CN112980854B - 一种编码GA3ox-氧化酶的基因及其应用 - Google Patents

一种编码GA3ox-氧化酶的基因及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN112980854B
CN112980854B CN202110266460.9A CN202110266460A CN112980854B CN 112980854 B CN112980854 B CN 112980854B CN 202110266460 A CN202110266460 A CN 202110266460A CN 112980854 B CN112980854 B CN 112980854B
Authority
CN
China
Prior art keywords
gene
oxidase
ga3ox
leu
dwarfing
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202110266460.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112980854A (zh
Inventor
张宇
黄国弟
张继
莫永龙
龙凌云
唐玉娟
欧克纬
荣涛
罗世杏
赵英
李日旺
陈永森
覃昱茗
单彬
庞新华
陈燕丽
卢业飞
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangxi Subtropical Crops Research Institute
Original Assignee
Guangxi Subtropical Crops Research Institute
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guangxi Subtropical Crops Research Institute filed Critical Guangxi Subtropical Crops Research Institute
Priority to CN202110266460.9A priority Critical patent/CN112980854B/zh
Publication of CN112980854A publication Critical patent/CN112980854A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112980854B publication Critical patent/CN112980854B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/13—Plant traits
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种编码GA3ox‑氧化酶的基因及其应用。一种编码GA3ox‑氧化酶的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明通过半荧光定量分析法测定GA3ox‑氧化酶基因表达量对早期预判供试材料是否具有矮化特性的方法简单高效。

