CN114231538B

CN114231538B - 一条天目地黄RcMYB3基因及其在提高植物花青素含量中的应用

Info

Publication number: CN114231538B
Application number: CN202111657682.XA
Authority: CN
Inventors: 王丰青; 左鑫; 智惊宇; 张重义; 李烜桢; 张宝; 黄勇; 谢彩侠
Original assignee: Henan Agricultural University
Current assignee: Henan Agricultural University
Priority date: 2021-12-31
Filing date: 2021-12-31
Publication date: 2023-06-30
Anticipated expiration: 2041-12-31
Also published as: CN114231538A

Abstract

本发明提供一条天目地黄RcMYB3基因及其在提高植物花青素含量中的应用。RcMYB3转录因子来源地黄近缘物种天目地黄，与拟南芥PAP2基因cDNA相似性51.09％，序列长度963bp，包含一个完整的开放阅读框，编码区长度795bp，推测编码264个氨基酸。其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。对RcMYB3氨基酸序列的结构特征和进化特征进行分析，与已知花青素调控MYB转录因子的同源性均低于50％。RcMYB3基因可参与调控花青素的合成，利用转基因技术将RcMYB3转录因子过量表达载体转化地黄，可以有效提高地黄叶和块根的花青素含量。

Description

一条天目地黄RcMYB3基因及其在提高植物花青素含量中的应用

技术领域

本发明涉及一条天目地黄RcMYB3基因及其在提高植物花青素含量中的应用，属于分子生物学、基因工程技术领域。

背景技术

地黄属Rehmannia为玄参科Scrophulariaceae草本植物。根据《中国植物志》记载，地黄属包括地黄Remannia glutinosa、天目地黄Remannia chingii、裂叶地黄Remanniapiasezkii、湖北地黄Remannia henryi、高地黄Remannia elata和茄叶地黄Remanniasolanifolia等6种植物。其中地黄为4倍体物种，以块根入药，为常用大宗中药材，在我国有几千年的用药历史，始载于《神农百草经》，列为上品。栽培的地黄主要分布在河南、山西、河北、山东等地，道地产区在河南焦作的温县、武陟、修武、沁阳等地，常年保持10万亩以上的种植面积。天目地黄、湖北地黄、裂叶地黄和高地黄为2倍体物种，以全草入药，虽未被《中国药典》收录，但在民间也有较长的用药历史。地黄属植物的叶和根部均含有丰富的环烯醚萜苷、苯乙醇苷、水苏糖、多糖、紫罗兰酮、三萜、黄酮等多种活性成分，具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎、抗糖尿病、抗老年痴呆、改善肠道功能等药理活性，具有重要的药用价值。

地黄在民间有上千年的食用历史，民间食用地黄叶，采叶煮羹食以作充饥的习惯。《本草纲目》记载地黄：“地黄嫩苗，摘其旁叶作菜，甚益人”。李时珍认为，地黄的根苗、叶都可以入食。本草图注对地黄花的食用也有记载：“为末服食，共同地黄”。虽然地黄暂未列入《药食同源目录》，但随着科技的发展，以及资源多样化利用趋势，势必会增强对地黄药食部位的拓展和挖掘。为了更好的利用地黄药食兼用的特性，选育药用或食用专用型的品种将会为地黄产业的发展提供新的思路和增长点。然而，地黄栽培品种的遗传基础狭窄，缺乏满足生产需要的专用型地黄品种。因此，应充分利用地黄近缘种优异的遗传特性和优良基因，用于改良和完善栽培地黄存在的问题和不足。

花青素(Anthocyanidin)是一类广泛存在与植物中的水溶性天然色素，属于黄酮类化合物。花青素在自然状态下常与根中单糖形成糖苷，成为花色苷(Anthocyanin)。花青素可以延缓衰老，激活巨噬细胞，保护血管，降低糖尿病的发病风险，改善老年痴呆，降低癌症的发生率等。有研究表明，花青素是迄今为止所发现的最有效的天然水溶性自由基清除剂，抗氧化活性非常高。而且，花青素口服时易被人体快速吸收，能在口服后45min后快速进入人体各个组织器官。地黄块根和叶中花青素的研究迄今未见报道。因此，培育花青素含量高的地黄品种将为地黄的药食功能拓展提供新的思路。

