CN108018292A

CN108018292A - 一种耐旱基因及其用于制备耐旱转基因植物的应用

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Publication number: CN108018292A
Application number: CN201711478710.5A
Authority: CN
Inventors: 岳修乐; 安黎哲; 张国艳
Original assignee: Lanzhou University
Current assignee: Lanzhou University
Priority date: 2017-12-29
Filing date: 2017-12-29
Publication date: 2018-05-11
Anticipated expiration: 2037-12-29
Also published as: CN108018292B

Abstract

本发明提供了一种耐旱基因CbDREB2AS、其编码产物CbDREB2AS蛋白、含有耐旱基因CbDREB2AS的植物的制备方法、及其在制备耐旱转基因植物中的应用。本发明公开的CbDREB2AS基因可应用到耐旱转基因作物育种中以提高其耐旱性，具有广阔的应用前景。

Description

一种耐旱基因及其用于制备耐旱转基因植物的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种高山离子芥耐旱基因CbDREB2AS、其编码产物CbDREB2AS蛋白、含有耐旱基因CbDREB2AS的植物的制备方法、及其在制备耐旱转基因植物中的应用。

背景技术

干旱严重影响着植物的生长发育，制约着作物的产量及种植范围，是目前影响农业生产的世界性问题。据统计：全球干旱、半干旱地区已超过土地总面积的1/3，在我国占土地总面积的47％，在耕地面积中干旱、半干旱地区已占51％，每年粮食产量因干旱而造成的损失非常惨重，我国每年因旱灾损失粮食达50亿公斤^[1]。目前，关于利用转基因技术提高植物的耐旱性已有不少报道，如：Mie Kasuga等人将拟南芥基因DREB1A转入烟草后能够提高转基因植株的耐旱性^[2]，Honghong Hu等人将SNAC1基因在水稻中过表达能将转基因水稻在干旱胁迫下的结实率提高22–34％，Bi‐Yan Zao等人将油菜中的BaABF2基因在拟南芥中过表达也能提高转基因植株的抗旱能力^[3,4]。

高山离子芥(Chorispora bungeana，又名Chorispora exscapa)是十字花科离子芥，属多年生草本植物，分布在高海拔亚高山草甸和砾石质山坡上，该地区的环境特点是气候寒冷、干旱、强辐射。在我国主要分布于乌鲁木齐河源区流石碓，流石碓中砾石保水性差，恶劣环境时常造成高山离子芥的干旱胁迫。高山离子芥为了适应低温、强紫外、大风和干旱等不利的环境条件，进化出了优秀的逆境适应机制^[5]。

本发明公开了一种干旱响应基因CbDREB2AS，该基因编码高山离子芥一个新的受干旱诱导而产生的蛋白CbDREB2AS。该基因编码的蛋白与山萮菜(Es)、天蓝遏蓝菜(Nc)、琴叶拟南芥(Al)、拟南芥(At)以及花生(Ah)的同源基因有较近的亲缘关系。本发明公开的CbDREB2AS基因可应用到耐旱转基因作物育种中以提高其耐旱性，具有广阔的应用前景。

1.吴金山等人,植物对干旱胁迫的生理机制及适应性研究进展.山西农业大学学报,2017.37(6):p.452.

2.Kasuga,M.,et al.,A combination of the Arabidopsis DREB1A gene andstress-inducible rd29A promoter improved drought-and low-temperature stresstolerance in tobacco by gene transfer.Plant Cell Physiol,2004.45(3):p.346-50.

3.Zhao,B.Y.,et al.,BnaABF2,a bZIP transcription factor from rapeseed(Brassica napusL.),enhances drought and salt tolerance in transgenicArabidopsis.Bot Stud,2016.57(1):p.12.

4.Hu,H.H.,et al.,Overexpressing a NAM,ATAF,and CUC(NAC)transcriptionfactor enhances drought resistance and salt tolerance in rice.Proceedings ofthe National Academy of Sciences of the United States of America,2006.103(35):p.12987-12992.

5.Zhao,Z.,et al.,Deep-sequencing transcriptome analysis of chillingtolerance mechanisms of a subnival alpine plant,Chorispora bungeana.BMC PlantBiology,2012.12(1):p.222.

