CN111971391A - 通过编辑ga20氧化酶基因产生矮株型植物来增加可收获产量的方法和组合物 - Google Patents
通过编辑ga20氧化酶基因产生矮株型植物来增加可收获产量的方法和组合物 Download PDFInfo
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Abstract
本公开提供了用于对GA20氧化酶基因的特定亚型进行编辑或突变以及实现这些编辑或突变的特定接合性组合的组合物和方法。还提供了具有降低GA20氧化酶基因的表达或活性的突变的修饰的植物及其植物部分和细胞，所述修饰的植物具有改善的特征，诸如降低的植株高度和增加的抗倒伏性，但没有异型。还提供了用于制备在GA20氧化酶基因的特定亚型中具有一个或多个突变的修饰的植物及其植物部分和细胞的方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年2月15日提交的美国临时申请号62/631,412和2018年2月15日提交的美国临时申请号62/631,416的权益，所述临时申请均以引用方式整体并入本文。
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背景技术
本公开涉及用于改善玉米中的性状(诸如抗倒伏性和增加的产量)的组合物和方法。
赤霉素(赤霉酸或GA)是调控多个主要的植物生长和发育过程的植物激素。在20世纪期间，对半矮化小麦、水稻和高粱植物品种中的GA水平的操纵使得这些谷类作物的产量增加且倒伏减少，这是绿色革命(Green Revolution)的主要原因。然而，尚未通过GA途径的操纵实现其他谷类作物(诸如玉米)的成功增产。实际上，GA途径基因中的一些突变和玉米中与产量不相容的多种异型(off-type)一直存在关联，这导致研究人员无法通过对GA途径的操纵来发现半矮化的高产玉米品种。
本领域中仍然需要开发具有增加的产量和/或抗倒伏性的单子叶植物或谷类作物植物，诸如玉米。
发明内容
在一个方面，本公开提供了一种修饰的玉米植物，所述修饰的玉米植物具有相对于野生型对照植物降低的植株高度，以及(i)相对于野生型对照植物增加的茎或秆直径，(ii)相对于野生型对照植物改善的抗倒伏性，或(iii)相对于野生型对照植物改善的耐旱性。
在一个方面，本公开提供了一种修饰的玉米植物或其植物部分，所述修饰的玉米植物或其植物部分具有期望的半矮化表型并且具有中等植株高度降低。在另一方面，具有适度降低的植株高度的修饰的玉米植物可提供优于具有常规高度的未修饰的植物或可能表现出植株高度显著降低的其他修饰的植物的农艺学优势。
在一个方面，本公开提供了一种修饰的玉米植物或其植物部分，所述修饰的玉米植物或其植物部分在GA20氧化酶_3基因座处包含突变等位基因并且在GA20氧化酶_5基因座处包含突变等位基因，其中所述GA20氧化酶_3基因座和所述GA20氧化酶_5基因座中的至少一者包含纯合突变等位基因。
在另一方面，本公开提供了一种修饰的玉米植物或其植物部分，所述修饰的玉米植物或其植物部分在GA20氧化酶_3基因和GA20氧化酶_5基因中的一者中包含第一纯合突变，并且在所述GA20氧化酶_3基因和所述GA20氧化酶_5基因中的另一者中还包含第二杂合或纯合突变。
在一个方面，本公开提供了一种制备修饰的玉米植物或其植物部分的方法，所述方法包括：(a)使包含所述GA20氧化酶_3基因座的突变等位基因的第一玉米植物与包含所述GA20氧化酶_5基因座的突变等位基因的第二植物杂交；以及(b)从步骤(a)中的杂交种中选择符合以下条件的子代玉米植物或其植物部分：(i)对于所述GA20氧化酶_3基因座的一个或多个突变等位基因是纯合的并且对于所述GA20氧化酶_5基因座的突变等位基因是杂合的，或者(ii)对于所述GA20氧化酶_3基因座的突变等位基因是杂合的并且对于所述GA20氧化酶_5基因座的一个或多个突变等位基因是纯合的。
在另一方面，本公开提供了一种制备修饰的玉米植物或其植物部分的方法，所述方法包括：(a)使包含所述GA20氧化酶_3基因座的突变等位基因和所述GA20氧化酶_5基因座的突变等位基因的第一玉米植物与第二植物杂交；以及(b)从步骤(a)中的杂交种中选择符合以下条件的子代玉米植物或其植物部分：(i)对于所述GA20氧化酶_3基因座的一个或多个突变等位基因是纯合的并且对于所述GA20氧化酶_5基因座的突变等位基因是杂合的，或者(ii)对于所述GA20氧化酶_3基因座的突变等位基因是杂合的并且对于所述GA20氧化酶_5基因座的一个或多个突变等位基因是纯合的。
附图说明
图1示出了与近交野生型对照植物和表达GA20氧化酶抑制构建体的植物相比，具有编辑的突变GA20氧化酶_3和/或GA20氧化酶_5基因的近交突变植物的植株高度。
具体实施方式
为了便于理解本公开，如本文所用的若干术语和缩写在下文定义如下：
当在两个或更多个项目的列表中使用时，术语“和/或”意指所列项目中的任一个可单独使用或与所列项目中的任何一个或多个组合使用。例如，表述“A和/或B”旨在表示A和B中的任一者或两者-即，单独的A、单独的B、或组合的A和B。表述“A、B和/或C”旨在表示单独的A、单独的B、单独的C、组合的A和B、组合的A和C、组合的B和C、或组合的A、B和C。
如本文所用的术语“约”旨在限定其所修饰的数值，将这样的值表示为在误差界限内是可变的。当没有列出具体的误差界限，诸如平均值的标准偏差时，术语“约”应理解为意指将涵盖所列出的值的范围和通过该数字的向上或向下舍入而将包括的范围，考虑到有效数字。
如本文所用，“基因座”是多态性核酸、性状定子、基因或标记物所在的染色体基因座或区域。两个同源染色体可共享一个“基因座”，以指代它们的对应基因座或区域。如本文所用，“等位基因”是指基因或特定基因座处的替代核酸序列(例如，与相同基因或基因座的其他等位基因不同的基因或基因座的核酸序列)。这样的等位基因可视为(i)野生型，或者(ii)如果相对于野生型等位基因，突变等位基因的核酸序列中存在一个或多个突变或编辑，那么这样的等位基因可视为突变型。相对于野生型等位基因，基因的突变等位基因可能具有降低或消除的基因活性或表达水平。对于二倍体生物体(诸如玉米)，第一等位基因可出现在一个染色体上，而第二等位基因可出现在第二同源染色体上的相同基因座上。如果植物的一个染色体上的基因座处的一个等位基因是突变等位基因，而植物的同源染色体上的另一个对应等位基因是野生型，那么所述植物被描述为对于所述突变等位基因杂合的。但是，如果一个基因座处的两个等位基因都是突变等位基因，那么所述植物被描述为对于所述突变等位基因纯合的。对于基因座处的突变等位基因纯合的植物可包含相同的突变等位基因或不同的突变等位基因(如果是异等位基因的或双等位基因的话)。
如本文所用，“野生型基因”或“野生型等位基因”是指这样的基因或等位基因：其具有在特定植物物种中最常见的序列或基因型，或相对于所述最常见的序列或基因型具有不会显著影响所述基因或等位基因的表达和活性的天然变异、多态性或其他沉默突变的另一种序列或基因型。实际上，“野生型”基因或等位基因不包含实质上影响基因或等位基因的正常功能、活性、表达或表型结果的变异、多态性或任何其他类型的突变。
如本文关于两个或更多个核苷酸或蛋白质序列所用的术语“同一性百分比”或“百分比相同”通过以下方式计算：(i)在比较窗口上比较两个最佳比对序列(核苷酸或蛋白质)，(ii)确定两条序列中出现相同核酸碱基(对于核苷酸序列)或氨基酸残基(对于蛋白质)的位置的数目以得到匹配位置的数目，(iii)将匹配位置的数目除以比较窗口中位置的总数，并且接着(iv)将该商乘以100％以得到同一性百分比。为了计算DNA序列与RNA序列之间的“同一性百分比”，将RNA序列的尿嘧啶(U)视为与DNA序列的胸腺嘧啶(T)相同。如果比较窗口被定义为两个或更多个序列之间比对的区域(即，不包括在比较序列之间不相同的所比对的多核苷酸序列的5’端和3’端的核苷酸，或所比对的蛋白质序列的N末端和C末端的氨基酸)，那么“同一性百分比”也可称为“比对同一性百分比”。如果在没有指定具体比较窗口的情况下相对于参考序列计算“同一性百分比”，那么通过将比对区域上的匹配位置的数目除以参考序列的总长度来确定同一性百分比。因此，出于本公开的目的，当对两条序列(查询和目标)进行最佳比对(在其比对中允许空位)时，查询序列的“同一性百分比”等于两条序列之间的相同位置的数目除以查询序列在其长度(或比较窗口)上位置的总数，然后乘以100％。
已经认识到，不相同的蛋白质的残基位置的差别往往在于保守氨基酸取代，其中氨基酸残基由具有相似大小和化学特性(例如，电荷、疏水性、极性等)的其他氨基酸残基取代，因此可不改变分子的功能特性。当序列差别在于保守取代时，可上调序列相似性百分比以校正一个或多个非相同取代的保守性质。差别在于此类保守取代的序列被称为具有“序列相似性”或“相似性”。因此，如本文关于两个或更多个蛋白质序列所用的“相似性百分比”或“百分比相似”通过以下方式计算：(i)在比较窗口上比较两个最佳比对的蛋白质序列，(ii)确定两条序列中出现相同或相似氨基酸残基的位置的数目以得到匹配位置的数目，(iii)将匹配位置的数目除以比较窗口(或如果未指定比较窗口的话，那么为参考或查询蛋白的总长度)中位置的总数，并且接着(iv)将该商乘以100％以得到相似性百分比。蛋白质的保守氨基酸取代是本领域已知的。
为了最佳比对序列以计算它们的同一性或相似性百分比，本领域已知多种成对或多序列比对算法和程序，诸如ClustalW或Basic Local Alignment Search
等，它们可用于比较两个或更多个核苷酸或蛋白质序列之间的序列同一性或相似性。尽管其他比对和比较方法是本领域已知的，但是两条序列之间的比对(包括上述同一性百分比范围)可如通过ClustalW或
算法所确定的，参见，例如，ChennaR.等人,“Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs,”Nucleic Acids Research 31:3497-3500(2003)；Thompson JD等人,“Clustal W:Improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment throughsequence weighting,position-specific gap penalties and weight matrix choice,”Nucleic Acids Research 22:4673-4680(1994)；以及Larkin MA等人,“Clustal W andClustal X version 2.0,”Bioinformatics 23:2947-48(2007)；以及Altschul,S.F.、Gish,W.、Miller,W.、Myers,E.W.和Lipman,D.J.(1990)"Basic local alignment searchtool."J.Mol.Biol.215:403-410(1990)，所述文献的全部内容和公开内容以引用方式并入本文。
如本文关于两个核苷酸序列所用的术语“互补性百分比”或“百分比互补”类似于同一性百分比的概念，但是指当对查询序列和目标序列进行线性排列和最佳碱基配对而没有诸如环、茎或发夹的二级折叠结构时与目标序列的核苷酸最佳碱基配对或杂交的查询序列的核苷酸的百分比。这种互补性百分比可介于两条DNA链、两条RNA链、或DNA链与RNA链之间。“互补性百分比”通过以下方式计算：(i)在比较窗口上以线性且完全延伸的排列方式(即，没有折叠或二级结构)对两个核苷酸序列进行最佳碱基配对或杂交，(ii)确定在比较窗口上在两条序列之间碱基配对的位置的数目以得到互补位置的数目，(iii)将互补位置的数目除以比较窗口中位置的总数，并且(iv)将该商乘以100％以得到两条序列的互补性百分比。两条序列的最佳碱基配对可基于通过氢键合实现的核苷酸碱基的已知配对(诸如G-C、A-T和A-U)来确定。如果在没有指定具体比较窗口的情况下相对于参考序列计算“互补性百分比”，那么通过将两个线性序列之间的互补位置的数目除以参考序列的总长度来确定同一性百分比。因此，出于本公开的目的，当对两条序列(查询和目标)进行最佳碱基配对(允许错配或非碱基配对的核苷酸，但没有折叠或二级结构)时，查询序列的“互补性百分比”等于两条序列之间的碱基配对位置的数目除以查询序列在其长度(或查询序列在比较窗口上的位置数目)上的位置总数，然后乘以100％。
如本文所用，植物、植物种子、植物部分、植物细胞和/或植物基因组的上下文中的“修饰的”是指相对于野生型或对照植物、植物种子、植物部分、植物细胞和/或植物基因组包括一种或多种GA氧化酶基因的表达水平和/或编码序列的工程改造变化的植物、植物种子、植物部分、植物细胞和/或植物基因组，诸如通过影响(例如，降低或消除)一种或多种内源GA3和/或GA20氧化酶基因的表达水平或活性的基因组编辑事件或突变实现。实际上，术语“修饰的”还可指具有通过化学诱变、转座子插入或切除、或任何其他已知的诱变技术引入的、或通过基因组编辑引入的影响一种或多种内源GA氧化酶基因(诸如一种或多种内源GA3和/或GA20氧化酶基因)的表达的一个或多个突变的植物、植物种子、植物部分、植物细胞和/或植物基因组。因此，为清楚起见，修饰的植物、植物种子、植物部分、植物细胞和/或植物基因组包括突变的和/或编辑的植物、植物种子、植物部分、植物细胞和/或植物基因组，其相对于野生型或对照植物、植物种子、植物部分、植物细胞和/或植物基因组具有一种或多种GA氧化酶基因的改变的表达水平、表达模式和/或编码序列。修饰的植物可对于任何给定的突变或编辑为纯合的或杂合的，并且/或者在GA氧化酶基因座处可为双等位基因的。如果GA氧化酶基因的每个拷贝均被不同的等位基因(即，一个或多个不同的突变和/或编辑)修饰，那么修饰的植物对于GA氧化酶基因是双等位基因的，其中每个等位基因均会降低GA氧化酶基因的表达水平和/或活性。修饰的植物或种子可包含影响一种或多种GA氧化酶基因(诸如一种或多种GA3和/或GA20氧化酶基因)的表达的各种分子变化，包括遗传和/或表观遗传修饰。修饰的植物、植物部分、种子等可已经受诱变、基因组编辑或定点整合(例如但不限于通过使用位点特异性核酸酶的方法)、遗传转化(例如但不限于通过农杆菌转化或微粒轰击的方法)或它们的组合。此类“修饰的”植物、植物种子、植物部分和植物细胞包括为保留一种或多种GA氧化酶基因的分子变化(例如，表达水平和/或活性的变化)的“修饰的”植物、植物种子、植物部分和植物细胞的后代或由其衍生的植物、植物种子、植物部分和植物细胞。本文所提供的修饰的种子可产生本文所提供的修饰的植物。本文所提供的修饰的植物、植物种子、植物部分、植物细胞或植物基因组可包含如本文所提供的重组DNA构建体或载体或基因组编辑。“修饰的植物产品”可以是由本文所提供的修饰的植物、植物部分、植物细胞、或植物染色体或其任何部分或组分制成的任何产品。
如本文所用，术语“纯合的”是指在二倍体基因组的给定基因座处包含两个相同等位基因的基因型，或在二倍体基因组的给定基因座处包含两个不同突变等位基因的基因型。后一种包含两个不同突变等位基因的基因型也称为异等位基因的或交叉杂合的(transheterozygous)，或称为异等位基因组合。如本文所用，“杂合的”描述在二倍体基因组的给定基因座处包含突变等位基因和野生型等位基因的基因型。
如本文所用，术语“对照植物”(或类似的“对照”植物种子、植物部分、植物细胞和/或植物基因组)是指用于与修饰的植物(或修饰的植物种子、植物部分、植物细胞和/或植物基因组)进行比较且除了影响一种或多种GA氧化酶基因的一个或多个基因组编辑事件之外具有与修饰的植物(或植物种子、植物部分、植物细胞和/或植物基因组)相同或相似的遗传背景(例如，相同的亲本系、杂交种、近交系、测试种等)的植物(或植物种子、植物部分、植物细胞和/或植物基因组)。例如，对照植物可以是与用于制备修饰的植物的近交系相同的近交系，或者对照植物可以是与修饰的植物相同的近交亲本系的杂交种的产物，不同的是在对照植物中不存在影响一种或多种GA氧化酶基因的任何一个或多个基因组编辑事件。类似地，未修饰的对照植物是指与修饰的植物享有基本上相似或大体上相同的遗传背景，但没有修饰的植物的基因组的一个或多个工程改造变化(例如，转基因、突变或编辑)。为了与修饰的植物、植物种子、植物部分、植物细胞和/或植物基因组进行比较，“野生型植物”(或类似的“野生型”植物种子、植物部分、植物细胞和/或植物基因组)是指非转基因和非基因组编辑的对照植物、植物种子、植物部分、植物细胞和/或植物基因组。如本文所用，“对照”植物、植物种子、植物部分、植物细胞和/或植物基因组还可以是与修饰的植物、植物种子、植物部分、植物细胞和/或植物基因组具有相似(但不一样或相同)的遗传背景的植物、植物种子、植物部分、植物细胞和/或植物基因组，条件是认为足够相似以用于进行待分析的特征或性状的比较。
