CN109536516B - 玉米抗旱基因ZmDSR的克隆及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了玉米抗旱基因ZmDSR在玉米育种中的应用，所述的应用为玉米抗旱基因ZmDSR提高玉米品种耐干旱胁迫能力的应用。所述的玉米抗旱基因ZmDSR编码的蛋白质具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。所述的玉米抗旱基因ZmDSR具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。本发明还提供一种提高玉米耐干旱能力的植物表达载体，其主要活性成分为玉米抗旱基因ZmDSR编码的蛋白质，或表达该蛋白质的元件，或表达玉米抗旱基因ZmDSR的元件。用引物ZmDSR‑Cloning扩增ZmDSR基因，构建ZmDSR的过量表达载体，对拟南芥进行遗传转化。该基因在拟南芥植株中的过量表达，可以显著提高植株的耐旱性，为培育耐干旱玉米新品种提供了一种新途径。

Description

玉米抗旱基因ZmDSR的克隆及其应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及玉米抗旱基因ZmDSR的克隆及其应用。

背景技术

玉米是重要的粮食作物、饲料作物和能源作物，是我国第一大粮食作物；玉米在我国粮食安全保障体系中发挥重要作用。玉米生长期对水分需求量大，而我国国土面积的47％属于干旱半干旱地区，水资源匮乏(王涛,杨保同,A.Braeuning et al.近0.5ka来中国北方干旱半干旱地区的降水变化分析[J].科学通报,2004,49(9):883-887)；加上近年来全球气候变暖，降雨量减少，加剧了我国干旱半干旱区水资源紧张的局面。干旱造成玉米产量的大幅度下降，严重年份，甚至造成玉米颗粒无收；在所有影响因素中，干旱是影响我国玉米种植、生长、产量的最重要因素(佘花娣,李孝,陆晴等.玉米耐旱育种研究进展[J].农业与技术,2013,(9):126-127.)。培育耐干旱玉米新品种，保持玉米产量稳定是保障我国粮食安全的当务之急，玉米耐旱基因的研究为培育抗逆、资源节约型玉米新品种提供理论依据。

近二十年来，玉米抗旱性研究取得了重要研究进展。玉米基因组中120个WRKY转录因子中，多达58个WRKY基因响应干旱胁迫(Zhang T,Tan D,Zhang L,et al.Phylogeneticanalysis and drought-responsive expression profiles of the WRKY transcriptionfactor family in maize[J].Agri Gene,2017,3:99-108.)；ZmWRKY58的过量表达可显著提高转基因水稻的耐旱性(Cai R,Zhao Y,Wang Y,et al.Overexpression of a maizeWRKY58,gene enhances drought and salt tolerance in transgenic rice[J].PlantCell,Tissue and Organ Culture(PCTOC),2014,119(3):565-577.)。转录因子ZmNAC111表达量的提高，能够促进玉米叶片气孔在干旱胁迫下关闭、提高水分利用效率，增强玉米耐旱能力；抑制该基因表达，可显著降低玉米的抗旱性(Mao H,Wang H,Liu S,et al.Atransposable element in a NAC gene is associated with drought tolerance inmaize seedlings[J].Nature Communications,2015,6(8326):8326.)。从玉米耐旱自交系“CN165”中分离得到NAC家族基因ZmSNAC1，受非生物逆境胁迫诱导而表达上调，受水杨酸诱导表达下调；在干旱胁迫条件下，ZmSNAC1过表达转基因株系较野生型株系存活率提高了50-52％，转基因株系的相对电导率较野生型株系降低了17-21％，叶绿素含量较对照株系提高了36-47％，脯氨酸含量提高了17-23％。玉米ZmVPP1基因编码一个定位于液泡膜上的质子泵-焦磷酸水解酶。提高ZmVPP1的表达量可以促进根系发育、增加侧根数目、提高叶片的光合速率和水分利用效率，从而增强玉米的抗旱能力。在田间干旱缺水条件下，ZmVPP1过表达植株的产量显著高于对照植株，其产量受干旱影响较小(Wang X,Wang H,Liu S,etal.Genetic variation in ZmVPP1 contributes to drought tolerance in maizeseedlings[J].Nature Genetics,2016.)。Liu等(2013)以玉米ZmDREB基因家族为研究对象，在玉米B73基因组中，分离克隆了18个ZmDREB基因。利用来自全球的386份玉米自然变异材料，对ZmDREB基因与玉米抗旱性进行了关联分析。研究发现，ZmDREB2.7基因与玉米抗旱性呈现极显著相关(Liu S,Wang X,Wang H,et al.Genome-wide analysis of ZMDREBgenes and their association with natural variation in drought tolerance atseedling stage of Zea mays L[J].PLoS Genetics,2013,9(9):e1003790.)。抗旱基因的克隆与功能解析为创制玉米耐旱材料提供了理论基础，为玉米耐旱的分子设计育种提供了新的基因资源和选择靶点。

