CN113845578A

CN113845578A - 调控植物原花青素合成的myb类转录因子及其编码基因和应用

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Publication number: CN113845578A
Application number: CN202111233901.1A
Authority: CN
Inventors: 张凯旋; 周美亮; 赵辉; 范昱; 丁梦琦; 胡永平
Original assignee: Guizhou Province Weining County Dongfangshengu Co ltd; Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Guizhou Province Weining County Dongfangshengu Co ltd; Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2021-10-22
Filing date: 2021-10-22
Publication date: 2021-12-28
Anticipated expiration: 2041-10-22
Also published as: CN113845578B

Abstract

本发明公开了调控植物原花青素合成的MYB类转录因子及其编码基因和应用。本发明从苦荞中克隆了MYB类转录因子FtMYB43，其氨基酸序列为SEQ ID No.1所示。本发明将该转录因子FtMYB43基因分别遗传转化荞麦以及拟南芥获得转基因荞麦毛状根以及拟南芥，对获得的阳性拟南芥中的原花青素通路的酶基因进行表达量检测并检测FtMYB43基因转拟南芥异位表达后的原花青素含量，检测结果显示，FtMYB43基因有助于提高毛状根中类黄酮代谢途径部分关键酶基因的表达量，进而促进原花青素的生物合成；转基因株系原花青素含量有显著增加，说明FtMYB43基因参与上调拟南芥植株中原花青素的生物合成。

Description

调控植物原花青素合成的MYB类转录因子及其编码基因和应用

技术领域

本发明涉及转录因子，尤其涉及从苦荞(Fagopyrum tataricum(L.)Gaertn)中分离的MYB类转录因子及其编码基因，本发明进一步涉及它们在调控植物原花青素合成中的应用，属于MYB类转录因子及其应用领域。

背景技术

现代临床医学观察表明苦荞制品具有降血糖、降血脂、冠心病、抗癌、抗衰老等药用疗效，这些生物活性与苦荞中生物类黄酮抗氧化能力密切相关。原花青素是苦荞重要的黄酮次生代谢产物，其分子结构中的多电子酚羟基结构，使之具有较强的生理活性，在保健食品、医药、化妆品等领域中被广泛使用。

MYB是植物体内最大的转录因子家族，是一类DNA结合蛋白，具有高度保守的DNA结合域-MYB结构域，由51～52个氨基酸构成。根据MYB结构域达到个数可将MYB转录因子分为4类，即：R1-MYB、R2R3-MYB、R1R2R3-MYB和4R-MYB。MYB类转录因子广泛参与调控植物的生长发育过程，对次生代谢等具有重要调控作用。MYB转录因子基因在植物基因组数量庞大，是植物中最大的转录因子家族之一。目前研究发现，尽管已有很多MYB基因的功能已被证明，如参与次生代谢调控、环境与激素胁迫的应答、器官发育等，但是这些研究进展主要集中在模式植物拟南芥中。前人在苹果、樱桃、桃子、梨子、梨、覆盆子、草莓中均发现分离出多个与花青素合成有关的MYB转录因子，说明该类转录因子广泛参与植物中花青素通路的生物合成。原花青素物质合成途径作为植物的最重要的天然活性产物生成通路之一，在植物中环境适应适应和调控下游相关基因的应答上发挥重要作用。

但是，目前在苦荞中黄酮类化合物的代谢调控机理尚不清晰，关于原花青素类物质合成和调控机制的研究较少。

发明内容

本发明目的之一是提供从苦荞分离的与原花青素类物质合成相关的MYB类转录因子及其编码基因。

本发明目的之二是提供含有上述编码基因的重组表达载体以及含有该重组表达载体的宿主细胞。

本发明目的之三是将所述的转录因子及其编码基因应用于调控植物原花青素类物质合成等方面。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

为实现上述目的，本发明一方面提供了从苦荞分离得到了MYB类转录因子FtMYB43，其氨基酸为(a)或(b)所示：

(a)、SEQ ID No.1所示的氨基酸；或

(b)、将SEQ ID No.1所示的氨基酸通过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或/和插入而衍生得到的仍具有调控原花青素合成功能或活性的蛋白变体。

