CN108660140B - SlSL4基因在调控番茄果实成熟中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种SlSL4基因在调控番茄果实成熟中的应用。所述SlSL4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明研究了SlSL4基因在番茄中的功能，该基因与番茄果实的成熟密切相关，并在乙烯调控果实成熟突变体中起到核心调控作用，对于详细阐明番茄果实成熟调控机理具有重要的理论价值。本发明首次利用SlSL4基因构建超表达载体，利用农杆菌介导的遗传转化法转化番茄植株，从而控制番茄的成熟进程，可以合理调控果实上市时间，大量减少因果实过熟腐烂造成的损失，可为农业生产节约成本且提高管理水平，因此本发明具有广阔的市场应用前景，在生产实践中具有重要意义。

Description

SlSL4基因在调控番茄果实成熟中的应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种SlSL4基因在调控番茄果实成熟中的 应用。

背景技术

果实成熟通常可以定义为组织代谢变化促使果实器官中的有机体消耗有利于 种子的释放和传播，涉及一系列的生理和生化变化，包括色素积累及叶绿素降解导 致果实颜色变化，细胞壁降解及细胞膨压变化导致果实组织软化，果实形状改变， 可溶性糖、风味物质和营养物质合成，以及果实成熟后抗病性降低，对病原体感染 的易感性增加，耐贮性变差等。而这些变化由内部因素和外部因素共同调控，包括 发育基因调控、激素、光和温度等。这些相同点说明调节果实成熟的潜在遗传机制 可能在不同物种的果实之间很保守。因此，揭示果实发育与成熟的调控机制一直是 国内外研究的热点。

番茄(solanum lycopersicum)是人类日常饮食中常见的果蔬产品，其果实营 养丰富并且具有特殊风味，原产于中美洲和南美洲。番茄目前不但作为食用蔬果被 全球性广泛种植，而且也是研究肉质果实发育和成熟的模式植物(Giovannoni 2004； Fonseca andAl 2009)，其原因除了它的农业经济价值，还包括：(1)番茄是二倍 体植物，生长周期较短，生长习性简单，果实成熟表型易观察；(2)番茄已研究出 成熟高效的遗传转化体系；(3)番茄具有丰富的种质资源，其中包括大量果实成熟 突变体；(4)番茄果实成熟过程的研究拥有丰富的生物化学和分子学数据；(5)番 茄全基因组序列的测序已完成。

所以，研究调节番茄果实成熟的因子对于详细阐明番茄果实成熟调控机理具有重要的理论价值，并且可以通过转基因技术，控制番茄的成熟进程，在生产实践中 也具有重要意义。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种SlSL4基因在调控番茄果实成熟中的应用，该基因与番茄果实的成熟密切相关，对于详细阐明番茄果实成熟调控机理具有 重要的理论价值。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

SlSL4基因在调控番茄果实成熟中的应用，所述SlSL4基因的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

进一步，SlSL4基因在番茄中表达量随着果实发育逐渐升高，在果实破色期表 达量达到最高，在果实成熟过程中其表达量又降低。

进一步，SlSL4基因通过调控番茄果实成熟相关基因的表达来调控番茄果实的 成熟，所述番茄果实成熟相关基因包括ACO1(NCBI登录号：NM_001247095)， ACO3(NCBI登录号：NM_001309213)，ACS2(NCBI登录号：NM_001247249)， E4(NCBI登录号：S44898)，E8(NCBI登录号：X13437)，ERF1(NCBI登录号： NM_001247912)。

SlSL4基因在番茄果实成熟中超表达后乙烯生物合成相关基因ACO1，ACO3， ACS2和乙烯响应基因E4，E8，ERF1表达量显著降低。

通过检测了ACO1,ACO3,ACS2等乙烯合成相关基因以及RIN基因在SlSL4基 因超表达转基因番茄果实中的表达水平，发现这些乙烯合成基因在转基因果实中的 表达水平相较于野生型果实明显受到抑制，说明SlSL4基因表达差异可能影响了乙 烯的生物合成。在乙烯响应过程中，E4和E8是其中的重要基因，参与果实成熟调 控过程。其中ERF1基因是乙烯信号传导的末端，通过与目标基因启动子区域的 GCC-Box结合完成对成熟相关基因的调控。申请人研究发现，E4，E8和ERF1基因 在SlSL4基因超表达转基因番茄果实中的表达量与野生型果实相比明显下调。

