CN110387377B - 油菜耐旱基因BnNAC129及其用于制备耐旱转基因植物的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及油菜耐旱基因BnNAC129及其用于制备耐旱转基因植物的应用，本发明提供的油菜耐旱基因BnNAC129、其编码产物BnNAC129蛋白、含有耐旱基因BnNAC129的植物的制备方法可应用到耐旱转基因作物育种中以提高其耐旱性，具有广阔的应用前景。

Description

油菜耐旱基因BnNAC129及其用于制备耐旱转基因植物的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及油菜耐旱基因BnNAC129及其用于制备耐旱转基因植物的应用。

一种油菜耐旱基因BnNAC129、其编码产物BnNAC129蛋白、含有耐旱基因BnNAC129的植物的制备方法、及其在制备耐旱转基因植物中的应用。

背景技术

在长期进化过程中，植物逐渐形成了各种抵御外界逆境胁迫的机制，转录因子(Transcription Factors,TFs)在这个过程中起着非常重要的作用。植物中转录因子包括NAC、WRKY、bZIP、MYB等多种类型，其中NAC转录因子是植物中所特有的大型转录因子家族之一，在植物的生长发育以及抵抗各种生物和非生物逆境胁迫中发挥着重要的作用。NAC转录因子的典型特征包含N-末端区域中的高度保守的NAC结构域和C-末端区域中的可变转录调节区域。BnNAC129属于NAC家族成员之一。

油菜是重要的油料作物，同时又是抗旱性较差的作物。全球气候变化下频繁发生的干旱等极端天气严重影响油菜的产量。因此，研究油菜抗旱性的遗传学和生物学机制，利用现代生物技术提高油菜的抗旱能力，培育抗旱的油菜新品种，是当前油菜生产迫切需要解决的科学问题。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种耐旱基因BnNAC129，该基因的核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示。

本发明的目的之二是提供上述耐旱基因BnNAC129编码的蛋白质BnNAC129，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明的目的之三是提供一种含有上述耐旱基因BnNAC129的表达载体。

本发明的目的之四是提供一种含有上述耐旱基因BnNAC129的宿主菌。

本发明的目的之五是提供一种上述耐旱基因BnNAC129在转化双子叶植物以产生耐旱转基因双子叶植物中的应用。

本发明的目的之六是提供一种含有上述耐旱基因BnNAC129的植物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：

S1、过表达载体的构建：设计引物，PCR扩增BnNAC129基因，将扩增的基因片段通过BP反应重组到pDONR207载体上，转化至大肠杆菌感受态细胞，庆大霉素筛选获得入门克隆，提取质粒，获得含BnNAC129基因的pDONR207载体，将含BnNAC129基因的pDONR207载体和pEarleyGate103-RFP载体通过LR反应重组，转化至大肠杆菌感受态细胞，经卡那霉素筛选得到成功重组的过表达载体；

S2、农杆菌介导的转化：将构建成功的过表达质粒转化至农杆菌，筛选阳性克隆，将阳性克隆接种到YEP液体培养基中培养至OD600＝0.8-1.2，离心后用侵染培养基重悬至OD600＝0.8-1.2，将宿主植物花苞浸没在侵染培养基中侵染后继续培养直至收获种子；

S3、转基因株系的筛选：挑选S2收获的种子中带有红色荧光的阳性种子进行种植，经过传代，半定量RT-PCR验证，最后得到纯合的含耐旱基因BnNAC129的植物。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明克隆了甘蓝型油菜耐旱基因BnNAC129，所述耐旱基因BnNAC129具有SEQ IDNO:1所示的核苷酸序列，其中，序列表中的SEQ ID NO：1由417个碱基组成。该耐旱基因BnNAC129能够编码BnNAC129蛋白，此种蛋白具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，其中，序列表中的SEQ ID NO：2由139个氨基酸组成。

本发明中BnNAC129基因编码的蛋白与双子叶植物拟南芥(At)、琴叶拟南芥(Al)、亚麻芥(Cs)、芜菁(Br)、花椰菜(Bo)以及萝卜(Rs)等的同源基因具有较近的亲缘关系。

