CN114106124B

CN114106124B - 一种能够提高蒜氨酸含量的大蒜AsNAC1转录因子基因及其应用

Info

Publication number: CN114106124B
Application number: CN202111419937.9A
Authority: CN
Inventors: 宛雯; 杨绪勤; 张春媚; 齐东东; 徐春燕; 李�杰; 吴家莹
Original assignee: Jiangsu Normal University
Current assignee: Jiangsu Normal University
Priority date: 2021-11-26
Filing date: 2021-11-26
Publication date: 2023-06-23
Anticipated expiration: 2041-11-26
Also published as: CN114106124A

Abstract

本发明公开了一种能够提高蒜氨酸含量的大蒜AsNAC1转录因子基因及其应用，所述大蒜AsNAC1转录因子基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。与现有技术相比，本发明发现AsNAC1转录因子基因可以提高大蒜愈伤细胞的蒜氨酸含量。本发明提出一种能够提高大蒜蒜氨酸含量的新型转录因子基因，通过转基因方法可以提高大蒜愈伤组织细胞的蒜氨酸合成能力，进而为提高大蒜品质提供有效途径。

Description

一种能够提高蒜氨酸含量的大蒜AsNAC1转录因子基因及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种能够提高蒜氨酸含量的大蒜AsNAC1转录因子基因及其应用。

背景技术

大蒜(Allium sativum L.)属于百合科葱蒜属多年生草本植物，虽产生种子，但通常采用无性繁殖。大蒜除具有食用价值以外，还具有重要的药用保健功能，是一种重要的药食同源植物。现代医学研究表明，大蒜在抗菌消炎、预防和治疗心血管疾病以及糖尿病等方面具有显著的效果。此外其还具有一定的防癌和抗癌作用(张燕等，2005；Apple et al.,2010)。

蒜素(Alliicin)及其相关的含硫化合物是大蒜所特有的一类化合物，也是决定其独特气味和重要药用价值的关键物质。蒜素的主要成分为2-丙烯基硫代亚磺酸酯，有蒜氨酸酶催化蒜氨酸而来。正常情况下，蒜氨酸酶存在于细胞液泡中，而蒜氨酸存在于细胞质中，当大蒜组织或细胞遭受破坏时，蒜氨酸酶从液泡中释放出来，催化蒜氨酸生成包括蒜素在内的多种含硫化合物(Shimon et al.,2005)。蒜素极其不稳定，在不同条件下会氧化生成不同的物质，不利储存和实际应用。然而其前体物质蒜氨酸则相对稳定。蒜氨酸，全称为S-烯丙基-L-半胱氨酸亚砜(S-allyl-L-cysteinesulfoxide,SACS)(Fillmore et al.,1995)，属于非蛋白类氨基酸。它是一种极易溶于水，不溶于乙醚等非极性有机溶剂的极性有机硫化物，分子量为177.22，等电点PI为4.86，它通常与多糖结合，以稳定的形式存在于大蒜鳞茎细胞中；且是大蒜中主要的硫代半胱氨酸亚砜化合物，含量约占90％(黄雪松等，2004)；具有抗炎、杀菌、抗肿瘤、抗糖尿病、保肝等作用(孙明江,2009；Anwar and Younus,2017)。虽然目前已经实现蒜氨酸的化学合成，但是产量较低，价格昂贵。此外由于蒜氨酸合成途径复杂，涉及的酶类众多，且合成关键酶还未知。所以目前还无法实现在微生物或生物反应器中生物合成蒜氨酸，其主要获取途径还是来源于新鲜大蒜组织。

NAC转录因子是植物所特有的一类转录因子家族，最早在拟南芥和矮牵牛中发现(Aida et al.,1997)。这类蛋白家族在其N端含有一个有约150个氨基酸组成的NAC结构域。该结构域可以分为5个亚区域A、B、C、D和E。其中A、C和D亚结构域高度保守，B和E亚结构域保守性相对较弱。转录调控区域则通常位于该类蛋白的C端，其氨基酸组成和功能方面呈现高度多样化(Olsen.,2005)。越来越多的研究结果表明，NAC转录因子家族在植物的生长发育、激素调控、生物及非生物胁迫等方面发挥重要的调控作用。而目前大蒜的NAC类转录因子的克隆，及其功能研究还比较少。

