CN108588092B

CN108588092B - 一种梨花色素苷合成转录因子PbMYB109及其应用

Info

Publication number: CN108588092B
Application number: CN201810771000.XA
Authority: CN
Inventors: 张勇; 程丽娟; 汤浩茹; 陈清; 罗娅; 孙勃; 王小蓉; 马旭辉; 孔令灵
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2018-07-13
Filing date: 2018-07-13
Publication date: 2021-06-29
Anticipated expiration: 2038-07-13
Also published as: CN108588092A

Abstract

本发明公开了一种梨花色素苷合成转录因子PbMYB109及其应用。该转录因子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。通过农杆菌介导遗传转化方法将PbMYB109基因瞬时转化梨果实和稳定转化拟南芥，对获得的转基因植株进行表型鉴定，结果显示与野生型相比转基因拟南芥在在莲座叶、种荚和主茎上都出现了明显的花色素苷积累，表明本发明克隆的PbMYB109基因是一个全新的参与花色素苷合成的转录因子，能够促进花色素苷的合成；该转录因子的发现，为探究花色素苷合成途径和改善果实品质基因工程提供了重要的基因资源。

Description

一种梨花色素苷合成转录因子PbMYB109及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种从‘红早酥’梨（Pyrus bretschneideri Rehd）果实中分离、那个得到一个编码花色素苷合成转录因子PbMYB109，还涉及一种梨花色素苷合成转录因子PbMYB109基因在调节花色苷合成方面的应用。

背景技术

花色素是植物中普遍存在于液泡中的的水溶性色素，在植物果实、花和叶等部位中一般以花色素苷的形式存在。花色素苷广泛存在于植物中，花、叶、茎、果实等多个植物器官中都有花色素苷的积累。花色素苷的积累使植物呈现出多种多样的色彩，能够吸引昆虫的授粉并利于种子的形成和传播。同时花色素苷的积累量也是判断果实品质、成熟度和采收时间的重要指标。一般而言，梨的果皮色泽可以具体分为三种：绿色、褐色及红色，研究发现其中花色素在红色果皮的梨品种中积累量最高。对果实外观品质评价的重要指标之一就是颜色，色泽鲜艳的果实受到市场的欢迎。但目前亚洲的主栽品种通常都是绿色或者褐色，所以近年来红皮梨的育种和栽培已经成为了亚洲尤其是中国的梨产业一种主流趋势。相关研究报道MYB类转录因子家族调节花色素的生物合成中起着重要的作用，因此研究该基因家族有助于了解花色素苷合成基因调控的分子机制，为利用基因工程的手段改善果实品质的研究提供新的基因资源。

植物体中的花色素一般积累到液泡中，其合成需要前体物质并受到由结构和调控基因的控制。花色素苷的生物合成受到多个结构基因编码酶的控制：查尔酮异构酶(CHI)、黄酮合成酶(CHS)、黄酮三羟化酶(F3H)、苯丙氨酸氨裂解酶(PAL)、二氢黄酮醇四还原酶(DFR)、花色素合成酶(ANS)和黄酮糖基转移酶(UFGT)。前人的研究中已经发现，不同物种中的花色素苷生物合成是在多因素共同作用和影响下的复杂过程。相关研究报道其有以下几个特点：大多数调控基因都不仅仅调控一个结构基因，大多数情况下调控因子可以调节花色素苷合成中的多个结构基因；在植物中不同品种、不同组织、不同发育阶段中，花色素苷结构基因的作用并不相同；不同的植物中，对花色素苷生物合成起着关键作用的结构基因也不相同；大多数物种中花色素苷的合成是由多个花色素苷合成途径中的结构基因协同调控的；在某些物种中，花色素苷合成途径中的结构基因在不同组织中会出现特异性表达。