本发明进一步提供了MYB类转录因子的编码基因，其多核苷酸序列为(a)、(b)、(c)、(d)或(e)所示：

(a)、SEQ ID No.2所示的多核苷酸序列；或

(b)、编码SEQ ID No.1所示氨基酸序列的多核苷酸序列；或

(c)、与SEQ ID NO.2的多核苷酸序列的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸序列，该多核苷酸序列所编码蛋白质仍具有调控原花青素合成功能；或

(d)、与SEQ ID No.2所示的多核苷酸序列至少有90％或以上同源性的多核苷酸序列；或

(e)、在SEQ ID NO.2所示的多核苷酸序列的基础上进行一个或多个碱基的缺失、取代或插入的多核苷酸变体，且该多核苷酸变体所编码的蛋白仍具有调控原花青素合成的功能或活性。

本发明所述的蛋白变体可由遗传多态性或人为操作产生，这些操作方法通常为本领域所了解。例如，可通过DNA的突变来制备MYB转录因子的氨基酸序列变体或片段，其中由于诱变或改变多核苷酸的方法为本领域所习知。其中，保守的取代是将一种氨基酸残基替换成具有相似性质的另一种氨基酸。

本发明所述的转录因子FtMYB43包括天然存在的序列和变体两种形式。“变体”意指基本相似的序列，对于多核苷酸，变体包含天然多核苷酸中一个或多个位点处一个或多个核苷酸的缺失、插入或/和替换。对于多核苷酸，保守的变体包括由于遗传密码的简并性而不改变编码的氨基酸序列的那些变体。诸如此类天然存在的变体可通过现有的分子生物学技术来鉴定。变体多核苷酸还包括合成来源的多核苷酸，例如采用定点诱变所得到的仍编码SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的多核苷酸变体或者是通过重组的方法(例如DNA改组)。本领域技术人员可通过以下分子生物技术手段来筛选或评价变体多核苷酸所编码蛋白的功能或活性：DNA结合活性、蛋白之间的相互作用，瞬时研究中基因表达的激活情况或转基因植物中表达的效应等。

本发明还提供了含有所述转录因子FtMYB43的编码基因的重组植物表达载体以及含有该重组植物表达载体的宿主细胞。

将所述FtMYB43基因可操作的与表达调控元件相连接，得到可以在植物中表达该编码基因的重组植物表达载体；该重组植物表达载体可以由5′端非编码区、SEQ ID No.2所示的多核苷酸序列和3′非编码区组成，其中，所述的5′端非编码区可以包括启动子序列、增强子序列或/和翻译增强序列；所述的启动子可以是组成性启动子、诱导型启动子、组织或器官特异性启动子；所述的3′非编码区可以包含终止子序列、mRNA切割序列等。合适的终止子序列可取自根癌农杆菌的Ti-质粒，例如章鱼碱合成酶和胭脂碱合成酶终止区。

另外，本领域技术人员可以将SEQ ID No.2所示的多核苷酸进行优化以增强在植物中的表达效率。例如，可采用目标植物的偏爱密码子进行优化来合成多核苷酸以增强在目标植物中的表达效率。

所述重组植物表达载体还可含有用于选择转化细胞的选择性标记基因。选择性标记基因用于选择经转化的细胞或组织。标记基因包括：编码抗生素抗性的基因以及赋予除草化合物抗性的基因等。此外，所述的标记基因还包括表型标记，例如β-半乳糖苷酶和荧光蛋白等。

本发明还涉及将所述的转录因子FtMYB43编码基因引入到植物中以调控原花青素合成的应用，其中，所述的调控原花青素合成代谢包括促进原花青素的生物合成；作为参考，所述的应用包括：(1)构建含有所述转录因子FtMYB43编码基因的重组植物表达载体；(2)将所构建的重组植物表达载体转化到植物组织或植物细胞中；(3)将转录因子FtMYB43编码基因在植物组织或细胞中进行过表达。

本发明进一步提供了一种促进植物体内原花青素生物合成的方法，包括：(1)构建含有所述转录因子FtMYB43编码基因的重组植物表达载体；(2)将所构建的重组植物表达载体转化到植物组织或植物细胞中；(3)将所述转录因子FtMYB43编码基因在植物组织或细胞中进行过表达。

