CN113557408A - 用于使用基因组编辑产生显性矮株型等位基因的方法和组合物 - Google Patents

用于使用基因组编辑产生显性矮株型等位基因的方法和组合物 Download PDF

Info

Publication number
CN113557408A
CN113557408A CN202080020110.8A CN202080020110A CN113557408A CN 113557408 A CN113557408 A CN 113557408A CN 202080020110 A CN202080020110 A CN 202080020110A CN 113557408 A CN113557408 A CN 113557408A
Authority
CN
China
Prior art keywords
endogenous
oxidase
sequence
locus
plant
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202080020110.8A
Other languages
English (en)
Inventor
S·曼朱纳斯
L·A·赖默奎斯
T·L·斯勒温斯基
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Monsanto Technology LLC
Original Assignee
Monsanto Technology LLC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Monsanto Technology LLC filed Critical Monsanto Technology LLC
Publication of CN113557408A publication Critical patent/CN113557408A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8218—Antisense, co-suppression, viral induced gene silencing [VIGS], post-transcriptional induced gene silencing [PTGS]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8213—Targeted insertion of genes into the plant genome by homologous recombination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8262—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield involving plant development
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8291—Hormone-influenced development
    • C12N15/8297—Gibberellins; GA3
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
    • C12Y114/11—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with 2-oxoglutarate as one donor, and incorporation of one atom each of oxygen into both donors (1.14.11)
    • C12Y114/11012—Gibberellin-44 dioxygenase (1.14.11.12)

Abstract

本公开提供了用于改变玉米或其他谷类植物中的赤霉素(GA)含量的组合物和方法。还提供了用于通过编辑GA20氧化酶基因的特定亚型以将反义序列或区段引入至基因中来改变与赤霉素生物合成相关的基因的表达的方法和组合物。还提供了具有降低一种或多种GA氧化酶基因的表达或活性的显性等位基因的经修饰植物细胞和植物，所述经修饰植物细胞和植物包含降低的赤霉素水平和改善的特征，诸如降低的植物高度和增加的倒伏抗性，但不具有异型。

