的重组DNA构建体产生。
如本文所用，“接触”、“与......接触”或“与......进行接触”意指“直接接触”或“间接接触”。例如，将细胞置于细胞可以与任何本文所公开的任何孤雌生殖因子、和/或胚发生因子接触的条件下、形态发育基因、小分子或加倍剂接触。允许此类物质存在于细胞存活的环境(例如，培养基或在细胞中表达或邻近细胞中表达)中并且可以在细胞上起作用。例如，包含加倍剂的培养基可以与单倍体细胞直接接触，或者包含加倍剂的培养基可以通过滤纸、植物组织或其他细胞与单倍体细胞分开，因此加倍剂穿过滤纸或细胞被转移到单倍体细胞中。
如本文所用，术语“双亲本杂交”是两种遗传上不同的植物的杂交受精以获得后代的第一杂交(F1)世代和/或之后的任何连续杂交世代。如本文所用，双亲本杂交包括作为后代的任何杂交世代的子代的后代，包括将后代与其亲本系之一或遗传上类似于其亲本的个体杂交受精，以获得称为“回交”的具有与亲本更接近的遗传同一性的，和/或其后的任何连续回交世代。
本文提供的方法依赖于使用细菌介导的和/或生物射弹介导的基因转移以产生可再生的植物细胞。可用于本公开的方法中的细菌株包括但不限于卸甲农杆菌(Agrobacteria)、苍白杆菌属(Ochrobactrum)细菌或根瘤菌科(Rhizobiaceae)细菌(其全文以引用方式并入本文的美国专利号9,365,859)。粒子轰击(Finer和McMullen，1991，InVitro Cell Dev.Biol.-Plant[体外细胞发育生物学-植物]27：175-182)、农杆菌(Agrobactgrium)介导的转化(Jia等人，2015，Int J.Mol.Sci.[国际分子科学杂志]16：18552-18543；US 2017/0121722，其全文以引用方式并入本文)、或苍白杆菌属介导的转化(US 2018/0216123，其全文以引用方式并入本文)的标准方案可用于本公开的方法和组合物。用于将异源基因引入植物的多种方法是已知的，并且可用于将多核苷酸插入植物宿主中，所述方法包括生物和物理植物转化方案。参见例如，Miki等人，“Procedures forIntroducing Foreign DNA into Plants[用于将外源DNA引入植物的程序]，”Methods inPlant Molecular Biology and Biotechnology[植物分子生物学和生物技术的方法]，Glick和Thompson，编辑(CRCPress，Inc.[CRC出版公司]，Boca Raton[波卡拉顿]，第67-88页(1993)。所选择的方法随宿主植物变化并且包括化学转染方法(如磷酸钙)、微生物介导的基因转移(如农杆菌(Horsch，等人，(1985)Science[科学]227：1229-31)、苍白杆菌属(US2018/0216123))、电穿孔、显微注射和生物射弹轰击。用于植物细胞或组织转化和转基因植物再生的表达盒和载体以及体外培养方法是已知的并且可用的。参见例如，Gruber，等人，“Vectors for Plant Transformation[用于植物转化的载体]，”Methods in PlantMolecular Biology and Biotechnology[植物分子生物学和生物技术的方法]，同上，第89-119页。
转化方案以及将核苷酸序列引入植物中的方案，可根据要靶向转化的植物或者植物细胞的类型(即单子叶植物或者双子叶植物)而变化。将核苷酸序列引入到植物细胞中并随后插入到植物基因组中的合适方法包括显微注射(Crossway，等人，(1986)Biotechniques[生物技术]4：320-334)、电穿孔(Riggs，等人，(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]83：5602-5606)、农杆菌属介导的转化(Townsend，等人，美国专利号5,563,055和Zhao，等人，美国专利号5,981,840)、苍白杆菌属(Ochrobactrum)介导的转化(US 2018/0216123)、直接基因转移(Paszkowski，等人，(1984)EMBO J[欧洲分子生物学学会杂志]3：2717-2722)以及弹道粒子加速(参见例如，美国专利号4,945,050；5,879,918；5,886,244；5,932,782；Tomes，等人，(1995)在Plant Cell，Tissue，and Organ Culture：Fundamental Methods[植物细胞、组织和器官培养：基本方法]，编辑Gamborg和Phillips(Springer-Verlag，Berlin[柏林施普林格出版社])；McCabe，等人，(1988)Biotechnology[分子技术学]6：923-926)和Lec1转化(WO00/28058)。还参见，Weissinger，等人，(1988)Ann.Rev.Genet.[遗传学年鉴]22：421-477；Sanford，等人，(1987)Particulate Science and Technology[微粒科学与技术]5：27-37(洋葱)；Christou，等人，(1988)Plant Physiol.[植物生理学]87：671-674(大豆)；McCabe，等人，(1988)Bio/Technology[生物/技术]6：923-926(大豆)；Finer和McMullen，(1991)In VitroCell Dev.Biol.[体外细胞生物学和发育生物学]27P：175-182(大豆)；Singh，等人，(1998)Theor.Appl.Genet.[理论与应用遗传学]96：319-324(大豆)；Datta，等人，(1990)Biotechnology[生物技术]8：736-740(水稻)；Klein，等人，(1988)Proc.Natl.AcadSci.USA[美国科学院院报]85：4305-4309(玉蜀黍)；Klein，等人，(1988)Biotechnology[生物技术]6：559-563(玉蜀黍)；美国专利号5,240,855；5,322,783和5,324,646；Klein，等人，(1988)Plant Physiol.[植物生理学]91：440-444(玉蜀黍)；Fromm，等人，(1990)Biotechnology[生物技术]8：833-839(玉蜀黍)；Hooykaas-Van Slogteren，等人，(1984)Nature[自然](伦敦)311：763-764；美国专利号5,736,369(谷类)；Bytebier，等人，(1987)Proc.Natl.Acad Sci.USA[美国科学院院报]84：5345-5349(百合科(Liliaceae))；De Wet，等人，(1985)The Experimental Manipulation of Ovule Tissues[胚珠组织的实验操作]，编辑Chapman，等人(Longman[朗文出版社]，纽约)，第197-209页(花粉)；Kaeppler，等人，(1990)Plant Cell Reports[植物细胞报告]9：415-418和Kaeppler，等人，(1992)Theor.Appl.Genet.[理论与应用遗传学]84：560-566(晶须介导的转化)；D′Halluin，等人，(1992)Plant Cell[植物细胞]4：1495-1505(电穿孔)；Li，等人，(1993)Plant CellReports[植物细胞报告]12：250-255以及Christou和Ford，(1995)Annals of Botany[植物学年报]75：407-413(稻)；Ishida，等人，(1996)Nature Biotechnology[自然生物技术]14：745-750(经由根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的玉蜀黍)，所有这些通过引用以其整体并入本文。在U.S.2017/0121722中也发现了用于快速植物转化的方法和组合物，通过援引以其全文并入本文。在美国专利申请序列号15/765,521中发现了可用于植物转化的载体，通过援引以其全文并入本文。
本公开的组合物和方法包括通过使植物细胞与孤雌生殖因子基因产物和/或形态发育基因、和/或胚发生因子接触而从配子产生双单倍体植物，该孤雌生殖因子基因产物和/或形态发育基因、和/或胚发生因子可在细胞中诱导细胞重编程并且活化孤雌生殖。
本公开提供了一种通过转化玉蜀黍非单倍体诱导物系以表达异源表达盒来诱导孤雌生殖和再生母本单倍体的方法，该异源表达盒编码孤雌生殖因子和形态发生基因并且还编码包括用于基因编辑目的的基因的其他组分。报道基因或可选择标记基因也可以包括在本公开的表达盒中。合适的报告基因的实例可以在以下中找到：例如，Jefferson等人(1991)Plant Molecular Biology Manual[植物分子生物学年刊]，Gelvin等人编辑，(Kluwer Academic Publishers[鲁维尔学术出版社])，第1-33页；DeWet，等人，(1987)Mol.Cell.Biol.[分子细胞生物学]7：725-737；Goff，等人，(1990)EMBOJ.[欧洲分子生物学学会杂志]9：2517-2522；Kain，等人，(1995)Bio Techniques[生物技术]19：650-655和Chiu，等人，(1996)Current Biology[当前生物学]6：325-330，通过引用以其全文并入本文。
用于选择转化细胞或者组织的可选择标记基因可以包括赋予抗生素抗性或除草剂抗性的基因。合适的选择性标记基因的实例包括但不限于编码对如下的耐受性的基因：氯霉素(Herrera Estrella，等人，(1983)EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]2：987-992)；氨甲蝶呤(Herrera Estrella，等人，(1983)Nature[自然]303：209-213；Meijer，等人，(1991)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]16：807-820)；潮霉素(Waldron，等人，(1985)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]5：103-108和Zhijian，等人，(1995)Plant Science[植物科学]108：219-227)；链霉素(Jones，等人，(1987)Mol.Gen.Genet.[分子遗传学和普通遗传学]210：86-91)；壮观霉素(Bretagne-Sagnard，等人，(1996)Transgenic Res.[转基因研究]5：131-137)；博莱霉素(Hille，等人，(1990)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]7：171-176)；磺酰胺类(Guerineau，等人，(1990)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]15：127-36)；溴草腈(Stalker，等人，(1988)Science[科学]242：419-423)；草甘膦(Shaw，等人，(1986)Science[科学]233：478-481以及美国专利申请序列号10/004,357和10/427,692)；草丁膦(DeBlock，等人，(1987)EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]6：2513-2518)，通过引用以其全文并入本文。
其他基因可以使用本公开的表达盒，它们也有助于转基因事件的恢复，并且包括但不限于GUS(β-葡糖醛酸糖苷酶；Jefferson，(1987)Plant Mol.Biol.Rep.[植物分子生物学报告]5：387)、GFP(绿色荧光蛋白；Chalfie，等人，(1994)Science[科学]263：802)、萤光素酶(Riggs，等人，(1987)Nucleic Acids Res.[核酸研究]15(19)：8115和Luehrsen，等人，(1992)Methods Enzymol.[酶学方法]216：397-414)以及编码花色素产生的玉蜀黍基因(Ludwig，等人，(1990)Science[科学]247：449)，通过引用以其全文并入本文。
本公开还提供了在分离和胚发生诱导方法(用于生成父本配子(产雄性特征的)或母本配子(产生雌性特征的)双单倍体群体)的任何部分之前、期间、之后或与之重叠，使单倍体细胞与一定量的染色体加倍剂接触的方法。
如本文所使用的“重组体”意指细胞或载体，其已经通过引入异源核酸或衍生自已经如此修饰的细胞而被修饰。因此，例如，重组细胞是表达未在天然(非重组)细胞中以相同形式或位置发现的基因的细胞、或以不同于天然(非重组)细胞的表达模式表达天然基因的细胞，例如，由于故意的人为干预，天然基因异常表达、表达不足、表达降低或根本不表达。如本文所用的术语“重组”不涵盖由于自然发生的事件(例如，自发突变、自然转化/转导/转位)(如在没有故意的人为干预的情况下发生的事件)而引起的细胞或载体的改变。
如本文所用，“重组表达盒”是以重组或合成方式产生的具有允许特定核酸在靶细胞中转录的一系列特定核酸元件的核酸构建体。重组表达盒被掺入质粒、染色体、线粒体DNA、质粒DNA、病毒或核酸片段中。典型地，表达载体的重组表达盒部分包括，除了其他序列之外，待转录的核酸和启动子。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物。所述术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。
术语“调节元件”是指具有基因调节活性的核酸分子，即能够影响可操作地连接的可转录多核苷酸的转录和/或翻译表达模式的核酸分子。因此，术语“基因调节活性”是指通过影响可操作地连接的可转录多核苷酸分子的转录和/或翻译，从而影响这种可操作地连接的可转录多核苷酸分子表达的能力。基因调节活性可为正向和/或负向，并且该影响可通过其下列特性来表征：时间、空间、发育、组织、环境、生理、病理、细胞周期和/或化学响应，还可通过定量指示或定性指示来表征。
在一方面，在植物卵细胞中表达的调节元件可用于调节ZM-ODP2肽活性以引起母本单倍体诱导，导致所产生的一定比例的子代为单倍体(与亲本相比具有一半染色体数目)。此外，使用替代调节元件以进一步优化孤雌生殖母本单倍体诱导水平。例如，在本公开的方法中使用以下调节元件，诸如US 2015/0152430中公开的那些(启动子包括但不限于AT-DD5启动子、AT-DD31启动子、AT-DD65启动子和ZM-DD45)和US 2018/0094273中公开的那些(玉蜀黍卵细胞启动子)(US 2015/0152430和US 2018/0094273通过引用以其全文并入本文)。
顺式调节元件是影响基因表达的调节元件。顺式调节元件是调节相邻基因转录的非编码DNA区域，通常为它们调节的基因附近的DNA序列。顺式调节元件通常通过编码赋予转录因子结合的DNA序列来调节基因转录。
如本文所用，“启动子”是示例性调节元件，并且通常是指能够控制编码序列或功能性RNA的表达的核苷酸序列。一般来讲，编码序列位于启动子序列的3′端。启动子序列包含近端元件和较远端上游元件，后一元件通常称为增强子。因此，“增强子”是可以刺激启动子活性的核苷酸序列，并且可以是启动子的固有元件或插入的异源元件，用来增强启动子的水平或组织特异性。启动子可以全部衍生自天然基因，或者可以由衍生自在自然界发现的不同启动子的不同元件构成，或者甚至包含合成的核苷酸区段。不同的调节元件可能引导基因在不同组织或细胞类型中、或在不同发育阶段、或者响应于不同环境条件的表达。
植物启动子是能够在植物细胞中起始转录的启动子。示例性的植物启动子包括但不限于，从植物、植物病毒和包含在植物细胞内表达的基因的细菌(如农杆菌属(Agrobacterium)或根瘤菌属(Rhizobium))中获得的启动子。实例是优先在某些组织(如叶、根、种子、纤维、木质部导管、管胞或厚壁组织)中启动转录的启动子。这样的启动子称为“组织偏好性”启动子。“细胞类型”特异性启动子主要驱动在一个或多个器官中的某些细胞类型(例如，根或叶中的维管细胞)中的表达。“诱导型”或“调节型”启动子是指在环境控制下的启动子。可通过诱导型启动子影响转录的环境条件的实例包括厌氧条件或光照的存在。另一类型的启动子是发育调节启动子，例如在花粉发育期间驱动表达的启动子。组织偏好性启动子、细胞类型特异性启动子、发育调节启动子和诱导型启动子是“非组成性”启动子类别的成员。“组成型”启动子是导致核酸片段在大多数环境条件和发育或细胞分化状态下在大多数时间在大多数细胞类型中表达的启动子。
在一方面，卵细胞启动子和卵细胞特异性启动子可用于本公开的方法中。除本文所公开的那些卵细胞启动子和/或卵细胞特异性启动子以及US 2015/0152430和US 2018/0094273中(其各自全文以引用方式并入本文)公开的那些以外，可用于本公开中的卵细胞启动子和/或卵细胞特异性启动子包括但不限于Sprunck等人(2012)Science[科学]，338，1093-1097和Steffen等人(2007)Plant J.[植物杂志]，51：281-92中公开的卵细胞特异性EC1.1和EC1.2启动子。
“翻译前导序列”是指位于基因的启动子序列和编码序列之间的核苷酸序列。翻译前导序列存在于翻译起始序列的经完全处理的mRNA上游。翻译前导序列可以影响多种参数，包括初级转录物到mRNA的加工、mRNA稳定性和/或翻译效率。已经描述了翻译前导序列的实例(Turner和Foster，(1995)Mol.Biotechnol[分子生物技术]3：225-236)。
如本文所用，“异源”是指源于外来物种，或者，如果源于同一物种的话，则是通过蓄意人为干预对其天然形式在组成和/或基因组基因座方面进行实质性修饰得到的核酸。例如，可操作地连接到异源结构基因的启动子，所述异源结构基因来自与衍生结构基因的物种不同的物种，或者，如果来自相同的物种，则其中一者或二者从其原始形式和/或基因组位置进行了实质性的修饰。
在用于在目的植物中表达的表达盒中提供可用于本公开的方法中的孤雌生殖因子和形态发育基因。表达盒可以包括可操作地连接到本文所公开的孤雌生殖因子和形态发育基因序列的5′和3′调节序列。“可操作地连接”旨在表示两个或更多个元件之间的功能性连接。例如，目的多核苷酸和调节序列(即启动子)之间的可操作连接是允许目的多核苷酸表达的功能性连接。可操作地连接的元件可以是连续的或非连续的。当用来指两个蛋白质编码区域的连接(融合蛋白)时，可操作地连接意指所述编码区域处于相同的阅读框中。该盒可以另外包含至少一个待共转化到生物体中的另外的基因。替代性地，在多个表达盒上提供一种或多种孤雌生殖因子和形态发育基因。此类表达盒具有用于插入孤雌生殖因子和形态发育基因序列的多个限制性位点，该孤雌生殖因子和形态发育基因序列将位于调节区域(一个或多个启动子)的转录调节之下。表达盒可另外含有选择性标记基因。
可用于本公开的方法中的多核苷酸包括但不限于孤雌生殖因子、形态发育基因和细胞周期基因(包括周期蛋白A、周期蛋白B、周期蛋白C、周期蛋白D、周期蛋白E、周期蛋白F、周期蛋白G和周期蛋白H)：Pin1；E2F；Cdc25；RepA基因和类似的编码复制相关蛋白的植物病毒多核苷酸。参见美国专利公开号2002/0188965，通过援引以其全文并入本文。
如本文所用，“嵌合基因表达盒”是包含可操作地连接到转录起始区的编码序列的表达盒，该转录起始区与该编码序列异源，并且该表达盒可以在转录的5′-3′方向上包括转录起始区域(即启动子)和翻译起始区、分泌信号肽、孤雌生殖诱导基因序列、荧光蛋白序列以及在植物中起作用的转录和翻译终止区(即终止区)。其他组分(包括但不限于形态发育基因和/或胚发生因子)也可见于在嵌合基因表达盒中。
本公开的孤雌生殖诱导方法改善母本单倍体胚再生生产力并且使基因编辑能够提供再生的经基因编辑的玉蜀黍母本单倍体。
在一方面，使单倍体细胞与一定量的染色体加倍剂接触，以促进染色体加倍，然后从经处理的单倍体细胞再生纯合二倍体植物。在小孢子胚发生或胚成熟之前、期间或之后，使单倍体小孢子细胞与加倍剂接触。染色体加倍后，加倍的单倍体胚将含有2拷贝的由父本衍生的染色体。用于从单倍体胚获得双单倍体植物的方法的效率可以大于10％、20％、30％、50％、60％、70％、80％或90％。单倍体细胞与染色体加倍剂之间接触的持续时间可以变化。接触时间可以是从少于24小时(例如4-12小时)至约一周。接触的持续时间通常为从约8小时至2天。
染色体加倍方法公开于：Antoine-Michard，S.等人，Plant cell，tissue organcult.[植物细胞、组织器官培养]，荷兰Cordrecht，Kluwer Academic Publishers[鲁维尔学术出版社]，1997，48(3)：203-207；Kato，A.，Maize Genetics Cooperation Newsletter[玉蜀黍遗传学合作通讯]1997，36-37；和Wan，Y.等人，TAG[理论与应用遗传学]，1989，77：889-892。Wan，Y.等人，TAG[理论与应用遗传学]，1991，81：205-211。将所公开的内容通过引用并入本文。典型的加倍方法涉及使细胞与秋水仙碱、抗微管剂或抗微管除草剂、拿草特、一氧化二氮或任何有丝分裂抑制剂接触，以产生纯合的双单倍体细胞。培养基中使用的秋水仙碱的量通常是0.01％-0.2％，或可以使用约0.05％的甲基胺草磷(APM)(5-225μM)。秋水仙碱的量可以是在约400-600mg/L的范围或约500mg/L。培养基中拿草特的量是约0.5-20μM。表1中包括有丝分裂抑制剂的实例。其他试剂可以与有丝分裂抑制剂一起使用以改善加倍效率。此类试剂包括二甲基亚砜(DMSO)、佐剂、表面活性剂等。
表1.化学染色体加倍剂