MYB转录因子是植物中最大的转录因子家族，在植物的生长发育、次生代谢调控、激素信号转导、逆境胁迫响应等多方面发挥作用。根据MYB结构域的数量可将MYB转录因子分为4类：1R-MYB、R2R3-MYB、3R-MYB和4R-MYB。其中R2R3-MYB转录因子是一类在植物花青素合成途径中很重要的转录因子。迄今已有包括拟南芥、矮牵牛、葡萄、苹果、番茄、樱桃、草莓、金鱼草、梨、兰花等多种植物中克隆得到了正调控或负调控花青素合成的MYB转录因子基因。虽然不同植物中调控花青素合成的MYB转录因子有着相似的保守功能结构域，但也有不同的特异性序列片段，不同的转录因子具有种间特异性，分别调节花青素合成途径不同的结构基因表达，调控形成不同种类的花青素及其在植物中的含量。

地黄属植物的花富含花青素，尤其是天目地黄花的花青素含量很高。然而，天目地黄的分子生物学研究薄弱，还未见有克隆天目地黄MYB转录因子调节花青素合成的报道。克隆参与天目地黄花青素合成的MYB转录因子，不但可以丰富MYB调节植物花青素合成的理论，而且也有助于揭示地黄属不同物种的花色形成机制，也为地黄的分子改良育种提供了重要的基因资源。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一条天目地黄RcMYB3基因及其在提高植物花青素含量中的应用。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一条天目地黄RcMYB3基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；

其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

进一步的，本申请还包括所述RcMYB3基因的重组载体；所述RcMYB3基因的重组载体的重组菌株。

更进一步的，所述的天目地黄RcMYB3基因在制备转基因植物中的应用；

所述的天目地黄RcMYB3基因在调控植物花青素合成中的应用。

所述的天目地黄RcMYB3基因在调控地黄花青素合成中的应用。

本发明有益效果：

本发明涉及一个来源于地黄近缘物种天目地黄的RcMYB3转录因子，与拟南芥PAP2基因cDNA相似性为51.09％，序列长度为963bp，包含一个完整的开放阅读框，编码区长度为795bp，推测编码264个氨基酸。并对RcMYB3氨基酸序列的结构特征和进化特征进行分析，与已知的花青素调控MYB转录因子的同源性均低于50％。

本发明所述RcMYB3基因可参与调控花青素的合成，利用转基因技术将RcMYB3转录因子过量表达载体转化地黄，可以有效提高地黄叶和块根的花青素含量，RcMYB3转基因地黄叶色呈深紫红色，块根韧皮部薄壁细胞紫红色均匀分布，花青素的含量从非转基因地黄叶的0.10mg/g FW(鲜重)提高到9.97mg/g FW，从非转基因地黄块根的0.18mg/g FW提高到2.49mg/g FW，叶和块根中花青素的含量分别提高98.70倍和12.83倍。

本发明通过对转RcMYB3基因地黄叶和块根花青素途径结构基因表达量的分析可知，RcMYB3基因通过促进催化酶基因的表达量实现提高地黄叶和块根中的花青素含量。通过对RcMYB3结合烟草NtANS和NtDFR基因启动子的双荧光素酶活性分析可知，RcMYB3可以绑定到NtDFR和NtANS启动子上，增强启动子的活性，RcMYB3使NtDFR启动子的活性增强了14.16倍，使NtANS启动子的活性增强了108.30倍。由此可知，RcMYB3是一个花青素合成强调控因子，为地黄属植物的品种改良提供了优异的基因，对于培育高花青素含量的地黄品种具有重要意义。

附图说明

图1为本发明实施例1中RcMYB3与PAP2的核苷酸序列比对图。

图2为本发明实施例1中RcMYB3基因克隆的cDNA电泳图。

图3为本发明实施例2中RcMYB3保守结构域分析。

图4为本发明实施例2中RcMYB3的系统进化分析。

图5为本发明实施例3中RcMYB3在天目地黄不同发育阶段花冠和叶中的相对表达量。

图6为本发明实施例4中转基因RcMYB3地黄的表型和花青素含量。

其中，A，转基因地黄叶片形态；B，转基因地黄根部形态；C，转基因地黄块根横截面解剖图；D，转基因地黄的总花青素含量；WT，对照组；RcMYB3-OX，实验组；**，有显著性差异。