发明内容

发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种能够提高蒜氨酸含量的大蒜AsNAC1转录因子基因及其应用。

技术方案：为了达到上述发明目的，本发明所采用的技术方案如下：

一种能够提高蒜氨酸含量的大蒜AsNAC1转录因子基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

所述大蒜AsNAC1转录因子基因的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

含有权利要求1所述大蒜AsNAC1转录因子基因的植物双元表达载体。

所述大蒜AsNAC1转录因子基因提高大蒜中蒜氨酸含量的应用。

优选的，所述大蒜选自邳州紫皮大蒜。

一种获取能够高表达蒜氨酸大蒜的方法，包括将克隆有所述大蒜AsNAC1转录因子基因的植物双元表达载体，转化进入大蒜愈伤组织细胞中。

优选的，所述植物双元表达载体pHB-AsNAC1-GFP。

一种克隆所述大蒜AsNAC1转录因子基因的PCR引物对，引物序列如下所示：

AsNAC1-F：ATCACCAGTCTCTCTCTCAAGCTTATGAGTTACTTGAGTATGATGG AGGC(SEQ IDNO.3)；

AsNAC1-R：CTCGCCCTTGCTCACCATAAGCTTCCACATATTTGACCCACCATTT T(SEQ IDNO.4)。

本发明通过基于前期大蒜叶片夹伤实验转录组测序结果分析，鉴定到一个AsNAC1转录因子基因，该基因在大蒜叶片夹伤后基因表达水平显著上调。暗示其在大蒜抗逆胁迫过程中可能发挥作用。基于转录组测序AsNAC1转录因子基因序列信息，设计特异性引物，以夹伤后大蒜叶片组织获得的cDNA为模板，通过PCR方法，成功克隆到AsNAC1转录因子基因。以克隆到的AsNAC1转录因子基因构建植物双元表达载体，转化邳州紫皮大蒜愈伤细胞。通过荧光显微镜，以AsNAC1转录因子基因C端融合的GFP蛋白标签。观察目标基因是否成功转化并表达于大蒜愈伤细胞。收集转化有空载体和过表达AsNAC1转录因子基因的大蒜愈伤细胞，分析其蒜氨酸含量。发现过表达AsNAC1转录因子基因的大蒜愈伤细胞的蒜氨酸含量是对照的3倍。

有益效果：与现有技术相比，本发明发现AsNAC1转录因子基因可以提高大蒜愈伤细胞的蒜氨酸含量。本发明提出一种能够提高大蒜蒜氨酸含量的新型转录因子基因，通过转基因方法可以提高大蒜愈伤组织细胞的蒜氨酸合成能力，进而为提高大蒜品质提供有效途径。

附图说明

图1为AsNAC1基因的进化树分析。

图2为AsNAC1基因在夹伤胁迫条件下随时间变化的表达情况分析(以大蒜β-actin基因为定量PCR内参基因)。

图3为pHB-AsNAC1-GFP图谱(仅显示基因克隆附近序列信息)。

图4为AsNAC1-GFP过表达愈伤组织细胞荧光显微镜检测结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。下述实施例中的实验方式，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的实验材料和试剂，如无特殊说明，均为自常规生化试剂供应商处购买。

实施例1大蒜抗逆相关转录因子AsNAC1基因的生物信息学分析

项目组前期研究中，以邳州大白蒜为试材，采用二代高通量测序RNA-seq方法进行大蒜叶片夹伤胁迫应答转录组分析，发现一个差异表达基因表达蛋白具有NAC特征，位于大蒜8号染色体，将该基因命名为AsNAC1。利用相关数据库及生物信息学软件对AsNAC1基因进行分析，主要内容如下：