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作为使用化学染色体加倍剂的替代方案，通过刺激细胞周期(和细胞分裂)或通过刺激核内复制来调节已知影响植物细胞周期(遗传染色体加倍蛋白)的基因的表达，用于使胚中的染色体组加倍。通过调节刺激细胞周期细胞中关键控制点的基因表达，可实现植物细胞中倍性水平的提高。在本公开中，已经证明使用卵细胞启动子表达孤雌生殖因子增强了母本单倍体胚的形成，而同时表达孤雌生殖因子和ZM-DZ470(玉蜀黍周期蛋白-D家族成员)不仅导致母本单倍体胚形成，而且刺激染色体数目加倍。因此，在形成母本单倍体胚中添加过表达的周期蛋白-D似乎提供了适当水平的细胞周期刺激，从而导致1n单倍体染色体数目加倍至2n(二倍体)。预计使用其他已知刺激植物细胞周期(或细胞分裂)的植物基因，以在形成母本单倍体胚中产生类似的染色体数目加倍。过表达刺激细胞周期的植物基因的实例包括烟草中的周期蛋白A(Yu等人，2003)、烟草中的周期蛋白D(Cockcroft等人，2000，Nature[自然]405：575-79；Schnittger等人，2002，PNAS[美国科学院院报]99：6410-6415；Dewitte等人，2003，Plant Cell[植物细胞]15：79-92)、拟南芥属中的E2FA(De Veylder等人，2002，EMBO J[欧洲分子生物学学会杂志]21：1360-1368)、拟南芥属中的E2FB(Magyar等人，2005，Plant Cell[植物细胞]17：2527-2541)。类似地，使用已知调节植物细胞周期机制的病毒基因的过度表达，例如当小麦矮化病毒RepA基因的过表达时刺激玉蜀黍中的细胞周期进展(G1/S转变)和细胞分裂时(Gordon-Kamm等人，2002，PNAS[美国科学院院报]99：11975-11980)。相反，当拟南芥属中的周期蛋白依赖性激酶抑制剂(ICK1/KRP)等基因下调时，已知其编码的产物抑制细胞周期的植物基因已经显示会导致细胞分裂增加(Cheng等人2013，Plant J[植物杂志]75：642-655)。因此，使用卵细胞特异性启动子驱动表达的KRP基因的下调预计与DZ470的过表达具有相似的效果，导致染色体加倍。下调基因(诸如KRP)的方法包括表达靶向KRPmRNA的人工微RNA，或表达通过gRNA靶向KRP启动子序列来靶向KRP启动子的dCas9-阻遏子融合物。最后，已知存在特异性影响核内复制过程的植物基因。当在本公开的方法中使用此类基因(如例如ccs52基因或Del1基因)时，预期ccs52的过表达将导致增加的倍性水平，如在紫花苜蓿(Medicago sativa)中观察到的(Cebolla等人，1999，EMBO J[欧洲分子生物学学会杂志]18：4476-4484)，并且Dell的下调将导致增加的倍性水平，如在拟南芥属中观察到的(Vlieghe等人，2005，Current Biol[当代生物学]15：59-63)。预期在本文公开的方法中使用刺激细胞周期、G1/S转变或核内复制的其他基因以增加倍性水平。
阻遏子基序包括Kagale和Rozwadowski(Epigenetics[表观遗传学].2011.6：141-146)中公开的那些。乙烯响应元件结合因子相关的两亲性阻遏(EAR)基序介导的转录阻遏在植物中是已知的，包括由LxLxL和DLNxxP的共有序列模式所定义的EAR基序(参见Hiratsu等人，2003.Plant J.[植物杂志]35：177-192)。可用于本文所公开的方法中的肽包括但不限于US20150197768A1A1及其中引用的所有参考文献中公开的两亲性阻遏基序，以及Dr1/DRAP1全局阻遏子复合物(参见US 7,288,695 B2及其中引用的所有参考文献)，包括类似于拟南芥(Arabidopsis thaliana)MYBL2中发现的基序的Dr1基序(参见Matsui K，UmemuraY，Ohme-Takagi M.2008.Plant J.[植物杂志]55：954-967)。
用于创建单倍体诱导物系的方法包括异位表达含有转录因子的AP2结构域。例如，优选地使用Gordon-Kamm等人的方法(参见美国专利号7,579,529；其内容据此通过引用并入)。
如前所述的全长ZM-ODP2肽的表达(参见美国专利号7,579,529；其内容据此通过引用并入)可用于本文所公开的方法中。另外，非洲狼尾草(Pennisetum squamulatum)AP2转录因子无孢子生殖特异性基因组区域(Apospory-Specific-Genomic-Region)BabyBoomLike(本文称为PsASGR-BBML)转基因可在不受精的情况下诱导孤雌生殖和胚形成。在玉蜀黍中，用具有R1-navajo花青素颜色标记的花粉受精的具有PsASGR-BBML转基因的个体表现出单倍体胚生产(Steffen JG等人2007.Plant J[植物杂志]51：281-292，US2016/0304901 A1，其通过引用以其全文并入本文)。最近，Khanday和Sundaresan的方法证明了类似的发现，例如在水稻中(参见WO 2018/098420 A1；其内容据此通过引用并入)。
在一方面，本文所公开的方法用于获得具有抑制或突变的基因产物的无融合生殖植物，这些抑制或突变的基因产物诱导有丝分裂而非减数分裂，即所谓的“MiMe”表型(参见美国专利公开号2012/0042408和美国专利公开号2014/0298507，其通过引用以其全文并入本文)。通过消除重组和/或配对，抑制或突变有效减数分裂重组所必需的蛋白质，从而诱导MiMe表型。对于玉蜀黍，提供Spo11、Rec8、OSD1-1A和OSDl-3A的多核苷酸和相关多肽以抑制其表达水平或活性的方法(参见US 20190098858 A1，其通过引用以其整体并入本文)。
本公开的方法使用此类表达盒进行转化以获得fie(不依赖能育性的胚乳)-空遗传背景，以促进从头胚发育和未经受精的胚乳发育两者。此外，如上所述将实例4中所示的变体ODP2 DNA序列中任一个递送至纯合子合子-胚致死基因型中，其中仅从体细胞珠心组织产生的不定胚在种子中发育。使用这些方法在没有花粉的情况下获得无融合生殖种子，以获得不减数配子(未减数孢子生殖)。
通过向能够产生不减数配子的植物细胞提供实例4中所述的蛋白质活性来获得无融合生殖种子，其中显示变体ODP2肽相对于天然Zm-ODP2肽能够改善单倍体孤雌生殖。还通过向能够产生不减数配子的植物细胞提供实例10中所述的蛋白质活性来获得无融合生殖种子，其中至少一种变体ODP2肽在至少一种孤雌生殖因子受到阻遏的细胞中共表达。预计与仅使用天然ZM-ODP2肽的方法相比，无性生殖得到改善(参见US 7579529 B2，其通过引用以其整体并入本文)。
在一方面，可用于本文所公开的方法中的翻译融合蛋白包含识别结构域，例如使用表21中所示的Cas肽的灭活的Casα蛋白(dCasα)，其融合至基因活化结构域(例如表19中所示的那些)，或融合至基因阻遏结构域(例如表22中所示的那些)。各表达盒可操作地连接到预计影响母本单倍体孤雌生殖的调节元件，例如使用如表23中所示的启动子。本文不试图描述此类表达盒的所有可能的组合。预计这两个表达盒的组合活性同时实现植物细胞(优选雌配子细胞，诸如卵细胞)中基因表达的改变。具体地，卵细胞内此类改变的基因表达靶向一组将要上调的基因座和第二组将要下调的基因座，从而导致改善的单倍体孤雌生殖。
编码用于靶向上调的基因产物的示例性基因组基因座包括编码形态发育基因和胚发生因子的基因座。例如，编码WUS/WOX同源盒多肽或Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽或其组合的形态发生基因。在一方面，编码WUS/WOX同源盒多肽的形态发生基因为WUS1、WUS2、WUS3、WOX2A、WOX4、WOX5和WOX9蛋白。在另一方面，编码Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽的形态发生基因为Babyboom(BBM1)、BBM2、BMN2和BMN3或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽。
编码可用于在雌配子(诸如卵细胞)中上调的其他形态发生基因的另外的基因座包括但不限于LEC1(通过引用以其整体并入本文的美国专利6,825,397；Lotan等人，1998，Cell[细胞]93：1195-1205)、LEC2(Stone等人，2008，PNAS[美国科学院院报]105：3151-3156；Belide等人，2013，Plant Cell Tiss.Organ Cult[植物细胞组织器官培养]113：543-553)、KN1/STM(Sinha等人，1993.Genes Dev[基因发育]7：787-795)、MONOPTEROS-DELTA的同源物(Ckurshumova等人，2014，New Phytol.[新植物学]204：556-566)、拟南芥属SERK基因的同源物(Hecht等人，2001，Plant Physiol.[植物生理学]127：803-816)、拟南芥属AGL15基因的同源物(Harding等人，2003，Plant Physiol.[植物生理学]133：653-663)或FUSCA基因的同源物(Castle和Meinke，Plant Cell[植物细胞]6：25-41)。编码细胞重编程因子的另外的基因座包括WO 2020214986 A1(其通过引用以其整体并入本文)中所述的胚发生因子，在本文中用于雌配子(诸如卵细胞)中的上调。
编码用于靶向基因阻遏的基因产物的示例性基因组基因座包括编码形态发育基因的阻遏子的基因座。例如，作为干细胞信号通路组分的阻遏靶位点(例如CLV3及其物种特异性蛋白，抑制WUSCHEL的C2H2型锌指蛋白，如KNUCKLES阻遏蛋白，以及MADS-盒转录因子，如AGAMOUS或物种特异性AGAMOUS样直系同源物)可用于本文所公开的方法中。阻遏靶位点包括但不限于编码多梳组(PcG)蛋白或其亚基(作用是阻遏编码形态发育基因和/或胚发生因子的基因组基因座的表达)的基因组基因座。作为E(z)(Zeste的增强子)家族成员的阻遏靶位点，诸如多梳阻遏复合物2(PRC2)的EZH1和EZH2，或任何具有组蛋白甲基转移酶活性并且对组蛋白H3(在本文中称为“H3K37me3”)的Lys 9(K9)和Lys 27(K27)具有特异性的蛋白质，也可用于本文所公开的方法中。可用于本文所公开的方法中的另外的阻遏靶位点包括但不限于编码CHD3染色质重塑因子或其亚基(作用是阻遏编码形态发育基因和/或胚发生因子的基因组基因座的表达)的基因组基因座包括但不限于PICKLE基因的同源物(Ogas等人，1999，PNAS[美国科学院院报]96：13839-13844)。
利用位点特异性重组系统实现多核苷酸在所需的基因组位置处的插入。参见例如，WO 99/25821、WO 99/25854、WO 99/25840、WO 99/25855和WO 99/25853，将其通过援引以其全文并入本文。简而言之，侧翼为两个不相同重组位点的目标多核苷酸包含在T-DNA转移盒中。将T-DNA转移盒引入植物中，该植物已经将靶位点稳定地掺入其基因组中，该靶位点侧翼为与转移盒的位点相对应的两个不相同的重组位点。提供适当的重组酶，并将转移盒整合到靶位点。由此，目的多核苷酸被整合在植物基因组中的特定染色体位置处。
所公开的方法用于向外植体中引入多核苷酸，这些多核苷酸用于靶向衍生自该外植体的植物的基因组中特定位点以进行修饰。用所公开的方法引入的位点特异性修饰包括使用用于引入位点特异性修饰的任何方法产生的修饰，该方法包括但不限于通过使用基因修复寡核苷酸(例如美国公开2013/0019349)，或通过使用双链断裂技术，如TALEN、大范围核酸酶、锌指核酸酶、CRISPR-Cas等。例如，所公开的方法用于将CRISPR-Cas系统引入植物细胞或植物中，以用于以下目的：对植物或植物细胞的基因组中的靶序列进行基因组修饰，选择植物，缺失碱基或序列，基因编辑，以及将目的多核苷酸插入植物或植物细胞的基因组中。因此，所公开的方法与CRISPR-Cas系统一起使用以提供用于修饰或改变植物、植物细胞或种子的基因组内的靶位点和目的核苷酸的有效系统。所述Cas内切核酸酶基因是植物优化的Cas9内切核酸酶，其中植物优化的Cas9内切核酸酶能够结合植物基因组的基因组靶序列并在其中产生双链断裂。
Cas内切核酸酶在指导核苷酸的指导下识别并任选地将特定靶位点处的双链断裂引入细胞的基因组中。CRISPR-Cas系统提供了用于修饰植物、植物细胞或种子的基因组内的靶位点的有效系统。还提供了采用指导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统的方法，以提供用于修饰细胞基因组内的靶位点和用于编辑细胞基因组内的核苷酸序列的有效系统。一旦鉴定了基因组靶位点，即采用多种方法进一步修饰靶位点，使得它们含有多种目的多核苷酸。所公开的方法用于引入用于编辑细胞基因组中的核苷酸序列的CRISPR-Cas系统。待编辑的核苷酸序列(目的核苷酸序列)位于由Cas内切核酸酶识别的靶位点之内或之外。
CRISPR基因座(规律间隔成簇短回文重复序列)(又称SPIDR-间隔区散在同向重复序列)构成最近描述的DNA基因座的家族。CRISPR基因座由部分回文的短而高度保守的DNA重复序列(通常为24至40bp，重复从1至140次，也称为CRISPR重复序列)组成。重复序列(通常具有物种特异性)由恒定长度的可变序列(通常为20至58，依赖于CRISPR基因座(WO2007/025097，2007年3月1日公开))间隔。
Cas基因包括通常与侧翼CRISPR基因座偶合、相关或相近或相邻的基因。术语“Cas基因”和“CRISPR相关的(Cas)基因”在本文中可互换地使用。
在另一方面，Cas内切核酸酶基因可操作地连接到Cas密码子区域上游的SV40核靶向信号和Cas密码子区域下游的二分型VirD2核定位信号(Tinland等人，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]89：7442-6)。
关于Cas内切核酸酶，术语“功能片段”、“功能上等效的片段”和“功能等效片段”在本文中可互换使用。这些术语意指Cas内切核酸酶序列的一部分或子序列，其中产生双链断裂的能力被保留。
关于Cas内切核酸酶，术语“功能变体”、“功能上等效的变体”和“功能等效变体”在本文中可互换使用。这些术语意指Cas内切核酸酶的变体，其中产生双链断裂的能力被保留。这些片段和变体经由例如定点诱变和合成构建等方法来获得。
在一方面，Cas内切核酸酶基因是可以识别N(12-30)NGG型的任何基因组序列并且原则上是可以靶向的植物密码子优化的酿脓链球菌Cas9基因。
内切核酸酶是切割多核苷酸链内的磷酸二酯键的酶，并且包括在特定位点切割DNA而不损害碱基的限制性内切核酸酶。限制性内切核酸酶包括I型、II型、III型、和IV型内切核酸酶，这些限制性内切核酸酶进一步包括亚型。在I型和III型系统中，甲基化酶和限制性酶活性二者均包含在单复合物中。内切核酸酶还包括大范围核酸酶，也称为归巢内切核酸酶(HE酶)，该酶相似于限制性内切核酸酶，在特定识别位点处结合并且切割，然而对于大范围核酸酶，这些识别位点通常更长，约18bp或更长(于2012年3月22日提交的专利申请PCT/US 12/30061)。基于保守序列基序，大范围核酸酶已被分为四个家族。这些基序参与金属离子的配位和磷酸二酯键的水解。大范围核酸酶的显著之处在于它们的长识别位点，并且还在于耐受其DNA底物中的一些序列多态性。对于大范围核酸酶的命名约定相似于对其他限制性内切核酸酶的约定。大范围核酸酶还分别表征为针对由独立的ORF、内含子、和内含肽编码的酶的前缀F-、I-、或PI-。重组方法的一个步骤涉及在识别位点处或在该识别位点附近的多核苷酸切割。将该切割活性用于产生双链断裂。对于位点特异性重组酶和它们的识别位点的综述，参见Sauer(1994)Curr Op Biotechnol[生物技术新见]5：521-7；以及Sadowski(1993)FASEB[美国实验生物学学会联合会杂志]7：760-7。在一些实例中，重组酶来自整合酶(Integrase)或解离酶(Resolvase)家族。TAL效应物核酸酶是一类新的序列特异性核酸酶，其用于在植物或其他生物的基因组中特异性靶序列处造成双链断裂。(Miller，等人(2011)Nature Biotechnology[自然生物技术]29：143-148)。锌指核酸酶(ZFN)是由锌指DNA结合结构域和双链-断裂-诱导剂结构域组成的工程化双链断裂诱导剂。识别位点特异性由锌指结构域赋予，该锌指结构域典型地包含两个、三个、或四个锌指，例如具有C2H2结构，然而其他锌指结构是已知的并且已经被工程化。锌指结构域适于设计特异性结合所选择的多核苷酸识别序列的多肽。ZFN包括连接至非特异性内切核酸酶结构域(例如来自Ms型内切核酸酶，例如Fokl的核酸酶结构域)的工程化DNA结合锌指结构域。另外的功能性融合到锌指结合结构域中，这些另外的功能性包括转录活化物结构域、转录阻遏子结构域、和甲基化酶。在一些实例中，核酸酶结构域的二聚化是切割活性所需的。每个锌指在靶DNA中识别三个连续的碱基对。例如，3指结构域识别9个连续核苷酸的序列，由于该核酸酶的二聚化需要，因此两组锌指三联体用于结合18个核苷酸的识别序列。
本文所用的“Dead-CAS9”(dCAS9)用于提供转录阻遏子结构域。dCAS9已发生突变，因此无法再切割DNA。dCAS0在被gRNA引导至序列时仍然可以结合，也可以与阻遏子元件融合。如本文所述，融合至阻遏子元件的dCAS9缩写为dCAS9-REP，其中阻遏子元件(REP)是已在植物中表征的任何阻遏子基序。表达的指导RNA(gRNA)与dCAS9-REP蛋白结合，并靶向dCAS9-REP融合蛋白与启动子(T-DNA内的启动子)内特定的预定核苷酸序列的结合。例如，如果使用ZM-UBIPRO：：dCAS9-REP：：PINIITERM盒和U6-POL PRO：：gRNA：：U6TERM盒将其表达在边界外，且gRNA被设计成指导dCAS9-REP蛋白以结合T-DNA内表达盒SB-UBI PRO：：moPAT：：PINII TERM中的SB-UBI启动子，任何整合了边界外序列的事件会是双丙氨膦敏感性的。仅整合T-DNA的转基因事件将表达moPAT，并且对双丙氨磷具有抗性。使用与阻遏子融合的dCAS9蛋白(与TETR或ESR相反)的优点是能够将这些阻遏子靶向T-DNA内的任何启动子。TETR和ESR仅限于同源操纵子结合序列。替代性地，可使用与阻遏子结构域融合的合成的锌指核酸酶代替gRNA和dCAS9～REP(Urritia等人，2003，Genome Biol.[基因组生物学]4：231)，如上所述。
来自细菌的II型CRISPR/Cas系统采用crRNA和tracrRNA将Cas内切核酸酶指导至其DNA靶。该crRNA(CRISPR RNA)包含与双链DNA靶的一条链互补，并且与tracrRNA(反式激活CRISPR RNA)碱基配对形成RNA双链体的区域，该RNA双链体引导Cas内切核酸酶切割DNA靶。如本文所用，术语“指导核苷酸”涉及两个RNA分子-包含可变靶向结构域的crRNA(CRISPR RNA)和tracrRNA的合成性融合。在一方面，该指导核苷酸包含12至30个核苷酸序列的可变靶向结构域和可以与Cas内切核酸酶相互作用的RNA片段。
如本文所用，术语“指导多核苷酸”涉及可以与Cas内切核酸酶形成复合物的多核苷酸序列，并且使得Cas内切核酸酶能够识别并任选地切割DNA靶位点。指导多核苷酸为单分子或双分子。指导多核苷酸序列为RNA序列、DNA序列或其组合(RNA-DNA组合序列)。任选地，指导多核苷酸可以包含至少一种核苷酸、磷酸二酯键或连接修饰，例如但不限于锁核酸(LNA)、5-甲基dC、2，6-二氨基嘌呤、2′-氟代A、2′-氟代U、2′-O-甲基RNA、硫代磷酸酯键、与胆固醇分子的连接、与聚乙二醇分子的连接、与间隔子18(六乙二醇链)分子的连接、或导致环化的5′至3′共价连接。仅包含核糖核酸的指导多核苷酸也被称为“指导核苷酸”。
指导多核苷酸、VT结构域和/或CER结构域的核苷酸序列修饰选自但不限于由以下组成的组：5′帽、3′聚腺苷酸尾、核糖开关序列、稳定性控制序列、形成dsRNA双链体的序列、将指导多核苷酸靶向亚细胞位置的修饰或序列、提供跟踪的修饰或序列、提供蛋白质结合位点的修饰或序列、锁核酸(LNA)、5-甲基dC核苷酸、2,6-二氨基嘌呤核苷酸、2′-氟代A核苷酸、2′-氟代U核苷酸；2′-O-甲基RNA核苷酸、硫代磷酸酯键、与胆固醇分子的连接、与聚乙二醇分子的连接、与间隔子18分子的连接、5′至3′共价连接、或其任何组合。这些修饰可以产生至少一个另外的有益特征，其中该另外的有益特征选自由以下组成的组：修饰的或调节的稳定性、亚细胞靶向、跟踪、荧光标记、用于蛋白质或蛋白质复合物的结合位点、对互补靶序列的修饰的结合亲和力、修饰的细胞降解抗性和增加的细胞渗透率。
在一方面，该指导核苷酸和Cas内切核酸酶能够形成复合物，该复合物使得Cas内切核酸酶能够在DNA靶位点引入双链断裂。
在本公开的一方面中，可变靶结构域是12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸长度。
在本公开的一方面，指导核苷酸包含II型CRISPR/Cas系统中的可以与II型Cas内切核酸酶形成复合物的cRNA(或cRNA片段)和tracrRNA(或tracrRNA片段)，其中所述指导核苷酸/Cas内切核酸酶复合物可以将Cas内切核酸酶指导至植物基因组靶位点，使得Cas内切核酸酶能够将双链断裂引入基因组靶位点。使用任何方法(包括但不限于粒子轰击或局部应用)将指导核苷酸直接引入植物或植物细胞。
在一方面，通过引入包含相应指导DNA序列的重组DNA分子间接引入指导核苷酸，该指导DNA序列可操作地连接到能够在植物细胞中转录指导核苷酸的植物特异性启动子。术语“相应的指导DNA”包括与RNA分子相同但用“T”代替RNA分子的每个“U”的DNA分子。
在一方面，经由粒子轰击或使用所公开的用于重组DNA构建体的农杆菌转化的方法来引入所述指导核苷酸，所述重组DNA构建体包含可操作地连接到植物U6聚合酶III启动子的相应指导DNA。
在一方面，指导RNA/Cas9内切核酸酶复合物的RNA是包含双链体crRNA-tracrRNA的双链体化的RNA。使用指导核苷酸对比双链体crRNA-tracrRNA的一个优点是，为了表达融合的指导核苷酸，仅需要制造一个表达盒。
术语“靶位点”、“靶序列”、“靶DNA”、“靶基因座”、“基因组靶位点”、“基因组靶序列”、以及“基因组靶基因座”在本文中可互换地使用，并且意指植物细胞的基因组(包括叶绿体DNA和线粒体DNA)中的多核苷酸序列，在该多核苷酸序列处通过Cas内切核酸酶在植物细胞基因组中诱导双链断裂。靶位点为植物基因组中的内源性位点，或者替代性地，靶位点与植物异源，从而不是基因组中天然存在的，或者与其在自然界中存在的地方相比，靶位点发现于异源基因组位置中。
如本文所用，术语“内源性靶序列”和“天然靶序列”在本文中可互换地使用，从而意指对于植物的基因组是内源的或天然的靶序列，并且是在植物的基因组中靶序列的内源或天然位置处。
“人工靶位点”或“人工靶序列”在本文中可互换地使用，并且意指已经引入植物基因组中的靶序列。此类人工靶序列在序列上与植物的基因组中的内源性或天然靶序列相同，但是位于植物的基因组中的不同位置(即，非内源性的或非天然的位置)处。
“改变的靶位点”、“改变的靶序列”、“修饰的靶位点”和“修饰的靶序列”在本文中可互换地使用，并且是指如本文公开的靶序列：该靶序列当与未改变的靶序列相比时包含至少一种改变。此类“改变”包括，例如：(i)至少一个核苷酸的替代、(ii)至少一个核苷酸的缺失、(iii)至少一个核苷酸的插入、或(iv)(i)-(iii)的任何组合。
在一方面，将所公开的方法用于向植物中引入用于植物中靶基因的基因抑制的多核苷酸。对于植物基因工程的几个方面来说，降低特定基因的活性(也称为基因沉默或基因抑制)是所希望的。基因沉默技术包括反义技术。
在一方面，将所公开的方法用于可用于多核苷酸引入植物中，这些多核苷酸可用于将核苷酸序列靶向整合到植物中。例如，将所公开的方法用于引入T-DNA表达盒以转化包含靶位点的植物，该转移盒包含不相同重组位点侧翼的目的核苷酸序列。在一方面，靶位点包含至少一组与T-DNA表达盒上的那些相对应的不相同的重组位点。重组位点侧翼的核苷酸序列的交换通过重组酶进行。因此，将所公开的方法用于引入T-DNA表达盒以靶向整合核苷酸序列，其中该T-DNA表达盒的侧翼为由重组酶识别的不相同重组位点，该重组酶识别并实现不相同重组位点处的重组。因此，将所公开的方法和组合物用于提高含有不相同重组位点的植物的发育效率和发育速度。