Description

一种编码GA3ox-氧化酶的基因及其应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种编码GA3ox-氧化酶的基因及其应用。
背景技术
矮化种植是农作物生产不变的发展趋势。植物矮化主要分为遗传性矮化和生理性矮化。单一基因突变属于遗传性矮化，其矮化激励多为基因合成蛋白，蛋白影响激素，激素影响表型；受环境因素影响，导致植株表型发生变化，属于生理性矮化，其矮化作用机理多为环境变化影响植物激素分泌，最终导致变化。但不论哪种矮化模式，都要通过激素来影响表型，植株生长过程中的激素多与赤霉素有关。
矮化基因的研究是阐释矮化特性的重要手段。GA3ox(GA3-氧化酶)是活性赤霉素生物合成途径的关键一步，催化转化GA12和GA53分别生成活性的GA1和GA4。GA3-氧化酶受反馈和正馈机制调节。当体内活性GA水平低时，GA3ox的转录水平明显升高；当体内活性GA水平高时，外源GA处理时GA3ox转录受到抑制。深入研究GA3ox的生物合成过程，克隆调控这一过程的关键基因，并对其表达产物进行分析就显得尤为必要。
目前，拟南芥、甘蔗、小麦、苜蓿、黄瓜、油菜、苹果和葡萄等多种植物的GA3ox基因被挖掘，越来越多的矮化基因被报道，为植物矮化分子机理研究提供丰富的素材。
通过对比具有乔化特性和矮化特性植物材料GA3ox基因的表达量，在植物童期预判是否具有矮化特性的，既省时又省力，该方法变得十分迫切和必要。
发明内容
为了克服上述技术的不足，本发明提供了一种编码GA3ox-氧化酶的基因及其应用，其可以预判芒果实生苗早期是否具有矮化特性。
本发明解决问题所采用的技术方案：
一种编码GA3ox-氧化酶的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
本发明还提供了所述的编码GA3ox-氧化酶的基因在早期预判芒果实生苗是否具有矮化表型特性。
另外，本发明还提供了所述编码GA3ox-氧化酶基因测定基因表达量的方法，包含以下步骤：
(1)克隆编码GA3ox-氧化酶的基因；
(2)将编码GA3ox-氧化酶基因与表达质粒连接构建重组表达质粒；
(3)将重组表达质粒线性化与纯化；
(4)将纯化后的重组表达质粒转化受体菌，筛选后获得基因工程菌；
(5)将基因工程菌诱导表达，纯化鉴定后获得GA3ox-氧化酶。
本发明所述的GA3ox-氧化酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。所述GA3ox-氧化酶由381个氨基酸组成，分子量为42620.09Da，理论等电点为5.17。
本发明还提供了一种重组表达质粒，所述重组表达质粒由表达质粒和编码GA3ox-氧化酶的基因重组而得。
作为优选，所述表达质粒为真核表达质粒pEAYS-T1。
另外，本发明还提供了了一种基因工程菌，所述基因工程菌由所述的重组表达质粒转化宿主菌而得。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明从供试材料中直接获取GA3ox-氧化酶基因序列，分析该基因理化活性，把该基因作为调控矮化性状的指标。
(2)本发明涉及到该GA3ox-氧化酶基因克隆、与之相对应的氨基酸序列分析，通过半荧光定量方法测定GA3ox-氧化酶基因表达量作为早期预判供试材料是否具有矮化性状提供了一种新的方法。
(3)本发明通过半荧光定量分析法测定GA3ox-氧化酶基因表达量对早期预判供试材料是否具有矮化特性的方法简单高效。
附图说明
图1为GA3ox-氧化酶基因中间片段PCR扩增结果图；
图2为GA3ox-氧化酶基因3’端PCR扩增结果图；
图3为GA3ox-氧化酶基因5’端PCR扩增结果图；
图4-6为GA3ox与其它植物GA3ox同源性比对结果示意图；
图7为GA3ox(左)编码蛋白的信号肽及跨膜结构域分析图；
图8为GA3ox编码蛋白二级结构分析图；
图9为GA3ox编码蛋白疏水性分析分析图；
图10为Mango GA3ox系统进化分析图；
图11为样本PCR扩增曲线图；
图12为样本PCR产物溶解曲线图；
图13为物候期一矮化特性和乔化特性种质中GA3ox基因表达量图；
图14为物候期二矮化特性和乔化特性种质中GA3ox基因表达量图；
图15为物候期三矮化特性和乔化特性种质中GA3ox基因表达量图；
图16为物候期四矮化特性和乔化特性种质中GA3ox基因表达量图；
图17为物候期五矮化特性和乔化特性种质中GA3ox基因表达量图。
具体实施方式
下面结合对本发明专利的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域所属的技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在实施例1中，主要仪器和试剂为：PCR仪：Takara；电泳仪：Bio-Rad；
Figure BDA0002972169210000041
2000分光光度计：Thermo；恒温摇床；
Figure BDA0002972169210000042
超保真DNA聚合酶：NEB；FirstChoice RLM-RACEKit：Thermo；2×Taq Master Mix(Dye Plus)：Vazyme。
在实施例2中，主要仪器和试剂为：ABI 7900-Fast Real-Time PCR DetectionSystem：ABI；
Figure BDA0002972169210000043
2000分光光度计：Thermo；普通PCR仪：Takara；All-in-OneTMFirst-Strand cDNA Synthesis Kit：GeneCopoeia(Cat.No.AORT-0050)；All-in-OneTMqPCR Mix：GeneCopoeia(Cat.No.AOPR-0200)；EpcentreTM RNase R。