调控基因通过编码转录因子来控制着结构基因的时间和空间表达。在众多研究中，转录因子(TFs)在高等植物花色素生物合成途径的调控中扮演着重要的角色，同时前人的研究也证实了这些控制花色素生物合成的调节复合体的成员在所有高等植物中都是保守的。转录因子（TFs）在细胞核中通过对目的基因转录的激活和抑制来调控其表达水平。根据DNA结合域的结构特征可以将转录因子的划分为MYB蛋白、NAC蛋白、bZIP蛋白、bHLH蛋白等多个转录因子基因家族。转录因子家族中都存在着大量的家族成员，它们的功能包括调控植物的生长发育、逆境调控和代谢等各个生物过程等。众多的转录因子家族研究中，MYB转录因子家族被证明对花色素的转录调节中起着重要作用。研究发现，在MYB 类转录因子的序列上包含一段高度保守的DNA结合区，即是MYB DNA-binding domain。MYB 转录因子的结构域在N端区域是高度保守的，且MYB转录因子的结构域由一到三个不等的R结构组成。在近年来的研究中，越来越多的蔷薇科的果树中的R2R3-MYB成员被证明参与了植物的花色素苷合成调控。在苹果中，一种R2R3型MYB转录因子MdMYB1从‘Cripps’s Pink’果皮中分离出来，MdMYB1在转入拟南芥愈伤组织后可以诱导花色素苷的合成。并且MdMYB1在红色果皮的苹果中的表达量显著高于非红果皮中的表达量，并且在红色果皮品种中当被套袋的果实解除套袋后，伴随着果皮中花色素苷积累量增加，MdMYB1的表达量也随之上升。

目前有关植物果实色泽受到MYB转录因子的调控，梨中一些MYB转录因子的功能已经得到了初步研究，但大部分MYB是否对梨果实色泽中花色素生物合成有影响还有待探明，也未见PbMYB109基因参与花色素苷合成的报到。

发明内容

针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种梨花色素苷合成转录因子PbMYB109及其应用，本发明筛选得到了一个可能参与花色素苷合成的MYB基因PbMYB109，通过对该基因的功能研究，以期对梨中花色素苷的调控机理有深入的认识，进一步为梨的品质改良和育种提供理论基础。

为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种梨花色素苷合成转录因子PbMYB109，该转录因子PbMYB109的编码序列如SEQID NO.1所示或SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个核苷酸，且能编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。

其中，序列表SEQ ID NO.1从梨中分离克隆得到，码区序列(CDS) 长度为1086bp，编码361 个氨基酸残基。

编码的蛋白分子量为336396.86KD，等电点为7.32；并且在33-130个氨基酸的位置上有两个保守的MYB DNA-binding domain，属于R2R3-MYB转录因子。

包含上述梨花色素苷合成转录因子PbMYB109基因的质粒。

包含上述梨花色素苷合成转录因子PbMYB109基因的重组表达载体。

包含上述梨花色素苷合成转录因子PbMYB109基因的转基因细胞系

包含上述梨花色素苷合成转录因子PbMYB109基因的工程菌。

上述PbMYB109基因在促进植物器官花色素苷合成过程中的应用。

本发明的有益效果为：

本发明利用转基因技术得到花色素苷积累的植株，突破了传统育种手段的障碍，为探究花色素苷合成途径和改善果实品质基因工程提供了重要的基因资源。

本发明克隆的PbMYB109基因是一个全新的参与花色素苷合成的转录因子，PbMYB109可以通过诱导花色素苷合成途径中的结构基因表达从而促进花色素苷的合成；该基因的发现，为探究花色素苷合成途径和改善果实品质基因工程提供了重要的基因资源。

附图说明

图1为本发明克隆的PbMYB109基因和拟南芥中MYB成员的系统发育树；

图2为本发明通过瞬时表达后果实花色素苷生物合成相关基因的表达特性；

图3为本发明转基因拟南芥和野生型的表型；其中，1为野生型植株主茎；2为转基因植株主茎；3为野生型植株叶片；4为转基因植株叶片。

图4为本发明转基因拟南芥和野生型的花色素苷含量；其中，1为野生型植株主茎；2为转基因植株主茎；3为野生型植株叶片；4为转基因植株叶片。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列；

实施例1 PbMYB109基因的克隆和序列对比

1、设计引物

通过文库筛选及引物设计得到克隆引物；其具体序列如下：

Clone -F1：5’-ATGACGGCCCCAAACGACG-3’；（SEQ ID NO.2）

Clone -R1：5’-CTAGGTAGTGGCAGCTGCTTGAAAG-3’。（SEQ ID NO.3）

2、PCR反应扩增

PCR扩增反应体系包括：2µL的Primer F（10mmol·L^-1）、Primer R（10mmol·L^-1）、Template cDNA、29µL的ddH₂O、10µL的5×TransStart FastPfu Fly Buffer、4µL的2.5mMdNTPs、1µL 5×TransStart FastPfu Fly DNA Polymerase；PCR反应条件为：95℃预变性2min，95℃变性20s，60℃退火2s，72℃延伸2s，40个循环，最后72℃终延伸10min。