所述的“引入”指将编码基因导入到植物细胞内部这样的方式将多核苷酸或多肽遗传转化到植物中。将所述多核苷酸或多肽引入到植物中的方法为本领域所习知，包括但不限于稳定转化法、瞬时转化法和病毒介导法等。“稳定转化”指被引入的多核苷酸构建体整合至植物细胞的基因组中并能通过其子代遗传；“瞬时转化”指多核苷酸被引入到植物中但只能在植物中暂时性表达或存在。

转化方案以及将所述多核苷酸或多肽引入植物的方案可视用于转化的植物(单子叶植物或双子叶植物)或植物细胞的类型而变化。将所述多核苷酸或多肽引入植物细胞的合适方法包括：显微注射、电穿孔、农杆菌介导的转化、直接基因转移以及高速弹道轰击等。在特定的实施方案中，可利用多种瞬时转化法将本发明转录因子FtMYB43编码基因提供给植物。在其它实施方案中，本发明的转录因子FtMYB43编码基因可通过将植物与病毒或病毒核酸接触来引入到植物中，通常，这样的方法涉及将本发明的转录因子的编码基因构建体引入病毒DNA或RNA分子中。

利用常规方法可使已转化的细胞再生稳定转化植株(McCormick et al.PlantCell Reports.1986.5:81-84)。本发明可用于转化任何植物种类，包括但不限于：单子叶植物或双子叶植物，优选的，所述的目标植物包括荞麦、大豆、白三叶、苜蓿或拟南芥等，更优选为苦荞。

本发明从苦荞中克隆了一个新的MYB类转录因子，将其命名为FtMYB43；本发明利用基因工程手段，将该转录因子FtMYB43基因遗传转化荞麦外植体获得过表达的转基因荞麦毛状根；检测了阳性苦荞毛状根中的FtMYB43和原花青素合成通路的关键酶基因的表达水平。并将含FtMYB43基因编码序列的植物表达载体转化拟南芥；对获得的阳性拟南芥中的原花青素通路的酶基因进行qPCR表达量检测；最后，以高效液相色谱法检测FtMYB43基因转拟南芥异位表达后的原花青素含量。检测结果显示，过表达苦荞毛状根中，FtMYB43和黄酮代谢通路中的FtANS、FtDFR和FtFLS的表达量显著升高。FtMYB43基因成功转入拟南芥中且能够正常过量表达，另外一些关键酶基因等，如AtANS、AtDFR和AtTT10基因表达量显著增加，表明FtMYB43基因有助于提高毛状根中类黄酮代谢途径部分关键酶基因的表达量，从而促进原花青素的生物合成。转FtMYB43基因拟南芥原花青素平均含量为0.683mg/g，是野生型的1.8倍。转基因株系原花青素含量有显著增加，说明FtMYB43基因可参与上调拟南芥植株中原花青素通路的生物合成。

本发明通过基因克隆和筛选获得了一个重要的FtMYB43基因，对苦荞黄酮类物质原花青素的生物合成过程中所涉及的酶基因的功能进行了较系统的探究，填补了苦荞中原花青素物质受R2R3类MYB转录因子特异调控的空白，并深入地研究了整个合成通路基因的调控机制。本发明可以为生产具有重要临床需要的苦荞原花青素类物质提供了一种新型的优质药源，且发明效果可靠、成本低廉；过程高效、绿色、安全、无环境污染。

本发明所涉及到的术语定义

除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。虽然在本发明的实践或测试中可使用与本文所述者类似或等效的任何方法、装置和材料，但现在描述优选方法、装置和材料。

术语“转录因子”是能够与真核生物基因启动子区域中顺式作用元件特异性结合，从而激活或抑制下游基因在特定时间和空间转录与表达的一类DNA结合蛋白。

术语“多核苷酸”或“核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA(肽核酸)、在反义技术中所用的DNA类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等)。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选(或所有)密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代(Batzer等人,Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；和Cassol等人,(1992)；Rossolini等人,Mol Cell.Probes 8:91-98(1994))。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中互换使用以意指氨基酸残基的聚合物。即，针对多肽的描述同样适用于描述肽和描述蛋白，且反之亦然。所述术语适用于天然产生氨基酸聚合物以及其中一个或一个以上氨基酸残基为非天然编码氨基酸的氨基酸聚合物。如本文中所使用，所述术语涵盖任何长度的氨基酸链，其包括全长蛋白(即抗原)，其中氨基酸残基经由共价肽键连接。