实施例1：芒果GA3ox-氧化酶基因的克隆与序列分析
一、RNA提取与纯化
1.RNA提取
1.1样品处理：取80-100mg芒果叶片至冷冻研钵中，加入液氮研磨至粉末状，转移至装有1mL Trizol的1.5mL离心管中，振荡混匀后室温静置约5min。
1.2相分离：每1mL Trizol加入0.2mL氯仿，振荡混匀15s后室温静置约3min，4℃，12000rpm，离心15min。
1.3沉淀：转移水相至新的1.5mL离心管中，每1mL Trizol加入0.5mL异丙醇，混匀后室温静置10min，4℃，12000rpm，离心10min。
1.4洗涤：弃上清，每1mL Trizol加入1mL75％的乙醇，混匀后4℃，7500rpm，离心5min。
1.5溶解：弃上清，空气干燥RNA沉淀约5min(注意不要完全干燥，只需沉淀泛白即可)。
2.纯化提取的RNA
在微量离心管中配制下列反应液，50ul体系：RNA 50ug；10xDNase I Buffer 5ul；Recombinant DNase I(RNase—free，5U/ul)2ul；RNase Inhibitor(40U/ul)20Units，加DEPC-treated water补足50ul；37℃反应25min后，使Recombinant DNase I失活；然后加入10ul 3M醋酸钠和250ul冷乙醇，-80℃放置20min；接着4℃，12000rpm离心10min，弃上清，最后加入70％冷乙醇洗净，4℃，12000rpm离心5min，弃上清，干燥沉淀即可。
二、克隆目的基因中间片段
2.1根据GenBank中公布的植物的GA3ox基因cDNA序列，经过DNAMAN软件比对后，根据保守区域分别设计一对简并引物。
GA3ox-F：TCAYGGCATCCCCACTTC；
GA3ox-R：GACTCCACCATTCTYACT。
2.2反转录中间片段
(1)解冻First-Strand cDNA Synthesis Kit的试剂，上下轻柔颠倒混匀，短暂离心后放置冰上待用。
(2)冰上配制RNA-Primer Mix，在预冷的RNase-free反应管内加入以下试剂至总体积13μL；
Figure BDA0002972169210000051
(3)混匀RNA-Primer Mix，进行短暂离心，65℃变性10min后立即放于冰上；
(4)在RNA-Primer Mix反应管内加入以下试剂至总体积25μL；
Figure BDA0002972169210000061
(5)混匀反应Mix，短暂离心后37℃孵育1小时；
(6)反应结束后，85℃灭活处理5min，-20℃保存反转录产物待用。
2.3中间片段分析和分离
中间片段PCR反应体系：
Figure BDA0002972169210000062
PCR反应程序为：94℃5min；94℃40s，58℃40s，72℃1min，35个循环；72℃10min；4℃10min；结束后将PCR反应产物在质量分数为1％的琼脂糖凝胶电泳分析，结果见图1，并进行切胶回收目的片段。
从图1中可以看出：从芒果叶片中克隆出的GA3ox中间片段大小约为500bp。
三、克隆目的基因3’端
3.1根据已经获得的目的基因中间片段设计一对3’末端特异性引物。
GA3ox 3’GSP 1：AAAGCCGAAATCCCAGACC(inner)；
GA3ox 3’GSP 2：AACGCAGTGTTGTGATGGA(outer)。
3.2 Outer 3'PCR反应体系
Figure BDA0002972169210000071
PCR反应程序为：94℃3min；94℃40s，60℃40s，72℃1min，35个循环；72℃10min；4℃10min；
3.3 Inner 3'PCR反应体系
Figure BDA0002972169210000072
PCR反应程序为：94℃3min；94℃40s，60℃40s，72℃1min，35个循环；72℃10min；4℃10min；
3.4目的基因3’端分析和分离
将PCR反应产物在质量分数为1％的琼脂糖凝胶电泳分析，结果见图2，并进行切胶回收目的片段。
从图2可以看出：根据已获得的GA3ox基因中间片段的序列信息设计特异引物GA3ox3’GSP-1、GA3ox3’GSP-2与各自的通用引物进行PCR扩增，得到约1000bp-2000bp大小的DNA片段。
四、克隆目的基因5’端
4.1.根据已经获得的目的基因中间片段设计一对5’末端特异性引物。
GA3ox 5’GSP 1:TTCTCGCCAAACCATAGC(inner)；
GA3ox 5’GSP 2:CGAGTGGAGATCCATTGATAG(outer)。
4.2 Outer 5'PCR反应体系
Figure BDA0002972169210000081
PCR反应程序为：94℃3min；94℃40s，60℃40s，72℃1min，35个循环；72℃10min；4℃10min；
4.3 Inner 3'PCR反应体系
Figure BDA0002972169210000082
PCR反应程序为：94℃3min；94℃40s，60℃40s，72℃1min，35个循环；72℃10min；4℃10min；
4.4目的基因5’端分析和分离
将PCR反应产物在质量分数为1％的琼脂糖凝胶电泳分析，结果见图3，并进行切胶回收目的片段。
从图3可以看出：根据已获得的GA3ox基因中间片段的序列信息设计特异引物GA3ox5’GSP-1、GA3ox5’GSP-2与各自的通用引物进行PCR扩增，得到约750bp-2000bp大小的DNA片段。
五、基因序列拼接与分析
5.1利用DNAMAN对5’端、3’端及中间片段进行拼接，得到GA3ox基因的全长序列，翻译成蛋白质序列；再用BLAST进行氨基酸相似性检索，结果见图4-6。
