CN114213514B - 上游调控因子IbSCF及其在调控紫心甘薯IbMYB1表达中的应用 - Google Patents

上游调控因子IbSCF及其在调控紫心甘薯IbMYB1表达中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了上游调控因子IbSCF及其在调控紫心甘薯IbMYB1表达中的应用。本发明以紫心甘薯品系“A5”为实验材料，克隆了IbMYB1的启动子序列，通过酵母单杂交文库筛选实验，成功获得了IbMYB1基因的上游调控因子IbSCF。运用酵母单杂交回转实验和双荧光素酶报告系统检测证实，IbMYB1启动子与上游调控因子IbSCF之间存在相互作用。通过酵母双杂交和双分子荧光互补实验，研究了调控因子之间的相互作用，结果显示，IbSCF与IbEBF2存在相互作用。本发明在理论上可以丰富和深化植物花色素苷生物合成分子调控的基础理论，同时还可望为提高紫心甘薯块根中色素含量的栽培措施提供新的思路和线索。

Description

上游调控因子IbSCF及其在调控紫心甘薯IbMYB1表达中的 应用
技术领域
本发明涉及植物遗传与变异的分子机制领域，具体涉及上游调控因子IbSCF及其在调 控紫心甘薯IbMYB1表达中的应用。
背景技术
甘薯是一年生或多年生的旋花科甘薯属根茎类草本植物，是全球最重要的粮食作物之 一，它已经在100多个国家栽植。我国的甘薯种植面积达660万公顷，产量为1亿吨，占世界甘薯总产量的70％。
20世纪90年代，紫心甘薯是由日本培育成功的具有独特遗传性状的甘薯新品种，其块 根中因含有十分丰富的花色素苷而呈深紫色。紫心甘薯植株的株型匍匐，蔓比较长，分枝 位置偏中上，叶片呈现深绿色，须根较多，块茎膨大生长缓慢，而且富含蛋白质和多种氨 基酸。与普通甘薯相比，硒、铁、磷等微量元素的含量高25～30％左右。亩产在1000～1500 公斤，而且抗病性强，适应性广。此外，紫心甘薯最重要的性状是其块根中富含大量的花 色素苷。
目前，在模式植物中对花色素苷的合成代谢途径及其相关的调控因子进行了大量的研 究。研究表明，花色素苷的合成是由一系列结构基因编码的酶催化完成的，而转录因子在 不同时空上的组合调控可以影响这些结构基因的转录水平(R2R3-MYB、bHLH和WD40是参与花色素苷生物合成途径调控的主要转录因子。这三类转录因子可单独调控花色素苷合成途径中相关结构基因的表达，也可以形成蛋白复合体共同调控相关结构基因的表达，进而控制花色素苷在植物中的积累模式。MBW复合物对于后期类黄酮生物合成基因的直接转录调控是必要和充分的。
MYB类转录调节因子存在于所有真核生物中。动物MYB转录因子通常包含三个不完善的MYB重复序列(R1R2R3重复序列)，并包含一小部分由两个或三个蛋白质组成的家 族，这些蛋白质在细胞增殖中起作用。每个重复序列包含52个氨基酸和规则间隔的色氨酸 残基，并且能折叠成与原核生物阻遏物相关的螺旋-转-螺旋变体。大多数植物中的MYB蛋 白含有两个不完善的MYB重复序列，分别与动物MYB蛋白的R2R3 MYB重复序列相对 应。已经证明了几种R2R3 MYB转录因子具有与一种或多种DNA序列结合的序列特异性。 此外，R2R3植物MYB蛋白可能包含一个酸性转录激活域。因此，MYB蛋白可以在调节 植物形态，细胞周期，细胞分化，代谢和胁迫反应等过程中起作用。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于筛选一种促进紫心甘薯IbMYB1表达的上游调控因子。
为了解决上述技术问题，本发明首先用Trizol法从甘薯块根提取RNA，用SMART技术逆转录合成双链的cDNA，构建紫心甘薯酵母单杂交cDNA文库。
进一步的，以紫心甘薯块根DNA为模板，用TaKaRa高保真酶
Figure BDA0003370502850000021
Max DNAPolymerase扩增两端带有不同酶切位点末端的IbMYB1的启动子DNA片段，并将启动子IbMYB1构建到pAbAi载体中，扩增IbMYB1的启动子DNA片段的PCR引物对的具体序 列如下所示：
PIbMYB1-F：5'-TATTGCTCTCAATGTGCAAGAATCA-3'和
PIbMYB1-R：5'-TTTGATACGCATACCTTATGCCTAA-3'。
构建的pAbAi-PIbMYB1诱饵载体经过自激活检测后，确定其自激活AbA最低抑制浓度为300ng/mL。
本发明其次将诱饵菌株制成Y1HGold感受态细胞，把文库质粒转入pAbAi-PIbMYB1感受态细胞中，通过酵母单杂交筛库对结合蛋白进行筛选，筛选得到了紫心甘薯IbMYB1 基因表达的上游调控因子为IbSCF。
因此，本发明的第一个目的是提供一种紫心甘薯IbMYB1转录因子的上游调控因子IbSCF，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明的第二个目的是提供一种上述的上游调控因子IbSCF的编码基因，该编码基因 的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明的第三个目的是提供一种含有上述的编码基因的重组载体或重组菌。
本发明的第四个目的是提供一种上述的上游调控因子IbSCF的扩增引物，该扩增引物 的具体序列如下所示：
IbSCF-F：5'-ATGAAGCGGCCCCATACTTCCGACG-3'和
IbSCF-R：5'-TCACGTTTGTTTGTGACGATTACTGGAA-3'。
本发明的第五个目的是提供上述的上游调控因子IbSCF在促进紫心甘薯IbMYB1转录 因子表达中的应用。
本发明的第六个目的是提供上述的上游调控因子IbSCF在促进植物花色素苷生物合成 中的应用。
本发明的第七个目的是提供上述的上游调控因子IbSCF在植物高花色素苷品种选育中 的应用。
进一步的，所述的植物为紫心甘薯。
本发明人通过酵母单杂交的方法从cDNA文库中筛选出促进IbMYB1表达的上游调控 因子包括IbEBF1、IbSCF和IbWRKY1，但是不同上游调控因子的作用位点不同。IbMYB1 启动子分成四段，第二和第三段具有控制不住的自激活活性，其中IbSCF和IbWRKY1作 用位点在第一段(位于启动子的前面)，而IbEBF1作用位点在第四段(位于启动子的后面)。
进一步的，为了进一步验证筛选出来的上游调控因子IbSCF与启动子IbMYB1结合，将IbSCF构建到pGADT7酵母重组表达载体，选择载体中EcoRⅠ和BamHⅠ作为目的片 段插入的酶切位点，合成引物序列见表2。将pGADT7-IbSCF酵母重组表达载体质粒与 pAbAi-PIbMYB1诱饵载体共同转化Y1HGold酵母中进行酵母单杂交实验，结果发现：阳 性对照p53AbAi+AD53转化的菌株在SD/-Leu/AbA培养基上能够生长，而阴性对照 pAbAi-PIbMYB1+pGADT7空载转化的菌株不能在SD/-Leu/AbA培养基上生长。说明该酵 母单杂交实验能够有效检测蛋白是否结合在启动子上。而pAbAi-PIbMYB1+pGADT7- IbSCF在SD/-Leu/AbA培养基上能够生长(图1)，说明IbSCF蛋白能结合在启动子IbMYB1 上。