本发明中所述“严谨杂交条件”意指在所属领域中已知的低离子强度和高温的条件。通常，在严谨条件下，探针与其靶序列杂交的可检测程度比与其它序列杂交的可检测程度更高(例如超过本底至少2倍。严谨杂交条件是序列依赖性的，在不同的环境条件下将会不同，较长的序列在较高温度下特异性杂交。通过控制杂交的严谨性或洗涤条件可鉴定与探针100％互补的靶序列。对于核酸杂交的详尽指导可参考有关文献(Tijssen,Techniquesin Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes,"Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acidassays.1993)。更具体的，所述严谨条件通常被选择为低于特异序列在规定离子强度pH下的热熔点(T_m)约5-10℃。T_m为在平衡状态下50％与目标互补的探针杂交到目标序列时所处的温度(在指定离子强度、pH和核酸浓度下)(因为目标序列过量存在，所以在T_m下在平衡状态下50％的探针被占据)。严谨条件可为以下条件：其中在pH 7.0到8.3下盐浓度低于约1.0M钠离子浓度，通常为约0.01到1.0M钠离子浓度(或其它盐)，并且温度对于短探针(包括(但不限于)10到50个核苷酸)而言为至少约30℃，而对于长探针(包括(但不限于)大于50个核苷酸)而言为至少约60℃。严谨条件也可通过加入诸如甲酰胺的去稳定剂来实现。对于选择性或特异性杂交而言，正信号可为至少两倍的背景杂交，视情况为10倍背景杂交。例示性严谨杂交条件可如下：50％甲酰胺，5×SSC和1％SDS，在42℃下培养；或5×SSC，1％SDS，在65℃下培养，在0.2×SSC中洗涤和在65℃下于0.1％SDS中洗涤。所述洗涤可进行5、15、30、60、120分钟或更长时间。

本发明中所述的“多个”通常意味着2-8个，优选为2-4个，这取决于转录因子三维结构中氨基酸残基的位置或氨基酸的种类；所述的“替换”是指分别用不同的氨基酸残基取代一个或多个氨基酸残基；所述的“缺失”是指氨基酸残基数量的减少，也即是分别缺少其中的一个或多个氨基酸残基；所述的“插入”是指氨基酸残基序列的改变，相对天然分子而言，所述改变导致添加一个或多个氨基酸残基。

术语“重组宿主细胞株”或“宿主细胞”意指包含本发明多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、f配对或所属领域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。宿主细胞可为原核细胞或真核细胞，宿主细胞还可为单子叶或双子叶植物细胞。

术语“可操作的连接”指两个或更多个元件之间功能性的连接，可操作的连接的元件可为邻接或非邻接的。

术语“转化”：将异源性DNA序列引入到宿主细胞或有机体的方法。

术语“表达”：内源性基因或转基因在植物细胞中的转录和/或翻译。

术语“编码序列”：转录成RNA的核酸序列。

术语“重组植物表达载体”：一种或多种用于实现植物转化的DNA载体；本领域中这些载体常被称为二元载体。二元载体连同具有辅助质粒的载体是大多常用于土壤杆菌介导转化的。二元载体通常包括：T-DNA转移所需要的顺式作用序列、经工程化处理以便能够在植物细胞中表达的选择标记物，待转录的异源性DNA序列等。

附图说明

图1FtMYB43与其他MYB蛋白构建NJ聚类树。

图2FtMYB43基因CDS的克隆，编号1，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，20呈现阳性结果。

图3RT-PCR检测FtMYB43基因过表达毛状根原花青素合成基因的表达模式。

图4原花青素生物合成基因在拟南芥异位表达FtMYB43中的表达模式。

图5DCMCA-HCl法测定FtMYB43基因在拟南芥异位表达后的原花青素含量(显著性差异用星号表示，其中，**：P<0.01，***：P<0.001)。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1 FtMYB43基因CDS的克隆