3、纯化回收

然后取5µL PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，采用生工生物工程（上海）有限公司的SanPrep柱式PCR产物回收纯化试剂盒，参考药品说明书回收特异条带。

4、连接

采用全氏金公司的连接试剂盒，将回收得到的产物与载体pEASY@-Blunt SimpleCloning Vector(全氏金)连接；连接反应体系包括供体DNA片段4µL，pEASY@-Blunt SimpleCloning Vector 1µL。

然后采用热击法（参照《分子克隆实验手册》第三版，科学出版社，2002）转化大肠杆菌，在含有50mg/l氨苄霉素的LB固体平板中筛选阳性克隆，挑取10个阳性克隆测序（由上海生工生物技术有限公司完成）。测序结果表明，本发明扩增的目的片段长度为1086bp，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示，通过序列比对分析，确定该序列是本发明需要的目的基因PbMYB109。

从‘红早酥’中克隆得到的PbMYB109基因，该基因全长1086bp，编码361个氨基酸，其分子质量估算为336396.86Da，等电点为7.32；通过系统建树与拟南芥中的MYB成员对比后发现PbMYB109与AtMYB109归属同一分支（见图1）。

实施例2 PbMYB109的瞬时表达

1、引物设计

在已经克隆得到的PbMYB109基因的序列两端设计一对引物，引物序列为：

Prime-F：5’-GGCCGGTACCATGACGGCCC-3’ ；（SEQ ID NO.4）

Prime-R：5’-CGGGATCCCTAGGTAGTGGCAGC-3’ ；（SEQ ID NO.5）

2、PCR扩增

根据对序列的分析，表达载体pCambia1301-35SN具有酶切位点BamHⅠ和KpnⅠ，通过PCR扩增，在目的基因的前后分别引入需要的酶切位点；该PCR扩增的反应体系包括：1.5µLPrimer F（10 mmol·L^-1）、1.5µL Primer R（mmol·L^-1），2µL Template cDNA、32µL ddH₂O、10µL 5× Prime STAR Buffer(Mg2+Plus)、4µL dNTP；PCR反应条件为98℃预变性2min, 98℃变性10s，58℃退火5s，72℃延伸1min，35个循环，最后72℃终延伸5min。

3、纯化回收

然后取5µL PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测并纯化回收，最终获得带有酶切位点的目的基因，再将目的基因与空载PCAMBIA1301-35SN连接转化大肠杆菌后提质粒，将目的片段用BamHⅠ和KpnⅠ这两个限制性内切酶进行双酶切；其中，酶切体系包括：5µLCutSmart Buffer、1µL BamH I、1µL lKpn I、1ng的目的基因/pCambia1301-35SN，最后用ddH₂O补足至50µL。

4、连接

收集酶切产物，并在1.0%琼脂糖1×TAE电泳缓冲液中电泳检测是否全完切开，再使用胶回收试剂盒并进行回收纯化，然后将目的基因和过表达空载(PCAMBIA1301-35SN)相连接，载体连接反应体系包括：1µL载体酶切回收产物、7µL PbMYB109酶切回收产物、1µLT4DNA连接酶和T4DNA连接 Buffer。

5、瞬时表达

然后进行连接产物转化与重组子筛选，并采用PCR技术对阳性克隆检测；其中，PCR反应体系包括：1.5µL菌液、1µL PbMYB109-F、1µL M13-R、12.5µL 2×Taq PCR MasterMix、9µL ddH₂O；并参考LIU等人的方法进行瞬时表达，使用1mL的注射器吸取800-900µL的侵染液注射进入新鲜的‘早酥’梨果皮中，侵染每隔一天进行一次，共侵染三次；注射侵染液后的‘早酥’梨避光放置24h，然后储存于湿度为90%，温度为20℃的培养箱中，并使其每天光照9h，15天后采集果皮保存于-80℃。