(1)CD-search搜索AsNAC1蛋白保守结构域；

(2)ProtParam分析AsNAC1蛋白的基本理化性质；

(3)Clustal W软件进行AsNAC1蛋白同源比对，MEGA X软件构建系统进化树；

(4)Plant-mPLoc(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/cgi-bin/PlantmPLoc.cgi)进行亚细胞定位预测；

(5)PlantCARE分析AsNAC1基因侧翼序列顺式作用元件。

1.基因的结构

截取NCBI数据库中Allium sativum中AsNAC1基因参考序列(chr8：501919633--501923169)。该基因全长3537bp，包含2内含子；3外显子，其中外显子1全长190bp，外显子2全长276bp，外显子3全长428bp。

2.基因编码氨基酸序列分析

该基因包含一个全长894bp的完整开放阅读框，编码298个氨基酸。

3.基因编码蛋白保守结构域分析

利用NCBI中的CD-search搜索AsNAC1基因编码蛋白的保守结构域。结果表明，AsNAC1蛋白在N-端具有一个保守的NAM蛋白结构域，位于12aa-142aa。AsNAC1蛋白属于NAC蛋白家族成员，在植物生长发育及胁迫响应过程中发挥调控作用，其结构高度保守。分析结果进一步证明了AsNAC1蛋白是一个典型的NAC家族蛋白。

4.基因编码蛋白理化性质分析

利用ExPaSy ProtParam对AsNAC1蛋白进行基本的理化性质预测和分析。结果表明：AsNAC1蛋白包含297个氨基酸，相对分子质量为33.81KD，理论等电点为8.08,为碱性蛋白。一共4672个原子，包含C(1482)、H(2304)、N(414)、O(451)和S(21)，理论半衰期为30h，不稳定参数为37.62，属于稳定蛋白。带正电荷氨基酸(Arg+Lys)37个，带负电荷氨基酸(Asp+Glu)35个。

5.蛋白序列比对

NAC蛋白由高度保守的N-末端结构域和高度分化的C-末端调控区组成。为了全面分析AsNAC1编码蛋白的结构特征，本研究根据NCBI网站上的蛋白序列，选择了来源于不同植物的18条NAC蛋白(见图1)，利用Clustal W软件进行同源序列比对。比对结果显示，AsNAC1蛋白包含一个典型的NAM保守结构域。AsNAC1与来源于Asparagus officinalis的XP_020270095.1和XP_020244502.1蛋白同源性最高，这些蛋白都属于NAC转录因子家族。

6.亚细胞定位预测

使用Plant-mPLoc数据库对AsNAC1基因编码蛋白进行亚细胞定位预测。预测结果显示，该蛋白定位于细胞核。

7.AsNAC1基因侧翼序列分析

利用PlantCARE在线软件分析AsNAC1起始密码子上游1500bp的侧翼序列。结果显示，AsNAC1启动子中具有LTR和MBS等与生物胁迫和非生物胁迫相关的元件，以及与激素信号调控相关元件，如：与脱落酸相关的ABRE元件，参与水杨酸的TCA元件等(表1)。基于序列分析推测，该启动子为一个胁迫诱导型启动子。

表1AsNAC1基因启动子结构预测结果

实施例2AsNAC1基因的表达特征分析

夹伤胁迫条件下的AsNAC1基因的表达情况

使用邳州大白蒜品种PZ1作为实验材料，种植约35天，待大蒜长至二叶期、使用无菌镊子夹伤大蒜叶片，分别于0h,3h,6h和12h取夹伤叶片。每个处理三个重复。采用艾德莱植物RNA提取试剂盒提取植物总RNA，使用诺唯赞反转录试剂盒进行反转录合成cDNA。Real-time PCR方法分析AsNAC1基因表达水平，以大蒜β-actin基因为定量PCR内参基因。结果如图2所示，大蒜叶片夹伤胁迫下，AsNAC1基因的表达显著上调，在6h后达到最高，约提高2.75倍，随后表达下降。