从苦荞幼苗的cDNA中克隆获得FtMYB43基因，根据FtMYB43的ORF设计特异引物：

FtMYB43-F：5'-ATGGGGAGGCCACCTTGCT-3'(SEQ ID NO.3)，

FtMYB43-R：5'-CTAGAACAAATCATGATCATTTT-3'(SEQ ID NO.4)；

以材料“品苦”为cDNA为模板进行PCR扩增，获得目的基因的CDS序列。

PCR程序为95℃3min；95℃30s，57℃30s，72℃90s，33个循环。PCR纯化产物连接到pTOPO-Blunt Simple平末端克隆载体上，获得FtMYB43-T载体质粒。送经测序、分析、拼接后得到FtMYB43基因全长序列。所述FtMYB43基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

实施例2转录因子FtMYB43的氨基酸序列分析

将FtMYB43基因氨基酸序列在NCBI数据库中Blast比对，获得其他物种MYB类蛋白序列。使用MEGA6.0软件构建了聚类树，并利用蛋白预测工具网站(https://web.expasy.org/cgi-bin/compute_pi/pi_tool)进行等电点(pl)和蛋白分子量(Mw)预测。

FtMYB43基因的CDS长度为939bp，编码蛋白分子量34.8KDa的312个氨基酸，所编码蛋白的等电点(pI)为5.13。用NCBI的blast在线分析FtMYB43氨基酸的保守域，发现所编码的蛋白属于MYB型转录因子。在NCBI数据库中Blast比对，获得其他物种MYB类蛋白序列，使用MEGA6.0软件构建了聚类树(图1)，发现该基因属于R2R3-MYB类转录因子。

实施例3 FtMYB43基因过表达载体的构建、转化苦荞以及阳性苦荞毛状根中的FtMYB43和原花青素合成通路的关键基因的表达水平检测

将FtMYB43基因可操作性地构建于表达调控序列，形成含FtMYB43基因的植物表达载体，包括：设计同源重组引物，以FtMYB43-T载体为模板，所设计的引物如下：

OE-FtMYB43-F/R:

OE-FtMYB43-F:gacttgaactcggtatctagaATGGGGAGGCCACCTTGC；

OE-FtMYB43-R:gtcgacggtatcgataagcttCTAGAACAAATCATGATCATTTTCAAAT；

以上述的OE-FtMYB43-F/R为引物，PCR扩增FtMYB43基因的全长序列。随后经酶切、回收、和连接转化后，将FtMYB43全长序列正向插入过表达载体的CaMV35S启动子后，经测序完全后得到过表达载体pCAMBIA1307-FtMYB43。

将所得的含FtMYB43基因的植物表达载体转化发根农杆菌，获得用于转化苦荞的含FtMYB43基因植物表达载体的发根农杆菌菌株：测序验证正确的pCAMBIA1307-FtMYB43重组质粒以及pCAMBIA1307-空载体质粒用热激法分别转化发根农杆菌A4感受态细胞。经菌落PCR鉴定后，将得到pCAMBIA1307-FtMYB43重组质粒阳性菌，pCAMBIA1307-空载体阳性菌。

利用所构建的发根农杆菌菌株遗传转化苦荞组织：挑选成熟饱满的苦荞种子(品苦)用10％次氯酸钠溶液消毒7～10min，用75％酒精灭菌5～8min，再用无菌水清洗3～5次；4℃春化3～4d后选取萌发状态一致的种子种植在无激素MS培养基上，将其置于组培室25℃(光周期为16h/8h)培养，待其萌发生长2周龄后用于农杆菌侵染。用热激法将过表达载体质粒pCAMBIA1307-FtMYB43以及空载体质粒分别转化发根农杆菌A4。接着挑取阳性单克隆至YEB液体培养基中(含有Kan50mg/L)28℃振荡培养48h，2500r/min离心8min后集菌，并用液体MS溶液重悬菌体至终浓度OD600＝0.6～0.8。在超净台剪下培养2周龄的苦荞幼苗的下胚轴或叶片，并用尖镊子扎破创造尽可能多的伤口。然后将外植体浸入提前制备好的侵染液中边摇晃边侵染8～15min。将处理后的苦荞下胚轴放在无激素的MS培养基上，放置在组培室中黑暗条件下25℃共培养3～7d。选取生长良好的毛状根提取DNA并进行PCR分子鉴定，将阳性毛状根移入含100mg/mL Cef的液体MS培养基培养。其中FtMYB43-F/R为引物，PCR程序与实施例1中的PCR程序一致。