因此，所公开的方法可以进一步包括用于将外源核苷酸定向、靶向整合到转化植物中的方法。在一方面，所公开的方法在基因靶向系统中使用重组位点，该基因靶向系统有利于将希望的基因和核苷酸序列定向靶向到先前引入到靶植物基因组中的相应重组位点。
在一方面，将侧翼有两个不相同重组位点的核苷酸序列引入到衍生自靶生物体基因组的外植体的一个或多个细胞中，从而建立用于插入目的核苷酸序列的靶位点。一旦建立了稳定的植物或培养组织，将侧翼有与侧翼靶位点的那些重组位点相对应的重组位点的第二构建体或目的核苷酸序列，在重组酶蛋白存在下引入稳定转化的植物或组织中。该过程导致靶位点和T-DNA表达盒的不相同重组位点之间的核苷酸序列的交换。
应认识到，以这种方式制备的转化植物可以包含多个靶位点；即多组不相同的重组位点。以这种方式，转化植物中的靶位点的多个操作是可获得的。转化植物中的靶位点是指已经插入到转化植物基因组中的并包含不相同重组位点的DNA序列。
用于所公开的方法中的重组位点的实例是已知的。在大多数天然存在的酿酒酵母菌株中发现的两微米质粒编码位点特异性重组酶，其促进两个反向重复之间的DNA的倒位。这种倒位在质粒拷贝数扩增中起着核心作用。
名为FLP蛋白的蛋白质催化位点特异性重组事件。最小重组位点(FRT)已被定义并且包含围绕不对称8-bp间隔子的两个反向的13个碱基对(bp)的重复序列。FLP蛋白切割该重复序列和间隔子连接处的位点，并经由3′磷酸共价连接至DNA。位点特异性重组酶(如FLP)在特定靶序列处切割和再次连接DNA，这导致两个相同位点之间的精确限定的重组。为了起作用，系统需要重组位点和重组酶。不需要辅助因子。因此，将整个系统插入到植物细胞中并在其中起作用。已显示酵母FLP\FRT位点特异性重组系统在植物中起作用。迄今为止，该系统已被用于切除不需要的DNA。参见Lyznik等人(1993)Nucleic Acids Res.[核酸研究]21：969-975。相比之下，本公开利用不相同的FRT用于植物基因组中核苷酸序列的交换、靶向、排列、插入和表达的控制。
在一方面，需要转化的、含有整合到其基因组中的靶位点的目的生物体，如来自植物的外植体。靶位点的特征在于侧翼有不相同的重组位点。另外需要靶向盒，其含有侧翼有与包含在转化生物体的靶位点中的那些位点相对应的不相同重组位点的核苷酸序列。需要识别不相同重组位点并催化位点特异性重组的重组酶。
应认识到，重组酶通过任何方式提供。即，通过瞬时表达或通过提供重组酶或重组酶蛋白质的信使RNA(mRNA)，在生物体或植物细胞中通过用能够在生物体中表达重组酶的表达盒转化生物体而提供。
“不相同重组位点”意指侧翼重组位点在序列上不相同并且不会重组，或在位点之间的重组为最小化的。即，一个侧翼重组位点可以是FRT位点，而第二个重组位点可以是突变的FRT位点。本公开的方法中使用的不相同重组位点阻止或大大抑制两个侧翼重组位点之间的重组和其中所含的核苷酸序列的切除。因此，应认识到，可以在本公开中使用任何合适的不相同重组位点，包括但不限于FRT和突变FRT位点、FRT和lox位点、lox和突变lox位点。
通过合适的不相同重组位点暗示，在活性重组酶存在下，两个不相同重组位点之间的序列切除(如果有的话)以显著低于核苷酸序列重组介导的交换靶向排列到植物基因组中的效率存在。因此，用于本公开的合适的不相同位点包括那些位点之间的重组效率低的位点；例如，其中效率小于约30％至约50％，优选小于约10％至约30％，更优选小于约5％至约10％。
如上所指出，靶向盒中的重组位点对应于转化植物的靶位点中的重组位点。即，如果转化植物的靶位点含有FRT和突变FRT的侧翼的不相同重组位点，则靶向盒将含有相同的FRT和突变FRT不相同的重组位点。
此外还应认识到，用于所公开的方法中的重组酶将取决于转化植物的靶位点中的和靶向盒中的重组位点。即，如果使用FRT位点，则需要FLP重组酶。以相同的方式，在使用lox位点的情况下，需要Cre重组酶。如果不相同重组位点包含FRT和lox位点两者，则植物细胞中需要FLP和Cre重组酶两者。
该FLP重组酶是催化位点特异性反应的蛋白质，该蛋白质参与在DNA复制期间扩增酿酒酵母的两微米质粒的拷贝数。FLP蛋白质已被克隆并表达。参见例如，Cox(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.[美国国家科学院院刊]80：4223-4227。用于本公开的FLP重组酶可以是衍生自酵母属的酶。可能优选的是使用植物优选密码子合成重组酶，用于在目的植物中最佳表达。参见例如，1997年11月18日提交的、标题为“Novel Nucleic AcidSequence Encoding FLP Recombinase[编码FLP重组酶的新颖核酸序列]”的美国申请系列号08/972，258，通过引用并入本文。
该噬菌体重组酶Cre催化在两个lox位点之间的位点特异性重组。参见例如Guo等人(1997)Nature[自然]389：40-46；Abremski等人，(1984)J.Biol.Chem.[生物化学杂志]259：1509-1514；Chen等人(1996)Somat.Cell Mol.Genet.[体细胞与分子遗传学]22：477-488；以及Shaikh等人(1977)J.Biol.Chem.[生物化学杂志]272：5695-5702。将其全部通过引用并入本文。这样的Cre序列也可以使用植物优选密码子来合成。
在适当的情况下，可以对待插入植物基因组的核苷酸序列进行优化以增加转化植物中的表达。在本公开中使用哺乳动物、酵母或细菌基因的情况下，使用植物优选密码子来合成它们以改善表达。应认识到，为了在单子叶植物中表达，也可以使用单子叶植物优选密码子合成双子叶植物基因。可获得用于合成植物偏好性基因的方法。参见例如，美国专利号5,380,831、5,436,391，以及Murray等人(1989)Nucleic Acids Res.[核酸研究]17：477-498，这些文献通过引用并入文中。可以从目的植物中表达的蛋白质中更频繁使用的密码子确定植物优选密码子。应认识到，可以构建单子叶植物或双子叶植物优选序列以及特定植物物种的植物优选序列。参见例如，EPA 0359472；EPA 0385962；WO 91/16432；Perlak等人，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]88：3324-3328；以及Murray等人(1989)Nucleic Acids Res.[核酸研究]17：477-498。美国专利号5,380,831；美国专利号5,436,391；等，这些文献通过引用并入本文中。进一步认识到，该基因序列的所有或任何部分可以是优化的或合成的。即，还可以使用完全优化的或部分优化的序列。
已知另外的序列修饰增强细胞宿主中的基因表达并且用于本公开中。这些包括：消除编码假的聚腺苷酸化信号和外显子-内含子剪接位点信号的序列、转座子样重复序列、及可能不利于基因表达的其他经充分表征的序列。可以将序列的G-C含量调整至通过参照宿主细胞中表达的已知基因而计算出的给定细胞宿主的平均水平。如果可能，修饰序列以避免出现预测的发夹二级RNA结构。
本公开还包括FLP重组靶位点(FRT)。FRT已被鉴定为包含由八(8)个碱基间隔子隔开的两个13个碱基对重复序列的最小序列。只要这两个13碱基的重复序列被八个核苷酸分开，间隔区中的核苷酸即可被核苷酸组合代替。似乎间隔区的实际核苷酸序列不是关键的；然而，对于本公开的实践，间隔区域中核苷酸的某些取代可能比其他取代更好地起作用。在链交换期间，八个碱基对间隔子参与DNA-DNA配对。该区域的不对称性决定了重组事件中位点比对的方向，这将随后导致倒位或切除。如上所示，大部分间隔子可以被突变而不丧失功能。参见例如，Schlake和Bode(1994)Biochemistry[生物化学133：12746-12751，通过引用并入本文。
将FRT突变位点用于实践所公开的方法。这样的突变位点可以通过基于PCR的诱变来构建。尽管突变FRT位点是已知的(参见WO 1999/025821的SEQ ID NO：2、3、4和5)，但认识到其他突变FRT位点可用于实践本公开。本公开不限于使用特定的FRT或重组位点，而是使用不相同的重组位点或FRT位点以将核苷酸序列在植物基因组中靶向插入和表达。因此，基于本公开构建和使用其他突变FRT位点。
如上所讨论的，在重组酶存在下，含有具有不相同重组位点的靶位点的基因组DNA与含有具有相应不相同重组位点的T-DNA表达盒的载体一起导致重组。将位于侧翼重组位点之间的T-DNA表达盒的核苷酸序列与位于侧翼重组位点之间的靶位点的核苷酸序列进行交换。以此方式，目的核苷酸序列可以精确地并入宿主的基因组中。
认识到可以实行本公开的许多变化。例如，可以构建具有多个不相同重组位点的靶位点。因此，多个基因或核苷酸序列可以在植物基因组中的精确位置处堆叠或排序。同样地，一旦已经在基因组内建立了靶位点，可以通过将此类位点并入T-DNA表达盒的核苷酸序列内并将位点转移至靶序列来引入另外的重组位点。因此，一旦已经建立了靶位点，就可能随后通过重组来添加位点或改变位点。
另一种变化包括提供与生物体中的靶位点可操作地连接的启动子或转录起始区。优选地，该启动子位于第一个重组位点的5′。通过用包含编码区的T-DNA表达盒转化生物体，在T-DNA表达盒整合到靶位点时将发生编码区的表达。这方面提供了通过提供可选择标记序列作为编码序列来选择转化细胞(特别是植物细胞)的方法。
本系统的其他优点包括通过利用如上所讨论的T-DNA表达盒并且用简单的整合模式选择生物体来降低转基因或转移的DNA在生物体中整合的复杂性的能力。以相同的方式，通过比较几个转化事件来鉴定基因组内的优选位点。基因组内的优选位点包括不破坏必需序列的表达并提供转基因序列的充分表达的位点。
以下实例是通过说明的方式但不是通过限制的方式来提供的。
实例
本公开的多个方面在以下实例中被进一步定义，其中除非另有说明，否则份数和百分数以重量计，并且度数以摄氏度计。尽管这些实例说明了本公开的多个方面，但仅是通过说明的方式给出的。从以上的讨论和这些实例中，本领域的技术人员能够确定本公开的多个方面的本质特性，并且在不脱离本公开的精神和范围的情况下，可进行它们的各种变化和修改以使其适应各种用途和条件。因此，从上述说明书来看，除了本文所示出和描述的那些之外，各种修改对于本领域技术人员来说将是清楚的。此类修改也当视为落入所附权利要求的范围内。
实例1：质粒
可用于本公开中的质粒的描述参见表2。
表2.
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实例2：培养基
可用于本公开的方法中的用于转化、选择和再生的培养基形成的描述参见表3和表4。
表3.
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表4.
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实例3：农杆菌属介导的玉米转化
A.农杆菌属母板的制备
将带有二元供体载体的根癌农杆菌从-80℃冷冻等分试样划线到固体12R培养基上，并在黑暗中在28℃培养2-3天，以制备母板。
B.使农杆菌属在固体培养基上生长
从母板上挑出单菌落或多菌落的农杆菌属，并将其划线到含有810K培养基的第二平板上，并在黑暗中于28℃孵育过夜。将农杆菌感染培养基(700A；5ml)和100mM 3′-5′-二甲氧基-4′-羟基苯乙酮(乙酰丁香酮；5μL)添加到通风橱中的14mL锥形管中。将来自第二平板的约3个满环的农杆菌属悬浮于管中，然后将管涡旋以形成均匀的悬浮液。将悬浮液(1ml)转移到分光光度计管中，并将悬浮液的光密度(550nm)调节至约0.35-1.0的读数。农杆菌属浓度为约0.5至2.0×109cfu/mL。将最终的农杆菌属悬浮液等分到2mL微量离心管中，每个管含有约1mL悬浮液。然后尽快使用悬浮液。
C.使农杆菌属在液体培养基中生长
替代性地，通过在液体培养基中生长来制备农杆菌属用于转化。感染前一天，用以下来准备125ml烧瓶：30ml 557A培养基(10.5g/l磷酸氢二钾、4.5g/l无水磷酸二氢钾、1g/l硫酸铵、0.5g/1脱水柠檬酸钠、10g/l蔗糖、1mM硫酸镁)和30μL壮观霉素(50mg/mL)和30μL乙酰丁香酮(20mg/mL)。将来自第二平板的半环农杆菌悬浮于烧瓶中，并置于设定为200rpm的轨道振荡器上，并在28℃下孵育过夜。将农杆菌属培养物以5000rpm离心10分钟。去除上清液并添加含乙酰丁香酮溶液的农杆菌属感染培养基(700A)。将细菌通过涡旋重悬，并将农杆菌属悬液的光密度(550nm)调节至约0.35至2.0的读数。
D.玉蜀黍转化
将玉米(玉蜀黍(Zea mays L.))栽培品种的穗在20％(v/v)漂白剂(5.25％次氯酸钠)加1滴Tween 20中进行表面灭菌15-20分钟，然后在无菌水中洗涤3次。从穗分离未成熟胚(IE)，并将其置于具有乙酰丁香酮溶液的2ml农杆菌感染培养基(700A)中。胚的最佳大小因近交系而异，但是对于用WUS2和ZM-ODP2转化，使用大范围的未成熟胚大小。取出农杆菌属感染培养基(810K)，将1ml农杆菌属悬液加入胚中，并将试管涡旋5-10秒。使微量离心管在通风橱中孵育5分钟。将农杆菌属悬液和胚倾倒在710I(或562V)共培养基(分别参见表3和表4)上。使用无菌刮刀将留在管中的任何胚转移到平板上。然后抽取农杆菌属悬液，并且将胚置于培养基的轴侧。将平板在黑暗中于21℃孵育1-3天进行共培养，然后将胚转移到静息培养基(605B培养基)中而不进行选择。
实例4：改善单倍体孤雌生殖的方法
评估了全长ZM-ODP2肽的V59至D266(见图1)区域内的肽结构域。在该区域中鉴定出两个基序结构域，在本文称为“基序A”和“基序B”，该基序A包含编码基序A肽片段(SEQ IDNO：36)的ZM-ODP2(TR12)DNA片段(SEQ ID NO：35)，该基序B包含编码基序B肽片段(SEQ IDNO：38)的ZM-ODP2(TR11)DNA片段(SEQ ID NO：37)。相对于全长ZM-ODP2肽，基序B肽片段开始于A60并且结束于G69，基序A肽片段开始于I156并且结束于P171(见图1)。产生DNA多核苷酸片段，其中每个片段编码ZM-ODP2肽(见表5)。某些DNA多核苷酸(SEQ ID NO：3、8、9和10)为合成DNA序列，这些合成DNA序列包含使用人工接头的至少两个DNA片段的融合，以分别编码合成肽SEQ ID NO：13、18、19和20。
表5.
编码ZM-ODP2肽的每个DNA多核苷酸与在单倍体细胞或组织中有活性的调节元件(例如在雌配子发育期间有活性的启动子)连接。替代性地，ZM-ODP2核苷酸序列可以在诱导型启动子的控制下。替代性地，所用启动子为诱导型和组织优选的。例如，启动子为单倍体组织特异性的和诱导型的。具体地，编码ZM-ODP2肽的每个DNA多核苷酸可操作地连接到包含PV-EGG CELL PRO(TR1)(SEQ ID NO：31)、EGG MIN PRO(SEQ ID NO：32)和PV-PRO31696.15UTR(SEQ ID NO：33)的调节元件，调节元件SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：33的这种组合称为“PvEC1启动子”(SEQ ID NO：34)。
使用编码ZM-ODP2肽的每个相应DNA多核苷酸产生包含表达盒的质粒(见图1)，如表6所示。因此，制备了一系列具有包含这些与ZM-ODP2(TR5)(SEQ ID NO：2)融合的DNA序列的表达盒的质粒，以检查这些结构域对单倍体孤雌生殖的影响。例如，质粒RV036694(SEQID NO：28)包含ZM-ODP2变体6表达盒，该表达盒含有编码ZM-ODP2-(156-171)-(266-669)肽的ZM-ODP2(TR12)-接头-ZM-ODP2(TR5)-V2多核苷酸；质粒RV036693(SEQ ID NO：29)包含ZM-ODP2变体7表达盒，该表达盒含有编码ZM-ODP2-(60-69)-(266-669)肽的ZM-ODP2(TR11)-接头-ZM-ODP2(TR5)-V2；并且质粒RV036695(SEQ ID NO：30)包含ZM-ODP2变体8表达盒，该表达盒含有编码ZM-ODP2-(60-69)-(156-171)-(266-669)肽的ZM-ODP2(TR11)-接头-ZM-ODP2(TR12)-接头-ZM-ODP2(TR5)多核苷酸(见表6和图1)。
表6.
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下文描述的方法使用含有孤雌生殖因子(诸如ODP2)的转化系。优选地，转化系包含杂交基因组。在雌配子发生期间，发生孤雌生殖因子的表达，并且在胚囊细胞(特别是卵细胞)内或附近提供孤雌生殖因子的活性，以刺激单倍体孤雌生殖。此类单倍体孤雌生殖发生在没有卵细胞受精的情况下(见图2)。母本中央细胞需要来自花粉细胞的精子细胞核的单次受精，以形成适当的胚乳(例如，假受精或假受精胚乳)。下文展示了通过假受精使用母本(产生雌性特征的)双单倍体生产方法提高玉蜀黍双单倍体生产力。
A.响应于ZM-ODP2肽变体的母本单倍体诱导，使用第一育种杂交
本公开的方法涉及通过用孤雌生殖因子(包括但不限于ODP2)转化非单倍体诱导系来产生单倍体诱导物系。孤雌生殖因子在不通过精子受精的情况下诱导母本单倍体胚的发育和生长。
具体地，将具有表2中所述的T-DNA特征的表6中所示的质粒用于农杆菌属介导的未成熟二倍体胚的转化。使用本文所述的转化、再生、生长和杂交方法，检查半合子T0转基因植物以测量单倍体诱导水平。具体地，通过执行第一育种杂交来获得未成熟的F1杂交胚。该育种杂交使用两个不同的近交系(P1和P2)作为相应的亲本系，其中一个亲本系用作雌穗供体(P1)，用获自第二父本系(P2)的花粉进行授粉(见图3A)。在抽丝前将母本植物(P1)的穗进行芽套袋，以避免任何外来花粉污染。在用来自父本系(P2)的花粉授粉后大约9-14天，收获未成熟的穗。将穗在30％漂白剂加上0.5％洗涤剂中表面消毒20分钟，并且用无菌水冲洗两次，并且使用实例3中所述的方法将二倍体(F1)胚用表6中所示的质粒转化。
转化后，作为具有一个T-DNA拷贝的稳定插入的半合子T0植物的每个再生植物被视为独特事件并且生长至成熟。在抽丝前将每个半合子T0植物的穗进行芽套袋，以避免任何外来花粉污染。用从组成型表达青色荧光蛋白颜色标记(CFP)的雄性非单倍体诱导亲本植物的花药中收集的有活力的花粉粒对母本植物的植物上的穗丝进行授粉。在授粉后大约9-14天，收获未成熟的穗。将穗在30％漂白剂加上0.5％洗涤剂中表面消毒20分钟，并且用无菌水冲洗两次。
分离胚并且检查是否存在CFP表达，以分别检测二倍体胚和单倍体胚。使用单倍体胚的数量除以分离的胚的总数，对每个独特事件的CFP阴性胚(单倍体胚)的百分比(％)进行评分。将受精不良的穗(例如，总共少于50个籽粒)丢弃。使用每个质粒的所有检查事件的平均CFP阴性胚(单倍体胚)计算平均单倍体诱导水平和标准偏差(见表7)。
在该第一育种杂交中，对表6中所示的每个实验质粒相对于阳性对照进行成对比较。将包含全长ZM-ODP2肽(ZM-ODP2)的PHP94831用作阳性对照，并且将包含截短的ZM-ODP2肽(ZM-ODP2(TR5))的PHP92900用作最小阳性对照。在每个成对比较中，使用双侧学生t检验(α＝0.95)，对包含ZM-ODP2变体肽的实验质粒与PHP94831或PHP92900进行比较。该测试的零假设是ZM-ODP2变体肽与对照质粒相比将表现出相同的单倍体诱导水平(无差异，nd)；该测试的备择假设是ZM-ODP2变体肽与对照质粒相比不会表现出相同的单倍体诱导水平。使用该第一育种杂交进行的每个成对比较的结果显示在表7中。
表7.
含有ZM-ODP2变体表达盒的每个质粒具有平均单倍体诱导(HI)水平，该诱导水平在95％置信水平上与使用质粒PHP92900(最小阳性对照)所观察到的平均HI水平显著不同。除质粒RV036687(其中ZM-ODP2变体缺乏AP2转录因子的两个DNA结合结构域(DBD)特征(见图1))外，每个ZM-ODP2变体肽均改变孤雌生殖，并且最终相对于PHP92900改善了母本单倍体诱导。
然后确定与PHP94831(阳性对照)相比，含有ZM-ODP2变体肽的表6质粒能否改善母本单倍体诱导，其中ZM-ODP2变体包含全长ZM-ODP2肽。如上所述，与质粒PHP92900相比，质粒RV036687诱导孤雌生殖和母本单倍体诱导的能力也显著降低(p＜.00001，95％置信水平)；当与PHP94831相比时，使用质粒PHP92900所观察到的单倍体诱导水平也是如此(p＜0.000026，95％置信水平)(见表7)。
出乎意料的是，相对于全长ZM-ODP2肽，几种ZM-ODP2变体肽能够改善单倍体诱导。响应于用质粒RV036689(含有编码从全长ZM-ODP2肽的G155开始的N末端肽的多核苷酸)和RV036690(含有编码从全长ZM-ODP2肽的V59开始的N末端肽的多核苷酸)的转化，观察到显著增加的单倍体诱导水平(见表6、表7、图1和图3B)。这些结果表明，全长ZM-ODP2肽的G155至D266区域和V59至D266区域对单倍体孤雌生殖具有积极影响。
与质粒PHP92900(其中截短的ZM-ODP2-(266-669)肽表现出3.4％的单倍体诱导水平)相比，质粒RV036693、RV036694和RV036695各自在95％置信水平上显著不同(见表7和图3B)。这些结果清晰地确定了这些结构域在赋予孤雌生殖母本单倍体诱导中的功能作用。
与质粒PHP94831(其中全长ZM-ODP2-(1-711)肽表现出16.8％的单倍体诱导水平)相比，质粒RV036693和RV036694在95％置信水平上无显著差异(见表7和图3B)。
出乎意料的是，使用质粒RV036695观察到的平均单倍体诱导水平在95％置信水平上存在显著差异，并且使用ZM-ODP2-(60-69)-(156-171)-(266-669)肽表现出更高的母本单倍体诱导水平(见表7和图3B)。该结果进一步证明这些结构域赋予改善单倍体孤雌生殖的功能作用。
此外，这些结果表明有可能设计合成ZM-ODP2变体，该变体包含具有至少一个融合至进一步改善孤雌生殖的最小ZM-ODP2肽的N末端结构域的肽。具体地，与全长ZM-ODP2肽相比，质粒RV036690在孤雌生殖诱导方面表现出显著差异(见表7)。
B.响应于ZM-ODP2肽变体的母本单倍体诱导，使用第二育种杂交
鉴于上文A中所示的结果，使用第二育种杂交评估响应于ZM-ODP2肽变体的诱导水平，以确定响应于相同质粒活性的类似的母本单倍体诱导水平是否以独立于基因型的方式发生。该第二育种杂交使用第三亲本系作为雌穗供体(P3)，该雌穗供体用获自第四父本系(P4)获得的花粉受精(见图4A和图4B)。该实验按照如上文A中所述的相同方式进行。
在该第二育种杂交中，对表6中所示的每个实验质粒相对于阳性对照进行成对比较。将包含全长ZM-ODP2肽(ZM-ODP2)的PHP94831用作阳性对照，并且将包含截短的ZM-ODP2肽(ZM-ODP2(TR5))的PHP92900用作最小阳性对照。在每个成对比较中，使用双侧学生t检验(α＝0.95)，对包含ZM-ODP2变体肽的实验质粒与PHP94831或PHP92900进行比较。该测试的零假设是ZM-ODP2变体肽与对照质粒相比将表现出相同的单倍体诱导水平(无差异，nd)；该测试的备择假设是ZM-ODP2变体肽与对照质粒相比不会表现出相同的单倍体诱导水平。使用该第一育种杂交进行的每个成对比较的结果显示在表8中。
表8.