实施例3AsNAC1基因全长cDNA克隆以及植物双元表达载体的构建

以二叶期的大蒜幼苗为材料，提取总RNA，反转录获得cDNA。

以转录组测序结果预测的AsNAC1转录因子基因，ORF全长序列为模板设计扩增全长ORF序列，引物序列为

AsNAC1-F:ATCACCAGTCTCTCTCTCAAGCTTATGAGTTACTTGAGTATGATGGA GGC

AsNAC1-R:CTCGCCCTTGCTCACCATAAGCTTCCACATATTTGACCCACCATTTT

以cDNA为模板，AsNAC1-F和AsNAC1-R为引物，扩增AsNAC1包含完整的ORF序列。使用1％琼脂糖凝胶进行电泳，切胶回收目标片段大小序列。将目标片段使用ClonExpress IIOne Step Cloning Kit(Vazyme,南京)按照产品使用说明书，克隆到pHB-GFP(购自BioVector NTCC)的Hind III位点。菌落PCR筛选阳性转化子，提取质粒，酶切鉴定，选择正确转化子质粒，命名为pHB-AsNAC1-GFP(图3)，送上海生工生物有限公司进行序列测定，AsNAC1基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

电泳检测结果显示，扩增产物大小与目的基因片段大小一致，约为1.0kb。将克隆的AsNAC1测序结果与转录组测序组装的对应unigene基因序列进行比对，AsNAC1基因核苷酸序列(SEQ ID NO.1所示)与预测序列相似度为100％，无突变存在。

实施例4AsNAC1基因对大蒜愈伤的遗传转化

1.大蒜愈伤的制备

愈伤培养基：MS，4.42g/L；蔗糖，30g/L；琼脂，8g/L；2,4-D，1.5mg/L；NAA，0.5mg/L。调节pH值为5.8。湿热高压灭菌，121℃，15分钟。

(1)蒜瓣剥皮后，流水冲洗30min。

(2)于无菌超净台中，将水冲洗干净的蒜瓣用75％乙醇消毒1min，倒去废液，无菌水冲洗5次后倒掉废液；再用1％的生汞消毒15min，用无菌水冲洗7次后倒掉废液备用。

(3)用无菌的镊子夹取消毒好的大蒜蒜瓣放置到无菌的滤纸上剥取大蒜嫩芽，将其切成2mm大小的块状，放置在培养基上。22℃，避光培养，每2周于新鲜配置培养基上传代培养。

2.含有PHB-AsNAC1-GFP载体的GV3101细胞的制备

将PHB-AsNAC1-GFP载体和PHB-GFP(空载体，设为对照)，按照产品使用说明书分别转化进入农杆菌GV3101感受态细胞中，菌落PCR鉴定获得阳性克隆，含有目标载体PHB-AsNAC1-GFP的GV3102克隆，命名为GV3101(AsNAC1-GFP)。含有空载体PHB-GFP的GV3101克隆，命名为GV3101(GFP)。

2.大蒜愈伤的转化

愈伤转化前，

(1)分别接种GV3101(AsNAC1-GFP)和GV3101(GFP)于5ml LB(含有50μg/ml卡那霉素和50μg/ml利福平),28℃,200rpm,过夜培养。

(2)将2ml过夜培养菌液转接入50ml液体LB(含有50μg/ml卡那霉素和50μg/ml利福平)，28℃，200rpm过夜培养。

(3)次日于过夜培养菌液中补充同等体积的LB液体并且含有相同浓度的抗生素和100μM乙酰丁香酮(使其最终浓度为0.1μM),28℃，200rpm诱导4h。

(4)4℃4000rpm,离心5min收集菌体，用MS液体培养基重悬菌体，使用分光光度计测量菌液OD₅₅₀值在0.5-1.0之间，并加入适量的乙酰丁香酮，使其终浓度达到0.4μM。

(5)于无菌超净台中，将大蒜愈伤细胞放入上述菌液中，静置侵染30-40min，倒掉侵染液，随后将侵染后的愈伤组织放在无菌滤纸上，以吸去多余菌液。并将愈伤细胞放置在MS愈伤培养基上。避光，25℃，共培养6天后，收集愈伤组织细胞。