挑选20份苦荞毛状根和pCAMBIA1307-FtMYB43C质粒，PCR检测。其中，编号1,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,20呈现阳性结果(图2)。

经qPCR检测为阳性的苦荞转基因毛状根克隆并PCR检测表达：将侵染后的苦荞下胚轴和子叶于MS固体培养基上，待毛状根的量足够后，取适量于MS液体培养基中，室温震荡(120r/min)处理。其中，A4和35S:GFP毛状根作为对照，qPCR检测MYB43-OE11、MYB43-OE13、MYB43-OE25转基因毛状根中的基因表达。

利用qPCR检测阳性苦荞毛状根中的FtMYB43和原花青素合成通路的关键基因的表达水平：检测FtMYB43以及苦荞花色素合酶(FtANS)、苦荞二氢黄酮醇4-还原酶(FtDFR)、苦荞黄酮醇合酶(FtFLS)、苦荞类黄酮3'-羟化酶(FtF3’H)、苦荞苯丙氨酸裂解酶(FtPAL)、苦荞4-香豆酸酯-CoA连接酶(Ft4CL)、苦荞反肉桂酸4-单加氧酶(FtC4H)和苦荞查尔酮合酶(FtCHS)等基因的表达水平。

其中，用含有不同重组质粒的发根农杆菌A4菌株侵染荞麦毛状根。以感染A4或含35S:GFP的A4的毛状根为阴性对照。结果显示，过表达苦荞毛状根中，FtMYB43和黄酮代谢通路中的FtANS、FtDFR和FtFLS的表达量显著升高(图3)。

实施例4 FtMYB43基因过表达载体的构建、转化拟南芥以及在拟南芥异位表达量检测

将FtMYB43基因可操作性地构建于表达调控序列，形成含FtMYB43基因的植物表达载体，包括：设计同源重组引物，以FtMYB43-T载体为模板，设计下述引物：

OE-FtMYB43-F/R：

OE-FtMYB43-F:ACGGGGGACTCTTGAATGGCGTCGATCAAAATCAGAT；

OE-FtMYB43-R:GTTCTTCTCCTTTACT GCCTTTGGGTGCGGC；

以上述OE-FtMYB43-F/R为引物，PCR扩增FtMYB43的全长序列。随后经酶切、回收和连接转化后，将FtMYB43全长序列正向插入过表达载体的CaMV35S启动子后，经测序完全后得到过表达载体pCAMBIA1302-FtMYB43。

将所得的含FtMYB43基因编码序列的植物表达载体转化拟南芥：pCAMBIA1302-FtMYB43重组质粒转入农杆菌GV3101感受态细胞，筛选鉴定后得到阳性克隆。将阳性菌液摇至OD＝0.8对野生型拟南芥进行侵染(蘸花法)。收取转基因植株T0代种子，经潮霉素抗性筛选后获得T1代转基因拟南芥。提取T1代幼苗叶片基因组DNA为模板，以pCAMBIA1302载体通用引物TLF作为正向引物，基因特异性引物1302-FtMYB43-R作为反向引物进行PCR检测，单株收获阳性植物种子并加代获得T3代纯合植株。

对阳性拟南芥中的原花青素通路的基因进行qPCR表达量检测：利用qPCR检测阳性苦荞毛状根中的FtMYB43和原花青素合成通路的关键基因的表达水平，检测FtMYB43以及拟南芥的花色素合酶(AtANS)、二氢黄酮醇4-还原(AtDFR)、黄酮醇合酶1(AtFLS1)、查尔酮异构酶(AtCHI)、查尔酮合酶(AtCHS)、苯丙氨酸裂解酶(AtPAL)、黄烷酮3-羟化酶(AtF3H)、类黄酮3'-羟化酶(AtF3'H)、类黄酮3-0-葡萄糖基转移酶(AtUF3GT)、AtTT10和AtTT19等基因的表达水平。