含有ZM-ODP2变体表达盒的每个质粒具有平均单倍体诱导(HI)水平，该诱导水平在95％置信水平上与使用质粒PHP92900(最小阳性对照)所观察到的平均HI水平显著不同。除质粒RV036687(其中ZM-ODP2变体缺乏AP2转录因子的两个DNA结合结构域(DBD)特征(见图1))外，每个ZM-ODP2变体肽均改变孤雌生殖，并且最终相对于PHP92900改善了母本单倍体诱导(见表8和图4B)。
然后确定与PHP94831(阳性对照)相比，含有ZM-ODP2变体肽的表6质粒能否改善母本单倍体诱导，其中ZM-ODP2变体包含全长ZM-ODP2肽。如上所述，与质粒PHP92900相比，质粒RV036687诱导孤雌生殖和母本单倍体诱导的能力也显著降低(p＜.00001，95％置信水平)；当与PHP94831相比时，使用质粒PHP92900所观察到的单倍体诱导水平也是如此(p＜0.000086，95％置信水平)(见表8)。
编码ZM-ODP2变体肽的剩余质粒中的每一个均表现出与质粒PHP94831提供的全长ZM-ODP2肽相似的母本单倍体诱导水平，但存在以下例外。首先，与PHP94831相比，质粒RV036688的平均单倍体诱导水平显著增加(p＜.022960；见表8和图4B)。其次，与PHP94831相比，质粒RV036689的平均单倍体诱导也显著增加(p＜.035662；见表8和图4B)。值得注意的是，质粒RV036689包含基序A结构域，因此支持在上文A部分中观察到的结果。
剩余质粒RV036690、RV036693、RV036694和RV036695在转化为由该第二育种杂交得到的F1胚中时与全长ZM-ODP2肽无统计学差异。尽管如此，当使用这些ZM-ODP2肽变体时，观察到与全长ZM-ODP2肽相似的母本单倍体诱导趋势。例如，分别具有翻译融合至ZM-ODP2-(266-669)的基序B(10个氨基酸)和基序A(16个氨基酸)的质粒RV036693和RV036694证明补充ZM-ODP2-(266-669)的这些基序具有类似于全长ZM-ODP2肽的活性。有趣的是，与质粒PHP94831(平均单倍体诱导水平为29％)相比，使用质粒RV036695(平均单倍体诱导水平为34％)观察到5个百分点的差异(增加17.2％)；趋势与第一育种杂交的结果一致。此类差异是生物相关，并且对依赖此类母本单倍体诱导过程的植物育种过程具有积极影响。因此，这些结果的趋势表明ZM-ODP2变体肽改善了玉蜀黍中的单倍体孤雌生殖。
与天然ZM-ODP2肽相比，包含合成肽的部分ZM-ODP2肽和/或非天然存在的ZM-ODP2融合体显著改善了单倍体孤雌生殖，如表7和8所示。
C.响应于ZM-ODP2肽变体的母本单倍体诱导，使用单倍体诱导杂交
鉴于A和B部分所示的以上结果，对响应于通过向卵细胞提供ZM-ODP2变体肽的活性所赋予的单倍体孤雌生殖以及响应于使用玉蜀黍单倍体诱导物系的母本单倍体诱导水平(见图4)进行评估。
未成熟的F1杂交胚通过执行育种杂交获得，其中将母本系穗供体用获自父本系的花粉受精。在抽丝前将母本植物的穗进行芽套袋，以避免任何外来花粉污染。在授粉后大约9-14天，收获未成熟的穗。将穗在30％漂白剂加上0.5％微量洗涤剂中表面消毒20分钟，并且用无菌水冲洗两次，并且使用实例3中所述的方法转化二倍体胚。具体地，使用具有编码ZM-ODP2变体肽的DNA多核苷酸的质粒转化二倍体胚，如表4中所示。与质粒PHP94831(SEQID NO：21)相比，赋予改善的单倍体孤雌生殖的编码ZM-ODP2变体肽的质粒，如本实例4的A和B部分所示，包括但不限于质粒RV036689、RV036690、RV036688、RV036694、RV036693和RV036695(分别为SEQ ID NO：25-30)，可用于本文所公开的方法中。
每个再生F1杂种植物是具有一个稳定插入的拷贝(单拷贝T-DNA)的半合子T0植物，其被视为独特事件，并且生长至成熟。在抽丝前将每个半合子T0植物的穗进行芽套袋，以避免任何外来花粉污染。执行单倍体诱导杂交，其中用从作为单倍体诱导物系的雄性花粉供体的花药收集的有活力的花粉粒对母本植物穗的穗丝进行授粉。
雄性花粉供体单倍体诱导物系选自和/或衍生自Stock 6、RWK、RWS、UH400、AX5707RS和NP2222-matl、或任何单倍体诱导物系。单倍体诱导物的使用可包括单倍体检测方法，其中单倍体诱导物系具有形态标记。形态标记鉴别二倍体和单倍体胚，其中选择缺乏形态标记遗传的单倍体胚。使用形态标记的方法包括在荧光报告表达构建体的早期发育阶段进行检测，诸如绿色、黄色或红色荧光报告基因和/或花青素基因的等位基因(诸如在早期发育阶段的胚中表达的R1-scm等位基因)。此类标记基因允许分别基于这些报告基因产物的存在或不存在来鉴别二倍体和单倍体胚。
执行单倍体诱导杂交后，在授粉后大约9-14天收获未成熟的穗。将穗在30％漂白剂加上0.5％微量洗涤剂中表面消毒20分钟，并且用无菌水冲洗两次。分离胚并且检查是否存在父本遗传的形态标记，以分别对二倍体和单倍体胚进行计数。使用单倍体胚的数量除以分离的胚的总数，计算每个独特事件的父本遗传形态标记的百分比(％)。将受精不良的穗(例如，总共少于50个籽粒)丢弃。使用每个质粒的所有检查事件观察到的单倍体水平计算每个质粒的平均单倍体诱导水平和标准偏差。
与该实例4的A和B部分相比，预计单倍体孤雌生殖将响应于雌配子体内的质粒所提供的母本卵细胞活性和响应于父本的花粉所提供的单倍体诱导特性而得到改善。与该实例4的A和B部分所示结果(其中雄性花粉供体是非单倍体诱导物)相比，预计这些赋予母本卵细胞单倍体孤雌生殖的组合活性将导致改善的母本单倍体诱导。
D.响应于ZM-ODP2肽变体获得母本单倍体诱导的替代转化方法
以上结果(A和B部分)证明，与ZM-ODP2(SEQ ID NO：1)相比，在用具有编码ODP2变体(ZM-ODP2(TR9)、ZM-ODP2(TR10)、ZM-ODP2(TR8)、ZM-ODP2(TR12)-接头-ZM-ODP2(TR5)-V2、ZM-ODP2(TR11)-接头-ZM-ODP2(TR5)-V2或ZM-ODP2(TR11)-接头-ZM-ODP2(TR12)-接头-ZM-ODP2(TR5)(分别为SEQ ID NO：5-10)的多核苷酸的构建体稳定转化的植物中，母本单倍体诱导得到改善。以上结果表明，将具有单倍体诱导能力的构建体整合到再生的F1植物中能够遗传，并且在后续世代中赋予单倍体诱导表型。本实验描述了一种获得具有单倍体诱导能力的再生F1植物和提供单倍体诱导能力的构建体的Cre介导的切除的方法，从而提供了一种获得缺乏单倍体诱导表型的双单倍体子代的方法。
简而言之，使用农杆菌属菌株LBA4404 THY-转化由两个近交亲本系杂交得到的玉蜀黍F1杂交体的未成熟胚(参见美国专利8,334,429，其通过引用以其整体并入本文)。转化使用农杆菌属混合物进行，如先前所述(参见美国专利公开20210062203，其通过引用以其整体并入本文)。利用含有质粒RV020636(SEQ ID NO：151)的农杆菌属菌株获得具有来自“性状”质粒的整合T-DNA的单拷贝的转基因植物，其中每个性状质粒包含ZM-ODP2变体(SEQID NO：5-10)。在本实验中，使用包含90％的具有“性状”质粒的农杆菌属菌株和10％的具有RV020636质粒的农杆菌属菌株的混合物(v/v)。
在该实例中，“性状”质粒包含含有编码ZM-ODP2变体的多核苷酸的第一表达盒和含有编码Cre重组酶的多核苷酸的第二表达盒，其中两个表达盒的侧翼均为上游和下游loxP位点。例如，将包含编码全长ZM-ODP2肽的表达盒和编码Cre重组酶的表达盒的质粒RV03440X(SEQ ID NO：154)用作对照性状质粒。对响应于质粒RV03440X的母本单倍体诱导水平与响应于用含有ZM-ODP2变体编码序列的实验状质粒转化的植物所观察到的母本单倍体诱导水平进行比较。例如，含有编码ZM-ODP2变体肽的多核苷酸的实验性状质粒可包括：编码ZM-ODP2(TR9)(SEQ ID NO：155)的质粒RZ000001；编码ZM-ODP2(TR10)(SEQ ID NO：156)的RZ000002；编码ZM-ODP2(TR8)(SEQ ID NO：157)的RZ000003；编码ZM-ODP2(TR12)-接头-ZM-ODP2(TR5)-V2(SEQ ID NO：158)的RZ000004；编码ZM-ODP2(TR11)-接头-ZM-ODP2(TR5)-V2(SEQ ID NO：159)的RZ000005；或编码ZM-ODP2(TR11)-接头-ZM-ODP2(TR12)-接头-ZM-ODP2(TR5)(SEQ ID NO：160)的RZ000006。在该实验中，获得含有性状质粒的稳定转化的植物。
在用包含90％的具有“性状”质粒的农杆菌属菌株和10％的具有RV020636质粒的农杆菌属菌株的混合物共感染每个胚后，体细胞胚发生响应于RV020636质粒而被活化，并且体细胞胚如本文所述进行培养。大约6-10天后，任何增殖组织和体细胞胚被解剖和传代培养，并且将解剖组织的每一部分被转移到成熟培养基(289Q)中，在26℃-28℃在黑暗条件下进行体外培养。约6-10天后，将传代培养的组织转移到26℃的光培养室中，直到长出具有良好根的健康小植株。约7-14天后，将小植株转移到含有盆栽土壤的平地中并在生长室中生长1周，随后在温室中再生长1-2周，然后移植到盆中的土壤中并在温室条件下生长。
为鉴别具有由“性状”质粒提供的稳定整合的T-DNA并且缺乏质粒RV020636的T-DNA的T0植物，对每株植物的叶组织取样并且使用PCR诊断方法进行评估。选择缺乏RV020636质粒序列(其为性状质粒的单拷贝)的植物，其中每株植物包含独特的事件。
使选择的T0植物生长至成熟并且用作与来自玉蜀黍近交系的花粉受精的穗供体，该玉蜀黍近交系为例如具有野生型马铃薯糖蛋白样磷脂酶A2基因的近交系的非单倍体诱导物。使用表达标记基因(诸如GUS、PMI、PAT、GFP、CFP、B1、C1、R-nj和/或提供花青素色素活性的基因)的任何非单倍体诱导物。例如，将表达青色荧光蛋白(CFP)报告基因的非单倍体诱导物系用于本文所公开的方法中。为测量母本单倍体诱导，单倍体胚(CFP阴性胚)基于来自父本的标记基因的不存在进行评分。对于每个事件，单倍体诱导水平通过将CFP阴性胚的数量除以每个事件取样的胚总数来计算。每个构建体的平均单倍体诱导水平是所有事件的平均单倍体诱导水平。
在该实验中，预计母本单倍体诱导增加，因为与使用质粒RV03440X(SEQ ID NO：154)观察到的诱导水平相比，在用实验质粒诸如质粒RZ000001至RZ000006(SEQ ID NO：155-160)转化的植物中观察到改善的单倍体孤雌生殖反应。还预计在单倍体孤雌生殖期间，Cre介导的稳定整合的“性状”构建体切除将产生缺乏单倍体诱导性状盒的植物。因此，使用该方法获得的双单倍体植物缺乏升高水平的母本单倍体诱导，并且预计主要产生二倍体种子，因此使这些植物可用于常见的育种实践。
实例5：使用修饰的调节元件优化单倍体孤雌生殖的方法
在实例4的方法中，每个ZM-ODP2表达盒可操作地连接到包含名为PV-EGG CELLPRO(SEQ ID NO：31)、EGG MIN PRO(SEQ ID NO：32)和PV-PRO316965UTR(SEQ ID NO：33)的DNA片段的调节元件，在本文中称为“PvEC1启动子”(SEQ ID NO：34)。
如上所述，在植物卵细胞中表达的调节元件可用于调节ZM-ODP2肽活性以诱导母本单倍体诱导，导致所产生的子代中有一定百分比是单倍体(与亲本相比，具有一半染色体数目)。此外，使用替代调节元件以进一步优化孤雌生殖母本单倍体诱导水平。例如，在本公开的方法中使用以下调节元件，诸如US2015/0152430中公开的那些(启动子包括但不限于AT-DD5启动子、AT-DD31启动子、AT-DD65启动子和ZM-DD45)和US 2018/0094273中公开的那些(玉蜀黍卵细胞启动子)(US 2015/01 52430和US 2018/0094273通过引用以其全文并入本文)。
编码本文所公开的ZM-ODP2变体的表达盒可操作地连接到含有至少一种表达调节元件(EME)的调节元件可用于本公开的方法中。可用于本公开的方法中的EME包括但不限于表9中列出的那些。
表9.
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编码与含有至少一种表达调节元件(EME)和/或增强子的调节元件可操作地连接到ZM-ODP2变体的表达盒也可用于本公开的方法中。表10中列出了可用于本公开方法的增强子。
表10.
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预计包括至少一个EME(见表9)和/或至少一个增强子(见表10)的替代“PvEC1启动子”(SEQ ID NO：34)将用于改变雌配子发生期间的mRNA转录水平，从而与ZM-ODP2变体相比，进一步改善和/或优化孤雌生殖母本单倍体诱导，该ZM-ODP2变体可操作地连接到包含名为PV-EGG CELL PRO(SEQ ID NO：31)、EGG MIN PRO(SEQ ID NO：32)和PV-PRO316965UTR(SEQ ID NO：33)的DNA片段的调节元件，该调节元件在本文中称为“PvEC1启动子”(SEQ IDNO：34)，如实例4中所示。
例如，示例性启动子示于表11中。如表11中所示，“PvEC1启动子”(SEQ ID NO：34)使用具有一个、两个或三个拷贝的ZM-AS2EME(分别显示为1X ZM-AS2、2X ZM-AS2和3X ZM-AS2)在不同位置处被修饰。EME位置指示插入每个相应EME序列的TATA盒上游的DNA碱基对数量。用于每个启动子的TATA序列显示在TATA框列中。
表11.
预计表11中所示的修饰调节元件将用于改变雌配子发生期间的mRNA转录水平，从而与ZM-ODP2变体相比，进一步改善和/或优化孤雌生殖母本单倍体诱导，这些ZM-ODP2变体可操作地连接到包含名为PV-EGG CELL PRO(SEQ ID NO：31)、EGG MIN PRO(SEQ ID NO：32)和PV-PRO316965UTR(SEQ ID NO：33)的DNA片段的调节元件，该调节元件在本文中称为“PvEC1启动子”(SEQ ID NO：34)，如实例4中所述。
本公开的方法还可以使用具有或不具有表9中所示的EME序列和/或表10中所示的增强子的不同启动子。由天然启动子的片段组成的合成启动子可用于本公开的方法中。此类合成启动子被设计为调节基因的活性，例如，以改善如本文所述的单倍体孤雌生殖。
本文用于产生合成启动子的天然启动子及其片段包括PvEC1启动子(SEQ ID NO：34)、玉蜀黍卵细胞启动子“ZM-EXP31554 PRO”(SEQ ID NO：128)和普通小麦卵细胞启动子“TA-EC PRO”(SEQ ID NO：129)。将PvEC1启动子(SEQ ID NO：34)用作玉蜀黍卵细胞启动子的核心启动子，并且来自玉蜀黍卵细胞启动子“ZM-EXP31554PRO”(SEQ ID NO：128)或普通小麦卵细胞启动子“TA-EC PRO”(SEQ ID NO：129)的其他DNA片段用于表12中所述的合成启动子中的至少一个上游活化区(UAR)。
表12.
预计表12中显示的合成启动子(SynPRO_04、SynPRO_05、SynPRO_06、SynPRO_07、SynPRO_08、SynPRO_09)将改变雌配子发生期间的mRNA转录水平，从而与ZM-ODP2变体相比，进一步改善和/或优化孤雌生殖母本单倍体诱导，这些ZM-ODP2变体可操作地连接到包含名为PV-EGG CELL PRO(SEQ ID NO：31)、EGG MIN PRO(SEQ ID NO：32)和PV-PRO31696 5UTR(SEQ ID NO：33)的DNA片段的调节元件，该调节元件在本文中称为“PvEC1启动子”(SEQ IDNO：34)，如实例4中所示。
进一步，与ZM-ODP2变体相比，预计表12中所示的合成启动子在与表9的EME和/或表10的增强子组合时将导致孤雌生殖母本单倍体诱导的进一步改善和/或优化，这些ZM-ODP2变体可操作地连接到包含名为PV-EGG CELL PRO(SEQ ID NO：31)、EGG MIN PRO(SEQID NO：32)和PV-PRO31696 5UTR(SEQ ID NO：33)的DNA片段的调节元件，该调节元件在本文中称为“PvEC1启动子”(SEQ ID NO：34)，如实例4中所示。
实例6：另外的孤雌生殖因子的发现
将酵母双杂交(Y2H)系统用于鉴别与包含编码基序A肽片段(SEQ ID NO：36)的ZM-ODP2(TR12)DNA片段(SEQ ID NO：35)的基序“A”相互作用的蛋白质和/或与编码基序B肽片段(SEQ ID NO：38)的ZM-ODP2(TR11)DNA片段(SEQ ID NO：37)的基序“B”相互作用的蛋白质，将此类鉴别出的蛋白质用作孤雌生殖因子(PF)。
将Y2H系统用于鉴别体内特异性蛋白质相互作用。具体地，在Y2H系统中，两种融合蛋白在酵母细胞中表达。第一融合蛋白具有与测试蛋白融合的转录激活因子的DNA结合结构域，在本文中称为“诱饵”蛋白。第二融合蛋白包括融合至另一测试蛋白的转录激活因子的转录活化结构域。如果两种测试蛋白在体内相互作用，则转录激活因子的两个结构域结合在一起，重组转录激活因子并且活化由转录激活因子控制的报告基因。
第一诱饵蛋白(SEQ ID NO：119)，在本文中称为“ZM-ODP2诱饵1”，具有包含ZM-ODP2(TR5)(SEQ ID NO：2)的多核苷酸，以产生包含ZM-ODP2-(266-669)肽变体(SEQID NO：12)的测试蛋白。第二诱饵蛋白(SEQ ID NO：120)，在本文中称为“ZM-ODP2诱饵2”，具有包含ZM-ODP2(TR11)-接头-ZM-ODP2(TR12)-接头-ZM-ODP2(TR5)的多核苷酸(SEQID NO：10)，以产生包含ZM-ODP2-(60-69)-(156-171)-(266-669)肽变体(SEQ ID NO：20)的测试蛋白。每个诱饵蛋白(ZM-ODP2诱饵1和ZM-ODP2诱饵2)在酵母中表现出一定程度的毒性，因此，将编码诱饵测试蛋白的每个多核苷酸插入诱导型载体并且如下所述使用。在不存在或存在剂量范围的3-氨基三唑(3-AT)以降低背景水平的情况下，对每种诱饵蛋白进行测试，并且初步测试将评估诱饵蛋白是否自动活化咪唑甘油磷酸脱水酶(HIS3)报告基因。
利用可从马萨诸塞州的剑桥(Cambridge，MA)的Hybrigenics Corporation获得(参见US 2003/0134268，其通过引用以其整体并入本文)的优化版本的Y2H系统，使用Hybrigenics玉米(玉蜀黍)叶和子房ref：[MALO]文库，鉴别与上文所述的每个“诱饵”蛋白相互作用的蛋白质。具体地，“猎物”蛋白包含融合至转录活化结构域的Hybrigenics玉米(玉蜀黍)叶和子房ref：[MALO]文库的多核苷酸，该转录活化结构域为例如识别并结合至上游活化序列并且正向调节基因表达的Gal4结构域。当将两者结合在一起时，鉴别出“诱饵”蛋白与“猎物”蛋白之间的蛋白质相互作用，从而重组转录激活因子，该转录激活因子活化由转录激活因子控制的报告基因。“猎物”相互作用配偶体的种类通过对选择的酵母菌落中的相应质粒进行测序获得，并且使用专有的基因模型注释确定相应的全长蛋白质。
使用ZM-ODP2诱饵1蛋白(数据集hgx5639)和ZM-ODP2诱饵2蛋白(数据集hgx5640)，通过蛋白质相互作用鉴定出总共139个孤雌生殖因子(PF)(见表13)。在这139个孤雌生殖因子(PF)中，15个PF与ZM-ODP2诱饵1蛋白和ZM-ODP2诱饵2蛋白共有的酵母两种杂交相互作用相关联(见表13；Y2H缔合“两者”)；47个PF与ZM-ODP2诱饵1蛋白特有的酵母两种杂交相互作用相关联(见表13；Y2H缔合“hgx5639”)；并且77个PF与ZM-ODP2诱饵2蛋白特有的酵母两种杂交相互作用相关联(见表13；Y2H缔合“hgx5640”)。
表13.
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预计与ZM-ODP2诱饵2蛋白和ZM-ODP2诱饵1蛋白共享相互作用的孤雌生殖因子的鉴别可用于单倍体孤雌生殖诱导以调节孤雌生殖因子的活性，或与本文所公开的ODP2变体孤雌生殖因子组合使用时实现该用途。
预计通过向细胞诸如卵细胞提供ZM-ODP2肽(包括ZM-ODP2肽变体，例如表5中所述的变体)的活性，同时调节表13中所示的孤雌生殖因子的活性，来改善单倍体孤雌生殖。
实例7：使用ZM-ODP2肽变体和另外的孤雌生殖因子改变单倍体孤雌生殖
预计将通过向雌配子体(诸如卵细胞)提供孤雌生殖因子的活性来调节单倍体孤雌生殖。预计表13中使用包含编码获自叶和子房组织两者的转录物的多核苷酸的文库鉴定的孤雌生殖因子能够以可能活化或抑制ODP2活性的方式与ODP2肽相互作用，因此预计其将改变单倍体孤雌生殖。
通过向雌配子体诸如卵细胞提供孤雌生殖因子(诸如表13中所示的肽)与ODP2肽相结合的活性来评估单倍体孤雌生殖。使用含有编码ZM-ODP2变体8的多核苷酸的对照质粒RV036695(SEQ ID NO：30)观察单倍体孤雌生殖。此外，将表14中所述的质粒用于如实例3中所述的转化。如实例4A中所述测量单倍体孤雌生殖。
构建另外的表达盒并将其用于本文所公开的方法中，该另外的表达盒含有编码孤雌生殖因子(PF)和/或ZM-ODP2肽变体的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接到调节元件，诸如如实例4中所示的“PvEC1启动子”(SEQ ID NO：34)，和/或可操作地连接到如实例5中所述的调节元件(包括但不限于表9中列出的EME、和/或表10中列出的增强子、和/或表11和/或表12中列出的启动子)。
表14.
与响应于单独ZM-ODP2变体8肽的表达所观察到的单倍体孤雌生殖的水平相比，响应于ZM-ODP2变体8肽和孤雌生殖因子肽的共表达所观察到的单倍体孤雌生殖水平降低。这些结果表明，共表达的蛋白质组合在不同程度上减少了单倍体孤雌生殖(见表14)。这种单倍体孤雌生殖的减少可能是由调节ODP2活性的孤雌生殖因子引起的，例如，通过调节ODP2转录因子的蛋白质稳定性、通过调节ODP2与另一种蛋白质或作为蛋白质复合物的模块组分的蛋白质的相互作用、和/或者通过调节其他类型的相互作用(包括但不限于蛋白质-DNA、蛋白质-RNA、蛋白质一辅因子和/或蛋白质-配体相互作用)来实现。
因此，预计改善的单倍体孤雌生殖通过向雌配子体诸如卵细胞提供ZM-ODP2肽(诸如ZM-ODP2变体8)和一个或多个基因座的阻遏子的组合活性，赋予孤雌生殖因子基因产物来实现。预计通过向植物细胞提供ZM-ODP2肽活性，从而阻遏表现为减少单倍体孤雌生殖的相互作用蛋白质时，可实现增加的单倍体孤雌生殖。
实例8：获得经基因组修饰的母本双单倍体植物的改善方法
本公开的方法涉及通过转化非单倍体诱导物系以表达ZM-ODP2变体肽组分和基因编辑组分来创建基因组修饰的单倍体诱导物系。将这些组分的活性提供给植物的母本单倍体胚，以获得基因编辑的母本单倍体胚。
本文使用的单倍体孤雌生殖诱导/基因编辑方法包括基因编辑活性与ZM-ODP2变体(孤雌生殖因子)的活性、和/或在实例6中鉴定的另外孤雌生殖因子的活性、或其任何组合。这些组分可以以组织特异性方式进行调节，例如可操作地连接到在卵细胞中有活性的启动子，诸如如实例4中所示的“PvEC1启动子”(SEQ ID NO：34)，或可操作地连接到如实例5中所述的调节元件(包括但不限于表9中所列的EME、和/或表10中所列的增强子、和/或表11和/或表12中所列的启动子)，从而同时赋予单倍体孤雌生殖和基因编辑。
该实例8的方法遵循与上述实例中所证明的类似的原理。首先，转化未成熟的胚，例如，使用具有第一代(F1)或杂交的基因组(如实例4中所述)的未成熟的二倍体胚，其中二倍体胚包含遗传自两个亲本系的染色体。然后预计转化的植物将产生用于育种目的的目的遗传多样性配子。
将F1胚用含有多核苷酸的构建体转化，该多核苷酸具有侧接含有三个组分(包含单倍体诱导组分)的序列的loxP位点，其中转化的植物在未受精胚中活化单倍体孤雌生殖；基因修饰组分，其中孤雌生殖胚可具有基因组修饰，诸如突变、缺失、取代或经由同源定向DNA修复的基因靶向事件；以及第三，向经基因组修饰的孤雌生殖胚提供可用于基因切除的Cre重组酶组分。获得具有在基因组靶位点处的基因组修饰以及在两个loxP位点之间的构建体多核苷酸的Cre介导的切除的单倍体胚。
本文描述了使用特定核酸酶Cas9的方法。提供双链断裂活性的替代性Cas核酸酶可用于本公开的方法中。可对此类核酸酶进行编程以衍生其他类型的基因组修饰，诸如由两个相邻的双链断裂得到的靶向缺失(例如，序列“丢失”)，然后进行非同源末端连接，排除在两个双链断裂位点之间的插入DNA序列。此外，由于将与靶向区域(SDN-2)同源的修复DNA模板(供体DNA)引入细胞而产生的小缺失/添加可用于本公开的方法中。
A.获得经基因编辑的双单倍体植物的改善方法
Cas9介导的SDN-1方法在不添加外来DNA的情况下在植物基因组中产生双链断裂。这种断裂的自发修复可能导致突变或缺失，引起基因沉默、基因敲除或基因活性的变化。为展示这种Cas9介导的SDN-1方法，使用含有以下组分的RV034409(性状对照)、RA000007(性状测试7)、RA000008(性状测试8)、RA000009(性状测试9)、RA0000010(性状测试10)、RA0000011(性状测试11)、RA0000012(性状测试12)的质粒：具有编码全长ZM-ODP2蛋白(性状对照)的多核苷酸或编码ZM-ODP2变体蛋白(性状测试7-12)的多核苷酸的单倍体诱导表达盒，其可操作地连接到“PvEC1启动子”(SEQ ID NO：34)；可操作地连接到ZM-EXP31554启动子的SV40NLS-Cas9-VIRD2融合蛋白：gRNA表达盒，其可操作地连接到玉蜀黍RNA聚合酶III启动子序列，该启动子序列是切割ZM-NAC7(SEQ ID NO：136)的靶位点所需的；可操作地连接至组成型启动子的DsRED荧光蛋白；以及可操作地连接到“PvEC1启动子”(SEQ ID NO：34)的玉蜀黍优化的Cre重组酶蛋白。LoxP位点侧接于上述表达盒，以允许间插多核苷酸的CRE介导的切除。
质粒RV034409(性状对照)在单倍体孤雌生殖期间提供Cas9活性，以在NAC7靶位点处产生双链断裂，其中该断裂的自发修复导致变化，诸如突变或缺失。这些先前的结果表明，高达68％的所获得的单倍体植物在ZM-NAC7靶位点处表现出SDN-1编辑的证据。
预计当本文所公开的赋予改善的单倍体孤雌生殖的ZM-ODP2变体与SDN-1基因组修饰组分组合使用时，SDN-1编辑得到改善。简而言之，使用农杆菌属菌株LBA4404 THY-转化由两个近交亲本系杂交得到的玉蜀黍F1杂交体的未成熟胚(参见美国专利8,334,429，其通过引用以其整体并入本文)。转化使用农杆菌属混合物进行，如先前所述(参见美国专利公开20210062203，其通过引用以其整体并入本文)。利用含有RV020636质粒(SEQ ID NO：151)的农杆菌属菌株进行转化以获得具有来自“性状”质粒的整合T-DNA的单拷贝的转基因植物，其中每个质粒包含ZM-ODP2变体(SEQ ID NO：1和5-10)(见表15)。具体地，用包含90％的具有“性状”质粒的农杆菌属菌株和10％的RV020636质粒(v/v)的混合物进行转化。
表15.
