CN105647943B - 天山雪莲细胞鲨烯合酶基因SiSQS及其编码的产物和应用 - Google Patents

天山雪莲细胞鲨烯合酶基因SiSQS及其编码的产物和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种天山雪莲细胞鲨烯合酶基因SiSQS及其编码的产物和应用。该基因的cDNA长度为1846bp。利用该基因与原核表达载体相连接得到SiSQS重组表达载体并制备得到该酶，雪莲细胞鲨烯合酶可以应用于以法尼基焦磷酸为底物制备鲨烯。利用本发明所提供的基因可以通过基因工程技术提高雪莲细胞化学成分β‑谷甾醇的含量，尤其是可以应用于雪莲及其相近种属植物细胞和/或组织培养领域。

Description

天山雪莲细胞鲨烯合酶基因SiSQS及其编码的产物和应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及天山雪莲细胞鲨烯合酶基因SiSQS及其编码的产物和应用。
背景技术
2015版《中国药典》记载天山雪莲来源于菊科植物天山雪莲Saussureainvolucrate的干燥地上部分，因具有补肾活血和强筋骨的功效，被用于治疗风湿性关节炎、关节疼痛、肺寒咳嗽、肾与小腹冷痛等疾病。雪莲主产于我国西北、西南等高寒地区，由于其生长环境特殊导致栽培困难，野生天山雪莲资源处于濒危状态，因此雪莲细胞近年来成为天山雪莲的替代品。天山雪莲化学成分具有多样性，目前已报道的成分有多糖、黄酮、生物碱、萜类、木质素、甾醇及挥发油等，其中甾醇类成分主要为β-谷甾醇。β-谷甾醇是一种植物甾醇，具有明显降低血清胆固醇的功效，其生物合成途径中的一个关键酶为鲨烯合酶。
鲨烯合酶(Squalene Synthase，SQS)催化两个分子的法尼基焦磷酸(FPP)生成鲨烯，它在三萜和甾醇的生物合成中起着关键作用。由于鲨烯合酶催化的底物FPP处于异类戊二烯代谢途径中的分支点，因此鲨烯合酶的活性能够直接影响甾醇和三萜等类异戊二烯化合物的生物合成。所以对天山雪莲细胞鲨烯合酶(SiSQS)基因进行研究，能够为通过基因工程技术提高雪莲细胞活性成分β-谷甾醇的含量提供重要技术支持。但是本领域目前尚未有关于天山雪莲鲨烯合酶基因及其编码的氨基酸序列的相关研究。
发明内容
本发明的第一个目的是提供天山雪莲细胞鲨烯合酶的编码基因序列及氨基酸序列。
本发明的第二个目的是提供天山雪莲细胞鲨烯合酶基因的应用。
为达到本发明的第一个目的，本发明的发明人通过对天山雪莲的基因组进行测序分析和功能研究提供了一种天山雪莲细胞鲨烯合酶基因SiSQS，该基因具有(1)或(2)所示的核苷酸序列：
(1)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；
(2)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。
其中，当所述基因具有(1)所示的核苷酸序列时，该基因cDNA的长度为1846bp，开放读码框位于222-1478bp处。
本发明还提供了所述基因SiSQS所编码的产物，所述产物可以为RNA、多肽或蛋白质，优选的，所述产物的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
应当理解，本领域技术人员可根据本发明公开的蛋白SiSQS的氨基酸序列，在不影响其活性的前提下，取代、缺失或增加一个或几个氨基酸，得到所述蛋白的突变序列，该突变序列也属于本发明的保护范围。
本发明的另一目的是提供含有所述基因SiSQS的重组表达载体。
本发明的一个方面还提供了含有所述基因的宿主细胞。
其中，所述宿主细胞含有所述天山雪莲细胞鲨烯合酶基因SiSQS或其重组表达载体。本发明所提供的基因SiSQS，连接于可以引导外源基因在植物表达中的表达载体制备得到基因SiSQS的重组表达载体。优选的情况下，所述表达载体为质粒pGEX-4T-1。本发明的基因SiSQS在构建到表达载体中时，在其转录起始核苷酸前加上任何一种强启动子或诱导性启动子均可，同时必须与编码序列的阅读框相同，要保证整个序列的翻译。为了便于对转基因植物细胞或植株进行鉴定和筛选，可以在构建载体时对载体进行加工，例如加入可选择标记，通常可使用的标记是对抗生素抗性酶的基因和生物安全标记，也可以是GUS、GFP等可以产生颜色变化的酶或发光化合物的基因等。