从图4-6可以看出：GA3ox序列与以下物种的一致性分别为：阿月浑子(XP_031281616.1)80.16％、(XP_031256858.1)79.43％、(XP_031281617.1)69.90％、(XP_031256859.1)69.27％，柑橘(XP_006427125.2)64.25％，麻风树(XP_012073283.1)65.75％，木薯(XP_021627636.1)61.66％，橡胶树(XP_021675996.1)62.83％，甜橙(XP_015386120.1)66.29％。
将芒果与上述6个物种GA3ox氨基酸序列进行多重序列对比，结果表明，GA3ox氨基酸序列较为保守。
5.2氨基酸序列理化性质分析
用protparam(http://web.expasy.org/protparam/)分析，GA3ox序列均含有完整的开放阅读框，终止密码子分别为TAG、TGA。GA3ox编码381个氨基酸，产物的分子量为42620.09Da，理论等电点为5.17。其中酸性氨基酸(Asp+Glu)48个，碱性氨基酸(Arg+Lys)33个。该蛋白不稳定指数为47.15，为不稳定蛋白；脂肪指数为83.99；亲水性总平均值为-0.307。
用Phobius(http://phobius.sbc.su.se/)在线分析，分析结果见图7。
从图7可以看出，GA3ox为非胞浆蛋白，GA3ox的蛋白质均没有信号肽。对GA3ox蛋白序列的跨膜结构域进行预测结果显示，GA3ox跨膜区域不明显。
利用DNAMAN对GA3ox进行二级结构预测，预测结果见图8。
从图8可以看出，在GA3ox编码蛋白中，螺旋结构占25.15％，折叠占24.87％，无规则卷曲占49.98％。
利用DNAMAN预测GA3ox的疏水性，预测结果见图9。
从图9可以看出，GA3ox多肽链第177位的酪氨酸具有最低值-3.13，亲水性最强，而第245位的亮氨酸具有最高值2.65，疏水性最强。
为了研究Mango GA3ox的进化情况，构建了GA3ox氨基酸序列的系统进化树，如图10所示。
从图10可以看出，Mango GA3ox与Pistacia vera开心果GA3ox(XP031256858.1)、(XP 031256859.1)、(XP 031281617.1)、(XP 031281580)亲缘关系较近；其次为Citrusclementina(XP 006427125.2)，Citrus sinensis(XP 015386120.1)，Jatropha curcas(XP012073283.1)，Manihot esculenta(XP 021627636.1)，Hevea brasiliensis(XP021675996.1)。
实施例2：基因相对量PCR检测
1.提取RNA：按照实施例1的方法提取RNA，并往沉淀的RNA加入适量的DEPC处理水进行溶解，用分光光度计测定RNA浓度和纯度后-80℃保存；测定的结果见下表1。
表1各组样本及RNA含量
Figure BDA0002972169210000101
Figure BDA0002972169210000111
2.mRNA反转录
(1)解冻mRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit的试剂，上下轻柔颠倒混匀，短暂离心后放置冰上待用。
(2)冰上配制RNA-Primer Mix，在预冷的RNase-free反应管内加入以下试剂至总体积13μL；
Figure BDA0002972169210000112
(3)混匀RNA-Primer Mix，进行短暂离心，65℃变性10min后立即放于冰上；
(4)在RNA-Primer Mix反应管内加入以下试剂至总体积25μL；
Figure BDA0002972169210000113
(5)混匀反应Mix，短暂离心后37℃孵育1小时；
(6)反应结束后，85℃灭活处理5min，-20℃保存反转录产物待用。
3.miRNA反转录
(1)解冻miRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit的试剂，上下轻柔颠倒混匀，短暂离心后放置冰上待用。
(2)在无菌条件下加入以下试剂至总体积25μL；
Figure BDA0002972169210000121
(3)混匀反应Mix，短暂离心后37℃孵育1小时；
(4)反应结束后，85℃灭活处理5min，-20℃保存反转录产物待用。
4.定量PCR实验
(1)将All-in-OneTM qPCR Mix在室温下融解，轻柔地上下颠倒混匀并进行短暂离心；
(2)冰上配制PCR Reaction Mix
Figure BDA0002972169210000122
(3)将反应管进行短暂离心，确保所有反应液在反应孔底部；
(4)采用标准的三步法程序进行反应：
Figure BDA0002972169210000123
Figure BDA0002972169210000131
扩增曲线和溶解曲线分别见图11和图12。
从图11和图12中可以看出：总体看曲线拐点清楚，指数期明显，扩增曲线整体平行性极好，基线平无上扬现象，低浓度样本扩增曲线指数期明显。曲线指数期斜率，反应了扩增效率，越大说明扩增效率越高。图上的基线也就是阴性样本的扩增曲线，平直或略微下降是好试剂的表现，阴阳性清楚，不易误判。如果有上扬趋势，有可能造成阴性标本误判。曲线与曲线间平行性非常好，说明各反应管扩增效率相近，外标准定量建立在每管扩增效率一样的假定基础上，所以扩增效率越相近，定量的重复性和准确性就越好。溶解曲线是为了验证扩增产物特异性的，要是溶解曲线是单峰说明产物只有一条，结果较好；要是双峰说明产物不特异，可能存在引物二聚体或非特异性扩增，有可能引物设计有问题。