在每个胚共感染后，响应于RV020636质粒活性活化体细胞胚发生，并且如实例3中所述培养体细胞胚(包括染色体加倍步骤)，诸如使植物细胞与浓度为约0.1至约1.0g/ml的秋水仙碱接触持续24小时，然后转移至缺乏染色体加倍处理的静息培养基(605J)中。替代性地，染色体加倍步骤在稍后进行，例如使用浸根法。
大约6-10天后，任何增殖组织和体细胞胚被解剖和传代培养，其中解剖组织的每一部分被转移到成熟培养基(289Q)中，在26℃-28℃在黑暗条件下进行体外培养。约6-10天后，将传代培养的组织转移到26℃的光培养室中，直到长出具有良好根的健康小植株。大约7-14天后，将小植株转移到含有盆栽土壤的平地中并在生长室中生长1周，随后小植株在温室中再生长1-2周，然后移植到盆中的土壤中并在温室条件下生长。
为鉴别具有由“性状”质粒提供的稳定整合的T-DNA并且缺乏RV020636质粒的T-DNA的T0植物，对每株植物的叶组织取样并且使用PCR诊断方法进行评估。选择缺乏RV020636质粒序列(其为表15中的性状质粒的单拷贝)的植物，其中每株植物包含独特的事件。
使选择的T0植物生长至成熟并且用作与来自玉蜀黍近交系的花粉受精的穗供体，该玉蜀黍近交系为例如具有野生型马铃薯糖蛋白样磷脂酶A2基因的近交系的非单倍体诱导物。特别地，本公开的方法使用表达标记基因(诸如GUS、PMI、PAT、GFP、CFP、B1、C1、R-nj和/或提供花青素色素活性的基因)的非单倍体诱导物。例如，将表达青色荧光蛋白(CFP)报告基因的非单倍体诱导物系用于本文所公开的方法中。因此，基于来自父本CFP的标记基因的不存在对单倍体胚(CFP阴性胚)进行评分，以测量响应于由“性状”T-DNA提供给未受精卵细胞的孤雌生殖基因活性的母本单倍体诱导。对于每个事件，单倍体诱导水平通过将CFP阴性胚的数量除以每个事件取样的胚总数来计算。每个构建体的平均单倍体诱导是所有事件的平均单倍体诱导水平。
与使用质粒RV034409(见表15性状对照SEQ ID NO：137)获得的基因编辑的双单倍体植物相比，预计具有“性状”质粒(见表15性状测试7-12，SEQ ID NO：138-143)的植物将具有改善的经基因编辑的双单倍体植物的频率。
B.Crispr/Cas9介导的双单倍体基因靶向的改善方法
Cas9介导的SDN-3方法诱导DNA中的双链断裂，并且伴随含有基因或其他遗传物质序列的模板。然后，细胞的自然修复过程利用该模板修复断裂，从而引入遗传物质。为展示这种Cas9介导的SDN-3方法，使用PHP97131(SEQ ID NO：144)、RC000019(SEQ ID NO：145)、RC000020(SEQ ID NO：146)、RC000021(SEQ ID NO：147)、RC000022(使用SEQ ID NO：148)、RC000023(SEQ ID NO：149)、RC000024(SEQ ID NO：150)质粒，其包含以下组分：具有编码全长ZM-ODP2蛋白(SEQ ID NO：144)的多核苷酸或编码ZM-ODP2蛋白变体((SEQ ID NO：145)、(SEQ ID NO：146)、(SEQ ID NO：147)、(SEQ ID NO：148)、(SEQ ID NO：149)或(SEQ ID NO：150))的多核苷酸的单倍体诱导表达盒，其可操作地连接到“PvEC1启动子”(SEQ ID NO：34)；可操作地连接到ZM-EXP31554启动子的SV40 NLS-Cas9-VIRD2融合蛋白；可操作地连接到玉蜀黍RNA聚合酶III启动子序列上的gRNA表达盒，其是产生玉蜀黍染色体1靶位点的双链断裂所需的；可操作地连接到组成型启动子的DsRED荧光蛋白；可操作地连接到“PvEC1启动子”(SEQ ID NO：34)的玉蜀黍优化的Cre重组酶蛋白；以及具有编码新霉素磷酸转移酶II(nptII)可选择性标记基因的多核苷酸的基因靶向供体模板，该多核苷酸可操作地连接到侧翼是同源臂的组成型启动子(ZmUBI PRO)。LoxP位点侧接于上述表达盒，以允许间插多核苷酸的CRE介导的切除。
质粒PHP97131在单倍体孤雌生殖期间提供Cas9活性，以在1号染色体靶位点处产生双链断裂，然后通过同源介导的修复(HDR)对ZmUBI PRO：：NPTII：PIN II终止子进行同源重组，从而赋予卡那霉素耐受性。对每个胚每个事件的DsRED表达或其不存在进行评分，以评估Cre介导的切除频率。在体外对卡那霉素耐受性进行阳性选择以评估基因靶向频率。先前使用质粒PHP97131的结果表明，多达1.4％的植物具有HDR介导的两个侧接连接位点中至少一个的修复的证据。
预计使用含有ZM-ODP2变体的质粒((SEQ ID NO：145)、(SEQ ID NO：146)、(SEQ IDNO：147)、(SEQ ID NO：148)、(SEQ ID NO：149)或(SEQ ID NO：150))改善HDR介导的修复，能够与SDN3基因组修饰组分组合以赋予改善的单倍体孤雌生殖。简而言之，使用农杆菌属菌株LBA4404 THY-转化由两个近交亲本系杂交得到的玉蜀黍F1杂交体的未成熟胚(参见美国专利8,334,429，其通过引用以其整体并入本文)。转化使用农杆菌属混合物进行，如先前所述(参见美国专利公开号2021/0062203，其通过引用以其整体并入本文)。利用含有RV020636质粒(SEQ ID NO：151)的农杆菌属菌株进行转化以获得具有来自“性状”质粒的整合T-DNA的单拷贝的转基因植物，其中每个质粒包含ZM-ODP2全长或变体(SEQ ID NO：1(全长)和SEQ ID NO：5-10ZM-ODP2变体)(见表16)。具体地，用包含90％的具有“性状”质粒((SEQ ID NO：144)、(SEQ ID NO：145)、(SEQ ID NO：146)、(SEQ ID NO：147)、(SEQ ID NO：148)、(SEQ ID NO：149)或(SEQ ID NO：150))的农杆菌属菌株和10％的RV020636质粒(SEQID NO：151)(v/v)的混合物进行转化。
表16.
预计很少(如果有的话)植物将具有来自RV020636质粒的T-DNA。使具有来自赋予同时单倍体诱导、基因组修饰和Cre介导的切除能力的“性状”质粒(见表16)的T-DNA单拷贝的植物生长至成熟。
用作穗供体(母本)的F1/T0植物用来自玉蜀黍近交系(其为含有CFP颜色标记的非单倍体诱导物系)的花粉受精。受精后大约14-18天，收获含有未成熟胚的供体穗，并且收集未成熟胚。鉴于不存在父本CFP颜色标记，将评分为CFP阴性的胚解释为母本单倍体胚。将同时呈DsRED阴性的CFP阴性胚解释为具有基因组修饰表达盒的卵细胞表达，选择并培养这些CFP阴性胚，并且将再生的小植株移植到土壤中。
对叶材料进行取样，分离DNA并且将其用于分子分析方法中。进行对跨接合点的PCR扩增的诊断分析，以测量供体模板的HDR介导的基因插入。
预计与由全长ZM-ODP2与SDN3基因组修饰组分组合表达的HDR介导的修复相比，使用与SDN3基因组修饰组分组合表达的ZM-ODP2变体将改善HDR介导的修复。
实例9：使用ZM-ODP2变异体和遗传染色体加倍以获得体内母本双单倍体的改善方法
预计通过使用质粒RV035609(SEQ ID NO：112)向卵细胞提供ZM-ODP2-(266-669)变体(缺乏终止密码子)和编码周期蛋白δ-2样蛋白(SEQ ID NO：111)的周期蛋白基因dpzm07g031470.1.1(在本文中称为Dz470(SEQ ID NO：110))的组合活性，将进一步改善同时单倍体孤雌生殖和遗传染色体加倍的水平。
单倍体诱导物系的单倍体诱导特征的同时活性与遗传染色体加倍活性相结合的益处有很多。这些益处包括但不限于：消除1)进行需要种植供体植物和单倍体诱导物植物的单倍体诱导杂交，2)在进行单倍体诱导杂交后监测胚发育，3)基于胚发育及时收获所述单倍体诱导杂交的供体穗，4)从所述供体穗中分离胚(通常是耗时费力且繁琐的过程)，5)使分离的胚与化学染色体加倍剂接触(该过程可能造成暴露于哺乳动物细胞的安全性和健康问题)，6)避免处理后的胚与所述化学染色体加倍剂接触，7)从二倍体胚中鉴别和分选单倍体，8)转移选定的单倍体胚以在体外继续组织培养繁殖，9)从所述组织培养步骤再生小植株，10)硬化小植株，11)移植所述硬化小植株，以及12)在每个步骤中可能发生的导致发育受损的负面影响，以及更重要的是所述双单倍体植物的能育性的受损。本文所公开的方法对后勤具有积极影响，从而节省成本，并且通过减少整个过程中单倍体胚的损耗，为使用双单倍体技术的育种计划提供生产力提升。因此，本文所公开的方法以相对较少的后勤支持、降低的成本和减少的损耗提供双单倍体植物。
A.使用dz470提高获得体内二倍化母本双单倍体的方法的生产力
如实例3和4中所述，获得衍生自育种杂交(诸如双亲本杂交)的F1胚并用实验对照质粒RV035609(SEQ ID NO：112，见表2)进行转化。RV035609质粒含有多顺反子表达盒。在本文所公开的方法中使用的实验质粒(RX000001、RX000002、RX000003、RX000004、RX000005和RX000006)示于表17中。每个质粒包含编码替代性ZM-ODP2肽的多顺反子表达盒，其中显示各ZM-ODP2肽赋予改善的单倍体孤雌生殖，如实例4中所示。
表17.
当非单倍体诱导物系用作花粉供体时，在用质粒RV035609(SEQ ID NO：112)转化的T0事件中观察到的母本单倍体诱导水平表现出18.2％的母本单倍体诱导频率，并且在母本单倍体胚样本中，观察到那些胚中的18％也表现出体内染色体加倍。
预计通过向植物细胞提供来自表达ZM-ODP2变体肽和周期蛋白Dz470肽活性的单倍体诱导物系的花粉，以提供仅含有母本染色体的体内二倍化(2n)胚，可同时改善单倍体孤雌生殖和体内染色体加倍频率。例如，单倍体诱导杂交(其中T0穗的丝用来自任何单倍体诱导物植物(诸如Stock 6、RWK、RWS、UH400、AX5707RS和NP2222-matl，或任何单倍体诱导物系)的花粉粒授粉，预计与使用质粒RV035609(SEQ ID NO：112)所表现出的结果相比，表17中所示的质粒将改善获得仅含有母本染色体的二倍化(2n)胚的生产力和频率。
B.使用周期蛋白D家族成员蛋白改善获得体内二倍化母本双单倍体的生产力
预计周期蛋白家族成员可用作Dz470蛋白的替代物，用于本文所公开的方法中的遗传染色体加倍，以获得在体内响应于ZM-ODP2肽和Dz470肽的同时活性已经二倍化的母本胚。可用于本文所公开的方法中的周期蛋白家族成员是那些能够连接生长和细胞周期控制的周期蛋白，诸如D型周期蛋白。例如，D型周期蛋白是与Dz470(一种周期蛋白δ-2蛋白)具有同源性的家族成员。预计与表17中所示质粒相似的那些质粒将提供已经在体内二倍化的母本胚，其中表18中所示的周期蛋白家族成员替代Dz470，同时提供在本文所公开的方法中使用的ZM-ODP2肽和周期蛋白基因家族成员的活性。
此外，预计本文所公开的遗传染色体加倍方法(其中周期蛋白基因，诸如Dz470，或替代性地周期蛋白基因家族成员，或优选它们的组合)将提高使用任何单倍体诱导物系从单倍体诱导杂交产生的母本双单倍体胚的频率。与非转基因植物相比，预计本文所公开的使用替代周期蛋白的体内遗传染色体加倍方法将提高转基因T1植物中双单倍体的频率。
表18.
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C.使用体外组织培养获得双单倍体植物
将可用于本文所公开的方法中的T-DNA质粒元件切除，以提供在后续世代中具有正常二倍体种子的植物。例如，将赋予遗传染色体加倍性状的T-DNA以组织偏好方式切除，优选以组织特异性方式切除，且更优选地在已向植物细胞提供遗传染色体加倍活性后以组织特异性方式切除，从而消除化学染色体加倍的需要。用作对照的第一质粒，在本文中称为质粒“Dz470control”(SEQ ID NO：152)，含有以下特征元件：PV-EGG CELL PRO(TR1)：：PINII TERM；并且第二质粒，在本文称为质粒“Dz470experimental”(SEQ ID NO：153)，含有具有以下特征元件的表达盒：PV-EGG CELL PRO(TR1)：：ZM-CYCD2：：PINII TERM，将其分别转化为任何目的近交系或杂交体。将含有所需表达盒的转基因T0植物再生并且通过qPCR分析进行筛选，以鉴别各质粒的单拷贝、半合子单个植物。使选择的植物生长，并且将其用作单倍体诱导杂交中的穗丝供体。
转基因穗供体具有三个表达盒，其赋予1)单倍体诱导、2)遗传染色体加倍和3)CRE介导的使用侧接所有三个表达盒的loxP位点的切除。在抽丝前将转基因T0植物的穗进行芽套袋，以避免任何外来花粉污染。将T0穗的穗丝用来自单倍体诱导物植物(诸如Stock 6、RWK、RWS、UH400、AX5707RS和NP2222-matl，或任何单倍体诱导物系)的花粉粒授粉。在授粉后大约3-24天(理想情况下大约15天)收获未成熟的穗。将穗在30％漂白剂加上0.5％微量洗涤剂中表面消毒20分钟，并且用无菌水冲洗三次。
分离所有胚，并且基于来自父本诱导物系的花青素的表达的不存在来鉴别单倍体胚。鉴别体内二倍体胚，并且将其与单倍体胚分离，例如，通过使用流式细胞术倍性分析方法来实现。对双单倍体母本胚进行基因分型和选择，例如，通过使用基于遗传标记数据的预测性选择算法来估计基因组估计育种值。预计此类用于预测性选择的方法可通过减少对不希望的基因型进行表型分析的需要来提高育种计划的效率。在将取样的小植株移植到土壤之前进行基于种群的选择，从而降低生成育种种群的成本。
将单倍体玉米胚置于光照培养室中的植物再生培养基上。大约12-18天后，将小植株转移到含有盆栽土壤的平地上，并且在温室中生长2周，然后转移到盆中并生长至成熟。这些植物通过自花授粉以产生T2种子。
D.从成熟种子中获得母本双单倍体胚
本文所公开的方法提高了产生和鉴别由单倍体诱导杂交所得到的成熟种子的效率。预计生成的母本胚为体内二倍化(2n)胚，其随后产生具有正常有性生殖模式的子代。在另一方面，本文所公开的方法如上所述进行，其中供体植物具有用来自单倍体诱导物系的花粉授粉的供体穗，使其生长至成熟以获得种子。恢复成熟种子不需要上述胚补救步骤或后续的组织培养过程。
如实例4中所述，通过父本基因组消除获得胚。使用包含编码周期蛋白基因、报告基因和可用于定点重组技术的基因产物的多核苷酸的表达盒。例如，编码Dz470基因的异源多核苷酸、荧光蛋白和用于切除的重组酶，其中编码这些组分的DNA序列侧接有编码位点特异性重组酶的识别位点的DNA序列。使用与可操作地连接到赋予组成型表达的调节元件、或优选可操作地连接到赋予种子优选表达的调节元件、或更优选可操作地连接到赋予胚优选表达的调节元件的荧光蛋白(报告基因)。预计鉴别包含由母本衍生的双单倍体胚的种子，该胚具有缺乏报告基因(荧光蛋白)活性的切除的T-DNA以及由单倍体诱导物花粉供体提供的报告基因活性。
实例10：在植物细胞中使用灭活的Cas蛋白的靶向孤雌生殖因子调节来获得母体单倍体的方法
本实例10描述了使用包含Cas内切核酸酶的翻译融合蛋白进行靶向孤雌生殖因子调节的方法。具体地，将RNA指导的CRISPR-Cas系统用于与编码靶序列的DNA杂交，从而改变至少一种基因产物的表达。可用于本文所公开的方法中的靶序列包括但不限于形态发育基因和/或孤雌生殖因子，诸如实例6中所述的那些。RNA指导的CRISPR-Cas系统包括异源蛋白的设计，这些异源蛋白包含简并的、也称为灭活的Cas蛋白(dCas)，其用作与调节结构域(例如用于改变靶位点的表达的转录活化物结构域、转录阻遏子结构域和/或染色质修饰结构域)融合的识别结构域。
A.使用灭活的Cas蛋白在植物细胞中活化ZM-ODP2
使用指导RNA(gRNA)将dCas9融合蛋白募集到编码至少一个含有AP2的转录因子(并且优先ZM-ODP2基因)的内源基因座。一旦将核糖核苷酸复合物募集到靶基因座，通过改变至少一种基因产物的表达(包括但不限于组蛋白修饰的翻译后修饰)来实现单倍体孤雌生殖，这些翻译后修饰包括但不限于：(a)去除与阻遏基因表达相关的组蛋白修饰，(b)建立与促进基因表达相关的组蛋白修饰，和/或(c)募集与表达基因相关的转录机器。本公开的方法通过向卵细胞提供上述活性中的一者以活化孤雌生殖来改善玉蜀黍母本双单倍体技术。
包含含有染色质修饰结构域(包括组蛋白去甲基化酶结构域)的dCas9翻译融合蛋白的异源蛋白，特别是赋予组蛋白去甲基化酶催化活性的赖氨酸去甲基化酶的Jumanji(JMJ)家族，本文称为dCAS9-JMJ融合蛋白，可用于本文所公开的方法中。包含与组蛋白乙酰转移酶(HAT)结构域(包括但不限于以下结构域，其特征为一般控制非阻遏(Gcn5)相关的N-乙酰转移酶(GNAT)结构域、MYST结构域、和/或B型催化亚基结构域，其中每个都赋予组蛋白乙酰转移酶催化活性)融合的灭活的Cas9(dCas9)蛋白的异源蛋白(本文中称为dCas9-HAT融合蛋白)也可用于本文所公开的方法中。可用于dCas翻译融合蛋白的染色质调节结构域的示例性序列显示在表19中。
表19.
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可用于本文所公开的方法中dCas9表达盒示于表20中，这些表达盒用于活化孤雌生殖母本单倍体诱导，其含有可操作地连接到PvEC1启动子的表19中所示的染色质修饰结构域。
表20.
优选地，使用包含dCas-α(dCasα)翻译融合蛋白的异源蛋白质，例如，其中Cas内切核酸酶是如表21中所示的Casα内切核酸酶。
表21.
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表21中所示的Cas内切核酸酶可包含Cas蛋白的修饰形式。Cas蛋白的修饰形式包括降低Cas蛋白的天然存在的核酸酶活性的氨基酸改变(例如，缺失、插入或取代)。例如，在一些情况下，Cas蛋白的修饰形式具有低于50％、低于40％、低于30％、低于20％、低于10％、低于5％、或低于1％的相应的野生型Cas多肽的核酸酶活性。在某些情况下，Cas蛋白的修饰形式没有实质的核酸酶活性，被称为催化“失活的Cas”或“简并的Cas”或“灭活的Cas(dCas)”。“失活的”Cas、或“简并的”或“灭活的”Cas包括灭活的Cas内切核酸酶(dCas)。灭活的Cas内切核酸酶(dCas)可以与指导RNA一起用于本文所公开的方法中，以靶向特定的DNA靶位点。
将催化失活的Cas效应蛋白与包含调节结构域的异源序列融合，从而产生促进细胞重编程以用于单倍体孤雌生殖诱导的翻译融合蛋白。例如，可用于细胞重编程的融合蛋白包括但不限于包含基因活化结构域和/或如表19所示的染色质修饰结构域的融合蛋白，其中调节结构域提供诱导或修饰(调节)基因调控和/或诱导或修饰(调节)基因组靶位点的基因染色质重塑活性。
预计通过向未受精的卵细胞提供含有靶向ZM-ODP2的gRNA的dCas核糖核苷酸复合物将改善单倍体孤雌生殖。孤雌生殖通过改变(调节)ZM-ODP2的表达(包括但不限于组蛋白修饰的翻译后修饰)来实现，这些翻译后修饰包括但不限于：(a)去除与阻遏基因表达相关的组蛋白修饰，(b)建立与促进基因表达相关的组蛋白修饰，和/或(c)募集与表达基因相关的转录机器。本公开的方法通过向卵细胞提供上述活性中的一者以活化单倍体孤雌生殖来改善玉蜀黍母本双单倍体技术。
B.使用灭活的Casα蛋白在植物细胞中组遏孤雌生殖因子蛋白
本文公开了克服植物细胞阻遏单倍体孤雌生殖的方法。一种此类增加单倍体孤雌生殖的方法通过抑制ZM-ODP2蛋白活性的阻遏子(诸如实例6和7中所示的孤雌生殖因子)来实现。编码用于抑制ZM-ODP2蛋白活性的蛋白质的遗传基因座可用作本文所公开的方法中的基因组靶位点。
使用包含Cas内切核酸酶的翻译融合蛋白进行靶向基因阻遏的方法可用于本文所公开的方法中。优选地，具有催化失活的Casα肽(诸如表21中所示的肽)翻译融合蛋白融合至包含调节结构域的异源序列，其中融合蛋白在基因组靶位点阻遏编码抑制所用的ZM-ODP2蛋白活性的基因产物的基因。可用于本文所公开的方法中的阻遏子结构域示于表22中。
表22.