提取阳性拟南芥DNA，利用qRT-PCR检测FtMYB43基因的相对表达量。其中，以Col-0(野生型)和GFP(35S:GFP)异位表达作为阴性对照。结果表明，FtMYB43基因成功转入拟南芥中,且能够正常过量表达。另外一些关键酶基因等，如AtANS、AtDFR和AtTT10基因表达量显著增加(图4)。结果表明FtMYB43基因有助于提高毛状根中类黄酮代谢途径部分关键酶基因的表达量，从而促进原花青素的生物合成。

实施例5采用高效液相色谱法检测FtMYB43基因转拟南芥异位表达后拟南芥中的原花青素含量

采用DMACA-HCl法对转基因拟南芥(构建过程同实施例4)叶片进行原花青素含量检测。以吸光度值Y为纵坐标,原花青素浓度(mg/mL)为横坐标,绘制标准曲线,Y＝0.9329X-0.0031(R²＝0.9996)。用紫外分光光度计于640nm测原花青素的吸光度,根据标准曲线方程计算样品中原花青素的含量。每个样本有三个重复。

以GFP(35S:GFP)异位表达作为阴性对照。转FtMYB43基因拟南芥原花青素平均含量为0.683mg/g，是野生型的1.8倍(0.38mg/g)。转基因株系原花青素含量有显著增加(图5)，说明FtMYB43基因可以参与上调拟南芥植株中原花青素通路的生物合成。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院作物科学研究所,贵州省威宁县东方神谷有限责任公