可用现有的植物表达载体构建含有BnNAC129基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pEarley Gate103、pEarleyGate103-RFP(pEarleyGate103载体进行改造，在载体上加入红色荧光基因，并利用拟南芥种子特异性启动子At2S3A使其表达)或其它衍生植物表达载体。携带有本发明基因BnNAC129的植物表达载体可通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到植物细胞或组织中。被转化的宿主植物可以是拟南芥、烟草、油菜等双子叶植物。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GFP基因、GUS基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除草剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

本发明所提供的获得耐旱的转基因植物的方法，是将上述植物耐旱蛋白的编码基因BnNAC129导入植物中，得到耐旱转基因植物。

附图说明

图1甘蓝型油菜BnNAC129蛋白的氨基酸序列经同源性比对，利用MEGA软件分析的进化关系。

图2构建的过表达载体图谱，pEarleyGate103-RFP-BnNAC129。

图3利用Gateway重组技术构建了超表达载体及转基因植株筛选，图3，A：根据文献，对表达载体进行改造后的含荧光筛选标记载体；B：阳性转基因拟南芥的筛选：a图代表经红色荧光筛选得到的阳性转基因拟南芥；b图代表在明场条件下的拟南芥种子(包括野生型和阳性转基因种子)；c图代表在红色荧光和明场合并视野下的拟南芥种子(包括野生型和阳性转基因种子)。

图4各纯合转基因株系半定量RT-PCR检测电泳，WT表示野生植株、OE1、OE2、OE3、OE4和OE5五个株系BnNAC129基因的表达情况，BnACTIN为内参基因。

图5转BnNAC129基因拟南芥和野生植株的表型比较，A，干旱胁迫前，B，干旱胁迫后7天，C，浇水3天后，其中WT表示野生植株，OE1、OE2、OE3表示转BnNAC129基因拟南芥植株。

图6干旱胁迫处理后，转BnNAC129基因拟南芥和野生植株的存活率比较，其中WT表示野生植株，OE1、OE2、OE3表示转BnNAC129基因拟南芥植株。

图7干旱胁迫处理后，转BnNAC129基因拟南芥和野生植株的失水率比较，其中WT表示野生植株，OE1、OE2、OE3表示转BnNAC129基因拟南芥植株。

图8干旱胁迫处理后，转BnNAC129基因拟南芥和野生植株的叶温比较，其中WT表示野生植株，OE1、OE2、OE3表示转BnNAC129基因拟南芥植株。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

在本发明的下述实施例中，所用的实验材料为甘蓝型油菜(Brassica napus L.)(中国农业科学院油料作物研究所提供的中双11)和拟南芥WT(Arabidopsis thaliana，Col-0)(美国拟南芥生物资源中心)，农杆菌GV3101(上海唯地生物技术有限公司)，质粒pEarley-Gate103(美国拟南芥生物资源中心)。

实施例1

甘蓝型油菜耐旱蛋白编码基因BnNAC129序列的克隆：

利用RNA提取分离试剂(Trizol，Invitrogen)提取甘蓝型油菜幼苗总RNA，其具体方法是：收集甘蓝型油菜幼苗150mg，置于液氮中研磨成粉末，然后加入1ml Trizol试剂，快速混匀后冰上放置10min；加入0.2ml氯仿，匀速震荡15s，冰上静置5min；4℃，12000rpm离心15min；上清转移到一个新的1.5ml离心管中，加入0.5ml异丙醇混匀，静置3min，4℃，12000g离心20min沉淀RNA；RNA沉淀用1ml 75％乙醇洗涤后溶于适量DEPC处理过的水中，-80℃保存备用。

根据Gateway重组技术构建基因的超表达载体，通过Primer 5.0软件设计以下引物进行目的基因的克隆：

5’端引物：

GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTATGGTGGATCCGCATCCG，如SEQ ID NO：3所示；

(其中划线序列为Invitrogen Gateway系统attB1序列)；

3’端引物：

GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCATTCTTCTTCTTTCTTGTCATGGGC，如SEQ ID NO：4所示；