如本文所用，用于基因组编辑的“靶位点”是指植物基因组内的多核苷酸序列的位置，所述位置被位点特异性核酸酶结合和切割，从而向多核苷酸序列和/或其互补DNA链的核酸骨架中引入双链断裂(或单链切口)。靶位点可包括至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个、至少27个、至少29个、或至少30个连续核苷酸。用于RNA指导的核酸酶的“靶位点”可包含靶位点处的双链核酸(DNA)分子或染色体的任一互补链的序列。位点特异性核酸酶可与靶位点结合，诸如通过非编码指导RNA(例如但不限于，如下文进一步描述的CRISPR RNA(crRNA)或单指导RNA(sgRNA))。本文所提供的非编码指导RNA可与靶位点互补(例如，与靶位点处的双链核酸分子或染色体的任一链互补)。应当理解，非编码指导RNA与靶位点结合或杂交可能不需要完全的同一性或互补性。例如，可容许靶位点与非编码RNA之间有至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、或至少8个错配(或更多)。“靶位点”还指植物基因组内的多核苷酸序列的位置，所述位置被可不通过非编码RNA分子指导的另一位点特异性核酸酶(诸如大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)或类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN))结合和切割，从而向多核苷酸序列和/或其互补DNA链中引入双链断裂(或单链切口)。如本文所用，“靶区域”或“靶向区域”是指侧翼为两个或更多个靶位点的多核苷酸序列或区域。在不作限制的情况下，在一些实施方案中，靶区域可经受突变、缺失、插入或倒位。如本文所用，“侧翼的”当用于描述多核苷酸序列或分子的靶区域时，是指靶区域周围的多核苷酸序列或分子的两个或更多个靶位点，在靶区域的每一侧具有一个靶位点。除了基因组编辑之外，术语“靶位点”还可在基因抑制的上下文中用于指与由抑制构建体编码的非编码RNA分子(例如，miRNA、siRNA等)的至少一部分互补的mRNA分子的一部分(例如，“识别位点”)。
均于2017年8月17日提交的共同未决的PCT申请号PCT/US2017/047405和美国申请号15/679,699以引用方式整体并入本文。
大多数产谷粒的禾草，诸如小麦、水稻和高粱，在穗的每个颖花内产生雄性和雌性结构(即，它们具有单一的生殖结构)。然而，玉米(corn或maize)在产谷粒禾草中是独特的，因为它形成单独的雄性花序(雄穗)和雌性花序(穗)。玉米通过在发育阶段前期内选择性地停止穗小花中的雄性器官(花药)和雄穗小花中的雌性器官(胚珠)的发育而产生完全性二形的生殖结构。精确调控的赤霉素合成和信号传导对于这种选择性停止发育过程的调控至关重要，其中雌性生殖穗对GA途径的破坏最敏感。实际上，“花药穗”表型是GA玉米突变体中最常见的生殖表型。
与玉米相比，引起小麦、水稻和高粱的“绿色革命”的赤霉素合成或信号传导途径的突变对它们的生殖结构几乎没有影响，因为这些作物物种在发育期间不经历携带圆锥花序的谷粒的选择性停止发育过程，并且因此对GA水平的破坏不敏感。在玉米中尚未使用相同的突变，因为除了在一些情况下的极端矮化之外，GA合成和信号传导途径的破坏已经反复导致穗(“花药穗”)的明显畸变和雄性化以及雄穗的不育性(被破坏的花药和小孢子发育)。参见，例如，Chen,Y.等人,“The Maize DWARF1 Encodes a Gibberellin 3-Oxidaseand Is Dual Localized to the Nucleus and Cytosol,”Plant Physiology 166:2028-2039(2014)。玉米中的这些GA突变表型(异型)导致籽粒产生的显著降低和产量的降低。此外，在穗内产生花药增加了真菌或昆虫感染的可能性，这降低了在这些突变穗上产生的谷粒的质量。用于开发半矮化玉米品系的向前育种(Forward breeding)尚未成功，并且GA突变体的生殖异型(以及极端矮化)一直难以克服。因此，在其他禾草中引起绿色革命的GA途径中的相同突变在玉米中尚未成功。
尽管通过GA途径的操纵在玉米中实现更高的谷粒产量存在这些先前的困难，但本发明人已经发现了以降低总体植株高度和茎节间长度并增加抗倒伏性，但不造成先前与玉米中GA途径的突变相关联的生殖异型的方式操纵玉米植物中的GA水平的方法。另外的证据表明，这些矮株型或半矮化玉米植物也可具有一个或多个另外的性状，包括增加的茎直径、减少的未成熟折断、较深的根、增加的叶面积、较早的冠层闭合、较高的气孔导度、较低的穗高度、增加的叶片含水量、改善的耐旱性、增加的氮利用效率、增加的水利用效率、在正常或限氮或限水胁迫条件下减少的叶中花色素苷含量和面积、增加的穗重量、增加的籽粒数量、增加的籽粒重量、增加的产量和/或增加的收获指数。
根据本公开的实施方案，提供了修饰的玉米植物，所述修饰的玉米植物具有至少一种有益的农艺学性状和至少一个基本上或完全不含异型的雌性生殖器官或穗。有益的农艺学性状可包括，例如，较短的植株高度、一个或多个节间中较短的节间长度、较大(较厚)的茎或秆直径、增加的抗倒伏性、改善的耐旱性、增加的氮利用效率、增加的水利用效率、较深的根、较大的叶面积、较早的冠层闭合和/或增加的可收获产量。异型可包括雄性(雄穗或花药)不育、减少的籽粒或种子数量，和/或在植物的雌性器官或穗(例如，花药穗)中存在一个或多个雄性化的或雄性(或类雄性)生殖结构。本文提供了一种修饰的玉米植物，所述修饰的玉米植物在植物的生殖组织中没有显著的异型。这种修饰的玉米植物可具有相对于对照或野生型植物似乎正常的雌性生殖器官或穗。实际上，提供了包括至少一个生殖器官或穗的修饰的玉米植物，所述生殖器官或穗不具有或不表现出，或基本上或完全不含异型，所述异型包括雄性不育、减少的籽粒或种子数量和/或一个或多个雌性器官或穗中的一个或多个雄性化结构。如本文所用，如果在生殖阶段后期基于雌性器官或穗的视觉检查在植物的雌性器官或穗中不存在或几乎不存在雄性生殖结构，那么植物(诸如玉米)的雌性器官或穗“基本上不含”雄性生殖结构。如果在生殖阶段后期通过雌性器官或穗的视觉检查发现在植物(诸如玉米植物)的雌性器官或穗中不存在或未观察到或观察不到雄性生殖结构，那么植物(诸如玉米)的雌性器官或穗“完全不含”成熟的雄性生殖结构。在穗中没有显著异型且基本上不含雄性生殖结构的植物(诸如玉米)的雌性器官或穗的每个植物雌性器官或穗的籽粒或种子数量可为每个野生型或对照植物雌性器官或穗的籽粒或种子数量的至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、或至少99.9％。同样，在穗中没有显著异型且基本上不含雄性生殖结构的植物(诸如玉米)的雌性器官或穗的每个植物雌性器官或穗的平均籽粒或种子重量可为每个野生型或对照植物雌性器官或穗的平均籽粒或种子重量的至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、或至少99.9％。完全不含成熟的雄性生殖结构的植物(诸如玉米)的雌性器官或穗可具有与野生型或对照植物大致相同的每个植物雌性器官或穗的籽粒或种子数量。换句话说，植物的雌性器官或穗的生殖发育可以是正常或基本上正常的。然而，每个雌性器官或穗的种子或籽粒的数量可取决于影响植物的资源利用和发育的其他因素。实际上，每个植物雌性器官或穗的籽粒或种子数量和/或每个植物雌性器官或穗的籽粒或种子重量可与野生型或对照植物大致相同或比野生型或对照植物更大。
植物激素赤霉素在包括发芽、细胞伸长、开花、胚胎发生和种子发育在内的多个植物发育过程中发挥重要作用。GA途径中的某些生物合成酶(例如，GA20氧化酶和GA3氧化酶)和分解代谢酶(例如，GA2氧化酶)对于影响植物组织中的活性GA水平是至关重要的。
谷类植物中的几种GA氧化酶由相关GA氧化酶基因的家族组成。例如，玉米具有至少9个GA20氧化酶基因的家族，这些GA20氧化酶基因包括GA20氧化酶_1、GA20氧化酶_2、GA20氧化酶_3、GA20氧化酶_4、GA20氧化酶_5、GA20氧化酶_6、GA20氧化酶_7、GA20氧化酶_8和GA20氧化酶_9。然而，在玉米中仅有两种GA3氧化酶，即GA3氧化酶_1和GA3氧化酶_2。表1中以SEQ ID NO形式提供了这些GA20氧化酶基因中的每一个的DNA和蛋白质序列。
表1.通过序列标识符给出的玉米中GA20氧化酶基因的DNA和蛋白质序列.
| GA20氧化酶基因 | cDNA | 编码顺序(CDS) | 蛋白质 |
| GA20氧化酶_1 | SEQ ID NO:1 | SEQ ID NO:2 | SEQ ID NO:3 |
| GA20氧化酶_2 | SEQ ID NO:4 | SEQ ID NO:5 | SEQ ID NO:6 |
| GA20氧化酶_3 | SEQ ID NO:7 | SEQ ID NO:8 | SEQ ID NO:9 |
| GA20氧化酶_4 | SEQ ID NO:10 | SEQ ID NO:11 | SEQ ID NO:12 |
| GA20氧化酶_5 | SEQ ID NO:13 | SEQ ID NO:14 | SEQ ID NO:15 |
| GA20氧化酶_6 | SEQ ID NO:16 | SEQ ID NO:17 | SEQ ID NO:18 |
| GA20氧化酶_7 | SEQ ID NO:19 | SEQ ID NO:20 | SEQ ID NO:21 |
| GA20氧化酶_8 | SEQ ID NO:22 | SEQ ID NO:23 | SEQ ID NO:24 |
| GA20氧化酶_9 | SEQ ID NO:25 | SEQ ID NO:26 | SEQ ID NO:27 |
GA20氧化酶_3的基因组DNA序列在SEQ ID NO:34中提供，并且GA20氧化酶_5的基因组DNA序列在SEQ ID NO:35中提供。对于GA20氧化酶_3基因，SEQ ID NO:34提供了在GA20氧化酶_35’-UTR上游的3000个核苷酸；核苷酸3001-3096对应于5’-UTR；核苷酸3097-3665对应于第一外显子；核苷酸3666-3775对应于第一内含子；核苷酸3776-4097对应于第二外显子；核苷酸4098-5314对应于第二内含子；核苷酸5315-5584对应于第三外显子；并且核苷酸5585-5800对应于3’-UTR。SEQ ID NO:34还提供了在3’-UTR的末端下游的3000个核苷酸(核苷酸5801-8800)。对于GA20氧化酶_5基因，SEQ ID NO:35提供了在GA20氧化酶_5起始密码子上游的3000个核苷酸(核苷酸1-3000)；核苷酸3001-3791对应于第一外显子；核苷酸3792-3906对应于第一内含子；核苷酸3907-4475对应于第二外显子；核苷酸4476-5197对应于第二内含子；核苷酸5198-5473对应于第三外显子；并且核苷酸5474-5859对应于3’-UTR。SEQ ID NO:35还提供了在3’-UTR的末端下游的3000个核苷酸(核苷酸5860-8859)。
本文所提供的修饰的植物、植物部分、细胞或外植体可属于优良品种或优良品系。优良品种或优良品系是指通过针对优异的农艺学表现育种和选择所得到的品种。本文所提供的编辑的植物、细胞、或外植体可以是杂种植物、细胞或外植体。如本文所用，“杂种”是通过使来自不同品种、品系、近交系或物种的两种植物杂交，使得子代包含来自每个亲本的遗传物质而产生的。技术人员应认识到也可生成更高级的杂种。例如，可通过将品种A与品种B杂交产生A x B杂种来制备第一杂种，并且可通过将品种C与品种D杂交产生C x D杂种来制备第二杂种。可将第一杂种和第二杂种进一步杂交以产生包含来自所有四个亲本品种的遗传信息的更高级的杂种(A x B)x(C x D)。
植物基因组中的靶向突变可通过引入双链断裂(DSB)或切口来实现。根据此方法，可通过DSB或切口的不完全修复在靶位点处引入诸如缺失、插入、倒位和/或取代的突变，以产生GA氧化酶基因的敲除或敲低。即使在不使用供体模板分子的情况下，也可通过靶向基因座的不完美修复产生此类突变。GA氧化酶基因的“敲除”可通过在GA氧化酶基因的内源基因座处或附近诱导DSB或切口来实现，这导致GA氧化酶蛋白的不表达或非功能蛋白的表达；而GA氧化酶基因的“敲低”可通过在GA氧化酶基因的内源基因座处或附近诱导DSB或切口而以类似方式实现，所述DSB或切口在不影响GA氧化酶基因的编码序列的位点处以将消除所编辑的GA氧化酶蛋白的功能的方式不完全修复。例如，内源基因座内的DSB或切口的位点可处于GA氧化酶基因的上游或5'区(例如，启动子和/或增强子序列)，以影响或降低其表达水平。类似地，GA氧化酶基因的此类靶向敲除或敲低突变可用供体模板分子产生，以通过DSB或切口的修复在靶位点处或附近引导特定或期望的突变。相对于DSB或切口位点处或附近的靶向基因组序列，供体模板分子可包含，所述同源序列具有或不具有插入序列且包含一个或多个突变，诸如一个或多个缺失、插入、倒位和/或取代。例如，GA氧化酶基因的靶向敲除突变可通过使基因的至少一部分缺失或倒位或通过将移码或提前终止密码子引入基因的编码序列中来实现。GA氧化酶基因的一部分的缺失还可通过在两个靶位点处产生DSB或缺口并造成侧翼为靶位点的居间靶区域的缺失来引入。
本文所提供位点特异性核酸酶可选自由以下组成的组：锌指核酸酶(ZFN)、大范围核酸酶、RNA指导的核酸内切酶、TALE核酸内切酶(TALEN)、重组酶、转座酶或它们的任意组合。参见，例如，Khandagale,K.等人,“Genome editing for targeted improvement inplants,”Plant Biotechnol Rep 10:327-343(2016)；以及Gaj,T.等人,“ZFN,TALEN andCRISPR/Cas-based methods for genome engineering,”Trends Biotechnol.31(7):397-405(2013)，所述文献的内容和公开内容以引用方式并入本文。重组酶可以是与DNA识别基序附接的丝氨酸重组酶、与DNA识别基序附接的酪氨酸重组酶或本领域已知的其他重组酶。重组酶或转座酶可以是与DNA结合结构域附接的DNA转座酶或重组酶。与DNA识别基序附接的酪氨酸重组酶可选自由Cre重组酶、Flp重组酶和Tnp1重组酶组成的组。根据一些实施方案，本文所提供的Cre重组酶或Gin重组酶拴系于锌指DNA结合结构域。在另一个实施方案中，本文所提供的与DNA识别基序附接的丝氨酸重组酶选自由PhiC31整合酶、R4整合酶和TP-901整合酶组成的组。在另一个实施方案中，本文所提供的与DNA结合结构域附接的DNA转座酶选自由TALE-piggyBac和TALE-Mutator组成的组。
根据本公开的实施方案，RNA指导的核酸内切酶可选自由以下组成的组：Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csn1和Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、Cpf1、CasX、CasY以及它们的同源物或修饰形式、Argonaute(Argonaute蛋白的非限制性实例包括嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)Argonaute(TtAgo)、激烈热球菌(Pyrococcus furiosus)Argonaute(PfAgo)、格氏嗜盐碱杆菌(Natronobacterium gregoryi；NgAgo)以及它们的同源物或修饰形式。根据一些实施方案，RNA指导的核酸内切酶可以是Cas9或Cpf1酶。
在一个方面，本文所提供的位点特异性核酸酶选自由以下组成的组：锌指核酸酶、大范围核酸酶、RNA指导的核酸酶、TALE核酸酶、重组酶、转座酶或它们的任意组合。在另一方面，本文所提供的位点特异性核酸酶选自由Cas9或Cpf1组成的组。在另一方面，本文所提供的位点特异性核酸酶选自由以下组成的组：Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、Cpf1、CasX、CasY、它们的同源物、或它们的修饰形式。在另一方面，本文所提供的RNA指导的核酸酶选自由Cas9或Cpf1组成的组。在另一方面，本文所提供的RNA指导的核酸酶选自由以下组成的组：Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、Cpf1、CasX、CasY、它们的同源物、或它们的修饰形式。在另一方面，本文所提供的方法和/或组合物包含至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、或至少十种位点特异性核酸酶。在另一方面，本文所提供的方法和/或组合物包含至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、或至少十种多核苷酸，所述多核苷酸编码至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、或至少十种位点特异性核酸酶。
对于RNA指导的核酸内切酶，还提供了指导RNA(gRNA)分子，以通过碱基配对或杂交引导核酸内切酶到达植物基因组中的靶位点，从而在靶位点处或附近产生DSB或切口。gRNA可作为gRNA分子，或作为包含与植物可表达启动子可操作地连接的编码指导RNA的可转录DNA序列的重组DNA分子、构建体或载体被转化或引入植物细胞或组织中(可能连同核酸酶或编码核酸酶的DNA分子、构建体或载体一起)。如本领域所理解的，“指导RNA”可包括，例如，CRISPR RNA(crRNA)、单链指导RNA(sgRNA)，或可指导或引导核酸内切酶到达基因组中的特定靶位点的任何其他RNA分子。“单链指导RNA”(或“sgRNA”)是包含通过接头序列共价连接tracrRNA的crRNA的RNA分子，其可表达为单个RNA转录物或分子。指导RNA包含与植物基因组内(诸如GA氧化酶基因处或附近)的靶位点相同或互补的指导或靶向序列。原间隔序列邻近基序(PAM)可存在于基因组中、紧邻与指导RNA的靶向序列互补的基因组靶位点序列的5’端且在其上游-即，紧邻基因组靶位点(相对于指导RNA的靶向序列)的有义(+)链的下游(3’)，如本领域已知的。参见，例如，Wu,X.等人,“Target specificity of theCRISPR-Cas9 system,”Quant Biol.2(2):59-70(2014)，所述文献的内容和公开内容以引用方式并入本文。与靶位点(相对于指导RNA的靶向序列)相邻的有义(+)链上的基因组PAM序列可包含5’-NGG-3’。然而，指导RNA的对应序列(即，紧邻指导RNA的靶向序列的下游(3’))通常可不与基因组PAM序列互补。指导RNA通常可以是不编码蛋白质的非编码RNA分子。指导RNA的指导序列的长度可为至少10个核苷酸，诸如长度为12-40个核苷酸、12-30个核苷酸、12-20个核苷酸、12-35个核苷酸、12-30个核苷酸、15-30个核苷酸、17-30个核苷酸、或17-25个核苷酸，或长度为约12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个或更多个核苷酸。指导序列可与基因组靶位点处的DNA序列的至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、或更多个连续核苷酸具有至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％同一性或互补性。