6、设计引物

使用引物设计软件Beacon Designer 7合成花色素生物合成基因PbPAL、PbCHS、PbCHI、PbF3H、PbDFR、PbANS以及PbMYB109的引物，选择Action基因（CN938023）作为内参基因，上述引物的具体序列如下：

PbPAL-F：5’-GAAGTGCTACAGAATCAG-3’；（SEQ ID NO.6）

PbPAL-R：5’-GGACTTACATTTCACCTT-3’；（SEQ ID NO.7）

PbCHS-F：5’-CAACTTGGACTCTACTTG-3’；（SEQ ID NO.8）

PbCHS-R：5’-CCTCTATTCTCTTCACAC-3’；（SEQ ID NO.9）

PbCHI-F：5’-GTTCAACAGTTCGGATAA-3’；（SEQ ID NO.10）

PbCHI-R：5’-CAAGAAGAAGATGAGCAA-3’；（SEQ ID NO.11）

PbF3H-F：5’-CTTTATCTCCACTTTGTCT-3’；（SEQ ID NO.12）

PbF3H-R：5’-CATTATGGCATCATCAAG-3’；（SEQ ID NO.13）

PbDFR-F：5’-CAAGTTCGTGAATTGTAG-3’；（SEQ ID NO.14）

PbDFR-R：5’-GTCCAGGAGCATCAACAG-3’；（SEQ ID NO.15）

PbANS-F：5’-CCTCGGTAAGATTCAAG-3’；（SEQ ID NO.16）

PbANS-R：5’-TTGCCTCAATGTAATCAG-3’；（SEQ ID NO.17）

PbMYB109-F：5’-CCAGGTAGAACAGATAAC-3’；（SEQ ID NO.18）

PbMYB109-R：5’-AGTCTTGAATGAACTGATAT-3’；（SEQ ID NO.19）

Pbactin-F：5’-CCATCCAGGCTGTTCTCTC-3’；（SEQ ID NO.20）

Pbactin-R：5’-GCAAGGTCCAGACGAAGG-3’；（SEQ ID NO.21）

7、实时荧光定量PCR

采用上述引物，以及CFX96 Real-Time PCR Detection System检测仪和SYBR®Premix Ex Taq™ II试剂盒，对基因PbPAL、PbCHS、PbCHI、PbF3H、PbDFR、PbANS以及PbMYB109在‘早酥’梨果实中的表达量进行PCR检测，其检测结果见图2，其中，a、b代表5%差异显著水平；PCR反应体系包括：1µL Primer F（10mmol·L^-1）、1µL Primer R（10mmol·L^-1）、2µL Template cDNA、8.5µL ddH₂O、12.5µL 2×SYBR Premix Ex Taq II；反应条件为95℃预变性30s，95℃变性5s，57℃退火30s，40个循环且每个循环结束后测定荧光，在65℃到95℃熔解中进行连续荧光数据采集用以熔解曲线分析。

如图2所示，在‘早酥’中对PbMYB109进行瞬时表达中发现，PbMYB109能诱导花色素苷合成基因（PbANS、PbCHI、PbCHS、PbF3H、PbDFR和PbPAL）的表达量上调。

实施例3 拟南芥转化

1、配置1L，pH值为5.7的重悬渗透培养液备用，该培养液包括：1/2 MS培养基、500μL Silwet L-77、50 g蔗糖，以及0.5 g MES。

2、构建过表达载体PCAMBIA1301-PbMYB109，然后将其转化至农杆菌中，并将转化后的农杆菌接种于含有1mL培养基的EP管中，培养13h，然后将菌液扩大培养至100mL，继续培养至OD₆₀₀=1.0左右，富集菌体，然后加入适量的重悬渗透培养液重悬菌体至OD₆₀₀约为0.8。

3、准备健康的拟南芥植株，待植株长出顶生花序时将其剪除，然后通过步骤2中培养得到的农杆菌细胞悬液刺激腋生花序的发生，当较多腋生花序生长至1-10cm长时进行转化后收集T1代种子，再将T1代种子无菌播种至选择培养基上，通过逐步PCR筛选培养得到拟南芥小苗后移栽到培养箱中基质培养长大，即T1代植株，最后得到过表达PbMYB109基因的转基因拟南芥植株，使用野生型拟南芥作为对照，并在对获得的转基因植株进行表型鉴定，其结果见图3和图4，图3中，a、b、c、d代表5%差异显著水平；图4中，a、b代表5%差异显著水平；1为野生型植株主茎；2为转基因植株主茎；3为野生型植株叶片；4为转基因植株叶片。