本发明再次检测了上游调控因子IbSCF是否具有自激活活性，构建pGBKT7-IbSCF融 合表达载体，构建成功后将融合表达载体转入酵母Y2HGold，将转化后的菌液均匀涂布在 色氨酸缺陷培养基上生长，挑取阳性单克隆点在组氨酸缺陷培养基上培养，结果显示pGBKT7-IbSCF转化的酵母菌株能在组氨酸缺陷培养基上生长，并能使X-α-Gal显现蓝色(图2)。说明IbSCF蛋白具有自激活活性。
进一步的，为了验证启动子IbMYB1与其上游转录因子IbSCF的相互作用，本发明将IbSCF构建到过表达载体pGreenII 0029 62-SK上，将PIbMYB1插入到载体pGreenII 0800-LUC荧光素酶的前端作为报告质粒，选择pGreenII 0029 62-SK载体中Sac I和Xho I 及pGreenII 0800-LUC载体中的Kpn I和Nco I作为插入目的片段的酶切位点，构建载体引 物序列见表2。将测序成功的重组菌液提取质粒后与PIbMYB1+pGreenII0800LUC重组质 粒共同转入拟南芥原生质体中。结果显示IbSCF能够提高IbMYB1启动子的活性(图3)， 说明IbSCF能够促进IbMYB1的表达。
进一步的，为了明确上游调控因子IbSCF的功能，本发明构建了IbSCF与绿色荧光蛋 白(GFP)的融合蛋白，对IbSCF的作用场所进行定位。亚细胞定位载体是C17GFP，根 据载体和互作蛋白的关键位点选择限制性内切酶，用SmaI进行单酶切。设计包含起始密码 子而去掉终止密码子的特定引物，构建C17GFP亚细胞表达载体上，并通过转化拟南芥原 生质体瞬时表达蛋白，观察目的基因蛋白的亚细胞定位。合成引物序列见表2，空载中的 GFP蛋白能够在拟南芥原生质体的各个结构中表达，IbSCF蛋白在细胞核中表达(图4)， 表明IbSCF是一个典型的转录因子。
此外，本发明人通过酵母单杂交的方法成功从cDNA文库中筛选出启动子IbbHLH2和 IbWD40的上游调控因子IbEBF2。所述上游调控因子IbEBF2的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
进一步的研究了IbEBF2和IbSCF的相互作用，将IbEBF和IbSCF与pGBKT-7载体连接进行毒性检测，观察pGBKT-7-上游调控因子载体与pGBKT-7空载载体在SD/-Trp培养基上单克隆菌落的生长情况，结果显示实验组和对照组单克隆菌落在数量和大小上无明显差异(图5)，说明pGBKT-7-上游调控因子载体对酵母没有毒性。
运用酵母双杂交检测上游调控因子之间的相互作用，将具有自激活活性的上游调控因 子IbEBF2与pGADT-7连接构建重组载体，IbSCF的与pGBKT-7连接构建重组载体，进行酵母双杂交实验检测其相互作用，结果显示，IbEBF2与IbSCF存在相互作用(图6)。
进一步的，本发明运用双分子荧光互补实验对酵母双杂交检测结果进行验证，以检测 上述IbEBF2与IbSCF蛋白在植物细胞中是否存在相互作用。将IbEBF2与EYFP蛋白N端融合，IbSCF与EYFP蛋白C端融合，然后将带EYFP蛋白N端的融合质粒和带EYFP蛋 白C端的融合质粒共转化到拟南芥原生质体中进行表达。
GFP荧光蛋白在拟南芥原生质体里面呈现组成型表达，在整个原生质体中都有表达， IbEBF2-nYFP+cYFP和nYFP+IbSCF-cYFP分别转到拟南芥原生质体中都没有检测到荧光信 号，说明这2个蛋白与空载并没有相互作用，而共转到拟南芥原生质体后能够检测到明显 的荧光信号，IbEBF2-nYFP+IbSCF-cYFP荧光信号在细胞核内(图7)，说明在细胞核中IbEBF2蛋白与IbSCF蛋白可发生相互作用，两者可以形成复合物共同调控基因的表达。
本发明的有益效果在于：通过酵母单杂交文库筛选实验，对启动子IbMYB1的上游调 控因子的筛选中成功获得了其上游调控因子IbSCF。此发明结果在理论上可以丰富和深化植 物花色素苷生物合成分子调控的基础理论；在应用上可以为紫心甘薯高花色素苷品种选育 提供新的遗传标记，为其分子育种筛选出合适的操作元件或改造靶标，同时还可望为提高 紫心甘薯块根中色素含量的栽培措施提供新的思路和线索。
附图说明
图1为IbMYB1启动子与其上游调控因子IbSCF回转验证结果。阳性对照为 p53AbAi+AD-53，阴性对照为PIbMYB1-pAbAi+AD，阳性菌落(PIbMYB1-pAbAi+ IbSCF-AD)说明相应上游调控因子蛋白(IbSCF)能结合在IbMYB1启动子上，AD：pGADT7。
图2为IbMYB1启动子上游调控因子IbSCF的自激活活性检测。
图3为IbMYB1启动子与其上游调控因子IbSCF的相互作用。
图4为IbMYB1启动子上游调控因子IbSCF在拟南芥原生质体的亚细胞定位(标尺20μm)。
图5为上游调控因子的毒性检测。对照为pGBKT-7，BK：pGBKT-7。
图6为酵母双杂交检测上游调控因子的相互作用。阳性对照为AD-T+BK-53，阴性对照为AD-T+BK-Lam，阳性菌株(AD-IbEBF2+BK-IbSCF)说明相应2个上游调控因子之间 存在相互作用，AD：pGADT-7，BK：pGBKT-7。
图7为双分子荧光互补实验检测上游调控因子在拟南芥原生质体的相互作用(标尺20 μm)。A：绿色荧光图；B：叶绿体自发荧光；C：明场图；D：叠加图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，下述实施例中试验方法如无特殊说明，均为 常规试验方法，下述实施例中所述的实验试剂及耗材如无特殊说明，均来自常规生化试剂 公司。
实施例1：构建紫心甘薯酵母单杂交cDNA文库
(1)用Trizol法从紫心甘薯(品系A5)块根提取RNA，用SMART技术逆转录合成 双链的cDNA。
(2)扩增得到的cDNA要用TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit进行纯 化处理，使dH2O溶出。
(3)对用限制性内切酶SfiI酶切后cDNA进行过柱处理，再经过PCI/CI净化处理，最终使ddH2O溶出。
(4)将pGADT7-SfiI vector(clontech,货号630490)与适量过柱后cDNA用DNAligation Kit连接。纯化精制连接液，得到初级cDNA文库。
(5)通过电转化的方法将少量初级文库连接液转入感受态细胞E.coli HST08；鉴定正 确后，取适量的菌液涂布在含Amp抗性的LB平板上，37℃培养12h；通过平板上生长的菌落个数，计算初级文库库容。
(6)将扩增菌落进行过夜培养，然后进行质粒提取，得到文库质粒。
实施例2：构建pAbAi-PIbMYB1诱饵载体
(1)以紫心甘薯块根DNA为模板，用TaKaRa高保真酶
Figure BDA0003370502850000083
Max DNAPolymerase扩增两端带有不同酶切位点末端的IbMYB1的启动子DNA片段，扩增IbMYB1 的启动子DNA片段的PCR引物对的序列为PIbMYB1-F：5'-TATTGCTCTCAATGTGCAAG AATCA-3'和PIbMYB1-R：5'-TTTGATACGCATACCTTATGCCTAA-3'。反应体系(20μL) 如下：
Figure BDA0003370502850000081
PCR反应条件为：
Figure BDA0003370502850000082
Figure BDA0003370502850000091