图7为本发明实施例5中转基因RcMYB3地黄叶和块根花青素途径结构基因表达量分析。其中，A，叶中催化酶基因的表达量；B，块根中催化酶基因的相对表达量。

图8为本发明实施例6中RcMYB3结合烟草NtANS和NtDFR基因启动子的双荧光素酶活性分析。

其中，+pNtDFR，RcMYB3绑定NtDFR启动子的活性分析；+pNtANS，RcMYB3绑定NtANS启动子的活性分析。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；涉及试剂如无特别说明，均为市售常规试剂；涉及试验方法如无特别说明均为常规方法。

实施例1、天目地黄RcMYB3基因的克隆

取浙江临安天目山的天目地黄新鲜花冠，液氮速冻后研磨成粉末。以

Reagent试剂盒(Invitrogen)提取花冠的总RNA，提取方法参考说明书进行，用DNaseI(脱氧核糖核酸酶I)进行DNA消化提取的总RNA。以Nanodrop^TM 2000核酸测定仪检测RNA的浓度和质量。取质量优异的总RNA，用带有Oligo(dT)的磁珠富集真核生物mRNA，纯化后得到所需RNA。用打断缓冲液把获得的RNA片段化，随机的N6引物进行反转录，再合成cDNA二链形成双链DNA。经末端修复、3’末端加碱基A、加测序接头后，进行PCR扩增，cDNA文库建成。

委托深圳华大基因以Illumina HiSeq^TM 2000平台进行转录组测序。测序获得的数据通过去杂、去冗余、组装等程序，获得天目地黄的转录组数据库。

以拟南芥PAP2基因为查询序列，在天目地黄转录组数据库中进行搜索，获得一条与拟南芥PAP2基因的cDNA相似性为51.09％的片段(RcMYB3基因)(图1)，序列长度为963bp，包含一个完整的开放阅读框，编码区长度为795bp，推测编码264个氨基酸。所得天目地黄RcMYB3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

SEQ ID NO:1：

SEQ ID NO:2

在编码区设计特异引物RcMYB3_F(SEQ ID NO:3：5’-ATGGAGAAAAATGCCCGAGG-3’)和RcMYB3_R(SEQ ID NO:4：5’-TCATTGATGATCACATGAGAGTTGC-’)，利用高保真DNA聚合酶以天目地黄花冠的cDNA为模板进行PCR扩增。

PCR扩增体系：

缓冲液(Mg²⁺plus)10μL，dNTP(脱氧核糖核苷三磷酸，各2.5mmol/L)4μL，正反向引物(10μmol/L)均为1μL，cDNA模板0.5μL，/>

HS DNA聚合酶(2.5U/μL)0.5μL，灭菌蒸馏水33μL，共计50μL。PCR反应的条件：98℃10s，58℃5s，72℃1min，30个循环；72℃4min。

得到包含RcMYB3完整编码区的795bp的cDNA片段(图2)。

实施例2、RcMYB3的序列比对及进化分析

以RcMYB3的氨基酸序列为查询序列，在NCBI上进行BLASTp搜索，获得RcMYB3的同源蛋白。利用MAFFT软件进行多序列联配，发现RcMYB3及其同源蛋白具有保守的结构域，RcMYB3序列含有保守的R2R3-MYB结构域(图3)，属于R2R3-MYB转录因子亚家族。

利用MEGA软件进行进化分析，构建RcMYB3及其它已经报道具有花青素调控功能的MYB转录因子的系统进化树，发现RcMYB3与拟南芥PAP2、胡萝卜DcMYB6和胡萝卜亚种sativus DcMYB113聚为一类，亲缘关系最近(图4)，序列一致性分别为44.44％、46.26％和45.92％。

实施例3、RcMYB3基因的表达特性分析

在RcMYB3基因的编码区设计特异引物RcMYB3_qF(SEQ ID NO:5：5’-ACCCCAAGAACACATCTTCG-3’)和RcMYB3_qR(SEQ ID NO:6：5’-GGTGGAGGAATAATCGGCTG-3’)。以RcTIP41为内参基因，引物序列为RcTIP41_qF(SEQ ID NO:7：5’-AAGAGCAGCTTCAGACTTCC-3’)和RcTIP41_qR(SEQ ID NO:8：5’-GAATTTCCATTGAGCAGCCG-3’)。

分别以天目地黄不同发育阶段(幼蕾、中蕾、成熟蕾、初开花、成熟花)花冠及叶中的cDNA为模板，进行实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析。