(其中划线序列Invitrogen Gateway系统attB2序列)。

通过RT-PCR扩增得到BnNAC129的cDNA序列，具体方法是：

依据HiScriptⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒说明书进行后续实验：1μg总RNA和试剂盒中的部分试剂混合(4×Gdna wiper Mix 4μl,RNase free Water to 16μl)，42℃处理2min后，继续加入试剂混合(5×HiScriptⅡqRT Super MixⅡ4μl)，混匀后，50℃处理15min；80℃处理5ses，完成反转录反应。

吸取1μl上述反转录产物，作为模板进行PCR反应：95℃5min后进入扩增程序：95℃30s、58℃30s、72℃30s，32个循环后，72℃5min。扩增得到的SEQ ID NO：1序列总长417个碱基，编码139个氨基酸，根据ExPASy's Compute pI/Mw program计算等电点为TheoreticalpI/Mw:10.39/12775.56.

本发明中BnNAC129基因编码的蛋白与双子叶植物拟南芥(At)、琴叶拟南芥(Al)、亚麻芥(Cs)、芜菁(Br)、花椰菜(Bo)以及萝卜(Rs)的同源基因有较近的亲缘关系，如图1所示。

实施例2

转BnNAC129基因植株的获得及耐旱特性的测定

1、甘蓝型油菜BnNAC129基因植物过表达载体的构建：利用Invitrogen公司Gateway技术将测序验证过的实施例1得到的片段通过BP反应(BP Clonase IIEnzyme Mix，Invitrogen)重组到pDONR207载体，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞中，经50mg/L庆大霉素筛选获得入门克隆，之后提取质粒再通过Gateway技术中的LR反应(LR Clonase II EnzymeMix，Invitrogen No.11791-020)将BnNAC129基因重组到pEarleyGate103-RFP载体上，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞中，经50mg/L卡那霉素筛选得成功重组的过表达载体pEarleyGate103-RFP-BnNAC129，结果如图2所示。

2、农杆菌介导的转化：将构建成功的过表达质粒pEarleyGate103-RFP-BnNAC129通过电转的方式(电压2400V，电容25F，阻抗200Ω，电击杯1mm)转化农杆菌GV3101，用50mg/L利福平+50mg/L卡那霉素的LB平板筛选阳性克隆。将阳性克隆接种到YEP液体培养基中(含抗生素：利福平50mg/L、卡那霉素50mg/L)于恒温摇床上28℃，220rpm摇床培养至OD600＝0.8-1.2，离心后用侵染培养基(1/2MS，5％sucrose，0.05％silwetL-77，pH5.7)重悬OD600＝0.8-1.2。将拟南芥Col-0倒置使花苞浸没在侵染培养基溶液里30-40秒，用保鲜膜将侵染之后的拟南芥地上部分包裹，黑暗培养24h后去掉保鲜膜，正常条件(25℃，16小时光照、8小时黑暗)继续培养直至收获种子。

3、转基因株系的筛选：将转基因拟南芥收获的种子，在体式显微镜下观察种皮颜色，挑选能在种皮上观察到红色荧光的阳性种子进行种植，经过传代，半定量RT-PCR验证，最后得到纯合的BnNAC129过表达的拟南芥T3代转基因株系。

4、转基因BnNAC129拟南芥株系的耐旱性测定：将生长4周的转基因拟南芥和野生型拟南芥同时进行干旱处理，干旱处理7天，然后恢复浇水3天，统计存活率、失水率及检测叶温的变化。

通过对比试验，验证了含有BnNAC129基因的转基因植株具有耐旱特性，图3和图4结果显示，BnNAC129的过表达可以显著增强拟南芥的耐旱特性，使干旱处理之后的拟南芥的存活率提高了40％左右。这对于培养优良的植物品种特别是耐旱植物品种具有重要的理论及实践意义。

结果显示BnNAC129的过表达可以显著增强拟南芥的耐旱性，如图5所示，与野生型拟南芥相比，含有BnNAC129基因的转基因拟南芥在干旱下的存活率和叶温有明显的提高且差异显著，结果如图6，7所示；含有BnNAC129基因的转基因拟南芥的失水率相比野生型拟南芥较低且差异显著，结果如图8所示。尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

序列表

<110> 河南大学

<120> 油菜耐旱基因BnNAC129及其用于制备耐旱转基因植物的应用

<141> 2019-08-31

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 417

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜(Brassica napus L.)