其中，所述宿主细胞为天山雪莲细胞，具体的，所述宿主细胞的物种为菊科风毛菊属植物天山雪莲Saussurea involucrate，所述宿主细胞为有价值的活体材料，包括组培获得的天山雪莲细胞及天山雪莲植株的细胞。
在本发明中，所述的宿主细胞可以为E.coli transetta(DE3)细胞。
本发明还提供了所述的基因SiSQS的特异性引物对，所述引物对包括如SEQ IDNO.3所示的上游引物，以及如SEQ ID NO.4所示的下游引物。
所述特异性引物对可以通过聚合链式反应(PCR)扩增得到基因SiSQS的核苷酸序列。
本发明的一个方面涉及所述的基因SiSQS、载体或宿主细胞在天山雪莲及其相近种属植物细胞和/或组织培养中的应用。
具体可以应用于生物合成甾醇类或三萜类成分的制备，进一步的，所述甾醇类成分为β-谷甾醇。所述相近种属包括风毛菊属Saussurea和雪莲亚属Subgen.Amphilaena(Stschegl.)Lipsch.。
本发明还提供了所述基因SiSQS、载体或宿主细胞在制备三萜类和/或甾醇类化合物中的应用；所述应用包括在细胞中转入SiSQS基因，在宿主细胞中表达天山雪莲细胞鲨烯合酶，利用天山雪莲细胞鲨烯合酶促进甾醇类化合物的合成。
其中，所述的甾醇类化合物优选为β-谷甾醇。
本发明的发明人成功从雪莲细胞中克隆出了一种天山雪莲鲨烯合酶(SiSQS)的编码基因，该酶可以应用于以法尼基焦磷酸(FPP)为底物制备鲨烯的通路。利用本发明所提供的基因可以通过基因工程技术提高雪莲细胞药效成分β-谷甾醇的含量。
附图说明
图1为SiSQS结构功能域预测分析(来源于NCBI数据库)；
图2为SiSQS系统进化树；
图3为表达本发明SiSQS基因的重组表达载体pGEX-SiSQS的图谱；
图4为SiSQS蛋白质的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果。其中泳道1为Protein RulerMarker l，泳道2为含有pGEX-4T-1空载体的E.coli Trasetta(DE3)培养物；泳道3为含有pGEX-SiSQS的E.coli Trasetta(DE3)培养物。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
试验中使用试剂如T4-DNA连接酶、Marker、大肠杆菌感受态DH5α和E.coliTrasetta(DE3)、pGEX-4T-1载体以及DNA凝胶回收试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司，Taq酶及RNA反转录试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司公司，BamH I和Sma I等限制性内切酶购自纽英伦(NEB)生物技术北京有限公司，其他常用试剂购自宝生物(大连)工程有限公司(TaKaRa)公司。引物合成和测序由北京睿博兴科生物技术有限公司完成。
实施例1雪莲细胞转录组测序
利用Trizol分别提取天山雪莲细胞的总RNA，通过Illumina Hiseq2000平台测序，总计产出14372403000nt数据。组装结果总Unigene148718个，总长138529450nt，平均长度931nt，N50达到1515nt。Unigene功能注释，注释到NR，NT，Swiss-Prot，KEGG，COG，GO库的Unigene分别是77514个，63458个，49750个，45573个，28939个，55950个，所有注释上的Unigene是83169个。预测编码蛋白框(CDS)，比对到蛋白库的CDS有75735个，预测出的CDS有5305个，共81040个。通过GO注释，Blast对比分析以及MEGA6.0构建系统发育树等分析，得到天山雪莲细胞鲨烯合酶基因家族序列。
所述的天山雪莲细胞是按照申请号为200510115902.0的发明专利中记载的方法获得，是选取天山雪莲离体组织，经脱分化形成的愈伤组织作为继代种，给与一定条件进行大规模继代培养获得的紫红色团块。
实施例2 雪莲细胞鲨烯合酶基因的克隆
SiSQS的克隆利用正向引物：P1:5’ATGGGGAGTTTAAAAGCAGTGTTGA 3’，反向引物P2:5’TTACAACGTAAGCTTGATTTTATTT 3’，以天山雪莲细胞鲨烯合酶SiSQS编码基因全长序列为模板进行PCR扩增。扩增体系如下：10×Buffer 2.5μL，dNTP(2.5mmol·L-1)1μL，引物P1和P2各1μL，Taq DNA聚合酶(5U·L-1)0.2μL，模板1μL(约20ng)，其余用无菌双蒸水补足。反应条件：94℃预变性5min，94℃30s，56℃退火30s，72℃延伸2min30s，35个循环后72℃延伸10min，4℃保存。至此获得了天山雪莲鲨烯合酶SiSQS基因克隆。