PCR扩增体系：TB

Premix Ex酶12.5μL，正反向引物(10μmol/L)各1μL，cDNA模板2.0μL，去离子水8.5μL，共计25μL。反应条件：95℃30s；95℃5s，60℃30s，40个循环。根据BIO-RAD iQ5软件生成的Ct(cycle threshold)值，以2^-ΔΔCt计算RcMYB3基因的相对表达量。

结果发现，RcMYB3基因在花冠中具有较高的表达量，成熟花蕾的花冠中的RcMYB3表达水平最高，其次为中蕾期的花冠，在叶中的表达量最低(图5)，说明RcMYB3在天目地黄花冠的花色形成过程中表达水平较高。

实施例4、RcMYB3转基因地黄的表型分析

为了分析RcMYB3在地黄中的花青素合成中的分子功能，构建了由花椰菜病毒(CaMV)35S启动子驱动的RcMYB3过量表达载体。

设计特异引物分别带有Sal I和BamH I酶切位点的引物RcMYB3_oxF(SEQ ID NO:9：5’-gcGTCGACagaccATGGAGAAAAATGCCCGAGG-3’)和RcMYB3_oxR(SEQ ID NO:10：5’-cgGGATCCTCATTGATGATCACATGAGAGTTGC-3’)，以天目地黄花冠cDNA为模板，用高保真DNA聚合酶进行PCR扩增。

PCR反应体系为50μL，包括10μL的

缓冲液(Mg²⁺plus)，4μL的dNTP混合物，正反向引物(10μmol/L)均为1μL，1μL模板cDNA，0.5μL />

HS DNA聚合酶(2.5U/μL)，添加32.5μL的去离子水。PCR反应的条件：98℃10s，58℃5s，72℃1min，30个循环；72℃4min。

扩增产物纯化后以Sal I和BamH I双酶切，酶和酶切缓冲液的用量参考说明书，酶切反应体系总体积为20μL，反应条件为37℃3h。酶切产物在割胶仪中进行切胶回收，具体操作按照天根琼脂糖凝胶回收试剂盒进行。

回收产物以T4-DNA连接酶连接到带有35S启动子和Nos终止子的植物双元表达载体中。连接反应体系为：质粒DNA 6μL，RcMYB3 cDNA片段2μL，10×Buffer 1μL，T4 DNA连接酶1μL，总体系10μL。体系配置完毕后置于PCR扩增仪中16℃过夜连接。构建好的载体命名为p35S-RcMYB3-Nos。测序正确的RcMYB3过量表达载体以冻融转化法转入根癌农杆菌LBA4404中。

以携带RcMYB3过量表达载体p35S-RcMYB3-Nos的根癌农杆菌侵染地黄叶片。

1)将根癌农杆菌在含卡那霉素的YEB固体培养基表面划线后暗培养活化，培养温度为28℃，活化后的菌株在YEB固体培养基表面划线培养48h后，以含有100mg/L乙酰丁香酮(AS)液体MS培养基冲洗农杆菌至菌体浓度至OD₆₀₀＝0.5制备成侵染培养基。

2)将继代30d的无菌地黄苗叶片去叶脉后剪成长和宽均约0.5～0.8cm的叶片小块(叶盘)，浸泡入侵染培养基中5～8min，之后取出叶盘接种到含有100mg/L乙酰丁香酮的固体MS培养基上进行暗培养，培养温度为26℃。

3)48h后取出共培养后的叶盘，无菌水洗净表面的农杆菌，放入含有2mg/L 6-BA(6苄基腺嘌呤)、0.05mg/L NAA(萘乙酸)、200mg/L特美汀和12mg/L潮霉素的固体MS分化培养基上进行愈伤诱导和再生芽分化，培养温度为26℃，光照强度为2000～4 000lx，每天14光照。每2周更换一次培养基，直至分化出抗性分化芽。

4)待芽长至2-3cm时剪下转入MS固体生根含200mg/L特美汀的MS固体培养基中生根培养，培养温度为26℃，光照强度为2000～4 000lx，每天14光照。生根的再生芽移栽到营养土中，在温室中进行培养，温度26℃，每天14h光照。在温室中生长40d后进行表型分析。