发明内容

本发明的目的是在玉米基因组中克隆抗旱基因，创制耐干旱的转基因玉米材料，解决植物在高温、干旱逆境条件下的生长发育问题。

为解决上述技术问题，本发明采用了以下方案：

玉米抗旱基因ZmDSR在玉米育种中的应用。

进一步地，所述的应用为玉米抗旱基因ZmDSR提高玉米品种耐干旱胁迫能力的应用。

进一步地，所述的玉米抗旱基因ZmDSR编码的蛋白质具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

进一步地，所述的玉米抗旱基因ZmDSR具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

进一步地，本发明还提供一种提高玉米耐干旱能力的植物表达载体，其主要活性成分为玉米抗旱基因ZmDSR编码的蛋白质，或表达该蛋白质的元件，或表达玉米抗旱基因ZmDSR的元件。

具体地，所述的玉米抗旱基因ZmDSR编码的蛋白质具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

具体地，所述的玉米抗旱基因ZmDSR具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

玉米082自交系抗旱基因ZmDSR CDS全长234bp，编码的蛋白质具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。用聚乙二醇模拟干旱胁迫处理玉米三叶期幼苗，基因表达量检测结果表明ZmDSR强烈响应干旱胁迫。

用引物ZmDSR-Cloning扩增ZmDSR基因，构建ZmDSR的过量表达载体，对拟南芥进行遗传转化。过表达转基因株系OE3、OE7和OE12的生物量、根长、胁迫处理下的存活率及保水率均高于野生型拟南芥，说明过表达ZmDSR基因增强了转基因株系在干旱胁迫的长势，表现出了更高的抗逆性。按照同样的方法构建ZmDSR的过量表达载体，对玉米、水稻、小麦植株进行遗传转化，可以提高转基因植株的耐干旱能力。

本申请的有益效果：本申请提供的ZmDSR基因是玉米中未知的，可显著提高植物耐干旱胁迫的一个基因。该基因在拟南芥植株中的过量表达，可以显著提高植株耐干旱的抗逆性，为快速培育耐干旱玉米新品种提供了一种新的途径。本发明成功克隆了耐干旱基因ZmDSR，提供了该基因的核苷酸序列和编码蛋白质氨基酸序列，为玉米抗逆材料的创制及新品种的选育提供理论基础和应用参考。

附图说明

图1为ZmDSR基因扩增电泳图；

标识：M代表DNA标准分子量，泳道1和2为ZmDSR基因PCR扩增片段

图2为ZmDSR在干旱胁迫条件下表达量检测图；

图3为ZmDSR表达载体酶切验证图；

标识：M代表DNA标准分子量，泳道1为重组质粒BglII和PmlI酶切

图4为ZmDSR过表达载体构建示意图；

标识，CaMV 35s promoter：花椰菜花叶病毒35s启动子；Nos-poly A：Nos多聚腺苷酸；T-Border(right)：T-DNA右边界；pVS1 sta：pVS1稳定位点；pVS1 rep：pVS1复制起始位点；pBR322 ori：pBR322复制起始位点；pBR322-bom：pBR322框；kanamycin(R)：卡那霉素抗性基因；T-Border(L)：T-DNA左边界；CaMV 35s polyA：花椰菜花叶病毒35s多聚腺苷酸；phosphinothricin(R)：抗草铵膦基因

图5为ZmDSR转基因拟南芥干旱胁迫、复水处理后存活率统计图；

标识：**代表该株系与野生型存活率在统计学上具有极显著差异

图6为ZmDSR转基因拟南芥离体叶片保水率统计图；

图7为模拟干旱胁迫条件下ZmDSR转基因拟南芥根长统计图；

标识：*代表该株系与野生型根长在统计学上具有显著差异

图8为模拟干旱胁迫条件下ZmDSR转基因拟南芥鲜重分析图；

标识：*和**分别代表该株系与野生型在统计学上具有显著和极显著差异

具体实施方式

为了详细阐释专利发明过程、发明专利用途，下述内容结合图表说明对发明实施例进行详细描述，但本发明的实施方式不限于此。

本发明技术方案使用的分子生物学实验方法均为常规操作技术，参照《分子克隆实验指南(精编版)》(J.萨姆布鲁克、D.W.拉塞尔著，黄培堂等译，化学工业出版社2007)和《精编分子生物学实验指南》(F.M.奥斯伯、R.布伦特、R.E.金斯顿等著，金由辛、包慧中和赵丽云等译，科学出版社2008)。