实施例3 SiSQS基因的生物信息学分析
本发明所提供的天山雪莲鲨烯合酶基因SiSQS全长cDNA的长度为1846bp，详细序列如序列表中SEQ ID NO.1所示，其中开放读码框位于222-1478bp。将SiSQS基因序列用NCBI数据库中的BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundantGenBank CDS translation+PDB+Swissprot+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸同源性检索。该基因在氨基酸水平上与其它物种中的SQS有同源性，同时具有典型的Isoprenoid_Biosyn_C1superfamily结构域。如图1和图2。其中图1为SiSQS结构功能域预测分析(来源于NCBI数据库)；图2为SiSQS系统进化树(邻接法)。
实施例4 SiSQS基因原核表达载体的构建
以SiSQS cDNA为模板，设计特异性上游引物P3和下游引物P4(如表1所示)，进行PCR扩增反应，引物中划线部分为酶切位点。
表1
引物名称 序列名称 碱基序列(5’→3’)
P3 SEQ ID NO.3 <u>CGCGGATCC</u>ATGGGGAGTTTGGGAGCGAT
P4 SEQ ID NO.4 <u>TCCCCCGGG</u>TCATTTAGTGGAGAGAAATGCAAAC
PCR反应体系(25μL)为：反应体系中含10×PCR缓冲液2.5μL、dNTP(2.5mmol·L-1)1μL、鉴别引物(10μmol·L-1)各0.2μL、TaqDNA聚合酶(5U·L-1)0.2μL和模板1μL(约20ng)，用无菌双蒸水补足反应体积。
PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃30s，56℃退火30s，72℃延伸2min30s，35个循环后72℃延伸10min，4℃保存。
取5μl扩增产物加入3μl溴芬兰进行琼脂糖凝胶电泳，半小时后照相，观察胶图，扩增片段为1256bp。BamH I和Sma I在37℃下酶切扩增产物3小时，利用DNA凝胶回收试剂盒(Takara公司，中国)纯化酶切产物。同时利用BamH I和Sma I在37℃下酶切pGEX-4T-1载体2小时，加入5μl溴芬兰进行琼脂糖凝胶电泳，观察胶图，并利用DNA凝胶回收试剂盒回收。
二者经T4连接酶在16℃连接过夜。电击转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含有氨苄青霉素的LB平板上筛选重组子。含SiSQS克隆的pGEX质粒经PCR和限制性内切酶酶切电泳鉴定和DNA序列分析，保存具有正确目标序列的重组质粒pGEX-SiSQS用于表达转化，该原核表达载体命名为pGEX-SiSQS(图谱如图3所示)。
实施例5 工程菌的诱导表达
用目标质粒pGEX-SiSQS转化E.coli transetta(DE3)感受态细胞，培养筛选含有pGEX-SiSQS质粒的阳性菌株E.coli transetta(DE3)-SiSQS。该菌株含有可诱导SiSQS重组基因的高效表达。将阳性克隆E.coli transetta(DE3)-SiSQS接种于含50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，25℃振荡培养12-16h，OD600＝0.4-0.6，以1∶100比例接种于新鲜的含抗生素氨苄青霉素的培养基中，37℃振荡培养3～5h进行扩增，取1ml菌液作为诱导前对照，然后加入终浓度为0.4mmol/L的异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)，在25℃振荡培养中诱导工程菌表达，以含有pGEX-4T-1空载体的E.colitransetta(DE3)培养物为阴性对照。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明，在分子量约为68kDa处，出现一条明显的特异蛋白质表达条带，与理论值一致(如图4)。其中泳道1为Protein Ruler Marker l，泳道2为含有pGEX-4T-1空载体的E.coli transetta(DE3)培养物；泳道3为含有pGEX-SiSQS的培养物。