Description

用于使用基因组编辑产生显性矮株型等位基因的方法和组 合物
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年5月29日提交的美国临时申请第62/854,142号和2019年8月14日提交的美国临时申请第62/886,726号的权益，所述美国临时申请两者均通过引用以它们的整体并入本文。
技术领域
本公开涉及用于通过靶向基因组编辑产生GA氧化酶基因的显性等位基因的方法和组合物。
序列表的并入
含于是79,988字节(在
Figure BDA0003255407500000011
中测量)并于2020年5月28日创建，并且包含36个序列的名为P34745WO00_SL.txt的文件中的序列表以电子方式随同提交，并且通过引用以它的整体并入本文。
背景技术
赤霉素(Gibberellin)(赤霉酸(gibberellic acid)或GA)是调控许多主要植物生长和发育过程的植物激素。在20世纪期间，操控半矮化小麦、稻和高粱植物品种中的GA水平导致这些谷类作物的产量增加和倒伏降低，此在很大程度上导致了绿色革命(GreenRevolution)。然而，通过操控GA路径来在其他谷类作物诸如玉米中获得成功产量增加一直具有挑战性。在本领域中仍旧需要开发具有增加的产量和/或倒伏抗性的单子叶植物或谷类作物植物诸如玉米。
发明内容
在一方面，本公开提供了一种包含内源性GA20氧化酶_3基因座的突变等位基因的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述突变等位基因包含插入至所述内源性GA20氧化酶_3基因座中的DNA区段，其中所述DNA区段编码与SEQ ID NO:1-3以及5-7中的一者或多者的至少20、至少25、至少30、至少40、至少50、至少75、至少100、至少150、至少200、至少300、至少400、至少500、至少750、或至少1000个连续核苷酸至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％互补的反义RNA序列，并且其中所述内源性GA20氧化酶_3基因座的所述突变等位基因产生包含所述反义RNA序列的RNA转录物。
在一方面，本公开提供了一种用于产生内源性GA20氧化酶_3基因座的突变等位基因的方法，所述方法包括：(a)使用靶向编辑技术在玉米细胞中的所述内源性GA20氧化酶_3基因座中产生第一双链断裂；(b)在所述第一双链断裂处插入DNA区段，其中所述DNA区段编码与SEQ ID NO:1-3以及5-7中的一者或多者的至少20、至少25、至少30、至少40、至少50、至少75、至少100、至少150、至少200、至少300、至少400、至少500、至少750、或至少1000个连续核苷酸至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％互补的反义RNA序列，并且其中所述内源性GA20氧化酶_3基因座的所述突变等位基因产生包含所述反义RNA序列的RNA转录物。
在一方面，本公开提供了一种用于产生内源性GA20氧化酶_3基因座的突变等位基因的方法，所述方法包括：(a)使用靶向编辑技术在玉米细胞中的所述内源性GA20氧化酶_3基因座中产生第一双链断裂和第二双链断裂；(b)在所述第一双链断裂与所述第二双链断裂之间插入DNA区段，其中所述DNA区段编码与SEQ ID NO:1-3以及5-7中的一者或多者的至少20、至少25、至少30、至少40、至少50、至少75、至少100、至少150、至少200、至少300、至少400、至少500、至少750、或至少1000个连续核苷酸至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％互补的反义RNA序列，并且其中所述内源性GA20氧化酶_3基因座的所述突变等位基因产生包含所述反义RNA序列的RNA转录物。
在一方面，本公开提供了一种包含内源性GA20氧化酶_5基因座的突变等位基因的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述突变等位基因包含插入至所述内源性GA20氧化酶_5基因座中的DNA区段，其中所述DNA区段编码与SEQ ID NO:1-3以及5-7中的一者或多者的至少20、至少25、至少30、至少40、至少50、至少75、至少100、至少150、至少200、至少300、至少400、至少500、至少750、或至少1000个连续核苷酸至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％互补的反义RNA序列，并且其中所述内源性GA20氧化酶_5基因座的所述突变等位基因产生包含所述反义RNA序列的RNA转录物。
在一方面，本公开提供了一种用于产生内源性GA20氧化酶_5基因座的突变等位基因的方法，所述方法包括：(a)使用靶向编辑技术在玉米细胞中的所述内源性GA20氧化酶_5基因座中产生双链断裂(DSB)；(b)使用靶向编辑技术在所述DSB处插入DNA区段，其中所述DNA区段编码与SEQ ID NO:1-3以及5-7中的一者或多者的至少20、至少25、至少30、至少40、至少50、至少75、至少100、至少150、至少200、至少300、至少400、至少500、至少750、或至少1000个连续核苷酸至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％互补的反义RNA序列，并且其中所述内源性GA20氧化酶_5基因座的所述突变等位基因产生包含所述反义RNA序列的RNA转录物。
在一方面，本公开提供了一种用于产生内源性GA20氧化酶_5基因座的突变等位基因的方法，所述方法包括：(a)使用靶向编辑技术在玉米细胞中的所述内源性GA20氧化酶_5基因座中产生第一双链断裂和第二双链断裂；(b)在所述第一双链断裂与所述第二双链断裂之间插入DNA区段，其中所述DNA区段编码与SEQ ID NO:1-3以及5-7中的一者或多者的至少20、至少25、至少30、至少40、至少50、至少75、至少100、至少150、至少200、至少300、至少400、至少500、至少750、或至少1000个连续核苷酸至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％互补的反义RNA序列，并且其中所述内源性GA20氧化酶_5基因座的所述突变等位基因产生包含所述反义RNA序列的RNA转录物。
在一方面，本公开提供了一种用于产生玉米植物的方法，所述方法包括：(a)用来自雄性玉米植物的花粉对至少一个雌性玉米植物进行受精，其中所述至少一个雌性玉米植物和/或所述雄性玉米植物包含内源性GA20氧化酶基因座的突变等位基因，其中所述突变等位基因包含插入至所述内源性GA20氧化酶基因座中的DNA区段，其中所述DNA区段编码与SEQ ID NO:1-3或5-7中的一者或多者的至少20、至少25、至少30、至少40、至少50、至少75、至少100、至少150、至少200、至少300、至少400、至少500、至少750、或至少1000个连续核苷酸至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％互补的反义RNA序列，并且其中所述内源性GA20氧化酶基因座的所述突变等位基因产生包含所述反义RNA序列的RNA转录物；以及(b)获得至少一个通过步骤(a)的所述受精产生的种子。
在一方面，本公开提供了一种包含内源性GA20氧化酶_3基因座的突变等位基因的经修饰玉米植物部分、玉米细胞或玉米组织，其中所述突变等位基因包含插入至所述内源性GA20氧化酶_3基因座中的DNA区段，其中所述DNA区段编码与SEQ ID NO:1-3以及5-7中的一者或多者的至少20、至少25、至少30、至少40、至少50、至少75、至少100、至少150、至少200、至少300、至少400、至少500、至少750、或至少1000个连续核苷酸至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％互补的反义RNA序列，并且其中所述内源性GA20氧化酶_3基因座的所述突变等位基因产生包含所述反义RNA序列的RNA转录物。
在一方面，本公开提供了一种包含内源性GA20氧化酶_5基因座的突变等位基因的经修饰玉米植物部分、玉米细胞或玉米组织，其中所述突变等位基因包含插入至所述内源性GA20氧化酶_5基因座中的DNA区段，其中所述DNA区段编码与SEQ ID NO:1-3以及5-7中的一者或多者的至少20、至少25、至少30、至少40、至少50、至少75、至少100、至少150、至少200、至少300、至少400、至少500、至少750、或至少1000个连续核苷酸至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％互补的反义RNA序列，并且其中所述内源性GA20氧化酶_5基因座的所述突变等位基因产生包含所述反义RNA序列的RNA转录物。
附图说明
图1提供用于产生Zm.GA20ox3基因座的基因组修饰以编码具有倒置序列的RNA转录物的说明性实例，所述倒置序列可杂交于所述RNA转录物的相应序列以产生茎-环结构，以导致阻抑在内源性Zm.GA20ox3和Zm.GA20ox5基因座处的一个或两个拷贝或等位基因。
图2描绘野生型和杂合性经编辑玉米植物的以英寸表示的平均高度(Y轴)。
图3描绘在来自含有经编辑GA20ox3等位基因的植物的样品中检测到的定位于包含来自GA20ox5的倒位序列和经编辑GA20ox3基因的相应序列的经编辑茎-环的茎中的区域的每百万读段中的21聚体小RNA的数目(Y轴)。
图4.描绘经编辑和对照玉米植物中GA12和GA9的以pmol/g表示的浓度(Y轴)。
图5描绘经编辑和对照玉米植物中GA20和GA53的以pmol/g表示的浓度(Y轴)。
具体实施方式
除非在本文中另外定义，否则术语应根据由相关领域普通技术人员对它们的常规用法加以理解。为有助于理解本公开，如本文所用的若干术语和缩写在下文中定义如下：
术语“和/或”在用于两个或更多个条目的清单中时意指所列条目中的任一者可单独采用或与所列条目中的任何一者或多者组合采用。举例来说，表述“A和/或B”意指A和B中的任一者或两者–即单独A，单独B，或A和B组合。表述“A、B和/或C”意指单独A，单独B，单独C，A和B组合，A和C组合，B和C组合，或A、B和C组合。
如本文所用的术语“约”意图限定它修饰的数值，从而将此种值表示为在某一误差界限内的变量。当未叙述特定误差界限，诸如平均值的标准偏差时，术语“约”应被理解为意指将涵盖所述值以及将在考虑有效数字的情况下通过上舍入或下舍入至那个数字而包括的范围的那个范围。
如本文所用，“植物”包括处于任何再生或发育阶段的外植体、植物部分、幼苗、小植株或完整植物。如本文所用的术语“谷类植物”是指属于禾草的禾本科(Poaceae/Gramineae)，并且通常收集它的种子的单子叶(单子叶植物)作物植物，包括例如小麦、玉米、稻、粟、大麦、高粱、燕麦和黑麦。如通常所了解，“玉米植物”或“玉蜀黍植物”是指玉米(Zea mays)物种的任何植物，并且包括可与玉米交配的所有植物品种，包括野生玉蜀黍物种。
如本文所用，“植物部分”可指植物的任何器官或完整组织，诸如分生组织、嫩芽器官/结构(例如叶、茎或节)、根、花或花器官/结构(例如苞片、萼片、花瓣、雄蕊、心皮、花药和胚珠)、种子、胚、胚乳、种皮、果实、成熟子房、繁殖体、或其他植物组织(例如维管组织、皮组织、基本组织等)、或它们的任何部分。本公开的植物部分可为有活力的，无活力的，可再生的，以及/或者非可再生的。“繁殖体”可包括可生长成整个植物的任何植物部分。
如本文所用，“基因座”是多态性核酸、性状决定簇、基因或标记所位于的染色体位点或区域。“基因座”可由两个同源染色体共有以指代它们的相应位点或区域。
如本文所用，“等位基因”是指基因的或在特定基因座处的替代性核酸序列(例如基因或基因座的不同于所述同一基因或基因座的其他等位基因的核酸序列)。此种等位基因可被视为(i)野生型的，或(ii)突变的，如果相对于野生型等位基因，一个或多个突变或编辑存在于突变等位基因的核酸序列中。相对于野生型等位基因，基因的突变或经编辑等位基因可具有所述基因的降低或消除的活性或表达水平。根据本发明实施方案，基因的突变或经编辑等位基因可具有可与所述基因的另一部分以及/或者所述基因和/或另一基因的另一拷贝或等位基因的编码序列互补的倒位或反义序列。对于二倍体生物体诸如玉米，第一等位基因可存在于一个染色体上，并且第二等位基因可存在于第二同源染色体上的相同基因座处。如果在植物的一个染色体上的基因座处的一个等位基因是突变或经编辑等位基因，而在所述植物的同源染色体上的另一相应等位基因是野生型的，那么所述植物被描述为就所述突变或经编辑等位基因来说是杂合的。然而，如果在某一基因座处的两个等位基因均是突变或经编辑等位基因，那么植物被描述为就所述突变或经编辑等位基因来说是纯合的。就在某一基因座处的突变等位基因来说是纯合的植物可包含相同突变或经编辑等位基因，或如果是异等位基因的或双等位基因的，那么可包含不同突变或经编辑等位基因。
如本文所用，“内源性基因座”是指在它的天然和原始染色体位置处的基因座。如本文所用，“内源性GA20氧化酶_3基因座”是指在它的原始染色体位置处的GA20氧化酶_3基因座。如本文所用，“内源性GA20氧化酶_5基因座”是指在它的原始染色体位置处的GA20氧化酶_5基因座。
如本文所用，“基因”是指形成遗传和功能性单元，并且编码一种或多种序列相关RNA和/或多肽分子的核酸序列。基因通常含有可操作地连接于调控基因产物(例如多肽或功能性RNA)的表达的适当调控序列的编码区。基因可具有各种序列元件，包括但不限于启动子、非翻译区(UTR)、外显子、内含子、以及其他上游或下游调控序列。
如本文所用，在蛋白质编码基因的情形下，“外显子”是指DNA或RNA分子的含有编码蛋白质或多肽序列的信息的区段。
如本文所用，基因的“内含子”是指DNA或RNA分子的区段，所述区段不含有编码蛋白质或多肽的信息，并且首先转录成RNA序列，但接着从成熟RNA分子剪除。
如本文所用，基因的“非翻译区(UTR)”是指RNA分子或序列(例如mRNA分子)的从基因(或转基因)表达，但排除所述RNA分子的外显子和内含子序列的区段。“非翻译区(UTR)”还指编码RNA分子的此种UTR区段的DNA区段或序列。视非翻译区相对于DNA或RNA分子或序列的编码区位于所述DNA或RNA分子或序列的5′还是3′末端(即分别在外显子和内含子序列的上游或下游)而定，它可为5′-UTR或3′-UTR。
如本文所用，术语“表达”是指在细胞、组织、器官或生物体诸如植物、植物部分、或植物细胞、组织或器官中生物合成基因产物，并且通常是转录和/或翻译核苷酸序列诸如内源性基因、异源性基因、转基因或RNA和/或蛋白质编码序列。
如本文所用，“茎-环结构”是指RNA分子中的二级结构，所述二级结构具有由所述RNA分子的两个退火RNA链、序列或区段组成的双链区域(例如茎)，所述两个退火RNA链、序列或区段由所述RNA分子的单链间插RNA序列(例如环或发夹)连接。RNA分子的“茎-环结构”可具有更复杂的二级RNA结构，例如包含具有内部错配、突起和/或环的自退火双链RNA序列。
如本文所用，“天然序列”是指天然存在于它的原始染色体位置中的核酸序列。
如本文所用，“野生型基因”或“野生型等位基因”是指以下基因或等位基因：所述基因或等位基因具有在特定植物物种中最常见的序列或基因型，或相对于最常见的序列或基因型仅具有不显著影响所述基因或等位基因的表达和活性的天然变异、多态性或其他沉默突变的另一序列或基因型。实际上，相对于最常见的序列或基因型，“野生型”基因或等位基因不含有实质上影响所述基因或等位基因的正常功能、活性、表达或表型结果的变异、多态性或任何其他类型的突变。
如本文关于两个或更多个核苷酸或蛋白质序列所用的术语“同一性百分比”或“百分比同一”通过以下方式计算：(i)在比较窗上比较两个最优对准的序列(核苷酸或蛋白质)，(ii)确定相同核酸碱基(对于核苷酸序列)或氨基酸残基(对于蛋白质)存在于两个序列中所处的位置的数目以产生匹配位置的数目，(iii)用匹配位置的数目除以所述比较窗中位置的总数，接着(iv)用100％乘以这个商以产生同一性百分比。出于计算DNA序列与RNA序列之间的“同一性百分比”的目的，RNA序列的尿嘧啶(U)被视为与DNA序列的胸腺嘧啶(T)相同。如果比较窗定义为两个或更多个序列之间的比对区域(即排除在所比较序列之间不相同的在所比对多核苷酸序列的5′和3′末端的核苷酸，或在所比对蛋白质序列的N末端和C末端的氨基酸)，那么“同一性百分比”也可被称为“比对同一性百分比”。如果“同一性百分比”在未指定特定比较窗的情况下相对于参考序列计算，那么通过用在比对区域上匹配的位置的数目除以所述参考序列的总长度来确定同一性百分比。因此，出于本公开的目的，当两个序列(查询和目标)最优比对(在它们的比对中虑及空位)时，查询序列的“同一性百分比”等于在两个序列之间相同的位置的数目除以查询序列中在它的长度(或比较窗)上的位置的总数，接着乘以100％。
对于最优比对序列以计算它们的同一性百分比，可用于比较两个或更多个核苷酸或蛋白质序列之间的序列同一性或类似性的各种成对或多重序列比对算法和程序在本领域中是已知的，诸如ClustalW或Basic Local Alignment Search
Figure BDA0003255407500000101
等。尽管其他对准和比较方法在本领域中是已知的，但两个序列之间的比对(包括以上所述的同一性百分比范围)可如通过ClustalW或
Figure BDA0003255407500000102
算法来确定，参见例如Chenna R.等人,“Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs,”NucleicAcids Research 31:3497-3500(2003)；Thompson JD等人,“Clustal W:Improving thesensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequenceweighting,position-specific gap penalties and weight matrix choice,”NucleicAcids Research 22:4673-4680(1994)；以及Larkin MA等人,“Clustal W and Clustal Xversion 2.0,”Bioinformatics 23:2947-48(2007)；以及Altschul,S.F.,Gish,W.,Miller,W.,Myers,E.W.和Lipman,D.J.(1990)"Basic local alignment search tool."J.Mol.Biol.215:403-410(1990)，所述文献的全部内容和公开内容通过引用并入本文。
如本文关于两个核苷酸序列所用的术语“互补性百分比”或“百分比互补”类似于同一性百分比的概念，但指代当查询序列和目标序列线性排列并且最优碱基配对而无二级折叠结构诸如环、茎或发夹时，查询序列的与目标序列的核苷酸最优碱基配对或杂交的核苷酸的百分比。此种互补性百分比可在两个DNA链，两个RNA链，或DNA链与RNA链之间。“互补性百分比”通过以下方式计算：(i)在比较窗上以线性和充分伸展排列方式(即无折叠或二级结构)使两个核苷酸序列最优碱基配对或杂交，(ii)确定在所述比较窗上在两个序列之间碱基配对的位置的数目以产生互补位置的数目，(iii)用互补位置的数目除以所述比较窗中位置的总数，以及(iv)用100％乘以这个商以产生两个序列的互补性百分比。两个序列的最优碱基配对可基于核苷酸碱基通过氢键合达成的已知配对确定，诸如G-C、A-T和A-U。如果“互补性百分比”在未指定特定比较窗的情况下相对于参考序列计算，那么通过用在两个线性序列之间互补的位置的数目除以所述参考序列的总长度来确定同一性百分比。因此，出于本公开的目的，当两个序列(查询和目标)最优碱基配对(虑及错配或非碱基配对核苷酸，但无折叠或二级结构)时，查询序列的“互补性百分比”等于在两个序列之间碱基配对的位置的数目除以查询序列中在它的长度上的位置的总数(或除以查询序列中在比较窗上的位置的数目)，接着乘以100％。
如本文所用，关于给定序列，“互补序列”、“互补性序列”和“反向互补序列”可互换使用。所有三个术语都指代核苷酸序列的反向互补性序列，即指代以相反核苷酸顺序与给定序列互补的序列。作为一实例，具有序列5′-atggttc-3′的核苷酸序列的反向互补序列是5′-gaaccat-3′。
如本文所用，术语“反义”是指与特定DNA或RNA序列互补的DNA或RNA序列。反义RNA分子是可由于序列的互补性而与有义RNA链或序列或mRNA组合以形成双链体的单链核酸。术语“反义链”是指与“有义”链互补的核酸链。基因或基因座的“有义链”是与从所述基因或基因座转录的RNA分子具有相同序列的DNA或RNA链(除RNA中的尿嘧啶和DNA中的胸腺嘧啶之外)。
如本文所用，“倒置基因组片段”是指在基因组中倒转以致原始有义链和反义链序列在整个基因组区段的相对定向上反转或转向的基因组区段。
如本文所用，在“相应内源性序列”或“相应内源性DNA区段”的情形下，当序列或DNA区段共有充分序列同源性、同一性或互补性时，内源性序列或内源性DNA区段被视为对应于另一序列或DNA区段(例如非内源性的，引入的或插入的序列或DNA区段)。
如本文所用，除非另外指定，否则当表示为“上游”、“下游”、“在5′末端”或“在3′末端”时，基因座的两个序列元件的相对位置基于与那个基因座相关的转录活性的方向来确定。举例来说，对于两个经转录基因组DNA元件，它们的相对位置基于它们的有义链，其中当第一基因组DNA元件首先转录时，第一基因组DNA元件在第二基因组DNA元件的上游或5′末端。
术语“可操作地连接”是指启动子或其他调控元件与基因(或转基因)的相关可转录DNA序列或编码序列之间的功能性连接，以致所述启动子等至少在某一或某些细胞、组织、发育阶段中和/或条件下发挥启动、辅助、影响、导致和/或促进所述相关可转录DNA序列或编码序列的转录和表达的作用或功能。如果两个可转录DNA序列的转录受共同启动子或其他调控元件的控制，那么它们也可为“可操作地连接”于彼此的。
如本文所用，“编码区域”或“编码区”是指多核苷酸的编码功能性单元或分子(例如不限于mRNA、蛋白质、或非编码RNA序列或分子)的部分。“编码区域”或“编码区”可含有例如一个或多个外显子、一个或多个内含子、5′-UTR、3′-UTR、或它们的任何组合。
如本文所用，“邻近”是指核酸序列紧密邻近于或挨着另一核酸序列。在一个方面，邻近核酸序列是物理连接的。在另一方面，邻近核酸序列或基因是紧挨着彼此的，以致在第一核酸序列与第二核酸序列之间不存在间插核苷酸。在一方面，如果第一基因和第二基因相隔小于50,000、小于25,000、小于10,000、小于9000、小于8000、小于7000、小于6000、小于5000、小于4000、小于3000、小于2500、小于2000、小于1750、小于1500、小于1250、小于1000、小于900、小于800、小于700、小于600、小于500、小于400、小于300、小于200、小于100、小于75、小于50、小于25、小于20、小于10、小于5、小于4、小于3、小于2、或小于1个核苷酸，那么它们邻近于彼此。
如本文所用，“靶向基因组编辑技术”是指允许使用位点特异性核酸酶对植物的基因组中的特定位置进行精确和/或靶向编辑(即编辑基本上或完全是非随机的)的任何方法、方案或技术，所述位点特异性核酸酶诸如是兆碱基大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、RNA引导的核酸内切酶(例如CRISPR/Cas9系统)、TALE(转录活化子样效应物)-核酸内切酶(TALEN)、重组酶或转座酶。如本文所用，“编辑”或“基因组编辑”是指产生内源性植物基因组核酸序列的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少75、至少100、至少250、至少500、至少1000、至少2500、至少5000、至少10,000、或至少25,000个核苷酸的靶向突变、缺失、倒位或取代。如本文所用，“编辑”或“基因组编辑”还涵盖将至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少75、至少100、至少250、至少500、至少750、至少1000、至少1500、至少2000、至少2500、至少3000、至少4000、至少5000、至少10,000、或至少25,000个核苷酸靶向插入或定点整合至植物的内源性基因组中。呈单数形式的“编辑”或“基因组编辑”是指一个这种靶向突变、缺失、倒位、取代或插入，而多个“编辑”或“基因组编辑”是指两个或更多个靶向突变、缺失、倒位、取代和/或插入，其中每个“编辑”通过靶向基因组编辑技术来引入。
如本文所用，在植物、植物种子、植物部分、植物细胞和/或植物基因组的情形下，“经修饰”是指相对于野生型或对照植物、植物种子、植物部分、植物细胞和/或植物基因组，植物、植物种子、植物部分、植物细胞和/或植物基因组包含一种或多种目标基因的表达水平和/或编码序列的工程改造变化。实际上，术语“经修饰”还可指植物、植物种子、植物部分、植物细胞和/或植物基因组具有通过化学诱变、转座子插入或切除、或任何其他已知诱变技术引入，或通过基因组编辑引入的影响一种或多种内源性GA氧化酶基因诸如一种或多种内源性GA20氧化酶基因的表达的一个或多个倒位、缺失、反义插入、或它们的组合。在一方面，经修饰植物、植物种子、植物部分、植物细胞和/或植物基因组可包含一种或多种转基因。为明晰起见，因此，经修饰植物、植物种子、植物部分、植物细胞和/或植物基因组包括相对于野生型或对照植物、植物种子、植物部分、植物细胞和/或植物基因组，具有一种或多种GA氧化酶基因的改变的表达水平、表达样式和/或编码序列的突变、经编辑和/或转基因植物、植物种子、植物部分、植物细胞和/或植物基因组。经修饰植物就任何给定突变或编辑来说可为纯合的或杂合的，并且/或者在GA氧化酶基因基因座处可为双等位基因的或异等位基因的。如果GA氧化酶基因的每个拷贝是不同等位基因(即包含不同的一个或多个突变和/或编辑)，那么经修饰植物就所述GA氧化酶基因来说是双等位基因的或异等位基因的，其中每个等位基因降低所述GA氧化酶基因的表达水平和/或活性。经修饰植物、植物部分、种子等可已经受诱变、基因组编辑或定点整合(例如不限于通过使用位点特异性核酸酶的方法)、遗传转化(例如不限于通过土壤杆菌(Agrobacterium)转化或微粒轰击的方法)、或它们的组合。此类“经修饰”植物、植物种子、植物部分和植物细胞包括保留对一种或多种GA氧化酶基因的分子变化(例如表达水平和/或活性的变化)的是“经修饰”植物、植物种子、植物部分和植物细胞的后代或源于“经修饰”植物、植物种子、植物部分和植物细胞的植物、植物种子、植物部分和植物细胞。本文提供的经修饰种子可产生本文提供的经修饰植物。本文提供的经修饰植物、植物种子、植物部分、植物细胞或植物基因组可包含如本文提供的重组DNA构建体或载体或基因组编辑。“经修饰植物产品”可为由本文提供的经修饰植物、植物部分、植物细胞或植物染色体、或它们的任何部分或组分制得的任何产品。
如本文所用，术语“对照植物”(或同样地，“对照”植物种子、植物部分、植物细胞和/或植物基因组)是指用于与经修饰植物(或经修饰植物种子、植物部分、植物细胞和/或植物基因组)比较，并且除影响一种或多种GA氧化酶基因的转基因事件和/或一个或多个基因组编辑(例如倒位或反义插入)之外与所述经修饰植物(或植物种子、植物部分、植物细胞和/或植物基因组)具有相同或类似遗传背景(例如相同亲本株系、杂交、近交系、测交系等)的植物(或植物种子、植物部分、植物细胞和/或植物基因组)。举例来说，对照植物可为与用于制备经修饰植物的近交系相同的近交系，或对照植物可如同经修饰植物一样是近交亲本株系的相同杂交的产物，例外之处是在对照植物中不存在影响一种或多种GA氧化酶基因的任何一个或多个转基因或基因组编辑。类似地，未修饰对照植物是指与经修饰植物共有大致上类似或基本上相同的遗传背景，但不具有对经修饰植物的基因组的一个或多个工程改造变化(例如转基因、突变或编辑)的植物。出于与经修饰植物、植物种子、植物部分、植物细胞和/或植物基因组比较的目的，“野生型植物”(或同样地，“野生型”植物种子、植物部分、植物细胞和/或植物基因组)是指非转基因和非基因组编辑对照植物、植物种子、植物部分、植物细胞和/或植物基因组。如本文所用，如果被视为对于比较待分析的特征或性状是足够类似的，那么“对照”植物、植物种子、植物部分、植物细胞和/或植物基因组还可为与经修饰植物、植物种子、植物部分、植物细胞和/或植物基因组具有类似(而非相同或等同)遗传背景的植物、植物种子、植物部分、植物细胞和/或植物基因组。
如本文所用，基因组编辑的“靶标位点”是指植物基因组内由位点特异性核酸酶结合和裂解的多核苷酸序列的位置，所述结合和裂解将双链断裂(或单链切口)引入至所述多核苷酸序列和/或它的互补性DNA链的核酸骨架中。靶标位点可包含至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少29或至少30个连续核苷酸。RNA引导的核酸酶的“靶标位点”可包含双链核酸(DNA)分子或染色体的任一互补链的在所述靶标位点处的序列。位点特异性核酸酶可结合靶标位点，诸如通过非编码引导RNA(例如不限于如以下进一步所述的CRISPR RNA(crRNA)或单链引导RNA(sgRNA))。本文提供的非编码引导RNA可与靶标位点互补(例如在所述靶标位点处与双链核酸分子或染色体的任一链互补)。应了解完全同一性或互补性可不为非编码引导RNA结合或杂交于靶标位点所需。举例来说，可容许靶标位点与非编码RNA之间有至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、或至少8个错配(或更多个)。“靶标位点”还指植物基因组内由可不由非编码RNA分子引导的另一位点特异性核酸酶诸如兆碱基大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、或转录活化子样效应物核酸酶(TALEN)结合和裂解的多核苷酸序列的位置，所述结合和裂解用以将双链断裂(或单链切口)引入至所述多核苷酸序列和/或它的互补性DNA链中。如本文所用，“靶标区域”或“靶向区域”是指由两个或更多个靶标位点侧接的多核苷酸序列或区域。在不加限制下，在一些实施方案中，靶标区域可经受突变、缺失、插入或倒位。如本文所用，当用于描述多核苷酸序列或分子的靶标区域时，“侧接”是指所述多核苷酸序列或分子的两个或更多个靶标位点在所述靶标区域周围，其中在所述靶标区域的每侧上有一个靶标位点。
如本文所用，可为重组DNA供体模板的“供体模板”定义为具有用于通过对植物细胞的基因组中切口或双链DNA断裂的修复来定点靶向插入或重组至植物细胞的基因组中的核酸模板或插入序列的核酸分子。举例来说，“供体模板”可用于定点整合编码目标反义序列的DNA区段，或作为模板用于将突变诸如插入、缺失等引入至植物的基因组内的靶标位点中。本文提供的靶向基因组编辑技术可包括使用一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、或五种或更多种供体模板。“供体模板”可为单链或双链DNA或RNA分子或质粒。供体模板的“插入序列”是被设计用于靶向插入至植物细胞的基因组中的可具有任何适合长度的序列。举例来说，供体模板的插入序列在长度方面可在2与50,000，2与10,000，2与5000，2与1000，2与500，2与250，2与100，2与50，2与30，15与50，15与100，15与500，15与1000，15与5000，18与30，18与26，20与26，20与50，20与100，20与250，20与500，20与1000，20与5000，20与10,000，50与250，50与500，50与1000，50与5000，50与10,000，100与250，100与500，100与1000，100与5000，100与10,000，250与500，250与1000，250与5000，或250与10,000个核苷酸或碱基对之间。供体模板还可具有至少一个同源序列或同源臂，诸如两个同源臂，以通过同源性重组来指导突变或插入序列整合至植物的基因组内的靶标位点中，其中同源序列或一个或多个同源臂与在所述植物的基因组内的所述靶标位点处或附近的序列是同一的或互补的，或具有某一同一性百分比或互补性百分比。当供体模板包含一个或多个同源臂和插入序列时，所述一个或多个同源臂将侧接于所述供体模板的所述插入序列或在所述插入序列周围。
供体模板可为线性的或环状的，并且可为单链或双链。供体模板可以裸核酸形式(例如通过粒子轰击)，以与一种或多种递送剂(例如脂质体、蛋白质、泊洛沙姆(poloxamer)、用蛋白质囊封的T链等)的复合物形式，或含于细菌或病毒递送载体分别诸如像根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)或双粒病毒中来递送至细胞。供体模板的插入序列或本文提供的插入序列可包含可转录成RNA分子的全部或一部分诸如RNA分子的反义序列或部分的可转录DNA序列或区段。
如本文所用，术语“阻抑(suppress/suppression)”、“抑制(inhibit/inhibition/inhibiting)”和“下调(downregulation)”是指相较于在一个或多个植物发育阶段时野生型或对照植物、细胞或组织中由靶标基因编码的mRNA和/或蛋白质的表达水平，降低、减小或消除在相同的一个或多个植物发育阶段时植物、植物细胞或植物组织中此靶标mRNA和/或蛋白质的表达水平。通过一种或多种如本文提供的不同机制，可阻抑植物或植物组织中的靶标基因。根据一些实施方案，提供了一种相较于对照植物，具有在至少一种植物组织中降低至少5％、至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、或100％的GA20氧化酶基因表达水平诸如GA20氧化酶3和/或GA20氧化酶5基因表达水平的经修饰植物。根据一些实施方案，提供了一种相较于对照植物，具有在至少一种植物组织中降低5％-20％、5％-25％、5％-30％、5％-40％、5％-50％、5％-60％、5％-70％、5％-75％、5％-80％、5％-90％、5％-100％、75％-100％、50％-100％、50％-90％、50％-75％、25％-75％、30％-80％、或10％-75％的GA20氧化酶基因表达水平诸如GA20氧化酶3和/或GA20氧化酶5基因表达水平的经修饰植物。
根据一些实施方案，提供了一种相较于对照植物，具有在至少一种植物组织中降低至少5％、至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、或100％的GA20氧化酶mRNA水平诸如GA20氧化酶3和/或GA20氧化酶5mRNA水平的经修饰植物。根据一些实施方案，提供了一种相较于对照植物，具有在至少一种植物组织中降低5％-20％、5％-25％、5％-30％、5％-40％、5％-50％、5％-60％、5％-70％、5％-75％、5％-80％、5％-90％、5％-100％、75％-100％、50％-100％、50％-90％、50％-75％、25％-75％、30％-80％、或10％-75％的GA20氧化酶mRNA表达水平诸如GA20氧化酶3和/或GA20氧化酶5mRNA水平的经修饰植物。根据一些实施方案，提供了一种相较于对照植物，具有在至少一种植物组织中降低至少5％、至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、或100％的GA20氧化酶蛋白质表达水平诸如GA20氧化酶3和/或GA20氧化酶5蛋白质水平的经修饰植物。根据一些实施方案，提供了一种相较于对照植物，具有在至少一种植物组织中降低5％-20％、5％-25％、5％-30％、5％-40％、5％-50％、5％-60％、5％-70％、5％-75％、5％-80％、5％-90％、5％-100％、75％-100％、50％-100％、50％-90％、50％-75％、25％-75％、30％-80％、或10％-75％的GA20氧化酶蛋白质表达水平诸如GA20氧化酶3和/或GA20氧化酶5蛋白质水平的经修饰植物。
如本文所用，“间插区”或“间插序列”是指在物理连接的第一多核苷酸序列与第二多核苷酸序列之间的多核苷酸序列。间插序列可形成茎-环结构的环，并且第一序列和第二序列可杂交以形成茎-环结构的茎。在一个方面，间插区或间插序列包含至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少10、至少25、至少50、至少100、至少150、至少200、至少250、至少500、至少1000、至少1250、至少1500、至少1750、至少2000、至少2500、至少3000、至少4000、至少5000、至少6000、至少7000、至少8000、至少9000、至少10,000、至少15,000、至少20,000、至少25,000、或至少50,000个核苷酸。在一个方面，间插区或间插序列包含DNA序列。在一个方面，间插区或间插序列包含RNA序列。在一个方面，间插区或间插序列包含内源性或天然核酸序列。在另一方面，间插区或间插序列包含转基因或外源性核酸序列。在一个方面，间插区或间插序列包含内源性或天然核酸序列和转基因或外源性核酸序列。
谷类植物中的GA氧化酶由相关GA氧化酶基因的家族组成。举例来说，玉米具有至少九种GA20氧化酶基因的家族，所述家族包括GA20氧化酶_1、GA20氧化酶_2、GA20氧化酶_3、GA20氧化酶_4、GA20氧化酶_5、GA20氧化酶_6、GA20氧化酶_7、GA20氧化酶_8和GA20氧化酶_9。GA20氧化酶_3和GA20氧化酶_5的由SEQ ID NO表示的DNA和蛋白质序列提供于表1中。
表1.玉米中GA20氧化酶_3和GA20氧化酶_5基因的由序列标识符表示的DNA和蛋白质序列。
Figure BDA0003255407500000201
来自参考基因组的GA20氧化酶_3基因座的野生型基因组DNA序列以SEQ ID NO:1提供，并且来自参考基因组的GA20氧化酶_5基因座的野生型基因组DNA序列以SEQ ID NO:5提供。
对于GA20氧化酶_3基因，SEQ ID NO:1提供在GA20氧化酶_3 5′-UTR的上游的3000个核苷酸；核苷酸3001-3096对应于5′-UTR；核苷酸3097-3665对应于第一外显子；核苷酸3666-3775对应于第一内含子；核苷酸3776-4097对应于第二外显子；核苷酸4098-5314对应于第二内含子；核苷酸5315-5584对应于第三外显子；并且核苷酸5585-5800对应于3′-UTR。SEQ ID NO:1还提供在3′-UTR的末端的下游的3000个核苷酸(核苷酸5801-8800)。
对于GA20氧化酶_5基因，SEQ ID NO:5提供在GA20氧化酶_5起始密码子的上游的3000个核苷酸(核苷酸1-3000)；核苷酸3001-3791对应于第一外显子；核苷酸3792-3906对应于第一内含子；核苷酸3907-4475对应于第二外显子；核苷酸4476-5197对应于第二内含子；核苷酸5198-5473对应于第三外显子；并且核苷酸5474-5859对应于3′-UTR。SEQ ID NO:5还提供在3′-UTR的末端的下游的3000个核苷酸(核苷酸5860-8859)。
先前显示通过转基因阻抑(例如人工微小RNA介导的对GA20氧化酶_3基因与GA20氧化酶_5基因两者的阻抑)来阻抑一种或多种GA20氧化酶基因以及/或者靶向一种或多种GA氧化酶基因的子组可有效实现矮株型半矮化表型以及增加的倒伏抗性，但在穗中不具有生殖异型。参见PCT申请第PCT/US2017/047405号和美国申请第15/679,699号，两者均在2017年8月17日提交，并且分别以WO/2018/035354和US20180051295公布。此外，通过基因组编辑剔除GA20氧化酶_3、GA20氧化酶_5、或两种基因也可导致植物高度降低和倒伏抗性增加，并且影响GA激素水平。参见PCT申请第PCT/US2019/018128、PCT/US2019/018131和PCT/US2019/018133号，所述PCT申请全都在2019年2月15日提交。
显性等位基因是掩蔽在相同基因座处的第二等位基因(例如野生型等位基因)(例如同一基因的第二等位基因)的影响的等位基因。如果掩蔽效应是部分的或不完全的，那么显性等位基因可被称为半显性的。有时，一个基因座或基因的显性等位基因还可具有胜过另一基因座或基因的显性效应。显性负性等位基因或反效等位基因是产生与野生型等位基因功能相反地起作用的改变的基因产物的等位基因。举例来说，显性负性等位基因可以杂合状态消除或阻抑野生型等位基因或基因产物的正常功能。
创建以杂合状态起作用的显性等位基因可加速杂交作物诸如玉米中基因编辑源性产物的有效性状开发、利用和推出。显性负性等位基因具有以杂合状态提供正性或有益植物性状的潜在优势–例如当以单一拷贝存在时。因此，显性负性突变等位基因可通过杂交从单一亲本引入至子代植物中，而不必如同隐性等位基因一样从两个亲本植物引入等位基因。本公开提供了用以选择性编辑玉米植物的基因组以创建在植物中产生有益性状的显性等位基因的方法和组合物。
在一方面，本公开提供了一种经修饰玉米植物或一种用于产生此经修饰玉米植物的方法，其中所述经修饰玉米植物在内源性GA20氧化酶_3基因座或内源性GA20氧化酶_5基因座处具有显性等位基因(例如半显性等位基因)，此显性等位基因阻抑或抵抗内源性GA20氧化酶_3基因座、内源性GA20氧化酶_5基因座、或两者的一个或多个野生型等位基因的表达或功能。
在一方面，本公开提供了一种在内源性GA20氧化酶_3和内源性GA20氧化酶_5基因座中的一者或两者处包含突变等位基因的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述突变等位基因包含编码反义RNA序列的DNA插入物，其中所述突变等位基因产生包含所述反义RNA序列的RNA转录物，并且能够阻抑或抵抗GA20氧化酶_3基因座或基因、GA20氧化酶_5基因座或基因、或两者的野生型等位基因的表达。在一方面，由DNA插入物编码的反义RNA序列与SEQ ID NO:1-3以及5-7中的一者或多者的至少20、至少25、至少30、至少40、至少50、至少75、至少100、至少150、至少200、至少300、至少400、至少500、至少750、或至少1000个连续核苷酸至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％互补。在一方面，在内源性GA20氧化酶_3和内源性GA20氧化酶_5基因座中的一者或两者处的第一突变等位基因能够阻抑或抵抗GA20氧化酶_3基因座或基因、GA20氧化酶_5基因座或基因、或两者的第二突变等位基因的表达。