在一个方面，通过基因组编辑技术编辑GA20氧化酶_3基因。对于利用RNA指导的核酸内切酶在GA20氧化酶_3基因处或附近进行基因编辑，可使用包含指导序列的指导RNA，所述指导序列与SEQ ID NO:34或其互补序列的至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个或更多个连续核苷酸(例如，SEQ ID NO:34或其互补序列的12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个或更多个连续核苷酸)具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％同一性或互补性。对于利用RNA指导的核酸内切酶在GA20氧化酶_5基因处或附近进行基因编辑，可使用包含指导序列的指导RNA，所述指导序列与SEQ ID NO:35或其互补序列的至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个或更多个连续核苷酸(例如，SEQ ID NO:35或其互补序列的10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个或更多个连续核苷酸)具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％同一性或互补性。如本文所用，关于多核苷酸或蛋白质序列的术语“连续”意指序列中没有缺失或空位。
对于通过基因组编辑进行的敲低(和可能的敲除)突变，RNA指导的核酸内切酶可靶向GA20氧化酶_3或GA20氧化酶_5基因的上游或下游序列，诸如启动子和/或增强子序列、或内含子、5’UTR和/或3’UTR序列，以使所述基因的一个或多个启动子和/或调控序列突变并影响或降低其表达水平。对于玉米中的GA20氧化酶_3基因的敲低(和可能的敲除)，可使用包含指导序列的指导RNA，所述指导序列与SEQ ID NO:34的核苷酸序列范围1-3096、SEQIDNO:34的核苷酸序列范围3666-3775、SEQ ID NO:34的核苷酸序列范围4098-5314、SEQIDNO:34的核苷酸序列范围5585-5800、或SEQ ID NO:34的核苷酸序列范围5801-8800或其互补序列内的至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、或更多个连续核苷酸(例如，SEQ ID NO:34的核苷酸序列范围1-3096、3666-3775、4098-5314、5585-5800、5801-8800或5585-8800、或其互补序列内的10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个或更多个连续核苷酸)具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％同一性或互补性。
对于玉米中的GA20氧化酶_5基因的敲低(和可能的敲除)，可使用包含指导序列的指导RNA，所述指导序列与SEQ ID NO:35的核苷酸序列范围1-3000、SEQ IDNO:35的核苷酸序列范围1-3000、SEQ ID NO:35的核苷酸序列范围3792-3906、SEQ IDNO:35的核苷酸序列范围4476-5197、或SEQ ID NO:35的核苷酸序列范围5860-8859或其互补序列内的至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、或更多个连续核苷酸(例如，SEQ ID NO:35的核苷酸序列范围1-3000、3792-3906、4476-5197或5860-8859、或其互补序列内的10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个或更多个连续核苷酸)具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％同一性或互补性。
对于通过基因组编辑进行的敲除(和可能的敲低)突变，RNA指导的核酸内切酶可靶向GA20氧化酶_3或GA20氧化酶_5基因的编码和/或内含子序列，以潜在地消除所述基因的功能GA氧化酶蛋白的表达和/或活性。然而，在一些情况下，通过靶向基因的一个或多个上游和/或5'UTR序列，或基因的基因组基因座处或附近的其他序列，也可实现GA氧化酶基因表达的敲除。因此，可通过靶向靶标GA20氧化酶_3或GA20氧化酶_5基因的位点或基因座处或附近的基因组序列、GA20氧化酶_3或GA20氧化酶_5基因的上游或下游序列(诸如启动子和/或增强子序列、或内含子、5'UTR和/或3'UTR序列)来实现GA氧化酶基因表达的敲除，如上文针对GA20氧化酶_3或GA20氧化酶_5基因的敲低所描述的。
对于玉米中的GA20氧化酶_3基因的敲除(和可能的敲低)，可使用包含指导序列的指导RNA，所述指导序列与SEQ ID NO:34的核苷酸序列范围3097-5584、SEQ ID NO:34的核苷酸序列范围3097-3665、SEQ ID NO:34的核苷酸序列范围3776-4097、或SEQ ID NO:34的核苷酸序列范围5315-5584或其互补序列内的至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、或更多个连续核苷酸(例如，SEQ ID NO:34的核苷酸序列范围3097-5584、3097-3665、3097-3775、3665-4097、3776-4097、3776-5314、4098-5584或5315-5584、或其互补序列内的10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个或更多个连续核苷酸)具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％同一性或互补性。
对于玉米中的GA20氧化酶_5基因的敲除(和可能的敲低)，可使用包含指导序列的指导RNA，所述指导序列与SEQ ID NO:35的核苷酸序列范围3001-5473、SEQ ID NO:35的核苷酸序列范围3001-3791、SEQ ID NO:35的核苷酸序列范围3907-4475、或SEQ ID NO:35的核苷酸序列范围5198-5473或其互补序列内的至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、或更多个连续核苷酸(例如，SEQ ID NO:35的核苷酸序列范围3001-5473、3001-3791、3001-3906、3792-4475、3907-4475、3907-5197、4476-5473或5198-5473、或其互补序列内的10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个或更多个连续核苷酸)具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％同一性或互补性。
根据一些实施方案，提供了用于靶向内源GA20氧化酶_3和/或GA20氧化酶_5基因的指导RNA，所述指导RNA可包含与SEQ ID NO:138-167中的任何一个或多个的至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、或至少21个连续核苷酸具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％同一性或互补性的指导序列。根据一些实施方案，提供了用于靶向内源GA20氧化酶_3和GA20氧化酶_5基因两者的指导RNA，所述指导RNA可包含与SEQ ID NO:34的至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、或至少21个连续核苷酸具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％同一性或互补性且与SEQ ID NO:35的至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、或至少21个连续核苷酸具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％同一性或互补性的指导序列。根据一些实施方案，提供了用于靶向内源GA20氧化酶_3和GA20氧化酶_5基因两者的指导RNA，所述指导RNA可包含与SEQ ID NO:158-167中的任何一个或多个的至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、或至少21个连续核苷酸具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％同一性或互补性的指导序列。
除了指导序列之外，指导RNA还可包含一个或多个其他结构或支架序列，所述一个或多个其他结构或支架序列可与RNA指导的核酸内切酶结合或相互作用。此类支架或结构序列还可与其他RNA分子(例如，tracrRNA)相互作用。用于设计使用RNA指导的核酸内切酶在植物基因组内的靶位点处进行基因组编辑和定点整合的靶向构建体和指导RNA的方法和技术是本领域已知的。
根据一些实施方案，提供了包含编码位点特异性核酸酶的多核苷酸序列的重组DNA构建体和载体，所述位点特异性核酸酶诸如锌指核酸酶(ZFN)、大范围核酸酶、RNA指导的核酸内切酶、TALE核酸内切酶(TALEN)、重组酶或转座酶，其中编码序列与植物可表达启动子可操作地连接。对于RNA指导的核酸内切酶，还提供了包含编码指导RNA的多核苷酸序列的重组DNA构建体和载体，其中所述指导RNA包含具有足够长度的指导序列，所述指导序列与植物基因组内(诸如靶向GA氧化酶基因处或附近)的靶位点具有一定百分比的同一性或互补性。根据一些实施方案，编码位点特异性核酸酶或指导RNA的重组DNA构建体和载体的多核苷酸序列可与植物可表达启动子(诸如诱导型启动子、组成型启动子、组织特异性启动子等)可操作地连接。
在一个方面，本公开提供了一种修饰的玉米植物或其植物部分，所述修饰的玉米植物或其植物部分在所述GA20氧化酶_3基因座处包含突变等位基因并且在所述GA20氧化酶_5基因座处包含突变等位基因，其中所述GA20氧化酶_3基因座和所述GA20氧化酶_5基因座中的至少一者包含纯合突变等位基因。在另一方面，修饰的玉米植物在所述GA20氧化酶_3基因座处包含纯合等位基因。在另一方面，修饰的玉米植物在所述GA20氧化酶_5基因座处包含纯合等位基因。在另一方面，在修饰的玉米植物中所述GA20氧化酶_3基因座和所述GA20氧化酶_5基因座中仅一者包含纯合等位基因。在另一方面，修饰的玉米植物在所述GA20氧化酶_3基因座和所述GA20氧化酶_5基因座两者处均包含纯合等位基因。在另一方面，在修饰的植物中所述GA20氧化酶_3基因座和所述GA20氧化酶_5基因座中的一者或两者包含异等位基因组合或两个相同的突变等位基因。在一个方面，修饰的植物包含含有突变等位基因的异等位基因组合的纯合GA20氧化酶_3基因座和杂合GA20氧化酶_5基因座。在另一方面，修饰的植物包含含有突变等位基因的异等位基因组合的纯合GA20氧化酶_3基因座和杂合GA20氧化酶_5基因座。在一个方面，修饰的植物包含杂合GA20氧化酶_3基因座和含有突变等位基因的异等位基因组合的纯合GA20氧化酶_5基因座。在另一方面，修饰的植物包含杂合GA20氧化酶_3基因座和含有两个相同的突变等位基因的纯合GA20氧化酶_5基因座。
在另一方面，本公开提供了一种修饰的玉米植物或其植物部分，所述修饰的玉米植物或其植物部分在GA20氧化酶_3基因和GA20氧化酶_5基因中的一者中包含第一纯合突变，并且在所述GA20氧化酶_3基因和所述GA20氧化酶_5基因中的另一者中还包含第二杂合或纯合突变。在一个方面，第一纯合突变在GA20氧化酶_3中。在另一方面，第二突变在GA20氧化酶_5中，是杂合的。在一个方面，第一纯合突变在GA20氧化酶_5中。在另一方面，第二突变在GA20氧化酶_3中，是杂合的。在另一方面，第一纯合突变包括在所述GA20氧化酶_3基因和所述GA20氧化酶_5基因中的一者中的突变的异等位基因组合或两个相同的突变等位基因。
在一个方面，GA20氧化酶_3基因座或基因包含与SEQ ID NO.34或168共享至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％、或至少99.5％序列同一性的序列。在一个方面，GA20氧化酶_5基因座或基因包含与SEQ ID NO.35或169共享至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％、或至少99.5％序列同一性的序列。
在一个方面，GA20氧化酶_3或GA20氧化酶_5突变(突变基因或突变等位基因)包含选自由无义突变、错义突变、移码突变和剪接位点突变组成的组的突变类型。在一个方面，GA20氧化酶_3或GA20氧化酶_5突变(或突变等位基因)产生截短的mRNA或多肽，或者产生不可翻译的mRNA分子。错义突变是一个DNA碱基对的变化，导致由基因制成的蛋白质中的一个氨基酸取代另一个氨基酸。无义突变也是一个DNA碱基对的变化。然而，改变的DNA序列不是用一个氨基酸取代另一个氨基酸，而是过早地发出信号，通知细胞停止构建蛋白质。这种类型的突变会导致蛋白质缩短，而蛋白质的功能可能不正确或根本不起作用。当添加或损失DNA碱基使基因的阅读框改变时，就会发生移码突变。移码突变会改变这些碱基的分组，并更改氨基酸的代码。所得蛋白质即使被制成，也通常是无功能的。插入、缺失和复制都可以是移码突变。在另一方面，GA20氧化酶_3或GA20氧化酶_5突变(突变基因或突变等位基因)可包含沉默突变，沉默突变不改变编码的氨基酸序列，但会影响mRNA转录物表达、稳定性或蛋白质翻译效率，或以其他方式导致相对于对应野生型GA20氧化酶_3或GA20氧化酶_5基因，酶活性降低。在另一方面，GA20氧化酶_3或GA20氧化酶_5突变(突变基因或突变等位基因)可在TATA盒或影响基因转录的其他启动子元件处或周围包含突变或编辑。在一个方面，修饰的玉米植物中的GA20氧化酶_3突变或等位基因是隐性突变或等位基因。在一个方面，修饰的玉米植物中的GA20氧化酶_3突变或等位基因是显性突变或等位基因。在一个方面，修饰的玉米植物中的GA20氧化酶_5突变或等位基因是隐性突变或等位基因。在一个方面，修饰的玉米植物中的GA20氧化酶_5突变或等位基因是显性突变或等位基因。
在一个方面，GA20氧化酶_3或GA20氧化酶_5突变(或突变等位基因)在选自由启动子、5’UTR、第一外显子、第一内含子、第二外显子、第二内含子、第三外显子、3’UTR和终止子组成的组的GA20氧化酶_3或GA20氧化酶_5序列区域中包含突变。在一个方面，GA20氧化酶_3或GA20氧化酶_5突变(或突变等位基因)在GA20氧化酶_3或GA20氧化酶_5基因的第一或第二外显子中包含突变。
在一个方面，突变GA20氧化酶_3或GA20氧化酶_5等位基因相对于未修饰的野生型GA20氧化酶_3或GA20氧化酶_5基因等位基因表现出至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或100％的表达或酶活性降低。在另一方面，突变GA20氧化酶_3或GA20氧化酶_5等位基因在选自由以下组成的组的序列区域中包含突变：启动子、5’UTR、第一外显子、第一内含子、第二外显子、第二内含子、第三外显子、3’UTR、终止子以及它们的任意组合。在另一方面，突变GA20氧化酶_3或GA20氧化酶_5等位基因包含选自由以下组成的组的一种或多种突变类型：无义突变、错义突变、移码突变、剪接位点突变以及它们的任意组合。在另一方面，突变GA20氧化酶_3或GA20氧化酶_5等位基因产生以下一项或多项：蛋白质截短体、不可翻译的转录物、无功能的蛋白质、提前终止密码子以及它们的任意组合。在另一方面，突变GA20氧化酶_3或GA20氧化酶_5等位基因相对于野生型GA20氧化酶_3基因包含选自由以下组成的组的突变：一个或多个核苷酸的取代、缺失、插入、复制和倒位。在另一方面，突变GA20氧化酶_3或GA20氧化酶_5等位基因在第一外显子中包含一个或多个突变。在另一方面，突变GA20氧化酶_3或GA20氧化酶_5等位基因在第二外显子中包含一个或多个突变。