实施例6 体外酶功能验证
1.粗酶提取液的制备：在实施例5得到含有pGEX-SiSQS质粒的阳性菌株E.coliTrasetta(DE3)-SiSQS在含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃振荡培养，当菌体密度达到OD600＝0.8-1.0后，12000r/min，4℃，离心1min。收集菌体沉淀，重悬于PBS(pH7.5)缓冲液中，洗涤2次，再加入2mL细胞裂解液(00mMTris–HCl(pH 7.5)，10mM FPP，10mM MgCl2，1mM DTT，2％Glycine，3mM NADPHNa4)，剧烈振荡1min，冰浴1min，重复5次。12000r/min，4℃，离心30min，吸取上清液作为粗酶提取液，置冰上备用。
2.SQS酶功能验证：以FPP为反应底物进行体外酶功能，反应体系为:100mMTris-HCl(pH 7.5)，10mM FPP，10mM MgCl2，1mM DTT，2％Glycine，3mM NADPHNa4及475μL酶液。混匀，水浴32℃，0h。直接加入1倍体积正己烷，涡悬提取3次(1mL×3次)，合并提取液。真空浓缩至干，加60μL正己烷复溶，取1μL进样，以鲨烯作为标准品。GC-MS检测反应GC-M S分析条件为：120℃3min，15℃/min升至180℃，25℃/min升至260℃，保持25min，对产物进行定性，结果发现鲨烯标准品在GC中保留时间为18.45min，样品在保留时间为18.47min存在特征峰，而空载体对照样品中没有检测到相应的特征峰，再对样品产物中的特征峰进行GC–MS分析定性为鲨烯(squalene)，同时有m/z69[CH3(CH3)＝CHCH2-]+、410[M]+等特征离子峰，因此可以认定pGEX-SiSQS具有催化FPP合成鲨烯的活性。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Figure IDA0000941112730000011
Figure IDA0000941112730000021
Figure IDA0000941112730000031
Figure IDA0000941112730000041
Figure IDA0000941112730000051

Claims (8)

1.天山雪莲（Saussurea involucrata）细胞鲨烯合酶基因SiSQS，其核苷酸序列如SEQID NO.1所示。
2.权利要求1所述的天山雪莲（Saussurea involucrata）细胞鲨烯合酶基因SiSQS编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.权利要求1所述的天山雪莲（Saussurea involucrata）细胞鲨烯合酶基因SiSQS的特异性引物对，所述引物对包括如SEQ ID NO.3所示的上游引物，以及如SEQ ID NO.4所示的下游引物。
4.含有权利要求1所述的天山雪莲（Saussurea involucrata）细胞鲨烯合酶基因SiSQS的重组表达载体。
5.权利要求1所述的天山雪莲（Saussurea involucrata）细胞鲨烯合酶基因SiSQS或权利要求4所述的重组表达载体在天山雪莲细胞和/或组织培养中的应用。
6.权利要求1所述的天山雪莲（Saussurea involucrata）细胞鲨烯合酶基因SiSQS或权利要求4所述的重组表达载体在制备三萜类和/或甾醇类化合物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，所述应用包括在细胞中转入所述天山雪莲（Saussurea involucrata）细胞鲨烯合酶基因SiSQS，在宿主细胞中表达天山雪莲细胞鲨烯合酶，利用天山雪莲细胞鲨烯合酶促进三萜类和/或甾醇类化合物的合成。
8.根据权利要求6或7所述的应用，所述的甾醇类化合物为β-谷甾醇。
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