在另一方面，本公开提供了一种仅在内源性GA20氧化酶_3和内源性GA20氧化酶_5基因座中的一者处包含单一突变等位基因的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述单一突变等位基因包含编码反义RNA序列的DNA区段，并且其中所述突变等位基因编码包含所述反义RNA序列，能够阻抑或抵抗所述经修饰玉米植物或其植物部分中GA20氧化酶_3和/或GA20氧化酶_5基因座或基因的一个或两个野生型等位基因的表达的RNA(mRNA)分子。在一方面，DNA插入物与SEQ ID NO:1-3以及5-7中的一者或多者的至少20、至少25、至少30、至少40、至少50、至少75、至少100、至少150、至少200、至少300、至少400、至少500、至少750、或至少1000个连续核苷酸至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％互补。
本文还提供了使用靶向基因组编辑技术产生基因或基因区域的显性等位基因的方法。本文还提供了通过此类方法和此类方法中使用的组合物产生的细胞、组织或外植体。本描述还提供了从经受本文提供的方法的细胞、组织或外植体再生的经修饰植物、它们的任何子代、以及它们的任何植物部分。在一个方面，本文提供的基因的显性等位基因能够以杂合状态阻抑相同以及/或者不同的一个或多个基因座或基因的一个或多个野生型和/或突变等位基因的表达。
根据本公开的方面，提供了内源性GA20氧化酶_3(GA20ox3)或内源性GA20氧化酶_5(GA20ox5)基因或基因座的包含编码反义RNA序列的DNA区段的突变或经编辑等位基因。预期从此种经编辑GA20ox3或GA20ox5等位基因表达的包含反义RNA序列的RNA转录物可通过不同机制影响GA20氧化酶_3和/或内源性GA20氧化酶_5基因的表达水平，所述机制诸如是无义介导的降解、无终止降解、翻译停滞降解、DNA或组蛋白甲基化或其他表观遗传变化、抑制转录和/或翻译或降低转录和/或翻译的效率、核糖体干扰、干扰mRNA加工或剪接、以及/或者泛素介导的通过蛋白酶体达成的蛋白质降解。参见例如Nickless,A.等人,“Controlof gene expression through the nonsense-mediated RNA decay pathway”,CellBiosci 7:26(2017)；Karamyshev,A.等人,“Lost in Translation:Ribosome-AssociatedmRNA and Protein Quality Controls”,Frontiers in Genetics 9:431(2018)；Inada,T.,“Quality controls induced by aberrant translation”,Nucleic Acids Res 48:3(2020)；以及Szadeczky-Kardoss,I.等人,“The nonstop decay and the RNA silencingsystems operate cooperatively in plants”,Nucleic Acids Res 46:9(2018)，所述文献的全部内容和公开内容通过引用并入本文。这些不同机制中的每一者可替代地或外加于RNA干扰(RNAi)、转录基因沉默和/或转录后基因沉默(PTGS)机制来起作用。参见例如Wilson,R.C.等人,“Molecular Mechanisms of RNA Interference”,Annu RevBiophysics 42:217-39(2013)；以及Guo,Q.等人,“RNA Silencing in Plants:Mechanism,Technologies and Applications in Horticulture Crops”,Current Genomics 17:476-489(2016)，所述文献的全部内容和公开内容通过引用并入本文。以上机制中的一些可降低经编辑等位基因自身的表达，而其他还可降低内源性GA20氧化酶_3和/或GA20氧化酶_5基因座或基因的其他一个或多个拷贝或等位基因的表达。实际上，预计在经编辑内源性GA20氧化酶_3或GA20氧化酶_5基因、基因座或等位基因中存在反义或倒位序列诸如编码反义RNA序列的DNA区段不仅可降低或消除它自身的表达和/或活性水平，而且还可对内源性GA20氧化酶_3和/或GA20氧化酶_5基因座或基因的其他一个或多个拷贝或等位基因具有一种或多种显性或半显性效应。对GA20氧化酶_3和/或GA20氧化酶_5基因的此(此类)显性或半显性效应可通过不涉及RNAi以及/或者在显著或可检测水平上形成靶向小RNA的非典型阻抑机制来起作用，然而前提是以下实施例5中的数据确实支持形成小RNA分子。
在一方面，本公开提供了一种包含内源性GA20氧化酶_3基因座或基因的突变等位基因的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述突变等位基因包含插入至所述内源性GA20氧化酶_3基因座或基因中的DNA区段，其中所述DNA区段编码与SEQ ID NO:1-3以及5-7中的一者或多者的至少20、至少25、至少30、至少40、至少50、至少75、至少100、至少150、至少200、至少300、至少400、至少500、至少750、或至少1000个连续核苷酸至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％互补的反义RNA序列，并且其中所述突变等位基因产生包含所述反义RNA序列的RNA转录物。在一方面，GA20氧化酶_3突变等位基因能够阻抑内源性GA20氧化酶_3基因座或基因的野生型(或突变)等位基因、内源性GA20氧化酶_5基因座或基因的野生型(或突变)等位基因、或两者的表达。在另一方面，GA20氧化酶_3突变等位基因阻抑内源性GA20氧化酶_3基因座或基因的野生型(或突变)等位基因、内源性GA20氧化酶_5基因座或基因的野生型(或突变)等位基因、或两者的表达。在另一方面，由本文提供的GA20氧化酶_3突变等位基因产生的RNA转录物还包含内源性GA20氧化酶_3基因座或基因的一种或多种选自由以下组成的组的序列元件：5′UTR、第1外显子、第1内含子、第2外显子、第2内含子、第3外显子、3′UTR、以及它们的任何部分。
在一方面，GA20氧化酶_3突变等位基因中的插入DNA区段包含来源于内源性GA20氧化酶_3基因座的核苷酸序列。在另一方面，GA20氧化酶_3突变等位基因中的插入DNA区段对应于内源性GA20氧化酶_3基因座的倒置基因组片段。在一方面，GA20氧化酶_3突变等位基因中的插入DNA区段包含来源于内源性GA20氧化酶_5基因座的核苷酸序列。在另一方面，GA20氧化酶_3突变等位基因中的插入DNA区段对应于内源性GA20氧化酶_5基因座的倒置基因组片段。
在一方面，由GA20氧化酶_3突变等位基因产生的RNA转录物中的反义RNA序列的至少一部分与所述RNA转录物的相应内源性序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％互补。在另一方面，RNA转录物的相应内源性序列与SEQ ID NO:1-3以及5-7中的一者或多者的至少20、至少25、至少30、至少40、至少50、至少75、至少100、至少150、至少200、至少300、至少400、至少500、至少750、或至少1000个连续核苷酸至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％同一。在另一方面，由GA20氧化酶_3突变等位基因中的插入DNA区段编码的反义RNA序列杂交于由所述GA20氧化酶_3突变等位基因产生的RNA转录物的相应内源性序列。在另一方面，由GA20氧化酶_3突变等位基因产生的RNA转录物包含发夹或茎-环结构，所述发夹或茎-环结构包含杂交于所述RNA转录物的相应内源性序列的反义RNA序列。
在一方面，此处提供的GA20氧化酶_3突变等位基因包含具有至少15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、75、100、125、150、175、200、250、300、400、500、750、1000、1500、2000、2500或3000个核苷酸的长度的插入DNA区段。在另一方面，GA20氧化酶_3突变等位基因包含具有至多、小于、或小于或等于25、50、100、150、200、250、300、400、500、750、1000、1500、2000、2500或3000个核苷酸的长度的插入DNA区段。在另一方面，GA20氧化酶_3突变等位基因包含具有在20与25，20与30，20与35，20与40，20与50，50与100，100与200，200与300，300与400，400与500，500与750，750与1000，1000与1500，1500与2000，2000与3000，或3000与4000个核苷酸之间的长度的插入DNA区段。在另一方面，GA20氧化酶_3突变等位基因包含具有在20与4000，50与4000，100与4000，200与4000，300与4000，400与4000，500与4000，750与4000，1000与4000，1500与4000，或2000与4000个核苷酸之间的长度的插入DNA区段。在另一方面，GA20氧化酶_3突变等位基因包含具有在20与100，20与200，20与300，20与400，20与500，20与750，20与1000，20与1500，20与2000，20与3000，或20与4000个核苷酸之间的长度的插入DNA区段。在另一方面，GA20氧化酶_3突变等位基因包含具有在20与3000，50与2000，100与1500，200与1000，300与750，或400与750个核苷酸之间的长度的插入DNA区段。
在一方面，GA20氧化酶_3突变等位基因包含在内源性GA20氧化酶_3基因座或基因的相应内源性DNA区段的附近或邻近处插入的DNA区段。在另一方面，由插入DNA区段编码的反义RNA序列杂交于RNA转录物的由相应内源性DNA区段编码的相应内源性序列。在另一方面，反义RNA序列与RNA转录物的相应内源性序列形成茎-环结构。
在一方面，GA20氧化酶_3突变等位基因包含由间插DNA序列分隔的插入DNA区段和相应内源性DNA区段。在另一方面，间插DNA序列具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、40、50、75、100、150、200、250、300、400、500、750、1000、1500、2000、3000或4000个连续核苷酸的长度。在另一方面，间插序列具有至多、小于、或小于或等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、40、50、75、100、150、200、250、300、400、500、750、1000、1500、2000、3000或4000个连续核苷酸。在另一方面，间插DNA序列具有在2与10，10与20，20与50，50与100，100与200，200与300，300与400，400与500，500与750，750与1000，1000与1500，1500与2000，2000与3000，或3000与4000个核苷酸之间的长度。在另一方面，间插DNA序列具有在2与4000，10与4000，20与4000，50与4000，100与4000，200与4000，300与4000，400与4000，500与4000，750与4000，1000与4000，1500与4000，或2000与4000个核苷酸之间的长度。在另一方面，间插DNA序列具有在10与20，10与50，10与100，10与200，10与300，10与400，10与500，10与750，10与1000，10与1500，10与2000，10与3000，或10与4000个核苷酸之间的长度。在另一方面，间插DNA序列具有在20与3000，50与2000，100与1500，200与1000，300与750，或400与750个核苷酸之间的长度。
在另一方面，间插DNA序列编码在RNA转录物的反义RNA序列与相应内源性序列之间的间插RNA序列。在一方面，间插RNA序列形成由GA20氧化酶_3突变等位基因产生的RNA转录物的茎-环结构的环部分。在另一方面，茎-环二级结构含有具有错配的接近完美的互补序列茎。在另一方面，茎-环二级结构含有不具有错配的完美的互补序列茎。在另一方面，间插DNA序列包含内源性GA20氧化酶_3基因座或基因的天然序列。在一方面，间插DNA序列包含插入至内源性GA20氧化酶_3基因座或基因中的外源性序列。在另一方面，间插DNA序列包含内含子序列。在另一方面，间插DNA序列不含有内含子序列。
在一方面，GA20氧化酶_3突变等位基因包含位于相应内源性DNA区段的上游(5’)的插入DNA区段。在另一方面，GA20氧化酶_3突变等位基因包含位于相应内源性DNA区段的下游(3’)的插入DNA区段。
在一方面，GA20氧化酶_3突变等位基因在选自由以下组成的组的区域内包含插入DNA区段：内源性GA20氧化酶_3基因座或基因的5′非翻译区(UTR)、第1外显子、第1内含子、第2外显子、第2内含子、第3外显子和3′UTR、以及它们的组合。在一方面，GA20氧化酶_3突变等位基因在通过靶向编辑技术识别以创建双链断裂(DSB)的基因组位点处包含插入DNA区段。在一方面，GA20氧化酶_3突变等位基因还包含内源性GA20氧化酶_3基因座或基因的至少一个部分或序列的缺失。
在一方面，GA20氧化酶_3突变等位基因包含插入DNA区段，其中所述插入DNA区段的有义链包含与内源性GA20氧化酶_3或GA20氧化酶_5基因座或基因的外显子序列或其一部分至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％互补的序列。在一方面，GA20氧化酶_3突变等位基因包含插入DNA区段，其中所述插入DNA区段的有义链包含与内源性GA20氧化酶_3或GA20氧化酶_5基因座或基因的内含子序列或其一部分至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％互补的序列。在另一方面，GA20氧化酶_3突变等位基因包含插入DNA区段，其中所述插入DNA区段的有义链包含与内源性GA20氧化酶_3或GA20氧化酶_5基因座或基因的非翻译区(UTR)序列或其一部分至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％互补的序列。在另一方面，GA20氧化酶_3突变等位基因包含插入DNA区段，其中所述插入DNA区段的有义链包含与内源性GA20氧化酶_3或GA20氧化酶_5基因座或基因的外显子序列的至少一部分和内含子序列的至少一部分至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％互补的序列，所述外显子序列和所述内含子序列在内源性基因座或基因内是邻近的。
在一方面，GA20氧化酶_3突变等位基因包含插入DNA区段，所述插入DNA区段包含与SEQ ID NO:13、14、26、28、30、32和36中的一者或多者具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％同一性或互补性的序列。
在一方面，经修饰玉米植物或其植物部分就在内源性GA20氧化酶_3基因座、内源性GA20氧化酶_5基因座、或两者处的一个或多个突变等位基因来说是纯合的。在另一方面，经修饰玉米植物或其植物部分就在内源性GA20氧化酶_3基因座、内源性GA20氧化酶_5基因座、或两者处的一个或多个突变等位基因来说是杂合的。在另一方面，经修饰玉米植物或其植物部分就内源性GA20氧化酶_3基因座、内源性GA20氧化酶_5基因座、或两者的一个或多个等位基因来说是反式杂合的。在另一方面，经修饰玉米植物或其植物部分就在内源性GA20氧化酶_3基因座和内源性GA20氧化酶_5基因座中的一者处的第一突变等位基因来说是杂合的，并且就在内源性GA20氧化酶_3基因座和内源性GA20氧化酶_5基因座的另一基因座处的第二突变等位基因来说是纯合的。
在一方面，本公开提供了一种包含内源性GA20氧化酶_5基因座或基因的突变等位基因的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述突变等位基因包含插入至所述内源性GA20氧化酶_5基因座或基因中的DNA区段，其中所述DNA区段编码与SEQ ID NO:1-3以及5-7中的一者或多者的至少20、至少25、至少30、至少40、至少50、至少75、至少100、至少150、至少200、至少300、至少400、至少500、至少750、或至少1000个连续核苷酸至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％互补的反义RNA序列，并且其中所述突变等位基因产生包含所述反义RNA序列的RNA转录物。在一方面，GA20氧化酶_5突变等位基因能够阻抑内源性GA20氧化酶_3基因座或基因的野生型(或突变)等位基因、内源性GA20氧化酶_5基因座或基因的野生型(或突变)等位基因、或两者的表达。在另一方面，GA20氧化酶_5突变等位基因阻抑内源性GA20氧化酶_3基因座或基因的野生型(或突变)等位基因、内源性GA20氧化酶_5基因座或基因的野生型(或突变)等位基因、或两者的表达。在另一方面，由本文提供的GA20氧化酶_5突变等位基因产生的RNA转录物还包含内源性GA20氧化酶_5基因座或基因的一种或多种选自由以下组成的组的序列元件：5′UTR、第1外显子、第1内含子、第2外显子、第2内含子、第3外显子、3′UTR、以及它们的任何部分。
在一方面，插入至内源性GA20氧化酶_5基因座或基因中的DNA区段包含来源于内源性GA20氧化酶_3基因座或基因的核苷酸序列。在另一方面，GA20氧化酶_5突变等位基因中的插入DNA区段对应于内源性GA20氧化酶_3基因座或基因的倒置基因组片段。在一方面，GA20氧化酶_5突变等位基因中的插入DNA区段包含来源于内源性GA20氧化酶_5基因座或基因的核苷酸序列。在另一方面，GA20氧化酶_5突变等位基因中的插入DNA区段对应于内源性GA20氧化酶_5基因座或基因的倒置基因组片段。
在一方面，由GA20氧化酶_5突变等位基因产生的RNA转录物中的反义RNA序列的至少一部分与所述RNA转录物的相应内源性序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％互补。在另一方面，RNA转录物的相应内源性序列与SEQ ID NO:1-3以及5-7中的一者或多者的至少20、至少25、至少30、至少40、至少50、至少75、至少100、至少150、至少200、至少300、至少400、至少500、至少750、或至少1000个连续核苷酸至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％同一。在另一方面，由GA20氧化酶_5突变等位基因中的插入DNA区段编码的反义RNA序列杂交于由GA20氧化酶_5突变等位基因产生的RNA转录物的相应内源性序列。在另一方面，由GA20氧化酶_3突变等位基因产生的RNA转录物包含发夹或茎-环结构，所述发夹或茎-环结构包含杂交于所述RNA转录物的相应内源性序列的反义RNA序列。
在一方面，此处提供的GA20氧化酶_5突变等位基因包含具有至少15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、75、100、125、150、175、200、250、300、400、500、750、1000、1500、2000、2500或3000个核苷酸的长度的插入DNA区段。在另一方面，GA20氧化酶_5突变等位基因包含具有至多、小于、或小于或等于25、50、100、150、200、250、300、400、500、750、1000、1500、2000、2500或3000个核苷酸的长度的插入DNA区段。在另一方面，GA20氧化酶_5突变等位基因包含具有在20与25，20与30，20与35，20与40，20与50，50与100，100与200，200与300，300与400，400与500，500与750，750与1000，1000与1500，1500与2000，2000与3000，或3000与4000个核苷酸之间的长度的插入DNA区段。在另一方面，GA20氧化酶_5突变等位基因包含具有在20与4000，50与4000，100与4000，200与4000，300与4000，400与4000，500与4000，750与4000，1000与4000，1500与4000，或2000与4000个核苷酸之间的长度的插入DNA区段。在另一方面，GA20氧化酶_5突变等位基因包含具有在20与100，20与200，20与300，20与400，20与500，20与750，20与1000，20与1500，20与2000，20与3000，或20与4000个核苷酸之间的长度的插入DNA区段。在另一方面，GA20氧化酶_5突变等位基因包含具有在20与3000，50与2000，100与1500，200与1000，300与750，或400与750个核苷酸之间的长度的插入DNA区段。
在一方面，GA20氧化酶_5突变等位基因包含在内源性GA20氧化酶_5基因座或基因的相应内源性DNA区段的附近或邻近处插入的DNA区段。在另一方面，由插入DNA区段编码的反义RNA序列杂交于RNA转录物的由相应内源性DNA区段编码的相应内源性序列。在另一方面，反义RNA序列与RNA转录物的相应内源性序列形成茎-环结构。
在一方面，GA20氧化酶_5突变等位基因包含由间插DNA序列分隔的插入DNA区段和相应内源性DNA区段。在另一方面，间插DNA序列具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、40、50、75、100、150、200、250、300、400、500、750、1000、1500、2000、3000或4000个连续核苷酸的长度。在另一方面，间插序列具有至多、小于、或小于或等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、40、50、75、100、150、200、250、300、400、500、750、1000、1500、2000、3000或4000个连续核苷酸。在另一方面，间插DNA序列具有在2与10，10与20，20与50，50与100，100与200，200与300，300与400，400与500，500与750，750与1000，1000与1500，1500与2000，2000与3000，或3000与4000个核苷酸之间的长度。在另一方面，间插DNA序列具有在2与4000，10与4000，20与4000，50与4000，100与4000，200与4000，300与4000，400与4000，500与4000，750与4000，1000与4000，1500与4000，或2000与4000个核苷酸之间的长度。在另一方面，间插DNA序列具有在10与20，10与50，10与100，10与200，10与300，10与400，10与500，10与750，10与1000，10与1500，10与2000，10与3000，或10与4000个核苷酸之间的长度。在另一方面，间插DNA序列具有在20与3000，50与2000，100与1500，200与1000，300与750，或400与750个核苷酸之间的长度。
在另一方面，间插DNA序列编码在RNA转录物的反义RNA序列与相应内源性序列之间的间插RNA序列。在一方面，间插RNA序列形成由GA20氧化酶_5突变等位基因产生的RNA转录物的茎-环结构的环部分。在另一方面，茎-环二级结构含有具有错配的接近完美的互补序列茎。在另一方面，茎-环二级结构含有不具有错配的完美的互补序列茎。在另一方面，间插DNA序列包含内源性GA20氧化酶_5基因座或基因的天然序列。在一方面，间插DNA序列包含插入至内源性GA20氧化酶_5基因座或基因中的外源性序列。在另一方面，间插DNA序列包含内含子序列。在另一方面，间插DNA序列不含有内含子序列。
在一方面，GA20氧化酶_5突变等位基因包含位于相应内源性DNA区段的上游(5’)的插入DNA区段。在另一方面，GA20氧化酶_5突变等位基因包含位于相应内源性DNA区段的下游(3’)的插入DNA区段。
在一方面，GA20氧化酶_5突变等位基因在选自由以下组成的组的区域内包含插入DNA区段：内源性GA20氧化酶_5基因座或基因的5′非翻译区(UTR)、第1外显子、第1内含子、第2外显子、第2内含子、第3外显子和3′UTR、以及它们的组合。在一方面，GA20氧化酶_5突变等位基因在通过靶向编辑技术识别以创建双链断裂(DSB)的基因组位点处包含插入DNA区段。在一方面，GA20氧化酶_5突变等位基因还包含内源性GA20氧化酶_5基因座或基因的至少一个部分或序列的缺失。
在一方面，GA20氧化酶_5突变等位基因包含插入DNA区段，其中所述插入DNA区段的有义链包含与内源性GA20氧化酶_3或GA20氧化酶_5基因座或基因的外显子序列或其一部分至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％互补的序列。在一方面，GA20氧化酶_5突变等位基因包含插入DNA区段，其中所述插入DNA区段的有义链包含与内源性GA20氧化酶_3或GA20氧化酶_5基因座或基因的内含子序列或其一部分至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％互补的序列。在另一方面，GA20氧化酶_5突变等位基因包含插入DNA区段，其中所述插入DNA区段的有义链包含与内源性GA20氧化酶_3或GA20氧化酶_5基因座或基因的非翻译区(UTR)序列或其一部分至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％互补的序列。在另一方面，GA20氧化酶_5突变等位基因包含插入DNA区段，其中所述插入DNA区段的有义链包含与内源性GA20氧化酶_3或GA20氧化酶_5基因座或基因的外显子序列的至少一部分和内含子序列的至少一部分至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％互补的序列，所述外显子序列和所述内含子序列在内源性基因座或基因内是邻近的。
在一方面，GA20氧化酶_5突变等位基因包含插入DNA区段，所述插入DNA区段包含与SEQ ID NO:13、14、26、28、30、32和36中的一者或多者具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％同一性或互补性的序列。
在一方面，本公开提供了一种用于产生内源性GA20氧化酶_3或GA20氧化酶_5基因座或基因的突变等位基因的方法，所述方法包括：(a)使用靶向编辑技术在玉米细胞中的所述内源性GA20氧化酶_3或GA20氧化酶_5基因座或基因中产生双链断裂(DSB)；以及(b)在所述DSB处将DNA区段插入至所述内源性GA20氧化酶_3或GA20氧化酶_5基因座或基因中，其中所述DNA区段编码与SEQ ID NO:1-3以及5-7中的一者或多者的至少20、至少25、至少30、至少40、至少50、至少75、至少100、至少150、至少200、至少300、至少400、至少500、至少750、或至少1000个连续核苷酸至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％互补的反义RNA序列，并且其中所述内源性GA20氧化酶_3基因座或基因的所述突变等位基因产生包含所述反义RNA序列的RNA转录物。在另一方面，方法还包括从玉米细胞再生或发育成玉米植物。
在一方面，本公开提供了一种用于产生内源性GA20氧化酶_5基因座的突变等位基因的方法，所述方法包括：(a)使用靶向编辑技术在玉米细胞中的所述内源性GA20氧化酶_5基因座中产生第一双链断裂和第二双链断裂；(b)在所述第一双链断裂与所述第二双链断裂之间插入DNA区段，其中所述DNA区段编码与SEQ ID NO:1-3以及5-7中的一者或多者的至少20、至少25、至少30、至少40、至少50、至少75、至少100、至少150、至少200、至少300、至少400、至少500、至少750、或至少1000个连续核苷酸至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％互补的反义RNA序列，并且其中所述内源性GA20氧化酶_5基因座的所述突变等位基因产生包含所述反义RNA序列的RNA转录物。
在一方面，本公开提供了一种用于产生内源性GA20氧化酶_3基因座的突变等位基因的方法，所述方法包括：(a)使用靶向编辑技术在玉米细胞中的所述内源性GA20氧化酶_3基因座中产生第一双链断裂和第二双链断裂；(b)在所述第一双链断裂与所述第二双链断裂之间插入DNA区段，其中所述DNA区段编码与SEQ ID NO:1-3以及5-7中的一者或多者的至少20、至少25、至少30、至少40、至少50、至少75、至少100、至少150、至少200、至少300、至少400、至少500、至少750、或至少1000个连续核苷酸至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％互补的反义RNA序列，并且其中所述内源性GA20氧化酶_3基因座的所述突变等位基因产生包含所述反义RNA序列的RNA转录物。
在一方面，本文所用的靶向编辑技术包括使用至少一种位点特异性核酸酶。在一方面，位点特异性核酸酶选自由以下组成的组：锌指核酸酶、兆碱基大范围核酸酶、RNA引导的核酸酶、TALE-核酸酶、重组酶、转座酶、以及它们的任何组合。在另一方面，位点特异性核酸酶是选自由Cas9核酸酶或其变体以及Cpf1核酸酶或其变体组成的组的RNA引导的核酸酶。
在一方面，本文提供的方法向内源性GA20氧化酶_3或GA20氧化酶_5基因座或基因中插入来源于内源性GA20氧化酶_3基因座或基因或内源性GA20氧化酶_5基因座或基因的DNA区段。在另一方面，在供体模板中提供插入DNA区段。在另一方面，通过从另一染色体位置(例如反式片段模板)切除DNA区段提供插入DNA区段。
根据其他实施方案，提供了用于用编码一种或多种为靶向基因组编辑所需的分子(例如一种或多种引导RNA和/或一种或多种定点核酸酶)的重组DNA分子或构建体转化植物细胞、组织或外植体的方法。用于用重组DNA分子或构建体转化植物细胞中的染色体或质体的众多方法在本领域中是已知的，所述众多方法可根据本发明的方法实施方案使用以产生转基因植物细胞和植物。本领域中已知的用于转化植物细胞的任何适合方法或技术都可根据本发明方法加以使用。用于转化植物的有效方法包括细菌介导的转化诸如土壤杆菌介导或根瘤菌(Rhizobium)介导的转化、以及微粒或粒子轰击介导的转化。用于通过细菌介导的转化或微粒或粒子轰击来用转化载体转化外植体，接着随后对那些外植体进行培养等以再生或发育成转基因植物的多种方法在本领域中是已知的。用于植物转化的其他方法，诸如显微注射、电穿孔、真空渗入、加压、声波处理、碳化硅纤维搅拌、PEG介导的转化等，在本领域中也是已知的。
转化植物细胞和外植体的方法为本领域普通技术人员所熟知。用于通过微粒轰击用经重组DNA包被的粒子转化植物细胞的方法例如提供在美国专利第5,550,318；5,538,880 6,160,208；6,399,861；和6,153,812号中，并且土壤杆菌介导的转化例如描述于美国专利第5,159,135；5,824,877；5,591,616；6,384,301；5,750,871；5,463,174；和5,188,958号中，所述专利全都通过引用并入本文。用于转化植物的额外方法可例如见于Compendiumof Transgenic Crop Plants(2009)Blackwell Publishing中。本领域中已知或以后开发的任何适合植物转化方法都可用于用本文提供的任何核酸分子、构建体或载体转化植物细胞或外植体。
用于转化的一种或多种接受细胞或外植体或细胞靶标包括但不限于种子细胞、果实细胞、叶细胞、子叶细胞、下胚轴细胞、分生组织细胞、胚细胞、胚乳细胞、根细胞、嫩芽细胞、茎细胞、荚细胞、花细胞、花序细胞、柄细胞、花梗细胞、花柱细胞、柱头细胞、花托细胞、花瓣细胞、萼片细胞、花粉细胞、花药细胞、花丝细胞、子房细胞、胚珠细胞、果皮细胞、韧皮部细胞、芽细胞、愈伤组织细胞、叶绿体、气孔细胞、毛状体细胞、根毛细胞、贮藏根细胞或维管组织细胞、种子、胚、分生组织、子叶、下胚轴、胚乳、根、嫩芽、茎、节、愈伤组织、细胞悬液、原生质体、花、叶、花粉、花药、子房、胚珠、果皮、芽和/或维管组织、或前述各物中的任一者的任何可转化部分。对于植物转化，可用于接受本公开的重组DNA转化载体或分子的任何一种或多种靶标细胞、组织、外植体等都可被总称为用于转化的“外植体”。优选地，可使可转化或经转化外植细胞或组织进一步发育或再生成植物。可育植物可从其生长或再生的任何细胞或外植体都被考虑为用于实施本公开的有用接受细胞或外植体(即为用于转化的靶标外植体)。愈伤组织可从各种组织来源创始或创建，包括但不限于胚或胚的部分、非胚种子组织、幼苗顶端分生组织、小孢子等。能够增殖成愈伤组织的任何细胞都可充当用于转化的接受细胞。用于制备转基因植物的转化方法和材料(例如各种培养基和接受靶标细胞或外植体以及转化和后续再生成为转基因植物的方法)在本领域中是已知的。
靶标植物材料或外植体的转化或编辑可在于营养培养基上进行的组织培养中实施，所述营养培养基例如是允许细胞在体外生长或允许进行细胞培养的营养物的混合物。经修饰外植体、细胞或组织可经受如本领域中已知的额外培养步骤，诸如愈伤组织诱导、选择、再生等。转化或编辑还可在不创建或使用愈伤组织的情况下进行。可根据本领域中已知的方法，使含有DNA序列插入或编辑的经转化或经编辑细胞、组织或外植体在培养基、穴盘或土壤中生长、发育或再生成转基因植物。经修饰植物可进一步与它们自身或其他植物杂交以产生经修饰植物种子和子代。经修饰植物还可通过使包含DNA序列或构建体或编辑(例如反义序列或倒位)的第一植物与缺乏插入的第二植物杂交制备。举例来说，可将DNA序列或倒位引入至可经受转化或编辑的第一植物株系中，可接着使所述第一植物株系与第二植物株系杂交以将所述DNA序列或编辑(例如倒位)渗入至所述第二植物株系中。这些杂种的子代可进一步与合乎需要的株系多次回交，诸如通过6至8代或6至8次回交，以产生与原始亲本株系具有大致上相同基因型，但引入了DNA序列或编辑的子代植物。
在一方面，本公开提供了一种用于产生玉米植物的方法，所述方法包括：(a)用来自雄性玉米植物的花粉对至少一个雌性玉米植物进行受精，其中所述雌性玉米植物和/或所述雄性玉米植物包含如本文提供的内源性GA20氧化酶基因座或基因的突变(例如经编辑)等位基因，其中所述突变等位基因包含插入至所述内源性GA20氧化酶基因座中的DNA区段，其中所述DNA区段编码与SEQ ID NO:1-3或5-7中的一者或多者的至少20、至少25、至少30、至少40、至少50、至少75、至少100、至少150、至少200、至少300、至少400、至少500、至少750、或至少1000个连续核苷酸至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％互补的反义RNA序列，并且其中所述内源性GA20氧化酶基因座的所述突变等位基因产生包含所述反义RNA序列的RNA转录物；以及(b)获得至少一个通过步骤(a)的所述受精产生的种子。根据一方面，步骤(b)中的至少一个种子包含来自雌性玉米植物的内源性GA20氧化酶基因座或基因的突变等位基因。在另一方面，方法还包括(c)使在步骤(b)中获得的至少一个种子生长以产生至少一个包含所述突变等位基因的子代玉米植物。在一方面，在步骤(c)中获得的至少一个子代玉米植物就突变等位基因来说是杂合的或纯合的。根据一些方面，此类方法可包括(d)选择至少一个包含突变等位基因的子代玉米植物，此可包括选择至少一个就突变等位基因来说是纯合的或杂合的子代玉米植物。
在一方面，雌性玉米植物就突变等位基因来说是纯合的。在另一方面，雌性玉米植物就突变等位基因来说是杂合的。在一方面，雄性玉米植物缺乏突变等位基因。在一方面，雄性玉米植物就突变等位基因来说是杂合的。在一方面，雄性玉米植物就突变等位基因来说是纯合的。在一方面，相对于缺乏突变等位基因的对照植物，至少一个子代玉米植物具有更矮的植物高度和/或改善的倒伏抗性。在一方面，相对于雄性或雌性玉米植物，至少一个子代玉米植物具有更矮的植物高度和/或改善的倒伏抗性。在一方面，雌性玉米植物是近交玉米植物。在一方面，雌性玉米植物是杂交玉米植物。在一方面，雄性玉米植物是近交玉米植物。在一方面，雄性玉米植物是杂交玉米植物。在一方面，雌性玉米植物是优良玉米植物株系。在一方面，雄性玉米植物是优良玉米植物株系。在一方面，雌性玉米植物是第一近交玉米株系或品种，并且雄性玉米植物是不同的第二近交玉米株系或品种。在一方面，使雌性玉米植物和雄性玉米植物在温室或生长室中生长。在一方面，使雌性玉米植物和雄性玉米植物在户外或在田地中生长。在一方面，雌性玉米植物已去雄。在一方面，雌性玉米植物是细胞质雄性不育玉米植物。
如本文所用，“去雄”玉米是指其中已移除产生花粉的花或雄穗的玉米。去雄通常在雄穗可脱落花粉之前进行。去雄可通过机器去雄、手工去雄、或机器去雄与手工去雄两者的组合实现。去雄可将玉米植物的顶叶连同发育中的雄穗一起移除。去雄玉米植物保留它们的雌花，所述雌花可由来自另一玉米植物的花粉授粉，并且最终在穗上产生籽粒。在一方面，本文提供的玉米植物是去雄玉米植物。
作为化学处理的替代方案，可通过导致细胞质雄性不育的遗传杂交和遗传来使玉米植物(或雌性玉米植物)雄性不育。如本文所用，术语“细胞质雄性不育”或“CMS”是指其中玉米植物部分地或完全地不能产生功能性花粉的状况。如本领域中所知，细胞质雄性不育是一种通常与线粒体基因组内的导致细胞质功能异常的异常开放阅读框相关的母系遗传性状。在一方面，本文提供的玉米植物或雌性玉米植物是细胞质雄性不育玉米植物。
本文提供的经修饰植物、植物部分、细胞或外植体可属于优良品种或优良株系。优良品种或优良株系是指已由育种以及选择优越农艺学性能所产生的品种。本文提供的经修饰(例如经编辑)植物、细胞或外植体可为杂交植物、细胞或外植体。如本文所用，“杂种”通过使来自不同品种、株系、近交系或物种的两个植物杂交，以致子代包含来自每个亲本的遗传物质来创建。熟练技术人员认识到也可产生更高级杂种。举例来说，可通过使品种A与品种B杂交以创建A x B杂种来制备第一杂种，并且可通过使品种C与品种D杂交以创建C x D杂种来制备第二杂种。第一杂种和第二杂种可进一步杂交以创建包含来自全部四个亲本品种的遗传信息的更高级杂种(A x B)x(C x D)。
本公开的转化载体或构建体中的植物可选择标记转基因可用于辅助由于存在选择剂诸如抗生素或除草剂而达成的对经转化细胞或组织的选择，其中所述植物可选择标记转基因提供对所述选择剂的耐受性或抗性。因此，选择剂可偏向于或有利于表达植物可选择标记基因的经转化细胞的存活、发育、生长、增殖等，诸如以增加R0植物中经转化细胞或组织的比例。通常使用的植物可选择标记基因包括例如赋予对抗生素诸如卡那霉素(kanamycin)和巴龙霉素(paromomycin)(nptII)、潮霉素B(hygromycin B)(aph IV))、链霉素(streptomycin)或壮观霉素(spectinomycin)(aadA)和庆大霉素(gentamycin)(aac3和aacC4)的耐受性或抗性的那些，或赋予对除草剂诸如草铵膦(glufosinate)(bar或pat)、麦草畏(dicamba)(DMO)和草甘膦(glyphosate)(aroA或EPSPS)的耐受性或抗性的那些。还可使用提供目视筛选转化子的能力的植物可筛选标记基因，诸如荧光素酶或绿色荧光蛋白(GFP)、或表达其各种显色底物是已知的β葡萄糖醛酸苷酶的基因或uidA基因(GUS)。在一些实施方案中，本文提供的载体或多核苷酸包含至少一种选自由以下组成的组的可选择标记基因：nptII、aph IV、aadA、aac3、aacC4、bar、pat、DMO、EPSPS、aroA、GFP和GUS。植物转化还可在不存在选择下在培养经转化外植体、组织、植物和/或植物部分，使经转化外植体、组织、植物和/或植物部分发育或再生的一个或多个步骤或阶段期间进行。
根据本发明实施方案，用于用重组DNA分子或构建体转化植物细胞、组织或外植体的方法还可包括定点或靶向整合。根据这些方法，重组DNA供体模板分子的一部分(即插入序列)可插入或整合在植物基因组内的所需位点或基因座处。供体模板的插入序列可包含转基因或构建体，诸如编码靶向内源性GA氧化酶基因以达成阻抑的反义RNA序列的目标转基因或可转录DNA序列。供体模板还可具有一个或两个侧接于插入序列以通过同源性重组和/或同源性引导的修复来促进靶向插入事件的同源臂。每个同源臂可与单子叶植物或谷类植物(例如玉米植物)的基因组内靶标DNA序列的至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少150、至少200、至少250、至少500、至少1000、至少2500、或至少5000个连续核苷酸至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％同一或互补。因此，本公开的重组DNA分子可包含用于将转基因或构建体定点或靶向整合至植物的基因组中的供体模板，所述转基因或构建体诸如是编码靶向内源性GA氧化酶基因以达成阻抑的反义RNA序列的目标转基因或可转录DNA序列。在一方面，本公开提供了一种包含一种或多种供体模板的重组DNA构建体。在一方面，可使用本领域中已知的任何植物转化技术将包含一种或多种供体模板的重组DNA构建体引入至本文提供的植物细胞、植物组织或植物部分。
植物的基因组内的任何位点或基因座都可潜在地被选择用于定点整合本文提供的转基因、构建体或可转录DNA序列。对于定点整合，可首先用位点特异性核酸酶在所选基因组基因座处产生双链断裂(DSB)或切口，所述位点特异性核酸酶诸如像锌指核酸酶、经工程改造或天然兆碱基大范围核酸酶、TALE-核酸内切酶、或RNA引导的核酸内切酶(例如Cas9或Cpf1)。可使用本领域中已知的用于定点整合的任何方法。在具有插入序列的供体模板分子存在下，DSB或切口可接着通过供体模板的一个或多个同源臂与植物基因组之间的同源性重组，或通过非同源性末端接合(NHEJ)来修复，从而导致所述插入序列定点整合至植物基因组中以在DSB或切口的位点处创建靶向插入事件。因此，可实现转基因、构建体或序列的位点特异性插入或整合。
本文提供的位点特异性核酸酶可选自由以下组成的组：锌指核酸酶(ZFN)、兆碱基大范围核酸酶、RNA引导的核酸内切酶、TALE-核酸内切酶(TALEN)、重组酶、转座酶、或它们的任何组合。参见例如Khandagale,K.等人,“Genome editing for targeted improvementin plants,”Plant Biotechnol Rep 10:327-343(2016)；以及Gaj,T.等人,“ZFN,TALENand CRISPR/Cas-based methods for genome engineering,”Trends Biotechnol.31(7):397-405(2013)，所述文献的内容和公开内容通过引用并入本文。重组酶可为连接于DNA识别基序的丝氨酸重组酶、连接于DNA识别基序的酪氨酸重组酶或本领域中已知的其他重组酶。重组酶或转座酶可为连接于DNA结合结构域的DNA转座酶或重组酶。连接于DNA识别基序的酪氨酸重组酶可选自由以下组成的组：Cre重组酶、Flp重组酶和Tnp1重组酶。根据一些实施方案，本文提供的Cre重组酶或Gin重组酶栓系于锌指DNA结合结构域。在另一实施方案中，本文提供的连接于DNA识别基序的丝氨酸重组酶选自由以下组成的组：PhiC31整合酶、R4整合酶和TP-901整合酶。在另一实施方案中，本文提供的连接于DNA结合结构域的DNA转座酶选自由以下组成的组：TALE-piggyBac和TALE-Mutator。