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本文所公开了用于改善母本单倍体诱导的表达盒，该表达盒含有编码dCas-α翻译融合蛋白的多核苷酸，该dCas-α翻译融合蛋白可操作地连接到卵细胞表达启动子以活化单倍体孤雌生殖。构建了用于诱导单倍体孤雌生殖的质粒，这些质粒包含编码dCas-α阻遏子翻译融合蛋白的多核苷酸序列。此类有用的质粒的实例包括但不限于实例4中所述的质粒，其中多核苷酸编码ZM-ODP2蛋白。提供了含有编码dCas-α阻遏子翻译融合蛋白的多核苷酸的示例性表达盒，该表达盒包含灭活的假定II类CRISPR/Cas内切核酸酶，该内切核酸酶具有引入以消除切割活性的D228A突变，去除用于C末端核定位信号的终止密码子并且融合至玉蜀黍Dr1相关协阻遏子样1序列(SEQ ID NO：550)。如实例4中所述评估单倍体孤雌生殖。
其他阻遏子可用于本文所公开的方法中。此类融合蛋白被设计为编码两个或更多此类阻遏子结构域。含有不同Cas肽、优选表22中所示的任何替代Cas-α肽的融合蛋白可用于本文所公开的方法中。在本文所公开的方法中使用设计用于将融合蛋白募集到编码基因产物的基因组靶位点的gRNA分子，这些基因产物的作用是抑制ZM-ODP2蛋白活性。预计使用本文所公开的方法将发生增加的单倍体孤雌生殖。例如，预计含有玉蜀黍Dr1相关协阻遏子样1序列的融合蛋白是一种阻遏子，该阻遏子与转录因子II D(TFIID)复合物的TATA结合蛋白(TBP)相互作用，以通过阻碍转录因子II A(TFIIA)和/或转录因子II B(TFIIB)进入预起始复合物，防止形成活性转录复合物。如实例6和/或实例7中所述，与至少一种孤雌生殖因子的至少一个基因组靶位点具有同源性的gRNAa可用于本文所公开的方法中。
C.使用组合灭活的Cas蛋白在植物细胞中用联合孤雌生殖因子阻遏来改善单倍体孤雌生殖
预计使用包括同时活化编码ZM-ODP2肽的基因组靶位点和阻遏至少一个编码用于抑制ZM-ODP2蛋白活性的基因产物的基因组靶位点的方法将实现改善的单倍体孤雌生殖。
上文提供了多种Cas肽，其各自具有不同的PAM位点，从而实现使用为此目的设计的gRNA以同源依赖性方式募集提供给细胞的两种或更多种灭活的Cas蛋白的方法。所需靶位点的DNA序列使用PAM位点进行设计，这些PAM位点对应于各融合蛋白的所需dCas识别结构域及其所需的基因调控作用。通过在一个细胞中结合两种以上的dCas融合蛋白活性，实现编码Zm-ODP2基因产物的基因组靶位点的活化，同时阻遏编码Zm-ODP2蛋白活性的阻遏子(诸如实例7中所示的孤雌生殖因子)的基因组靶位点。
孤雌生殖母本单倍体胚的发育不需要双受精，但胚乳的正常发育需要单受精。本文公开了需要不涉及父本遗传的授粉的母本单倍体诱导的假受精法(图2)。使用实例4中所述的方法检测孤雌生殖单倍体胚。
预计与使用本实例10中上述单独A部分或单独B部分中所公开的方法获得的结果相比，当将本文所述的此类组合dCas融合蛋白活性提供给植物细胞、特别是雌配子体(诸如卵细胞)时，此类组合活性将改善单倍体孤雌生殖。
D.使用Zm-ODP2蛋白活性的突变阻遏子改善单倍体孤雌生殖
将编码ZM-ODP2肽的基因组靶位点的活化和至少一个编码用于抑制ZM-ODP2蛋白活性的基因产物的基因组靶位点的阻遏同时提供给母本细胞，该母本细胞在至少一个编码可抑制单倍体孤雌生殖的基因产物的基因座中具有突变。如上所述，孤雌生殖母本单倍体胚的发育不需要双受精，但胚乳的正常发育需要单受精。本文公开了需要不涉及父本遗传的授粉的母本单倍体诱导的假受精法(图2)。
多种方法可用于获得具有基因突变的植物。优选地，该方法使用可编程的核酸酶以赋予靶位点特异性突变，例如使用CRISPR-Cas核酸酶来实现。更优选地，本文所公开的方法使用功能活性的Cas核酸酶，例如表22中所示的Casα，其中将Casα蛋白募集到编码抑制单倍体孤雌生殖的基因产物的基因组靶位点。将Cas内切核酸酶与指导RNA一起使用，以靶向特定的DNA靶位点，从而有可能获得在向母本细胞(诸如卵细胞)提供ZM-ODP2蛋白活性之前、期间或之后抑制单倍体孤雌生殖的基因中具有突变的植物。
预计与缺乏此类突变的细胞相比，当向此类具有突变的细胞提供ZM-ODP2蛋白活性时，本文所公开的方法将提供改善的单倍体孤雌生殖。进一步，预计本文所公开的方法将在更广泛的遗传背景下改善单倍体孤雌生殖。例如，在实例4中显示，即使在转化中使用相同的质粒(遗传构建体)，单倍体孤雌生殖在第一育种杂交与第二育种杂交之间是不同的。这些表型差异可能是由于此类抑制ZM-ODP2蛋白活性的阻遏子的水平不同所致。预计表现出较低水平的单倍体诱导的基因型具有相应较高活性的至少一种此类抑制单倍体孤雌生殖的阻遏蛋白。因此，预计使用本文所公开的方法将改善单倍体孤雌生殖，特别是当应用于表现出较低水平的单倍体孤雌生殖的遗传背景时。
实例11：使用调节单倍体孤雌生殖的单倍体诱导杂交获得母本单倍体的方法
本文公开了使用包含Cas内切核酸酶的翻译融合蛋白调节孤雌生殖因子活性的方法，其中将孤雌生殖因子活性的调节效应通过父本基因组(特别是雄配子体，诸如花粉细胞)提供给母本细胞(特别是雌配子体，诸如卵细胞)。更特别地，父本基因组为单倍体诱导物系，诸如Stock 6、RWK、RWS、UH400、AX5707RS和NP2222-matl，或使用实例3中所述的方法转化的任何单倍体诱导物系。将转化的单倍体诱导物系用于花粉介导的至少一种蛋白质的递送，该至少一种蛋白质在母本细胞中起到调节基因调控的作用。
调节母本细胞中单倍体孤雌生殖的方法包括使用由父本染色质提供的RNA指导的CRISPR-Cas系统与编码母本或父本染色质上的靶序列的DNA杂交，从而在受精时精子细胞核提供给卵细胞时改变至少一种基因产物的表达。使用在雄配子体中有活性的调节元件实现花粉介导的至少一种蛋白质的递送以调节母本细胞中的基因调控，该调节元件为例如赋予花粉表达的调节元件(其在受精时向卵细胞提供表达的蛋白质)、或在卵细胞与花粉细胞融合(同配)之后但在父本基因组消除发生之前提供表达的蛋白质的胚调节元件。示例性序列包括但不限于表23中所示的调节元件。
表23.
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本文所公开的方法可使用任何上述调节元件、或任何另外的调节元件，本文不试图描述其所有可能的排列或组合。还应当理解，使用不同调节元件的不同表达盒改变由任何给定调节元件所赋予的基因表达的持续时间、强度和时空控制。此类结果可用于调节单倍体孤雌生殖。
调节母本细胞中孤雌生殖因子活性的方法使用翻译融合蛋白，该翻译融合蛋白优先含有Cas内切核酸酶。特别地，包含以下的构建体可用于本文所公开的方法中：第一表达盒，其编码能够靶向一个或多个基因组靶位点以用于上调(增加基因活性)的第一翻译融合蛋白；以及第二表达盒，其编码能够靶向一个或多个基因组靶位点以用于下调(降低基因活性)的第二翻译融合蛋白。预计每个相应的翻译融合蛋白将识别相互排斥的前间隔序列邻近基序(PAM)序列。本文中的PAM是指与由指导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统识别的(靶向的)靶序列(前间区)邻近的短核苷酸序列。因此，通过gRNA设计、目的基因组位点的PAM序列、以及各种Cas核酸酶的PAM识别要求，实现对每个翻译融合蛋白的精确靶向。
翻译融合蛋白可用于本文所公开的方法中，该翻译融合蛋白含有识别结构域，该识别结构域具有不切割其被引导至的靶位点的简并的、也称为灭活的Cas蛋白(dCas)。可用于本文所公开的方法中的Cas核酸酶示于表21中。预计dCas识别结构域与指导RNA形成功能复合物，该指导RNA与基因组靶位点处的DNA序列共享同源性。与被募集并结合至靶位点的指导多核苷酸形成功能复合物的dCas翻译融合体影响在基因组靶位点处编码的基因座的基因调控状态，其取决于每个相应的融合蛋白的调节结构域的调节活性。
可用于本文所公开的方法中的调节结构域包括但不限于编码转录激活因子结构域、转录阻遏子结构域和/或可用于改变在靶位点处表达的染色质修饰结构域的肽。可用于赋予增加的基因活性的示例性结构域示于表19中。可用于赋予降低的基因活性的示例性结构域示于表22中。
构建具有以下多核苷酸的质粒，该多核苷酸含有：第一表达盒，其编码能够靶向一个或多个基因组靶位点以用于上调(增加基因活性)的第一翻译融合蛋白；以及第二表达盒，其编码能够靶向一个或多个基因组靶位点以用于下调(降低基因活性)的第二翻译融合蛋白。翻译融合蛋白含有识别结构域，例如使用表21中所示的Cas肽的灭活的Casα蛋白(dCasα)，其融合至基因活化结构域(例如表19中所示的那些)，或融合至基因阻遏结构域(例如表22中所示的那些)。各表达盒可操作地连接到预计影响母本单倍体孤雌生殖的调节元件，例如使用如表23中所示的启动子。本文不试图描述此类表达盒的所有可能的组合。预计这两个表达盒的组合活性同时实现植物细胞(优选雌配子细胞，诸如卵细胞)中基因表达的改变。具体地，卵细胞内此类改变的基因表达靶向一组将要上调的基因座和第二组将要下调的基因座，从而导致改善的单倍体孤雌生殖。
编码用于靶向上调的基因产物的示例性基因组基因座包括编码形态发育基因和胚发生因子的基因座。例如，编码WUS/WOX同源盒多肽或Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽或其组合的形态发生基因。在一方面，编码WUS/WOX同源盒多肽的形态发生基因为WUS1、WUS2、WUS3、WOX2A、WOX4、WOX5和WOX9蛋白。在另一方面，编码Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽的形态发生基因为Babyboom(BBM1)、BBM2、BMN2和BMN3或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽。
编码可用于在雌配子(诸如卵细胞)中上调的其他形态发生基因的另外的基因座包括但不限于：LEC1、LEC2、KN1/STM、MONOPTEROS-DELTA的同源物、拟南芥属SERK基因的同源物、拟南芥属AGL15基因的同源物、或FUSCA基因的同源物。编码用于靶向基因阻遏的基因产物的示例性基因组基因座包括编码形态发育基因的阻遏子的基因座。例如，作为干细胞信号通路组分的阻遏靶位点(例如CLV3及其物种特异性蛋白，抑制WUSCHEL的C2H2型锌指蛋白，如KNUCKLES阻遏蛋白，以及MADS-盒转录因子，如AGAMOUS或物种特异性AGAMOUS样直系同源物)可用于本文所公开的方法中。阻遏靶位点包括但不限于编码多梳组(PcG)蛋白或其亚基(作用是阻遏编码形态发育基因和/或胚发生因子的基因组基因座的表达)的基因组基因座。作为E(z)(Zeste的增强子)家族成员的阻遏靶位点，诸如多梳阻遏复合物2(PRC2)的EZH1和EZH2，或任何具有组蛋白甲基转移酶活性并且对组蛋白H3(在本文中称为“H3K37me3”)的Lys 9(K9)和Lys 27(K27)具有特异性的蛋白质，也可用于本文所公开的方法中。
可用于本文所公开的方法中的另外的阻遏靶位点包括但不限于编码CHD3染色质重塑因子或其亚基(作用是阻遏编码形态发育基因和/或胚发生因子的基因组基因座的表达)的基因组基因座包括但不限于PICKLE基因的同源物。
鉴于实例7的结果，其中与单独ZM-ODP2变体8肽变体的活性相比，响应于ZM-ODP2变体8肽和孤雌生殖因子肽的共表达所观察到的单倍体孤雌生殖减少，还预计编码Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)的形态发生基因的组合上调与编码孤雌生殖因子的基因的阻遏相结合，可用于本文所公开的方法中。例如，表13中所示的基因的阻遏。
设计和/或获得具有以下多核苷酸的质粒，该多核苷酸含有：第一表达盒，其编码能够靶向一个或多个基因组靶位点以用于上调(增加基因活性)的第一翻译融合蛋白；和第二表达盒，其编码能够靶向一个或多个基因组靶位点以用于下调(降低基因活性)的第二翻译融合蛋白；以及第三表达，其含有以下多核苷酸，该多核苷酸含有至少一种设计用于活化一个基因组靶位点的gRNA和至少一种设计用于阻遏第二基因组靶点的gRNA，其中所需的基因活化和阻遏模式遵循如上所述的示例性靶位点。本文不试图描述所有此类可能的质粒组合。
预计用于改善单倍体孤雌生殖的方法通过向雌配子体(诸如卵细胞)提供基因活性的组合来实现，该基因活性的组合包括对可用于单倍体孤雌生殖的基因的上调以及同时对抑制单倍体孤雌生殖的基因的下调。特别有趣的是防止抑制Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)活性的方法。例如，通过阻遏减少单倍体孤雌生殖的蛋白质的表达来实现，诸如表14中所示的结果。
预计提供给雌配子体的该活性由父本染色质提供，本文使用具有单倍体诱导表型的父本基因组，该单倍体诱导表型用含有如上所述三个表达盒的多核苷酸稳定转化。重要的是，预计在父本消除之前将所述活性提供给卵细胞。
在受精并且dCas核糖核苷酸复合物募集到靶基因座后，通过改变至少一种基因产物的表达(包括但不限于组蛋白修饰的翻译后修饰)来实现调节单倍体孤雌生殖的方法，这些翻译后修饰包括但不限于：(a)去除与阻遏基因表达相关的组蛋白修饰，(b)建立与促进基因表达相关的组蛋白修饰，(c)募集与表达基因相关的转录机器，和/或(d)抑制与表达基因相关的转录机器。
实例12：使用孤雌生殖和改变细胞周期调节来单倍体诱导杂交获得母本双单倍体的方法
本文公开了通过向母本细胞提供单倍体诱导杂交组合遗传染色体加倍和调节孤雌生殖活性来生产母本双单倍体植物的方法。这些组合方法进一步改善了获自单倍体诱导杂交的体内母本双单倍体的频率。使用实例11中所述的方法，其中使用dCas翻译融合蛋白的组合来改变母本细胞(诸如卵细胞)内的基因调节来改善单倍体孤雌生殖，以及实例10的方法，其中使用遗传染色体加倍方法实现从单倍体诱导杂交体内获得母本双单倍体的频率，改善母本双单倍体的回收。使用体外技术将此类母本双单倍体分离为未成熟胚，或如实例10所述从成熟种子中分离为成熟胚。
使用单倍体诱导物系，诸如Stock 6、RWK、RWS、UH400、AX5707RS和NP2222-matl，或使用实例3中所述的方法转化的任何单倍体诱导物系，进行单倍体诱导杂交。将转化的单倍体诱导物系用于花粉介导的性状构建体的递送，该性状构建体含有调节单倍体孤雌生殖的表达盒与赋予遗传染色体加倍的表达盒的组合，其中加倍的单倍体群体以简化的后勤、降低的成本和提高的安全性产生。
实例13：使用父本指导RNA分子获得经基因组修饰的母本单倍体的方法
本公开的方法包括整合单倍体孤雌生殖、基因组修饰和遗传染色体加倍方法，以改善来自非单倍体诱导杂交的体内母本双单倍体的频率。
A.使用非单倍体诱导物父本植株获得母本基因组修饰
使用来自非单倍体诱导物玉蜀黍近交系的花粉，例如具有野生型马铃薯糖蛋白样磷脂酶A2基因的玉蜀黍品系，其用编码至少一种指导RNA分子的性状构建体转化。使用实例3和8中所述的方法获得此类花粉供体。如实例8中所述，预计本文用作花粉供体的品系具有报告基因活性，诸如CFP颜色标记。
将选择的具有单倍体孤雌生殖、遗传染色体加倍和基因组修饰核酸酶性状盒的T0母本植物用作穗供体。使雌株如实例4中所述生长并且将其用作穗供体，将穗供体用来自用编码至少一种gRNA的表达盒转化的非单倍体诱导物玉蜀黍近交系的花粉受精。受精后，预计花粉提供的gRNA由母本表达的基因编辑核酸酶使用，从而修饰母本胚的基因组，该母本胚的基因组也被提供体内单倍体孤雌生殖和染色体加倍活性。
受精后大约14-18天，收获含有未成熟胚的供体穗，并且收集未成熟胚用于体外组织培养。由于缺乏父本CFP颜色标记，母本单倍体胚呈CFP阴性。替代性地，使种子生长至成熟，收获，然后选择具有经基因组修饰的母本双单倍体胚的CFP阴性种子。
从取样的叶子材料中分离出的DNA用于分子分析方法中。将PCR扩增基因组靶位点的诊断测定用于测量基因组修饰频率，并且用于基因分型目的。选择具有所需基因突变的经基因组修饰的母本双单倍体胚。
创建两个或更多个父本系以用作花粉供体。每个相应的父本系优选地用编码一组独特的gRNA分子的多核苷酸转化，以获得具有独特的基因组修饰组的经基因组修饰的母本双单倍体胚。将具有单倍体孤雌生殖、遗传染色体加倍和基因组修饰核酸酶性状盒的第一选择的T0母本植株用来自具有第一组gRNA的父本系的花粉进行受精，并且将具有单倍体孤雌生殖、遗传染色体加倍和基因组修饰核酸酶性状盒的第二选择的T0母本植株用来自具有第二组gRNA的父本系的花粉进行受精。子代获自第一杂交和第二杂交。来自第一杂交的子代具有第一组基因组修饰，而来自第二杂交的子代具有第二组基因组修饰。使相应的子代生长，并且将其用于植物育种工作。例如，在育种计划中，将此类子代杂交以产生第一代(F1)杂交体，其中基因组修饰中的每一组均在杂合条件下存在。获得从杂种植物获得的种子，使其生长，并且针对基因组修饰的等位基因的最佳组合的遗传，对子代进行遗传评估。替代性地，针对影响表型变异的基因组修饰的等位基因的最佳组合，对子代进行表型评估。优选地，使用检测基因组修饰以及表型变异的诊断测定来评估子代。
B.使用单倍体诱导父本植株获得母本基因组修饰
使用来自单倍体诱导物玉蜀黍近交系(例如，具有马铃薯糖蛋白样磷脂酶A2基因功能丧失的玉米品系)的花粉。将单倍体诱导物系用编码至少一种指导RNA分子的性状构建体转化。使用实例3和8中所述的方法获得此类花粉供体。如实例8中所述，预计本文用作花粉供体的品系将具有报告基因活性，并且将此类活性用于分别基于父本报告基因活性的存在和不存在来检测单倍体和二倍体胚。
预计在实践本实例13的A部分中所公开的方法时(其中花粉供体为单倍体诱导物系)，将获得经基因组修饰的母本单倍体胚，例如，作为未成熟单倍体胚或作为成熟种子获得(如上所述)。进一步，用编码至少一种指导RNA分子的性状构建体转化的单倍体诱导物系也包含实例10的方面，其中单倍体诱导物父本基因组提供遗传染色体加倍性状和至少一种可用于编辑靶位点的gRNA两者。使用本文所公开的方法获得经体内基因组修饰的双单倍体母本胚。
C.经基因组修饰的母本双单倍体的育种效用
使用本文所公开的方法通过在母本细胞内提供组合的经调节的孤雌生殖、遗传染色体加倍和核酸酶活性来获得母本双单倍体植物，其中核酸酶活性可由父本细胞提供的至少一种gRNA来编程。此外，预计用于多重编辑的方法将通过获得两个或更多个此类父本系来实现，其中各父本系向母本细胞提供一种或多种独特的gRNA分子。预计随后将衍生自此类交叉遗传相应靶向突变的子代用于植物育种工作。例如，当前的方法可用于杂交子代以产生新的子代群体，该子代群体分割由第一和第二花粉供体提供的累积突变。预计该植物育种方法将加速遗传发现和表征工作的各个方面，特别适用于多基因的数量性状，即由许多基因和基因相互作用控制的表型性状。
实例14：使用单倍体诱导来递送一种或多种指导RNA多核苷酸
在本实例中，利用单倍体诱导将一种或多种指导RNA多核苷酸递送至植物细胞中以用于基因组编辑应用。在植物细胞的一个实例中，使用玉蜀黍细胞。在一种方法中，递送一种或多种指导RNA的单倍体诱导物系不包括预整合的RNA指导的酶，诸如CRISPR-Cas多肽(例如，在不存在由单倍体诱导物雄配子递送的CRISPR-Cas多核苷酸的情况下也提供指导RNA)。在一种方法中，多重gRNA由单倍体诱导物系递送，其中一种或多种多核苷酸提供转录单位，用于转录若干指导RNA，这些指导RNA专门选择用于靶向基因组中的多个靶位点。
在一种方法中，将带有一个或多个转录指导RNA(gRNA)的DNA表达盒的第一玉蜀黍植株用于对第二植株进行授粉，该第二植株用编码gRNA结合蛋白(GBP)的DNA表达盒稳定转化，该gRNA结合蛋白与其gRNA复合时能够结合DNA靶位点、形成缺口或将其切割。在一种情况下，第一植株包含父本单倍体诱导物系，诸如Stock 6(Liu等人(2017)Mol.Plant.[分子植物]10，520-522)、RWK、RWS、UH400、AX5707RS和NP2222-matl，或任何单倍体诱导物系和第二株非单倍体诱导玉蜀黍植物。在另一种情况下，第一植株包含非单倍体诱导植物，并且第二植株为母本单倍体诱导植物，例如但不限于表达baby boom(bbm)基因的植物。授粉后，接下来将来自雄配子的gRNA递送至表达GBP的卵细胞。任选地，第二植株无需含有稳定转化的GBP，但是编码GBP的多核苷酸可以在单倍体诱导过程期间、期间或之后在体外外源递送。当组合时，gRNA和GBP形成能够引入靶向DNA编辑的复合物。这些靶向DNA编辑可由在靶标处或附近的DNA插入、缺失、单核苷酸多态性、倒置和/或交叉组成。在一些情况下，诱导的变化可为表观遗传，其导致DNA甲基化和/或组蛋白乙酰化、磷酸化或甲基化状态发生变化。然后选择经过单倍体诱导的后代，确保稳定表达的gRNA表达盒不会转移到后续世代，并且仅恢复母本DNA编辑。如果需要，可通过将所得单倍体植株与表达下一轮gRNA的另一植株进行授粉，对母本基因组进行另外的编辑。通过这种方式，最终可将多个编辑堆叠到单个植株中。一旦编辑完成，通过用编码Cre-Lox重组酶和/或一种或多种靶向用于无痕切除的转基因表达盒的gRNA的植物授粉，将编码GBP和任选的Bbm蛋白的转基因表达盒从母本基因组中移除。然后选择不含转基因的单倍体植株并且进行自花授粉以修复编辑结果。在另一种情况下，分离出转基因表达盒。
实例15：用于生产无融合生殖植物的方法
无融合生殖是无性生殖，得到与亲本在遗传上相同的子代(图2)。本文所公开的方法用于获得具有抑制或突变的基因产物的无融合生殖植物，这些基因产物诱导有丝分裂而不是减数分裂，即所谓的“MiMe”表型。通过消除重组和/或配对，抑制或突变有效减数分裂重组所必需的蛋白质，从而诱导MiMe表型。对于玉蜀黍，提供Spo11、Rec8、OSD1-1A和OSDl-3A的多核苷酸和相关多肽以抑制其表达水平或活性的方法。
本公开的方法使用此类表达盒进行转化以获得fie(不依赖能育性的胚乳)-空遗传背景，以促进从头胚发育和未经受精的胚乳发育两者。此外，如上所述将实例4中所示的变体ODP2 DNA序列中任一个递送至纯合子合子-胚致死基因型中，其中仅从体细胞珠心组织产生的不定胚在种子中发育。使用这些方法在没有花粉的情况下获得无融合生殖种子，以获得不减数配子(未减数孢子生殖)。
通过向能够产生不减数配子的植物细胞提供实例4中所述的蛋白质活性来获得无融合生殖种子，其中显示变体ODP2肽相对于天然Zm-ODP2肽能够改善单倍体孤雌生殖。还通过向能够产生不减数配子的植物细胞提供实例10中所述的蛋白质活性来获得无融合生殖种子，其中至少一种变体ODP2肽在至少一种孤雌生殖因子受到阻遏的细胞中共表达。预计与仅使用天然ZM-ODP2肽的方法相比，无性生殖得到改善。
A.使用经调节的单倍体孤雌生殖与赋予未减数孢子生殖遗传突变结合获得无融合生殖
本文所公开的方法可用于通过向植物细胞提供基因编辑性状以产生MiMe基因型来获得赋予未减数孢子生殖的基因突变，例如，三个基因中的突变的组合：SPO11-1、REC8和OSD1。SPO11-1功能的丧失将消除减数分裂重组。REC8功能的丧失导致姊妹染色单体在第一次减数分裂时分离，而不是同源染色体的分布。OSD1功能的丧失导致跳过第二次减数分裂。
本公开的方法使用基因编辑性状，该基因编辑性状包含编码CRISPR-Cas9基因编辑多核苷酸的第一表达盒和编码与MiMe基因具有序列同源性的gRNA分子的第二表达盒。预计MiMe基因靶位点处的突变将消除减数分裂重组。替代性地，本公开的方法使用基因编辑性状，该基因编辑性状包含编码Casα基因编辑多核苷酸的第一表达盒和编码与MiMe基因具有序列同源性的gRNA分子的第二表达盒。表21中描述的Casα内切核酸酶可用于本公开的方法中。预计MiMe基因靶位点处的突变提供了获得不减数配子的方法。