试验设置3次重复。采用7300System软件和2-ΔΔCt方法进行数据分析；在5个重要物候期时间点，进行实时荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)分析，测定芒果叶片的GA3ox基因表达量，结果如图13-17及表2所示。
表2各物候期mRNA的相对表达水平
Figure BDA0002972169210000132
如图13-17及表2所示，具有矮化特性的供试材料GA3ox基因表达量远远高于具有乔化特性的供试材料，说明GA3ox基因具有调控植物矮化表型的作用。
综上所述，本发明通过半荧光定量分析法测定GA3ox-氧化酶基因表达量为早期预判供试材料是否具有矮化性状提供了一种新的方法。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
序列表
<110> 广西壮族自治区亚热带作物研究所
<120> 一种编码GA30ox-氧化酶的基因及其应用
<130> 2020
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2256
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
caaaatacta atcacagtaa tataattaga taatacataa ttttattgtt atacaaaatc 60
atttataatg ttacaaaata aaagaatata taacaacaaa tatgaagttt gcaaaattat 120
cactatttaa aaagacttta ataaccttcc aagtaattta tttatctttt tggttcattc 180
aatcttgaca tgacttttaa gtgtatctgt attcaatatc tggttcattt tcttcaatct 240
tcgcagttat aaatgccaaa tgtgattcgt tttcttcgta tttctccttt tctgatcacc 300
tatatataca taatctttca actcatcgtt catcatccct tatctcaaat tcccccaaaa 360
cttcagctct atttgtcatc ctaaaatttt cacgatgtct tcaattcctg aaacttccac 420
tgagcctccg aaactctccg atgcttttcg cagccaccct ttccacctcc gtcacgaata 480
tcccgacttg acttcactaa gggaattacc agactcgtac gattggactg atcagcacta 540
cgtcgtttca gctaccaacg gtgactctgc cgtctacgag cccgttccgg tcatcgatct 600
cgaagacccg aatgctcagg aactcatcgg ccgtgcatgc aaaacttggg gagcttttca 660
agttataaat cacggcatcc ccacttccct tctcgatcac gctgagtgta ttactagaga 720
tcttttctct ttacccgttg aacaaaagct taaagcttct cgttctccag atgcttttac 780
aggctatggt ttggcgagaa gtaattcatt tttctccaag attatgtggt ctgaagtgtt 840
cactatcaat ggatctccac tcgatcattt tcgccaactt tggtcccaag attacaccga 900
acgcagtgtt gtgatggaag aatatgaaga ggagatgaaa aagttagcag caaaactaat 960
gtggctgatg ctggcttcac taaacataac aaaggaagac attgaatggg ccgaccggaa 1020
agccgaaatc ccagaccggt ctgcagtttt acaactgaat tattacccgg cttgtccgga 1080
cccggaccgg gccatgggta tggccgccca tacagactcc accattctca ctattattta 1140
ccagagcaac accagcggat tgcaggtcct aaacgaagga accagctggg tcactgtccc 1200
cgccattccc ggtgggctgg tggtgaatgt aggcgacttg cttcatatat tatccaatgg 1260
gtattacata agtgcactcc accgagcttt ggtgaaccga gacaaggcta ggttttccat 1320
cccctatttc tatgggccac cgccggaggc tcaagtctcg ccgttgccga agctggtaag 1380
cccaaaagat cctccccgct accgggctgt taattggact gaattccttg gcatcaaagc 1440
taaacatttc aacaacgggt tgtcttcaat cagaatttgt acttctcaga ctgatttggt 1500
cgctgcaaat ggtgatgata gtaatgcaga agtggcttag ctactatttg gattggagat 1560
cacaactgaa atcgacgtat caagtgtgct gaataatatg tattttattt aggtaataat 1620
ttaaaatatt atatttaaac tgttgtgtta tatgtttcat attttataaa tttgaagtca 1680
agttaacaaa tttcgtaaat aaatacttta tatattatga tttggtttag taacaggcag 1740