(2)将启动子IbMYB1(序列如SEQ ID NO.3所示)构建到pAbAi载体(柯蕾生物科 技有限公司，货号kl-zl-0879)，步骤为：使用TaKaRa限制性内切酶QuickCutTM Hind III 和QuickCutTM SmaⅠ对pAbAi质粒进行双酶切，合成引物序列见表2中的PM1-F/PM1-R， 反应条件为37℃，酶切3h以上，反应体系如下：
Figure BDA0003370502850000092
经电泳检测正确的酶切产物进行切胶回收。
使用Clon Express II One Step Cloning Kit试剂盒(Vazyme)将目的片段和表达载体进 行连接，反应条件为37℃，连接30min。反应体系如下：
Figure BDA0003370502850000093
(3)连接产物用于后续转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。
大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备(CaCl2法)：
(1)接种大肠杆菌DH5α到5mL的LB液体培养基中，在37℃下220rpm振荡培养 过夜。
(2)转移过夜培养的2mL菌液到100mL的LB液体培养基中，继续振荡培养至OD600到0.5左右，冰上放置30min。
(3)取1mL菌液到到新的1.5mL离心管中，4℃，4000rpm离心10min，用移液枪 吸走上清液。
(4)用移液枪吸取1mL预冷的0.1M CaCl2悬浮沉淀，轻吹混匀，冰上放置30min。
(5)4℃，4000rpm离心10min，用移液枪吸走上清液，用移液枪吸取0.2mL预冷的0.1M CaCl2悬浮沉淀，冰上放置5h即可用于转化。
连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞：
(1)取上述制备的大肠杆菌DH5α感受态细胞100μL到新的1.5mL离心管，于超净 工作台中加入10μL的DNA连接产物，轻弹混匀后在冰上放置30min。
(2)将转化产物于42℃水浴锅中热激90s，取出立刻至于冰上5min。
(3)加入1mL不含抗性的LB液体培养基，37℃下180rpm振荡培养60～90min。
(4)室温5000rpm离心4min，在无菌条件下用移液枪吸走900μL上清液，轻吹重悬剩余200μL液体。
(5)将菌液均匀涂布于含有Amp的LB固体培养基中，放置30min晾干。
(6)37℃培养箱倒置培养12～16h。
阳性克隆的筛选与测序鉴定：
从培养皿上用无菌小枪头挑取抗性单菌落于含抗性的LB液体培养基中，37℃，220rpm 振荡培养4h，取2μL上述菌液作为模板进行菌落PCR检测。取PCR反应中扩增得到与目 的片段大小一致的阳性菌种的菌液200μL，送至上海生工生物有限公司进行测序。测序正 确的菌液中加入20％的灭菌甘油于1.5mL离心管中，于-80℃冰箱保存。
实施例3：pAbAi-PIbMYB1诱饵菌株自激活检测
将pAbAi-PIbMYB1诱饵质粒转化Y1H酵母菌，得到诱饵菌株。采用自激活试验测试抑制诱饵菌株的最低AbA浓度，观察它们在SD/-Ura固体培养基上的生长情况，诱饵菌株 自激活检测及最低AbA浓度的确定方法如下：
(1)AbA母液的配制：1mL无水乙醇溶解1mg AbA，配制成1mg/mL的AbA母液， 于4℃下避光保存。
(2)从Y1H[pAbAi-prey]和Y1H[p53AbAi]的培养皿中挑取较大的单克隆菌落， 用10μL的0.9％NaCl溶液重悬菌液，将重悬溶液稀释成10-1、10-2和10-3浓度梯度。
(3)吸取10μL重悬菌液点在SD/-Ura，SD/-Ura/AbA(100ng/mL～1000ng/mL)培养基上。
(4)若在某一浓度下菌落Y1H[pAbAi-prey]不生长，而对照组Y1H[p53AbAi]正 常生长，则此浓度为抑制该重组酵母菌株的最低AbA浓度，可用于后续实验。
注：pAbAi-prey即为pAbAi-PIbMYB1。
经检测，确定pAbAi-PIbMYB1诱饵菌株的自激活AbA最低抑制浓度为300ng/mL。
实施例4：酵母单杂交文库筛选
酵母单杂交文库筛选方法按照Clontech公司Matchmaker Gold Yeast One-Hybrid Library Screening System说明书进行。酵母单杂交文库筛选方法如下：
(1)取25μL Yeastmaker Carrier DNA于95℃水浴5min使其变性，快速置于冰上数分 钟，待温度降至4℃(重复一次)。
(2)在已经预冷的10mL离心管中依次加入：2.5mL PEG/LiAc，25μL变性的Yeastmaker Carrier DNA，15μg文库质粒(实施例1得到)，600μL Y1HGold感受态细胞 (含诱饵表达载体pAbAi-PIbMYB1)，涡旋混匀。
(3)将离心管置于30℃水浴锅中水浴45min，期间每隔15min轻轻倒混数次。
(4)加入160μL DMSO，轻柔混匀。
(5)在42℃水浴中温浴20min，期间每隔10min轻轻倒混数次。
(6)12000rpm离心30s，收集菌液，弃上清，加入8mL 0.9％NaCl溶液，重悬菌体。
(7)吸取200μL转化后的酵母菌液，均匀涂布于SD/-Leu、SD/-Leu/AbA培养皿上，AbA浓度为抑制自激活最低浓度(即300ng/mL)。
(8)30℃培养箱中倒置培养48～96h。
挑取单菌落进行菌落PCR鉴定，鉴定方法参考实施例2，选用通用引物pGADT7F/R对菌液进行PCR检测，pGADT7F/R引物序列见表1，选取电泳后较亮且条带单一的样品送 上海生工生物有限公司测序，测序的结果在NCBI数据库进行BLAST，对测序结果进行分 析。
表1主要载体通用引物
Figure BDA0003370502850000121
Figure BDA0003370502850000131
通过酵母单杂交的方法筛选得到了紫心甘薯IbMYB1基因表达的上游调控因子为IbSCF，该上游调控因子IbSCF的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。并设计了上游调控因子IbSCF的扩增引物为IbSCF-F：5'-ATGAAGCGGCCCCATACTTCCGACG-3'和IbSCF-R：5'-TCACGTTTGTTTGTGACGATTACTGGAA-3'。
实施例5：上游调控因子IbSCF与启动子IbMYB1结合的验证
将IbSCF构建到pGADT7酵母重组表达载体(上海联迈生物工程有限公司，货号 LM-1639)，选择载体中EcoRⅠ和BamHⅠ作为目的片段插入的酶切位点，合成引物序 列见表2中的IbSCF-ADF/IbSCF-ADR，构建方法参考实施例2。将pGADT7-IbSCF酵母重 组表达载体质粒与pAbAi-PIbMYB1诱饵载体共同转化Y1HGold单杂交酵母菌株中进行酵 母单杂交实验。
酵母单杂交文库筛选方法按照Clontech公司Matchmaker Gold Yeast One-Hybrid Library Screening System说明书进行。酵母单杂交文库筛选方法如下：