本发明的目的之二在于提供一种控制番茄果实成熟进程的方法，包括以下步骤：

1)超表达载体的构建：将SlSL4基因片段通过PCR扩增克隆出SlSL4基因超表 达片段，通过限制性内切酶双酶切SlSL4基因超表达片段和载体，然后将酶切后的 目的片段和载体片段通过T4连接酶进行连接，获得超表达载体；

2)将构建好的超表达载体转化到根癌农杆菌LBA4404中，利用农杆菌介导的 遗传转化法转化番茄植株，利用荧光定量PCR技术(qRT-PCR)筛选SlSL4基因超 表达株系，得延迟成熟的转基因番茄植株。

SlSL4超表达番茄果实的成熟较野生型果实成熟明显推迟，表明了SlSL4基因表达影响番茄果实的成熟，所以通过构建超表达SlSL4的载体来转化番茄植株，以得 到延迟成熟的转基因番茄植株。

进一步，步骤1)中所用的载体为PVCT2024，限制性内切酶为BamHI和SacI。

阳性株系成熟特性分析：将生长健壮的转基因植株和野生型植株(非转基因对照)，分别种植，记录其果实达到成熟的时间，检测果实成熟相关指标(包括果实 呼吸速率、果实乙烯释放速率和果实硬度等)，从而验证超表达SlSL4基因干涉转基 因番茄的果实成熟显著延迟。

通过实验验证该基因在番茄果实成熟过程中所起的作用，为后期利用该基因改良番茄以及其他呼吸跃变型果实成熟进程的能力奠定基础。

该方法通过基因工程手段培育转基因植物能克服传统育种的不足，不仅育种周期短，而且操作简单，将SlSL4基因在番茄中超表达，能够显著延缓果实成熟的进 程，从而可以人为控制果实上市时间，并且不改变果实的口感特征，相比用人工激 素处理果实更加绿色环保，效果也更加稳定，因而具有明显的优势，它可以为呼吸 跃变型果实大规模生产提供方便，可以合理调控果实上市时间，大量减少因果实过 熟腐烂造成的损失，可为农业生产节约成本且提高管理水平，因此本发明具有广阔 的市场应用前景。

本发明的目的之三在于提供一种上述方法中得到的超表达载体在控制呼吸跃 变型果实成熟进程中的应用，所述呼吸跃变型果实包括番茄。

呼吸跃变型果实有苹果、香蕉、番茄、鳄梨、芒果等。

本发明的目的还在于提供一种番茄果实中SlSL4基因定量测定的方法，所述方 法以待测样品提取RNA后反转录成的cDNA为模板，以SlELF基因和/或SlCAC基因 为内标，进行qRT-PCR反应；反应后扫描荧光，用2^-ΔΔCt计算方法进行数据处理， 得番茄果实中SlSL4基因的表达水平。

进一步，SlSL4基因的引物序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示；SlELF基 因的引物序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示；SlCAC基因的引物序列如SEQ ID NO.6和SEQID NO.7所示。

进一步，所述qRT-PCR反应的条件为：94℃30s后94℃3min，56～65℃30s，40个循环后，65-95℃3s解链。

作为一种优选，所述qRT-PCR反应的条件为：94℃30s后94℃3min，59℃30s， 40个循环后，65-95℃3s解链。

本发明的有益效果在于：

1)本发明研究了SlSL4基因在番茄中的功能，该基因与番茄果实的成熟密切相关，并在乙烯调控果实成熟突变体中起到核心调控作用，对于详细阐明番茄果实成 熟调控机理具有重要的理论价值。

2)本发明首次利用SlSL4基因构建超表达载体，利用农杆菌介导的遗传转化法 转化番茄植株，从而控制番茄的成熟进程，在生产实践中也具有重要意义。该方法 不仅育种周期短，而且操作简单，能够显著延缓果实成熟的进程，从而可以人为控 制果实上市时间，并且不改变果实的口感特征，它可以为呼吸跃变型果实大规模生 产提供方便，可以合理调控果实上市时间，大量减少因果实过熟腐烂造成的损失， 可为农业生产节约成本且提高管理水平，因此本发明具有广阔的市场应用前景。

附图说明

图1为SlSL4基因在番茄果实中的表达模式。IMG:青果期果实；MG：青熟期 果实；B:破色期果实；B+4：破色期后4天果实；B+7：破色期后7天果实。突变 体与野生型果实样品表达差异显著性：*,p<0.05；**,p<0.01。