司

<120> 调控植物原花青素合成的MYB类转录因子及其编码基因和应用

<130> BJ-2011-210617A

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 312

<212> PRT

<213> Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn

<400> 1

Met Gly Arg Pro Pro Cys Cys Asp Lys Ala Gly Val Lys Lys Gly Pro

1 5 10 15

Trp Thr Pro Glu Glu Asp Ile Ile Leu Val Ser Tyr Ile Gln Asp His

20 25 30

Gly Pro Gly Asn Trp Arg Ala Val Pro Leu Asn Thr Gly Leu Leu Arg

35 40 45

Cys Ser Lys Ser Cys Arg Leu Arg Trp Thr Asn Tyr Leu Arg Pro Gly

50 55 60

Ile Lys Arg Gly Asn Phe Thr Glu Gln Glu Glu Lys Met Ile Ile His

65 70 75 80

Leu Gln Ala Leu Leu Gly Asn Arg Trp Ala Ala Ile Ala Ser Tyr Leu

85 90 95

Pro Gln Arg Thr Asp Asn Asp Ile Lys Asn Tyr Trp Asn Thr His Leu

100 105 110

Lys Lys Lys Leu Ser Lys Leu Glu Asn Gln Pro Thr Thr Ser Lys Ser

115 120 125

Thr Asn Ala Ser Ser Leu Ser Asp Asn Pro Leu Asn Ser Cys Phe Asp

130 135 140

Asn Gln Leu Gly Val Asn Ser Glu Pro Ile Ala Thr Ser Arg Gly Gln

145 150 155 160

Trp Glu Arg Arg Val Gln Thr Asp Ile Asn Leu Ala Lys Lys Ala Leu

165 170 175

Met Asp Ala Leu Ser Val Glu Asn Glu Thr Asp Thr Thr Lys Ser Asn

180 185 190

Thr Asn Thr Gln Ser Ser Cys Gly Ser Tyr Ala Ser Ser Ala Glu Asn

195 200 205

Ile Ala Arg Leu Leu Gln Gly Trp Ser Ser Ser Ser Thr Ser Gly Leu

210 215 220

Ser Lys Lys Pro Lys Glu Glu Pro Val Ser Tyr Asp Arg Arg Lys Cys

225 230 235 240

Glu Glu Ile Thr Asp Pro Val Cys Asp Pro Phe Gly Ser Val Phe Gly

245 250 255

Phe Glu Ser Phe Asp Ser Ser Ser Ser Gly Asn Leu Ser Pro Glu Glu

260 265 270

Gly Ser Val Leu Gln Glu Glu Ser Lys Asp Ile Gly Asn Glu Gly Asp

275 280 285

Gly Thr Phe Ser Leu Ile Glu Lys Trp Leu Phe Asp Glu Gly Met Lys

290 295 300

Phe Glu Asn Asp His Asp Leu Phe

305 310

<210> 2

<211> 939

<212> DNA

<213> Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn

<400> 2

atggggaggc caccttgctg tgataaagct ggtgtgaaga agggtccatg gacaccagaa 60

gaagacataa ttcttgtgtc ttatattcaa gatcatggcc ctggtaattg gagagcagtt 120

cctcttaata caggtttgct tagatgcagt aaaagttgca ggcttagatg gactaattac 180

cttagaccgg gtattaagag aggaaatttt actgagcaag aagagaaaat gattattcac 240

cttcaagccc ttctgggtaa tagatgggct gcaatagctt cgtatcttcc acaaagaaca 300

gacaatgata tcaagaacta ttggaacaca catctcaaga agaagctaag caaactcgag 360

aatcaaccta ctacatcaaa atcaacaaat gcgagcagtt tatcagataa tccgttaaac 420

tcgtgtttcg acaatcaact cggcgtaaac tcggagccta tagcgacatc tcgtgggcaa 480

tgggagagaa gagtacaaac ggacatcaac ctagccaaga aagctctaat ggatgcactt 540

tccgtcgaaa atgaaaccga cacgacaaag tcgaatacta atacgcaatc ttcttgtgga 600

agttatgctt cgagtgccga gaacatagct aggcttctac aaggatggag ttcgagttcg 660

acgagtggtt tgtctaagaa gccgaaggaa gagccggtga gctatgatcg gagaaagtgt 720

gaggagataa ccgatccggt ttgtgacccg ttcggaagtg ttttcgggtt cgagtctttc 780

gactcgtcaa gttcggggaa cttatcgccg gaggaaggga gtgtgttgca agaggagagt 840

aaggatattg ggaatgaagg agatggtaca ttttctttga ttgagaaatg gttgtttgat 900

gaaggaatga aatttgaaaa tgatcatgat ttgttctag 939

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 3

atggggaggc caccttgct 19

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 4

ctagaacaaa tcatgatcat ttt 23

Claims

1.从苦荞中分离的调控植物原花青素合成的MYB类转录因子，其特征在于，其氨基酸序列为(a)或(b)所示:

(a)、SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；或

(b)、将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列通过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或/和插入而衍生得到的仍具有调控原花青素合成功能或活性的蛋白变体。

2.权利要求1所述的MYB类转录因子的编码基因，其特征在于，其多核苷酸为(a)、(b)、(c)、(d)或(e)所示：

(a)、SEQ ID No.2所示的多核苷酸；或

(b)、编码SEQ ID No.1所示氨基酸的多核苷酸；或

(c)、与SEQ ID NO.2的多核苷酸的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸，该多核苷酸所编码蛋白质仍具有调控原花青素合成功能；或

(d)、与SEQ ID No.2所示的多核苷酸至少有90％或以上同源性的多核苷酸；或

(e)、在SEQ ID NO.2所示的多核苷酸的基础上进行一个或多个碱基的缺失、取代或插入的多核苷酸变体，且该多核苷酸变体所编码的蛋白仍具有调控原花青素合成功能的功能或活性。

3.含有权利要求2所述编码基因的表达载体。

4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于：所述表达载体是重组植物表达载体。

5.权利要求1所述的MYB类转录因子或权利要求2所述的编码基因在调控植物原花青素合成代谢中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的调控植物原花青素合成包括促进原花青素的生物合成。

7.按照权利要求5或6所述的应用，其特征在于，包括：(1)构建含有权利要求2所述编码基因的重组植物表达载体；(2)将所构建的重组植物表达载体转化到植物组织或植物细胞中；(3)将权利要求2所述编码基因在植物组织或细胞中进行过表达。

8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的植物包括苦荞或拟南芥。

9.一种促进植物原花青素生物合成的方法，其特征在于，包括：(1)构建含有权利要求2所述编码基因的重组植物表达载体；(2)将所构建的重组植物表达载体转化到植物组织或植物细胞中；(3)将权利要求2所述编码基因在植物组织或细胞中进行过表达。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的植物包括苦荞或拟南芥。