本发明研究材料玉米自交系082为西南大学玉米研究所培育。实验中所有试剂，如RNA提取试剂盒、质粒提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；普通Taq酶购自北京全式金生物技术有限公司；反转录试剂盒、限制性内切酶购自Fermentas公司；高保真聚合酶PrimeSTAR、T4DNA连接酶购自TaKaRa公司；DNA测序、引物合成在生工生物工程(上海)股份有限公司完成；过表达载体由中国农业大学国家玉米改良中心提供。

实施例1 ZmDSR基因的克隆

根据Gramene(http://www.gramene.org/)公布的ZmDSR基因(Gene ID:GRMZM2G122476)的cDNA序列，用在线引物设计软件Primer-BLAST(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi)设计引物ZmDSR-Cloning，正向引物序列：AGATCTTATGGCGCCGCCGGGGT，反向引物序列：CACGTGCTAGTAGTGGCAGCTCGTACCTAAC；然后用082材料提取的RNA反转录后生成的cDNA为模板进行扩增，电泳结果显示PCR产物在250bp左右，如图1。PCR产物连接到克隆载体，然后送测序公司测序，结果显示该基因CDS全长234bp，核苷酸序列见SEQ ID NO.1，编码77个如SEQID NO.2所示的氨基酸。

实施例2 ZmDSR在干旱胁迫条件下表达量检测

将082种子播于基质中，至幼苗生长至3叶期，用蒸馏水洗净其根部基质，并用滤纸吸干根部的水分；将洗净后的幼苗根部置于10％的PEG-4000水培液中，用气泵通气，增加溶液中氧气，每天通气3～4次；分别处理0h、1h、6h、12h、24h后取样，用于后续提取RNA，反转录生成cDNA模板。

利用克隆的ZmDSR基因的CDS序列，应用在线引物设计软件Primer-BLAST(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi)设计定量引物ZmDSR-qPCR扩增PEG-4000处理玉米幼苗，其中正向引物序列为：GGCGTACTTGGATTCTACGTCA，反向引物：CTTTATCCTCCCGCTGTACCTC。不同时间点材料RNA生成的cDNA，对ZmDSR基因的表达量进行分析，如图2所示。培养1h后基因的相对表达量超过2，培养12h后ZmDSR基因的相对表达量为最大值3.5，培养0h、6h、24h后ZmDSR基因的相对表达量都为1，故最佳处理时间为12h。

实施例3 ZmDSR表达载体构建

用添加了BglII和PmlI酶切位点的过表达载体引物ZmDSR-Cloning扩增ZmDSR CDS序列，酶切后连接到双元载体pCAMBIA3301(国家玉米改良中心惠赠)，酶切验证结果显示表达载体中插入了一个约为250bp左右大小的片段，符合预期目标，因此ZmDSR表达载体构建成功，如图3所示。ZmDSR由35s启动子驱动，pCAMBIA3301载体在T-DNA区域带有一个选择标记基因bar，该基因编码草丁膦乙酞CoA转移酶(PAT)，可催化草丁膦的自由氨基乙酞化，从而使除草剂草丁膦失活，见图4。

实施例4 ZmDSR表达载体对拟南芥的遗传转化

将ZmDSR-pCAMBIA3301重组质粒转化EHA105农杆菌，挑单克隆菌落摇菌至OD值约为0.6；选取生长健壮盛花期拟南芥，将刚露白的花蕾完全浸泡在转化缓冲液中0.5～1min，期间轻柔摇动花序使花序充分接触浸染菌液；待植株上所有的花序浸染完全后，将植株倾斜放置于预先准备的箱子内，将箱子放置于16℃～18℃的环境中，暗培养22～24h后取出浸染植株，转至正常培养条件下继续培养。

实施例5转基因拟南芥干旱胁迫处理

转基因阳性拟南芥种子播于MS培养基，培养基组份为：MS盐4.432g、蔗糖30g、固体琼脂9g，约一周后移栽至土壤，每三天用同等体积自来水150ml灌溉一次。灌溉三次后，停止浇水，进行干旱胁迫处理十五天，然后进行复水。统计复水前后野生型拟南芥和转基因拟南芥的存活率。由图5可见，转基因拟南芥比野生型拟南芥的存活率明显增加，OE3、OE7转基因拟南芥存活率都超过25％，其中OE7转基因拟南芥存活率接近30％。实验结果表明ZmDSR基因可以提高植株耐干旱的能力。