从相对于其内源性Spo11、Rec8、OSD1-1A和OSD1-3A具有抑制的活性的玉蜀黍植物产生和获得种子具有挑战性。例如，通常将Spo11和Rec8杂合子杂交以生成具有Spo11和Rec8纯合子基因敲除的子代，因为玉蜀黍中Spo11和Rec8的纯合子功能丧失突变体分别是雄性和雌性不育的，并且不能杂交以获得和维持所需的双纯合子突变体。在本实例中，用含有可用于获得MiMe基因型的第一性状盒和可用于调节孤雌生殖的第二性状盒的构建体转化杂种植物胚。优选地，转化的胚包含第一子代(F1)杂交基因组，其中转化的植物产生作为克隆植物诸如克隆F1杂交植物生殖的不减数胚。预计当结合调节单倍体孤雌生殖的方法时，从该植物产生的种子产生相对于亲本植物为不减数、非重组和克隆的子代。
预计各种调节元件可用于本公开的方法中使用的Cas核酸酶表达盒。在一方面，预计在转化植物的孢子体生长期间的组成型Cas核酸酶表达将在减数分裂孢子发生之前产生MiMe基因型。组成型Cas核酸酶表达通过将Cas核酸酶可操作地连接到任何组成型启动子来实现。优选地，Cas核酸酶可操作地连接到组织偏好的调节元件、或化学诱导的调节元件、或配子特异性调节元件。
在本公开的方法中，将gRNA优先设计为与编码其内源性Spo11、Rec8、OSD1-1A和OSD1-3A基因的每个基因组靶位点具有序列同源性。优先地，将gRNA设计为靶向等位基因特异性靶区域。预计各MiMe基因的每个等位基因都是基因突变的靶标。
本文所公开了通过使用基因编辑性状使编码Spo11、Rec8、OSD1-1A和OSD1-3的基因产物的基因座突变以抑制它们的表达水平或活性，来产生具有MiMe基因型的无融合生殖种子的方法。该方法还使用第二性状盒来调节单倍体孤雌生殖，例如使用实例4和10中所示的方法，其中含有调节孤雌生殖的多核苷酸的表达盒可操作地连接到作用于具有MiMe表型的植物细胞的调节元件。优选地，调节孤雌生殖的表达盒可操作地连接到组织特异性启动子，包括在减数分裂期间起作用的启动子。预计具有MiMe表型的植物细胞将产生频率增加的不减数胚，以响应于在未减数孢子生殖之前、期间和/或之后具有经调节的PF活性。
在一方面，向内珠被或珠心提供植物表达盒，包括但不限于用于调节孤雌生殖的单子叶植物或双子叶植物表达盒。例如，使用大麦Nucl启动子(SEQ ID NO：551)调节孤雌生殖的表达盒可用于本公开的方法中。预计带有该表达盒的转基因植物将从头产生胚。在玉蜀黍的情况下，通过对穗授粉以促进正常中央细胞受精和胚乳发育来补充这一点。
预计当具有MiMe表型的细胞是也具有经调节的PF的二倍体(2n)时，通过使用基因编辑诱导MiMe基因型将获得无融合生殖种子。
在对发育中的胚进行显微镜检查后，显然已经发生了无性生殖，例如，表现为在没有受精的情况下存在胚发育。对获自无融合生殖种子的植物进行遗传分析后，显然已经发生了无融合生殖，例如，表现为存在与第一子代(F1)(杂交体)基因组的遗传组成一致的全基因组杂合等位基因。
B.使用经调节的单倍体孤雌生殖结合阻遏赋予减数分裂的基因获得无融合生殖
如本文别处所述，使用基因突变实现获得MiMe表型的方法。此外，还描述了阻遏编码抑制异位ZM-ODP2活性的基因产物的基因座的基因活性的方法。此外，还描述了使用dCas阻遏子融合蛋白实现的阻遏方法。本文公开了抑制或阻遏具有编码Spo11、Rec8、OSD1-1A和OSDl-3的基因产物以抑制其表达水平或活性的MiMe表型基因座以及编码用作ZM-ODP2活性的阻遏子的基因产物(诸如实例7中所述的基因产物)的基因座的植物细胞的方法。具体地，本文公开了一种抑制或阻遏编码Spo11、Rec8、OSD1-1A和OSDl-3基因产物以抑制其表达水平或活性的基因座以及编码用作ZM-ODP2活性的阻遏子的基因产物的基因座，同时向具有MiMe表型的植物细胞提供ZM-ODP2肽活性的方法。优选地，ZM-ODP2肽是赋予改善的孤雌生殖的变体ZM-ODP2肽，如实例4中所示。
在本公开的方法中，用于获得克隆植物、优选第一子代(F1)杂种植物的无融合生殖种子通过转化由用来自第二植株(父本)的花粉对提供供体穗(母本)的第一植株受精得到的未成熟胚来实现。优选地，两个亲本系可各自为表现出可用于产生无融合生殖、克隆杂交体种子的最佳表型性能的近交系品种。从受精的供体穗收集未成熟胚，并且将其用于如实例3中所述的转化。预计转化的F1杂种植物对于T-DNA构建体是半合子的，该构建体具有含有编码dCas-阻遏子融合蛋白的多核苷酸的第一表达盒、含有编码一种或多种gRNA分子的多核苷酸的第二表达盒、以及含有编码ZM-ODP2肽(诸如表现出改善的孤雌生殖的变体ODP2肽(参见实例4))的多核苷酸的第三表达盒。
含有编码dCas-阻遏子融合蛋白的多核苷酸的第一表达盒使用实例10中所述的方法，例如其中阻遏子蛋白包含灭活的Cas-α肽作为与阻遏子结构域融合的识别结构域的方法。阻遏子结构域可包含任何阻遏子结构域。优选地，该方法使用包含至少一个如表22所示的阻遏子结构域的融合肽。
预计实例10中所述的方法仅在表达dCas阻遏子融合蛋白时才阻遏基因组靶位点处的基因表达。此外，预计一旦dCas阻遏子融合蛋白不再存在，基因组靶位点的基因表达将变成去阻遏的。本文公开了在dCas阻遏子融合蛋白不再具有活性并且存在于经处理的植物细胞内之后建立能够阻遏基因组靶位点处的基因表达的染色质修饰的阻遏子结构域。例如，编码染色质修饰结构域的阻遏子结构域可用于本文所公开的方法中，该染色质修饰结构域包含具有固有的组蛋白甲基转移酶(HMT)活性的SET结构域蛋白(“SET”首字母缩写词衍生自“Su(var)3-9，Enhancer-of-zeste and Trithorax”蛋白)。
在赖氨酸上甲基化组蛋白的SET结构域蛋白甲基转移酶超家族具有七个主要的SET结构域蛋白家族，包括SUV39、SET1、SET2、E(z)、RIZ、SMYD和SUV4-20家族。SET结构域蛋白将甲基基团从S-腺苷-L-甲硫氨酸(AdoMet)转移至组蛋白上赖氨酸残基的氨基基团，从而在基因组靶位点处的染色质上建立甲基化赖氨酸残基，其中发生募集和结合SET结构域甲基转移酶复合物。特异性组蛋白赖氨酸残基的组蛋白甲基化是一种直接或间接影响基因表达的翻译后表观遗传修饰。作为后者的一个实例，通过建立可用于募集指导染色质的组织的另外的复合物的染色质修饰。
作为E(z)(Zeste的增强子)家族成员的肽，诸如EZH1和EZH2。Zeste的增强子[E(z)]是一种多梳组转录阻遏子，并且含SET结构域的蛋白质家族的创始成员中的一者可用于本文所公开的方法中。多梳阻遏复合物2(PRC2)具有HMT活性，该HMT活性对组蛋白H3Lys9(K9)和Lys 27(K27)具有特异性(在本文中称为“H3K37me3”)。H3K27me3修饰与细胞类型特异性基因的基因阻遏相关。PRC2的HMT活性取决于E(z)蛋白中的完整SET结构域，dCas阻遏子融合结构域含有本文使用的SET结构域以抑制或阻遏编码Spo11、Rec8、OSD1-1A和OSDl-3基因产物的基因座并且在本文所公开的方法中用于抑制或阻遏编码用作ZM-ODP2活性的阻遏子的基因产物的基因座。
在本实例中，使用实例3的方法使用含有T-DNA构建体的质粒转化F1杂种植物的胚，该T-DNA构建体具有第一表达盒，该第一表达盒含有编码dCas阻遏子融合蛋白的多核苷酸。阻遏子结构域含有编码肽的多核苷酸，该肽具有赋予HMT活性的SET结构域。优选地，阻遏子结构域包含含Zeste[E(z)]SET结构域的蛋白质的增强子，如表24中所示。
表24.
提供了示例性表达盒，其中编码dCas-α10识别结构域的多核苷酸融合至核定位信号(VirD2 NLS)，该核定位信号融合至Mez1调节结构域(见表24)。该表达盒可操作地连接到大孢子发生特异性调节元件，诸如珠心启动子。例如，使用HV-NUC1C PRO-V1(SEQ ID NO：551)以获得可用于优选在大孢子发生之前和/或期间阻遏赋予减数分裂的基因的表达盒，以赋予编码dCas-α10：Mez1融合蛋白(SEQ ID NO：553；编码SEQ ID NO：554)的无融合生殖性状表达盒(SEQ ID NO：552)作为示例性dCas-PRC2融合蛋白。可用于本文所公开的方法中的另外的含E(z)-SET结构域的肽示于表24中。进一步，此类表达盒可包含另外的相关、保守的SET结构域序列，这些序列包含至少一个N末端前SET结构域、至少一个C末端后SET结构域、或其组合。
第二表达盒含有编码一种或多种gRNA分子的多核苷酸，所述一种或多种gRNA分子与编码Spo11、Rec8、OSD1-1A和OSD1-3的基因产物的基因座具有序列同源性。编码与实例7中所述的基因产物的基因座具有序列同源性的一种或多种gRNA分子的多核苷酸可用于本文所公开的方法中。该方法向植物细胞(诸如具有MiMe表型的植物细胞)改善的单倍体孤雌生殖表型。预计将dCas-PRC2融合蛋白的活性提供给植物细胞以抑制孢子发生和配子发生期间的减数分裂并且抑制Zm-ODP2活性的阻遏子，从而基因座被HMT活性抑制，该HMT活性由dCas-PRC2融合蛋白赋予，该融合蛋白在基因组靶位点处建立H3K27me3基因阻遏。
第三表达盒含有编码ZM-ODP2肽诸如表现出改善的孤雌生殖的变体ODP2肽(见实例4)的多核苷酸。此外，第三表达盒能够向具有MiMe表型的细胞提供改善的单倍体孤雌生殖表型，该改善的单倍体孤雌生殖表型是由于在编码用作ZM-ODP2活性的阻遏子的基因产物的基因座处建立了阻遏性H3K27me3修饰。本文所公开的方法使用在减数分裂期间有活性的调节元件，诸如来自在减数分裂期间表达的基因的调节元件。例如，Spo11、Rec8、OSD1-1A或OSDl-3基因座的玉蜀黍启动子可用于本文所公开的方法中。本文提供的示例性启动子为ZM-OSDL1 PRO-V1(SEQ ID NO：555)。
与上文本实例15的A部分中所公开的方法相比，此处无融合生殖通过使用调节的单倍体孤雌生殖结合对赋予减数分裂的基因的阻遏来实现，其中赋予减数分裂的基因未经遗传改变。与上文A部分的方法相比，预计向具有MiMe表型的细胞提供减数分裂的同时抑制、阻抑ZM-ODP2活性的基因的抑制、以及同时ZM-ODP2活性，将改善方法以获得用于获得克隆植物及其克隆种子的克隆、不减数、非重组胚。
实例16：鉴别和选择无融合生殖种子的方法
在大多数类型的无融合生殖中，假受精，即极核受精以产生胚乳，是种子活力所必需的。因此，使用实例11中所示的方法获得的无融合生殖种子的成熟使用中央细胞的单次受精以获得三倍体胚乳。三倍体胚乳通过提供养分、保护无融合生殖胚并且通过在种子发育和发芽期间中用作机械屏障来控制胚生长，以支持无融合生殖种子的胚生长。
使用花粉对中央细胞进行单次受精以获得三倍体胚乳可优选地包括使用具有父本形态标记基因的花粉供体植物以促进无融合生殖种子的鉴别，以将其与作为有性生殖的结果获得的种子区分开来。由无性生殖得到的无融合生殖种子将缺乏父本形态标记基因产物，而由有性生殖得到的种子将表达父本形态标记基因产物。
父本形态标记可包含荧光报告基因表达构建体，诸如绿色、黄色或红色荧光报告基因，该荧光报告基因表达构建体允许在种子和/或花青素基因的等位基因(诸如R1等位基因)中进行荧光检测，从而允许目视花青素检测。替代性地，由显性功能性C1等位基因(具体地，野生型功能性有色(C1)等位基因)赋予的籽粒中的花青素色素沉着也可用于本公开的方法中。此类标记基因允许分别基于父本标记基因产物的存在或不存在来鉴别有性和无性种子。
在本公开的方法中，基于父本标记基因产物的存在或不存在来鉴别有性和无性种子，用于从有性生殖所得到的种子中选择无融合生殖种子。预计分类和选择使用手动和/或自动化方法完成。用于种子分选的自动化方法，例如，使用机器视觉或其他机器学习使选择过程自动化的自动种子分选方法，可用于本公开的方法中。
实例17：使用用于假受精的雌性不育雄性近交系生产无融合生殖种子的方法
使用实例11所述的方法生产无融合生殖种子，并且使用具有形态标记和赋予雌性不育表型的突变的父本花粉供体系如实例12所述进行选择。
植物发育受胚发生期间形成的芽尖分生组织和根尖分生组织的活性调节，因此分生组织的维持和调节对于正常的胚后发育和生长至关重要。在玉蜀黍从营养期到生殖期的转变期间，营养芽尖分生组织将其命运改变为花序分生组织，然后进一步发育为包含分枝分生组织和小穗分生组织的特化分生组织。赋予分生组织形成缺陷的突变导致雌性不育，理想情况下为完全不育花序，可用于本公开的方法中。例如，由于不育花序2(bif2)基因(为拟南芥属丝氨酸-苏氨酸激酶PINOID的玉蜀黍直系同源物)的功能丧失造成花序的腋生分生组织未能启动而导致的雌性不育表型可用于本公开的方法中。此外，由空秆1基因(其编码玉蜀黍中所有气生侧生分生组织启动所需的非经典基本螺旋-环-螺旋蛋白)导致的雌性不育表型可用于本公开的方法中。其他赋予雌性不育性的突变可用于本公开的方法中。
本公开的方法通过获得对于实例12中所述的父本形态标记基因以及雌性不育表型(例如包括但不限于在本实例17中所述的突变)纯合的花粉供体亲本来进行。使用假受精生产无融合生殖种子，其中由供体穗(母本)的单次受精产生的三倍体胚乳不与由花粉供体(父本)植物的雌花所产生的种子混合。
预计获得此类具有雌性不育表型的父本形态标记纯合花粉供体是获自突变的孟德尔分离，该突变赋予来自对于雌性不育基因型为杂合的祖细胞的雌性不育表型。优选地，使用保持系保存杂合雌性不育基因型祖细胞。通过用含有编码突变基因的功能基因产物的多核苷酸的互补构建体转化具有雌性不育突变体基因型的雄性近交系来获得保持系。预计将维持对于雌性不育基因型为杂合的祖种子并且用于产生更多雌性不育基因型分离种子。
任选地，该方法的变体可包括使用对恢复雌性不育性的构建体独特的标记基因。例如，此类系统可包括用于检测含有互补构建体的种子的荧光颜色标记。预计具有雌性不育基因型的纯合突变种子将因此缺乏互补构建体所特有的标记基因，从而提供一种方法来鉴别、选择和分类对于具有雌性不育表型的父本形态标记为纯合的种子与来自含有互补构建体的种子。

Claims (155)

1.一种生产双单倍体植物的方法，所述方法包括：
a)向植物细胞提供表达盒，所述表达盒包含：
i)孤雌生殖形态发育基因；和
ii)可操作地连接到卵细胞启动子的孤雌生殖因子；
b)再生含有所述表达盒的T0植物；
c)用花粉对所述T0植物进行授粉：
d)从所述T0植物的孤雌生殖母本配子体获得单倍体胚；以及
e)从所述单倍体胚再生单倍体植物。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述表达盒进一步包含：
iii)可操作地连接到卵细胞启动子的遗传染色体加倍剂，
其中仅具有母本染色体的所述孤雌生殖母本配子体为二倍化的；
f)从二倍化的孤雌生殖母本配子体获得二倍体胚；以及
g)从所述二倍体胚再生双单倍体植物。
3.如权利要求1所述的方法，其进一步包括：
h)使所述单倍体胚与染色体加倍剂接触，持续足以生成双单倍体胚的时间段；以及
i)从所述双单倍体胚再生双单倍体植物。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述染色体加倍剂选自表1。
5.如权利要求1所述的方法，其进一步包括：
k)使所述单倍体植物与染色体加倍剂接触，持续足以生成双单倍体植物的时间段。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述染色体加倍剂选自表1。
7.如权利要求1或2所述的方法，其中所述表达盒进一步包含：
iv)调节所述孤雌生殖形态发育基因、所述孤雌生殖因子、或所述孤雌生殖形态发育基因和所述孤雌生殖因子两者、和/或孤雌生殖的内源性阻遏子的表达以提供所述T0植物的母本孤雌生殖配子体的工具。
8.如权利要求1、2或7中任一项所述的方法，其中所述表达盒进一步包含：
v)可操作地连接到胚发生启动子的CRE重组酶，
其中所述表达盒侧翼为loxP识别位点并且其中所述表达盒被切除。
9.如权利要求1、2、7或8中任一项所述的方法，其中所述孤雌生殖形态发育基因包含编码Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽的核苷酸序列。
10.如权利要求9所述的方法，其中编码所述Babyboom(BBM)多肽的所述核苷酸序列选自由BBM、BBM2、BMN2和BMN3组成的组，或所述胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽是ODP2。
11.如权利要求1、2、7或8中任一项所述的方法，其中所述孤雌生殖形态发育基因选自：
a)编码选自SEQ ID NO：11-20、162或164中的任一者的Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽的核苷酸序列；或
b)编码与SEQ ID NO：11-20、162或164中的任一者具有至少95％序列同一性的Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽的核苷酸序列；或
c)编码与SEQ ID NO：11-20、162或164中的任一者具有至少85％序列同一性的Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽的核苷酸序列。
12.如权利要求1、2、7或8中任一项所述的方法，其中所述孤雌生殖因子选自表13。
13.如权利要求1、2、7或8中任一项所述的方法，其中调节所述孤雌生殖形态发育基因、所述孤雌生殖因子、或所述孤雌生殖形态发育基因和所述孤雌生殖因子两者、和/或孤雌生殖的所述内源性阻遏子的表达的所述工具是对所述孤雌生殖形态发育基因、所述孤雌生殖因子、或所述孤雌生殖形态发育基因和所述孤雌生殖因子两者、和/或孤雌生殖的所述内源性阻遏子的表达进行修饰、控制或稳定的翻译融合蛋白，其中所述翻译融合蛋白上调和/或下调所述孤雌生殖形态发育基因、所述孤雌生殖因子、或所述孤雌生殖形态发育基因和所述孤雌生殖因子两者、和/或孤雌生殖的所述内源性阻遏子的表达。
14.如权利要求1、2、7或8中任一项所述的方法，其中所述花粉来自单倍体诱导物或非单倍体诱导物。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述单倍体诱导物或所述非单倍体诱导物包含标记基因。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述标记基因选自选择性标记、报告基因、可见内源性形态标记及其组合。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述选择性标记选自由以下组成的组：GUS、PMI、PAT及其组合。
18.如权利要求16所述的方法，其中所述报告基因选自由以下组成的组：GFP、RFP、CFP及其组合。
19.如权利要求16所述的方法，其中所述可见内源性形态标记选自由以下组成的组：B1、R-nj、R1-scm、花青素色素及其组合。
20.如权利要求15所述的方法，其中从所述二倍化的孤雌生殖母本配子体获得所述二倍体胚进一步包括从二倍化的孤雌生殖T0植物获得双单倍体胚，其中所述双单倍体胚缺乏所述标记基因。
21.如权利要求15所述的方法，其中从所述二倍化的孤雌生殖母本配子体获得所述二倍体胚进一步包括获得具有缺乏所述标记基因的二倍化母本胚的成熟种子以及使所述成熟种子萌发以获得双单倍体植物。
22.如权利要求2、7或8中任一项所述的方法，其中所述遗传染色体加倍剂包含编码周期蛋白基因家族成员的核苷酸序列。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述周期蛋白基因家族成员选自表18或为Dz470(SEQ ID NO：110)。
24.如权利要求1、2、7或8中任一项所述的方法，其中所述卵细胞启动子选自表11或表12。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述卵细胞启动子进一步包含选自表9的EME。
26.如权利要求24或25所述的方法，其中所述卵细胞启动子进一步包含选自表10的增强子。
27.如权利要求1、2、7或8中任一项所述的方法，其中所述表达盒进一步包含基因组修饰组分。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述基因编辑组分使用DNA修饰酶，所述DNA修饰酶是选自包含以下的组的定点核酸酶：大范围核酸酶(MN)、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活物样效应物核酸酶(TALEN)、Cas9核酸酶、Casα核酸酶、Cpf1核酸酶、dCas9-FokI、dCpf1-FokI、嵌合Cas9-胞苷脱氨酶、嵌合Cas9腺嘌呤脱氨酶、嵌合FEN1-Fok1、Mega-TAL、切口酶Cas9(nCas9)、嵌合dCas9-非-FokI核酸酶、和dCpf1-非-FokI核酸酶。
29.一种生产经基因组编辑的双单倍体植物的方法，所述方法包括：
a)向母本配子体提供表达盒，所述表达盒包含：
i)孤雌生殖形态发育基因；和
ii)可操作地连接到卵细胞启动子的孤雌生殖因子；
b)再生含有所述表达盒的T0植物；
c)用花粉对所述T0植物进行授粉；
d)从所述T0植物的孤雌生殖母本配子体获得单倍体胚；以及
e)从所述单倍体胚再生单倍体植物。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述表达盒进一步包含：
iii)可操作地连接到卵细胞启动子的遗传染色体加倍剂，
其中仅具有母本染色体的所述孤雌生殖母本配子体为二倍化的；
f)从所述二倍化的孤雌生殖母本配子体获得二倍体胚；以及
g)从所述二倍体胚再生双单倍体植物。
31.如权利要求29所述的方法，其进一步包括：
h)使所述单倍体胚与染色体加倍剂接触，持续足以生成双单倍体胚的时间段；以及
i)从所述双单倍体胚再生双单倍体植物。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述染色体加倍剂选自表1。
33.如权利要求29所述的方法，其进一步包括：
k)使所述单倍体植物与染色体加倍剂接触，持续足以生成双单倍体植物的时间段。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述染色体加倍剂选自表1。
35.如权利要求29或30所述的方法，其中所述表达盒进一步包含：
iv)调节所述孤雌生殖形态发育基因、所述孤雌生殖因子、或所述孤雌生殖形态发育基因和所述孤雌生殖因子两者、和/或孤雌生殖的内源性阻遏子的表达以提供所述T0植物的母本孤雌生殖配子体的工具。
36.如权利要求29、30或35中任一项所述的方法，其中所述表达盒进一步包含：
v)基因组修饰组分。
37.如权利要求29、30、35或36中任一项所述的方法，其中所述表达盒进一步包含：
vi)可操作地连接到胚发生启动子的CRE重组酶，
其中所述表达盒侧翼为loxP识别位点并且其中所述表达盒被切除。
38.如权利要求29、30、35、36或37中任一项所述的方法，其中所述孤雌生殖形态发育基因包含编码Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽的核苷酸序列。
39.如权利要求38所述的方法，其中编码所述Babyboom(BBM)多肽的所述核苷酸序列选自由BBM、BBM2、BMN2和BMN3组成的组，或所述胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽是ODP2。
40.如权利要求29、30、35、36或37中任一项所述的方法，其中所述孤雌生殖形态发育基因选自：
a)编码选自SEQ ID NO：11-20、162或164中的任一者的Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽的核苷酸序列；或
b)编码与SEQ ID NO：11-20、162或164中的任一者具有至少95％序列同一性的Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽的核苷酸序列；或
c)编码与SEQ ID NO：11-20、162或164中的任一者具有至少85％序列同一性的Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽的核苷酸序列。