发明内容

本发明的目的是提供一种耐旱基因CbDREB2AS及其编码蛋白。

本发明的另一个目的在于提供一种培育耐旱转基因植物的方法，是将所述的编码基因转入植物中，得到具有耐旱特性的转基因植物。

本发明的又一个目的在于提供一种由所述耐旱基因CbDREB2AS用于转化植物以产生耐旱转基因植物的用途。

含有本发明基因的表达载体、细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

本发明克隆了高山离子芥的耐旱基因CbDREB2AS，所述耐旱基因CbDREB2AS具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，其中，列表中的SEQ ID NO：1由990个碱基组成。该耐旱基因CbDREB2AS能够编码CbDREB2AS蛋白，此种蛋白具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，其中，列表中的SEQ ID NO：2由330个氨基酸组成。

本发明中CbDREB2AS基因编码的蛋白与双子叶植物山萮菜(Es)、天蓝遏蓝菜(Nc)、琴叶拟南芥(Al)、拟南芥(At)以及花生(Ah)等的同源基因具有较近的亲缘关系。

可用现有的植物表达载体构建含有CbDREB2AS基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如PMDC32、pCAMBIA3301、pCAMBIA1300或其它衍生植物表达载体。携带有本发明基因CbDREB2AS的植物表达载体可通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到植物细胞或组织中。被转化的宿主植物可以是拟南芥、烟草等双子叶植物。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GFP基因、GUS基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除芳剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

本发明所提供的获得耐旱的转基因植物的方法，是将上述植物耐旱蛋白的编码基因CbDREB2AS导入植物中，得到耐旱转基因植物。

本发明将CbDREB2AS基因的cDNA构建在CaMV35s启动子下游，得到表达载体(其图谱如图2所示)，利用电击转化的方法即得到含有该表达载体的农杆菌菌株，利用浸花法转染野生型拟南芥得到过表达的转基因植株。所述植物可为双子叶植物，如烟草、拟南芥等。

本发明通过对比试验验证了含有CbDREB2AS基因的转基因植株具有耐旱特性，图3和图4结果显示，CbDREB2AS的过表达可以显著增强拟南芥的耐旱特性，使干旱处理之后的拟南芥的存活率提高了50％左右。这对于培养优良的植物品种特别是耐旱植物品种具有重要的理论及实践意义。

附图说明

图1高山离子芥CbDREB2AS蛋白的氨基酸序列经同源性比对，利用MEGA软件分析的进化关系。

图2构建的过表达载体图谱，PMDC32-CbDREB2AS。

图3对照(野生型Col-0)和转基因植株(S-1,S-2,S-10)耐旱性表型比较。

图4对照(野生型Col-0)和转基因植株(S-1,S-2,S-10)干旱处理后的存活率比较。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案，但本发明的保护范围不局限于以下所述。

在本发明的下述实施例中，所用的实验材料为高山离子芥(Chorisporabungeana，又名Chorispora exscapa)(西部地区特色植物种质资源库平台)和拟南芥Col-0(Arabidopsis thaliana，Col-0)(美国拟南芥生物资源中心)，农杆菌GV3101(普如汀生物技术有限公司),质粒PMDC32(美国拟南芥生物资源中心)。

实施例1高山离子芥耐旱蛋白编码基因CbDREB2AS序列的克隆：

利用RNA提取分离试剂(Trizol，Invitrogen)分离高山离子芥再生苗总RNA，其具体方法是：收集高山离子芥再生苗100mg，立即置于液氮中研磨成粉末，之后加入1mlTrizol试剂，充分混匀，吸入到一个1.5ml的离心管中；室温放置5min；加入0.2ml新鲜氯仿，剧烈振摇15s，室温静置3min；4℃，12000g离心15min；上清转移到一个新的1.5ml离心管中，加入0.5ml异丙醇混匀，4℃，12000g离心10min沉淀RNA；RNA沉淀用1ml 75％乙醇洗涤后溶于适量DEPC处理过的水中，-70℃保存备用。

根据快速末端扩增技术(RACE)获取该基因全长序列，然后设计以下引物进行编码区的克隆：

5’端引物：

GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGGCAGTATACGATCAGAGTGGAG，

(其中划线序列为InvitrogenGateway系统attB1序列)；

3’端引物：

GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTCACTTCTCCAGATCCAAGAAACTCAAGTCG，

(其中划线序列Invitrogen Gateway系统attB2序列)。

通过RT-PCR扩增得到CbDREB2AS的cDNA序列，具体方法是：

依据PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa,No.6210A)的手册进行:4μl总RNA(约3μg)和试剂盒中的部分试剂混合(Oligo dT Primer 1μl,dNTPMixture 1μl,RNase free Water 4μl)，65℃处理5min之后立刻冰上冷却，继续加入试剂混合(5×PrimeScript II Buffer 4μl，RNase Inhibitor 0.5μl，PrimeScript II RTase 1μl，RNase free Water 4.5μl)，混匀后，42℃处理60min；95℃处理5min，完成反转录反应。