(1)取25μL Yeastmaker Carrier DNA于95℃水浴5min使其变性，快速置于冰上数分 钟，待温度降至4℃(重复一次)。
(2)在已经预冷的10mL离心管中依次加入：2.5mL PEG/LiAc，25μL变性的Yeastmaker Carrier DNA，15μg文库质粒，600μL Y1HGold感受态细胞，涡旋混匀。
(3)将离心管置于30℃水浴锅中水浴45min，期间每隔15min轻轻倒混数次。
(4)加入160μL DMSO，轻柔混匀。
(5)在42℃水浴中温浴20min，期间每隔10min轻轻倒混数次。
(6)12000rpm离心30s，收集菌液，弃上清，加入8mL 0.9％NaCl溶液，重悬菌体。
(7)吸取200μL转化后的酵母菌液，均匀涂布于SD/-Leu、SD/-Leu/AbA培养皿上，AbA浓度为抑制自激活最低浓度(即300ng/mL)。
(8)30℃培养箱中倒置培养48～96h。
挑取单菌落进行菌落PCR鉴定，选用通用引物pGADT7F/R(序列见表1)，选取电泳后较亮且条带单一的样品送上海生工生物有限公司测序，测序的结果在NCBI数据库进行BLAST，对测序结果进行分析。
结果发现：阳性对照p53AbAi+AD-53(即在pAbAi载体插入阳性对照53基因序列得到p53AbAi，在pGADT7载体插入阳性对照53基因序列得到AD-53，构建方法参考实施例 2)转化的菌株能够在SD/-Leu/AbA培养基上生长；而阴性对照pAbAi-PIbMYB1+pGADT7 空载转化的菌株不能在SD/-Leu/AbA培养基上生长；说明该酵母单杂交实验能够有效检测 蛋白是否结合在启动子上。pAbAi-PIbMYB1+pGADT7-IbSCF能够在SD/-Leu/AbA培养基 上生长(图1)，说明IbSCF蛋白能结合在启动子IbMYB1上。
实施例6：检测上游调控因子IbSCF的自激活活性
将IbSCF导入pGBKT7质粒(上海联迈生物工程有限公司，货号LM-8123)中，构建pGBKT7-IbSCF融合表达载体，选择载体中EcoRⅠ和BamHⅠ作为目的片段插入的酶切 位点，合成引物序列见表2中的IbSCF-BDF/IbSCF-BDR，构建方法参考实施例2。构建成 功后将融合表达载体转入Y2HGold酵母菌株，将转化后的菌液均匀涂布在色氨酸缺陷培养 基(TakaraCat#630413)上生长，挑取阳性单克隆点在含GAL和3AT的组氨酸缺陷培养基 (即SD/-His/-3AT-a-Gal plus培养基，该培养基是在组氨酸缺陷培养基(Takara Cat#630415) 和SD基础培养基(Takara Cat#630411)混合基础上添加GAL显色剂和3AT抑制剂制备得 到的)上培养，结果显示pGBKT7-IbSCF转化的酵母菌株能在含卡那霉素抗性和3AT的组 氨酸缺陷培养基上生长，并能使X-α-Gal显现蓝色(图2)。以上结果说明IbSCF蛋白具有 自激活活性。
实施例7：双荧光素酶报告系统载体的构建
将上游调控因子IbSCF的基因序列构建到过表达载体pGreenII 0029 62-SK(上海钦城 生物科技有限公司，货号QCP0465)上，称之为效应质粒，将PIbMYB1插入到载体pGreenII 0800-LUC(柯蕾生物科技有限公司，货号kl-zl-0808)荧光素酶的前端作为报告质粒。选择 pGreenII 0029 62-SK载体中Sac I和Xho I及pGreenII 0800-LUC载体中的KpnI和Nco I作 为插入目的片段的酶切位点，构建载体引物序列见表2中的IbPM1-0800F/IbPM1-0800R以 及IbSCF-62-SKF/IbSCF-62-SKR，构建方法参考实施例2。
实施例8：拟南芥原生质体的制备及转化
1、拟南芥原生质体的制备步骤如下：
(1)配制酶解液于55℃水浴锅中预热。
(2)选择四周后抽苔前的野生型拟南芥叶片，将叶片下表皮撕掉后迅速放入酶解液中。
(3)25℃，50rpm避光振荡酶解50min，至叶肉细胞酶解完全，可在显微镜下观察原生质体的形态，当细胞较圆、透亮时状态比较好。
(4)用等体积的W5溶液稀释酶液，轻轻混匀，用清水洗干净75μm的尼龙网布，然 后将其用W5溶液浸湿后过滤原生质体。
W5溶液的配制(100mL)：
Figure BDA0003370502850000161
(5)800rpm离心2min，尽量吸去上清，用1mL W5溶液重悬原生质体(重复此步 骤三次)。
(6)将原生质体重悬于1mL W5溶液中，然后冰上放置30min备用。
2、拟南芥原生质体的转化步骤如下：
(1)2mL EP管中加入10～20μg的目的质粒(实施例7构建的IbSCF-pGreenII 002962-SK重组质粒和PIbMYB1-pGreenII 0800-LUC重组质粒)，加入100μL的拟南芥原生质 体，轻轻混匀，加完后立即放冰上。
(2)加入110μL PEG/CaCl2，轻弹离心管使之混匀，室温孵育10min。
(3)在冰上加入220μL W5溶液，颠倒离心管使其混匀，冰上放置1min。
(4)再次向离心管加440μL W5溶液，轻轻颠倒，冰上放置1min。
(5)最后向离心管加880μL W5溶液，颠倒混匀，冰上放置1min。
(6)4℃800rpm离心3min，吸去上清。
(7)原生质体用500μL W5溶液重悬，22℃黑暗条件下培养16～20h。
实施例9：双荧光素酶报告系统的检测
使用
Figure BDA0003370502850000171
Reporter Assay(Promega)检测LUC和REN两种荧光素酶活性， 具体步骤如下：
(1)100μL 1×PLB裂解液的制备：20μL 5×Passive Lysis Buffer加水至100μL。10mL LAR II的制备：吸取10mL冰上融化的Luciferase Assay Buffer II加入到Luciferase Assay Substrate中，轻轻摇晃使之溶解(-20℃可放置一个月，–70℃可放置一年)。100μL Stop&
Figure BDA0003370502850000172
Reagent的制备：吸取100μL Stop&
Figure BDA0003370502850000173
Buffer，加入2μL 50×Stop&
Figure BDA0003370502850000174
Substrate， 可稍微涡旋使其混匀(在-20℃可放置15d)。
(2)取实施例8转化后的拟南芥原生质体溶液，4℃，13200rpm离心90s，除去W5 溶液。
(3)加入100μL 1×PLB裂解液，轻轻吹打混匀后转移至24孔板中，置于水平摇床，室温低速晃动15min。
(4)收集裂解液，转移至1.5mL离心管中，4℃13200rpm离心10min，取上清液60 μL置冰上待测荧光素酶。
(5)避光条件下，在黑色的96孔酶标板中加入100μL LAR II，然后加入20μL细胞裂解液，用枪头轻轻混匀2～3次，避免产生气泡。
(6)放入酶标仪中检测LUC的酶活性，并记录数据。
(7)取出96孔板，在同一孔中加入100μL Stop&
Figure BDA0003370502850000181
Reagent，用枪头轻轻混匀2～3次，整个操作过程要避免强光照射。
(8)放入酶标仪中检测REN的酶活性并记录数据。
(9)实验重复3次，取平均值，通过对比不同样品的LUC/REN的比值，检测转录因 子对启动子的激活作用。