attctcaagt atacgatcgt tcaagtaatg agatagtgaa gttgaatact aaaaatcaat 1800
attatgttaa ccatattgtt tttaaaacta ttcaaaaaga gctataatat gtgtatataa 1860
ttttataaca taatttaaat atataaataa tatgttatca tgtaattaag tgttatttta 1920
tttttaattt aaaatcattt aatcatataa tgataaatta tttataccta tttaacatag 1980
tttatgatta ttgaattatg attatatatc tgataatcaa ttcttgcatg ttgagtgtag 2040
tttataatta ttggattata aattagcata acccaattga ctatttagca aataataaaa 2100
ctatgtatat ctaattttat atatctaatt aagtatctag ataatatatt atcatataat 2160
tagagtattt ttaaactaat aataaaataa cactatgata atacattatc tgaaaacaca 2220
gttgagtaac taaaaaatta ggagaaaaaa aaaaaa 2256
<210> 2
<211> 381
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Ser Ser Ile Pro Glu Thr Ser Thr Glu Pro Pro Lys Leu Ser Asp
1 5 10 15
Ala Phe Arg Ser His Pro Phe His Leu Arg His Glu Tyr Pro Asp Leu
20 25 30
Thr Ser Leu Arg Glu Leu Pro Asp Ser Tyr Asp Trp Thr Asp Gln His
35 40 45
Tyr Val Val Ser Ala Thr Asn Gly Asp Ser Ala Val Tyr Glu Pro Val
50 55 60
Pro Val Ile Asp Leu Glu Asp Pro Asn Ala Gln Glu Leu Ile Gly Arg
65 70 75 80
Ala Cys Lys Thr Trp Gly Ala Phe Gln Val Ile Asn His Gly Ile Pro
85 90 95
Thr Ser Leu Leu Asp His Ala Glu Cys Ile Thr Arg Asp Leu Phe Ser
100 105 110
Leu Pro Val Glu Gln Lys Leu Lys Ala Ser Arg Ser Pro Asp Ala Phe
115 120 125
Thr Gly Tyr Gly Leu Ala Arg Ser Asn Ser Phe Phe Ser Lys Ile Met
130 135 140
Trp Ser Glu Val Phe Thr Ile Asn Gly Ser Pro Leu Asp His Phe Arg
145 150 155 160
Gln Leu Trp Ser Gln Asp Tyr Thr Glu Arg Ser Val Val Met Glu Glu
165 170 175
Tyr Glu Glu Glu Met Lys Lys Leu Ala Ala Lys Leu Met Trp Leu Met
180 185 190
Leu Ala Ser Leu Asn Ile Thr Lys Glu Asp Ile Glu Trp Ala Asp Arg
195 200 205
Lys Ala Glu Ile Pro Asp Arg Ser Ala Val Leu Gln Leu Asn Tyr Tyr
210 215 220
Pro Ala Cys Pro Asp Pro Asp Arg Ala Met Gly Met Ala Ala His Thr
225 230 235 240
Asp Ser Thr Ile Leu Thr Ile Ile Tyr Gln Ser Asn Thr Ser Gly Leu
245 250 255
Gln Val Leu Asn Glu Gly Thr Ser Trp Val Thr Val Pro Ala Ile Pro
260 265 270
Gly Gly Leu Val Val Asn Val Gly Asp Leu Leu His Ile Leu Ser Asn
275 280 285
Gly Tyr Tyr Ile Ser Ala Leu His Arg Ala Leu Val Asn Arg Asp Lys
290 295 300
Ala Arg Phe Ser Ile Pro Tyr Phe Tyr Gly Pro Pro Pro Glu Ala Gln
305 310 315 320
Val Ser Pro Leu Pro Lys Leu Val Ser Pro Lys Asp Pro Pro Arg Tyr
325 330 335
Arg Ala Val Asn Trp Thr Glu Phe Leu Gly Ile Lys Ala Lys His Phe
340 345 350
Asn Asn Gly Leu Ser Ser Ile Arg Ile Cys Thr Ser Gln Thr Asp Leu
355 360 365
Val Ala Ala Asn Gly Asp Asp Ser Asn Ala Glu Val Ala
370 375 380