吸取2μl上述反转录产物，作为模板进行PCR反应：94℃2min后进入扩增程序：94℃30s、55℃30s、72℃50s,30个循环后，72℃5min。扩增得到的SEQ ID NO：1序列总长990个碱基，编码330个氨基酸,根据the 1997 IUPAC standard atomic weights,assuming pH＝7.0计算分子量为36.749kDa,根据ExPASy's ComputepI/Mw program计算等电点为4.834。

本发明中CbDREB2AS基因编码的蛋白与双子叶植物与山萮菜(Es)、天蓝遏蓝菜(Nc)、琴叶拟南芥(Al)、拟南芥(At)以及花生(Ah)的同源基因有较近的亲缘关系，如图1所示。

实施例2转CbDREB2AS基因植株的获得及耐旱特性的测定

1、高山离子芥CbDREB2AS基因植物过表达载体的构建：利用Invitrogen公司Gateway技术将测序验证过的实施例1得到的片段通过BP反应(BPII Enzyme mix，Invitrogen No.11789020)重组到pDONR/Zeocin载体(Invitrogen No.12535-035)，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞中，经20mg/L的Zeocin筛选获得入门克隆，之后提取质粒再通过Gateway技术中的LR反应(LRII Enzyme mix，Invitrogen No.11791100)将CbDREB2AS基因重组到PMDC32载体上，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞中，经50mg/L卡那霉素筛选得成功重组的过表达载体PMDC32-CbDREB2AS，结果如图2所示。

2、农杆菌介导的转化：将构建成功的过表达质粒PMDC32-CbDREB2AS通过电击的方式(电压2400V，电容25F，阻抗200Ω，电击杯1mm)转化农杆菌GV3101，用10mg/L利福平+50mg/L卡那霉素的LB平板筛选阳性克隆。将阳性克隆接种到YEP液体培养基中(含抗生素：链霉素25mg/L、利福平50mg/L、卡那霉素50mg/L)于恒温摇床上28℃，180rpm摇床培养至OD600＝0.6-0.8，离心后用侵染培养基(1/2MS，5％sucrose，0.01％silwetL-77，pH5.7)重悬OD600＝0.8-1。将拟南芥Col-0倒置使花苞浸没在侵染培养基溶液里30-60秒，用保鲜膜将侵染之后的拟南芥地上部分包裹，黑暗培养两天之后去掉保鲜膜，并用清水轻柔冲洗侵染部分，正常条件(25℃，16小时光照、8小时黑暗)继续培养直至收获种子。

3、转基因株系的筛选：将转基因拟南芥收获的种子，经表面消毒后，种在含有50mg/L潮霉素的MS平板上进一步筛选，经过传代，半定量PCR验证，最后得到纯合的CbDREB2AS过表达的拟南芥T2代转基因株系。

4、转基因CbDREB2AS拟南芥株系的耐旱性测定：将萌发4周的转基因拟南芥和野生型拟南芥同时停止浇水，干旱处理15天，然后恢复浇水5天，统计存活率。

结果显示CbDREB2AS的过表达可以显著增强拟南芥的耐旱性，如图3所示，与野生型拟南芥相比，含有CbDREB2AS基因的转基因拟南芥在干旱下的存活率提高了50％左右，结果如图4所示。

序列表

<110> 兰州大学

<120> 一种耐旱基因及其用于制备耐旱转基因植物的应用

<141> 2017-12-29

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 990

<212> DNA

<213> 高山离子芥(Chorispora bungeana)