结果显示：IbSCF能够提高IbMYB1启动子的活性(图3)，说明IbSCF能够促进IbMYB1的表达。
实施例10：明确上游调控因子IbSCF的功能
构建了IbSCF与绿色荧光蛋白(GFP)的融合蛋白，对IbSCF的作用场所进行定位。亚细胞定位载体是C17GFP(BioVector NTCC典型培养物保藏中心，货号：BiovectorC17GFP)，根据载体和互作蛋白的关键位点选择限制性内切酶，用SmaI进行单 酶切。设计包含起始密码子而去掉终止密码子的特定引物，将IbSCF构建到C17GFP亚细 胞表达载体上，并通过转化拟南芥原生质体瞬时表达蛋白，观察目的基因蛋白的亚细胞定 位。合成引物序列见表2中的IbSCF-GFPF/IbSCF-GFPR。结果显示：空载中的GFP蛋白能 够在拟南芥原生质体的各个结构中表达，IbSCF蛋白在细胞核中表达(图4)，表明IbSCF 是一个典型的转录因子。
表2构建载体使用引物序列(下划线为酶切位点)
Figure BDA0003370502850000191
实施例11：IbEBF2和IbSCF的相互作用研究
1、毒性检测
将上游调控因子IbEBF2、IbSCF分别与pGBKT-7载体(上海联迈生物工程有限公司，货号LM-8123)连接，构建pGBKT-7-上游调控因子载体(即pGBKT-7-IbEBF2和 pGBKT-7-IbSCF)，选择载体中EcoRⅠ和BamHⅠ作为目的片段插入的酶切位点，合成 引物序列见表2中的IbSCF-BDF/IbSCF-BDR，构建方法参考实施例2。以pGBKT-7空载载 体作为对照组，将pGBKT-7-上游调控因子载体和pGBKT-7空载载体分别转化Y2H酵母菌， 将转化后的菌液均匀涂布在SD/-Trp培养基上生长，进行毒性检测，观察pGBKT-7-上游调 控因子载体与pGBKT-7空载载体在SD/-Trp培养基上单克隆菌落的生长情况，结果显示实 验组和对照组单克隆菌落在数量和大小上无明显差异(图5)，说明pGBKT-7-上游调控因 子载体对酵母菌没有毒性。
2、酵母双杂交检测IbEBF2和IbSCF之间的相互作用
运用酵母双杂交检测上游调控因子IbEBF2和IbSCF之间的相互作用，将具有自激活活 性的上游转录调控因子IbEBF2与pGADT-7连接构建重组载体(pGADT7-IbEBF2)，IbSCF的与pGBKT-7连接构建重组载体(pGBKT7-IbSCF)，以pGADT7+pGBKT7-53 (AD-T+BK-53)作为阳性对照，以pGADT7+pGBKT7-Lam(AD-T+BK-Lam)作为阴性 对照，进行酵母双杂交实验检测其相互作用，具体步骤为：
(1)酵母感受态细胞的制备
使用Yeastmaker Yeast Transformation System 2进行酵母感受态细胞的制备，具体步骤 如下：
①将Y2HGold酵母菌株在YPDA固体培养基上划线活化，30℃倒置培养3d。
②从YPDA固体培养基中挑取单菌落于30mL液体YPDA培养基中，30℃、220rpm 振荡培养8～12h，使其OD600达到1.4～1.5之间。
③吸取酵母菌液接种于100mL的液体YPDA培养基中，调OD600至0.1～0.2之间，30℃250rpm培养2～3h，使其OD600达到0.5。
④将上述菌液用2个50mL离心管分装，室温下5000rpm离心5min后弃上清。
⑤加入25mL无菌水重悬菌体，5000rpm离心5min后弃上清，重复该步骤两次。
⑥加入600μL 1.1×TE/LiAc重悬菌体，置于冰上备用。
(1)Y2HGold酵母转化
酵母转化参照Yeastmaker Yeast Transformation System 2进行，具体步骤如下：
①取5μL Yeastmaker Carrier DNA于95℃水浴5min使其变性，快速置于冰上数分钟， 待温度降至4℃(重复一次)。
②在已预冷的1.5mL离心管中依次加入：500μL PEG/LiAc(50μL TE，50μL LiAc和400μL PEG4000)，5μL变性的Yeastmaker Carrier DNA，100ng重组融合表达质粒，50μLY2HGold感受态细胞，涡旋混匀，置于30℃恒温培养箱中孵化30min(期间每隔10min轻 轻倒混数次)。
③加入20μL DMSO，轻柔混匀，置于42℃水浴中15min(期间每隔5min轻轻倒 混数次)。
④12000rpm离心30s，弃上清，加入0.9％NaCl溶液1mL，重悬菌体。
⑤吸取200μL转化后的酵母菌液，涂布于SD/-Trp培养皿上。
⑥30℃培养箱中倒置培养48～96h。
结果显示，IbEBF2与IbSCF存在相互作用(图6)。
3、双分子荧光互补实验检测IbEBF2和IbSCF之间的相互作用
运用双分子荧光互补实验对酵母双杂交检测结果进行验证，以检测上述蛋白在植物细 胞中是否存在相互作用。以pSAT6-cEYFP-C1(上海海吉浩格生物科技有限公司， HH-ZW-006)作为融合载体，将IbEBF2与EYFP蛋白N端融合，IbSCF与EYFP蛋白C 端融合，然后将带EYFP蛋白N端的融合质粒和带EYFP蛋白C端的融合质粒共转化到拟 南芥原生质体中进行表达。
GFP荧光蛋白在拟南芥原生质体里面呈现组成型表达，在整个原生质体中都有表达， IbEBF2-nYFP+cYFP和nYFP+IbSCF-cYF分别转到拟南芥原生质体中都没有检测到荧光信 号，说明这2个蛋白与空载并没有相互作用，而共转到拟南芥原生质体后能够检测到明显 的荧光信号，IbEBF2-nYFP+IbSCF-cYFP荧光信号在细胞核内(图7)，说明在细胞核中IbEBF2蛋白与IbSCF蛋白可发生相互作用，两者可以形成复合物共同调控基因的表达。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发 明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通 技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进 和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 广东省科学院南繁种业研究所
<120> 上游调控因子IbSCF及其在调控紫心甘薯IbMYB1表达中的应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 171
<212> PRT
<213> 甘薯(Ipomoea batatas)
<400> 1
Met Lys Arg Pro His Thr Ser Asp Asp Gly Asp Gly Ile His Gly Ser
1 5 10 15
Asn Glu Glu Glu Lys Lys Lys Thr Lys Thr Lys Val Glu Glu Glu Lys
20 25 30
Glu Ser Gly Arg Thr Leu Ala Ser Ala Gly Pro Met Pro Thr Thr Glu
35 40 45
Ser Val Leu Leu Asp Glu Asn Leu Leu Tyr Glu Val Leu Lys His Val
50 55 60