Claims (6)

1.一种编码GA3ox-氧化酶的基因，其特征在于：所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.一种权利要求1所述的编码GA3ox-氧化酶的基因的应用，其特征在于，所述编码GA3ox-氧化酶的基因用于早期预判芒果实生苗是否具有矮化特性。
3.一种GA3ox-氧化酶，其特征在于，所述GA3ox-氧化酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，所述GA3ox-氧化酶由381个氨基酸组成，分子量为42620.09Da，理论等电点为5.17。
4.一种重组表达质粒，其特征在于，所述重组表达质粒由表达质粒和权利要求1所述基因重组而得。
5.根据权利要求4所述的重组表达质粒，其特征在于，所述表达质粒为真核表达质粒pEAYS-T1。
6.一种基因工程菌，其特征在于：所述基因工程菌由权利要求4或5所述重组表达质粒转化宿主菌而得。
CN202110266460.9A 2021-03-11 2021-03-11 一种编码GA3ox-氧化酶的基因及其应用 Active CN112980854B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110266460.9A CN112980854B (zh) 2021-03-11 2021-03-11 一种编码GA3ox-氧化酶的基因及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110266460.9A CN112980854B (zh) 2021-03-11 2021-03-11 一种编码GA3ox-氧化酶的基因及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112980854A CN112980854A (zh) 2021-06-18
CN112980854B true CN112980854B (zh) 2022-03-18