以转入RcMYB3基因的处理组为实验组(RcMYB3-OX)，并以未转入RcMYB3基因的空白处理为对照组(WT)。

结果表明，在转RcMYB3基因的地黄(RcMYB3-OX实验组)叶片呈紫红色，叶脉颜色更深(图6A)；转基因地黄的块根表皮也呈紫红色(图6B)；块根纵切面皮层的紫红色较深，木质部颜色较浅(图6C)。

随机选取生长良好的有显著表型的3个转基因株系(RcMYB3-OX实验组)和未转基因植(对照组WT)株，分别取等量的叶片和块根鲜样切碎混匀，利用全波长酶标仪测定实验组和对照组的地黄叶和块根的总花青素含量，发现转基因(RcMYB3-OX实验组)地黄叶和块根中的总花青素含量分别为9.97mg/g FW和2.49mg/g FW，对照组(WT)地黄叶和块根中的总花青素含量分别为0.10mg/g FW和0.18mg/g FW，实验组较对照组提高了98.70倍和12.83倍(图6D)。

实施例5、RcMYB3调控花青素途径催化酶基因的表达分析

随机选取在温室里生长40d的转RcMYB3基因的3个地黄株系(实验组RcMYB3-OX)，及未转入RcMYB3基因的3个地黄株系(对照组WT)，取同样部位的叶和块根混匀，液氮速冻后提取总RNA。总RNA逆转录后合成cDNA第一链，作为检测基因表达量的模板。根据地黄的转录组信息，筛选编码花青素生物合成途径的关键催化酶基因RgCHS、RgCHI、RgF3H、RgDFR和RgANS的转录本，设计特异引物，用于检测转基因植株中相关基因的表达量，以RgTIP41为内参基因。引物由上海生工生物工程公司合成。定量PCR引物见表1。实时荧光定量PCR检测用TaKaRa公司TB

Premix Ex Taq^TM II(Tli RNaseH Plus)试剂盒。PCR扩增体系和反应条件见实施例3。

表1地黄花青素合成途径结构基因实时荧光定量PCR引物

引物名称	核苷酸序列(5’-3’)
		RgCHS_qF	AATTGCGTGGATCAGAGCAC(SEQ ID NO:11)
RgCHS_qR	TGTAAGCGCACATGTTTGGA(SEQ ID NO:12)
		RgCHI_qF	CTGTATCGCCTTCTGTCACC(SEQ ID NO:13)
RgCHI_qR	TGGCAGTGAACTTGACGAAC(SEQ ID NO:14)
		RgF3H_qF	GGTTATATCGCTCGACGGAG(SEQ ID NO:15)
RgF3H_qR	TTCTCTTGAGCAGGCAACTC(SEQ ID NO:16)
		RgDRF_qF	AAACCAACTGGAGTGACCTG(SEQ ID NO:17)
RgDRF_qR	GAATGGACCAACCACTACAGG(SEQ ID NO:18)
		RgANS_qF	CAGACATCAACTCCGACGAC(SEQ ID NO:19)
RgANS_qR	CCGATTTATGAGCTCCTCCG(SEQ ID NO:20)
		RgTIP41_qR	TGGCTCAGAGTTGATGGAGTG(SEQ ID NO:21)
RgTIP41_qR	TCTCCAGCAGCTTTCTCGGA(SEQ ID NO:22)

定量分析结果表明，除RgCHI外，其余4个催化酶基因RgCHS、RgF3H、RgDFR和RgANS在转基因地黄的叶片和块根中的表达水平均极显著高于对照组WT(图7)。RgCHS、RgCHI、RgF3H、RgDFR和RgANS转基因地黄叶中分别增加了305.54、0.91、1168.40、200.18、和5144.63倍(图7A)，在块根中分别增加了26295.39、-0.07、239.42、44.16和832.44倍(图7B)。说明RcMYB3在地黄中的异源表达提高了地黄花青素途径催化酶基因的表达量，转RcMYB3基因提高地黄叶和块根中的花青素含量是通过促进催化酶基因的表达量实现的。

实施例6、RcMYB3调控烟草NtANS和NtDFR基因启动子活性分析

由于地黄基因组信息有限，为了分析RcMYB3结合靶基因的活性，分析了RcMYB3结合烟草花青素催化酶基因NtANS和NtDFR启动子的活性。克隆NtDFR和NtANS的启动子序列，设计特异引物(表2)，以高保真DNA聚合酶进行PCR扩增。