在一个方面，修饰的玉米植物或其植物部分包含第一突变，所述第一突变包括作为两个相同等位基因的对或异等位基因的组合的一个或多个等位基因，所述一个或多个等位基因选自由以下组成的组：从536处开始缺失13个碱基；缺失碱基542；在碱基542处插入CC；缺失碱基541；从碱基540处开始缺失3nt；从碱基422处开始缺失2个碱基；在碱基422处插入A；在碱基422处插入T；缺失碱基564；在碱基564处插入A；在碱基565处插入C；以及在碱基63处插入C；其中碱基编号基于SEQ ID No.168，并且沿5’到3’方向从SEQ ID NO:168的第一个核苷酸计数。在另一方面，修饰的玉米植物或其植物部分包含第一突变，所述第一突变包括作为两个相同等位基因的对或异等位基因的组合的一个或多个等位基因，所述一个或多个等位基因选自由以下组成的组：缺失碱基644；从碱基644处开始缺失2个碱基；在碱基644处插入T；缺失碱基372；缺失碱基786；从碱基786处开始缺失5个碱基；从碱基101处开始缺失2个碱基；在碱基碱基102处插入T；从碱基99处开始缺失3个碱基；在碱基282处插入A；在碱基282处插入C；其中碱基编号基于SEQ ID No.169，并且沿5’到3’方向从SEQ ID NO:169的第一个核苷酸计数。在一个方面，修饰的玉米植物或其植物部分包含相对于SEQ IDNo:168的对应参考序列由SEQ ID No.:170至193和206至217中的一个或多个标识的第一突变。在一个方面，修饰的玉米植物或其植物部分包含相对于SEQ ID NO:169的对应参考序列由SEQ ID No.:218至239和251至261中的一个或多个标识的第一突变。在一个方面，本公开提供了表5或表6中所列的一种或多种植物的子代植物。在另一方面，还提供了表6中的植物编号17至31中任一个的子代植物。在另一方面，提供了来自表5或表6中所列的一种或多种植物的杂交(cross或hybridization)的植物。
在一个方面，纯合突变GA20氧化酶_3基因、纯合突变GA20氧化酶_5基因或两者在选自由以下组成的组的序列区域中包含突变：启动子、5’UTR、第一外显子、第一内含子、第二外显子、第二内含子、第三外显子、3’UTR、终止子以及它们的任意组合。在一个方面，纯合突变GA20氧化酶_3基因、纯合突变GA20氧化酶_5基因或两者包含选自由以下组成的组的一种或多种突变类型：无义突变、错义突变、移码突变、剪接位点突变以及它们的任意组合。在一个方面，纯合突变GA20氧化酶_3基因、纯合突变GA20氧化酶_5基因或两者产生以下一项或多项：蛋白质截短体、不可翻译的转录物、无功能的蛋白质、提前终止密码子以及它们的任意组合。在一个方面，纯合突变GA20氧化酶_3基因、纯合突变GA20氧化酶_5基因或两者相对于野生型GA20氧化酶_3基因包含选自由以下组成的组的突变：一个或多个核苷酸的取代、缺失、插入、复制和倒位。在一个方面，突变GA20氧化酶_3基因、纯合突变GA20氧化酶_5基因或两者包含无效等位基因。
在一个方面，相对于未修饰的对照植物，本文所述的修饰的玉米植物具有较矮的植株高度和/或改善的抗倒伏性。在一个方面，修饰的玉米植物比未修饰的对照植物矮至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、或至少40％。在另一方面，修饰的玉米植物在一个或多个茎节间处的秆或茎直径比未修饰的对照植物在相同的一个或多个节间处的秆或茎直径大至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、或至少40％。在一个方面，修饰的玉米植物在穗下方第一节间、第二节间、第三节间和/或第四节间中的一个或多个处的秆或茎直径比未修饰的对照植物的相同节间大至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、或至少40％。在另一方面，修饰的玉米植物的秆或茎的至少一个节间组织中的一种或多种活性GA的水平比未修饰的对照植物的相同节间组织低至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、或至少40％。在一个方面，修饰的玉米植物的秆或茎的至少一个节间组织中的一种或多种活性GA的水平低于未修饰的对照植物的相同节间组织。
在另一方面，修饰的玉米植物在至少一个雌性器官或穗中不具有任何显著的异型。在一个方面，修饰的玉米植物基本上不表现出生殖异常。在另一方面，异型或生殖异常选自由以下组成的组：雄性(雄穗或花药)不育、减少的籽粒或种子数量，以及在雌性器官或穗(例如，花药穗)中存在一个或多个雄性化的或雄性(或类雄性)生殖结构。
在另一方面，相对于未修饰的对照植物，修饰的玉米植物包含一个或多个性状，所述一个或多个性状选自由以下组成的组：较矮的植株高度、增加的秆/茎直径、改善的抗倒伏性、减少的未成熟折断、较深的根、增加的叶面积、较早的冠层闭合、较高的气孔导度、较低的穗高度、增加的叶片含水量、改善的耐旱性、改善的氮利用效率、在正常或限氮或限水胁迫条件下减少的叶中花色素苷含量和面积、增加的穗重量、增加的收获指数、增加的产量、增加的种子数量、增加的种子重量以及增加的多产性。
在一个方面，修饰的玉米植物是近交系。在另一方面，修饰的玉米植物是杂种。在一个方面，修饰的玉米植物是通过靶向基因组编辑技术修饰的植物。
根据一些实施方案，重组DNA构建体或载体可包含编码位点特异性核酸酶的第一多核苷酸序列和编码指导RNA的第二多核苷酸序列，它们可通过植物转化技术一起引入植物细胞中。另选地，可提供两种重组DNA构建体或载体，包括第一重组DNA构建体或载体和第二DNA构建体或载体，它们可通过植物转化技术一起或依次引入植物细胞中，其中第一重组DNA构建体或载体包含编码位点特异性核酸酶的多核苷酸序列并且第二重组DNA构建体或载体包含编码指导RNA的多核苷酸序列。根据一些实施方案，可通过植物转化技术将包含编码位点特异性核酸酶的多核苷酸序列的重组DNA构建体或载体引入已经包含含有编码指导RNA的多核苷酸序列的重组DNA构建体或载体(或被所述重组DNA构建体或载体转化)的植物细胞中。另选地，可通过植物转化技术将包含编码指导RNA的多核苷酸序列的重组DNA构建体或载体引入已经包含含有编码位点特异性核酸酶的多核苷酸序列的重组DNA构建体或载体(或被所述重组DNA构建体或载体转化)的植物细胞中。根据另外的实施方案，可将包含含有编码位点特异性核酸酶的多核苷酸序列的重组DNA构建体或载体(或被所述重组DNA构建体或载体转化)的第一植物与包含含有编码指导RNA的多核苷酸序列的重组DNA构建体或载体(或被所述重组DNA构建体或载体转化)的第二植物杂交。可将此类重组DNA构建体或载体瞬时转化到植物细胞中或稳定转化或整合到植物细胞的基因组中。
在一个方面，通过本领域已知的转化方法(例如但不限于，粒子轰击、PEG介导的原生质体转染或农杆菌介导的转化)向植物细胞提供包含编码位点特异性核酸酶、以及任选地一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、或四种或更多种gRNA的多核苷酸的载体。在一个方面，通过本领域已知的转化方法(例如但不限于，粒子轰击、PEG介导的原生质体转染或农杆菌介导的转化)向植物细胞提供包含编码Cas9核酸酶、以及任选地一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、或四种或更多种gRNA的多核苷酸的载体。在另一方面，通过本领域已知的转化方法(例如但不限于，病毒转染、粒子轰击、PEG介导的原生质体转染或农杆菌介导的转化)向细胞提供包含编码Cpf1、以及任选地一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、或四种或更多种crRNA的多核苷酸的载体。
若干位点特异性核酸酶(诸如重组酶、锌指核酸酶(ZFN)、大范围核酸酶和TALEN)不是RNA指导的，而是依靠它们的蛋白质结构来确定它们用于造成DSB或切口的靶位点，或者它们融合、拴系或附接于DNA结合蛋白结构域或基序。位点特异性核酸酶(或融合/附接/拴系的DNA结合结构域)的蛋白质结构可将位点特异性核酸酶靶向靶位点。根据许多这些实施方案，非RNA指导的位点特异性核酸酶(诸如重组酶、锌指核酸酶(ZFN)、大范围核酸酶和TALEN)可根据已知方法设计、工程改造和构建，以靶向并结合玉米植物的内源GA氧化酶基因(诸如玉米中的GA20氧化酶_3基因或GA20氧化酶_5基因)的基因组基因座处或附近的靶位点，以在此类基因组基因座处产生DSB或切口，以便通过DSB或切口的修复敲除或敲低GA氧化酶基因的表达。例如，工程改造的位点特异性核酸酶(诸如重组酶、锌指核酸酶(ZFN)、大范围核酸酶或TALEN)可被设计成靶向并结合(i)植物基因组内与SEQ ID NO:34内的序列或其互补序列相对应的靶位点，以在GA20氧化酶_3基因的基因组基因座处产生DSB或切口，(ii)植物基因组内与SEQ ID NO:35内的序列或其互补序列相对应的靶位点，以在GA20氧化酶_5基因的基因组基因座处产生DSB或切口，和/或(iii)植物基因组内与SEQ ID NO:38内的序列或其互补序列相对应的靶位点，以在GA20氧化酶_4基因的基因组基因座处产生DSB或切口，这接着可导致通过可由供体分子或模板指导的细胞修复机制在DSB或切口的位点处产生序列的突变或插入。
在一个方面，本文所述的靶标基因组编辑技术可包括重组酶的使用。在一些实施方案中，与DNA识别结构域或基序附接等的酪氨酸重组酶可选自由Cre重组酶、Flp重组酶和Tnp1重组酶组成的组。在一个方面，本文所提供的Cre重组酶或Gin重组酶可拴系于锌指DNA结合结构域。Flp-FRT定点重组系统可来自来源于面包的酵母酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的2μ质粒。在此系统中，Flp重组酶(翻转酶)可重组翻转酶识别靶标(FRT)位点之间的序列。FRT位点包括34个核苷酸。Flp可与FRT位点的“臂”(一个臂处于反向)结合并且在居间核酸序列的任一端切割FRT位点。切割后，Flp可重组两个FRT位点之间的核酸序列。Cre-lox是源自噬菌体P1的定点重组系统，该系统类似于Flp-FRT重组系统。Cre-lox可用于将核酸序列倒位、使核酸序列缺失或将核酸序列易位。在此系统中，Cre重组酶可重组一对lox核酸序列。Lox位点包括34个核苷酸，其中前和后13个核苷酸(臂)是回文的。在重组过程中，Cre重组酶蛋白与不同核酸上的两个lox位点结合并在lox位点处切割。将切割的核酸剪接在一起(相互易位)并完成重组。在另一方面，本文所提供的lox位点为loxP、lox2272、loxN、lox 511、lox 5171、lox71、lox66、M2、M3、M7或M11位点。
ZFN是由与切割结构域(或切割半结构域)融合的工程改造的锌指DNA结合结构域组成的合成蛋白，其可源自限制性核酸内切酶(例如，FokI)。DNA结合结构域可以是典型的(C2H2)或非典型的(例如，C3H或C4)。根据靶位点，DNA结合结构域可包括一个或多个锌指(例如，2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或更多个锌指)。DNA结合结构域中的多个锌指可通过一个或多个接头序列分开。ZFN可被设计成通过锌指DNA结合结构域的修饰来切割双链DNA的几乎任何链段。ZFN由包括与DNA结合结构域融合的非特异性DNA切割结构域(例如，源自FokI核酸酶)的单体形成二聚体，所述DNA结合结构域包括被工程改造以结合靶位点DNA序列的锌指阵列。ZFN的DNA结合结构域通常可由3-4个(或更多个)锌指组成。相对于促成与靶位点的位点特异性结合的锌指α-螺旋的起点而言的-1、+2、+3和+6位处的氨基酸可改变和定制以适应特定靶序列。其他氨基酸可形成共有骨架以产生具有不同序列特异性的ZFN。用于设计靶向和结合特定靶序列的ZFN的方法和规则是本领域已知的。参见，例如，美国专利申请号2005/0064474、2009/0117617和2012/0142062，所述专利申请的内容和公开内容以引用方式并入本文。FokI核酸酶结构域可能需要二聚化来切割DNA并且因此需要具有其C端区域的两个ZFN来结合切割位点的相反DNA链(分开5-7bp)。如果双ZF结合位点是回文的，那么ZFN单体可切割靶位点。如本文所用，ZFN是广义的并且包括单体ZFN，单体ZFN可在没有另一个ZFN帮助的情况下切割双链DNA。术语ZFN还可用于指被工程改造成共同作用以在同一位点处切割DNA的一对ZFN的一个或两个成员。
不受任何科学理论的限制，因为锌指结构域的DNA结合特异性可使用各种方法中的一种重新工程改造，因此定制的ZFN在理论上可被构建成靶向几乎任何靶序列(例如，在植物基因组中的GA氧化酶基因处或附近的靶序列)。用于工程改造锌指结构域的公开可获得的方法包括背景依赖组装法(Context-dependent Assembly(CoDA))、寡聚体库工程法(Oligomerized Pool Engineering(OPEN))和模块组装法。在一个方面，本文所提供的方法和/或组合物包含一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、或五种或更多种ZFN。在另一方面，本文所提供的ZFN能够产生靶向DSB或切口。在一个方面，通过本领域已知的转化方法(例如但不限于，病毒转染、粒子轰击、PEG介导的原生质体转染或农杆菌介导的转化)向细胞提供包含编码一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、或五种或更多种ZFN的多核苷酸的载体。ZFN可作为ZFN蛋白、作为编码ZFN蛋白的多核苷酸和/或作为蛋白质和编码蛋白质的多核苷酸的组合引入。
通常在微生物中鉴定的大范围核酸酶，诸如归巢核酸内切酶的LAGLIDADG家族，是具有高活性和导致靶DNA的位点特异性消化的长识别序列(>14bp)的独特的酶。天然存在的大范围核酸酶的工程改造形式通常具有延长的DNA识别序列(例如，14至40bp)。根据一些实施方案，大范围核酸酶可包含选自由I-CreI、I-CeuI、I-MsoI、I-SceI、I-AniI和I-DmoI组成的组的支架或碱基酶。大范围核酸酶的工程改造可能比ZFN和TALEN更具挑战性，因为大范围核酸酶的DNA识别和切割功能交织在单个结构域中。已经使用专门的诱变和高通量筛选方法来产生识别独特序列并具有改善的核酸酶活性的新型大范围核酸酶变体。因此，大范围核酸酶可经选择或工程改造以结合植物中的基因组靶序列，诸如在GA氧化酶基因的基因组基因座处或附近的靶序列。在一个方面，本文所提供的方法和/或组合物包含一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、或五种或更多种大范围核酸酶。在另一方面，本文所提供的大范围核酸酶能够产生靶向DSB。在一个方面，通过本领域已知的转化方法(例如但不限于，病毒转染、粒子轰击、PEG介导的原生质体转染或农杆菌介导的转化)向细胞提供包含编码一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、或五种或更多种大范围核酸酶的多核苷酸的载体。
TALEN是通过将类转录激活因子效应物(TALE)DNA结合结构域与核酸酶结构域(例如，FokI)融合而产生的人工限制性酶。当TALEN对的每个成员与靶位点侧翼的DNA位点结合时，FokI单体二聚化并在靶位点处造成双链DNA断裂。除野生型FokI切割结构域之外，已经设计了具有突变的FokI切割结构域的变体以改善切割特异性和切割活性。FokI结构域作为二聚体起作用，需要对于靶基因组中具有适当取向和间距的位点具有独特的DNA结合结构域的两个构建体。TALEN DNA结合结构域与FokI切割结构域之间的氨基酸残基数和两个单独TALEN结合位点之间的碱基数均是实现高活性水平的参数。
TALEN是通过将类转录激活因子效应物(TALE)DNA结合结构域与核酸酶结构域融合而产生的人工限制性酶。在一些方面，核酸酶选自由以下组成的组：PvuII、MutH、TevI、FokI、AlwI、MlyI、SbfI、SdaI、StsI、CleDORF、Clo051和Pept071。当TALEN对的每个成员与靶位点侧翼的DNA位点结合时，FokI单体二聚化并在靶位点处造成双链DNA断裂。如本文所用，术语TALEN是广义的并且包括单体TALEN，单体TALEN可在没有另一个TALEN帮助的情况下切割双链DNA。术语TALEN还指共同作用以在同一位点处切割DNA的一对TALEN的一个或两个成员。
类转录激活因子效应物(TALE)可被工程改造成实际上结合任何DNA序列，诸如在植物中的GA氧化酶基因的基因组基因座处或附近的序列。TALE具有由13-28个具有33-34个氨基酸的重复单体组成的中心DNA结合结构域。除了12和13位的高变氨基酸残基之外，各单体的氨基酸都是高度保守的。两种可变氨基酸被称为重复序列可变双残基(RVD)。RVD的氨基酸对NI、NG、HD和NN分别优先识别腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和鸟嘌呤/腺嘌呤，并且RVD的调节可识别连续的DNA碱基。氨基酸序列与DNA识别之间的这种简单关系允许通过选择含有适当RVD的重复序列区段的组合来工程改造特定的DNA结合结构域。
除野生型FokI切割结构域之外，已经设计了具有突变的FokI切割结构域的变体以改善切割特异性和切割活性。FokI结构域作为二聚体起作用，需要对于靶基因组中具有适当取向和间距的位点具有独特的DNA结合结构域的两个构建体。TALEN DNA结合结构域与FokI切割结构域之间的氨基酸残基数和两个单独TALEN结合位点之间的碱基数均是实现高活性水平的参数。PvuII、MutH和TevI切割结构域是用于与TALE一起使用的FokI和FokI变体的可用替代物。当与TALE偶联时，PvuII作为高度特异性的切割结构域起作用(参见Yank等人2013.PLoS One.8:e82539)。MutH能够在DNA中引入链特异性切口(参见Gabsalilow等人2013.Nucleic Acids Research.41:e83)。TevI在靶向位点处在DNA中引入双链断裂(参见Beurdeley等人,2013.Nature Communications.4:1762)。