图2为SlSL4基因在激素中的表达模式。Eth:乙烯；SA:水杨酸；GA:赤霉素； ABA:脱落酸；JA:茉莉酸。处理与未处理样品表达差异显著性：*,p<0.05；**,p< 0.01。

图3为SlSL4基因超表达转基因番茄果实中乙烯合成相关基因的表达。转基因 与野生型样品表达差异显著性：*,p<0.05；**,p<0.01。

图4为SlSL4基因超表达转基因番茄果实中乙烯响应基因的表达。转基因与野 生型样品表达差异显著性：*,p<0.05；**,p<0.01。

图5为SlSL4基因超表达转基因番茄果实中果实成熟相关基因的表达。转基因 与野生型样品表达差异显著性：*,p<0.05；**,p<0.01。

具体实施方式

以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明 具体条件的实验方法，通常按照常规条件，所举实施例是为了更好地对本发明的内 容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人 员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范 围。

实施例1番茄SlSL4基因的表达模式分析

1实验材料

野生型番茄AC⁺⁺(SolanμM Lycopersicon Mill.cv.Alsa Craig)，番茄不成熟突变体rin(ripening-inhibitor)、Nor(non-ripening)和Nr(never-ripening)。

2实验方法

2.1番茄样品的收集

(1)番茄果实材料：

采集不同番茄在果实成熟不同时期的果实样品，即AC⁺⁺、rin、Nor、Nr在以 下5个时期的果实样品，青果期(Immature Green,IMG)、绿熟期(Mature Green,MG)、 破色期(Breaker,B)、破色期后4天(4Day after Breaker,B+4)和破色期后7天(7 Day afterBreaker,B+7)。为了标定番茄果实的成熟进程，我们从番茄花开始授粉起 计算为其果实的成长天数，用授粉天数(days after pollination)区分果实成熟不同 阶段。其中由于AC⁺⁺、rin、Nor、Nr番茄从开花到达破色期天数有差异，因此收 取破色期(Breaker,B)样品时，野生型番茄收取35dpa样品，Nor、Nr、rin分别收取 41dpa、39dpa、40dpa样品。每种番茄每个时期均收取3个果实作为生物重复。采 收的材料立即速冻在液氮中，并保存在-80℃冰箱中备用。

(2)激素处理番茄叶片方法及收样：

将野生型番茄AC⁺⁺种子置于28℃黑暗培养催芽处理，萌芽后播种在直径0.5cm 的穴盘，待到2-3片真叶长出，再将大小、长势一致的番茄苗移栽到直径15cm的 营养钵，相同条件下培养40天左右，进行激素处理：选长势一致的番茄植株进行 Eth(1mM)、ABA(100μM)、GA(100μM)、JA(100μM)、SA(100μM)喷施 叶面，每种激素处理3棵植株作为生物重复，0h、1h、6h、12h、24h时间点分别 收取激素处理前和处理后的叶片样品，液氮迅速冷冻，放于-80℃冰箱备用。

2.2总RNA提取及反转录成cDNA

番茄果实总RNA的提取：

利用植物总RNA提取试剂盒(TIANGEN)提取总RNA，具体步骤如下：

(1)匀浆处理：将不同时期的果实样品在液氮中迅速研磨成粉末，加入450μLRL(使用前加入β-巯基乙醇)，涡旋剧烈震荡混匀。

(2)将所有溶液转移至过滤柱CS上(过滤柱CS放在收集管中)，12,000rpm离 心2min，吸取收集管中的上清至RNase-Free的离心管中，吸头尽量避免接触收集 管中的细胞碎片沉淀。

(3)缓慢加入0.5倍上清体积的无水乙醇，混匀，将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3中，12,000rpm离心60sec,倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收 集管中。

(4)向吸附柱CR3中加入350μL去蛋白液RW1，12,000rpm离心60sec,倒掉收 集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。

(5)DNase I工作液的配制：取10μL DNase I储存液放入新的RNase-Free离心管中，加入70μL RDD溶液，轻柔混匀。

(6)向吸附柱CR3中央加入80μL的DNase I工作液，室温放置15min。

(7)向吸附柱CR3中加入350μL去蛋白液RW1，12,000rpm离心30-60sec,倒掉 收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。