PCR反应体系：10μL的

缓冲液(Mg²⁺plus)，4μL的dNTP混合物，正反向引物(10μmol/L)均为1μL，1μL模板cDNA，0.5μL/>

HS DNA聚合酶(2.5U/μL)，去离子水32.5μL，总体积为50μL。PCR反应的条件：98℃10s，58℃5s，72℃2min，30个循环；72℃4min。

提取pGreen II 0800-LUC质粒，用KpnI限制性核酸内切酶单酶切并胶回收纯化；在启动子扩增重组引物两端添加同源臂，根据ClonExpress II One Step Cloning Kit(Vazyme)说明书进行无缝克隆，分别构建成含有目标基因启动子的报告基因载体pGreenII-Luc-pNtDFR和pGreenII-Luc-pNtANS。利用冻融法分别把实施例4构建的RcMYB3过量表达载体p35S-RcMYB3-Nos(处理组)、不含RcMYB3的空载体(对照组)和荧光素酶报告基因载体pGreenII-Luc-pNtDFR、pGreenII-Luc-pNtANS分别转入农杆菌GV3101

分别取转入启动子荧光素酶报告基因载体、RcMYB3过量表达载体、不含RcMYB1的空载体的农杆菌菌液，接种于LB液体培养基悬浮培养，待菌液浓度OD₆₀₀值为0.5时取等量的待测菌液进行混合，以含启动子荧光素酶报告基因载体和RcMYB3过量表达载体的混合农杆菌菌液为处理组，以含启动子荧光素酶报告基因载体和空载体的混合农杆菌菌液为对照，利用注射器分别将混合菌液注射入状态良好的本生烟草叶片。在处理后48h取烟草叶片进行荧光值的测定，计算荧光素酶相对活性。

表2烟草花青素合成途径催化酶基因启动子克隆引物

引物名称	核苷酸序列(5’-3’)
		NtANSp_F	ATCCCTTATCCCGCATGCA(SEQ ID NO:23)
NtANSP_R	GCACTGATCACCACCATCTCTG(SEQ ID NO:24)
		NtDFRp_F	AGAGTTAGGTCGGGCAAACGC(SEQ ID NO:25)
NtDFRp_R	CATGAACAGCTGCATGACCTTC(SEQ ID NO:26)

结果表明，RcMYB3可以绑定到NtDFR和NtANS的启动子上，增强启动子的活性，RcMYB3使NtDFR启动子的活性较对照组增强了14.16倍，使NtANS启动子的活性较对照组增强了108.30倍(图8)。说明RcMYB3激活NtDFR和NtANS启动子的能力很强。