氨基酸序列与TALE结合结构域的DNA识别之间的关系允许可设计的蛋白质。诸如DNA Works的软件程序可用于设计TALE构建体。设计TALE构建体的其他方法是本领域技术人员已知的。参见Doyle等人,Nucleic Acids Research(2012)40:W117-122.；Cermak等人,Nucleic Acids Research(2011).39:e82；以及tale-nt.cac.cornell.edu/about。在一个方面，本文所提供的方法和/或组合物包含一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、或五种或更多种TALEN。在另一方面，本文所提供的TALEN能够产生靶向DSB。在一个方面，通过本领域已知的转化方法(例如但不限于，病毒转染、粒子轰击、PEG介导的原生质体转染或农杆菌介导的转化)向细胞提供包含编码一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、或五种或更多种TALEN的多核苷酸的载体。参见，例如，美国专利申请号2011/0145940、2011/0301073和2013/0117869，所述专利申请的内容和公开内容以引用方式并入本文。
如本文所用，“靶向基因组编辑技术”是指允许使用位点特异性核酸酶精确和/或靶向编辑植物基因组中的特定位置(即，编辑大部分或完全是非随机的)的任何方法、方案或技术，所述位点特异性核酸酶诸如大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、RNA指导的核酸内切酶(例如，CRISPR/Cas9系统)、TALE-核酸内切酶(TALEN)、重组酶或转座酶。如本文所用，“编辑”或“基因组编辑”是指产生内源植物基因组核酸序列的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少75个、至少100个、至少250个、至少500个、至少1000个、至少2500个、至少5000个、至少10,000个、或至少25,000个核苷酸的靶向突变、缺失、倒位或取代。如本文所用，“编辑”或“基因组编辑”还涵盖将至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少75个、至少100个、至少250个、至少500个、至少750个、至少1000个、至少1500个、至少2000个、至少2500个、至少3000个、至少4000个、至少5000个、至少10,000个、或至少25,000个核苷酸靶向插入或定点整合到植物的内源基因组中。单数形式的“编辑”或“基因组编辑”是指一个这样的靶向突变、缺失、倒位、取代或插入，而“编辑”或“基因组编辑”是指两个或更多个靶向突变、缺失、倒位、取代和/或插入，其中每个“编辑”通过靶向基因组编辑技术引入。
在一个方面，靶向基因编辑方法用于修饰GA20氧化酶_3和/或GA20氧化酶_5基因中的一个或多个的启动子和/或一个或多个调控区的序列，以敲低或敲除这些一个或多个基因的表达，诸如通过靶向缺失、插入、突变或其他序列改变进行。实际上，GA20氧化酶_3和/或GA20氧化酶_5基因中的一个或多个的启动子和/或一个或多个调控区或序列、或5’-UTR、3’UTR和/或一个或多个内含子序列可大部分缺失或突变。另选地，GA20氧化酶_3和/或GA20氧化酶_5基因中的一个或多个的编码(外显子)、5-UTR、3’UTR和/或内含子序列的全部或一部分可被编辑、缺失、突变或以其他方式修饰以敲低或敲除这些基因的表达或活性。对GA20氧化酶_3和/或GA20氧化酶_5基因座的此类靶向修饰可使用本领域已知的任何合适的基因组编辑技术来实现，诸如通过由位点特异性核酸酶引入的双链断裂(DSB)或切口的修复，所述位点特异性核酸酶例如像锌指核酸酶、工程改造或天然的大范围核酸酶、TALE核酸内切酶、或RNA指导的核酸内切酶(例如，Cas9或Cpf1)。DSB或切口的这种修复可在引入DSB或切口的靶向位点处引入自发或随机缺失、添加、突变等，或者该位点的修复可涉及使用供体模板分子以在靶向位点处指导或引起优选或特定的缺失、添加、突变等。
出于本公开的目的，“植物”包括外植体、植物部分、幼苗、小植株或再生或发育的任何阶段的完整植物。如本文所用，“植物部分”可指植物的任何器官或完整组织，诸如分生组织、嫩枝器官/结构(例如，叶、茎或节)、根、花或花器官/结构(例如，苞片、花萼、花瓣、雄蕊、心皮、花药和胚珠)、种子(例如，胚、胚乳和种皮)、果实(例如，成熟子房)、繁殖体、或其他植物组织(例如，维管组织、皮组织、基本组织等)，或它们的任何部分。本公开的植物部分可以是能存活的、不能存活的、可再生的和/或不可再生的。“繁殖体”可包括可生长成整株植物的任何植物部分。
根据一些实施方案，修饰的植物可以比根据标准农艺学实践的作物植物的正常种植密度高至少5％、10％、15％、20％、25％、50％、75％、100％、125％、150％、175％、200％、225％、或250％的田间密度(单位土地/田地面积的植物)进行种植。修饰的植物可以每英亩至少38,000株植物、每英亩至少40,000株植物、每英亩至少42,000株植物、每英亩至少44,000株植物、每英亩至少45,000株植物、每英亩至少46,000株植物、每英亩至少48,000株植物、每英亩50,000株植物、每英亩至少52,000株植物、每英亩至少54,000株、或每英亩至少56,000株植物的田间密度进行种植。例如，不同于诸如每英亩约18,000株植物至每英亩约38,000株植物的标准密度范围，玉米植物可以诸如在以下范围内的更高的密度种植：每英亩约38,000株植物至每英亩约60,000株植物、或每英亩约40,000株植物至每英亩约58,000株植物、或每英亩约42,000株植物至每英亩约58,000株植物、或每英亩约40,000株植物至每英亩约45,000株植物、或每英亩约45,000株植物至每英亩约50,000株植物、或每英亩约50,000株植物至每英亩约58,000株植物、或每英亩约52,000株植物至每英亩约56,000株植物、或每英亩约38,000株植物、每英亩约42,000株植物、每英亩约46,000株植物、或每英亩约48,000株植物、每英亩约50,000株植物、或每英亩约52,000株植物、或每英亩约54,000株植物。
根据本公开的实施方案，提供了一种或多种修饰的玉米植物，所述修饰的玉米植物包括(i)小于2000mm、小于1950mm、小于1900mm、小于1850mm、小于1800mm、小于1750mm、小于1700mm、小于1650mm、小于1600mm、小于1550mm、小于1500mm、小于1450mm、小于1400mm、小于1350mm、小于1300mm、小于1250mm、小于1200mm、小于1150mm、小于1100mm、小于1050mm、或小于1000mm的植株高度，和/或(ii)至少18mm、至少18.5mm、至少19mm、至少19.5mm、至少20mm、至少20.5mm、至少21mm、至少21.5mm、或至少22mm的平均茎或秆直径。换句话说，提供了一种或多种修饰的玉米植物，所述修饰的玉米植物包括小于2000mm、小于1950mm、小于1900mm、小于1850mm、小于1800mm、小于1750mm、小于1700mm、小于1650mm、小于1600mm、小于1550mm、小于1500mm、小于1450mm、小于1400mm、小于1350mm、小于1300mm、小于1250mm、小于1200mm、小于1150mm、小于1100mm、小于1050mm、或小于1000mm的植株高度，和/或大于18mm、大于18.5mm、大于19mm、大于19.5mm、大于20mm、大于20.5mm、大于21mm、大于21.5mm、或大于22mm的平均茎或秆直径。以毫米(mm)表示的任何这种植株高度性状或范围可基于已知的换算关系(例如，1英寸等于2.54cm或25.4毫米，并且毫米(mm)、厘米(cm)和米(m)仅相差一个或多个十的次方)来换算成不同的计量单位。因此，根据已知和已建立的换算关系，关于任何其他可比较的计量单位进一步描述本文所提供的任何测量。然而，修饰的玉米植物的确切植株高度和/或茎直径可取决于环境和遗传背景。因此，修饰的玉米植物的植株高度和/或茎直径的变化可替代地关于相对于对照植物的最小差异或变化百分比来描述。修饰的玉米植物还可包括至少一个基本上不含雄性生殖组织或结构或其他异型的穗。
根据本公开的实施方案，提供了修饰的玉米植物，所述修饰的玉米植物在发育的营养阶段后期和/或生殖阶段(例如，在R3阶段)的植株高度在1000mm与1800mm之间、在1000mm与1700mm之间、在1050mm与1700mm之间、在1100mm与1700mm之间、在1150mm与1700mm之间、在1200mm与1700mm之间、在1250mm与1700mm之间、在1300mm与1700mm之间、在1350mm与1700mm之间、在1400mm与1700mm之间、在1450mm与1700mm之间、在1000mm与1500mm之间、在1050mm与1500mm之间、在1100mm与1500mm之间、在1150mm与1500mm之间、在1200mm与1500mm之间、在1250mm与1500mm之间、在1300mm与1500mm之间、在1350mm与1500mm之间、在1400mm与1500mm之间、在1450mm与1500mm之间、在1000mm与1600mm之间、在1100mm与1600mm之间、在1200mm与1600mm之间、在1300mm与1600mm之间、在1350mm与1600mm之间、在1400mm与1600mm之间、在1450mm与1600mm之间、在1000mm与2000mm之间、在1200mm与2000mm之间、在1200mm与1800mm之间、在1300mm与1700mm之间、在1400mm与1700mm之间、在1400mm与1600mm之间、在1400mm与1700mm之间、在1400mm与1800mm之间、在1400mm与1900mm之间、在1400mm与2000mm之间、或在1200mm与2500mm之间，和/或平均茎直径在17.5mm与22mm之间、在18mm与22mm之间、在18.5与22mm之间、在19mm与22mm之间、在19.5mm与22mm之间、在20mm与22mm之间、在20.5mm与22mm之间、在21mm与22mm之间、在21.5mm与22mm之间、在17.5mm与21mm之间、在17.5mm与20mm之间、在17.5mm与19mm之间、在17.5mm与18mm之间、在18mm与21mm之间、在18mm与20mm之间、或在18mm与19mm之间。修饰的玉米植物可在修饰玉米植物的一个或多个穗中基本上不含异型，诸如雄性生殖组织或结构。
根据本公开的实施方案，提供了修饰的玉米植物，所述修饰的玉米植物具有(i)比野生型或对照植物的高度小至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、或至少75％的植株高度，和/或(ii)比野生型或对照植物的茎直径大至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少100％的茎或秆直径。根据本公开的实施方案，修饰的玉米植物可具有比野生型或对照植物的高度矮不超过20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、或60％的降低的植株高度，和/或比野生型或对照植物的茎或秆直径大不到(或不会超过)10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的茎或秆直径。例如，修饰的植物可具有(i)比野生型或对照植物小或矮至少10％、至少15％、或至少20％(即，大于或等于10％、15％、或20％)，但矮不大于或不超过50％的植株高度，和/或(ii)比野生型或对照植物大至少5％、至少10％、或至少15％，但大不会超过30％、35％或40％的茎或秆直径。为清楚起见，短语“矮至少20％”和“矮大于或等于20％”将不包括例如矮10％。同样为了清楚起见，短语“矮不大于50％”、“矮不超过50％”和“矮不会超过50％”将不包括矮60％；短语“大至少5％”将不包括大2％；并且短语“大不会超过30％”和“大不超过30％”将不包括大40％。
根据本公开的实施方案，提供了修饰的玉米植物，所述修饰的玉米植物的高度比野生型或对照植物的高度小的程度在5％与75％之间、在5％与50％之间、在10％与70％之间、在10％与65％之间、在10％与60％之间、在10％与55％之间、在10％与50％之间、在10％与45％之间、在10％与40％之间、在10％与35％之间、在10％与30％之间、在10％与25％之间、在10％与20％之间、在10％与15％之间、在10％与10％之间、在10％与75％之间、在25％与75％之间、在10％与50％之间、在20％与50％之间、在25％与50％之间、在30％与75％之间、在30％与50％之间、在25％与50％之间、在15％与50％之间、在20％与50％之间、在25％与45％之间、或在30％与45％之间，和/或茎或秆直径比野生型或对照植物的茎或秆直径大的程度在5％与100％之间、在5％与95％之间、在5％与90％之间、在5％与85％之间、在5％与80％之间、在5％与75％之间、在5％与70％之间、在5％与65％之间、在5％与60％之间、在5％与55％之间、在5％与50％之间、在5％与45％之间、在5％与40％之间、在5％与35％之间、在5％与30％之间、在5％与25％之间、在5％与20％之间、在5％与15％之间、在5％与10％之间、在10％与100％之间、在10％与75％之间、在10％与50％之间、在10％与40％之间、在10％与30％之间、在10％与20％之间、在25％与75％之间、在25％与50％之间、在50％与75％之间、在8％与20％之间、或在8％与15％之间。
根据本公开的实施方案，提供了修饰的玉米植物，所述修饰的玉米植物的平均节间长度(或相对于穗位置的-2节间长度和/或-4节间长度)比野生型或对照植物的相同或平均节间长度小至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、或至少75％。玉米植物的“-2节间”是指植物穗下方的第二节间，并且玉米植物的“-4节间”是指植物穗下方的第四节间。根据许多实施方案，提供了修饰的玉米植物，所述修饰的玉米植物的平均节间长度(或相对于穗位置的-2节间长度和/或-4节间长度)比野生型或对照植物的相同或平均节间长度小的程度在5％与75％之间、在5％与50％之间、在10％与70％之间、在10％与65％之间、在10％与60％之间、在10％与55％之间、在10％与50％之间、在10％与45％之间、在10％与40％之间、在10％与35％之间、在10％与30％之间、在10％与25％之间、在10％与20％之间、在10％与15％之间、在10％与10％之间、在10％与75％之间、在25％与75％之间、在10％与50％之间、在20％与50％之间、在25％与50％之间、在30％与75％之间、在30％与50％之间、在25％与50％之间、在15％与50％之间、在20％与50％之间、在25％与45％之间、或在30％与45％之间。
根据本公开的实施方案，提供了修饰的玉米植物，所述修饰的玉米植物的穗重量(单独或平均)比野生型或对照植物的穗重量大至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少100％。本文所提供的修饰的玉米植物的穗重量比野生型或对照植物的穗重量大的程度可在5％与100％之间、在5％与95％之间、在5％与90％之间、在5％与85％之间、在5％与80％之间、在5％与75％之间、在5％与70％之间、在5％与65％之间、在5％与60％之间、在5％与55％之间、在5％与50％之间、在5％与45％之间、在5％与40％之间、在5％与35％之间、在5％与30％之间、在5％与25％之间、在5％与20％之间、在5％与15％之间、在5％与10％之间、在10％与100％之间、在10％与75％之间、在10％与50％之间、在25％与75％之间、在25％与50％之间、或在50％与75％之间。
根据本公开的实施方案，提供了修饰的玉米植物，所述修饰的玉米植物的收获指数为至少0.57、至少0.58、至少0.59、至少0.60、至少0.61、至少0.62、至少0.63、至少0.64、或至少0.65(或更大)。修饰的玉米植物的收获指数可在0.57与0.65之间、在0.57与0.64之间、在0.57与0.63之间、在0.57与0.62之间、在0.57与0.61之间、在0.57与0.60之间、在0.57与0.59之间、在0.57与0.58之间、在0.58与0.65之间、在0.59与0.65之间、或在0.60与0.65之间。修饰的玉米植物的收获指数可比野生型或对照植物的收获指数大至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、或至少50％。修饰的玉米植物的收获指数比野生型或对照植物的收获指数大的程度可在1％与45％之间、在1％与40％之间、在1％与35％之间、在1％与30％之间、在1％与25％之间、在1％与20％之间、在1％与15％之间、在1％与14％之间、在1％与13％之间、在1％与12％之间、在1％与11％之间、在1％与10％之间、在1％与9％之间、在1％与8％之间、在1％与7％之间、在1％与6％之间、在1％与5％之间、在1％与4％之间、在1％与3％之间、在1％与2％之间、在5％与15％之间、在5％与20％之间、在5％与30％之间、或在5％与40％之间。