<400> 1

atggcagtat acgatcagag tggagaagtc aatagaacac aactcgatac atcgaggaaa 60

aggaaatcga gaagtagagg tgatggtaca actgttgcag agaggttaaa gagatggaaa 120

gagtacaatg cgactgtaga agaagcatca gccacaaaga aaaggaaagt acctgcaaaa 180

gggtctaaga aaggttgtat gaaaggcaaa ggaggaccag agaatggtcg ttgtagtttc 240

agaggagtta gacaaaggat ttggggtaaa tgggttgctg agattagaga gcctaataga 300

ggaagtagac tttggctcgg cactttccca actgctgaag cagctgcctc tgcttatgat 360

gaggctgcta aagccatgta tggtcctttg gctcgtctta atttccctca atccgctgct 420

tctgatgaca cgagtacttc tagtcagtct gaggtgtgta cggctgagac ttatcctggt 480

ggtggtgttc atgtgaaaac agaggatgca gattgcgaat ccaaaccatt tgtcagtgaa 540

gctaaaccat tttccagtga agctaagccg atgaatacga ataacgattg gctgagcgag 600

tttgagcaga agtattggag tggagttgtg aaggagaaag agaaacagaa gaaggagatt 660

gatgaaactt gtcagcaaca gcaacaacaa caagaacaac aagagcaagt agattcgctt 720

tctgtttcgg actacggttg gccttgtgat gtggatcagg ctcaatggga ctcgtctgag 780

atgtttgatg ttaatgagct tctaggagac atcaatggcg acattttcac aggtttgaac 840

caggatcaat actcagggaa caatgttgga ttatccgagg cagagaagca gcaaagcggg 900

tactatactc tagactctgg ttatggattg cctccacttc aaatcgaagc gccggatggt 960

ttcgacttga gtttcttgga tctggagaag 990

<210> 2

<211> 330

<212> PRT

<213> 高山离子芥(Chorispora bungeana)

<400> 2

Met Ala Val Tyr Asp Gln Ser Gly Glu Val Asn Arg Thr Gln Leu Asp

1 5 10 15

Thr Ser Arg Lys Arg Lys Ser Arg Ser Arg Gly Asp Gly Thr Thr Val

20 25 30

Ala Glu Arg Leu Lys Arg Trp Lys Glu Tyr Asn Ala Thr Val Glu Glu

35 40 45

Ala Ser Ala Thr Lys Lys Arg Lys Val Pro Ala Lys Gly Ser Lys Lys

50 55 60

Gly Cys Met Lys Gly Lys Gly Gly Pro Glu Asn Gly Arg Cys Ser Phe

65 70 75 80

Arg Gly Val Arg Gln Arg Ile Trp Gly Lys Trp Val Ala Glu Ile Arg

85 90 95

Glu Pro Asn Arg Gly Ser Arg Leu Trp Leu Gly Thr Phe Pro Thr Ala

100 105 110

Glu Ala Ala Ala Ser Ala Tyr Asp Glu Ala Ala Lys Ala Met Tyr Gly

115 120 125

Pro Leu Ala Arg Leu Asn Phe Pro Gln Ser Ala Ala Ser Asp Asp Thr

130 135 140

Ser Thr Ser Ser Gln Ser Glu Val Cys Thr Ala Glu Thr Tyr Pro Gly

145 150 155 160

Gly Gly Val His Val Lys Thr Glu Asp Ala Asp Cys Glu Ser Lys Pro

165 170 175

Phe Val Ser Glu Ala Lys Pro Phe Ser Ser Glu Ala Lys Pro Met Asn

180 185 190

Thr Asn Asn Asp Trp Leu Ser Glu Phe Glu Gln Lys Tyr Trp Ser Gly

195 200 205

Val Val Lys Glu Lys Glu Lys Gln Lys Lys Glu Ile Asp Glu Thr Cys

210 215 220

Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Glu Gln Gln Glu Gln Val Asp Ser Leu

225 230 235 240

Ser Val Ser Asp Tyr Gly Trp Pro Cys Asp Val Asp Gln Ala Gln Trp

245 250 255

Asp Ser Ser Glu Met Phe Asp Val Asn Glu Leu Leu Gly Asp Ile Asn

260 265 270

Gly Asp Ile Phe Thr Gly Leu Asn Gln Asp Gln Tyr Ser Gly Asn Asn

275 280 285

Val Gly Leu Ser Glu Ala Glu Lys Gln Gln Ser Gly Tyr Tyr Thr Leu

290 295 300

Asp Ser Gly Tyr Gly Leu Pro Pro Leu Gln Ile Glu Ala Pro Asp Gly

305 310 315 320

Phe Asp Leu Ser Phe Leu Asp Leu Glu Lys

325 330

Claims

1.一种高山离子芥耐旱基因CbDREB2AS，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种由权利要求1所述的耐旱基因CbDREB2AS编码的蛋白质CbDREB2AS，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.一种含有如权利要求1所述的耐旱基因CbDREB2AS的表达载体。

4.一种含有如权利要求1所述的耐旱基因CbDREB2AS的细胞系。

5.一种含有如权利要求1所述的耐旱基因CbDREB2AS的宿主菌。

6.一种如权利要求1所述耐旱基因CbDREB2AS用于转化植物以产生耐旱转基因植物的用途。

7.一种含有如权利要求1所述的耐旱基因CbDREB2AS的植物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：(1)表达载体的构建；(2)农杆菌介导的转化；(3)转基因株系的筛选。