(8)向吸附柱CR3中加入500μL漂洗液RW(使用前加入乙醇)，室温静置2min， 12,000rpm离心30-60sec,倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。

(9)重复步骤8。

(10)12,000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CR3置于室温放置数分钟，以 彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

(11)将吸附柱CR3放入一个新的RNase-Free离心管中，向吸附膜的中间部位悬 空滴加30-100μL RNase-Free ddH2O，室温放置2min,12,000rpm离心2min，得 到RNA溶液。1.2％琼脂糖凝胶电泳和核酸浓度检测仪检测RNA的质量和浓度， RNA样品在-70℃中保存备用。

RNAiso plus(TaKaRa)提取番茄叶片RNA方法如下：

(1)取适量叶片样品立即放于液氮中充分研磨；

(2)将研磨充分的粉末置于2.0ml RNase-free离心管，并加入1ml RNAiso plus溶液，快速剧烈震荡混匀，然后室温静置5min；

(3)静置后，放于4℃，13000rpm离心机离心5min，并将上清转至新的RNase-free离心管中；

(4)加入200μl氯仿，剧烈摇晃混匀后静置5min；

(5)放于4℃，13000rpm离心机离心15min，收集上清于新的RNase-free离心管 中；

(6)加异丙醇300μl，轻柔上下混匀，于室温静置10min；

(7)放于4℃，13000rpm离心机离心10min，弃上清，加入75％乙醇1ml清洗沉 淀；

(8)放于4℃，13000rpm离心机离心15min，弃上清，于室温放置，干燥5-10min；

(9)加入RNase-free水(适量)溶解RNA，取2μlRNA溶液，用核酸浓度检测仪 和1％的琼脂糖凝胶电泳分析总RNA的浓度和完整性，将检测完成的RNA样品保 存在-80℃冰箱备用。

cDNA的合成：

用PrimeScript^TMRT反转录试剂盒(TaKaRa)来反转合成cDNA，过程如下：

(1)按如下成分在PCR管(置冰上)中配置混合液。

(2)42℃反应2min

(3)向上述PCR管中加入如下混匀的试剂：

(4)将上述反应液按如下程序进行反应：

37℃ 15min

85℃ 5sec

4℃ hold

(5)得到cDNA，放-20℃备用。

2.3番茄果实中SlSL4基因定量测定

(1)设计qRT-PCR引物

根据SlSL4基因序列，运用引物设计软件Premier 5，依据引物设计原则设计出 实时荧光定量引物，其序列如下：

qSlSL4-F:5’–TTCTCAATCCAAATACACAGCC-3’

qSlSL4-R:5’–AATCAATAGAGTTCAGCCAAAG-3’

根据SlCAC基因在番茄各个时期果实各组织中的稳定表达，选其作为本次番 茄果实qRT-PCR实验的内参引物，序列如下：

qSlCAC-F：5’-CCTCCGTTGTGATGTAACTGG-3’

qSlCAC-R：5’-ATTGGTGGAAAGTAACATCATCG-3’

根据SlELF基因在番茄各组织部位均具有稳定的表达，选其作为本次qRT-PCR 实验的内参引物(除果实外)，序列如下：

qSlELF-F：5’-ACCTTTGCTGAATACCCTCCATTG-3’

qSlELF-R：5’-CACACTTCACTTCCCCTTCTTCTG-3’

(2)定量引物qRT-PCR的条件筛选

为了使本次实验数据更为可信，我们对SlSL4基因的定量引物最适退火温度进 行了筛选，并且对溶解曲线是否单一、扩增效率是否达标进行了验证。

①对SlSL4基因利用温度梯度PCR的方法进行了该基因定量引物的最适温度的探究。PCR的反应体系及程序见下：

体系：

在PCR程序结束后观察扩增曲线和溶解曲线，扩增曲线的Ct值小，溶解曲线 的峰高且单一，表明扩增效率高，退火温度适宜。

②制作标准曲线

将①中最适退火温度下的PCR产物回收纯化后作为制作标准曲线的模板，并 先将其稀释10倍，后依次逐级10倍稀释至7个样品，将这7个样品作为模板在① 中最适退火温度下进行qRT-PCR扩增，最后制作标准曲线。以上实验均进行3次 技术重复。