根据本公开的实施方案，提供了修饰的玉米植物，相对于野生型或对照植物，所述修饰的玉米植物具有至少1蒲式耳(bushel)/英亩、至少2蒲式耳/英亩、至少3蒲式耳/英亩、至少4蒲式耳/英亩、至少5蒲式耳/英亩、至少6蒲式耳/英亩、至少7蒲式耳/英亩、至少8蒲式耳/英亩、至少9蒲式耳/英亩、或至少10蒲式耳/英亩的可收获产量的增加。修饰的玉米植物的可收获产量的增加可在1与10蒲式耳/英亩之间、在1与8蒲式耳/英亩之间、在2与8蒲式耳/英亩之间、在2与6蒲式耳/英亩之间、在2与5蒲式耳/英亩之间、在2.5与4.5蒲式耳/英亩之间、或在3与4蒲式耳/英亩之间。修饰的玉米植物的可收获产量的增加可比野生型或对照植物的可收获产量大至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少20％、或至少25％。修饰的玉米植物的可收获产量比野生型或对照植物的可收获产量大的程度可在1％与25％之间、在1％与20％之间、在1％与15％之间、在1％与14％之间、在1％与13％之间、在1％与12％之间、在1％与11％之间、在1％与10％之间、在1％与9％之间、在1％与8％之间、在1％与7％之间、在1％与6％之间、在1％与5％之间、在1％与4％之间、在1％与3％之间、在1％与2％之间、在5％与15％之间、在5％与20％之间、在5％与25％之间、在2％与10％之间、在2％与9％之间、在2％与8％之间、在2％与7％之间、在2％与6％之间、在2％与5％之间、或在2％与4％之间。
根据本公开的实施方案，提供了修饰的玉米植物，所述修饰的玉米植物的倒伏频率比野生型或对照植物小或低至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％。修饰的玉米植物的倒伏频率比野生型或对照植物小或低的程度可在5％与100％之间、在5％与95％之间、在5％与90％之间、在5％与85％之间、在5％与80％之间、在5％与75％之间、在5％与70％之间、在5％与65％之间、在5％与60％之间、在5％与55％之间、在5％与50％之间、在5％与45％之间、在5％与40％之间、在5％与35％之间、在5％与30％之间、在5％与25％之间、在5％与20％之间、在5％与15％之间、在5％与10％之间、在10％与100％之间、在10％与75％之间、在10％与50％之间、在10％与40％之间、在10％与30％之间、在10％与20％之间、在25％与75％之间、在25％与50％之间、或在50％与75％之间。还提供了具有增加的抗倒伏性和降低的倒伏频率的玉米植物的群体。提供了修饰的玉米植物的群体，所述修饰的玉米植物的群体的倒伏频率比野生型或对照植物的群体小或低至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％。修饰的玉米植物群体的倒伏频率比野生型或对照植物群体小或低的程度可在5％与100％之间、在5％与95％之间、在5％与90％之间、在5％与85％之间、在5％与80％之间、在5％与75％之间、在5％与70％之间、在5％与65％之间、在5％与60％之间、在5％与55％之间、在5％与50％之间、在5％与45％之间、在5％与40％之间、在5％与35％之间、在5％与30％之间、在5％与25％之间、在5％与20％之间、在5％与15％之间、在5％与10％之间、在10％与100％之间、在10％与75％之间、在10％与50％之间、在10％与40％之间、在10％与30％之间、在10％与20％之间、在25％与75％之间、在25％与50％之间、或在50％与75％之间，倒伏频率可表示为特定的植物数量或相等密度的作物面积的平均值。
根据本公开的实施方案，提供了修饰的玉米植物，所述修饰的玉米植物相对于野生型或对照植物具有显著降低或减小的植株高度(例如，2000mm或更小)和显著增加的茎直径(例如，18mm或更大)。根据这些实施方案，植株高度的减小或降低以及茎直径的增加可在本文所列举的任何高度、直径或百分比范围内。相对于野生型或对照植物具有降低的植株高度和增加的茎直径的此类修饰的玉米植物可用编码靶向至少一种GA20氧化酶基因以进行抑制的非编码RNA分子的可转录DNA序列转化。相对于野生型或对照植物具有显著降低的植株高度和/或显著增加的茎直径的修饰的玉米植物还可具有至少一个基本上不含雄性生殖组织或结构和/或其他异型的穗。相对于野生型或对照植物具有显著降低的植株高度和/或增加的茎直径的修饰的玉米植物可在植物的一种或多种组织(诸如植物的一种或多种维管和/或叶组织)中，相对于野生型或对照植物的一种或多种相同组织，具有降低的一种或多种GA20氧化酶和/或GA3氧化酶基因活性。根据许多实施方案，修饰的玉米植物可包含与启动子可操作地连接的编码非编码RNA分子的至少一个多核苷酸或可转录DNA序列，所述启动子可以是组成型、组织特异性或组织优选的启动子，其中所述非编码RNA分子靶向至少一种GA20氧化酶以进行抑制，如本文所提供的。非编码RNA分子可以是miRNA、siRNA、或miRNA或siRNA前体分子。根据一些实施方案，相对于野生型或对照植物具有显著降低的植株高度和/或增加的茎直径的修饰的玉米植物还可相对于野生型或对照植物具有增加的收获指数和/或增加的抗倒伏性。
相对于野生型或对照植物具有显著降低的植株高度和/或显著增加的茎直径的修饰的玉米植物可在GA氧化酶基因中包括通过基因编辑技术或其他诱变技术引入的突变(例如，插入、缺失、取代等)，其中GA氧化酶基因的表达在修饰植物的一个或多个组织中降低或消除。相对于野生型或对照植物具有降低的植株高度和/或增加的茎直径的此类修饰的玉米植物还可相对于野生型或对照植物具有增加的收获指数和/或增加的抗倒伏性。此类修饰的玉米植物可在修饰植物的至少一个穗中基本上不含异型，诸如雄性生殖组织或结构和/或其他异型。植物诱变技术(不包括基因组编辑)可包括化学诱变(即，用化学诱变剂处理，所述化学诱变剂诸如叠氮化物、羟胺、亚硝酸、吖啶、核苷酸碱基类似物，或烷化剂-例如，EMS(甲磺酸乙酯)、MNU(N-甲基-N-亚硝基脲)等)、物理诱变(例如，γ射线、X射线、紫外线、离子束、其他形式的辐射等)以及插入诱变(例如，转座子或T-DNA插入)。植物或各种植物部分、植物组织或植物细胞可经受诱变。经处理的植物可再生以收集种子或产生子代植物，并且经处理的植物部分、植物组织或植物细胞可发育或再生成植物或其他植物组织。用化学或物理诱变技术产生的突变可包括导致靶基因(诸如GA3或GA20氧化酶基因)的功能或表达损失的移码、错义或无义突变。
用于基因诱变的一种方法称为“TILLING”(用于靶向诱导基因组中的局部损害)，其中例如使用诱变剂，诸如EMS处理，在植物细胞或组织中，优选地在植物的种子、生殖组织或种系中产生突变。使所得的植物生长并自体受精，并使用子代制备DNA样品。GA氧化酶基因的核酸序列的PCR扩增和测序可用于鉴定突变的植物是否在GA氧化酶基因中具有突变。然后可测试在GA氧化酶基因中具有突变的植物的改变的性状，诸如降低的植株高度。另选地，可测试诱变的植物的改变的性状，诸如降低的植株高度，然后可使用GA氧化酶基因的核酸序列的PCR扩增和测序来确定具有改变的性状的植物是否也在GA氧化酶基因中具有突变。参见，例如，Colbert等人,2001,Plant Physiol 126:480-484；以及McCallum等人,2000,Nature Biotechnology 18:455-457。TILLING可用于鉴定改变基因的表达或由基因编码的蛋白质的活性的突变，其可用于引入和选择玉米植物的GA氧化酶基因中的靶向突变。
可基于可观察的表型(例如，本文所述的任何表型，诸如较矮的植株高度、增加的茎/秆直径等)，或使用具有选择性标记物(例如，除草剂等)的选择剂、可筛选标记物、或分子技术(例如，较低的GA水平、较低的GA氧化酶转录物或蛋白质水平、转基因或可转录序列的存在等)筛选和选择已经受诱变或基因组编辑处理的玉米植物。此类筛选和/或选择技术可用于鉴定和选择在GA氧化酶基因中具有导致期望植物表型的突变的植物。
根据本公开的实施方案，提供了修饰的玉米植物的群体，其中修饰的玉米植物的群体具有比野生型或对照植物的群体显著更小的平均植株高度和/或显著更大的平均茎或秆直径。修饰的玉米植物的群体可与单个修饰的玉米植物共享祖先。修饰的玉米植物群体内的修饰的玉米植物通常可包括至少一个基本上不含雄性生殖组织或结构和/或其他异型的穗。与野生型或对照植物的群体相比，修饰的玉米植物的群体可具有平均或单位植物数量或田地面积增加的抗倒伏性。修饰的玉米植物的群体可具有比对照玉米植物的群体小(或低)至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％至少80％、至少90％或100％的倒伏频率。修饰的玉米植物的群体可具有至少0.57或更大的收获指数。
根据本发明的实施方案，提供了修饰的玉米植物，与野生型或对照植物的相同的一个或多个组织相比，所述修饰的玉米植物在至少一个或多个茎和节间组织(诸如一个或多个茎、节间、叶和/或维管组织)中具有降低的赤霉素含量(活性形式)。根据许多实施方案，提供了修饰的玉米植物，所述修饰的玉米植物相对于野生型或对照植物具有显著降低的植株高度和/或显著增加的茎直径，其中修饰的玉米植物相对于野生型或对照植物的相同的一个或多个组织还在一个或多个茎、节间、叶和/或维管组织中具有显著降低或减小的活性赤霉素或活性GA(例如，GA1、GA3、GA4和/或GA7中的一个或多个)水平。例如，修饰的玉米植物的一个或多个茎、节间、叶和/或维管组织中的一种或多种活性GA的水平可比在野生型或对照玉米植物的相同的一个或多个组织中小或低至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少100％。
根据一些实施方案，修饰的玉米植物在一个或多个茎、节间、叶和/或维管组织中包含的活性赤霉素(GA)水平(例如，GA1、GA3、GA4和/或GA7中的一个或多个)比在野生型或对照玉米植物的相同的一个或多个组织中小(或低)的程度可在5％与50％之间、在10％与100％之间、在20％与100％之间、在30％与100％之间、在40％与100％之间、在50％与100％之间、在60％与100％之间、在70％与100％之间、在80％与100％之间、在80％与90％之间、在10％与90％之间、在10％与80％之间、在10％与70％之间、在10％与60％之间、在10％与50％之间、在10％与40％之间、在10％与30％之间、在10％与20％之间、在50％与100％之间、在20％与90％之间、在20％与80％之间、在20％与70％之间、在20％与60％之间、在20％与50％之间、在20％与40％之间、在20％与40％之间、在20％与30％之间、在30％与90％之间、在30％与80％之间、在30％与70％之间、在30％与60％之间、在30％与50％之间、在30％与40％之间、在40％与90％在40％与80％之间、在40％与70％之间、在40％与60％之间、在40％与50％之间、在50％与90％之间、在50％与80％之间、在50％与70％之间、在50％与60％之间、在60％与90％之间、在60％与80％之间、在60％与70％之间、在70％与90％之间、或在70％与80％之间。在一个或多个茎、节间、叶和/或维管组织中具有降低的活性赤霉素(GA)水平的修饰的玉米植物还可在修饰玉米植物的至少一个穗中基本上不含异型，诸如雄性生殖组织或结构和/或其他异型。
根据本公开的实施方案，提供了修饰的玉米植物，与野生型或对照植物的相同的一个或多个组织相比，所述修饰的玉米植物在修饰植物的一个或多个组织(诸如一个或多个茎、节间、叶和/或维管组织)中的一种或多种GA3氧化酶和/或GA20氧化酶基因转录物和/或一种或多种蛋白质的表达水平显著降低或消除。根据许多实施方案，提供了一种修饰的玉米植物，所述修饰的玉米植物相对于野生型或对照植物包括显著降低的植株高度和/或显著增加的茎直径，其中与野生型或对照玉米植物的相同的一个或多个组织相比，所述修饰的玉米植物在修饰植物的一个或多个组织(诸如一个或多个茎、节间、叶和/或维管组织)中的一种或多种GA20氧化酶和/或GA3氧化酶基因转录物和/或一种或多种蛋白质的表达水平显著降低或消除。例如，与野生型或对照植物的相同的一个或多个组织相比，修饰的玉米植物在完整修饰植物中或在修饰植物的一个或多个茎、节间、叶和/或维管组织中的GA20氧化酶_3和/或GA20氧化酶_5基因转录物和/或一种或多种蛋白质的表达水平显著降低或消除，和/或GA3氧化酶_1和/或GA3氧化酶_2基因转录物和/或一种或多种蛋白质的表达水平显著降低或消除。例如，修饰的玉米植物的一个或多个茎、节间、叶和/或维管组织中的一种或多种GA3氧化酶和/或GA20氧化酶基因转录物和/或一种或多种蛋白质、或一种或多种GA氧化酶(或类GA氧化酶)基因转录物和/或一种或多种蛋白质的水平可比野生型或对照玉米植物的相同的一个或多个组织中小或低至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少100％。
根据一些实施方案，修饰的玉米植物在完整植物中或在一个或多个茎、节间、叶和/或维管组织中包含的一种或多种GA3氧化酶和/或GA20氧化酶基因转录物和/或一种或多种蛋白质、或一种或多种GA氧化酶(或类GA氧化酶)基因转录物和/或一种或多种蛋白质的水平比在野生型或对照玉米植物的相同的一个或多个组织中小或低的程度可在5％与50％之间、在10％与100％之间、在20％与100％之间、在30％与100％之间、在40％与100％之间、在50％与100％之间、在60％与100％之间、在70％与100％之间、在80％与100％之间、在80％与90％之间、在10％与90％之间、在10％与80％之间、在10％与70％之间、在10％与60％之间、在10％与50％之间、在10％与40％之间、在10％与30％之间、在10％与20％之间、在50％与100％之间、在20％与90％之间、在20％与80％之间、在20％与70％之间、在20％与60％之间、在20％与50％之间、在20％与40％之间、在20％与40％之间、在20％与30％之间、在30％与90％之间、在30％与80％之间、在30％与70％之间、在30％与60％之间、在30％与50％之间、在30％与40％之间、在40％与90％之间、在40％与80％之间、在40％与70％之间、在40％与60％之间、在40％与50％之间、在50％与90％之间、在50％与80％之间、在50％与70％之间、在50％与60％之间、在60％与90％之间、在60％与80％之间、在60％与70％之间、在70％与90％之间、或在70％与80％之间。在一个或多个组织中具有降低或消除的至少一种GA20氧化酶和/或GA3氧化酶基因表达水平的修饰的玉米植物还可在修饰玉米植物的至少一个穗中基本上不含异型，诸如雄性生殖组织或结构和/或其他异型。
提供了用于针对靶向编辑或转基因的存在对细胞或植物等进行筛选和/或鉴定，并且选择包含靶向编辑或转基因的细胞或植物的方法和技术，所述方法和技术可基于一种或多种表型或形状，或基于细胞或植物中分子标记物或多核苷酸或蛋白质序列的存在或不存在。可使用本领域已知的技术分离和检测核酸。例如，可使用但不限于重组核酸技术和/或聚合酶链反应(PCR)分离和检测核酸。一般PCR技术描述于，例如，PCR Primer:ALaboratory Manual,Dieffenbach&Dveksler,编辑,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1995中。重组核酸技术包括，例如，限制性酶消化和连接，其可用于分离核酸。分离的核酸也可作为单个核酸分子或作为一系列寡核苷酸化学合成。可通过已知方法诸如DEAE离子交换、凝胶过滤和羟基磷灰石色谱法从天然来源(例如，生物样品)中纯化多肽。也可通过例如在表达载体中表达核酸来纯化多肽。另外，纯化的多肽可通过化学合成获得。多肽的纯度可使用任何适当的方法，例如柱色谱法、聚丙烯酰胺凝胶电泳或HPLC分析来测量。本领域已知的任何方法可用于筛选和/或鉴定在其基因组中具有转基因或基因组编辑的细胞、植物等，所述方法可基于任何合适形式的目视观察、选择、分子技术等。
在一些实施方案中，提供了用于检测植物细胞中的重组核酸和/或多肽的方法。例如，如本领域所已知的，可使用杂交探针或通过利用引物使用PCR产生扩增子来检测核酸。核酸之间的杂交论述于Sambrook等人(1989,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY)中。可使用抗体检测多肽。使用抗体检测多肽的技术包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白质印迹、免疫沉淀、免疫荧光等。本文所提供的抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。可使用本领域已知的方法产生对本文所提供的多肽具有特异性结合亲和力的抗体。可使用本领域已知的方法将抗体或杂交探针附接于固体支持体，诸如管、板或孔。
可使用可与杂交探针或抗体附接或缔合的可检测标记来完成(例如，扩增产物、杂交复合物、多肽的)检测。术语“标记”旨在涵盖使用直接标记以及间接标记。可检测标记包括酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料和放射性材料。
修饰的或编辑的植物或植物细胞的筛选和选择可通过分子生物学领域的技术人员已知的任何方法进行。筛选和选择方法的实例包括但不限于蛋白质印迹分析、用于检测多核苷酸的PCR扩增、DNA印迹、RNA酶保护、引物延伸、用于检测RNA转录物的RT-PCR扩增、Sanger测序、下一代测序技术(例如，
Ion TorrentTM等)、用于检测多肽和多核苷酸的酶或核酶活性的酶促测定、以及用以检测多肽的蛋白质凝胶电泳、蛋白质印迹、免疫沉淀和酶联免疫测定。诸如原位杂交、酶染色和免疫染色的其他技术也可用于检测多肽和/或多核苷酸的存在或表达。用于执行所有提及的技术的方法是本领域已知的。
实施例
实施例1.具有编辑的GA20氧化酶_3或GA20氧化酶_5基因的玉米植物的表型观察结果.