实施例6转基因拟南芥离体叶片保水率统计

将转基因和野生型灭菌拟南芥种子播种于MS培养基上，4℃黑暗处理72h，光照培养箱正常条件下生长10～12天后移载于蛭石：营养土比例为1:1的营养钵中，培养3～4周；剪取拟南芥中部大小较一致的叶片4～5片，每个株系24棵植株混合取样，每个株系设3个重复实验，对收集的样品准确初始称量后将叶片置于正常拟南芥培养条件中，0～4h期间每隔0.5h称量一次，从第4h起至第6h为止每隔1h称量一次；每个时间点所称重量与初始称量的百分比即为离体叶片保水率。如图6所示，转基因拟南芥的保水率明显高于野生型拟南芥的保水率，其中OE7转基因拟南芥的保水率最高。实验结果表明ZmDSR基因可以增强拟南芥叶片的储水能力，进而提高其耐干旱的能力。

实施例7在模拟干旱胁迫条件下对转基因拟南芥的根进行形态学观察

灭菌种子播种于MS平板上，4℃黑暗处理72h，光照培养箱中正常条件下生长4d后转移至含100mM甘露醇的1/2MS平板，竖直培养7d，观察根部形态变化，统计根长。每个株系重复8～10株，设置3～5个重复实验，统计平均根长。如图7所示，在不含甘露醇的MS培养基上，转基因拟南芥和野生型拟南芥的生长状况没有明显区别，各植株的平均根长相差不大。转移至含甘露醇的MS平板后，转基因拟南芥和野生型拟南芥的生长都受到抑制，野生型拟南芥生长受到的抑制更严重，转基因拟南芥的根长较野生型明显更长。实验结果表明ZmDSR基因可以增强拟南芥在干旱胁迫条件下的生长能力。

实施例8模拟干旱胁迫条件下转基因拟南芥的生物量统计

野生型和转基因灭菌种子播种于含100mM甘露醇的MS平板，每个株系播种30粒种子，设置3～5个重复实验；播种后的平板于4℃黑暗处理72h后，放置光照培养箱中，正常条件下生长14d，整株取出平板中的拟南芥幼苗，将根部的培养基清除干净；使用分析天平称量每株系30株拟南芥幼苗的鲜重，计算平均值。如图8所示，在含甘露醇的MS培养基上各植株的长势都受到抑制，野生型拟南芥的鲜重下降较剧烈，而转基因拟南芥鲜重下降较小。在含甘露醇的MS培养基上生长相同时间后，转基因拟南芥的鲜重明显比较野生型更重，实验结果表明ZmDSR基因可以增强拟南芥植株的组织含水量，进而增强其抗干旱能力。

干旱是影响玉米产量最为关键的因素。我国近一半国土处于干旱半干旱区域，全球气候变暖，降雨的不均衡，导致这些区域水资源的极度匮乏，严重影响了玉米的生产。上述实施例通过克隆玉米耐旱基因ZmDSR，构建过表达载体，对拟南芥进行遗传转化，可显著提高转基因株系的耐旱性。该研究为通过基因工程育种培育耐旱玉米新品种提供了基因资源。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，依据本发明的技术实质，在本发明的精神和原则之内，在本发明基础上对形式和细节做出的任何修改、等同替换与改进等，均仍属于本发明技术方案的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 西南大学

<120> 玉米抗旱基因ZmDSR的克隆及其应用

<130> 2018

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 234

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggcgccgc cggggtcgcg gcggtgggct tacgtgcgcg tgatggccgg caccatcctc 60

ggtggcgtac ttggattcta cgtcatgcac cgcatcgaga cctcgtacaa ggcgaggatg 120

gaggagaggc tgcggaggta cgaggcgcat atgctcgcca aagccaagga gtcgcagcag 180

ttgcaggacg aggtacagcg ggaggataaa gcccagttcc tgcccgactc gtga 234

<210> 2

<211> 77

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Ala Pro Pro Gly Ser Arg Arg Trp Ala Tyr Val Arg Val Met Ala

1 5 10 15

Gly Thr Ile Leu Gly Gly Val Leu Gly Phe Tyr Val Met His Arg Ile

20 25 30

Glu Thr Ser Tyr Lys Ala Arg Met Glu Glu Arg Leu Arg Arg Tyr Glu

35 40 45

Ala His Met Leu Ala Lys Ala Lys Glu Ser Gln Gln Leu Gln Asp Glu

50 55 60

Val Gln Arg Glu Asp Lys Ala Gln Phe Leu Pro Asp Ser

65 70 75

Claims (2)

1.玉米抗旱基因ZmDSR在玉米育种中的应用，其特征在于，所述的应用为玉米抗旱基因ZmDSR提高玉米品种耐干旱胁迫能力的应用；所述的玉米抗旱基因ZmDSR编码的蛋白质具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的玉米抗旱基因ZmDSR在玉米育种中的应用，其特征在于：所述的玉米抗旱基因ZmDSR具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

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