利用qRT-PCR技术在最适引物和最适退火温度下并在Bio-Rad CFX96荧光定 量系统下(Bio-Rad Laboratories,Hercμles,CA)对SlSL4基因的表达水平分析，实验 设立三次生物重复和三次技术重复，设空白对照NTC(no template control)和inter run对照。最后利用Bio-Rad CFX Manager软件，按照2^-ΔΔCt计算方法数据处理。

用基因SlCAC和SlCAC为内参分别对SlSL4基因在番茄叶片和果实中的表达 水平进行分析，qRT-PCR反应体系及反应程序参照以上。

3结果与分析

3.1 SlSL4基因在番茄果实成熟突变体中的表达模式

为了研究SlSL4基因是否与番茄果实成熟有关，对野生型番茄和3种果实成熟 突变体(Nor、Nr、rin)的5个不同果实成熟期(IMG、MG、B、B+4、B+7)样 品中SlSL4基因的表达水平进行了检测，结果如图1。SlSL4基因在番茄AC⁺⁺中表 达量随着果实发育(IMG-B)逐渐升高，并在果实破色期(B)表达量达到最高，而 后果实成熟过程中其表达量又降低(B-B+7)，表明该基因可能在果实发育过程中发 挥作用。SlSL4基因在果实不成熟突变体中的表达模式与野生型中明显不同。在突 变体rin果实发育过程中的表达量相对较低，但在果实成熟时(B+7)时期表达量 显著升高；SlSL4基因在突变体Nor、Nr果实中的表达量显著高于野生型果实，除 破色期例外；破色期SlSL4基因在野生番茄AC⁺⁺的表达量显著高于番茄果实不成熟突变体。结果表明SlSL4基因可能参与果实成熟过程的调控作用。

3.2激素处理对SlSL4基因表达的影响

为了研究SlSL4基因与植物激素调控途径的相关性，我们对野生番茄AC⁺⁺进行了外源激素(Eth,ABA,GA,JA,SA)喷施处理,用喷水处理番茄AC⁺⁺作为对照 (CK)检测该基因在激素处理后的番茄叶片中的表达量的变化，qRT-PCR结果 表明：

(1)乙烯处理(如图2a所示)：SlSL4基因在刚处理1h的叶片中的表达量同对照 组无差异，但随着处理时间加长(6h-24h)，该基因在处理叶片中的表达量明显低于 对照组，结果说明乙烯处理可以降低SlSL4基因的表达，SlSL4很可能与乙烯调控 途径相关。

(2)ABA处理(如图2b所示)：SlSL4基因在处理1h和24h的叶片中的表达量明显 高于对照组，但在处理6h和12h叶片中的表达量与对照组无显著差异，结果说明 ABA处理可能导致SlSL4基因表达升高，SlSL4可能与ABA途径相关。

(3)SA处理(如图2c所示)：SlSL4基因在处理1h的叶片中的表达水平稍高于对 照组，但但随着处理时间加长(6h-24h)，该基因在处理叶片中的表达水平与对照组 无差异，结果说明SA处理不影响SlSL4基因表达，SlSL4可能不参与SA调控途径。

(4)JA处理(如图2d所示)：同SA处理结果相同，该基因在处理1h的叶片中的 表达水平稍高于对照组，但但随着处理时间加长(6h-24h)，该基因在处理叶片中的 表达水平与对照组无差异，结果说明JA处理不影响SlSL4基因表达，SlSL4可能不 参与JA调控途径。

(5)GA处理(如图2e所示)：SlSL4基因在GA处理的叶片中表达量极低,结果说明 该基因可能对GA不敏感，GA处理不影响SlSL4基因表达，SlSL4可能不参与GA 调控途径。

上述结果表明SlSL4基因可能参与乙烯和脱落酸调控途径而对赤霉素、茉莉酸 和水杨酸不敏感。

实施例2番茄SlSL4基因超表达载体的构建

1实验材料和试剂

1.1材料

植物材料：野生型番茄AC⁺⁺(SolanμM Lycopersicon Mill.cv.Alsa Craig)

载体及菌株：PVCT2024质粒，pHANNIBAL质粒，pVCT2020质粒，大肠杆 菌DH5a，农杆菌LBA4404。

1.2实验方法

SlSL4基因超表达载体选用植物双元表达载体PVCT2024为骨架，通过分析载 体的多克隆位点以及酶切位点，我们选择了BamHI和SacI作为表达载体的内切酶 位点，然后通过设计带有相同酶切位点的目的基因片段插入表达载体相应的多克隆 位点中，完成表达载体的构建。