根据本公开的实施方案，RNA引导的核酸内切酶可选自由以下组成的组：Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也被称为Csn1和Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、Cpf1、CasX、CasY、以及它们的同源物或经修饰形式、Argonaute(Argonaute蛋白的非限制性实例包括嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)Argonaute(TtAgo)、激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)Argonaute(PfAgo)、格氏嗜盐碱杆菌(Natronobacterium gregoryi)Argonaute(NgAgo))及其同源物或经修饰形式。根据一些实施方案，RNA引导的核酸内切酶可为Cas9或Cpf1(或Cas12a)酶。
在一方面，本文提供的位点特异性核酸酶选自由以下组成的组：锌指核酸酶、兆碱基大范围核酸酶、RNA引导的核酸酶、TALE-核酸酶、重组酶、转座酶、或它们的任何组合。在另一方面，本文提供的位点特异性核酸酶选自由Cas9或Cpf1(或Cas12a)组成的组。在另一方面，本文提供的位点特异性核酸酶选自由以下组成的组：Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、Cpf1、CasX、CasY、它们的同源物、或它们的经修饰形式。在另一方面，本文提供的RNA引导的核酸酶选自由Cas9或Cpf1(或Cas12a)组成的组。在另一方面，本文提供的RNA引导的核酸酶选自由以下组成的组：Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、Cpf1、CasX、CasY、它们的同源物、或它们的经修饰形式。在另一方面，本文提供的方法和/或组合物包括至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、或至少十种位点特异性核酸酶。在另一方面，本文提供的方法和/或组合物包括至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、或至少十种编码至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、或至少十种位点特异性核酸酶的多核苷酸。
对于RNA引导的核酸内切酶，还提供了引导RNA(gRNA)分子以通过碱基配对或杂交将核酸内切酶导向至植物的基因组中的靶标位点以在所述靶标位点处或附近导致DSB或切口。gRNA可以gRNA分子形式，或以包含可操作地连接于植物可表达启动子的编码引导RNA的可转录DNA序列的重组DNA分子、构建体或载体形式转化或引入至植物细胞或组织中(也许连同核酸酶或核酸酶编码DNA分子、构建体或载体一起)。如本领域中所了解，“引导RNA”可包括例如CRISPR RNA(crRNA)、单链引导RNA(sgRNA)、或可将核酸内切酶引导或导向至基因组中特定靶标位点的任何其他RNA分子。“单链引导RNA”(或“sgRNA”)是包含由接头序列共价连接于tracrRNA的crRNA的RNA分子，其可表达为单一RNA转录物或分子。引导RNA包含与植物基因组内的诸如在GA氧化酶基因处或附近的靶标位点同一或互补的引导或靶向序列。如本领域中所知，原间隔体邻近基序(PAM)可与互补于引导RNA的靶向序列的基因组靶标位点序列的5′末端紧邻并且在其上游–即紧邻基因组靶标位点(与引导RNA的靶向序列有关)的有义(+)链的下游(3′)来存在于基因组中。参见例如Wu,X.等人,“Target specificityof the CRISPR-Cas9 system,”Quant Biol.2(2):59-70(2014)，所述文献的内容和公开内容通过引用并入本文。有义(+)链上邻近于靶标位点(与引导RNA的靶向序列有关)的基因组PAM序列可包括5′-NGG-3′。然而，引导RNA的相应序列(即紧邻引导RNA的靶向序列的下游(3′))可通常不互补于基因组PAM序列。引导RNA可通常是不编码蛋白质的非编码RNA分子。引导RNA的引导序列在长度方面可为至少10个核苷酸，诸如在长度方面可为12-40个核苷酸、12-30个核苷酸、12-20个核苷酸、12-35个核苷酸、12-30个核苷酸、15-30个核苷酸、17-30个核苷酸、或17-25个核苷酸，或在长度方面可为约12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或更多个核苷酸。引导序列可在基因组靶标位点处与DNA序列的至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25个或更多个连续核苷酸至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％同一或互补。
根据一些实施方案，重组DNA构建体或载体可包含可通过植物转化技术一起引入至植物细胞中的编码位点特异性核酸酶的第一多核苷酸序列和编码引导RNA的第二多核苷酸序列。或者，可提供可通过植物转化技术一起或依序引入至植物细胞中的两种重组DNA构建体或载体，包括第一重组DNA构建体或载体和第二DNA构建体或载体，其中所述第一重组DNA构建体或载体包含编码位点特异性核酸酶的多核苷酸序列，并且所述第二重组DNA构建体或载体包含编码引导RNA的多核苷酸序列。根据一些实施方案，包含编码位点特异性核酸酶的多核苷酸序列的重组DNA构建体或载体可通过植物转化技术引入至已包含含有编码引导RNA的多核苷酸序列的重组DNA构建体或载体(或用含有编码引导RNA的多核苷酸序列的重组DNA构建体或载体转化)的植物细胞中。或者，包含编码引导RNA的多核苷酸序列的重组DNA构建体或载体可通过植物转化技术引入至已包含含有编码位点特异性核酸酶的多核苷酸序列的重组DNA构建体或载体(或用含有编码位点特异性核酸酶的多核苷酸序列的重组DNA构建体或载体转化)的植物细胞中。根据其他实施方案，可使包含含有编码位点特异性核酸酶的多核苷酸序列的重组DNA构建体或载体(或用含有编码位点特异性核酸酶的多核苷酸序列的重组DNA构建体或载体转化)的第一植物与包含含有编码引导RNA的多核苷酸序列的重组DNA构建体或载体(或用含有编码引导RNA的多核苷酸序列的重组DNA构建体或载体转化)的第二植物杂交。在一方面，重组DNA构建体或载体可短暂转化至植物细胞中，或稳定转化或整合至植物细胞的基因组中。
在一方面，通过本领域中已知的转化方法(例如不限于粒子轰击、PEG介导的原生质体转染或土壤杆菌介导的转化)对植物细胞提供包含编码位点特异性核酸酶以及任选的一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、或四种或更多种gRNA的多核苷酸的载体。在一方面，通过本领域中已知的转化方法(例如不限于粒子轰击、PEG介导的原生质体转染或土壤杆菌介导的转化)对植物细胞提供包含编码Cas9核酸酶以及任选的一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、或四种或更多种gRNA的多核苷酸的载体。在另一方面，通过本领域中已知的转化方法(例如不限于病毒转染、粒子轰击、PEG介导的原生质体转染或土壤杆菌介导的转化)对细胞提供包含编码Cpf1以及任选的一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、或四种或更多种crRNA的多核苷酸的载体。
若干位点特异性核酸酶诸如重组酶、锌指核酸酶(ZFN)、兆碱基大范围核酸酶和TALEN不是RNA引导的，而是依赖于它们的蛋白质结构确定它们的靶标位点以导致DSB或切口，或它们被融合、栓系或连接于DNA结合蛋白结构域或基序。位点特异性核酸酶的蛋白质结构(或融合/连接/栓系的DNA结合结构域)可使位点特异性核酸酶靶向至靶标位点。根据这些实施方案中的许多，可根据已知方法设计、工程改造和构建非RNA引导的位点特异性核酸酶诸如重组酶、锌指核酸酶(ZFN)、兆碱基大范围核酸酶和TALEN，以靶向和结合在玉米植物的内源性GA氧化酶基因诸如玉米中的GA20氧化酶_3基因或GA20氧化酶_5基因的基因组基因座处或附近的靶标位点，从而在此基因组基因座处创建DSB或切口以通过对所述DSB或切口的修复来剔除或敲低所述GA氧化酶基因的表达。举例来说，可设计经工程改造位点特异性核酸酶诸如重组酶、锌指核酸酶(ZFN)、兆碱基大范围核酸酶或TALEN以靶向和结合(i)植物的基因组内对应于SEQ ID NO:1或它的互补性序列内的序列的靶标位点，以在GA20氧化酶_3基因的基因组基因座处创建DSB或切口，或(ii)植物的基因组内对应于SEQ ID NO:5或它的互补性序列内的序列的靶标位点，以在GA20氧化酶_5基因的基因组基因座处创建DSB或切口，此可接着导致通过可由供体分子或模板引导的细胞修复机制来在所述DSB或切口的位点处创建序列的突变或插入。
在一方面，本文所述的靶向基因组编辑技术可包括使用重组酶。在一些实施方案中，与DNA识别结构域或基序进行连接等的酪氨酸重组酶可选自由以下组成的组：Cre重组酶、Flp重组酶和Tnp1重组酶。在一方面，本文提供的Cre重组酶或Gin重组酶可栓系于锌指DNA结合结构域。Flp-FRT定点重组系统可来自从面包酵母酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)获得的2μ质粒。在这个系统中，Flp重组酶(flippase)可使flippase识别靶标(FRT)位点之间的序列重组。FRT位点包含34个核苷酸。Flp可结合FRT位点的“臂”(一个臂处于相反定向)，并且在间插核酸序列的任一末端裂解FRT位点。在裂解之后，Flp可使两个FRT位点之间的核酸序列重组。Cre-lox是一种源于噬菌体P1的与Flp-FRT重组系统类似的定点重组系统。Cre-lox可用于使核酸序列倒置，缺失核酸序列，或使核酸序列易位。在这个系统中，Cre重组酶可使一对lox核酸序列重组。Lox位点包含34个核苷酸，其中前13个核苷酸和后13个核苷酸(臂)是回文的。在重组期间，Cre重组酶蛋白结合在不同核酸上的两个lox位点，并且在lox位点处进行裂解。经裂解核酸被剪接在一起(相互易位)，于是重组完成。在另一方面，本文提供的lox位点是loxP、lox 2272、loxN、lox511、lox 5171、lox71、lox66、M2、M3、M7或M11位点。
ZFN是由融合于裂解结构域(或裂解半部结构域)的经工程改造锌指DNA结合结构域组成的合成蛋白质，所述裂解结构域可源于限制核酸内切酶(例如FokI)。DNA结合结构域可为典型的(C2H2)或非典型的(例如C3H或C4)。视靶标位点而定，DNA结合结构域可包含一个或多个锌指(例如2、3、4、5、6、7、8、9个或更多个锌指)。DNA结合结构域中的多个锌指可由一个或多个接头序列分隔。通过修饰锌指DNA结合结构域，ZFN可被设计来裂解双链DNA的几乎任何链段。ZFN从由融合于DNA结合结构域的非特异性DNA裂解结构域(例如源于FokI核酸酶)组成的单体形成二聚体，所述DNA结合结构域包含被工程改造来结合靶标位点DNA序列的锌指阵列。ZFN的DNA结合结构域可通常由3-4个(或更多个)锌指组成。可改变和定制相对于锌指α螺旋的起点在位置-1、+2、+3和+6处的促进与靶标位点的位点特异性结合的氨基酸以适应特定靶标序列。其他氨基酸可形成共有骨架以产生具有不同序列特异性的ZFN。用于设计ZFN以靶向和结合特定靶标序列的方法和规则在本领域中是已知的。参见例如美国专利申请第2005/0064474、2009/0117617和2012/0142062号，所述美国专利申请的内容和公开内容通过引用并入本文。FokI核酸酶结构域可需要二聚化来裂解DNA，因此，需要两个具有它们的C末端区域的ZFN来结合裂解位点的相对DNA链(分隔5-7bp)。如果两个ZF结合位点是回文的，那么ZFN单体可切割靶标位点。如本文所用的ZFN是广泛的，并且包括可在无来自另一ZFN的辅助下裂解双链DNA的单体ZFN。术语ZFN还可用于指代被工程改造来一起在相同位点处起裂解DNA的作用的一对ZFN中的一个或两个成员。
在不受任何科学理论限制的情况下，因为可使用各种方法中的一者对锌指结构域的DNA结合特异性进行再工程改造，所以可在理论上构建定制ZFN以靶向几乎任何靶标序列(例如在植物基因组中的GA氧化酶基因处或附近)。可公开获得的用于对锌指结构域进行工程改造的方法包括情形依赖性装配(CoDA)、寡聚库工程改造(OPEN)和模块装配。在一方面，本文提供的方法和/或组合物包括一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、或五种或更多种ZFN。在另一方面，本文提供的ZFN能够产生靶向DSB或切口。在一方面，通过本领域中已知的转化方法(例如不限于病毒转染、粒子轰击、PEG介导的原生质体转染、或土壤杆菌介导的转化)对细胞提供包含编码一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、或五种或更多种ZFN的多核苷酸的载体。ZFN可以ZFN蛋白形式，以编码ZFN蛋白的多核苷酸形式，以及/或者以蛋白质和编码蛋白质的多核苷酸的组合形式引入。
通常在微生物中鉴定的兆碱基大范围核酸酶，诸如归巢核酸内切酶的LAGLIDADG家族，是导致对靶标DNA的位点特异性消化的具有高活性和长识别序列(>14bp)的独特酶。天然存在的兆碱基大范围核酸酶的经工程改造形式通常具有延长的DNA识别序列(例如14至40bp)。根据一些实施方案，兆碱基大范围核酸酶可包含选自由以下组成的组的骨架或基础酶：I-CreI、I-CeuI、I-MsoI、I-SceI、I-AniI和I-DmoI。相比于ZFN和TALEN，兆碱基大范围核酸酶的工程改造可更具挑战，因为兆碱基大范围核酸酶的DNA识别功能和裂解功能缠结在单一结构域中。专门化诱变和高通量筛选方法已用于创建识别独特序列，并且具有改善的核酸酶活性的新型兆碱基大范围核酸酶变体。因此，可选择或工程改造兆碱基大范围核酸酶以结合植物中的基因组靶标序列，诸如在GA氧化酶基因的基因组基因座处或附近。在一方面，本文提供的方法和/或组合物包括一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、或五种或更多种兆碱基大范围核酸酶。在另一方面，本文提供的兆碱基大范围核酸酶能够产生靶向DSB。在一方面，通过本领域中已知的转化方法(例如不限于病毒转染、粒子轰击、PEG介导的原生质体转染或土壤杆菌介导的转化)对细胞提供包含编码一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、或五种或更多种兆碱基大范围核酸酶的多核苷酸的载体。
TALEN是通过使转录活化子样效应物(TALE)DNA结合结构域融合于核酸酶结构域(例如FokI)来产生的人工限制酶。当一对TALEN的每个成员结合侧接于靶标位点的DNA位点时，FokI单体二聚化，并且在所述靶标位点处导致双链DNA断裂。除野生型FokI裂解结构域之外，FokI裂解结构域的具有突变的变体已被设计来改善裂解特异性和裂解活性。FokI结构域以二聚体形式起作用，从而需要两个具有适当定向和间隔的具有针对靶标基因组中的位点的独特DNA结合结构域的构建体。TALEN DNA结合结构域与FokI裂解结构域之间的氨基酸残基的数目与两个单独TALEN结合位点之间的碱基的数目两者均是用于实现高活性水平的参数。
TALEN是通过使转录活化子样效应物(TALE)DNA结合结构域融合于核酸酶结构域来产生的人工限制酶。在一些方面，核酸酶选自由以下组成的组：PvuII、MutH、TevI、FokI、AlwI、MlyI、SbfI、SdaI、StsI、CleDORF、Clo051和Pept071。当一对TALEN的每个成员结合侧接于靶标位点的DNA位点时，FokI单体二聚化，并且在所述靶标位点处导致双链DNA断裂。如本文所用的术语TALEN是广泛的，并且包括可在无来自另一TALEN的辅助下裂解双链DNA的单体TALEN。术语TALEN还指一起在相同位点处起裂解DNA的作用的一对TALEN中的一个或两个成员。
转录活化子样效应物(TALE)可被工程改造来结合实际上任何DNA序列，诸如在植物中的GA氧化酶基因的基因组基因座处或附近。TALE具有由13-28个具有33-34个氨基酸的重复单体组成的中心DNA结合结构域。除在位置12和13处的高变氨基酸残基之外，每个单体的氨基酸是高度保守的。两个可变氨基酸被称为重复可变二残基(RVD)。RVD的氨基酸对NI、NG、HD和NN分别优先识别腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和鸟嘌呤/腺嘌呤，并且对RVD进行调节可识别连续DNA碱基。氨基酸序列与DNA识别之间的这个简单关系已允许通过选择含有适当RVD的重复区段的组合来对特定DNA结合结构域进行工程改造。
除野生型FokI裂解结构域之外，FokI裂解结构域的具有突变的变体已被设计来改善裂解特异性和裂解活性。FokI结构域以二聚体形式起作用，从而需要两个具有适当定向和间隔的具有针对靶标基因组中的位点的独特DNA结合结构域的构建体。TALEN DNA结合结构域与FokI裂解结构域之间的氨基酸残基的数目与两个单独TALEN结合位点之间的碱基的数目两者均是用于实现高活性水平的参数。PvuII、MutH和TevI裂解结构域是FokI和FokI变体的用于与TALE一起使用的有用替代物。PvuII在偶联于TALE时充当高度特异性裂解结构域(参见Yank等人2013.PLoS One.8:e82539)。MutH能够在DNA中引入链特异性切口(参见Gabsalilow等人2013.Nucleic Acids Research.41:e83)。TevI在DNA中在所靶向位点处引入双链断裂(参见Beurdeley等人,2013.Nature Communications.4:1762)。
TALE结合结构域的氨基酸序列与DNA识别之间的关系允许设计蛋白质。诸如DNAWorks的软件程序可用于设计TALE构建体。设计TALE构建体的其他方法为本领域技术人员所知。参见Doyle等人,Nucleic Acids Research(2012)40:W117-122.；Cermak等人,Nucleic Acids Research(2011).39:e82；以及tale-nt.cac.cornell.edu/about。在一方面，本文提供的方法和/或组合物包括一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、或五种或更多种TALEN。在另一方面，本文提供的TALEN能够产生靶向DSB。在一方面，通过本领域中已知的转化方法(例如不限于病毒转染、粒子轰击、PEG介导的原生质体转染或土壤杆菌介导的转化)对细胞提供包含编码一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、或五种或更多种TALEN的多核苷酸的载体。参见例如美国专利申请第2011/0145940、2011/0301073和2013/0117869号，所述美国专利申请的内容和公开内容通过引用并入本文。
本公开的实施方案还包括用于诸如通过转化、基因组编辑、突变、杂交等来制备或产生本文所述的经修饰植物的方法，其中方法包括将目标重组DNA分子、构建体或序列引入至植物细胞中，或对内源性GA氧化酶基因的基因组基因座进行编辑或突变，接着从经转化或经编辑植物细胞再生或发育成经修饰植物，此可在选择压力下进行。此类方法可包括用目标重组DNA分子、构建体或序列转化植物细胞，以及选择相较于野生型或对照植物，在一个或多个发育阶段时具有一种或多种改变的表型或性状诸如以下性状中的一者或多者的植物：更矮的或半矮化株型或植物高度、更短的在一个或多个节间中的节间长度、增加的秆/茎直径、改善的倒伏抗性、降低的未成熟折断、更深的根、增加的叶面积、更早的冠层郁闭、在水有限的条件下增加的叶含水量和/或更高的气孔导度、在正常或氮或水有限的胁迫条件下降低的叶中花色素苷含量和/或面积、改善的产量相关性状，包括更大的雌性生殖器官或穗、在穗重量、收获指数、产量、种子或籽粒数目和/或种子或籽粒重量方面的增加，增加的胁迫耐受性诸如增加的干旱耐受性、增加的氮利用率、以及/或者增加的对高密度种植的耐受性。
根据本公开的另一方面，提供了用于在正常/标准或较高的田间密度下种植一种或多种本文提供的经修饰植物的方法。根据一些实施方案，可通过在较高田间密度下种植本公开的经修饰植物来增加每英亩(或单位土地面积)作物植物的产量。如本文所述，具有基因组编辑的GA氧化酶基因的经修饰植物可具有降低的植物高度、一个或多个更短节间、增加的秆/茎直径、以及/或者增加的倒伏抗性。提出的是经修饰植物可耐受高密度种植条件，因为茎直径的增加可抵抗倒伏，并且较矮的植物高度可允许在高密度种植条件下向下部叶的光穿透增加。因此，本文提供的经修饰植物可在田地中在较高密度下种植以增加每英亩(或单位土地面积)产量。对于行栽作物，可通过单位行长度种植较大数目的种子/植物，以及/或者通过降低行间间隙来实现较高密度。
根据一些实施方案，相比于根据标准农艺学规范的关于这个作物植物的正常种植密度，经修饰作物植物可在高至少5％、10％、15％、20％、25％、50％、75％、100％、125％、150％、175％、200％、225％或250％的田间密度(单位土地/田地面积的植物)下种植。可在每英亩至少38,000个植物、每英亩至少40,000个植物、每英亩至少42,000个植物、每英亩至少44,000个植物、每英亩至少45,000个植物、每英亩至少46,000个植物、每英亩至少48,000个植物、每英亩50,000个植物、每英亩至少52,000个植物、每英亩至少54,000个、或每英亩至少56,000个植物的田间密度下种植经修饰作物植物。作为一实例，与诸如每英亩约18,000个植物至每英亩约38,000个植物的标准密度范围相对比，可在诸如在以下范围内的较高密度下种植玉米植物：每英亩约38,000个植物至每英亩约60,000个植物、或每英亩约40,000个植物至每英亩约58,000个植物、或每英亩约42,000个植物至每英亩约58,000个植物、或每英亩约40,000个植物至每英亩约45,000个植物、或每英亩约45,000个植物至每英亩约50,000个植物、或每英亩约50,000个植物至每英亩约58,000个植物、或每英亩约52,000个植物至每英亩约56,000个植物、或每英亩约38,000个植物、每英亩约42,000个植物、每英亩约46,000个植物、或每英亩约48,000个植物、每英亩约50,000个植物、或每英亩约52,000个植物、或每英亩约54,000个植物。
可使用本领域中已知的多种方法测量玉米植物的高度，此可基于玉米植物上的多种解剖位置。在一方面，玉米植物的高度测量为土壤或地面与所述玉米植物的最上完全展开叶的叶舌(或叶领)之间的距离。如本文所用，“完全扩展叶”是其中叶片是暴露的，并且在叶片/叶鞘边界处叶舌与叶耳两者均是可见的叶。在另一方面，玉米植物的高度测量为土壤或地面与离土壤或地面最远的叶的上部叶表面之间的距离。在另一方面，玉米植物的高度测量为土壤或地面与发育了至少50％的最高玉米叶的拱起之间的距离。如本文所用，“最高玉米叶的拱起”是玉米植物的顶叶的向下弯曲的拱起的最高点。在另一方面，在第一生殖(R1)阶段时测量玉米植物的高度。测量植物高度的示例性非限制性方法包括将玉米植物的照片与高度参考进行比较，或用适合尺子、棍棒或测量装置物理测量单个玉米植物。除非另外规定，否则玉米植物高度是在生殖或晚期营养阶段时测量的成熟或完全生长植物高度。本领域中的人士认识到当将经修饰玉米植物与对照玉米植物进行比较时，必须在相同生长阶段时进行测量。作为一非限制性实例，将不适当的是将在R3阶段时经修饰玉米植物的高度与在V6阶段时对照玉米植物的高度进行比较，即使两种植物已生长了相同时间量。除非另外规定，否则在R2生长阶段时从土壤平面至最上完全展开叶的基部来测量植物高度。
如本文所用，关于玉米植物使用，诸如使用来测量植物高度的术语“地面”或“地平面”是指所述玉米植物从其进行生长的生长介质或土壤(例如土地)的上部或最上表面。
玉米植物高度视生长的株系或品种，植物是杂种还是近交种，以及环境条件而变化。尽管杂交玉米植物到成熟时可达到超过3.6米高的高度，但杂交植物到成熟时约2.0-2.5米的高度是更常见的。相较于对照植物，本文提供的经修饰玉米植物具有降低的植物高度，诸如小于2.0米、小于1.9米、小于1.8米、小于1.7米、小于1.6米、或小于1.5米。
根据本公开的实施方案，提供了一种或多种经修饰玉米植物，其包含(i)小于2000mm、小于1950mm、小于1900mm、小于1850mm、小于1800mm、小于1750mm、小于1700mm、小于1650mm、小于1600mm、小于1550mm、小于1500mm、小于1450mm、小于1400mm、小于1350mm、小于1300mm、小于1250mm、小于1200mm、小于1150mm、小于1100mm、小于1050mm、或小于1000mm的植物高度，和/或(ii)至少18mm、至少18.5mm、至少19mm、至少19.5mm、至少20mm、至少20.5mm、至少21mm、至少21.5mm、或至少22mm的平均茎或秆直径。以不同方式来陈述，提供了一种或多种经修饰玉米植物，其包含小于2000mm、小于1950mm、小于1900mm、小于1850mm、小于1800mm、小于1750mm、小于1700mm、小于1650mm、小于1600mm、小于1550mm、小于1500mm、小于1450mm、小于1400mm、小于1350mm、小于1300mm、小于1250mm、小于1200mm、小于1150mm、小于1100mm、小于1050mm、或小于1000mm的植物高度，和/或大于18mm、大于18.5mm、大于19mm、大于19.5mm、大于20mm、大于20.5mm、大于21mm、大于21.5mm、或大于22mm的平均茎或秆直径。以毫米(mm)表示的任何这种植物高度性状或范围都可基于已知换算来转换成不同测量单位(例如一英寸等于2.54cm或25.4毫米，并且毫米(mm)、厘米(cm)和米(m)差异仅在于十的一次或多次幂)。因此，本文提供的任何测量结果都进一步以根据已知和确定的换算的任何其他类似测量单位描述。然而，经修饰玉米植物的精确植物高度和/或茎直径可取决于环境和遗传背景。因此，经修饰玉米植物的植物高度和/或茎直径的变化可改为以相对于对照植物的最小差异或百分比变化描述。在一方面，经修饰玉米植物在至少一个雌性器官或穗中不具有任何显著异型。经修饰玉米植物还可包含至少一个大致上不含雄性生殖组织或结构或其他异型的穗。在一方面，经修饰玉米植物基本上不展现生殖异常或异型–即无显著或可观察的生殖异常或异型。在另一方面，异型或生殖异常选自由以下组成的组：雄性(雄穗或花药)不育、降低的籽粒或种子数目、以及在雌性器官或穗(例如花药穗)中存在一种或多种雄性化或雄性(或雄性样)生殖结构。
根据本公开的实施方案，提供了经修饰玉米植物，所述经修饰玉米植物包含在晚期营养和/或生殖发育阶段期间(例如在R3阶段时)在1000mm与1800mm之间，在1000mm与1700mm之间，在1050mm与1700mm之间，在1100mm与1700mm之间，在1150mm与1700mm之间，在1200mm与1700mm之间，在1250mm与1700mm之间，在1300mm与1700mm之间，在1350mm与1700mm之间，在1400mm与1700mm之间，在1450mm与1700mm之间，在1000mm与1500mm之间，在1050mm与1500mm之间，在1100mm与1500mm之间，在1150mm与1500mm之间，在1200mm与1500mm之间，在1250mm与1500mm之间，在1300mm与1500mm之间，在1350mm与1500mm之间，在1400mm与1500mm之间，在1450mm与1500mm之间，在1000mm与1600mm之间，在1100mm与1600mm之间，在1200mm与1600mm之间，在1300mm与1600mm之间，在1350mm与1600mm之间，在1400mm与1600mm之间，在1450mm与1600mm，在1000mm与2000mm之间，在1200mm与2000mm之间，在1200mm与1800mm之间，在1300mm与1700mm之间，在1400mm与1700mm之间，在1400mm与1600mm之间，在1400mm与1700mm之间，在1400mm与1800mm之间，在1400mm与1900mm之间，在1400mm与2000mm之间，或在1200mm与2500mm之间的植物高度，和/或在17.5mm与22mm之间，在18mm与22mm之间，在18.5与22mm之间，在19mm与22mm之间，在19.5mm与22mm之间，在20mm与22mm之间，在20.5mm与22mm之间，在21mm与22mm之间，在21.5mm与22mm之间，在17.5mm与21mm之间，在17.5mm与20mm之间，在17.5mm与19mm之间，在17.5mm与18mm之间，在18mm与21mm之间，在18mm与20mm之间，或在18mm与19mm之间的平均茎直径。经修饰玉米植物可在所述经修饰玉米植物的一个或多个穗中大致上不含异型，诸如雄性生殖组织或结构。
根据本公开的实施方案，提供了经修饰玉米植物，所述经修饰玉米植物具有(i)相比于野生型或对照植物的高度，小至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、或至少75％的植物高度，和/或(ii)相比于所述野生型或对照植物的茎直径，大至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少100％的茎或秆直径。根据本公开的实施方案，经修饰玉米植物可具有相比于野生型或对照植物的高度，矮至多20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％或60％的降低的植物高度，和/或相比于野生型或对照植物的茎或秆直径，大小于(或不超过)10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的茎或秆直径。举例来说，经修饰植物可具有(i)相比于野生型或对照植物，小至少10％、至少15％、或至少20％或更矮(即矮大于或等于10％、15％或20％)，但矮不大于或超过50％的植物高度，和/或(ii)相比于野生型或对照植物，大至少5％、至少10％、或至少15％，但大不超过30％、35％或40％的茎或秆直径。为明晰起见，短语“矮至少20％”和“矮大于或等于20％”将排除例如矮10％。同样地，为明晰起见，短语“矮不大于50％”、“矮至多50％”和“矮不超过50％”将排除矮60％；短语“大至少5％”将排除大2％；并且短语“大不超过30％”和“大至多30％”将排除大40％。
根据本公开的实施方案，提供了经修饰玉米植物，所述经修饰玉米植物包含相比于野生型或对照植物的高度，小在5％与75％之间，在5％与50％之间，在10％与70％之间，在10％与65％之间，在10％与60％之间，在10％与55％之间，在10％与50％之间，在10％与45％之间，在10％与40％之间，在10％与35％之间，在10％与30％之间，在10％与25％之间，在10％与20％之间，在10％与15％之间，在10％与10％之间，在10％与75％之间，在25％与75％之间，在10％与50％之间，在20％与50％之间，在25％与50％之间，在30％与75％之间，在30％与50％之间，在25％与50％之间，在15％与50％之间，在20％与50％之间，在25％与45％之间，或在30％与45％之间的高度，和/或相比于所述野生型或对照植物的茎或秆直径，大在5％与100％之间，在5％与95％之间，在5％与90％之间，在5％与85％之间，在5％与80％之间，在5％与75％之间，在5％与70％之间，在5％与65％之间，在5％与60％之间，在5％与55％之间，在5％与50％之间，在5％与45％之间，在5％与40％之间，在5％与35％之间，在5％与30％之间，在5％与25％之间，在5％与20％之间，在5％与15％之间，在5％与10％之间，在10％与100％之间，在10％与75％之间，在10％与50％之间，在10％与40％之间，在10％与30％之间，在10％与20％之间，在25％与75％之间，在25％与50％之间，在50％与75％之间，在8％与20％之间，或在8％与15％之间的茎或秆直径。
如本文所用，“节间长度”是指植物的茎上两个连续节间之间的距离。根据本公开的实施方案，提供了经修饰玉米植物，所述经修饰玉米植物包含相比于野生型或对照植物的相同或平均节间长度，小至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、或至少75％的平均节间长度(或相对于穗的位置的负2节间长度和/或负4节间长度)。玉米植物的“负2节间”是指在植物的穗以下第二节间，并且玉米植物的“负4节间”是指在植物的穗以下第四节间。根据许多实施方案，提供了经修饰玉米植物，所述经修饰玉米植物具有相比于野生型或对照植物的相同或平均节间长度，小在5％与75％之间，在5％与50％之间，在10％与70％之间，在10％与65％之间，在10％与60％之间，在10％与55％之间，在10％与50％之间，在10％与45％之间，在10％与40％之间，在10％与35％之间，在10％与30％之间，在10％与25％之间，在10％与20％之间，在10％与15％之间，在10％与10％之间，在10％与75％之间，在25％与75％之间，在10％与50％之间，在20％与50％之间，在25％与50％之间，在30％与75％之间，在30％与50％之间，在25％与50％之间，在15％与50％之间，在20％与50％之间，在25％与45％之间，或在30％与45％之间的平均节间长度(或相对于穗的位置的负2节间长度和/或负4节间长度)。
根据本公开的实施方案，提供了经修饰玉米植物，所述经修饰玉米植物包含相比于野生型或对照植物的穗重量，大至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少100％的穗重量(单个地或平均地)。本文提供的经修饰玉米植物可包含相比于野生型或对照植物的穗重量，大在5％与100％之间，在5％与95％之间，在5％与90％之间，在5％与85％之间，在5％与80％之间，在5％与75％之间，在5％与70％之间，在5％与65％之间，在5％与60％之间，在5％与55％之间，在5％与50％之间，在5％与45％之间，在5％与40％之间，在5％与35％之间，在5％与30％之间，在5％与25％之间，在5％与20％之间，在5％与15％之间，在5％与10％之间，在10％与100％之间，在10％与75％之间，在10％与50％之间，在25％与75％之间，在25％与50％之间，或在50％与75％之间的穗重量。
根据本公开的实施方案，提供了经修饰玉米植物，所述经修饰玉米植物具有至少0.57、至少0.58、至少0.59、至少0.60、至少0.61、至少0.62、至少0.63、至少0.64、或至少0.65(或更大)的收获指数。经修饰玉米植物可包含在0.57与0.65之间，在0.57与0.64之间，在0.57与0.63之间，在0.57与0.62之间，在0.57与0.61之间，在0.57与0.60之间，在0.57与0.59之间，在0.57与0.58之间，在0.58与0.65之间，在0.59与0.65之间，或在0.60与0.65之间的收获指数。经修饰玉米植物可具有相比于野生型或对照植物的收获指数，大至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、或至少50％的收获指数。经修饰玉米植物可具有相比于野生型或对照植物的收获指数，大在1％与45％之间，在1％与40％之间，在1％与35％之间，在1％与30％之间，在1％与25％之间，在1％与20％之间，在1％与15％之间，在1％与14％之间，在1％与13％之间，在1％与12％之间，在1％与11％之间，在1％与10％之间，在1％与9％之间，在1％与8％之间，在1％与7％之间，在1％与6％之间，在1％与5％之间，在1％与4％之间，在1％与3％之间，在1％与2％之间，在5％与15％之间，在5％与20％之间，在5％与30％之间，或在5％与40％之间的收获指数。
根据本公开的实施方案，提供了经修饰玉米植物，相对于野生型或对照植物，所述经修饰玉米植物在可收获产量方面具有每英亩至少1蒲式耳(bushel)、每英亩至少2蒲式耳、每英亩至少3蒲式耳、每英亩至少4蒲式耳、每英亩至少5蒲式耳、每英亩至少6蒲式耳、每英亩至少7蒲式耳、每英亩至少8蒲式耳、每英亩至少9蒲式耳、或每英亩至少10蒲式耳的增加。经修饰玉米植物在可收获产量方面可具有在每英亩1与10蒲式耳之间，在每英亩1与8蒲式耳之间，在每英亩2与8蒲式耳之间，在每英亩2与6蒲式耳之间，在每英亩2与5蒲式耳之间，在每英亩2.5与4.5蒲式耳之间之间，或在每英亩3与4蒲式耳之间的增加。经修饰玉米植物在可收获产量方面相比于野生型或对照植物的可收获产量可具有至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少20％、或至少25％的增加。经修饰玉米植物可具有相比于野生型或对照植物的可收获产量，大在1％与25％之间，在1％与20％之间，在1％与15％之间，在1％与14％之间，在1％与13％之间，在1％与12％之间，在1％与11％之间，在1％与10％之间，在1％与9％之间，在1％与8％之间，在1％与7％之间，在1％与6％之间，在1％与5％之间，在1％与4％之间，在1％与3％之间，在1％与2％之间，在5％与15％之间，在5％与20％之间，在5％与25％之间，在2％与10％之间，在2％与9％之间，在2％与8％之间，在2％与7％之间，在2％与6％之间，在2％与5％之间，或在2％与4％之间的可收获产量。
根据本公开的实施方案，提供了一种经修饰玉米植物，相比于野生型或对照植物，所述经修饰玉米植物具有小或低至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或100％的倒伏频率。相比于野生型或对照植物，经修饰玉米植物可具有小或低在5％与100％之间，在5％与95％之间，在5％与90％之间，在5％与85％之间，在5％与80％之间，在5％与75％之间，在5％与70％之间，在5％与65％之间，在5％与60％之间，在5％与55％之间，在5％与50％之间，在5％与45％之间，在5％与40％之间，在5％与35％之间，在5％与30％之间，在5％与25％之间，在5％与20％之间，在5％与15％之间，在5％与10％之间，在10％与100％之间，在10％与75％之间，在10％与50％之间，在10％与40％之间，在10％与30％之间，在10％与20％之间，在25％与75％之间，在25％与50％之间，或在50％与75％之间的倒伏频率。还提供了具有增加的倒伏抗性和降低的倒伏频率的玉米植物的群体。提供了经修饰玉米植物的群体，相比于野生型或对照植物的群体，所述群体具有小或低至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或100％的倒伏频率。相比于野生型或对照植物的群体，经修饰玉米植物的群体可包含小或低在5％与100％之间，在5％与95％之间，在5％与90％之间，在5％与85％之间，在5％与80％之间，在5％与75％之间，在5％与70％之间，在5％与65％之间，在5％与60％之间，在5％与55％之间，在5％与50％之间，在5％与45％之间，在5％与40％之间，在5％与35％之间，在5％与30％之间，在5％与25％之间，在5％与20％之间，在5％与15％之间，在5％与10％之间，在10％与100％之间，在10％与75％之间，在10％与50％之间，在10％与40％之间，在10％与30％之间，在10％与20％之间，在25％与75％之间，在25％与50％之间，或在50％与75％之间的倒伏频率，所述倒伏频率可表示为指定数目的植物或相等密度的作物面积的平均值。
根据本公开的实施方案，提供了经修饰玉米植物，相对于野生型或对照植物，所述经修饰玉米植物具有显著降低或减小的植物高度(例如2000mm或更小)和显著增加的茎直径(例如18mm或更大)。根据这些实施方案，植物高度的减小或降低和茎直径的增加可在本文叙述的任何高度、直径或百分比范围内。相对于野生型或对照植物具有降低的植物高度和增加的茎直径的此类经修饰玉米植物可用编码靶向至少一种GA20氧化酶基因和/或至少一种GA3氧化酶基因以达成阻抑的非编码RNA分子的可转录DNA序列转化。相对于野生型或对照植物具有显著降低的植物高度和/或显著增加的茎直径的经修饰玉米植物还可具有至少一个大致上不含雄性生殖组织或结构和/或其他异型的穗。相对于野生型或对照植物具有显著降低的植物高度和/或增加的茎直径的经修饰玉米植物可在植物的一种或多种组织诸如植物的一种或多种维管组织和/或叶组织中，相对于野生型或对照植物的相同的一种或多种组织，具有一种或多种GA20氧化酶和/或GA3氧化酶基因的降低活性。根据许多实施方案，经修饰玉米植物可包含至少一种可操作地连接于启动子的编码非编码RNA分子的多核苷酸或可转录DNA序列，所述启动子可为组成型、组织特异性或组织优选启动子，其中所述非编码RNA分子靶向至少一种GA20氧化酶和/或GA3氧化酶基因以达成如本文提供的阻抑。非编码RNA分子可为miRNA、siRNA、或miRNA或siRNA前体分子。根据一些实施方案，相对于野生型或对照植物具有显著降低的植物高度和/或增加的茎直径的经修饰玉米植物相对于野生型或对照植物还可具有增加的收获指数和/或增加的倒伏抗性。
根据本发明的实施方案，提供了经修饰玉米植物，所述经修饰玉米植物至少在一种或多种茎和节间组织，诸如一种或多种茎、节间、叶和/或维管组织中，相较于野生型或对照植物的相同的一种或多种组织，具有降低的赤霉素含量(呈活性形式)。根据许多实施方案，提供了经修饰玉米植物，相对于野生型或对照植物，所述经修饰玉米植物具有显著降低的植物高度和/或显著增加的茎直径，其中所述经修饰玉米植物还在一种或多种茎、节间、叶和/或维管组织中，相对于野生型或对照植物的相同的一种或多种组织，具有显著降低或减小水平的活性赤霉素或活性GA(例如GA1、GA3、GA4和/或GA7中的一者或多者)。举例来说，在经修饰玉米植物的一种或多种茎、节间、叶和/或维管组织中，相比于在野生型或对照玉米植物的相同的一种或多种组织中，一种或多种活性GA的水平可小或低至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少100％。