Family

ID=76336411

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110266460.9A Active CN112980854B (zh) 2021-03-11 2021-03-11 一种编码GA3ox-氧化酶的基因及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112980854B (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113481176B (zh) * 2021-08-03 2022-04-19 中国农业大学 GA3ox1蛋白在调控苜蓿株型中的应用
CN113493803B (zh) * 2021-08-03 2022-04-19 中国农业大学 紫花苜蓿CRISPR/Cas9基因组编辑系统及其应用
CN114381546A (zh) * 2022-01-19 2022-04-22 河南农业大学 与西瓜短下胚轴基因Clsh共分离的分子标记及应用
CN114591976A (zh) * 2022-04-07 2022-06-07 广西壮族自治区亚热带作物研究所（广西亚热带农产品加工研究所） 一种编码GA2ox-氧化酶的基因及其在判断芒果矮化品种中的应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019161149A1 (en) * 2018-02-15 2019-08-22 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for increasing harvestable yield via editing ga20 oxidase genes to generate short stature plants
CN112251451A (zh) * 2020-10-30 2021-01-22 广西壮族自治区亚热带作物研究所（广西亚热带农产品加工研究所） 一种编码GA20ox-氧化酶的基因及其应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019161149A1 (en) * 2018-02-15 2019-08-22 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for increasing harvestable yield via editing ga20 oxidase genes to generate short stature plants
CN112251451A (zh) * 2020-10-30 2021-01-22 广西壮族自治区亚热带作物研究所（广西亚热带农产品加工研究所） 一种编码GA20ox-氧化酶的基因及其应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
gibberellin 3-beta-dioxygenase 1-like [Pistacia vera];NCBI Reference Sequence: XP_031256858.1;《GenBank》;20191022;全文 *
NCBI Reference Sequence: XP_031281616.1.gibberellin 3-beta-dioxygenase 1-like [Pistacia vera].《GenBank》.2019, *
杧果矮化基因 GA2ox 的克隆、亚细胞定位及表达分析;张继等;《经济林研究》;20200331;第38卷(第1期);90-97 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN112980854A (zh) 2021-06-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112980854B (zh) 一种编码GA3ox-氧化酶的基因及其应用
CN101086014B (zh) 鱼类线粒体dna控制区扩增引物及其设计方法和应用
CN105647943B (zh) 天山雪莲细胞鲨烯合酶基因SiSQS及其编码的产物和应用
Qureshi et al. Cloning and functional analysis of the TATA binding protein from Sulfolobus shibatae
CA2706439A1 (en) Maize ethylene signaling genes and modulation of same for improved stress tolerance in plants
CN112251451B (zh) 一种编码GA20ox-氧化酶的基因及其应用
CN105936898B (zh) 一种茶树紫芽相关蛋白CsGST及其编码基因和应用
US7943822B2 (en) Polynucleotides encoding proteins involved in plant metabolism
US20160024516A1 (en) Modulation of ACC Deaminase Expression
CN112961229A (zh) 橡胶树转录因子HbICE4及其编码基因与应用
CN111763252A (zh) 烟粉虱MED隐种染色质重塑因子Btbrm2及其编码基因和应用
CN114591976A (zh) 一种编码GA2ox-氧化酶的基因及其在判断芒果矮化品种中的应用
CN109022445B (zh) 荔枝蒂蛀虫卵黄原蛋白基因CsVg及其编码蛋白与应用
CN114149999B (zh) 一种玉米淀粉合成调控基因ZmSSP1及其应用
CN112646820B (zh) 改变玉米开花期的基因及方法
CN109485714B (zh) Tlk蛋白及其在虾蟹类抗病毒品系育种中的应用
US7034117B2 (en) RAD51 polypeptides and uses thereof
SHAN et al. Cloning of the full‐length cDNA of the wheat involved in salt stress: Root hair defective 3 gene (RHD3)
CN113846109B (zh) OsCRRP在水稻耐热胁迫中的应用
US20090222945A1 (en) Brittle stalk 2 polynucleotides, polypeptides, and uses thereof
CN116286856A (zh) 一种编码della6蛋白的基因及其在判断芒果矮化品种中的应用
CN114015709B (zh) 绵羊ctsd基因在调控初情期启动中的应用
RU2817905C1 (ru) Олигонуклеотидные днк праймеры для оценки суммарной экспрессии всех генов, кодирующих каталазу у персика prunus persica (l.) batsch
CN114605513B (zh) 一种毛竹蜡质合成转录因子基因PeWST及其应用
US9000262B2 (en) ETO1 genes and use of same for reduced ethylene and improved stress tolerance in plants

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
EE01 Entry into force of recordation of patent licensing contract

Application publication date: 20210618

Assignee: Guangxi Wanghe Technology Co.,Ltd.

Assignor: GUANGXI SUBTROPICAL CROPS Research Institute (GUANGXI SUBTROPICAL AGRICULTURAL PRODUCTS PROCESSING RESEARCH INSTITUTE)

Contract record no.: X2023450000016

Denomination of invention: A gene encoding GA3ox-oxygenase and its application

Granted publication date: 20220318

License type: Common License

Record date: 20230215

EE01 Entry into force of recordation of patent licensing contract