(1)SlSL4基因超表达片段的克隆

①引物设计

将之前鉴定正确的SlSL4基因片段设计带有BamHI和SacI限制性内切酶酶切 位点的引物，然后通过PCR扩增克隆出SlSL4基因超表达片段。根据PVCT2024 载体的限制性内切酶位点和基因启动方向，扩增引物设计如下：

(注：单下划线为BamHI限制性酶切位点；双下划线为SacI限制性酶切位点；酶切位点前 为保护碱基。)

②SlSL4基因超表达片段的PCR扩增

PCR扩增方法体系、程序以及琼脂糖凝胶电泳检测同2.2.3。

(2)PVCT2024-SlSL4载体构建

①PVCT2024载体和SlSL4基因超表达片段的酶切

将PVCT2024载体质粒和上述获得的SlSL4基因超表达片段用BamHI和SacI 酶切，酶切体系如下：

37℃酶切30min，取5μl酶切产物进行凝胶电泳检测，经凝胶成像系统观察结果，结果与目标条带大小一致则将剩余酶切产物回收纯化。

②连接酶切产物

使用T4连接酶(Takara)对上述纯化产物(SlSL4基因超表达片段及PVCT2024 载体质粒酶切纯化产物)进行连接，连接体系如下：

16℃过夜连接。

③大肠杆菌DH5a感受态的制备

a.将大肠杆菌DH5a的菌株接种于LB液体中培养至OD₆₀₀到0.3-0.5之间；

b.4℃,6000rpm离心5min，弃上清；

c.用原菌液体积1/10的TSB重悬菌体，冰上静置10min；

d.用1.5ml无菌离心管分装重悬液，每管60μl，液氮速冻，放-70℃备用。

④连接产物转化大肠杆菌DH5a

a.将上述10μl连接产物、5×KCM溶液10μl、双蒸水30μl，轻柔混匀后加入 60μl感受态中，轻柔混匀，立即放置冰上20min；

b.37℃热激5min；

c.加入500μlLB液体，37℃，225rpm摇床培养1h；

d.6000rpm离心5min，留取150μl上清(其余上清丢弃)，重悬菌体；

e.取100μl重悬菌液涂布于加有50μg/ml Kan的LB平板上，37℃烘箱倒置过 夜培养直至长出菌落。

⑤阳性克隆的PCR鉴定及测序

菌落PCR扩增引物设计如下：

SlSL4-F2：5'-ATGAAGATGCTCGATACACAACATTTTCA-3'

SlSL4-R2：5'-GGAGGTGCTTGTGTAGAGGAAGAAAC-3'

⑥阳性重组质粒的提取：

(1)将上述测序正确的剩余菌液加入到1.5mL离心管中，12,000rpm 离心1min，尽量吸除上清。

(2)向留有菌体沉淀的离心管中加入250μl溶液P1(已加入RNase A)，使用移液 器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。

(3)向离心管中加入250μl溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。

(4)向离心管中加入350μl溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时 将出现白色絮状沉淀。12,000rpm离心10min。

(5)将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)，注意尽量不要吸出沉淀。12,000rpm离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附 柱CP3放入收集管中。

(6)向吸附柱CP3中加入600μl漂洗液PW(请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。

(7)重复操作步骤6。

(8)将吸附柱CP3放入收集管中,12,000rpm离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。

(9)将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加100μl洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12,000rpm离心2min将质粒溶液收集到离心管中。 保存于-20℃备用。

实施例3超表达载体在控制呼吸跃变型果实成熟进程

将实施例2制备的超表达载体将构建好的超表达载体转化到根癌农杆菌 LBA4404中，通过农杆菌介导的遗传转化法，再经过Kan抗性基因筛选出具抗性的 愈伤组织，诱导愈伤组织分化出芽，诱导再生植株生根，最终培育出抗性植株，对 转基因植株进行阳性株系筛选，得延迟成熟的转基因番茄植株。

阳性株系成熟特性分析：将生长健壮的转基因植株和野生型植株(非转基因对照)，分别种植，记录其果实达到成熟的时间，检测果实成熟相关指标(包括果实 呼吸速率、果实乙烯释放速率和果实硬度等)，从而验证超表达SlSL4基因干涉转基 因番茄的果实成熟显著延迟。