根据一些实施方案，经修饰玉米植物可在一种或多种茎、节间、叶和/或维管组织中，相比于在野生型或对照玉米植物的相同的一种或多种组织中，包含小或(低)在5％与50％之间，在10％与100％之间，在20％与100％之间，在30％与100％之间，在40％与100％之间，在50％与100％之间，在60％与100％之间，在70％与100％之间，在80％与100％之间，在80％与90％之间，在10％与90％之间，在10％与80％之间，在10％与70％之间，在10％与60％之间，在10％与50％之间，在10％与40％之间，在10％与30％之间，在10％与20％之间，在50％与100％之间，在20％与90％之间，在20％与80％之间，在20％与70％之间，在20％与60％之间，在20％与50％之间，在20％与40％之间，在20％与40％之间，在20％与30％之间，在30％与90％之间，在30％与80％之间，在30％与70％之间，在30％与60％之间，在30％与50％之间，在30％与40％之间，在40％与90％之间，在40％与80％之间，在40％与70％之间，在40％与60％之间，在40％与50％之间，在50％与90％之间，在50％与80％之间，在50％与70％之间，在50％与60％之间，在60％与90％之间，在60％与80％之间，在60％与70％之间，在70％与90％之间，或在70％与80％之间的活性赤霉素(GA)水平(例如GA1、GA3、GA4和/或GA7中的一者或多者)。在一种或多种茎、节间、叶和/或维管组织中具有降低的活性赤霉素(GA)水平的经修饰玉米植物还可在经修饰玉米植物的至少一个穗中大致上不含异型，诸如雄性生殖组织或结构和/或其他异型。
根据本公开的实施方案，提供了经修饰玉米植物，所述经修饰玉米植物在经修饰植物的一种或多种组织，诸如一种或多种茎、节间、叶和/或维管组织中，相较于野生型或对照植物的相同的一种或多种组织，具有一种或多种GA3氧化酶和/或GA20氧化酶基因转录物和/或蛋白质的显著降低或消除的表达水平。根据许多实施方案，提供了一种经修饰玉米植物，相对于野生型或对照植物，所述经修饰玉米植物包含显著降低的植物高度和/或显著增加的茎直径，其中所述经修饰玉米植物在所述经修饰植物的一种或多种组织，诸如一种或多种茎、节间、叶和/或维管组织中，相较于野生型或对照玉米植物的相同的一种或多种组织，具有一种或多种GA20氧化酶和/或GA3氧化酶基因转录物和/或蛋白质的显著降低或消除的表达水平。举例来说，经修饰玉米植物在完整经修饰植物中，或在所述经修饰植物的一种或多种茎、节间、叶和/或维管组织中，相较于野生型或对照植物的相同的一种或多种组织，具有一种或多种GA20氧化酶_3和/或GA20氧化酶_5基因转录物和/或蛋白质的显著降低或消除的表达水平。举例来说，在经修饰玉米植物的一种或多种茎、节间、叶和/或维管组织中，相比于在野生型或对照玉米植物的相同的一种或多种组织中，一种或多种GA20氧化酶基因转录物和/或蛋白质或一种或多种GA氧化酶(或GA氧化酶样)基因转录物的水平可小或低至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少100％。
根据一些实施方案，经修饰玉米植物可在完整植物中，或在一种或多种茎、节间、叶和/或维管组织中，相比于在野生型或对照玉米植物的相同的一种或多种组织中，包含小或低在5％与50％之间，在10％与100％之间，在20％与100％之间，在30％与100％之间，在40％与100％之间，在50％与100％之间，在60％与100％之间，在70％与100％之间，在80％与100％之间，在80％与90％之间，在10％与90％之间，在10％与80％之间，在10％与70％之间，在10％与60％之间，在10％与50％之间，在10％与40％之间，在10％与30％之间，在10％与20％之间，在50％与100％之间，在20％与90％之间，在20％与80％之间，在20％与70％之间，在20％与60％之间，在20％与50％之间，在20％与40％之间，在20％与40％之间，在20％与30％之间，在30％与90％之间，在30％与80％之间，在30％与70％之间，在30％与60％之间，在30％与50％之间，在30％与40％之间，在40％与90％之间，在40％与80％之间，在40％与70％之间，在40％与60％之间，在40％与50％之间，在50％与90％之间，在50％与80％之间，在50％与70％之间，在50％与60％之间，在60％与90％之间，在60％与80％之间，在60％与70％之间，在70％与90％之间，或在70％与80％之间的水平的一种或多种GA20氧化酶基因转录物和/或蛋白质或一种或多种GA氧化酶(或GA氧化酶样)基因转录物和/或蛋白质。在一种或多种组织中具有至少一种GA20氧化酶基因的降低或消除的表达水平的经修饰玉米植物还可在所述经修饰玉米植物的至少一个穗中大致上不含异型，诸如雄性生殖组织或结构和/或其他异型。
提供了用于关于靶向编辑或转基因的存在来筛选和/或鉴定细胞或植物等，以及选择包含靶向编辑或转基因的细胞或植物的方法和技术，此可基于一种或多种表型或性状，或基于分子标记或多核苷酸或蛋白质序列在细胞或植物中的存在或不存在。可使用本领域中已知的技术分离和检测核酸。举例来说，可使用但不限于重组核酸技术和/或聚合酶链式反应(PCR)分离和检测核酸。一般性PCR技术例如描述于PCR Primer:A LaboratoryManual,Dieffenbach和Dveksler编,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1995中。重组核酸技术包括例如可用于分离核酸的限制酶消化和连接。经分离核酸还可以单一核酸分子形式或以一系列寡核苷酸形式化学合成。可通过已知方法诸如DEAE离子交换、凝胶过滤和羟磷灰石色谱法从天然来源(例如生物样品)纯化多肽。还可例如通过在表达载体中表达核酸来纯化多肽。此外，可通过化学合成获得纯化多肽。可使用任何适当方法例如柱色谱法、聚丙烯酰胺凝胶电泳或HPLC分析测量多肽的纯度。本领域中已知的任何方法都可用于筛选和/或鉴定在它的基因组中具有转基因或基因组编辑的细胞、植物等，此可基于任何适合形式的目视观察、选择、分子技术等。
在一些实施方案中，提供了用于检测植物细胞中的重组核酸和/或多肽的方法。举例来说，可如本领域中所知使用杂交探针或通过采用引物使用PCR产生扩增子来检测核酸。核酸之间的杂交讨论于Sambrook等人(1989,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY)中。可使用抗体检测多肽。用于使用抗体检测多肽的技术包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、Western印迹、免疫沉淀、免疫荧光等。本文提供的抗体可为多克隆抗体或单克隆抗体。可使用本领域中已知的方法产生对本文提供的多肽具有特异性结合亲和力的抗体。可使用本领域中已知的方法使抗体或杂交探针连接于固体载体，诸如管、板或孔。
可使用可与杂交探针或抗体连接或缔合的可检测标记实现检测(例如对扩增产物、杂交复合物、多肽的检测)。术语“标记”意图涵盖对直接标记以及间接标记的使用。可检测标记包括酶、辅基、荧光物质、发光物质、生物发光物质和放射性物质。
可通过为分子生物学领域技术人员所知的任何方法来筛选和选择经修饰、经编辑植物或植物细胞。筛选和选择方法的实例包括但不限于Southern分析、用于检测多核苷酸的PCR扩增、Northern印迹、RNA酶保护、引物延伸、用于检测RNA转录物的RT-PCR扩增、Sanger测序、下一代测序技术(例如
Figure BDA0003255407500000671
Ion TorrentTM等)、用于检测多肽和多核苷酸的酶或核酶活性的酶促测定、以及用以检测多肽的蛋白质凝胶电泳、Western印迹、免疫沉淀和酶联免疫测定。其他技术诸如原位杂交、酶染色和免疫染色也可用于检测多肽和/或多核苷酸的存在或表达。用于进行所有提及的技术的方法在本领域中是已知的。
设想了以下非限制性实施方案：
1.一种包含内源性GA20氧化酶_3基因座的突变等位基因的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述突变等位基因包含插入至所述内源性GA20氧化酶_3基因座中的DNA区段，其中所述DNA区段编码与SEQ ID NO:1-3以及5-7中的一者或多者的至少20、至少25、至少30、至少40、至少50、至少75、至少100、至少150、至少200、至少300、至少400、至少500、至少750、或至少1000个连续核苷酸至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％互补的反义RNA序列，并且其中所述内源性GA20氧化酶_3基因座的所述突变等位基因产生包含所述反义RNA序列的RNA转录物。
2.如实施方案1所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述内源性GA20氧化酶_3基因座的所述突变等位基因阻抑所述内源性GA20氧化酶_3基因座的野生型等位基因、内源性GA20氧化酶_5基因座的野生型等位基因、或两者的表达。
3.如实施方案1所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述RNA转录物还包含所述内源性GA20氧化酶_3基因座的一种或多种选自由以下组成的组的序列元件：5′UTR、第1外显子、第1内含子、第2外显子、第2内含子、第3外显子、3′UTR、以及它们的任何部分。
4.如实施方案1所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述DNA区段包含来源于所述内源性GA20氧化酶_3基因座的核苷酸序列。
5.如实施方案4所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述DNA区段对应于所述内源性GA20氧化酶_3基因座的倒置基因组片段。
6.如实施方案1所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述DNA区段包含来源于内源性GA20氧化酶_5基因座的核苷酸序列。
7.如实施方案6所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述DNA区段对应于所述内源性GA20氧化酶_5基因座的倒置基因组片段。
8.如实施方案1所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述反义RNA序列的至少一部分与所述RNA转录物的相应内源性序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％互补。
9.如实施方案8所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述RNA转录物的所述相应内源性序列与SEQ ID NO:1-3以及5-7中的一者或多者的至少20、至少25、至少30、至少40、至少50、至少75、至少100、至少150、至少200、至少300、至少400、至少500、至少750、或至少1000个连续核苷酸至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％同一。
10.如实施方案8或9所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述反义RNA序列杂交于所述RNA转录物的所述相应内源性序列。
11.如实施方案8-10中的任一者所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述DNA区段插入在所述内源性GA20氧化酶_3基因座的相应内源性DNA区段的附近或邻近处。
12.如实施方案11所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中由插入DNA区段编码的所述反义RNA序列杂交于所述RNA转录物的由所述相应内源性DNA区段编码的相应内源性序列。
13.如实施方案11或12所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述反义RNA序列与所述RNA转录物的所述相应内源性序列形成茎-环结构。
14.如实施方案11所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述突变等位基因的插入DNA区段和所述相应内源性DNA区段由间插DNA序列分隔。
15.如实施方案14所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述间插DNA序列具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、40、50、75、100、150、200、250、300、400、500、750、1000、1500、2000、3000或4000个连续核苷酸的长度。
16.如实施方案14所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述DNA区段和所述相应内源性DNA区段由具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、40、50、75、100、150、200、250、300、400、500、750、1000、1500、2000、3000或4000个连续核苷酸的间插序列分隔。
17.如实施方案14-16中的任一者所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述间插DNA序列编码在所述RNA转录物的所述反义RNA序列与所述相应内源性序列之间的间插RNA序列。
18.如实施方案17所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述RNA转录物形成茎-环结构，其中所述间插RNA序列形成所述茎-环结构的环部分。
19.如实施方案18所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述茎-环二级结构含有具有错配的接近完美的互补序列茎。
20.如实施方案18所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述茎-环二级结构含有不具有错配的完美的互补序列茎。
21.如实施方案14-20中的任一者所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述间插DNA序列包含所述内源性GA20氧化酶_3基因座的天然序列。
22.如实施方案14-20中的任一者所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述间插DNA序列包含插入至所述内源性GA20氧化酶_3基因座中的外源性序列。
23.如实施方案14-20中的任一者所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述间插序列含有内含子序列。
24.如实施方案14-20中的任一者所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述间插序列不含有内含子序列。
25.如实施方案11所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中插入DNA区段位于所述相应内源性DNA区段的上游。
26.如实施方案11所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中插入DNA区段位于所述相应内源性DNA区段的下游。
27.如实施方案8所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述DNA区段插入在选自由以下组成的组的区域内：所述内源性GA20氧化酶_3基因座的5′非翻译区(UTR)、第1外显子、第1内含子、第2外显子、第2内含子、第3外显子和3′UTR、以及它们的组合。
28.如实施方案8所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述DNA区段插入在通过靶向编辑技术识别以创建双链断裂(DSB)的基因组位点处。
29.如实施方案8所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述突变等位基因还包含所述内源性GA20氧化酶_3基因座的至少一个部分的缺失。
30.如实施方案8所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述DNA区段的有义链包含与所述内源性GA20氧化酶_3基因座、或内源性GA20氧化酶_5基因座的外显子序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％互补的序列。
31.如实施方案8所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述DNA区段的有义链包含与所述内源性GA20氧化酶_3基因座、或内源性GA20氧化酶_5基因座的非翻译区(UTR)序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％互补的序列。
32.如实施方案8所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述DNA区段的有义链包含与所述内源性GA20氧化酶_3基因座、或内源性GA20氧化酶_5基因座的外显子序列和内含子序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％互补的序列，所述外显子序列和所述内含子序列在所述内源性基因座内是邻近的。
33.如实施方案8所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述DNA区段包含与SEQ ID No:13、14、26、28、30、32和36中的一者或多者具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％同一性的序列。
34.如实施方案1至33中的任一者所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述玉米植物就在所述内源性GA20氧化酶_3基因座处的所述突变等位基因来说是纯合的。
35.如实施方案1至33中的任一者所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述玉米植物就在所述内源性GA20氧化酶_3基因座处的所述突变等位基因来说是杂合的。
36.如实施方案1至33中的任一者所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述DNA区段具有至少15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、75、100、125、150、175、200、250、300、400、500、750或1000个核苷酸的长度。
37.如实施方案1至33中的任一者所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述DNA区段具有至多25、50、100、150、200、250、300、400、500、750或1000个核苷酸的长度。
38.如实施方案1至37中的任一者所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中相对于未修饰对照植物，所述经修饰玉米植物具有更矮的植物高度和/或改善的倒伏抗性。
39.如实施方案1至37中的任一者所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中相对于未修饰对照植物，所述经修饰玉米植物展现在成熟时植物高度的至少2.5％、至少5％、至少7.5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、或至少40％降低。
40.如实施方案39所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述植物高度降低在5％与40％之间，在10％与40％之间，在15％与40％之间，在20％与40％之间，在30％与40％之间，在10％与30％之间，在15％与30％之间，在20％与30％之间，在5％与30％之间，在7.5％与25％之间，在10与20％,5％与7.5％之间，在7.5％与10％之间，在10与15％之间，或在15％至20％之间。
41.如实施方案1至37中的任一者所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述经修饰玉米植物的在一个或多个茎节间处的秆或茎直径相比于未修饰对照植物的在相同的一个或多个节间处的秆或茎直径，大至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、或至少40％。
42.如实施方案1至37中的任一者所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中在穗以下第一、第二、第三和/或第四节间中的一者或多者处，相比于未修饰对照植物的相同节间，所述经修饰玉米植物的秆或茎直径大至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、或至少40％。
43.如实施方案1至37中的任一者所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中在所述经修饰玉米植物的茎或秆的至少一种节间组织中，相比于未修饰对照植物的相同节间组织，一种或多种活性GA的水平低至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、或至少40％。
44.如实施方案1至37中的任一者所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中在所述经修饰玉米植物的茎或秆的至少一种节间组织中，相比于未修饰对照植物的相同节间组织，一种或多种活性GA的水平是较低的。
45.如实施方案1至37中的任一者所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述经修饰玉米植物在至少一个雌性器官或穗中不具有任何显著异型。
46.如实施方案1至37中的任一者所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述经修饰玉米植物基本上不展现生殖异常。
47.一种用于产生内源性GA20氧化酶_3基因座的突变等位基因的方法，所述方法包括：
a.使用靶向编辑技术在玉米细胞中的所述内源性GA20氧化酶_3基因座中产生双链断裂(DSB)；
b.使用靶向编辑技术在所述DSB处插入DNA区段，其中所述DNA区段编码与SEQ IDNO:1-3以及5-7中的一者或多者的至少20、至少25、至少30、至少40、至少50、至少75、至少100、至少150、至少200、至少300、至少400、至少500、至少750、或至少1000个连续核苷酸至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％互补的反义RNA序列，并且其中所述内源性GA20氧化酶_3基因座的所述突变等位基因产生包含所述反义RNA序列的RNA转录物。
48.如实施方案47所述的方法，其中所述靶向编辑技术包括使用至少一种位点特异性核酸酶。
49.如实施方案48所述的方法，其中所述至少一种位点特异性核酸酶选自由以下组成的组：锌指核酸酶、兆碱基大范围核酸酶、RNA引导的核酸酶、TALE-核酸酶、重组酶、转座酶、以及它们的任何组合。
50.如实施方案48所述的方法，其中所述至少一种位点特异性核酸酶是选自由Cas9核酸酶或其变体以及Cpf1核酸酶或其变体组成的组的RNA引导的核酸酶。
51.如实施方案47所述的方法，其中所述DNA区段来源于所述内源性GA20氧化酶_3基因座或内源性GA20氧化酶_5基因座。
52.如实施方案47所述的方法，其中在供体模板中提供所述DNA区段。
53.如实施方案47所述的方法，其中所述方法还包括从所述玉米细胞再生或发育成玉米植物。
54.如实施方案47所述的方法，其中所述内源性GA20氧化酶_3基因座的所述突变等位基因能够阻抑所述内源性GA20氧化酶_3基因座的野生型等位基因、内源性GA20氧化酶_5基因座的野生型等位基因、或两者的表达。
55.如实施方案47所述的方法，其中所述反义RNA序列的至少一部分与所述RNA转录物的相应内源性序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％互补。
56.如实施方案55所述的方法，其中所述反义RNA序列杂交于所述RNA转录物的所述相应内源性序列。
57.如实施方案47至56中的任一者所述的方法，其中将所述DNA区段插入在所述内源性GA20氧化酶_3基因座的相应内源性DNA区段的附近或邻近处。
58.如实施方案57所述的方法，其中由插入DNA区段编码的所述反义RNA序列杂交于所述RNA转录物的由所述相应内源性DNA区段编码的相应内源性序列。
59.如实施方案57所述的方法，其中所述反义RNA序列与所述RNA转录物的所述相应内源性序列形成茎-环结构。
60.如实施方案57所述的方法，其中所述突变等位基因的插入DNA区段和所述相应内源性DNA区段由间插DNA序列分隔。
61.如实施方案60所述的方法，其中所述间插DNA序列具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、40、50、75、100、150、200、250、300、400、500、750、1000、1500、2000、3000或4000个连续核苷酸的长度。
62.如实施方案60所述的方法，其中所述DNA区段和所述相应内源性序列由具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、40、50、75、100、150、200、250、300、400、500、750、1000、1500、2000、3000或4000个连续核苷酸的间插序列分隔。
63.如实施方案60-62中的任一者所述的方法，其中所述间插DNA序列编码在所述RNA转录物的所述反义RNA序列与所述相应内源性序列之间的间插RNA序列。
64.如实施方案63所述的方法，其中所述RNA转录物形成茎-环结构，其中所述间插RNA序列形成所述茎-环结构的环部分。
65.如实施方案60-64中的任一者所述的方法，其中所述间插DNA序列包含所述内源性GA20氧化酶_3基因座的天然序列。
66.如实施方案60-64中的任一者所述的方法，其中所述间插DNA序列包含插入至所述内源性GA20氧化酶_3基因座中的外源性序列。
67.如实施方案57所述的方法，其中插入DNA区段位于所述相应内源性DNA区段的上游。
68.如实施方案57所述的方法，其中插入DNA区段位于所述相应内源性DNA区段的下游。
69.如实施方案57所述的方法，其中所述DNA区段插入在选自由以下组成的组的区域内：所述内源性GA20氧化酶_3基因座的5′非翻译区(UTR)、第1外显子、第1内含子、第2外显子、第2内含子、第3外显子和3′UTR、以及它们的组合。
70.如实施方案57所述的方法，其中所述DNA区段的有义链包含(i)所述内源性GA20氧化酶_3或GA20氧化酶_5基因座的外显子序列的反向互补序列，或(ii)与所述反向互补序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％同一的序列。
71.如实施方案57所述的方法，其中所述DNA区段的有义链包含(i)所述内源性GA20氧化酶_3或GA20氧化酶_5基因座的非翻译区(UTR)序列的反向互补序列，或(ii)与所述反向互补序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％同一的序列。
72.如实施方案57所述的方法，其中所述DNA区段的有义链包含(i)所述内源性GA20氧化酶_3或GA20氧化酶_5基因座的外显子序列和内含子序列的反向互补序列，并且其中所述外显子序列和所述内含子序列在所述内源性基因座内是邻近的，或(ii)与所述反向互补序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％同一的序列。
73.如实施方案57所述的方法，其中所述DNA区段包含与SEQ ID No:13、14、26、28、30、32和36中的一者或多者具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、或100％同一性的序列。
74.如实施方案57至73中的任一者所述的方法，其中所述DNA区段具有至少15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、75、100、125、150、175、200、250、300、400、500、750或1000个核苷酸的长度。
75.如实施方案57至73中的任一者所述的方法，其中所述DNA区段具有至多25、50、100、150、200、250、300、400、500、750或1000个核苷酸的长度。
76.一种包含内源性GA20氧化酶_5基因座的突变等位基因的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述突变等位基因包含插入至所述内源性GA20氧化酶_5基因座中的DNA区段，其中所述DNA区段编码与SEQ ID NO:1-3以及5-7中的一者或多者的至少20、至少25、至少30、至少40、至少50、至少75、至少100、至少150、至少200、至少300、至少400、至少500、至少750、或至少1000个连续核苷酸至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％互补的反义RNA序列，并且其中所述内源性GA20氧化酶_5基因座的所述突变等位基因产生包含所述反义RNA序列的RNA转录物。
77.如实施方案76所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述内源性GA20氧化酶_5基因座的所述突变等位基因阻抑内源性GA20氧化酶_3基因座的野生型等位基因、所述内源性GA20氧化酶_5基因座的野生型等位基因、或两者的表达。
78.如实施方案76所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述RNA转录物还包含所述内源性GA20氧化酶_5基因座的一种或多种选自由以下组成的组的序列元件：5′UTR、第1外显子、第1内含子、第2外显子、第2内含子、第3外显子、3′UTR、以及它们的任何部分。
79.如实施方案76所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述DNA区段包含来源于内源性GA20氧化酶_3基因座的核苷酸序列。
80.如实施方案79所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述DNA区段对应于所述内源性GA20氧化酶_3基因座的倒置基因组片段。
81.如实施方案76所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述DNA区段包含来源于所述内源性GA20氧化酶_5基因座的核苷酸序列。
82.如实施方案81所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述DNA区段对应于所述内源性GA20氧化酶_5基因座的倒置基因组片段。
83.如实施方案76所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述反义RNA序列的至少一部分与所述RNA转录物的相应内源性序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％互补。
84.如实施方案83所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述RNA转录物的所述相应内源性序列与SEQ ID NO:1-3以及5-7中的一者或多者的至少20、至少25、至少30、至少40、至少50、至少75、至少100、至少150、至少200、至少300、至少400、至少500、至少750、或至少1000个连续核苷酸至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％同一。
85.如实施方案83或84所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述反义RNA序列杂交于所述RNA转录物的所述相应内源性序列。
86.如实施方案83-85中的任一者所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述DNA区段插入在所述内源性GA20氧化酶_5基因座的相应内源性DNA区段的附近或邻近处。
87.如实施方案86所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中由插入DNA区段编码的所述反义RNA序列杂交于所述RNA转录物的由所述相应内源性DNA区段编码的相应内源性序列。
88.如实施方案86或87所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述反义RNA序列与所述RNA转录物的所述相应内源性序列形成茎-环结构。
89.如实施方案86所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述突变等位基因的插入DNA区段和所述相应内源性DNA区段由间插DNA序列分隔。
90.如实施方案89所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述间插DNA序列具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、40、50、75、100、150、200、250、300、400、500、750、1000、1500、2000、3000或4000个连续核苷酸的长度。
91.如实施方案89所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述DNA区段和所述相应内源性DNA区段由具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、40、50、75、100、150、200、250、300、400、500、750、1000、1500、2000、3000或4000个连续核苷酸的间插序列分隔。
92.如实施方案89-91中的任一者所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述间插DNA序列编码在所述RNA转录物的所述反义RNA序列与所述相应内源性序列之间的间插RNA序列。
93.如实施方案92所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述RNA转录物形成茎-环结构，其中所述间插RNA序列形成所述茎-环结构的环部分。
94.如实施方案93所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述茎-环二级结构含有具有错配的接近完美的互补序列茎。
95.如实施方案93所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述茎-环二级结构含有不具有错配的完美的互补序列茎。
96.如实施方案89-95中的任一者所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述间插DNA序列包含所述内源性GA20氧化酶_5基因座的天然序列。
97.如实施方案89-95中的任一者所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述间插DNA序列包含插入至所述内源性GA20氧化酶_5基因座中的外源性序列。
98.如实施方案89-95中的任一者所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述间插序列含有内含子序列。
99.如实施方案89-95中的任一者所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述间插序列不含有内含子序列。
100.如实施方案86所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中插入DNA区段位于所述相应内源性DNA区段的上游。
101.如实施方案86所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中插入DNA区段位于所述相应内源性DNA区段的下游。
102.如实施方案83所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述DNA区段插入在选自由以下组成的组的区域内：所述内源性GA20氧化酶_5基因座的5′非翻译区(UTR)、第1外显子、第1内含子、第2外显子、第2内含子、第3外显子和3′UTR、以及它们的组合。
103.如实施方案83所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述DNA区段插入在通过靶向编辑技术识别以创建双链断裂(DSB)的基因组位点处。
104.如实施方案83所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述突变等位基因还包含所述内源性GA20氧化酶_5基因座的至少一个部分的缺失。
105.如实施方案83所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述DNA区段的有义链包含与内源性GA20氧化酶_3基因座、或所述内源性GA20氧化酶_5基因座的外显子序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％互补的序列。
106.如实施方案83所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述DNA区段的有义链包含与内源性GA20氧化酶_3基因座、或所述内源性GA20氧化酶_5基因座的非翻译区(UTR)序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％互补的序列。
107.如实施方案83所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述DNA区段的有义链包含与内源性GA20氧化酶_3基因座、或所述内源性GA20氧化酶_5基因座的外显子序列和内含子序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％互补的序列，所述外显子序列和所述内含子序列在所述内源性基因座内是邻近的。
108.如实施方案83所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述DNA区段包含与SEQ ID No:13、14、26、28、30、32和36中的一者或多者具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％同一性的序列。
109.如实施方案76所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述玉米植物就在所述内源性GA20氧化酶_5基因座处的所述突变等位基因来说是纯合的。
110.如实施方案76所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述玉米植物就在所述内源性GA20氧化酶_5基因座处的所述突变等位基因来说是杂合的。
111.如实施方案83所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述DNA区段具有至少15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、75、100、125、150、175、200、250、300、400、500、750或1000个核苷酸的长度。
112.如实施方案83所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述DNA区段具有至多25、50、100、150、200、250、300、400、500、750或1000个核苷酸的长度。
113.如实施方案76至112中的任一者所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中相对于未修饰对照植物，所述经修饰玉米植物具有更矮的植物高度和/或改善的倒伏抗性。
114.如实施方案76至112中的任一者所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中相对于未修饰对照植物，所述经修饰玉米植物展现在成熟时植物高度的至少2.5％、至少5％、至少7.5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、或至少40％降低。
115.如实施方案114所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述植物高度降低在5％与40％之间，在10％与40％之间，在15％与40％之间，在20％与40％之间，在30％与40％之间，在10％与30％之间，在15％与30％之间，在20％与30％之间，在5％与30％之间，在7.5％与25％之间，在10与20％,5％与7.5％之间，在7.5％与10％之间，在10与15％之间，或在15％至20％之间。
116.如实施方案76至112中的任一者所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述经修饰玉米植物的在一个或多个茎节间处的秆或茎直径相比于未修饰对照植物的在相同的一个或多个节间处的秆或茎直径，大至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、或至少40％。
117.如实施方案76至112中的任一者所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中在穗以下第一、第二、第三和/或第四节间中的一者或多者处，相比于未修饰对照植物的相同节间，所述经修饰玉米植物的秆或茎直径大至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、或至少40％。
118.如实施方案76至112中的任一者所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中在所述经修饰玉米植物的茎或秆的至少一种节间组织中，相比于未修饰对照植物的相同节间组织，一种或多种活性GA的水平低至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、或至少40％。