在玉米植物中的内源GA20氧化酶_3和GA20氧化酶_5基因中产生了若干基因组编辑的突变，以测试敲除这些基因中的每一个的表型影响。针对GA20氧化酶_3和GA20氧化酶_5基因中的每一个产生一系列10个编码靶向构建体的单链指导RNA(sgRNA)，所述单链指导RNA沿每个基因的基因组序列靶向不同位置。产生另外一系列10个sgRNA，所述sgRNA在沿每个基因的基因组序列的相似或不同位置处各自靶向GA20氧化酶_3和GA20氧化酶_5基因两者。靶向基因组编辑通过以下方式进行：将sgRNA与Cas9蛋白的表达一起递送至玉米外植体以使得在gRNA的基因组靶位点处或附近出现DSB或切口，所述DSB或切口接着可被不完全修复以在靶位点处或附近引入突变。随后通过对植物的RFLP分析和/或测序来确认突变的存在。下表2提供了被测试的指导RNA(gRNA)构建体的列表，所述指导RNA构建体可用于使用RNA指导的核酸内切酶对GA20氧化酶_3和GA20氧化酶_5基因中的一者或两者进行基因组编辑。这些指导RNA构建体通常被设计成靶向GA20氧化酶_3和/或GA20氧化酶_5基因的编码序列，但是一些联合靶向构建体可替代地靶向两个基因中的一个的UTR序列。这些gRNA可与合适的核酸内切酶一起使用，以在基因组中在相应gRNA的基因组靶位点处或附近产生双链断裂(DSB)或切口，所述双链断裂(DSB)或切口可被不完全修复以产生突变(例如，插入、缺失、取代等)。对于编辑的GA20氧化酶_3基因纯合或对于编辑的GA20氧化酶_5基因纯合的植物由少数几个构建体产生(参见粗体文本)。还由靶向两个基因以进行编辑的构建体产生事件。对于联合靶向GA20氧化酶_3和GA20氧化酶_5基因的构建体，参考如括号中指示的两个基因中的一个提供编码序列(CDS)坐标。表2还示出了哪些构建体产生基因编辑事件、那些事件在R0植物中是纯合的还是杂合的、以及括号中的±数字指示在突变情况下的可能序列变化(例如，+1意指插入1个核苷酸，-1意指缺失1个核苷酸等等，并且更大或更复杂的Indel被标记“缺失”或“插入”)。对于GA20氧化酶_3和GA20氧化酶_5基因的联合靶向，突变基因的同一性也在括号中提供。对于编辑的GA20氧化酶_3或GA20氧化酶_5基因纯合的R0植物不具有可观测的矮株型的半矮化表型并且相对于对照植物具有正常的植株高度(参见表2中的构建体GA20氧化酶_3-D和GA20氧化酶_3-G，以及构建体GA20氧化酶_5-B和GA20氧化酶_5-G)，表明这些基因中仅仅一个的敲除不足以产生半矮化表型。
表2.靶向GA20氧化酶_3和GA氧化酶_5基因以进行编辑的指导RNA(gRNA).
实施例2.鉴定具有编辑的GA20氧化酶_3和GA20氧化酶_5突变等位基因的各种组合的玉米植物的鉴定.
如实施例1中所述，通过基于CRISPR/Cas9的方法使用指导RNA(gRNA)编辑玉米植物，所述指导RNA特异性地靶向GA20氧化酶_3和GA20氧化酶_5基因中的一个或同时靶向这两个基因(参见表2)。将总共30个gRNA构建体转化到玉米中。收集来自R0植物的叶样品，并通过片段长度分析(FLA)分析来分析InDel。使用基因特异性引物和标准深度测序方案对通过FLA鉴定的推定突变等位基因进行测序，以确认一个或多个突变。表3提供了12个编辑的GA20氧化酶_3基因中突变等位基因(ga20ox3-1至ga20ox3-12)及其序列的列表。表4提供了11个编辑的GA20氧化酶_5基因中突变等位基因(ga20ox5-1至ga20ox5-11)及其序列的列表。将在GA20氧化酶_3或GA20氧化酶_5中任一者或在这两个基因中具有一个或多个突变的R0植物自交产生R1植物。
将来自多个R0植物的R1种子进行种植，并再次采样，以使用FLA和标准测序方案确认突变。表5提供了在GA20氧化酶_3、GA20氧化酶_5或这两个基因中具有突变的R1植物的列表。表5还示出了在R3阶段测得的R1植物的植株高度和节间长度(穗-2)。在R2/R3生长阶段，测量从土壤线到最高领叶基部的植株高度。通过测序鉴定对于目标基因(GA20氧化酶_3和/或GA20氧化酶_5)纯合或杂合的R1植物，并将其进一步自交以产生R2植物。再次通过FLA和测序确定R2植物的基因型。表6提供了在GA20氧化酶_3、GA20氧化酶_5或这两个基因中具有突变的R2植物以及它们在R2/R3阶段的植株高度的列表。表6还提供了未编辑的参考对照植物(野生型近交植物，显示为WT)以及具有靶向GA20氧化酶_3和GA20氧化酶_5基因以进行抑制的人工微小RNA抑制构建体的转基因近交玉米植物(SUP_GA20Ox3&Ox5(“SUP_Ox3&Ox5”))的对应表征结果。
平均而言，同时含有GA20氧化酶_3和GA20氧化酶_5基因的纯合突变等位基因(即，双重纯合)的R2植物显示出半矮化表型(相对于对照，植株高度降低了约27.5％)，其植物构造发生改变，类似于SUP_Ox3&Ox5植物(比较表7和图1中的Homo_ox3/Homo_ox5和SUP_Ox3&Ox5植物)。相对于未编辑的参考对照植物(WT近交系)，纯合单ga20ox3突变体和纯合单ga20ox5突变体表现出平均植株高度(在R3阶段)轻微降低(约10％-11％)。另外，相对于未编辑的参考对照植物(WT近交系)，具有纯合ga20ox3突变和杂合ga20ox5突变的玉米植物(即，表7和图1中的Homo_ox3/Het_ox5)表现出平均植株高度(在R3阶段)中度降低(约19.1％)。Homo_ox3/Het_ox5植物比双重纯合ga20ox3 ga20ox5植物(Homo_ox3/Homo_ox5)略高。鉴于玉米是二倍体生物体，CRISPR介导的基因编辑可在R0植物中导致双等位基因突变(也称为双等位基因突变组合或交叉杂合突变)。为简单起见，出于基因型描述和植株高度计算的目的，将特定基因座处的双等位基因突变体视为该基因座处的纯合突变体。表18和表19分别提供了R1和R2代植物的详细突变体基因型(包括双等位基因突变体)。双重纯合ga20ox3/ga20ox5突变体和纯合/杂合突变体组合(例如，Homo_ox3/Het_ox5或Het_ox3/Homo_ox5)均导致较矮的半矮化植物，但是纯合/杂合突变体组合的植株高度的降低程度没有双重纯合ga20ox3/ga20ox5突变植物那么大。
表3. 12个编辑的GA20氧化酶_3中突变等位基因(ga20ox3-1至ga20ox3-12)及其序列的列表.此处显示的gRNA ID与表2中的那些相对应。
表4. 11个编辑的GA20氧化酶_5中突变等位基因(ga20ox5-1至ga20ox5-11)及其序列的列表.此处显示的gRNA ID与表2中的那些相对应。
表5.在GA20氧化酶_3、GA20氧化酶_5或这两个基因中具有突变的R1植物的列表.
表6.在GA20氧化酶_3、GA20氧化酶_5或这两个基因中具有编辑的等位基因的R2植物的列表.植物编号45和46被认为是异常值，在生成表7中所示的平均植株高度数据时不包括在内。
表7.温室种植的近交基因编辑植物与参考对照植物之间的R2/R3阶段植株高度差异.
实施例3.编辑GA20氧化酶_3和GA20氧化酶_5两者降低了植物中的活性GA水平。
在田间测试了在GA20氧化酶_3、GA20氧化酶_5或这两个基因中具有编辑的等位基因的R2植物，以及具有靶向GA20氧化酶_3和GA20氧化酶_5基因以进行抑制的人工微小RNA抑制构建体的转基因近交玉米植物(SUP_GA20Ox3&Ox5(“SUP_Ox3&Ox5”))。测量了各种生理性状，包括在R3阶段至穗节的植株高度、至最上舌叶的植株高度、穗高度、穗长度、穗直径、籽粒/穗、籽粒/单位面积、单籽粒重量、杆直径和谷粒产量估计。同时包含GA20氧化酶_3和GA20氧化酶_5基因的纯合突变等位基因的植物(即双重纯合ga20ox3/ga20ox5突变体)显示出半矮化表型与改变的植物构造。纯合单ga20ox3突变体和纯合单ga20ox5突变体显示出比双重纯合ga20ox3/ga20ox5突变体略高的植株高度。表8示出关键性状的相对于无编辑等位基因的野生型对照植物的Δ百分比(即，与对照植物相比的差异百分比)。
另外，收集了V8阶段的顶领叶，以通过标准生化分析测量一组赤霉酸激素的水平。数据表明，在V8生长阶段，与野生型(对照)相比，同时具有GA20ox3和GA20ox5编辑的植物的顶领叶组织的GA20、GA4和GA1水平显著较低，但GA53的水平较高。在具有GA20ox3和GA20ox5编辑的植物的组织中观测到的GA激素水平变化与在转基因SUP_Ox3&Ox5植物中观测到的变化相似(表9)。
表8：编辑GA20氧化酶_3、GA20氧化酶_5或这两个基因影响各种生理性状(显示为相对于野生型对照的平均差异百分比)。
表9：编辑GA20氧化酶_3、GA20氧化酶_5或这两个基因影响GA激素水平(显示为相对于野生型对照的平均Δ，即pmol GA/克组织差异和(p值))。还示出了野生型激素水平的平均pmol GA/克组织。
已经详细描述了本公开，将显而易见的是，在不脱离如本文和所附权利要求中所述的本公开的精神和范围的情况下，修改、变型和等效实施方案是可能的。此外，应当理解，本公开中的所有实施例均作为非限制性实施例来提供。
Claims (92)
1.一种修饰的玉米植物或其植物部分，所述修饰的玉米植物或其植物部分在GA20氧化酶_3基因座处包含突变等位基因并且在GA20氧化酶_5基因座处包含突变等位基因，其中所述GA20氧化酶_3基因座和所述GA20氧化酶_5基因座中的至少一者包含纯合突变等位基因。
2.如权利要求1所述的修饰的玉米植物或其植物部分，其中所述GA20氧化酶_3基因座包含纯合突变等位基因。
3.如权利要求1所述的修饰的玉米植物或其植物部分，其中所述GA20氧化酶_3基因座和所述GA20氧化酶_5基因座中仅一者包含纯合突变等位基因。
4.如权利要求1所述的修饰的玉米植物或其植物部分，其中所述GA20氧化酶_5基因座包含纯合突变等位基因。
5.如权利要求1所述的修饰的玉米植物或其植物部分，其中所述GA20氧化酶_3基因座和所述GA20氧化酶_5基因座两者均包含纯合突变等位基因。
6.如权利要求1至5中任一项所述的修饰的玉米植物或其植物部分，其中所述GA20氧化酶_3基因座和所述GA20氧化酶_5基因座中的一者或两者包含异等位基因组合或两个相同的突变等位基因。
7.如权利要求1至5中任一项所述的修饰的玉米植物或其植物部分，其中所述突变等位基因相对于未修饰的野生型GA20氧化酶_3或GA20氧化酶_5基因等位基因表现出至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或100％的表达或酶活性降低。
8.如权利要求1至7中任一项所述的修饰的玉米植物或其植物部分，其中所述GA20氧化酶_3基因座处的所述突变等位基因在选自由以下组成的组的序列区域中包含突变：启动子、5’UTR、第一外显子、第一内含子、第二外显子、第二内含子、第三外显子、3’UTR、终止子以及它们的任意组合。
9.如权利要求1至8中任一项所述的修饰的玉米植物或其植物部分，其中所述GA20氧化酶_3基因座处的所述突变等位基因包含选自由以下组成的组的一种或多种突变类型：无义突变、错义突变、移码突变、剪接位点突变以及它们的任意组合。
10.如权利要求1至9中任一项所述的修饰的玉米植物或其植物部分，其中所述GA20氧化酶_3基因座处的所述突变等位基因产生以下一项或多项：GA20氧化酶_3蛋白质截短体、不可翻译的GA20氧化酶_3基因转录物、无功能的GA20氧化酶_3蛋白质、GA20氧化酶_3基因中的提前终止密码子以及它们的任意组合。
11.如权利要求1至10中任一项所述的修饰的玉米植物或其植物部分，其中所述GA20氧化酶_3基因座处的每个突变等位基因相对于野生型GA20氧化酶_3基因包含选自由以下组成的组的突变：一个或多个核苷酸的取代、缺失、插入、复制和倒位。
12.如权利要求1至11中任一项所述的修饰的玉米植物或其植物部分，其中所述GA20氧化酶_3基因座处的所述突变等位基因在所述GA20氧化酶_3基因的所述第一外显子中包含一个或多个突变。
13.如权利要求1至12中任一项所述的修饰的玉米植物或其植物部分，其中所述GA20氧化酶_3基因座处的所述突变等位基因在所述GA20氧化酶_3基因的所述第二外显子中包含一个或多个突变。
14.如权利要求1至13中任一项所述的修饰的玉米植物或其植物部分，其中所述GA20氧化酶_5基因座处的所述突变等位基因在选自由以下组成的组的序列区域中包含突变：启动子、5’UTR、第一外显子、第一内含子、第二外显子、第二内含子、第三外显子、3’UTR、终止子以及它们的任意组合。
15.如权利要求1至14中任一项所述的修饰的玉米植物或其植物部分，其中所述GA20氧化酶_5基因座处的所述突变等位基因包含选自由以下组成的组的一种或多种突变类型：无义突变、错义突变、移码突变、剪接位点突变以及它们的任意组合。
16.如权利要求1至15中任一项所述的修饰的玉米植物或其植物部分，其中所述GA20氧化酶_5基因座处的所述突变等位基因产生以下一项或多项：GA20氧化酶_5蛋白质截短体、不可翻译的GA20氧化酶_5基因转录物、无功能的GA20氧化酶_5蛋白质、GA20氧化酶_5基因中的提前终止密码子以及它们的任意组合。
17.如权利要求1至16中任一项所述的修饰的玉米植物或其植物部分，其中所述GA20氧化酶_5基因座处的每个突变等位基因相对于野生型GA20氧化酶_5基因包含选自由以下组成的组的突变：一个或多个核苷酸的取代、缺失、插入、复制和倒位。
18.如权利要求1至17中任一项所述的修饰的玉米植物或其植物部分，其中所述GA20氧化酶_5基因座处的所述突变等位基因在所述GA20氧化酶_5基因的所述第一外显子中包含一个或多个突变。
19.如权利要求1至18中任一项所述的修饰的玉米植物或其植物部分，其中所述GA20氧化酶_5基因座处的所述突变等位基因在所述GA20氧化酶_5基因的所述第二外显子中包含一个或多个突变。
20.一种修饰的玉米植物或其植物部分，所述修饰的玉米植物或其植物部分在GA20氧化酶_3基因和GA20氧化酶_5基因中的一者中包含第一纯合突变，并且在所述GA20氧化酶_3基因和所述GA20氧化酶_5基因中的另一者中还包含第二杂合或纯合突变。
21.如权利要求20所述的修饰的玉米植物或其植物部分，其中所述第一纯合突变在所述GA20氧化酶_3基因中。
22.如权利要求21所述的修饰的玉米植物或其植物部分，其中所述第二突变在所述GA20氧化酶_5基因中，是杂合的。
23.如权利要求20所述的修饰的玉米植物或其植物部分，其中所述第一纯合突变在所述GA20氧化酶_5基因中。
24.如权利要求23所述的修饰的玉米植物或其植物部分，其中所述第二突变在所述GA20氧化酶_3基因中，是杂合的。
25.如权利要求20所述的修饰的玉米植物或其植物部分，其中所述第一纯合突变包括在所述GA20氧化酶_3基因和所述GA20氧化酶_5基因中的一者中的突变的异等位基因组合或两个相同的突变等位基因。
26.如权利要求20至25中任一项所述的修饰的玉米植物或其植物部分，其中所述第一纯合突变导致所述修饰的玉米植物具有相对于未修饰的野生型GA20氧化酶_3基因等位基因至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或100％的所述GA20氧化酶_3的表达或酶活性降低。