41.如权利要求29、30、35、36或37中任一项所述的方法，其中所述孤雌生殖因子选自表13。
42.如权利要求29、30、35、36或37中任一项所述的方法，其中调节所述孤雌生殖形态发育基因、所述孤雌生殖因子、或所述孤雌生殖形态发育基因和所述孤雌生殖因子两者、和/或孤雌生殖的所述内源性阻遏子的表达的所述工具是对所述孤雌生殖形态发育基因、所述孤雌生殖因子、或所述孤雌生殖形态发育基因和所述孤雌生殖因子两者、和/或孤雌生殖的所述内源性阻遏子的表达进行修饰、控制或稳定的翻译融合蛋白，其中所述翻译融合蛋白上调和/或下调所述孤雌生殖形态发育基因、所述孤雌生殖因子、或所述孤雌生殖形态发育基因和所述孤雌生殖因子两者、和/或孤雌生殖的所述内源性阻遏子的表达。
43.如权利要求29、30、35、36或37中任一项所述的方法，其中所述花粉来自单倍体诱导物或非单倍体诱导物。
44.如权利要求43所述的方法，其中所述单倍体诱导物或所述非单倍体诱导物包含标记基因。
45.如权利要求44所述的方法，其中所述标记基因选自选择性标记、报告基因、可见内源性形态标记及其组合。
46.如权利要求45所述的方法，其中所述选择性标记选自由以下组成的组：GUS、PMI、PAT及其组合。
47.如权利要求45所述的方法，其中所述报告基因选自由以下组成的组：GFP、RFP、CFP及其组合。
48.如权利要求45所述的方法，其中所述可见内源性形态标记选自由以下组成的组：B1、R-nj、R1-scm、花青素色素及其组合。
49.如权利要求44所述的方法，其中从所述二倍化的孤雌生殖母本配子体获得所述二倍体胚进一步包括从二倍化的孤雌生殖T0植物获得双单倍体胚，其中所述双单倍体胚缺乏所述标记基因。
50.如权利要求44所述的方法，其中从所述二倍化的孤雌生殖母本配子体获得所述二倍体胚进一步包括获得具有缺乏所述标记基因的二倍化母本胚的成熟种子以及使所述成熟种子萌发以获得双单倍体植物。
51.如权利要求30、35、36或37中任一项所述的方法，其中所述遗传染色体加倍剂包含编码周期蛋白基因家族成员的核苷酸序列。
52.如权利要求22所述的方法，其中所述周期蛋白基因家族成员选自表18或为Dz470(SEQ ID NO：110)。
53.如权利要求29、30、35、36或37中任一项所述的方法，其中所述卵细胞启动子选自表11或表12。
54.如权利要求53所述的方法，其中所述卵细胞启动子进一步包含选自表9的EME。
55.如权利要求53或54所述的方法，其中所述卵细胞启动子进一步包含选自表10的增强子。
56.如权利要求36或37所述的方法，其中所述基因编辑组分使用DNA修饰酶，所述DNA修饰酶是选自包含以下的组的定点核酸酶：大范围核酸酶(MN)、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活物样效应物核酸酶(TALEN)、Cas9核酸酶、Casa核酸酶、Cpf1核酸酶、dCas9-FokI、dCpf1-FokI、嵌合Cas9-胞苷脱氨酶、嵌合Cas9腺嘌呤脱氨酶、嵌合FEN1-Fok1、Mega-TAL、切口酶Cas9(nCas9)、嵌合dCas9-非-FokI核酸酶、和dCpf1-非-FokI核酸酶。
57.一种生产双单倍体植物的方法，所述方法包括：
a)向植物细胞提供表达盒，所述表达盒包含：
i)可操作地连接到卵细胞启动子的孤雌生殖形态发育基因或孤雌生殖因子；以及
ii)可操作地连接到卵细胞启动子的遗传染色体加倍剂；
b)再生含有所述表达盒的T0植物；其中所述To植物的母本配子体通过所述孤雌生殖形态发育基因或所述孤雌生殖因子而成为孤雌生殖的，以提供母本孤雌生殖配子体，并且其中仅具有母本染色体的所述母本孤雌生殖配子体为二倍化的；
c)用花粉对所述T0植物进行授粉；
d)从所述二倍化的孤雌生殖母本配子体T0植物获得二倍体胚；以及
e)从所述二倍体胚再生双单倍体植物。
58.如权利要求57所述的方法，其中所述表达盒进一步包含：
iii)调节所述孤雌生殖形态发育基因或所述孤雌生殖因子和/或孤雌生殖的内源性阻遏子的表达的工具，
其中使所述母本配子体成为孤雌生殖的。
59.如权利要求57或58所述的方法，其中所述表达盒进一步包含：
iv)可操作地连接到胚发生启动子的CRE重组酶，
其中所述表达盒侧翼为loxP识别位点并且其中所述表达盒被切除。
60.如权利要求57-59中任一项所述的方法，其中所述孤雌生殖形态发育基因包含编码Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽的核苷酸序列。
61.如权利要求60所述的方法，其中编码所述Babyboom(BBM)多肽的所述核苷酸序列选自由BBM、BBM2、BMN2和BMN3组成的组，或所述胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽是ODP2。
62.如权利要求57-59中任一项所述的方法，其中所述孤雌生殖形态发育基因选自：
a)编码选自SEQ ID NO：11-20、162或164中的任一者的Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽的核苷酸序列；或
b)编码与SEQ ID NO：11-20、162或164中的任一者具有至少95％序列同一性的Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽的核苷酸序列；或
c)编码与SEQ ID NO：11-20、162或164中的任一者具有至少85％序列同一性的Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽的核苷酸序列。
63.如权利要求57-59中任一项所述的方法，其中所述孤雌生殖因子选自表13。
64.如权利要求57-59中任一项所述的方法，其中调节所述孤雌生殖形态发育基因或所述孤雌生殖因子和/或孤雌生殖的所述内源性阻遏子的表达的所述工具是对所述孤雌生殖形态发育基因或所述孤雌生殖因子的表达进行修饰、控制或稳定的翻译融合蛋白，其中所述翻译融合蛋白上调和/或下调所述孤雌生殖形态发育基因或所述孤雌生殖因子和/或孤雌生殖的所述内源性阻遏子的表达。
65.如权利要求57-59中任一项所述的方法，其中所述花粉来自单倍体诱导物或非单倍体诱导物。
66.如权利要求65所述的方法，其中所述单倍体诱导物或所述非单倍体诱导物包含标记基因。
67.如权利要求66所述的方法，其中所述标记基因选自选择性标记、报告基因、可见内源性形态标记及其组合。
68.如权利要求67所述的方法，其中所述选择性标记选自由以下组成的组：GUS、PMI、PAT及其组合。
69.如权利要求67所述的方法，其中所述报告基因选自由以下组成的组：GFP、RFP、CFP及其组合。
70.如权利要求67所述的方法，其中所述可见内源性形态标记选自由以下组成的组：B1、R-nj、R1-scm、花青素色素及其组合。
71.如权利要求66所述的方法，其中从所述二倍化的孤雌生殖母本配子体获得所述二倍体胚进一步包括从二倍化的孤雌生殖T0植物获得双单倍体胚，其中所述双单倍体胚缺乏所述标记基因。
72.如权利要求66所述的方法，其中从所述二倍化的孤雌生殖母本配子体获得所述二倍体胚进一步包括获得具有缺乏所述标记基因的二倍化母本胚的成熟种子以及使所述成熟种子萌发以获得双单倍体植物。
73.如权利要求57-59中任一项所述的方法，其中所述遗传染色体加倍剂包含编码周期蛋白基因家族成员的核苷酸序列。
74.如权利要求73所述的方法，其中所述周期蛋白基因家族成员选自表18或为Dz470(SEQ ID NO：110)。
75.如权利要求57-59中任一项所述的方法，其中所述卵细胞启动子选自表11或表12。
76.如权利要求75所述的方法，其中所述卵细胞启动子进一步包含选自表9的EME。
77.如权利要求75或76所述的方法，其中所述卵细胞启动子进一步包含选自表10的增强子。
78.如权利要求57-59中任一项所述的方法，其中所述表达盒进一步包含基因组修饰组分。
79.如权利要求78所述的方法，其中所述基因编辑组分使用DNA修饰酶，所述DNA修饰酶是选自包含以下的组的定点核酸酶：大范围核酸酶(MN)、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活物样效应物核酸酶(TALEN)、Cas9核酸酶、Casα核酸酶、Cpf1核酸酶、dCas9-FokI、dCpf1-FokI、嵌合Cas9-胞苷脱氨酶、嵌合Cas9腺嘌呤脱氨酶、嵌合FEN1-Fok1、Mega-TAL、切口酶Cas9(nCas9)、嵌合dCas9-非-FokI核酸酶、和dCpf1-非-FokI核酸酶。
80.一种生产双单倍体植物的方法，所述方法包括：
a)向植物细胞提供表达盒，所述表达盒包含：
i)孤雌生殖形态发育基因；以及
ii)可操作地连接到卵细胞启动子的翻译融合蛋白；
b)再生含有所述表达盒的T0植物；其中所述To植物的母本配子体通过所述孤雌生殖形态发育基因和/或所述翻译融合蛋白而成为孤雌生殖的，以提供母本孤雌生殖配子体；
c)用花粉对所述T0植物进行授粉；
d)从所述孤雌生殖母本配子体获得单倍体胚；以及
e)从所述单倍体胚再生单倍体植物。
81.如权利要求80所述的方法，其中所述表达盒进一步包含：
iii)可操作地连接到卵细胞启动子的遗传染色体加倍剂，
其中仅具有母本染色体的所述母本孤雌生殖配子体为二倍化的；
f)从所述二倍化的孤雌生殖母本配子体获得二倍体胚；以及
g)从所述二倍体胚再生双单倍体植物。
82.如权利要求80所述的方法，其进一步包括：
h)使所述单倍体胚与染色体加倍剂接触，持续足以生成双单倍体胚的时间段；以及
j)从所述双单倍体胚再生双单倍体植物。
83.如权利要求82所述的方法，其中所述染色体加倍剂选自表1。
84.如权利要求80所述的方法，其进一步包括：
k)使所述单倍体植物与染色体加倍剂接触，持续足以生成双单倍体植物的时间段。
85.如权利要求84所述的方法，其中所述染色体加倍剂选自表1。
86.如权利要求80或81中任一项所述的方法，其中所述表达盒进一步包含：
v)可操作地连接到胚发生启动子的CRE重组酶，
其中所述表达盒侧翼为loxP识别位点并且其中所述表达盒被切除。
87.如权利要求80、81或86中任一项所述的方法，其中所述翻译融合蛋白通过抑制孤雌生殖的内源性阻遏子来调节所述孤雌生殖形态发育基因的表达。
88.如权利要求80、81或86中任一项所述的方法，其中所述孤雌生殖形态发育基因包含编码Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽的核苷酸序列。
89.如权利要求88所述的方法，其中编码所述Babyboom(BBM)多肽的所述核苷酸序列选自由BBM、BBM2、BMN2和BMN3组成的组，或所述胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽是ODP2。
90.如权利要求80、81或86中任一项所述的方法，其中所述孤雌生殖形态发育基因选自：
a)编码选自SEQ ID NO：11-20、162或164中的任一者的Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽的核苷酸序列；或
b)编码与SEQ ID NO：11-20、162或164中的任一者具有至少95％序列同一性的Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽的核苷酸序列；或
c)编码与SEQ ID NO：11-20、162或164中的任一者具有至少85％序列同一性的Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽的核苷酸序列。
91.如权利要求87所述的方法，其中所述孤雌生殖形态发育基因的所述阻遏子选自表13。
92.如权利要求80、81或86中任一项所述的方法，其中所述花粉来自单倍体诱导物或非单倍体诱导物。
93.如权利要求92所述的方法，其中所述单倍体诱导物或所述非单倍体诱导物包含标记基因。
94.如权利要求93所述的方法，其中所述标记基因选自选择性标记、报告基因、可见内源性形态标记及其组合。
95.如权利要求94所述的方法，其中所述选择性标记选自由以下组成的组：GUS、PMI、PAT及其组合。
96.如权利要求94所述的方法，其中所述报告基因选自由以下组成的组：GFP、RFP、CFP及其组合。
97.如权利要求94所述的方法，其中所述可见内源性形态标记选自由以下组成的组：B1、R-nj、R1-scm、花青素色素及其组合。
98.如权利要求93所述的方法，其中从所述二倍化的孤雌生殖母本配子体获得所述二倍体胚进一步包括从二倍化的孤雌生殖T0植物获得双单倍体胚，其中所述双单倍体胚缺乏所述标记基因。
99.如权利要求93所述的方法，其中从所述二倍化的孤雌生殖母本配子体获得所述二倍体胚进一步包括获得具有缺乏所述标记基因的二倍化母本胚的成熟种子以及使所述成熟种子萌发以获得双单倍体植物。
100.如权利要求80、81或86中任一项所述的方法，其中所述遗传染色体加倍剂包含编码周期蛋白基因家族成员的核苷酸序列。
101.如权利要求100所述的方法，其中所述周期蛋白基因家族成员选自表18或为Dz470(SEQ ID NO：110)。
102.如权利要求80、81或86中任一项所述的方法，其中所述卵细胞启动子选自表11或表12。
103.如权利要求102所述的方法，其中所述卵细胞启动子进一步包含选自表9的EME。
104.如权利要求102或102所述的方法，其中所述卵细胞启动子进一步包含选自表10的增强子。
105.如权利要求80、81或86中任一项所述的方法，其中所述表达盒进一步包含基因组修饰组分。
106.如权利要求105所述的方法，其中所述基因编辑组分使用DNA修饰酶，所述DNA修饰酶是选自包含以下的组的定点核酸酶：大范围核酸酶(MN)、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活物样效应物核酸酶(TALEN)、Cas9核酸酶、Casα核酸酶、Cpf1核酸酶、dCas9-FokI、dCpf1-FokI、嵌合Cas9-胞苷脱氨酶、嵌合Cas9腺嘌呤脱氨酶、嵌合FEN1-Fok1、Mega-TAL、切口酶Cas9(nCas9)、嵌合dCas9-非-FokI核酸酶、和dCpf1-非-FokI核酸酶。
107.一种通过单倍体诱导进行基因组编辑的方法，所述方法包括通过单倍体诱导物系提供一个或多个指导RNA，其中所述单倍体诱导物系不包含稳定整合的指导RNA结合蛋白，并且使所述单倍体诱导物系与第二植物杂交以产生单倍体母本细胞，其中所述母本细胞含有所述指导RNA结合蛋白，所述指导RNA结合蛋白能够与所述一个或多个指导RNA形成复合物并且在所述母本细胞的所述基因组中引入一种或多种靶向基因组改变。
108.如权利要求107所述的方法，其中所述单倍体诱导物系和所述第二植物是能够远缘杂交或异型杂交的不同植物物种。
109.如权利要求107所述的方法，其中所述指导RNA结合蛋白是通过体外步骤外源性地提供的。
110.如权利要求107所述的方法，其中所述指导RNA结合蛋白是经通过杂交的稳定整合的植物株系提供的。
111.一种植物细胞，其包含父本提供的指导RNA和由母本衍生的指导RNA结合蛋白，其中所述指导RNA是通过单倍体诱导物系提供的。
112.如权利要求111所述的植物细胞，其通过染色体加倍而加倍。
113.如权利要求111所述的植物细胞，其中将所述指导RNA多重化以靶向所述植物细胞的基因组中的多个位点。
114.一种在没有卵细胞受精的情况下从开花植物中的一个或多个配子体或孢子体细胞产生克隆无融合生殖植物的方法，所述方法包括：
a)用包含编码至少一种孤雌生殖因子的多核苷酸的表达盒转化植物细胞，所述至少一种孤雌生殖因子与表13中所列的至少一种多肽具有至少85％的序列同一性，其中在没有卵细胞受精的情况下为转化的植物细胞的配子体或孢子体细胞提供至少一种孤雌生殖因子多肽的活性；
b)从所述配子体或孢子体细胞发育胚；以及
c)从所述配子体或孢子体细胞衍生出子代植物，其中所述子代植物含有来自所述转化的植物细胞的染色体，从而在没有卵细胞受精的情况下实现开花植物的繁殖。
115.如权利要求114所述的方法，其中所述多核苷酸可操作地连接到能够调节孢子发生组织、内珠被、珠心和/或大孢子母细胞中的基因表达的调节元件。
116.如权利要求114所述的方法，其中所述胚由未减数植物细胞形成。
117.如权利要求116所述的方法，其中所述未减数植物细胞是卵细胞。
118.如权利要求116所述的方法，其中所述未减数植物细胞由体细胞形成。
119.一种在没有卵细胞受精的情况下从开花植物中的一个或多个配子体或孢子体细胞产生克隆无融合生殖植物的方法，所述方法包括：
a)用表达盒转化植物细胞，所述表达盒包含：
i)可操作地连接到孢子发生启动子的编码第一翻译融合蛋白的第一多核苷酸，其中配子体或孢子体细胞通过所述第一翻译融合蛋白对内源性孤雌生殖形态发育基因的调节活性而成为孤雌生殖的；和/或
ii)可操作地连接到孢子发生启动子的编码第二翻译融合蛋白的第二多核苷酸，其中配子体或孢子体细胞通过所述第二翻译融合蛋白对孤雌生殖的内源性阻遏子和/或赋予减数分裂的基因的调节活性而成为孤雌生殖的；
b)再生T0植物，其中所述T0植物提供不减数、非重组配子；
c)在没有卵细胞受精的情况下从所述不减数、非重组配子获得胚；以及
d)从和所述胚获得子代植物。
120.如权利要求119所述的方法，其中所述调节活性包括对所述内源性孤雌生殖形态发育基因、和/或孤雌生殖的所述内源性阻遏子、和/或赋予减数分裂的所述基因的表达进行修饰、控制或稳定，其中所述翻译融合蛋白上调和/或下调所述孤雌生殖形态发育基因、和/或孤雌生殖的所述内源性阻遏子、和/或赋予减数分裂的所述基因的表达。
121.一种生产无融合生殖植物的方法，所述方法包括：
a)用以下转化植物细胞
i.第一表达盒，其包含编码活化孤雌生殖的第一基因产物蛋白的多核苷酸，和
ii第二表达盒，其包含编码第二基因产物的多核苷酸，所述第二基因产物抑制孤雌生殖的阻遏子和/或阻遏减数分裂所需的基因；
b)再生T0植物，其中所述T0植物的大孢子发生提供具有不减数(2n)、非重组基因组的母本配子体，所述母本配子体在大孢子发生期间成为孤雌生殖的；
c)从所述T0植物的所述母本配子体获得孤雌生殖、不减数(2n)、非重组胚；以及
d)从所述胚获得克隆的、不减数(2n)、非重组植物。
122.如权利要求121所述的方法，其中活化孤雌生殖的所述基因产物蛋白包含：
a)ODP2肽；或
b)翻译融合蛋白，其中所述融合蛋白包含：
i)赋予基因组靶位点结合特异性的识别结构域；以及
ii)在基因组靶位点处赋予增加的调节活性的调节结构域。
123.如权利要求121所述的方法，其中编码活化孤雌生殖的第一基因产物蛋白的所述多核苷酸选自：
a)编码选自SEQ ID NO：11-20、162或164中的任一者的Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽的核苷酸序列；或
b)编码与SEQ ID NO：11-20、162或164中的任一者具有至少95％序列同一性的Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽的核苷酸序列；或
c)编码与SEQ ID NO：11-20、162或164中的任一者具有至少85％序列同一性的Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽的核苷酸序列。
124.如权利要求122所述的方法，其中所述翻译融合蛋白具有包含Cas内切核酸酶的识别结构域。
125.如权利要求124所述的方法，其中所述Cas内切核酸酶是选自表21的Cas-α内切核酸酶。
126.如权利要求122所述的方法，其中所述翻译融合蛋白具有包含转录激活因子和/或染色质修饰结构域的调节结构域。
127.如权利要求126所述的方法，其中所述转录激活因子和/或染色质修饰结构域是选自表19的序列。
128.如权利要求121所述的方法，其中所述植物细胞在编码抑制孤雌生殖和/或作为减数分裂所需的基因产物的基因产物的基因座处包含功能丧失。
129.如权利要求121所述的方法，其中包含编码抑制孤雌生殖的阻遏子和/或阻遏减数分裂所需的基因的所述第二基因产物的多核苷酸的所述第二表达盒包含翻译融合蛋白，所述翻译融合蛋白包含：
a)赋予基因组靶位点结合特异性的识别结构域；以及
b)在基因组靶位点处赋予降低的调节活性的调节结构域。
130.如权利要求128所述的方法，其中通过获得在编码选自表13的基因的基因座处的突变来提供在编码孤雌生殖的阻遏子的基因座处的功能丧失。
131.如权利要求128所述的方法，其中通过以下方式提供在编码减数分裂所需的基因产物的基因座处的功能丧失突变：
a)在编码内源性Spo11基因的基因座处的突变；
b)在编码内源性Rec8基因的基因座处的突变；
c)在编码内源性OSD1-1A基因的基因座处的突变；
d)在编码内源性OSD1-3A基因的基因座处的突变；以及
f)前述的组合。
132.如权利要求131所述的方法，其中所述功能丧失突变包括表现出MiMe表型的MiMe基因型。
133.如权利要求129所述的方法，其中所述翻译融合蛋白具有包含Cas内切核酸酶的识别结构域。
134.如权利要求133所述的方法，其中所述Cas内切核酸酶是选自表21的Cas-α内切核酸酶。
135.如权利要求129所述的方法，其中所述翻译融合蛋白具有包含转录阻遏子和/或染色质修饰结构域的调节结构域。
136.如权利要求135所述的方法，其中所述转录阻遏子是选自表22的阻遏子。
137.如权利要求135所述的方法，其中所述染色质修饰结构域含有选自表24的SET结构域。
138.如权利要求121所述的方法，其中将再生的T0植物用来自花粉供体的花粉受精。
139.如权利要求138所述的方法，其中所述花粉供体具有父本标记基因。
140.如权利要求139所述的方法，其中所述父本标记基因选自选择性标记、报告基因、可见内源性形态标记及其组合。
141.如权利要求140所述的方法，其中所述选择性标记选自由以下组成的组：GUS、PMI、PAT及其组合。
142.如权利要求140所述的方法，其中所述报告基因选自由以下组成的组：GFP、RFP、CFP及其组合。
143.如权利要求140所述的方法，其中所述可见内源性形态标记选自由以下组成的组：B1、R-nj、R1-scm、花青素色素及其组合。
144.如权利要求138所述的方法，其中所述孤雌生殖、不减数(2n)、非重组胚缺乏所述标记基因。
145.如权利要求144所述的方法，其中使用以下方法选择所述孤雌生殖、不减数(2n)、非重组胚：
a)手动选择法；
b)自动选择法；以及
c)前述的组合。
146.如权利要求138所述的方法，其中所述花粉具有形态标记。
147.如权利要求138所述的方法，其中所述花粉具有赋予雌性不育表型的突变。
148.一种生产三倍体胚乳的方法，所述方法包括用来自花粉供体的花粉给无融合生殖植物进行授粉。
149.如权利要求148所述的方法，其中所述花粉供体具有父本标记基因。
150.如权利要求149所述的方法，其中所述父本标记基因选自选择性标记、报告基因、可见内源性形态标记及其组合。
151.如权利要求150所述的方法，其中所述选择性标记选自由以下组成的组：GUS、PMI、PAT及其组合。
152.如权利要求150所述的方法，其中所述报告基因选自由以下组成的组：GFP、RFP、CFP及其组合。
153.如权利要求150所述的方法，其中所述可见内源性形态标记选自由以下组成的组：B 1、R-nj、R1-scm、花青素色素及其组合。
154.如权利要求148所述的方法，其中所述花粉具有形态标记。
155.如权利要求148所述的方法，其中所述花粉具有赋予雌性不育表型的突变。
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