119.如实施方案76至112中的任一者所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中在所述经修饰玉米植物的茎或秆的至少一种节间组织中，相比于未修饰对照植物的相同节间组织，一种或多种活性GA的水平是较低的。
120.如实施方案76至112中的任一者所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述经修饰玉米植物在至少一个雌性器官或穗中不具有任何显著异型。
121.如实施方案76至112中的任一者所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述经修饰玉米植物基本上不展现生殖异常。
122.一种用于产生内源性GA20氧化酶_5基因座的突变等位基因的方法，所述方法包括：
a.使用靶向编辑技术在玉米细胞中的所述内源性GA20氧化酶_5基因座中产生双链断裂(DSB)；
b.使用靶向编辑技术在所述DSB处插入DNA区段，其中所述DNA区段编码与SEQ IDNO:1-3以及5-7中的一者或多者的至少20、至少25、至少30、至少40、至少50、至少75、至少100、至少150、至少200、至少300、至少400、至少500、至少750、或至少1000个连续核苷酸至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％互补的反义RNA序列，并且其中所述内源性GA20氧化酶_5基因座的所述突变等位基因产生包含所述反义RNA序列的RNA转录物。
123.如实施方案122所述的方法，其中所述靶向编辑技术包括使用至少一种位点特异性核酸酶。
124.如实施方案123所述的方法，其中所述至少一种位点特异性核酸酶选自由以下组成的组：锌指核酸酶、兆碱基大范围核酸酶、RNA引导的核酸酶、TALE-核酸酶、重组酶、转座酶、以及它们的任何组合。
125.如实施方案123所述的方法，其中所述至少一种位点特异性核酸酶是选自由Cas9核酸酶或其变体以及Cpf1核酸酶或其变体组成的组的RNA引导的核酸酶。
126.如实施方案122所述的方法，其中所述DNA区段来源于内源性GA20氧化酶_3基因座或所述内源性GA20氧化酶_5基因座。
127.如实施方案122所述的方法，其中在供体模板中提供所述DNA区段。
128.如实施方案122所述的方法，其中所述方法还包括从所述玉米细胞再生或发育成玉米植物。
129.如实施方案122所述的方法，其中所述内源性GA20氧化酶_5基因座的所述突变等位基因能够阻抑内源性GA20氧化酶_3基因座的野生型等位基因、所述内源性GA20氧化酶_5基因座的野生型等位基因、或两者的表达。
130.如实施方案122所述的方法，其中所述反义RNA序列的至少一部分与所述RNA转录物的相应内源性序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％互补。
131.如实施方案130所述的方法，其中所述反义RNA序列杂交于所述RNA转录物的所述相应内源性序列。
132.如实施方案122至131中的任一者所述的方法，其中将所述DNA区段插入在所述内源性GA20氧化酶_5基因座的相应内源性DNA区段的附近或邻近处。
133.如实施方案132所述的方法，其中由插入DNA区段编码的所述反义RNA序列杂交于所述RNA转录物的由所述相应内源性DNA区段编码的相应内源性序列。
134.如实施方案132所述的方法，其中所述反义RNA序列与所述RNA转录物的所述相应内源性序列形成茎-环结构。
135.如实施方案132所述的方法，其中所述突变等位基因的插入DNA区段和所述相应内源性DNA区段由间插DNA序列分隔。
136.如实施方案135所述的方法，其中所述间插DNA序列具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、40、50、75、100、150、200、250、300、400、500、750、1000、1500、2000、3000或4000个连续核苷酸的长度。
137.如实施方案135所述的方法，其中所述DNA区段和所述相应内源性序列由具有至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、40、50、75、100、150、200、250、300、400、500、750、1000、1500、2000、3000或4000个连续核苷酸的间插序列分隔。
138.如实施方案135-137中的任一者所述的方法，其中所述间插DNA序列编码在所述RNA转录物的所述反义RNA序列与所述相应内源性序列之间的间插RNA序列。
139.如实施方案138所述的方法，其中所述RNA转录物形成茎-环结构，其中所述间插RNA序列形成所述茎-环结构的环部分。
140.如实施方案135-139中的任一者所述的方法，其中所述间插DNA序列包含所述内源性GA20氧化酶_5基因座的天然序列。
141.如实施方案135-139中的任一者所述的方法，其中所述间插DNA序列包含插入至所述内源性GA20氧化酶_5基因座中的外源性序列。
142.如实施方案132所述的方法，其中插入DNA区段位于所述相应内源性DNA区段的上游。
143.如实施方案132所述的方法，其中插入DNA区段位于所述相应内源性DNA区段的下游。
144.如实施方案132所述的方法，其中所述DNA区段插入在选自由以下组成的组的区域内：所述内源性GA20氧化酶_5基因座的5′非翻译区(UTR)、第1外显子、第1内含子、第2外显子、第2内含子、第3外显子和3′UTR、以及它们的组合。
145.如实施方案132所述的方法，其中所述DNA区段的有义链包含(i)所述内源性GA20氧化酶_3或GA20氧化酶_5基因座的外显子序列的反向互补序列，或(ii)与所述反向互补序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％同一的序列。
146.如实施方案132所述的方法，其中所述DNA区段的有义链包含(i)所述内源性GA20氧化酶_3或GA20氧化酶_5基因座的非翻译区(UTR)序列的反向互补序列，或(ii)与所述反向互补序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％同一的序列。
147.如实施方案132所述的方法，其中所述DNA区段的有义链包含(i)所述内源性GA20氧化酶_3或GA20氧化酶_5基因座的外显子序列和内含子序列的反向互补序列，并且其中所述外显子序列和所述内含子序列在所述内源性基因座内是邻近的，或(ii)与所述反向互补序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％同一的序列。
148.如实施方案132所述的方法，其中所述DNA区段包含与SEQ ID No:13、14、26、28、30、32和36中的一者或多者具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、或100％同一性的序列。
149.如实施方案132所述的方法，其中所述DNA区段具有至少15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、75、100、125、150、175、200、250、300、400、500、750或1000个核苷酸的长度。
150.如实施方案132所述的方法，其中所述DNA区段具有至多25、50、100、150、200、250、300、400、500、750或1000个核苷酸的长度。
151.一种用于产生玉米植物的方法，所述方法包括：
(a)用来自雄性玉米植物的花粉对至少一个雌性玉米植物进行受精，其中所述至少一个雌性玉米植物和/或所述雄性玉米植物包含内源性GA20氧化酶基因座的突变等位基因，其中所述突变等位基因包含插入至所述内源性GA20氧化酶基因座中的DNA区段，其中所述DNA区段编码与SEQ ID NO:1-3或5-7中的一者或多者的至少20、至少25、至少30、至少40、至少50、至少75、至少100、至少150、至少200、至少300、至少400、至少500、至少750、或至少1000个连续核苷酸至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％互补的反义RNA序列，并且其中所述内源性GA20氧化酶基因座的所述突变等位基因产生包含所述反义RNA序列的RNA转录物；以及
(b)获得至少一个通过步骤(a)的所述受精产生的种子。
152.如实施方案151所述的方法，其中所述方法还包括(c)使在步骤(b)中获得的所述至少一个种子生长以产生至少一个包含所述突变等位基因的子代玉米植物。
153.如实施方案151所述的方法，其中来自步骤(b)的所述至少一个种子就所述突变等位基因来说是杂合的。
154.如实施方案151所述的方法，其中来自步骤(b)的所述至少一个种子就所述突变等位基因来说是纯合的。
155.如实施方案151-154中的任一者所述的方法，其中所述雌性玉米植物就所述突变等位基因来说是纯合的。
156.如实施方案151-154中的任一者所述的方法，其中所述雌性玉米植物就所述突变等位基因来说是杂合的。
157.如实施方案151-153、155或156中的任一者所述的方法，其中所述雄性玉米植物缺乏所述突变等位基因。
158.如实施方案151-156中的任一者所述的方法，其中所述雄性玉米植物就所述突变等位基因来说是杂合的。
159.如实施方案151-156中的任一者所述的方法，其中所述雄性玉米植物就所述突变等位基因来说是纯合的。
160.如实施方案152-157中的任一者所述的方法，其中相对于缺乏所述突变等位基因的对照植物，所述至少一个子代玉米植物具有更矮的植物高度和/或改善的倒伏抗性。
161.如实施方案152-157中的任一者所述的方法，其中相对于所述雄性玉米植物，所述至少一个子代玉米植物具有更矮的植物高度和/或改善的倒伏抗性。
162.如实施方案151-161中的任一者所述的方法，其中所述雌性玉米植物是近交玉米植物。
163.如实施方案151-161中的任一者所述的方法，其中所述雌性玉米植物是杂交玉米植物。
164.如实施方案151-163中的任一者所述的方法，其中所述雄性玉米植物是近交玉米植物。
165.如实施方案151-163中的任一者所述的方法，其中所述雄性玉米植物是杂交玉米植物。
166.如实施方案151-163中的任一者所述的方法，其中所述雌性玉米植物是优良玉米植物。
167.如实施方案151-165中的任一者所述的方法，其中所述雄性玉米植物是优良玉米植物。
168.如实施方案151-167中的任一者所述的方法，其中所述雌性玉米植物属于第一近交玉米株系或品种，并且其中所述雄性玉米植物属于不同的第二近交玉米株系或品种。
169.如实施方案151-168中的任一者所述的方法，其中使所述雌性玉米植物和所述雄性玉米植物在温室或生长室中生长。
170.如实施方案151-168中的任一者所述的方法，其中使所述雌性玉米植物和所述雄性玉米植物在户外生长。
171.如实施方案151-170中的任一者所述的方法，其中所述雌性玉米植物已去雄。
172.如实施方案151-170中的任一者所述的方法，其中所述雌性玉米植物是细胞质雄性不育玉米植物。
173.一种包含内源性GA20氧化酶_3基因座的突变等位基因的经修饰玉米植物部分、玉米细胞或玉米组织，其中所述突变等位基因包含插入至所述内源性GA20氧化酶_3基因座中的DNA区段，其中所述DNA区段编码与SEQ ID NO:1-3以及5-7中的一者或多者的至少20、至少25、至少30、至少40、至少50、至少75、至少100、至少150、至少200、至少300、至少400、至少500、至少750、或至少1000个连续核苷酸至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％互补的反义RNA序列，并且其中所述内源性GA20氧化酶_3基因座的所述突变等位基因产生包含所述反义RNA序列的RNA转录物。
174.一种包含内源性GA20氧化酶_5基因座的突变等位基因的经修饰玉米植物部分、玉米细胞或玉米组织，其中所述突变等位基因包含插入至所述内源性GA20氧化酶_5基因座中的DNA区段，其中所述DNA区段编码与SEQ ID NO:1-3以及5-7中的一者或多者的至少20、至少25、至少30、至少40、至少50、至少75、至少100、至少150、至少200、至少300、至少400、至少500、至少750、或至少1000个连续核苷酸至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％互补的反义RNA序列，并且其中所述内源性GA20氧化酶_5基因座的所述突变等位基因产生包含所述反义RNA序列的RNA转录物。
175.一种用于产生内源性GA20氧化酶_5基因座的突变等位基因的方法，所述方法包括：
a.使用靶向编辑技术在玉米细胞中的所述内源性GA20氧化酶_5基因座中产生第一双链断裂和第二双链断裂；
b.在所述第一双链断裂与所述第二双链断裂之间插入DNA区段，其中所述DNA区段编码与SEQ ID NO:1-3以及5-7中的一者或多者的至少20、至少25、至少30、至少40、至少50、至少75、至少100、至少150、至少200、至少300、至少400、至少500、至少750、或至少1000个连续核苷酸至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％互补的反义RNA序列，并且其中所述内源性GA20氧化酶_5基因座的所述突变等位基因产生包含所述反义RNA序列的RNA转录物。
176.一种用于产生内源性GA20氧化酶_3基因座的突变等位基因的方法，所述方法包括：
a.使用靶向编辑技术在玉米细胞中的所述内源性GA20氧化酶_3基因座中产生第一双链断裂和第二双链断裂；
b.在所述第一双链断裂与所述第二双链断裂之间插入DNA区段，其中所述DNA区段编码与SEQ ID NO:1-3以及5-7中的一者或多者的至少20、至少25、至少30、至少40、至少50、至少75、至少100、至少150、至少200、至少300、至少400、至少500、至少750、或至少1000个连续核苷酸至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％互补的反义RNA序列，并且其中所述内源性GA20氧化酶_3基因座的所述突变等位基因产生包含所述反义RNA序列的RNA转录物。
现已详细描述了本公开，将显而易知的是在不脱离如本文以及随附权利要求中所述的本公开的精神和范围的情况下，修改、变化和等同方面是可能的。此外，应了解本公开中的所有实例都作为非限制性实例提供。
实施例
实施例1.通过基因组编辑以产生含有发夹的转录物来创建显性等位基因
图1提供用于通过靶向基因编辑产生Zm.GA20ox3基因座的基因组修饰以编码具有倒置序列的RNA转录物的说明性实例，所述倒置序列可杂交于所述RNA转录物的相应序列以产生茎-环结构，以导致阻抑在内源性Zm.GA20ox3和Zm.GA20ox5基因座处的一个或两个拷贝或等位基因。Zm.GA20ox3基因和Zm.GA20ox5基因共有它们的相应外显子区域的高水平的核苷酸序列类似性。因此，Zm.GA20ox5基因的与Zm.GA20ox3基因的相应序列共有足够序列同一性或同源性，以相反定向在所述相应Zm.GA20ox3序列附近插入至Zm.GA20ox3基因中的预选位点中的片段可杂交于所述相应序列以形成茎-环结构，并且触发对Zm.GA20ox3和Zm.GA20ox5基因的阻抑。通过设计指导双链基因组DNA裂解的引导RNA来确定插入位点。在不束缚于任何特定理论的情况下，经编辑Zm.GA20ox3基因产生能够形成茎-环结构的转录物，所述茎-环结构可诱导Zm.GA20ox3和Zm.GA20ox5基因的野生型或其他等位基因的阻抑或基因沉默。在这个实施例中，插入Zm.GA20ox5片段可从内源性Zm.GA20ox5基因的拷贝或等位基因切除。这个类型的编辑被称为反式片段靶向(TFT)编辑，因为片段来源于内源性Zm.GA20ox5基因。切除片段的边界通过一对适当设计的引导RNA界定。根据这个实施例，插入Zm.GA20ox5片段还可从供体模板切除，所述供体模板是包含所需Zm.GA20ox5片段，并且由一种或多种引导RNA的靶标位点侧接的双链DNA分子。侧接gRNA靶标位点可为相同的(利用同一gRNA)或不同的，并且根据一些实施方案，以限制在裂解后包括在DNA插入片段中的gRNA靶标位点的量为目标。相对于待编辑的植物的内源性基因组，这些靶标位点可与内源性基因组匹配，可为人工源性的，或可与非内源性基因组匹配。根据一些实施方案，侧接于供体模板的待切除以插入至内源性基因座中的插入片段的靶标位点相对于天然或内源性基因组可为异源性的，以致可使内源性基因组内的任何脱靶DNA裂解最小化或消除。当与以从内源性Zm.GA20ox5基因座切除片段为目标的引导RNA组合进行时，这个方法被称为“模板辅助”。相反，Zm.GA20ox3片段可通过TFT从Zm.GA20ox3基因的拷贝或等位基因以及/或者从供体模板(例如模板辅助方法)切除，并且插入至内源性Zm.GA20ox5基因的预选位点中以产生可转录成包含茎-环结构的RNA转录物的反向重复序列，所述茎-环结构触发RNA介导的对Zm.GA20ox3和/或Zm.GA20ox5基因的野生型或其他等位基因的阻抑或沉默。
然而，采用这些方法中的任一者，视在gRNA或一个或多个编辑靶标位点处创建了哪个(些)DNA切割或断裂以及插入至那个(些)切割位点中或之间的一个或多个片段而定，有可能形成其他类型的编辑或突变，诸如一个或多个缺失和/或一个或多个倒位。插入DNA片段可来源于Zm.GA20ox3或Zm.GA20ox5基因的拷贝或等位基因，或来源于DNA模板分子。因此，可由切割一个或多个靶标位点产生缺失，并且/或者可通过相对于经编辑Zm.GA20氧化酶基因的编码序列以相对、相反或反义定向插入DNA片段产生倒位序列。倒位可存在于具有或不具有相应序列的经编辑基因中，所述相应序列在表达时可与从经编辑基因转录的mRNA的所编码倒位序列杂交以形成RNA发夹或茎-环结构。在无相应序列和所得发夹或茎-环结构下存在反义倒位序列可足以通过典型或非典型RNA机制触发对Zm.GA20ox3基因和Zm.GA20ox5基因中的一者或两者的阻抑。
设计植物转化构建体(pMON419922)以在Zm.GA20ox3基因中创建双链断裂(DSB)来允许插入Zm.GA20ox5基因的来自内源性Zm.GA20ox5基因座或外源提供的供体模板的反义DNA片段。在这个实施例中，构建体通常含有4个与基因编辑和经编辑基因中插入(例如倒位)的创建相关的功能性区域或盒：Cpf1或Cas12a变异蛋白的表达、用于Zm.GA20ox3基因基因座的三种引导RNA的表达、用于Zm.GA20ox5基因基因座的额外三种引导RNA的表达、以及用于从供体模板插入Zm.GA20ox5基因片段(在长度方面约400个核苷酸)的模板辅助方法的包含所述Zm.GA20ox5基因片段的所述供体模板区域。每个引导RNA单元含有可与Cpf1突变体相容的常用骨架以及与它的预定靶标位点互补的独特间隔体/靶向序列。
Cpf1表达盒包含玉蜀黍泛素启动子(SEQ ID NO:25)，所述启动子可操作地连接于编码毛螺菌科细菌(Lachnospiraceae bacterium)G532R/K595R突变Cpf1 RNA引导的核酸内切酶(SEQ ID NO:9)的序列，所述序列融合于两个核定位信号(SEQ ID NO:10和11)。参见例如Gao,L.等人,Nature Biotechnol.35(8):789-792(2017)，所述文献的全部内容和公开内容通过引用并入本文。
一个表达盒包含编码三种引导RNA(两种引导RNA具有靶向Zm.GA20ox3基因的外显子1中两个紧密间隔开的位点的由下表2中的SP1和SP2 DNA序列编码的靶向/间隔体序列(也参见图1)；并且另一引导RNA具有靶向Zm.GA20ox5基因的外显子1中的位点的由下表2中的SP3 DNA序列编码的靶向/间隔体序列(也参见图1))的序列，所述序列可操作地连接于玉蜀黍RNA聚合酶III(Pol3)启动子(SEQ ID NO:12)。间隔体序列SP1和SP2靶向Zm.GA20ox3的外显子-1中两个由约68个核苷酸间隔开的替代性断裂位点，并且任一断裂位点能够接受反向互补序列插入片段，或所述插入片段可替换SP1与SP2之间的序列。还有可能的是插入片段可整合在SP1靶标位点与SP2靶标位点两者处。
另一表达盒包含编码额外三种引导RNA(两种引导RNA具有靶向Zm.GA20ox5基因的外显子1中两个紧密间隔开的靶标位点的由表2中的SP4和SP5 DNA序列编码的靶向/间隔体序列(也参见图1)；并且另一引导RNA具有靶向侧接于供体模板区域中的Zm.GA20ox5基因片段的两个相同经工程改造位点的由表2中的SP6 DNA序列编码的靶向/间隔体序列(也参见图1))的序列，所述序列可操作地连接于合成启动子。间隔体序列SP3或SP4靶向内源性Zm.GA20ox5基因的外显子-1中由约83个核苷酸间隔开的两个替代性断裂位点，而间隔体序列SP5靶向内源性Zm.GA20ox5基因的外显子-1中的另一断裂点，所述另一断裂点与SP4间隔体的裂解位点间隔开约577个核苷酸的较大距离。靶向/间隔体序列SP6源于已被单独证明与Cpf1组合来起指导大豆植物的内源性PDS基因中靶标位点的裂解的作用的大豆PDS基因。
设计另一几乎相同的植物转化构建体(pMON422388)以在Zm.GA20ox3基因中创建双链断裂(DSB)来允许插入Zm.GA20ox5基因的反义DNA片段，但这个第二构建体不编码用于模板辅助方法的具有由SP6 DNA序列编码的靶向/间隔体序列的引导RNA，以致片段将来源于Zm.GA20ox5基因的内源性拷贝。
采用这个实施例中所述的构建体，具有间隔体SP3和SP4的引导RNA可与具有间隔体SP5的引导RNA组合来起作用，将从内源性Zm.GA20ox5基因的外显子-1产生在约500与700bp之间的片段，所述片段可以相反互补定向插入至内源性Zm.GA20ox3基因的外显子-1内的位点中，以致从内源性Zm.GA20ox3基因转录的RNA分子形成RNA转录物中的可触发对内源性Zm.GA20ox3和/或Zm.GA20ox5基因的其他一个或多个拷贝或等位基因的阻抑或沉默的茎-环结构。视涉及间隔体SP3还是SP4而定，所得片段可被称为SP3-SP5片段(SEQ ID NO:13)或SP4-SP5片段(SEQ ID NO:14)。此外，如果与以上所述的含有SP6序列的第一转化构建体组合使用，那么含有由两个SP6间隔体序列侧接的Zm.GA20ox5基因片段的供体模板可产生Zm.GA20ox5基因片段(被称为SP6-SP6片段(例如SEQ ID NO:26))，以采用相反互补定向插入至内源性Zm.GA20ox3基因内的位点中。
编码引导RNA间隔体和它们的预定靶标位点的DNA序列列于表2中。
表2.用于编辑Zm.GA20ox3基因座的实例引导RNA。
Figure BDA0003255407500000971
Figure BDA0003255407500000981
实施例2.对使用实施例1中的构建体获得的在植物中的倒位编辑的确认
通过土壤杆菌介导的转化用以上在实施例1中所述的转化载体中的一者转化近交玉米植物株系。使经转化植物组织生长以产生成熟R0植物。使具有一个或多个独特基因组编辑的R0植物自交以产生R1植物。为确定R0和R1植物的内源性Zm.GA20ox3基因中的编辑和插入，用被设计来鉴定预定插入物的大小或接合部的引物进行一种或两种PCR测定方法。一种方法使用包括一种杂交于插入Zm.GA20ox5基因片段中的序列的引物(SEQ ID NO:21)和杂交于内源性GA20ox3基因中的序列的另一引物(SEQ ID NO:22)的PCR引物对，其中使引物定向以致当Zm.GA20ox5基因片段以反义定向插入内源性GA20ox3基因中时产生PCR产物(即所述PCR产物仅穿过当以倒置反义方向定向时的插入片段的3′末端而产生)。如果产生了PCR片段，那么Zm.GA20ox5基因片段以反义定向插入在靶标位点处。此外，还可通过PCR产物大小以及/或者对PCR产物测序来确定和区分插入Zm.GA20ox5片段来源于内源性Zm.GA20ox5基因座还是供体模板区域。这个第一PCR方法用于确定哪个类型的倒置插入存在于内源性Zm.GA20ox3基因中(参见表3和表4)。
根据第二PCR方法，PCR引物对包括一种杂交于在Zm.GA20ox3基因中的两个引导RNA靶标位点(SP1和SP2)的上游(在5′侧)的序列的引物(SEQ ID NO:23)和杂交于在两个SP1和SP2引导RNA靶标位点的下游的序列的另一引物(SEQ ID NO:24)，以致产生跨越Zm.GA20ox3基因中的可能插入位点的PCR产物。因此，使用这个方法，PCR片段的存在和大小将显示插入是否存在于靶标位点处，而与定向无关。还可对PCR产物测序以确定插入的类型和定向。根据这个第二方法，PCR产物的大小/序列还可用于确定插入GA20ox5片段来源于内源性GA20ox5基因座还是供体模板区域，并且可通过是否存在野生型PCR片段大小/序列来确定植物的接合性。
测定通过使具有一个或多个编辑的R0植物自交产生的单个R1植物的插入类型以及插入突变体或等位基因的接合性(参见表3和表4)。如本文所用，“纯合”意指就突变等位基因来说是纯合的，并且“杂合”意指就突变等位基因来说是杂合的。表3和表4还提供经编辑GA20氧化酶3基因的从起始至终止密码子的编码序列或区域的基因组DNA序列，以及经编辑GA20氧化酶3基因的此编码序列或区域内的倒位序列或反义序列(各自由SEQ ID NO表示)。为避免重复，对于每个编辑标识符，倒位类型以及编码和倒位序列仅提供在表3和表4的第一行中。表3中的编辑标识符E270933和E271059以pMON419922构建体产生，并且表4中的编辑标识符E376333和E376314(和编辑标识符E376274)使用pMON422388构建体所创建。额外编辑以这些构建体产生，但未在R1植物/种子中重获，具有其他T-DNA插入，以及/或者不产生小RNA，因此被丢弃，并且未经推进用于进一步测试。用pMON422388构建体创建的包含插入至GA20ox3 SP1靶标位点中的倒置GA20ox5 SP4-SP5片段的编辑标识符E376274未在R1植物/种子中重获，因此未经推进。GA20氧化酶3基因的编辑标识符E376274具有SEQ IDNO:35的基因组编码序列和SEQ ID NO:36的倒位序列。
表3和表4还提供关于可存在于GA20氧化酶5基因中的一个或多个可能的简单/小型或较大编辑或缺失的信息。一个或多个简单或小型缺失也可在单个SP3、SP4和SP5靶标位点中的一者或多者处存在于内源性GA20氧化酶5(GA20ox5)基因中，并且一个或多个大型缺失可跨越SP3/SP5或SP4/SP5靶标位点之间存在于内源性GA20ox5基因中。对于pMON422388构建体，表4提供根据编辑标识符分组的R1植物的汇合信息和数目。如可在表3和表4中所见，在许多情况下，R0和R1植物确实在GA20ox5基因座中含有一个或多个编辑或缺失，但未测出一些R1植物(在表格中指定为“未知”)在GA20ox5基因中含有编辑或缺失。在其他情况下，未确定经编辑GA20ox5等位基因的接合性，因此指定为“纯合性或杂合性”。然而，存在于R0和R1植物中的经编辑GA20ox5等位基因在后续世代中从经编辑GA20ox3等位基因移除和分离。
表3.关于pMON419922的在R0和R1植物中的编辑倒位和接合性
Figure BDA0003255407500001001
Figure BDA0003255407500001011
Figure BDA0003255407500001021
Figure BDA0003255407500001031
表4.关于pMON422388的在R0和R1植物中的编辑倒位和接合性
Figure BDA0003255407500001041
Figure BDA0003255407500001051
实施例3.具有经编辑等位基因的玉米植物的植物高度降低
使就GA20氧化酶3基因的具有在实施例2中鉴定的相应倒位的经编辑等位基因来说是杂合的R1玉米植物生长至成熟以连同野生型对照植物一起测量它们的植物高度。在土壤中种植R1种子，并且使用用于玉米植物生长和发育的标准营养物和光照条件，使其在温室中在85℉/70℉(29.4℃/21.1℃)的白天/夜晚温度和16小时光照/8小时黑暗的光照期下生长至成熟。在R2生长阶段时从土壤平面至最上完全展开叶的基部来测量这些R1植物的植物高度(PHT)。表5提供就两个发夹倒位编辑中的一者来说是杂合的单个R1植物以及野生型对照植物的植物高度。还提供了关于野生型和每个编辑的平均植物高度(也参见显示平均植物高度以及误差棒的图2)。
这些植物高度证明相对于野生型对照的64.2英寸的平均植物高度，就包含倒位序列的经编辑GA20氧化酶3等位基因来说是杂合的植物具有降低的植物高度，对于两个经编辑等位基因，平均是54.0英寸或57.3英寸。
这个实施例中显示的植物高度数据证明相较于野生型对照植物，就GA20氧化酶3基因的包含反义倒位序列的经编辑等位基因来说是杂合的植物具有显著降低的植物高度，从而表明GA20氧化酶3基因的这些经编辑发夹倒位等位基因以显性或半显性方式起产生植物高度降低表型(即半矮化或矮株型玉米植物)的作用，尤其是因为已显示在无反义或倒位序列的情况下，GA20氧化酶3或GA20氧化酶5基因的单独经编辑功能丧失等位基因不产生矮株型玉米植物。参见例如公开PCT申请第WO/2019/161149、WO/2019/161147和WO/2019/161144号，所述公开PCT申请的全部内容和公开内容通过引用并入本文。然而，这些R1植物中的许多就一个或多个经编辑GA20ox5等位基因来说还可为纯合的或杂合的(参见表3)。许多R1植物的经编辑GA20ox5等位基因的存在和接合性是未知的，但关于E270933编辑标识符的R1植物标识符P758040、P757888、P757932和P757985就GA20ox5基因中的大型缺失来说是杂合的，R1植物标识符P758352就GA20ox5基因中的小型缺失来说是纯合的，R1植物标识符P758343在GA20ox5基因中含有一个或多个小型缺失和T-DNA插入，并且P758336就GA20ox5基因中的小型缺失来说是纯合的或杂合的。因此，有可能的是GA20ox5基因中的一个或多个额外突变也可对R1植物高度具有影响。将在移除了经编辑GA20ox5等位基因的后续世代中进行进一步植物高度测量以确认较矮植物高度表型。
表5.就Zm.GA20ox3的经编辑倒位等位基因来说是杂合的R1植物的植物高度
Figure BDA0003255407500001061
Figure BDA0003255407500001071
实施例4.从R2或R3植物收集样品以用于分子测定。
对于由pMON419922构建体获得的E270933倒位编辑，使就E270933编辑来说是杂合的R1植物(P757982)自交(自花受粉)以获得所选纯合性R2植物，使所述所选纯合性R2植物它们自身(i)进行自花受粉以产生纯合性近交R3植物或(ii)与另一优良亲本株系杂交以产生杂合性杂交R3植物。对于由pMON422388构建体获得的E376333倒位编辑，使在GA20ox5基因中含有大型缺失的就E376333编辑来说是纯合的R1植物(P127584)(i)进行自花受粉以产生纯合性近交R2植物或(ii)与另一优良亲本株系杂交以产生杂合性杂交R2植物。存在于R1植物中的经编辑GA20ox5等位基因通过分离和选择在R2和R3植物中被移除。使含有E270933编辑的R3植物、含有E376333编辑的R2植物、以及相同亲本株系的野生型对照植物在标准条件下在温室中生长，并且在V2生长阶段时取样以进行以下描述的分子测定。就在土壤平面以上切割植物，并且将植物的整个地上部分放置在50mL锥形管中并立刻在液氮中冷冻。每个样品含有一个或两个具有相同基因型的同胞植物。每种测定和基因型的样品的数目提供于表6中。研磨冷冻样品，并且用于以下实施例5和6中所述的小RNA和GA激素测定。
表6.用于小RNA和GA激素测定的样品的描述。
Figure BDA0003255407500001081
实施例5.具有经编辑倒位等位基因的植物中小RNA的检测。
为产生用于测序的小RNA文库，根据制造商方案(文件号15004197v02)使用Illumina的TruSeq小RNA文库制备试剂盒，其中在文库纯化步骤时进行了修改。用于这个小RNA测定实验的每种基因型的样品标识在以上实施例4中。在扩增cDNA之后，使用用于尺寸分离的6％Novex TBE PAGE凝胶对单个文库进行凝胶纯化。用1x SYBR Gold染色凝胶20分钟。在Illumina的NextSeq平台上，以每个样品300万个读段的最小深度对最终文库产物测序。在测序之后，通过以下步骤处理读段：修剪测序衔接物；移除匹配于持家非编码RNA的读段；并且将文库以每百万读段中的读段数作归一化。测定了每种基因型1个与9个之间的样品。
预测从含有E270933和E376333倒位编辑的经编辑GA20氧化酶3基因表达的mRNA会产生包含倒位序列和GA20氧化酶3中的天然序列的发夹或茎-环RNA结构，所述天然序列互补于并且可杂交于倒位序列。因为双链RNA发夹或茎-环结构可触发对编码相同或同源性RNA序列的基因的RNA干扰(RNAi)和阻抑，所以测定了含有倒位编辑的植物中小RNA的存在。将预期RNAi会从在这个实施例中由GA20ox5倒位序列和GA20ox3天然序列组成的茎-环结构的茎产生在长度方面是约21个核苷酸的小RNA(21聚体)。
如图3中所示，在来自含有经编辑GA20ox3等位基因的植物的样品中检测到对应于包含来自GA20ox5的倒位序列和经编辑GA20ox3基因的相应序列的经编辑茎-环的茎中的区域的小21聚体RNA，从而指示在来自这些经编辑植物的组织中存在小RNA，所述小RNA不存在于野生型对照植物中。将这些小RNA的丰度测量为每百万总测序读段中的读段的数目。小RNA存在于就经编辑等位基因来说是纯合的近交植物和就经编辑等位基因来说是杂合的杂交植物中，其中这些小RNA在每百万读段中19与84个读段数之间的范围内。鉴于杂合性杂交植物相比于纯合性近交植物产生较少小RNA，小RNA的丰度似乎与经编辑GA20ox3等位基因的拷贝的数目一致。
在这些样品中存在对应于经编辑GA20ox3基因的经编辑互补性茎区域的小RNA与经编辑GA20ox3倒位等位基因触发对GA20ox3基因以及可能还对GA20ox5基因的RNAi阻抑一致。额外实验将确定相对于对照，在就含有倒位序列的经编辑GA20ox3或GA20ox5等位基因来说是纯合的或杂合的植物中，GA20ox3和/或GA20ox5mRNA转录物的水平是否降低。
实施例6.具有经编辑倒位等位基因的植物中GA激素的检测。
GA20氧化酶基因的降低的表达可改变玉米植物中GA激素的水平，此可转而影响植物高度，其中较低水平的活性GA潜在地降低植物高度。测量含有经编辑GA20ox3等位基因的植物中生物活性GA激素和它们的前体的水平。GA20氧化酶在GA生物合成路径中具有活性，并且催化代谢中间产物GA12和GA53分别依序氧化成GA9和GA20(“早期13-羟基化路径”和“非13-羟基化路径”)。GA的主要生物活性形式包括在生物合成路径中在GA20氧化酶活性以及GA9和GA20中间体的更下游的GA1、GA3和GA4。如可在GA20ox3倒位编辑的情况下所预期，GA20氧化酶基因的表达水平和/或酶功能的降低或阻抑可导致下游代谢物(GA20和GA9)的降低以及上游前体(GA53和GA12)的积累。
对于这个实验，收集如在以上实施例4中提供的样品。使用Waters固相萃取MAX柱筒板提取和净化新鲜冷冻的植物样品组织。使用与采用MRM方法的ABSciex 5500质谱测定法联用的UPLC分析GA激素和两种内部标准物。用ABSciex软件Multi-Quan基于校正曲线计算最终GA激素值。每个GA激素校正曲线处于良好线性拟合下，R2线性回归>0.99。在分析过程中还包括和评估了在每种激素的情况下每个96孔板八个技术对照以满足标准准则。以pmol/克样品组织测量GA水平。
如图4中所示，相对于野生型对照植物，GA12的水平在就经编辑等位基因(E270933和E376333)来说是纯合的近交植物中增加，但在就经编辑E270933和E376333等位基因来说是杂合的杂交植物中是统计中性的或未改变的。如图4中进一步所示，各自相对于野生型对照植物，GA9的水平在就经编辑等位基因中的一者(E270933)来说是纯合的近交植物中增加，但在就另一经编辑等位基因(E376333)来说是纯合的近交植物中是中性的，并且GA9的水平在就经编辑等位基因来说是杂合的杂交植物中是中性的(E270933)或降低的(E376333)。
如图5中所示，各自相对于野生型对照植物，GA20的水平在就经编辑等位基因中的一者(E376333)来说是纯合的近交植物中降低，但在就另一经编辑等位基因(E270933)来说是纯合的近交植物中增加，并且GA20的水平在就这些经编辑等位基因来说是杂合的杂交植物中是中性的(E270933)或降低的(E376333)。如图5中进一步所示，相对于野生型对照植物，GA53的水平在就每个经编辑等位基因(E270933和E376333)来说是纯合的近交植物中以及在就每个经编辑等位基因(E270933和E376333)来说是杂合的杂交植物中增加。
图6提供相对于野生型对照，于在经编辑近交和杂交植物的V2生长阶段时收集的样品中测量的活性GA(GA1、GA3和GA4)的水平的结果。如图6中所示，在含有经编辑等位基因(E270933和E376333)中的每一者的近交和杂交植物中，这些活性GA的水平通常无统计学变化，例外之处是就经编辑等位基因中的一者(E270933)来说是纯合的近交植物中GA4小幅增加。
这些数据支持含有倒位序列，并且编码可形成RNA茎-环结构的转录物的经编辑GA20氧化酶3基因能够影响含有经编辑等位基因的近交和杂交植物中GA激素的水平的理论。尽管这个实验中的数据是混杂的，但对于在含有经编辑GA20氧化酶3等位基因的植物中在GA20氧化酶活性的上游的GA12和GA53前体的积累增加以及GA20氧化酶活性的GA9和GA20产物的水平降低存在支持，虽然一些样品具有增加水平的下游GA9和GA20产物。对在经编辑GA20氧化酶3等位基因的情况下降低的GA20氧化酶表达和/或活性的更大支持在这个实施例中由上游GA12和GA53前体的积累的水平提供。GA12在来自具有经编辑GA20氧化酶3等位基因的植物的样品中是中性的至增加的，并且GA53在来自具有经编辑GA20氧化酶3等位基因的植物的所有样品中都增加。
尽管在这个实施例中未显示生物活性GA的水平降低，但这可归因于收集植物组织样品所处的早期V2生长阶段。含有倒位、反义或茎-环序列的转录物的从内源性GA20氧化酶3基因座表达的样式还取决于内源性GA20氧化酶3基因启动子，所述启动子在V2生长阶段时可能不驱动表达(或在足够高水平下表达)以对GA激素的水平产生可测量影响。在不受理论束缚下，有可能的是在稍后发育阶段时，在相应GA20ox3或GA20ox5内源性启动子的控制下，含有倒位/发夹的转录物从内源性GA20ox3或GA20ox5基因的经编辑等位基因的表达可为更大的，因此对在那些稍后阶段时GA激素的水平具有更大影响。活性GA也在GA20氧化酶活性的更下游，并且不是GA20氧化酶活性的直接产物。未来实验将确定是否在稍后发育阶段时在就经编辑GA20氧化酶3或GA20氧化酶5等位基因来说是杂合的或纯合的植物中观察到较低活性GA水平。这由在早期V2生长阶段时在这个实施例中观察到的GA前体的水平改变所支持。
Figure IDA0003255407550000011
Figure IDA0003255407550000021
Figure IDA0003255407550000031
Figure IDA0003255407550000041
Figure IDA0003255407550000051
Figure IDA0003255407550000061
Figure IDA0003255407550000071
Figure IDA0003255407550000081
Figure IDA0003255407550000091
Figure IDA0003255407550000101
Figure IDA0003255407550000111
Figure IDA0003255407550000121
Figure IDA0003255407550000131
Figure IDA0003255407550000141
Figure IDA0003255407550000151
Figure IDA0003255407550000161
Figure IDA0003255407550000171
Figure IDA0003255407550000181
Figure IDA0003255407550000191
Figure IDA0003255407550000201
Figure IDA0003255407550000211
Figure IDA0003255407550000221
Figure IDA0003255407550000231
Figure IDA0003255407550000241
Figure IDA0003255407550000251
Figure IDA0003255407550000261
Figure IDA0003255407550000271
Figure IDA0003255407550000281
Figure IDA0003255407550000291
Figure IDA0003255407550000301
Figure IDA0003255407550000311
Figure IDA0003255407550000321
Figure IDA0003255407550000331
Figure IDA0003255407550000341
Figure IDA0003255407550000351
Figure IDA0003255407550000361
Figure IDA0003255407550000371
Figure IDA0003255407550000381
Figure IDA0003255407550000391
Figure IDA0003255407550000401
Figure IDA0003255407550000411
Figure IDA0003255407550000421
Figure IDA0003255407550000431
Figure IDA0003255407550000441
Figure IDA0003255407550000451
Figure IDA0003255407550000461
Figure IDA0003255407550000471
Figure IDA0003255407550000481
Figure IDA0003255407550000491
Figure IDA0003255407550000501
Figure IDA0003255407550000511
Figure IDA0003255407550000521
Figure IDA0003255407550000531
Figure IDA0003255407550000541