27.如权利要求20至25中任一项所述的修饰的玉米植物或其植物部分，其中所述第一纯合突变或所述第二杂合或纯合突变导致所述修饰的玉米植物具有相对于未修饰的野生型GA20氧化酶_5基因等位基因至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或100％的所述GA20氧化酶_5的表达或酶活性降低。
28.如权利要求20至27中任一项所述的修饰的玉米植物或其植物部分，其中所述GA20氧化酶_3基因座处的所述突变等位基因在选自由以下组成的组的序列区域中包含突变：启动子、5’UTR、第一外显子、第一内含子、第二外显子、第二内含子、第三外显子、3’UTR、终止子以及它们的任意组合。
29.如权利要求20至28中任一项所述的修饰的玉米植物或其植物部分，其中所述GA20氧化酶_3基因座处的所述突变等位基因包含选自由以下组成的组的一种或多种突变类型：无义突变、错义突变、移码突变、剪接位点突变以及它们的任意组合。
30.如权利要求20至29中任一项所述的修饰的玉米植物或其植物部分，其中所述GA20氧化酶_3基因座处的所述突变等位基因产生以下一项或多项：GA20氧化酶_3蛋白质截短体、不可翻译的GA20氧化酶_3基因转录物、无功能的GA20氧化酶_3蛋白质、GA20氧化酶_3基因中的提前终止密码子以及它们的任意组合。
31.如权利要求20至30中任一项所述的修饰的玉米植物或其植物部分，其中所述GA20氧化酶_3基因座处的每个突变等位基因相对于野生型GA20氧化酶_3基因包含选自由以下组成的组的突变：一个或多个核苷酸的取代、缺失、插入、复制和倒位。
32.如权利要求20至31中任一项所述的修饰的玉米植物或其植物部分，其中所述GA20氧化酶_3基因座处的所述突变等位基因在所述GA20氧化酶_3基因的所述第一外显子中包含一个或多个突变。
33.如权利要求20至32中任一项所述的修饰的玉米植物或其植物部分，其中所述GA20氧化酶_3基因座处的所述突变等位基因在所述GA20氧化酶_3基因的所述第二外显子中包含一个或多个突变。
34.如权利要求20至33中任一项所述的修饰的玉米植物或其植物部分，其中所述GA20氧化酶_5基因座处的所述突变等位基因在选自由以下组成的组的序列区域中包含突变：启动子、5’UTR、第一外显子、第一内含子、第二外显子、第二内含子、第三外显子、3’UTR、终止子以及它们的任意组合。
35.如权利要求20至34中任一项所述的修饰的玉米植物或其植物部分，其中所述GA20氧化酶_5基因座处的所述突变等位基因包含选自由以下组成的组的一种或多种突变类型：无义突变、错义突变、移码突变、剪接位点突变以及它们的任意组合。
36.如权利要求20至35中任一项所述的修饰的玉米植物或其植物部分，其中所述GA20氧化酶_5基因座处的所述突变等位基因产生以下一项或多项：GA20氧化酶_5蛋白质截短体、不可翻译的GA20氧化酶_5基因转录物、无功能的GA20氧化酶_5蛋白质、GA20氧化酶_5基因中的提前终止密码子以及它们的任意组合。
37.如权利要求20至36中任一项所述的修饰的玉米植物或其植物部分，其中所述GA20氧化酶_5基因座处的每个突变等位基因相对于野生型GA20氧化酶_5基因包含选自由以下组成的组的突变：一个或多个核苷酸的取代、缺失、插入、复制和倒位。
38.如权利要求20至37中任一项所述的修饰的玉米植物或其植物部分，其中所述GA20氧化酶_5基因座处的所述突变等位基因在所述GA20氧化酶_5基因的所述第一外显子中包含一个或多个突变。
39.如权利要求20至38中任一项所述的修饰的玉米植物或其植物部分，其中所述GA20氧化酶_5基因座处的所述突变等位基因在所述GA20氧化酶_5基因的所述第二外显子中包含一个或多个突变。
40.如权利要求20所述的修饰的玉米植物或其植物部分，其中所述第一纯合突变包括作为两个相同等位基因的对或异等位基因的组合的一个或多个等位基因，所述一个或多个等位基因选自由以下组成的组：
a.从536处开始缺失13个碱基；
b.缺失碱基542；
c.在碱基542处插入CC；
d.缺失碱基541；
e.从碱基540处开始缺失3nt；
f.从碱基422处开始缺失2个碱基；
g.在碱基422处插入A；
h.在碱基422处插入T；
i.缺失碱基564；
j.在碱基564处插入A；
k.在碱基565处插入C；以及
l.在碱基63处插入C；
其中所述碱基编号基于SEQ ID No.168，并且沿5’到3’方向从SEQ ID NO:168的第一个核苷酸计数。
41.如权利要求20所述的修饰的玉米植物或其植物部分，其中所述第一纯合突变是相对于SEQ ID No:168中的对应参考序列由SEQ ID No:170至193和206至217中的一个或多个标识。
42.如权利要求20所述的修饰的玉米植物或其植物部分，其中所述第一纯合突变包括作为两个相同等位基因的对或异等位基因的组合的一个或多个等位基因，所述一个或多个等位基因选自由以下组成的组：
a.缺失碱基644；
b.从碱基644处开始缺失2个碱基；
c.在碱基644处插入T；
d.缺失碱基372；
e.缺失碱基786；
f.从碱基786处开始缺失5个碱基；
g.从碱基101处开始缺失2个碱基；
h.在碱基碱基102处插入T；
i.从碱基99处开始缺失3个碱基；
j.在碱基282处插入A；以及
k.在碱基282处插入C；
其中所述碱基编号基于SEQ ID No.169，并且沿5’到3’方向从SEQ ID NO:169的第一个核苷酸计数。
43.如权利要求20所述的修饰的玉米植物或其植物部分，其中所述第一纯合突变是相对于SEQ ID No:169中的对应参考序列由SEQ ID No.:218至239和251至261中的一个或多个标识。
44.如权利要求1至43中任一项所述的修饰的玉米植物或其植物部分，其中所述修饰的玉米植物相对于未修饰的对照植物具有较矮的植株高度和/或改善的抗倒伏性。
45.如权利要求1至43中任一项所述的修饰的玉米植物或其植物部分，其中所述修饰的玉米植物比未修饰的对照植物矮至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、或至少40％。
46.如权利要求1至43中任一项所述的修饰的玉米植物或其植物部分，其中所述修饰的玉米植物在一个或多个茎节间处的秆或茎直径比未修饰的对照植物在相同的一个或多个节间处的秆或茎直径大至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、或至少40％。
47.如权利要求1至43中任一项所述的修饰的玉米植物或其植物部分，其中所述修饰的玉米植物在穗下方第一节间、第二节间、第三节间和/或第四节间中的一个或多个处的秆或茎直径比未修饰的对照植物的相同节间大至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、或至少40％。
48.如权利要求1至43中任一项所述的修饰的玉米植物或其植物部分，其中所述修饰的玉米植物的秆或茎的至少一个节间组织中的一种或多种活性GA的水平比未修饰的对照植物的相同节间组织低至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、或至少40％。
49.如权利要求1至43中任一项所述的修饰的玉米植物或其植物部分，其中所述修饰的玉米植物的秆或茎的至少一个节间组织中的一种或多种活性GA的水平低于未修饰的对照植物的相同节间组织。
50.如权利要求1至43中任一项所述的修饰的玉米植物或其植物部分，其中所述修饰的玉米植物在至少一个雌性器官或穗中不具有任何显著的异型。
51.如权利要求1至43中任一项所述的修饰的玉米植物或其植物部分，其中所述修饰的玉米植物基本上不表现出生殖异常。
52.如权利要求1至43中任一项所述的修饰的玉米植物或其植物部分，其中所述修饰的玉米植物相对于未修饰的对照植物包含一个或多个性状，所述一个或多个性状选自由以下组成的组：较矮的植株高度、增加的秆/茎直径、改善的抗倒伏性、减少的未成熟折断、较深的根、增加的叶面积、较早的冠层闭合、较高的气孔导度、较低的穗高度、增加的叶片含水量、改善的耐旱性、改善的氮利用效率、在正常或限氮或限水胁迫条件下减少的叶中花色素苷含量和面积、增加的穗重量、增加的收获指数、增加的产量、增加的种子数量、增加的种子重量以及增加的多产性。
53.一种制备修饰的玉米植物或其植物部分的方法，所述方法包括：
(a)使包含GA20氧化酶_3基因座的突变等位基因的第一玉米植物与包含GA20氧化酶_5基因座的突变等位基因的第二植物杂交；以及
(b)从步骤(a)中的杂交种中选择符合以下条件的子代玉米植物或其植物部分：
(i)对于所述GA20氧化酶_3基因座的一个或多个突变等位基因是纯合的并且对于所述GA20氧化酶_5基因座的突变等位基因是杂合的，或者
(ii)对于所述GA20氧化酶_3基因座的突变等位基因是杂合的并且对于所述GA20氧化酶_5基因座的一个或多个突变等位基因是纯合的。
54.如权利要求53所述的方法，其中所述第一玉米植物对于所述GA20氧化酶_3基因座的一个或多个突变等位基因是纯合的，并且所述第二玉米植物对于所述GA20氧化酶_5基因座的突变等位基因是杂合的。
55.如权利要求53所述的方法，其中所述第一玉米植物对于所述GA20氧化酶_3基因座的突变等位基因是杂合的，并且所述第二玉米植物对于所述GA20氧化酶_5基因座的一个或多个突变等位基因是纯合的。
56.如权利要求53所述的方法，其中所述第一玉米植物对于所述GA20氧化酶_3基因座的一个或多个突变等位基因是纯合的，并且所述第二玉米植物对于所述GA20氧化酶_5基因座的一个或多个突变等位基因是纯合的。
57.如权利要求53至56中任一项所述的方法，其中所述第一玉米植物对于所述GA20氧化酶_5基因座的突变等位基因是杂合的。
58.如权利要求57所述的方法，其中所述第二玉米植物对于所述GA20氧化酶_3基因座的野生型等位基因是纯合的。
59.如权利要求57所述的方法，其中所述第二玉米植物对于所述GA20氧化酶_3基因座的突变等位基因是杂合的。
60.如权利要求57所述的方法，其中所述第二玉米植物对于所述GA20氧化酶_3基因座的一个或多个突变等位基因是纯合的。
61.如权利要求53至56中任一项所述的方法，其中所述第一玉米植物对于所述GA20氧化酶_5基因座的一个或多个突变等位基因是纯合的。
62.如权利要求61所述的方法，其中所述第二玉米植物对于所述GA20氧化酶_3基因座的野生型等位基因是纯合的。
63.如权利要求61所述的方法，其中所述第二玉米植物对于所述GA20氧化酶_3基因座的突变等位基因是杂合的。
64.如权利要求61所述的方法，其中所述第二玉米植物对于所述GA20氧化酶_3基因座的一个或多个突变等位基因是纯合的。
65.如权利要求53至56中任一项所述的方法，其中所述第一玉米植物对于所述GA20氧化酶_5基因座的野生型等位基因是纯合的。
66.如权利要求64所述的方法，其中所述第二玉米植物对于所述GA20氧化酶_3基因座的野生型等位基因是纯合的。
67.如权利要求64所述的方法，其中所述第二玉米植物对于所述GA20氧化酶_3基因座的一个或多个突变等位基因是纯合的。
68.如权利要求64所述的方法，其中所述第二玉米植物对于所述GA20氧化酶_3基因座的突变等位基因是杂合的。
69.如权利要求53至68中任一项所述的方法，其中所述子代玉米植物是F1子代玉米植物。
70.一种制备修饰的玉米植物或其植物部分的方法，所述方法包括：
(a)使包含GA20氧化酶_3基因座的突变等位基因和GA20氧化酶_5基因座的突变等位基因的第一玉米植物与第二植物杂交；以及
(b)从步骤(a)中的杂交种中选择符合以下条件的子代玉米植物或其植物部分：
(i)对于所述GA20氧化酶_3基因座的一个或多个突变等位基因是纯合的并且对于所述GA20氧化酶_5基因座的突变等位基因是杂合的，或者
(ii)对于所述GA20氧化酶_3基因座的突变等位基因是杂合的并且对于所述GA20氧化酶_5基因座的一个或多个突变等位基因是纯合的。
71.如权利要求70所述的方法，其中所述第一玉米植物对于所述GA20氧化酶_3基因座的突变等位基因是杂合的并且对于所述GA20氧化酶_5基因座的突变等位基因是杂合的。
72.如权利要求70所述的方法，其中所述第一玉米植物对于所述GA20氧化酶_3基因座的一个或多个突变等位基因是纯合的并且对于所述GA20氧化酶_5基因座的突变等位基因是杂合的。
73.如权利要求70所述的方法，其中所述第一玉米植物对于所述GA20氧化酶_3基因座的一个或多个突变等位基因是纯合的并且对于所述GA20氧化酶_5基因座的一个或多个突变等位基因是纯合的。
74.如权利要求70所述的方法，其中所述第一玉米植物对于所述GA20氧化酶_3基因座的一个或多个突变等位基因是纯合的，并且所述第二玉米植物对于所述GA20氧化酶_5基因座的突变等位基因是杂合的。
75.如权利要求70所述的方法，其中所述第一玉米植物对于所述GA20氧化酶_3基因座的突变等位基因是杂合的，并且所述第二玉米植物对于所述GA20氧化酶_5基因座的一个或多个突变等位基因是纯合的。
76.如权利要求70所述的方法，其中所述第一玉米植物对于所述GA20氧化酶_3基因座的一个或多个突变等位基因是纯合的，并且所述第二玉米植物对于所述GA20氧化酶_5基因座的一个或多个突变等位基因是纯合的。
77.如权利要求70所述的方法，其中所述第一玉米植物对于所述GA20氧化酶_3基因座的一个或多个突变等位基因是纯合的，并且所述第二玉米植物对于所述GA20氧化酶_5基因座的一个或多个突变等位基因是纯合的。
78.如权利要求74至77中任一项所述的方法，其中所述第一玉米植物对于所述GA20氧化酶_5基因座的突变等位基因是杂合的。
79.如权利要求78所述的方法，其中所述第二玉米植物对于所述GA20氧化酶_3基因座的野生型等位基因是纯合的。
80.如权利要求78所述的方法，其中所述第二玉米植物对于所述GA20氧化酶_3基因座的突变等位基因是杂合的。
81.如权利要求78所述的方法，其中所述第二玉米植物对于所述GA20氧化酶_3基因座的一个或多个突变等位基因是纯合的。
82.如权利要求74至77中任一项所述的方法，其中所述第一玉米植物对于所述GA20氧化酶_5基因座的一个或多个突变等位基因是纯合的。
83.如权利要求82所述的方法，其中所述第二玉米植物对于所述GA20氧化酶_3基因座的野生型等位基因是纯合的。
84.如权利要求82所述的方法，其中所述第二玉米植物对于所述GA20氧化酶_3基因座的突变等位基因是杂合的。
85.如权利要求82所述的方法，其中所述第二玉米植物对于所述GA20氧化酶_3基因座的一个或多个突变等位基因是纯合的。
86.如权利要求74至77中任一项所述的方法，其中所述第二玉米植物对于所述GA20氧化酶_3基因座的突变等位基因是杂合的。
87.如权利要求86所述的方法，其中所述第一玉米植物对于所述GA20氧化酶_3基因座的突变等位基因是杂合的。
88.如权利要求86所述的方法，其中所述第一玉米植物对于所述GA20氧化酶_5基因座的一个或多个突变等位基因是纯合的。
89.如权利要求74至77中任一项所述的方法，其中所述第二玉米植物对于所述GA20氧化酶_3基因座的一个或多个突变等位基因是纯合的。
90.如权利要求89所述的方法，其中所述第一玉米植物对于所述GA20氧化酶_5基因座的突变等位基因是杂合的。
91.如权利要求89所述的方法，其中所述第一玉米植物对于所述GA20氧化酶_5基因座的一个或多个突变等位基因是纯合的。
92.如权利要求70至91中任一项所述的方法，其中所述子代玉米植物是F1子代玉米植物。
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