以上实施例表明，本发明提供的RcMYB3基因是植物花青素合成的强调控因子，利用RcMYB3基因进行转基因育种促进花青素的合成是可行且有效的。

以上仅以地黄为实施例，RcMYB3也可以用于其它地黄属植物的遗传改良，同时该基因对于地黄属以外的植物也具有较强的应用前景。

序列表

<110> 河南农业大学

<120> 一条天目地黄RcMYB3基因及其在提高植物花青素含量中的应用

<130> RcMYB3基因

<160> 26

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 795

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

atggagaaaa atgcccgagg agtgaggaaa ggtgcgtgga cgaaagatga agatattctt 60

ctcaagaaat gcattgaaaa atacggtgaa gggagatggc atctagtccc tcttagagct 120

gggctgaata gatgcaggaa gagttgcagg ctgagatggt tgaactatct gagaccaaac 180

attaaaagag gttactttaa caaagatgaa gtggatctca ttgtaaggct tcataagttg 240

ttaggaaaca gatggtcgtt gatagccggt agaatccccg ggagaacagc aaacgacgtc 300

aagaacttct ggaacaccca cgtcgagaaa aagttaaaac ccatgatcac tcagaccaac 360

atcataagac ctcaacctcg gatcttctcc aaacaacacg tggcgccagc taattggtcc 420

aatgatgtac caaatattga tggaaaaaac cccaagaaca catcttcgac tgatcatgca 480

tcatcgtcaa aaacctcgaa aacagacggt cgagatgaaa acaccaagaa taacaagcag 540

cagccgatta ttcctccacc attacaagaa gaagaagtag atgaatgcat gcgttggtgg 600

ggcaacttgc ttgaaattac cgaaaatggt gatggaattt tatttcccga agaggaccac 660

ttaccaattg tggacccatt attatcgcca ggatttggtg atcaaaacgg aaaagattac 720

ggtgttgagg atggaatatt gagtagttta gaattggatg ttgatgtttg gcaactctca 780

tgtgatcatc aatga 795

<210> 2

<211> 264

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 2

Met Glu Lys Asn Ala Arg Gly Val Arg Lys Gly Ala Trp Thr Lys Asp

1 5 10 15

Glu Asp Ile Leu Leu Lys Lys Cys Ile Glu Lys Tyr Gly Glu Gly Arg

20 25 30

Trp His Leu Val Pro Leu Arg Ala Gly Leu Asn Arg Cys Arg Lys Ser

35 40 45

Cys Arg Leu Arg Trp Leu Asn Tyr Leu Arg Pro Asn Ile Lys Arg Gly

50 55 60

Tyr Phe Asn Lys Asp Glu Val Asp Leu Ile Val Arg Leu His Lys Leu

65 70 75 80

Leu Gly Asn Arg Trp Ser Leu Ile Ala Gly Arg Ile Pro Gly Arg Thr

85 90 95

Ala Asn Asp Val Lys Asn Phe Trp Asn Thr His Val Glu Lys Lys Leu

100 105 110

Lys Pro Met Ile Thr Gln Thr Asn Ile Ile Arg Pro Gln Pro Arg Ile

115 120 125

Phe Ser Lys Gln His Val Ala Pro Ala Asn Trp Ser Asn Asp Val Pro

130 135 140

Asn Ile Asp Gly Lys Asn Pro Lys Asn Thr Ser Ser Thr Asp His Ala

145 150 155 160

Ser Ser Ser Lys Thr Ser Lys Thr Asp Gly Arg Asp Glu Asn Thr Lys

165 170 175

Asn Asn Lys Gln Gln Pro Ile Ile Pro Pro Pro Leu Gln Glu Glu Glu

180 185 190

Val Asp Glu Cys Met Arg Trp Trp Gly Asn Leu Leu Glu Ile Thr Glu

195 200 205

Asn Gly Asp Gly Ile Leu Phe Pro Glu Glu Asp His Leu Pro Ile Val

210 215 220

Asp Pro Leu Leu Ser Pro Gly Phe Gly Asp Gln Asn Gly Lys Asp Tyr

225 230 235 240

Gly Val Glu Asp Gly Ile Leu Ser Ser Leu Glu Leu Asp Val Asp Val

245 250 255

Trp Gln Leu Ser Cys Asp His Gln

260

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

atggagaaaa atgcccgagg 20

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

tcattgatga tcacatgaga gttgc 25

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

accccaagaa cacatcttcg 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

ggtggaggaa taatcggctg 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 7

aagagcagct tcagacttcc 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 8

gaatttccat tgagcagccg 20

<210> 9

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 9

gcgtcgacag accatggaga aaaatgcccg agg 33

<210> 10

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 10

cgggatcctc attgatgatc acatgagagt tgc 33

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 11

aattgcgtgg atcagagcac 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 12

tgtaagcgca catgtttgga 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 13

ctgtatcgcc ttctgtcacc 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 14

tggcagtgaa cttgacgaac 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 15

ggttatatcg ctcgacggag 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 16

ttctcttgag caggcaactc 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 17

aaaccaactg gagtgacctg 20

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 18

gaatggacca accactacag g 21

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 19

cagacatcaa ctccgacgac 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 20

ccgatttatg agctcctccg 20

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 21

tggctcagag ttgatggagt g 21

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 22

tctccagcag ctttctcgga 20

<210> 23

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 23

atcccttatc ccgcatgca 19

<210> 24

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 24

gcactgatca ccaccatctc tg 22

<210> 25

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 25

agagttaggt cgggcaaacg c 21

<210> 26

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 26

catgaacagc tgcatgacct tc 22

Claims

1.一条天目地黄RcMYB3基因，其特征在于，RcMYB3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.如权利要求1所述的天目地黄花RcMYB3基因，其特征在于，RcMYB3的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.含有如权利要求1所述RcMYB3基因的重组载体。

4.含有如权利要求3所述RcMYB3基因的重组载体的重组菌株。

5.如权利要求1或2所述的天目地黄RcMYB3基因在制备转基因植物中的应用。

6.如权利要求1或2所述的天目地黄RcMYB3基因在调控植物花青素合成中的应用。

7.如权利要求1或2所述的天目地黄RcMYB3基因在调控地黄花青素合成中的应用。