Asp Gly Arg Thr Leu Ala Trp Ala Ala Cys Val Ser Lys Leu Trp Lys
65 70 75 80
Arg Thr Ala Gln Asp Glu Arg Leu Trp Glu Leu Met Cys Leu Lys Asp
85 90 95
Gly Ser Arg Arg Asn Gln Gln Gln Gln Gln Leu Arg Asn Val Val Leu
100 105 110
Ala Leu Gly Gly Phe Arg Arg Leu Tyr Ser Leu His Leu Trp Pro Leu
115 120 125
Val Lys Pro Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Arg Leu Arg Arg Arg Val
130 135 140
Pro Gly Leu Ala Tyr Pro Arg Leu Gln Ser Leu Arg Arg Arg Asn Ser
145 150 155 160
Pro Pro Gly Lys His Gly Gly Glu Thr Thr Lys
165 170
<210> 2
<211> 516
<212> DNA
<213> 甘薯(Ipomoea batatas)
<400> 2
atgaagcggc cccatacttc cgacgacggc gacggaatcc acggttcgaa cgaggaggag 60
aagaagaaga cgaagacgaa ggttgaggag gagaaagagt ccgggcgtac gttagcgtcg 120
gcgggaccga tgccgacgac ggaatccgtg ttgttggacg agaacttgct gtacgaagtg 180
ctgaaacacg tggacgggcg tacgttagcg tgggcggcgt gcgttagcaa gctgtggaag 240
cggacggctc aggacgagcg gctctgggag ctgatgtgcc tcaaggacgg ctcgcggcgc 300
aatcagcaac agcagcagct ccgcaacgtg gtcctcgccc tcggcggctt ccgtcggctc 360
tactcgcttc acctctggcc gctagttaaa ccgtcgtcgt cgtcctcctc ctctcgtcta 420
cgccggcgtg tacctggcct tgcctacccc cgcctccaaa gccttcgtcg gcgaaattcg 480
ccgccgggaa aacacggtgg ggaaacgacg aaatga 516
<210> 3
<211> 2183
<212> DNA
<213> 甘薯(Ipomoea batatas)
<400> 3
tattgctctc aatgtgcaag aatcaaatga agtatcaatc agaagtttaa ttgggacata 60
tttattggta gcaaataaaa acaaacttgt taactctatt actaagtcaa aaaccttgtg 120
gtctagtgac acccgattgc acccccacat gggaagggtg agttcgagct tcagtaaatg 180
tgatattggc tctatgtgct tcatttggtt gagaaaatag ctataaacat atactacatt 240
gtaatggagt caatagttct caaaaaaaaa aaaaaagtct tcgaccgttt gcctactaac 300
ctagtattaa tgggagtttc tctcatacat tttataaaaa tttaaaaaga gtaatgctat 360
ttctctctaa aaaaaattct tctcaaaatt tcccgtaaca ttatttgatt ggccactttt 420
ctttttcatt aagggtccat ctgaaaaaca ggaaggatgt gtttggttgg ggggtttagg 480
cataaggtat gcgtatcaaa gtgattgtta gtgtttggtt gataggtttt gtgaatgtta 540
ctatgggttt ggaatacccc attaatggca aaacccatac ccttattaaa taagggtttc 600
atctcccttc atcatttttt ccccaattat taataaccat tcccattcca cccaactacc 660
aaacatgcta aatacttcca ccaaaaccca ttacccttac caagtatttg atacccattc 720
cgattccgat tccgattccc acgtgcgaac caaacgcacc cgaaaatgtc ttctgaaaaa 780
tgagtacaat tgtttaatta aacattttaa ttattttatt taaaatataa aaaattattt 840
ataataatat taaaaatatg ttatttatta ttgttattat tattttttaa atgatggttt 900
ccgacggaat ggtttctgcc gaaaacgaga gcctaggtcc agaaaatgta aagattttcc 960
cagtcaatgg aaagtgtttt tcgttgactg gatttttcaa gcgcatccaa acactggaaa 1020
ctccgaaaat gattttcaga aaacattttt cgagttttca aacaccctaa atgtgtgttg 1080
gtgtgtagtc agttaattca ttgcacccaa tgattataaa acatgtcatg cagagaattt 1140
aaagagagaa aaaattagaa tgagtaagaa gcatttttca ataaataatt aaataaataa 1200
aagattccta tgttatgaca aatttttggg caattaagat attgcttaaa ttatataatt 1260
tttacacaat attataatac tcatccaacg gttctcgata gaggcataca agtcgtgctc 1320
tagatattta gaaatatttg gagcaaatcc aatgatttga cacagcaaat atttgtgtgg 1380
cccacaaaat ttttttatgc acctcaaaaa tttaatgatg tctaatataa tgcattagtt 1440
aatttcttac ttattacatc aagttaaatt aatacgattt gtataaaatg acaatcatgt 1500
ttattacatc aagctaaata aatacgattt gtattaaatt aatacaataa taataataat 1560
caaggacaat ttagtcattt tctttgtttg ttcttttttc aagatgcatt aaattctaat 1620