如图3和图4所示，与野生型相比，转基因拟南芥在在莲座叶、种荚和主茎上都出现了明显的花色素苷积累，之后进行的花色素含量测定也肯定这一表型，说明PbMYB109基因确实可以诱导花色素苷的合成与积累。

序列表

<110> 四川农业大学

<120> 一种梨花色素苷合成转录因子PbMYB109及其应用

<160> 21

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1086

<212> DNA

<213> 红早酥梨（Pyrus pyrifolia‘Red Zaosu’）

<400> 1

ctaggtagtg gcagctgctt gaaagactct ctggcttgct acgctctctg gcatcctaat 60

cccattactc tcaaggccac tcttaatcca tgcaatcttg ttcaaatccg tagcaatgga 120

gattaattcg tggctggaga aagggagagg ctcatcatac tcaacgaact caggccccaa 180

caatgagctt tgagaatgcc ccttgactcg atcacagcaa ctgtggccac agcgttgagg 240

aaccataggc tcattgcatg caccgtcaag gaagttgtca aagccgaaat ctagtttagt 300

tattgggacc aaagggccat gacttgggac tgtccttgaa aaagatgaag catttgctgg 360

accacttgga cggttataag cactaaaagc actaacacgt gccactggac gacaagtggt 420

ggactggaga gttggatggt cacttggctc ggcaataaga gtagaattgt gctttgattc 480

ggcagtgcca gaaccctcct ttgcatgatt tcttacgtcg aactggtttg gtctattttc 540

catcaagacc tctcttcctt catgagtctt gaatgaactg atattcccaa ctgacagggt 600

ttcttctgag gatgcatttt ttctgtcaaa ggtgtcatct tccatcgttt ccccatgtcc 660

agtattaaac cttcctttat caaagcactt gcgccttagt gtagaattcc aatggttctt 720

gattccgtta tctgttctac ctggaagaag ctttgcaatt actgcccatt tgttcccatg 780

gatagcatgt gctgaaacta taatacggtc ttcttcctca gaaaagggtt tacgcttgac 840

gcaggggtca agctgattac accacctcag ccggcacgac ttcccagacc gtccgggaat 900

tcctcgggcg atcaggctcc aattcctcgc cccgaagttg cccacgagcc ggctcagcac 960

cgcgtcctcc tcgggcgacc acggtcccct cactttcccg ccgggcactg cgccctcgtt 1020

caactcggcc tcggtgccgg ggcggtcgtc ggcttctttg gggacggcgt cgtttggggc 1080

cgtcat 1086

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgacggccc caaacgacg 19

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctaggtagtg gcagctgctt gaaag 25

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggccggtacc atgacggccc 20

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cgggatccct aggtagtggc agc 23

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gaagtgctac agaatcag 18

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ggacttacat ttcacctt 18

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

caacttggac tctacttg 18

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cctctattct cttcacac 18

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gttcaacagt tcggataa 18

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

caagaagaag atgagcaa 18

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ctttatctcc actttgtct 19

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

cattatggca tcatcaag 18

<210> 14

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

caagttcgtg aattgtag 18

<210> 15

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gtccaggagc atcaacag 18

<210> 16

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

cctcggtaag attcaag 17

<210> 17

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ttgcctcaat gtaatcag 18

<210> 18

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

ccaggtagaa cagataac 18

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

agtcttgaat gaactgatat 20

<210> 20

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

ccatccaggc tgttctctc 19

<210> 21

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

gcaaggtcca gacgaagg 18

Claims

1.一种PbMYB109基因在促进拟南芥器官花色素苷合成过程中的应用，其特征在于，所述PbMYB109基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述器官为莲座叶、种荚和主茎。

2.一种质粒，其特征在于，包含如SEQ ID NO.1所示的PbMYB109基因。

3.一种重组表达载体，其特征在于，包含如SEQ ID NO.1所示的PbMYB109基因。

4.一种工程菌，其特征在于，包含如SEQ ID NO.1所示的PbMYB109基因。