实施例4番茄SlSL4基因在番茄果实成熟过程中的功能分析

1实验材料

植物材料：SlSL4基因超表达和野生型番茄AC⁺⁺不同株系和不同成熟时期的果 实样品；

质粒：酵母双杂交载体pGBKT7、pGADT7；

菌株：酵母菌株Y187和Y2HGold，大肠杆菌DH5a。

2实验方法

2.1 SlSL4基因转基因番茄果实成熟表型观察

为了标定番茄果实的成熟进程，从番茄花开始授粉起计算为果实成长天数。番 茄果实成熟过程有明显的果形和颜色变化，我们用番茄花授粉天数(days afterpollination,dpa)区分果实成熟不同阶段。野生型番茄AC⁺⁺果实从结果到果实变黄 再到完全成熟，我们分别采取了以下5个时期的果实样品：

IMG(Immature green)时期取样22dpa；MG(Mature green)时期取样30dpa， 此时果实大小确定不再生长，果实颜色无明显变化；B(Breaker)时期取样35dpa， 此时果实颜色开始由绿变黄，果实开始进入成熟期；进入成熟期的果实B+4(4days after B)时期取样38dpa；B+7(7days after B)时期取样41dpa。将野生番茄不同时期 果实样品作为对照，在相同时间段观察转基因番茄果实与野生型果实的不同点，观 察时至少保证有3个株系样品具有一致的表型，取样时要收集3个表型一致的生物 重复。

2.2 SlSL4基因超表达转基因番茄果实乙烯合成相关基因检测

提取SlSL4基因超表达转基因及野生型番茄果实成熟不同时间点 (22dpa,30dpa,35dpa,38dpa,41dpa)的果实RNA，并反转录成cDNA；将获得的cDNA 作为模板，并利用qRT-PCR检测番茄果实中乙烯合成基因表达量的变化。

2.3 SlSL4基因超表达转基因番茄果实乙烯响应基因检测

提取SlSL4基因超表达转基因及野生型番茄果实成熟不同时间点 (22dpa,30dpa,35dpa,38dpa,41dpa)的果实RNA，并反转录成cDNA；将获得的cDNA 作为模板，并利用qRT-PCR检测番茄果实中乙烯响应基因表达量的变化。

2.4 SlSL4基因超表达转基因番茄果实其他果实成熟相关基因检测

提取SlSL4基因超表达转基因及野生型番茄果实成熟不同时间点 (22dpa,30dpa,35dpa,38dpa,41dpa)的果实RNA，并反转录成cDNA,具体方法同2.2.1 和2.2.2；将获得的cDNA作为模板，并利用qRT-PCR检测番茄果实中果实成熟相 关基因表达量的变化。

3结果与分析

3.1 SlSL4基因超表达转基因番茄表型观察

通过对转基因番茄及野生型番茄开花天数的标记，将生长天数相同的番茄果实进行表型观察。

野生型番茄AC⁺⁺的果实在授粉35天时已开始由绿转黄进入破色期，在授粉38 天时番茄果实已变成红色；而授粉天数相同的超表达番茄果实在35天时果实依然为 绿色，直到38天时才开始进入破色期，直到41天时基本变成红色。这些说明了SlSL4 超表达番茄果实的成熟较野生型果实成熟明显推迟，表明了SlSL4基因表达影响番 茄果实的成熟。

3.2 SlSL4基因超表达转基因番茄果实中乙烯合成相关基因的检测

激素表达模式分析结果显示乙烯可以降低SlSL4基因的表达，而SlSL4基因超 表达后推迟了番茄果实成熟，说明SlSL4可能是果实成熟的负调控因子。为了进一 步明确SlSL4基因影响果实成熟的分子机理，我们检测了果实乙烯合成基因的表达 水平(图3)。实验结果显示，SlSL4基因超表达果实中的乙烯生物合成相关基因 ACO1(图3a)、ACO3(图3b)和ACS2(图3c)基因的表达量与野生型果实相比显著降 低，表明超表达转基因番茄中由于SlSL4基因表达水平的变化可能使乙烯生物合成 相关基因ACO1、ACO3和ACS2基因的表达水平受到影响，而这些基因表达水平 的变化可能会调控乙烯的合成改变最终影响番茄果实的成熟。