ttctaggaga tatatgaatt gcaatttcac aaatagaaaa aattgcaatt ccatcaattc 1680
aaacaccgta gtttatagct ccgttaaatt gcattgtaat tgaattaaaa tttatgtcaa 1740
ccaattaacc gaacaccctc taagggaatc tcttgtaatc taaaaaaaaa tgaattatca 1800
aaaatttaaa tgttgtttgt aaacctgtct tattcacaaa ctttatgtga tcatacagaa 1860
tctacataat gattttaata aaaaaaaaaa aagttaagaa aacaagtgta tttcgaaaaa 1920
aaaaaaaaaa acaagtggaa aacatgtgca gtgtcatcat gtaagtactc agtggtatat 1980
atagtagctg tgctaactat attgcagggc atacttatac caataattgg atgctgcgct 2040
atcttctatt atattactca aggtcgtttc tccatctttt cttcactttt tttttccgga 2100
attttggtgc taccacaccc aagtagccta cctatactac aacaacctta gctaagaatt 2160
tccgacaccc ttcaatatat ata 2183
<210> 4
<211> 286
<212> PRT
<213> 甘薯(Ipomoea batatas)
<400> 4
Met Ala Ser Ser Asp Gln Thr Val Leu Gln Ile Ser Ser Pro Ser Ser
1 5 10 15
Thr Thr Leu Ser Ala Arg Val His Pro Leu Val Ile Phe Asn Ile Cys
20 25 30
Asp Cys Phe Val Arg Arg Pro Asp Gln Ala Glu Arg Val Ile Gly Thr
35 40 45
Leu Leu Gly Ser Val Leu Pro Asp Gly Thr Val Asp Ile Arg Asn Ser
50 55 60
Tyr Ala Val Pro His Asn Glu Ser Gln Asp Gln Val Ala Leu Asp Ile
65 70 75 80
Asp Tyr His His Asn Met Leu Ala Ser His Gln Lys Val Asn Pro Lys
85 90 95
Glu Val Ile Val Gly Trp Phe Ser Thr Gly Phe Gly Val Ser Gly Gly
100 105 110
Ser Ala Leu Ile His Asp Phe Tyr Thr Arg Glu Val Thr Asn Pro Ile
115 120 125
His Leu Thr Val Asp Thr Gly Phe Thr Asn Gly Glu Ala Thr Ile Lys
130 135 140
Ala Phe Ile Ser Val Asn Leu Ser Leu Gly Asp Gln Pro Leu Ala Ala
145 150 155 160
Gln Phe Gln Glu Ile Pro Leu Asp Leu Arg Met Ile Glu Ala Glu Arg
165 170 175
Val Gly Phe Asp Met Leu Lys Thr Thr Val Val Asp Lys Leu Pro Asn
180 185 190
Asp Leu Glu Gly Met Glu Ala Ser Met Glu Arg Leu Leu Ala Leu Ile
195 200 205
Asn Asp Val His Lys His Val Asp Asp Val Val Glu Gly Arg Val Pro
210 215 220
Ala Asp Asn Asn Leu Gly Arg Leu Ile Ser Glu Thr Val Asn Ser Ile
225 230 235 240
Pro Lys Leu Ser Pro Gln Glu Phe Asp Lys Leu Val Asn Asp Ser Leu
245 250 255
Gln Asp Gln Leu Leu Leu Leu Tyr Leu Ser Ser Ile Thr Arg Thr Gln
260 265 270
Leu Ser Leu Ala Glu Lys Leu Asn Thr Ala Ala Gln Ile Leu
275 280 285
<210> 5
<211> 861
<212> DNA
<213> 甘薯(Ipomoea batatas)
<400> 5
atggcgtcca gtgatcaaac ggtgctccag atttcgtctc cttcttcaac aaccctctcc 60
gctagggttc acccgctggt gattttcaac atctgcgact gctttgtccg gcgacccgac 120
caagccgagc gcgtcattgg tacgcttctc ggatccgtct tacccgacgg caccgtcgat 180
attcgcaact cctatgccgt tcctcacaac gagtcccaag atcaggttgc tttggatatt 240
gattatcatc ataacatgtt ggcatcccat cagaaagtga atcctaagga agtcattgtt 300
ggatggtttt ccactgggtt tggagtttca ggcggtagcg ctctaatcca tgatttttac 360
actagagaag ttacaaatcc tatccatttg actgttgaca ctggattcac aaatggggag 420
gctaccatca aagcttttat ttctgtgaat ttgtcacttg gggatcaacc tcttgctgca 480
cagttccaag aaattccatt ggacttgcga atgattgaag ctgagcgggt tggatttgat 540
atgctgaaga caacagtggt tgacaaactt ccaaatgacc tagaaggaat ggaggcatca 600
atggagagat tacttgctct gatcaatgat gttcacaaac atgttgatga tgttgtggaa 660
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ccaaaactat caccacaaga atttgataag cttgtgaatg acagtcttca ggatcaattg 780
ctcctactat atttgtcgag catcacaaga acacaactca gcttggctga aaagttgaac 840
actgctgctc agatcctgta a 861