3.荧光显微镜观察检测愈伤转化结果

由于AsNAC1过表达蛋白C端融合有GFP蛋白标签，可以通过检测GFP信号来观测转化后的愈伤细胞是否表达有目标蛋白。取转化有PHB-AsNAC1-GFP载体的大蒜愈伤组织细胞，于荧光电子显微镜下观察，结果如图4所示，AsNAC1-GFP在愈伤细胞中有较高表达，表达有AsNAC1-GFP的细胞在荧光显微镜下较未转化愈伤细胞有较高的荧光信号。说明AsNAC1-GFP基因成功转化进入愈伤细胞，且在愈伤细胞中有较高水平的表达。

实施例5AsNAC1基因对大蒜愈伤的蒜氨酸含量的影响

将过表达有AsNAC1-GFP和对照GFP的大蒜愈伤细胞，分别提取其蒜氨酸，提取方法为：用液氮研磨新鲜愈伤组织，称取0.5g粉末加入500μL 4％的磺基水杨酸溶液后，涡旋震荡，室温静置提取30min后；7000rpm，离心15-20min，取上清即为提取样本。将提取样本使用氨基酸分析仪，按照仪器使用说明书进行氨基酸含量测定。根据不同浓度蒜氨酸标准品(购自solarbio)拟合标准曲线，并根据标准曲线以及蒜氨酸峰面积，计算转化有空载体和AsNAC1过表达的愈伤细胞的蒜氨酸含量。结果表明。与转化有空载体的对照相比较，过表达AsNAC1蛋白的氨基酸蒜氨酸含量为0.045±0.015μg/g.DW；较对照(转化有空载体的大蒜愈伤)0.015±0.005μg/g.DW有3倍的提高，表明AsNAC1基因的过表达，可以提高转基因大蒜愈伤的蒜氨酸含量。

上述研究结果表明，转化AsNAC1基因可以提高大蒜细胞的蒜氨酸含量。本发明为通过基因工程方法获得大蒜新品系提供可选基因，进而为提高大蒜品质提供了有效的途径。

以上实施方式仅用于说明本发明，而非对本发明的限制。尽管参照实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，对本发明的技术方案进行各种组合、修改或者等同替换，都不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

序列表

<110> 江苏师范大学

<120> 一种能够提高蒜氨酸含量的大蒜AsNAC1转录因子基因及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 894

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgagttact tgagtatgat ggaggctaca atgcctcctg gtttcaggtt tcatccaaga 60

gacgaagagc ttgtatgtga ctatttagca aaaaagatca atggagataa taccgataga 120

agtttaaatg atggttgtcc tgtgttgata agcgtggatt tgaacaagtg tgagccatgg 180

gatcttcctg aaatagcatg cgtaggagga aaagaatact acttctacag ccttcgtgac 240

cgaaagtacg caactgggca gcgaacaaat agagcaacca tatctggata ctggaaggcc 300

actgggaaag ataggcctgt atttcgtaaa ggacttctgg tagggatgag gaagacttta 360

gttttttacc aaggaagagc tcctaaaggt aaaaagactg attgggttat gcatgaattt 420

cgaatggagt cacctagtca taccttgaag cttcctgtag ctaaggaaga ttgggtgtta 480

tgcagagtat tctacaaaag tagaggatta acatcaaggc caattaccat gatgaccact 540

acaaattatg aaaatacaat tgcgtcttct tcgctaccac cattaaccga aacatacata 600

acgttcaacg gttacgatca agtgccctgc ttctccaata atcagtttca gaataatcca 660

gtggctatga ttggaagaag catgacaata aaaaatgatg cagctgcaca aatggatggt 720

ttggatcaac tgagtctgaa tcaagttggt tgtgacagga atgggattgt agatgtttta 780

aatcatttga ctaaaatgga agaaagaaca aaaagagagg cacacactga tagttatgga 840

gaagggaata tagatagtta ttttagcgaa aatggtgggt caaatatgtg gtga 894

<210> 2

<211> 297

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ser Tyr Leu Ser Met Met Glu Ala Thr Met Pro Pro Gly Phe Arg