3.3 SlSL4基因超表达转基因番茄果实中乙烯响应基因的检测

上述结果表明SlSL4基因与乙烯合成相关基因存在调控关系。而乙烯响应基因 同样与番茄果实成熟过程密切相关，因此为了研究SlSL4基因是否与乙烯响应基因 相互关联，我们检测了SlSL4基因超表达果实中乙烯响应基因的表达水平，实验结 果显示(图4)，SlSL4基因超表达果实中乙烯响应基因的表达水平发生的显著的变 化，乙烯响应基因E4(图4a)、E8(图4b)、ERF1(图4c)和Pti4(图4d)的表达量相 较于野生型果实中的表达量明显下降，表明超表达转基因番茄中由于SlSL4基因表 达水平的变化使得乙烯响应基因E4、E8和ERF1的表达受到影响而发生变化，进 而对番茄果实成熟产生影响。

3.4 SlSL4基因超表达转基因番茄果实中其他果实成熟相关基因的检测

上述结果中SlSL4基因对乙烯生物合成及响应相关基因都有一定的调控作用， 因此我们又检测了编码八氢番茄红素的合成酶的PSY1基因(内胡萝卜素合成中的 关键酶基因)、乙烯上游基因RIN和调控果实成熟的TAGL1基因在SlSL4转基因番 茄中的表达水平。实验结果显示(图5)：由图5a发现在转基因番茄成熟前PSY1 基因的表达相较于野生型受到明显抑制，相反果实成熟后PSY1基因的表达水平上 调，说明SlSL4基因可能参与番茄中内胡萝卜素的合成；由图5b发现转基因番茄 果实中RIN基因的表达水平相较于野生型受到明显抑制，说明SlSL4基因可能和 RIN基因间存在调控作用；由图5c发现TAGL1基因的表达水平在SlSL4转基因番 茄和野生型番茄中并无显著性差异，说明SlSL4基因可能不调控TAGL1基因的表 达。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照 较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本 发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围， 其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

<110> 西南大学

<120> SlSL4基因在调控番茄果实成熟中的应用

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 498

<212> RNA

<213> 番茄(Lycopersicon esculentum Mill.)

<220>

<223> SlSL4

<400> 1

atggtcaaaa tagaaaatga agatgctcga tacacaacat tttcaaagcg tcgatcaaca 60

ttatataaaa aagctagtga attggttgga aaatacgatg ttgatgtggg gataacatta 120

ttttctccga ctgataaacc ctactctttt tttcacccta cagttgatgt tgttgttgat 180

cgtattctca atccaaatac acagccaagt gaagataaca gcatcgcgat tgcaagttat 240

cgaaacaaag tgaaggatca aaaagttgag cttgacgagc ttgatatcat agaaagaggt 300

atatctaatt cgacatttgg cactaaggaa actaacatga aaaatatatg ggaatccttt 360

atgaaattta atgaagatga ggtgaatgaa ctcgagcttt ggctgaactc tattgatttt 420

gatttgaaaa attatttatc gcagctggaa aataatgttt cttcctctac acaagcacct 480

ccaaaaaatg ttggttag 498

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> SlSL4正向引物

<400> 2

ttctcaatcc aaatacacag cc 22

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> SlSL4反向引物

<400> 3

aatcaataga gttcagccaa ag 22

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> SlCAC正向引物

<400> 4

cctccgttgt gatgtaactg g 21

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213>

<220>

<223> SlCAC反向引物

<400> 5

attggtggaa agtaacatca tcg 23

Claims (4)

1.SlSL4基因在调控番茄果实成熟中的应用，其特征在于，所述SlSL4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，SlSL4基因在番茄中表达量随着果实发育逐渐升高，在果实破色期表达量达到最高，在果实成熟过程中其表达量又降低。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，SlSL4基因通过调控番茄果实成熟相关基因的表达来调控番茄果实的成熟，所述番茄果实成熟相关基因包括ACO1，ACO3，ACS2，E4，E8，ERF1。

4.一种控制番茄果实成熟进程的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）超表达载体的构建：将SlSL4基因片段通过PCR扩增克隆出SlSL4基因超表达片段，通过限制性内切酶双酶切SlSL4基因超表达片段和载体，然后将酶切后的目的片段和载体片段通过T4连接酶进行连接，获得超表达载体，所述SlSL4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

2）将构建好的超表达载体转化到根癌农杆菌LBA4404中，利用农杆菌介导的遗传转化法转化番茄植株，利用荧光定量PCR技术（qRT-PCR）筛选SlSL4基因超表达株系，得延迟成熟的转基因番茄植株。

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