<400> 1

atggtggatc cgcatccggt gggtttcaga ttccatccga ccgacgagga gatcattggc 60

tattacctca gggcaaaaaa tatggatggc aacacgactc atgtcaatga attcattaac 120

acagtcgata tctatagctt ggatccttgg gagttacctt cccagtcgag ttcgataagg 180

aaggactatg tttggtattt cttcggtcgt aaagacaaca aatatgtgca cacaaaaaga 240

aaagtaaaga cgacaaatat aacagaggaa cccctttttt ccaaaaaaaa agacaaatat 300

aacagaggag ggagacagag caggaaaaag agttctggtt tttggaagaa gaccggattt 360

actgttaaca tgatcaaccc aacagtccaa cagcccatga caagaaagaa gaagaat 417

<210> 2

<211> 139

<212> PRT

<213> 甘蓝型油菜(Brassica napus L.)

<400> 2

MET Val Asp Pro His Pro Val Gly Phe Arg Phe His Pro Thr Asp Glu

1 5 10 15

Glu Ile Ile Gly Tyr Tyr Leu Arg Ala Lys Asn MET Asp Gly Asn Thr

20 25 30

Thr His Val Asn Glu Phe Ile Asn Thr Val Asp Ile Tyr Ser Leu Asp

35 40 45

Pro Trp Glu Leu Pro Ser Gln Ser Ser Ser Ile Arg Lys Asp Tyr Val

50 55 60

Trp Tyr Phe Phe Gly Arg Lys Asp Asn Lys Tyr Val His Thr Lys Arg

65 70 75 80

Lys Val Lys Thr Thr Asn Ile Thr Glu Glu Pro Leu Phe Ser Lys Lys

85 90 95

Lys Asp Lys Tyr Asn Arg Gly Gly Arg Gln Ser Arg Lys Lys Ser Ser

100 105 110

Gly Phe Trp Lys Lys Thr Gly Phe Thr Val Asn MET Ile Asn Pro Thr

115 120 125

Val Gln Gln Pro Met Thr Arg Lys Lys Lys Asn

130 135

<210> 3

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctatggtggatccgcatccg 49

<210> 4

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcattcttcttctttcttgtcatgggc 49

Claims (6)

1.一种油菜耐旱基因BnNAC129，其特征在于，所述基因BnNAC129的核苷酸序列如SEQID NO：1所示。

2.一种由权利要求1所述的耐旱基因BnNAC129编码的蛋白质BnNAC129，其特征在于，所述蛋白质BnNAC129的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.一种含有权利要求1所述的耐旱基因BnNAC129的表达载体。

4.一种含有权利要求1所述的耐旱基因BnNAC129的宿主菌。

5.一种如权利要求1所述耐旱基因BnNAC129在转化双子叶植物以产生耐旱转基因双子叶植物中的应用。

6.一种含有权利要求1所述的耐旱基因BnNAC129的植物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：

S1、过表达载体的构建：设计引物，PCR扩增BnNAC129基因，将扩增的基因片段通过BP反应重组到pDONR207载体上，转化至大肠杆菌感受态细胞，庆大霉素筛选获得入门克隆，提取质粒，获得含BnNAC129基因的pDONR207载体，将含BnNAC129基因的pDONR207载体和pEarleyGate103-RFP载体通过LR反应重组，转化至大肠杆菌感受态细胞，经卡那霉素筛选得到成功重组的过表达载体；

S2、农杆菌介导的转化：将构建成功的过表达质粒转化至农杆菌，筛选阳性克隆，将阳性克隆接种到YEP液体培养基中培养至OD600＝0.8-1.2，离心后用侵染培养基重悬至OD600＝0.8-1.2，将宿主植物花苞浸没在侵染培养基中侵染后继续培养,直至收获种子；

S3、转基因株系的筛选：挑选S2收获的种子中带有红色荧光的阳性种子进行种植，经过传代，半定量RT-PCR验证，最后得到纯合的含耐旱基因BnNAC129的植物。

Images