Claims (92)

1.一种包含内源性GA20氧化酶_3基因座的突变等位基因的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述突变等位基因包含插入至所述内源性GA20氧化酶_3基因座中的DNA区段，其中所述DNA区段编码与SEQ ID NO:1-3以及5-7中的一者或多者的至少20个连续核苷酸至少70％互补的反义RNA序列，并且其中所述内源性GA20氧化酶_3基因座的所述突变等位基因产生包含所述反义RNA序列的RNA转录物。
2.如权利要求1所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述内源性GA20氧化酶_3基因座的所述突变等位基因阻抑所述内源性GA20氧化酶_3基因座的野生型等位基因、内源性GA20氧化酶_5基因座的野生型等位基因、或两者的表达。
3.如权利要求1所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述RNA转录物还包含所述内源性GA20氧化酶_3基因座的一种或多种选自由以下组成的组的序列元件：5′UTR、第1外显子、第1内含子、第2外显子、第2内含子、第3外显子、3′UTR、以及它们的任何部分。
4.如权利要求1所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述DNA区段包含来源于所述内源性GA20氧化酶_3基因座的核苷酸序列。
5.如权利要求4所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述DNA区段对应于所述内源性GA20氧化酶_3基因座的倒置基因组片段。
6.如权利要求1所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述DNA区段包含来源于内源性GA20氧化酶_5基因座的核苷酸序列。
7.如权利要求6所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述DNA区段对应于所述内源性GA20氧化酶_5基因座的倒置基因组片段。
8.如权利要求1所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述反义RNA序列的至少一部分与所述RNA转录物的相应内源性序列至少70％互补。
9.如权利要求8所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述RNA转录物的所述相应内源性序列与SEQ ID NO:1-3以及5-7中的一者或多者的至少20个连续核苷酸至少85％同一。
10.如权利要求8或9所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述DNA区段插入在所述内源性GA20氧化酶_3基因座的相应内源性DNA区段的附近或邻近处。
11.如权利要求10所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述反义RNA序列与所述RNA转录物的所述相应内源性序列形成茎-环结构。
12.如权利要求10所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述突变等位基因的插入DNA区段和所述相应内源性DNA区段由间插DNA序列分隔。
13.如权利要求12所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述间插DNA序列包含所述内源性GA20氧化酶_3基因座的天然序列。
14.如权利要求12所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述间插DNA序列包含插入至所述内源性GA20氧化酶_3基因座中的外源性序列。
15.如权利要求8所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述DNA区段插入在选自由以下组成的组的区域内：所述内源性GA20氧化酶_3基因座的5′非翻译区(UTR)、第1外显子、第1内含子、第2外显子、第2内含子、第3外显子和3′UTR、以及它们的组合。
16.如权利要求8所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述DNA区段插入在通过靶向编辑技术识别以创建双链断裂(DSB)的基因组位点处。
17.如权利要求8所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述突变等位基因还包含所述内源性GA20氧化酶_3基因座的至少一个部分的缺失。
18.如权利要求8所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述DNA区段的有义链包含与所述内源性GA20氧化酶_3基因座、或内源性GA20氧化酶_5基因座的外显子序列至少70％互补的序列。
19.如权利要求8所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述DNA区段的有义链包含与所述内源性GA20氧化酶_3基因座、或内源性GA20氧化酶_5基因座的非翻译区(UTR)序列至少70％互补的序列。
20.如权利要求8所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述DNA区段的有义链包含与所述内源性GA20氧化酶_3基因座、或内源性GA20氧化酶_5基因座的外显子序列和内含子序列至少70％互补的序列，所述外显子序列和所述内含子序列在所述内源性基因座内是邻近的。
21.如权利要求8所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述DNA区段包含与SEQID No:13、14、26、28、30、32和36中的一者或多者具有至少70％同一性的序列。
22.如权利要求1至21中任一项所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述玉米植物就在所述内源性GA20氧化酶_3基因座处的所述突变等位基因来说是纯合的。
23.如权利要求1至21中任一项所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述玉米植物就在所述内源性GA20氧化酶_3基因座处的所述突变等位基因来说是杂合的。
24.如权利要求1至23中任一项所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中相对于未修饰对照植物，所述经修饰玉米植物具有更矮的植物高度和/或改善的倒伏抗性。
25.如权利要求1至24中任一项所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中在所述经修饰玉米植物的茎或秆的至少一种节间组织中，相比于未修饰对照植物的相同节间组织，一种或多种活性GA的水平是较低的。
26.如权利要求1至25中任一项所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述经修饰玉米植物在至少一个雌性器官或穗中不具有任何显著异型。
27.一种用于产生内源性GA20氧化酶_3基因座的突变等位基因的方法，所述方法包括：
a.使用靶向编辑技术在玉米细胞中的所述内源性GA20氧化酶_3基因座中产生双链断裂；以及
b.在所述双链断裂处插入DNA区段，其中所述DNA区段编码与SEQ ID NO:1-3以及5-7中的一者或多者的至少20个连续核苷酸至少70％互补的反义RNA序列，并且其中所述内源性GA20氧化酶_3基因座的所述突变等位基因产生包含所述反义RNA序列的RNA转录物。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述靶向编辑技术包括使用至少一种位点特异性核酸酶。
29.如权利要求27所述的方法，其中所述DNA区段来源于所述内源性GA20氧化酶_3基因座或内源性GA20氧化酶_5基因座。
30.如权利要求27所述的方法，其中在供体模板中提供所述DNA区段。
31.如权利要求27所述的方法，其中所述方法还包括从所述玉米细胞再生或发育成玉米植物。
32.如权利要求27所述的方法，其中所述内源性GA20氧化酶_3基因座的所述突变等位基因能够阻抑所述内源性GA20氧化酶_3基因座的野生型等位基因、内源性GA20氧化酶_5基因座的野生型等位基因、或两者的表达。
33.如权利要求27至32中任一项所述的方法，其中将所述DNA区段插入在所述内源性GA20氧化酶_3基因座的相应内源性DNA区段的附近或邻近处。
34.如权利要求33所述的方法，其中由插入DNA区段编码的所述反义RNA序列杂交于所述RNA转录物的由所述相应内源性DNA区段编码的相应内源性序列。
35.如权利要求33所述的方法，其中所述反义RNA序列与所述RNA转录物的所述相应内源性序列形成茎-环结构。
36.如权利要求33所述的方法，其中所述突变等位基因的插入DNA区段和所述相应内源性DNA区段由间插DNA序列分隔。
37.如权利要求36所述的方法，其中所述间插DNA序列包含所述内源性GA20氧化酶_3基因座的天然序列。
38.如权利要求36所述的方法，其中所述间插DNA序列包含插入至所述内源性GA20氧化酶_3基因座中的外源性序列。
39.如权利要求33所述的方法，其中所述DNA区段插入在选自由以下组成的组的区域内：所述内源性GA20氧化酶_3基因座的5′非翻译区(UTR)、第1外显子、第1内含子、第2外显子、第2内含子、第3外显子和3′UTR、以及它们的组合。
40.如权利要求33所述的方法，其中所述DNA区段的有义链包含(i)所述内源性GA20氧化酶_3或GA20氧化酶_5基因座的外显子序列的反向互补序列，或(ii)与所述反向互补序列至少70％同一的序列。
41.如权利要求33所述的方法，其中所述DNA区段的有义链包含(i)所述内源性GA20氧化酶_3或GA20氧化酶_5基因座的非翻译区(UTR)序列的反向互补序列，或(ii)与所述反向互补序列至少70％同一的序列。
42.如权利要求33所述的方法，其中所述DNA区段的有义链包含(i)所述内源性GA20氧化酶_3或GA20氧化酶_5基因座的外显子序列和内含子序列的反向互补序列，并且其中所述外显子序列和所述内含子序列在所述内源性基因座内是邻近的，或(ii)与所述反向互补序列至少70％同一的序列。
43.如权利要求33所述的方法，其中所述DNA区段包含与SEQ ID No:13、14、26、28、30、32和36中的一者或多者具有至少70％同一性的序列。
44.一种用于产生内源性GA20氧化酶_3基因座的突变等位基因的方法，所述方法包括：
a.使用靶向编辑技术在玉米细胞中的所述内源性GA20氧化酶_3基因座中产生第一双链断裂和第二双链断裂；以及
b.在所述第一双链断裂与所述第二双链断裂之间插入DNA区段，其中所述DNA区段编码与SEQ ID NO:1-3以及5-7中的一者或多者的至少20、至少25、至少30、至少40、至少50、至少75、至少100、至少150、至少200、至少300、至少400、至少500、至少750、或至少1000个连续核苷酸至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％互补的反义RNA序列，并且其中所述内源性GA20氧化酶_3基因座的所述突变等位基因产生包含所述反义RNA序列的RNA转录物。
45.一种包含内源性GA20氧化酶_5基因座的突变等位基因的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述突变等位基因包含插入至所述内源性GA20氧化酶_5基因座中的DNA区段，其中所述DNA区段编码与SEQ ID NO:1-3以及5-7中的一者或多者的至少20个连续核苷酸至少70％互补的反义RNA序列，并且其中所述内源性GA20氧化酶_5基因座的所述突变等位基因产生包含所述反义RNA序列的RNA转录物。
46.如权利要求45所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述内源性GA20氧化酶_5基因座的所述突变等位基因阻抑内源性GA20氧化酶_3基因座的野生型等位基因、所述内源性GA20氧化酶_5基因座的野生型等位基因、或两者的表达。
47.如权利要求45所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述RNA转录物还包含所述内源性GA20氧化酶_5基因座的一种或多种选自由以下组成的组的序列元件：5′UTR、第1外显子、第1内含子、第2外显子、第2内含子、第3外显子、3′UTR、以及它们的任何部分。
48.如权利要求45所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述DNA区段包含来源于内源性GA20氧化酶_3基因座的核苷酸序列。
49.如权利要求48所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述DNA区段对应于所述内源性GA20氧化酶_3基因座的倒置基因组片段。
50.如权利要求45所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述DNA区段包含来源于所述内源性GA20氧化酶_5基因座的核苷酸序列。
51.如权利要求50所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述DNA区段对应于所述内源性GA20氧化酶_5基因座的倒置基因组片段。
52.如权利要求45所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述反义RNA序列的至少一部分与所述RNA转录物的相应内源性序列至少70％互补。
53.如权利要求52所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述RNA转录物的所述相应内源性序列与SEQ ID NO:1-3以及5-7中的一者或多者的至少20个连续核苷酸至少85％同一。
54.如权利要求52或53所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述DNA区段插入在所述内源性GA20氧化酶_5基因座的相应内源性DNA区段的附近或邻近处。
55.如权利要求54所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述反义RNA序列与所述RNA转录物的所述相应内源性序列形成茎-环结构。
56.如权利要求54所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述突变等位基因的插入DNA区段和所述相应内源性DNA区段由间插DNA序列分隔。
57.如权利要求56所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述间插DNA序列包含所述内源性GA20氧化酶_5基因座的天然序列。
58.如权利要求56所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述间插DNA序列包含插入至所述内源性GA20氧化酶_5基因座中的外源性序列。
59.如权利要求52所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述DNA区段插入在选自由以下组成的组的区域内：所述内源性GA20氧化酶_5基因座的5′非翻译区(UTR)、第1外显子、第1内含子、第2外显子、第2内含子、第3外显子和3′UTR、以及它们的组合。
60.如权利要求52所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述DNA区段插入在通过靶向编辑技术识别以创建双链断裂(DSB)的基因组位点处。
61.如权利要求52所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述突变等位基因还包含所述内源性GA20氧化酶_5基因座的至少一个部分的缺失。
62.如权利要求52所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述DNA区段的有义链包含与内源性GA20氧化酶_3基因座、或所述内源性GA20氧化酶_5基因座的外显子序列至少70％互补的序列。
63.如权利要求52所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述DNA区段的有义链包含与内源性GA20氧化酶_3基因座、或所述内源性GA20氧化酶_5基因座的非翻译区(UTR)序列至少70％互补的序列。
64.如权利要求52所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述DNA区段的有义链包含与内源性GA20氧化酶_3基因座、或所述内源性GA20氧化酶_5基因座的外显子序列和内含子序列至少70％互补的序列，所述外显子序列和所述内含子序列在所述内源性基因座内是邻近的。
65.如权利要求52所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述DNA区段包含与SEQID No:13、14、26、28、30、32和36中的一者或多者具有至少70％同一性的序列。
66.如权利要求45所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述玉米植物就在所述内源性GA20氧化酶_5基因座处的所述突变等位基因来说是纯合的。
67.如权利要求45所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述玉米植物就在所述内源性GA20氧化酶_5基因座处的所述突变等位基因来说是杂合的。
68.如权利要求45至67中任一项所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中相对于未修饰对照植物，所述经修饰玉米植物具有更矮的植物高度和/或改善的倒伏抗性。
69.如权利要求45至68中任一项所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中在所述经修饰玉米植物的茎或秆的至少一种节间组织中，相比于未修饰对照植物的相同节间组织，一种或多种活性GA的水平是较低的。
70.如权利要求45至69中任一项所述的经修饰玉米植物或其植物部分，其中所述经修饰玉米植物在至少一个雌性器官或穗中不具有任何显著异型。
71.一种用于产生内源性GA20氧化酶_5基因座的突变等位基因的方法，所述方法包括：
a.使用靶向编辑技术在玉米细胞中的所述内源性GA20氧化酶_5基因座中产生双链断裂(DSB)；以及
b.使用靶向编辑技术在所述DSB处插入DNA区段，其中所述DNA区段编码与SEQ ID NO:1-3以及5-7中的一者或多者的至少20个连续核苷酸至少70％互补的反义RNA序列，并且其中所述内源性GA20氧化酶_5基因座的所述突变等位基因产生包含所述反义RNA序列的RNA转录物。
72.如权利要求71所述的方法，其中所述靶向编辑技术包括使用至少一种位点特异性核酸酶。
73.如权利要求71所述的方法，其中所述DNA区段来源于内源性GA20氧化酶_3基因座或所述内源性GA20氧化酶_5基因座。
74.如权利要求71所述的方法，其中在供体模板中提供所述DNA区段。
75.如权利要求71所述的方法，其中所述方法还包括从所述玉米细胞再生或发育成玉米植物。
76.如权利要求71所述的方法，其中所述内源性GA20氧化酶_5基因座的所述突变等位基因能够阻抑内源性GA20氧化酶_3基因座的野生型等位基因、所述内源性GA20氧化酶_5基因座的野生型等位基因、或两者的表达。
77.如权利要求71所述的方法，其中将所述DNA区段插入在所述内源性GA20氧化酶_5基因座的相应内源性DNA区段的附近或邻近处。
78.如权利要求77所述的方法，其中由插入DNA区段编码的所述反义RNA序列杂交于所述RNA转录物的由所述相应内源性DNA区段编码的相应内源性序列。
79.如权利要求77所述的方法，其中所述反义RNA序列与所述RNA转录物的所述相应内源性序列形成茎-环结构。
80.如权利要求77所述的方法，其中所述突变等位基因的插入DNA区段和所述相应内源性DNA区段由间插DNA序列分隔。
81.如权利要求80所述的方法，其中所述间插DNA序列包含所述内源性GA20氧化酶_5基因座的天然序列。
82.如权利要求80所述的方法，其中所述间插DNA序列包含插入至所述内源性GA20氧化酶_5基因座中的外源性序列。
83.如权利要求77所述的方法，其中所述DNA区段插入在选自由以下组成的组的区域内：所述内源性GA20氧化酶_5基因座的5′非翻译区(UTR)、第1外显子、第1内含子、第2外显子、第2内含子、第3外显子和3′UTR、以及它们的组合。
84.如权利要求77所述的方法，其中所述DNA区段的有义链包含(i)内源性GA20氧化酶_3基因座或所述内源性GA20氧化酶_5基因座的外显子序列的反向互补序列，或(ii)与所述反向互补序列至少70％同一的序列。
85.如权利要求77所述的方法，其中所述DNA区段的有义链包含(i)内源性GA20氧化酶_3基因座或所述内源性GA20氧化酶_5基因座的非翻译区(UTR)序列的反向互补序列，或(ii)与所述反向互补序列至少70％同一的序列。
86.如权利要求77所述的方法，其中所述DNA区段的有义链包含(i)内源性GA20氧化酶_3基因座或所述内源性GA20氧化酶_5基因座的外显子序列和内含子序列的反向互补序列，并且其中所述外显子序列和所述内含子序列在所述内源性基因座内是邻近的，或(ii)与所述反向互补序列至少70％同一的序列。
87.如权利要求77所述的方法，其中所述DNA区段包含与SEQ ID No:13、14、26、28、30、32和36中的一者或多者具有至少70％同一性的序列。
88.一种用于产生内源性GA20氧化酶_5基因座的突变等位基因的方法，所述方法包括：
a.使用靶向编辑技术在玉米细胞中的所述内源性GA20氧化酶_5基因座中产生第一双链断裂和第二双链断裂；以及
b.在所述第一双链断裂与所述第二双链断裂之间插入DNA区段，其中所述DNA区段编码与SEQ ID NO:1-3以及5-7中的一者或多者的至少20、至少25、至少30、至少40、至少50、至少75、至少100、至少150、至少200、至少300、至少400、至少500、至少750、或至少1000个连续核苷酸至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％互补的反义RNA序列，并且其中所述内源性GA20氧化酶_5基因座的所述突变等位基因产生包含所述反义RNA序列的RNA转录物。
89.一种用于产生玉米植物的方法，所述方法包括：
(a)用来自雄性玉米植物的花粉对至少一个雌性玉米植物进行受精，其中所述至少一个雌性玉米植物和/或所述雄性玉米植物包含内源性GA20氧化酶基因座的突变等位基因，其中所述突变等位基因包含插入至所述内源性GA20氧化酶基因座中的DNA区段，其中所述DNA区段编码与SEQ ID NO:1-3或5-7中的一者或多者的至少20个连续核苷酸至少70％互补的反义RNA序列，并且其中所述内源性GA20氧化酶基因座的所述突变等位基因产生包含所述反义RNA序列的RNA转录物；以及
(b)获得至少一个通过步骤(a)的所述受精产生的种子。
90.如权利要求89所述的方法，其中所述方法还包括(c)使在步骤(b)中获得的所述至少一个种子生长以产生至少一个包含所述突变等位基因的子代玉米植物。
91.一种包含内源性GA20氧化酶_3基因座的突变等位基因的经修饰玉米植物部分、玉米细胞或玉米组织，其中所述突变等位基因包含插入至所述内源性GA20氧化酶_3基因座中的DNA区段，其中所述DNA区段编码与SEQ ID NO:1-3以及5-7中的一者或多者的至少20个连续核苷酸至少70％互补的反义RNA序列，并且其中所述内源性GA20氧化酶_3基因座的所述突变等位基因产生包含所述反义RNA序列的RNA转录物。
92.一种包含内源性GA20氧化酶_5基因座的突变等位基因的经修饰玉米植物部分、玉米细胞或玉米组织，其中所述突变等位基因包含插入至所述内源性GA20氧化酶_5基因座中的DNA区段，其中所述DNA区段编码与SEQ ID NO:1-3以及5-7中的一者或多者的至少20个连续核苷酸至少70％互补的反义RNA序列，并且其中所述内源性GA20氧化酶_5基因座的所述突变等位基因产生包含所述反义RNA序列的RNA转录物。
CN202080020110.8A 2019-05-29 2020-05-28 用于使用基因组编辑产生显性矮株型等位基因的方法和组合物 Pending CN113557408A (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962854142P 2019-05-29 2019-05-29
US62/854,142 2019-05-29
US201962886726P 2019-08-14 2019-08-14
US62/886,726 2019-08-14
PCT/US2020/034993 WO2020243361A1 (en) 2019-05-29 2020-05-28 Methods and compositions for generating dominant short stature alleles using genome editing