Claims (8)

1.一种紫心甘薯IbMYB1转录因子的上游调控因子IbSCF，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种编码权利要求1所述的紫心甘薯IbMYB1转录因子的上游调控因子IbSCF的基因。
3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于，所述的编码基因的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。
4.含有权利要求2或3所述的编码基因的重组载体或重组菌。
5.一种权利要求1所述的紫心甘薯IbMYB1转录因子的上游调控因子IbSCF的扩增引物，其特征在于，所述的扩增引物为IbSCF-F：5'-ATGAAGCGGCCCCATACTTCCGACG-3'和IbSCF-R：5'-TCACGTTTGTTTGTGACGATTACTGGAA-3'。
6.权利要求1所述的上游调控因子IbSCF在促进紫心甘薯花色素苷生物合成中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的上游调控因子IbSCF与IbEBF2存在相互作用，以促进紫心甘薯花色素苷生物合成。
8.权利要求1所述的上游调控因子IbSCF在紫心甘薯高花色素苷品种选育中的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN107746846A (zh) * 2017-10-26 2018-03-02 江苏省农业科学院 编码甘薯bZIP转录因子的IbABF4基因及应用

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PB01 Publication
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SE01 Entry into force of request for substantive examination
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GR01 Patent grant
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EE01 Entry into force of recordation of patent licensing contract

Application publication date: 20220322

Assignee: Guangzhou Chengfeng Ecological Farm Co.,Ltd.

Assignor: Nanfan Seed Industry Research Institute Guangdong Academy of Sciences

Contract record no.: X2023980035449

Denomination of invention: Upstream regulatory factor IbSCF and its application in regulating the expression of IbMYB1 in purple heart sweet potatoes

Granted publication date: 20221025

License type: Common License

Record date: 20230511

EE01 Entry into force of recordation of patent licensing contract
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Application publication date: 20220322

Assignee: Fengshun County Xiansheng Planting and Breeding Professional Cooperative

Assignor: Nanfan Seed Industry Research Institute Guangdong Academy of Sciences

Contract record no.: X2023980048068

Denomination of invention: Upstream regulatory factor IbSCF and its application in regulating the expression of IbMYB1 in purple sweet potatoes

Granted publication date: 20221025

License type: Common License

Record date: 20231123

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