1 5 10 15

Phe His Pro Arg Asp Glu Glu Leu Val Cys Asp Tyr Leu Ala Lys Lys

20 25 30

Ile Asn Gly Asp Asn Thr Asp Arg Ser Leu Asn Asp Gly Cys Pro Val

35 40 45

Leu Ile Ser Val Asp Leu Asn Lys Cys Glu Pro Trp Asp Leu Pro Glu

50 55 60

Ile Ala Cys Val Gly Gly Lys Glu Tyr Tyr Phe Tyr Ser Leu Arg Asp

65 70 75 80

Arg Lys Tyr Ala Thr Gly Gln Arg Thr Asn Arg Ala Thr Ile Ser Gly

85 90 95

Tyr Trp Lys Ala Thr Gly Lys Asp Arg Pro Val Phe Arg Lys Gly Leu

100 105 110

Leu Val Gly Met Arg Lys Thr Leu Val Phe Tyr Gln Gly Arg Ala Pro

115 120 125

Lys Gly Lys Lys Thr Asp Trp Val Met His Glu Phe Arg Met Glu Ser

130 135 140

Pro Ser His Thr Leu Lys Leu Pro Val Ala Lys Glu Asp Trp Val Leu

145 150 155 160

Cys Arg Val Phe Tyr Lys Ser Arg Gly Leu Thr Ser Arg Pro Ile Thr

165 170 175

Met Met Thr Thr Thr Asn Tyr Glu Asn Thr Ile Ala Ser Ser Ser Leu

180 185 190

Pro Pro Leu Thr Glu Thr Tyr Ile Thr Phe Asn Gly Tyr Asp Gln Val

195 200 205

Pro Cys Phe Ser Asn Asn Gln Phe Gln Asn Asn Pro Val Ala Met Ile

210 215 220

Gly Arg Ser Met Thr Ile Lys Asn Asp Ala Ala Ala Gln Met Asp Gly

225 230 235 240

Leu Asp Gln Leu Ser Leu Asn Gln Val Gly Cys Asp Arg Asn Gly Ile

245 250 255

Val Asp Val Leu Asn His Leu Thr Lys Met Glu Glu Arg Thr Lys Arg

260 265 270

Glu Ala His Thr Asp Ser Tyr Gly Glu Gly Asn Ile Asp Ser Tyr Phe

275 280 285

Ser Glu Asn Gly Gly Ser Asn Met Trp

290 295

<210> 3

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atcaccagtc tctctctcaa gcttatgagt tacttgagta tgatggaggc 50

<210> 4

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctcgcccttg ctcaccataa gcttccacat atttgaccca ccatttt 47

Claims

1.一种能够提高蒜氨酸含量的大蒜AsNAC1转录因子基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

2.权利要求1所述大蒜AsNAC1转录因子基因的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.含有权利要求1所述大蒜AsNAC1转录因子基因的植物双元表达载体。

4.权利要求1所述大蒜AsNAC1转录因子基因提高大蒜中蒜氨酸含量的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述大蒜选自邳州紫皮大蒜。

6.一种获取能够高表达蒜氨酸大蒜的方法，其特征在于，包括将克隆有权利要求1所述大蒜AsNAC1转录因子基因的植物双元表达载体，转化进入大蒜愈伤组织细胞中。

7.一种克隆权利要求1所述大蒜AsNAC1转录因子基因的PCR引物对，其特征在于，引物序列如下所示：

AsNAC1-F：ATCACCAGTCTCTCTCTCAAGCTTATGAGTTACTTGAGTATGATGG AGGC（SEQ IDNO.3）；

AsNAC1-R：CTCGCCCTTGCTCACCATAAGCTTCCACATATTTGACCCACCATTT T（SEQ ID NO.4）。