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN113557408A true CN113557408A (zh) 2021-10-26

Family

ID=73553531

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202080020110.8A Pending CN113557408A (zh) 2019-05-29 2020-05-28 用于使用基因组编辑产生显性矮株型等位基因的方法和组合物

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20220195445A1 (zh)
EP (1) EP3977061A4 (zh)
CN (1) CN113557408A (zh)
BR (1) BR112021014917A2 (zh)
CA (1) CA3131193A1 (zh)
MX (1) MX2021014229A (zh)
UY (1) UY38724A (zh)
WO (1) WO2020243361A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114540529A (zh) * 2022-02-16 2022-05-27 吉林省农业科学院 一种半矮秆增产的玉米基因型、功能性分子标记InDel-K2及其应用

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9311147D0 (en) * 1993-05-28 1993-07-14 Long Ashton Research Station Regulation of plant growth
BR112014013853A2 (pt) * 2011-12-09 2020-01-14 Ceres Inc uso de um ácido nucleico isolado, método de obtenção de uma célula vegetal transgênica, método de obtenção de uma planta transgênica, método de produção de uma planta, método de produção de biomassa, método de processamento de biomassa, método de alteração da composição de biomassa, método de modulação de composição de biomassa, método de produção de um produto de forragem
CN117604023A (zh) * 2016-08-17 2024-02-27 孟山都技术公司 通过操纵赤霉素代谢增加可收获产量的用于矮株型植物的方法和组合物
WO2018119225A1 (en) * 2016-12-22 2018-06-28 Monsanto Technology Llc Genome editing-based crop engineering and production of brachytic plants
EP3752621A4 (en) * 2018-02-15 2021-12-01 Monsanto Technology LLC COMPOSITIONS AND METHODS FOR IMPROVING CROP YIELD BY STACKING CHARACTERS

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114540529A (zh) * 2022-02-16 2022-05-27 吉林省农业科学院 一种半矮秆增产的玉米基因型、功能性分子标记InDel-K2及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CA3131193A1 (en) 2020-12-03
WO2020243361A9 (en) 2021-11-18
BR112021014917A2 (pt) 2021-09-28
UY38724A (es) 2020-12-31
US20220195445A1 (en) 2022-06-23
MX2021014229A (es) 2022-01-06
EP3977061A1 (en) 2022-04-06
EP3977061A4 (en) 2023-07-26
WO2020243361A1 (en) 2020-12-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20200140874A1 (en) Genome Editing-Based Crop Engineering and Production of Brachytic Plants
US20230265132A1 (en) Compositions and methods for improving crop yields through trait stacking
US20210032649A1 (en) Methods and compositions for short stature plants through manipulation of gibberellin metabolism to increase harvestable yield
CN111971391A (zh) 通过编辑ga20氧化酶基因产生矮株型植物来增加可收获产量的方法和组合物
US20230242931A1 (en) Compositions and methods for improving crop yields through trait stacking
CN112567041A (zh) 通过编辑ga20氧化酶基因产生矮株型植物来增加可收获产量的方法和组合物
US11702670B2 (en) Compositions and methods for improving crop yields through trait stacking
US20220195445A1 (en) Methods and compositions for generating dominant short stature alleles using genome editing
US20220195450A1 (en) Methods and compositions for generating dominant short stature alleles using genome editing
US20220307042A1 (en) Compositions and methods for improving crop yields through trait stacking
US20220298527A1 (en) Compositions and methods for improving crop yields through trait stacking
US20230416769A1 (en) Compositions and methods for improving crop yields through trait stacking
WO2023164456A2 (en) Methods and compositions for short stature plants through manipulation of gibberellin metabolism to increase harvestable yield

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination