CN109111514A - 兼抗纹枯病和根腐病的转基因小麦的培育方法及其相关生物材料 - Google Patents

Abstract

本发明公开了兼抗纹枯病和根腐病的转基因小麦的培育方法及其相关生物材料。该培育抗病的转基因小麦的方法，包括向受体小麦中导入氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的蛋白质的编码基因，得到抗病性高于所述受体小麦的转基因小麦的步骤；所述抗病性为对纹枯病的抗性和/或对根腐病的抗性。将TaOCS导入小麦的转基因实验证明，TaOCS过表达的转基因小麦与受体小麦相比，对纹枯病和根腐病的抗性显著提高，说明TaOCS是与植物纹枯病和根腐病相关的蛋白，TaOCS及其编码基因可用于提高植物对纹枯病和/或根腐病的抗性。

Description

兼抗纹枯病和根腐病的转基因小麦的培育方法及其相关生物 材料

技术领域

本发明涉及分子生物学和基因工程领域中兼抗纹枯病和根腐病的转基因小麦的培育方法及其相关生物材料。

背景技术

全球50％以上人口以小麦作为主粮作物，因此小麦对于保障粮食安全起着举足轻重的作用。随着种植密度增加、肥水条件和耕作制度的改变，小麦纹枯病和根腐病经常发生。小麦纹枯病，也称为小麦尖眼斑病(wheat sharp eyespot)，我国小麦纹枯病主要由腐生营养型病原真菌禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)引起的。纹枯病一般可使小麦减产10％～30％，严重地块则使小麦减产50％以上。小麦根腐病(common root rot)是由平脐蠕孢菌(Bipolaris sorokiniana)(有性态为禾旋孢腔菌

Cochliobolus sativus)等引起的小麦根部病害，于世界各国小麦产区均有发生，一般减产5％～10％，严重地块减产20％～50％。因此，选育和推广抗纹枯病和根腐病小麦新品种是防治该病害流行的最经济、安全和有效的途径，对于保障我国小麦稳产、高产非常重要。然而，由于缺乏易于利用的抗纹枯病和根腐病的小麦种质资源，常规育种方法在抗纹枯病和根腐病的小麦品种育种方面进展缓慢。分子生物学和基因工程的发展，特别是抗病重要基因的分离克隆及功能研究的进步，为抗纹枯病和根腐病小麦改良提供了一条新途径。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何提高植物的抗病性，该抗病性为植物对禾谷丝核菌和/或脐蠕孢菌的抗性。

为了解决上述技术问题，本发明首先提供了与植物抗病性相关的蛋白质。

本发明所提供的与植物抗病性相关的蛋白质，名称为TaOCS，为下述A1)或A2)或A3)的蛋白质：

A1)氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的蛋白质；

A2)在SEQ ID No.2所示的蛋白质的羧基末端或/和氨基末端连接蛋白标签得到的融合蛋白；

A3)将A1)或A2)所示的蛋白质经过一个以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)或A2)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且与植物抗病性相关的蛋白质

上述蛋白质中，所述蛋白标签(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。

上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

上述蛋白质中，所述90％以上的同一性可为至少91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。

上述蛋白质中，TaOCS可来源于小麦，如CI12633。

上述蛋白质中，SEQ ID No.2由723个氨基酸残基组成。

所述蛋白质相关的生物材料也属于本发明的保护范围。

本发明所提供的所述蛋白质相关的生物材料，可为下述S1)至S16)中的任一种：

S1)编码所述TaOCS的核酸分子；

S2)含有S1)所述核酸分子的表达盒；

S3)含有S1)所述核酸分子的重组载体；

S4)含有S2)所述表达盒的重组载体；

S5)含有S1)所述核酸分子的重组微生物；

S6)含有S2)所述表达盒的重组微生物；

S7)含有S3)所述重组载体的重组微生物；

S8)含有S4)所述重组载体的重组微生物；

S9)含有S1)所述核酸分子的转基因动物细胞系；

S10)含有S2)所述表达盒的转基因动物细胞系；

S11)含有S3)所述重组载体的转基因动物细胞系；

S12)含有S4)所述重组载体的转基因动物细胞系；

S13)含有S1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；

S14)含有S2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

S15)含有S3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

S16)含有S4)所述重组载体的转基因植物细胞系。

上述生物材料中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

上述生物材料中，S1)中编码所述TaOCS的核酸分子可为TaOCS基因。所述TaOCS基因可为如下D1)-D3)中任一所述的DNA分子：

D1)编码序列是序列表中序列1(SEQ ID No.1)的第1-2172位核苷酸的DNA分子；

D2)核苷酸序列是序列表中序列1的DNA分子；

D3)与D1)或D2)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码所述TaOCS的DNA分子。

其中，SEQ ID No.1由2295个核苷酸组成，其编码序列是序列表中序列1的第1-2172位核苷酸，编码序列表中序列2(SEQ ID No.2)所示的蛋白质。

上述生物材料中，90％以上的同一性可为至少91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述生物材料中，S2)所述的表达盒(TaOCS基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达TaOCS的DNA，该DNA不但可包括启动TaOCS基因转录的启动子，还可包括终止TaOCS转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S；来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)Plant Physiol120:979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸曱酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利2007 1 0099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4:3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I⁹⁸⁵)Nature 313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人Genes Dev.,5:141；Mogen等人(1990)PlantCell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.,15:9627)。

在本发明的实施例中，所述TaOCS基因表达盒中启动所述TaOCS基因转录的启动子为玉米Ubiquitin启动子，终止所述TaOCS基因转录的终止子为胭脂碱合成酶基因终止子TNos。

可用现有的植物表达载体构建含有所述TaOCS基因表达盒的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pWMB123、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对methatrexate抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

上述生物材料中，S5)-S8)所述的重组微生物具体可为酵母，细菌，藻和真菌。S9)-S16)所述的转基因细胞系可不包括繁殖材料。

为解决上述技术问题，本发明还提供了下述1)-6)中任一种应用：

1)所述蛋白质在调控植物抗病性中的应用；

2)所述蛋白质在制备提高植物抗病性的产品中的应用；

3)所述蛋白质在培育抗病植物中的应用；

4)所述蛋白质相关的生物材料在调控植物抗病性中的应用；

5)所述蛋白质相关的生物材料在制备提高植物抗病性的产品中的应用；

6)所述蛋白质相关的生物材料在培育抗病植物中的应用。

上述应用中，所述抗病性可为对纹枯病的抗性和/或对根腐病的抗性。

上述应用中，所述植物可为单子叶植物也可以是双子叶植物。所述单子叶植物可为小麦。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了抗植物纹枯病和/或抗植物根腐病的药剂。

本发明所提供的抗植物纹枯病和/或抗植物根腐病的药剂含有所述蛋白质或/和所述蛋白质相关的生物材料。

上述药剂的活性成分可为所述蛋白质或所述蛋白质相关的生物材料，上述药剂的活性成分还可含有其他生物成分或/和非生物成分，上述药剂的其他活性成分本领域技术人员可根据抗病效果确定。

上述药剂中，所述植物可为单子叶植物也可以是双子叶植物。所述单子叶植物可为小麦。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种培育抗病的转基因植物的方法。

本发明所提供的培育抗病的转基因植物的方法，包括向受体植物中导入所述蛋白质的编码基因，得到抗病性高于所述受体植物的转基因植物的步骤；所述抗病性为对纹枯病的抗性和/或对根腐病的抗性。

上述方法中，所述受体植物可为单子叶植物也可以是双子叶植物。所述单子叶植物可为小麦。

上述方法中，所述编码基因可为上述D1)-D3)中任一所述的DNA分子。

在本发明的实施例中，所述TaOCS的编码基因通过含有TaOCS基因表达盒的TaOCS基因重组表达载体导入目的植物中。

上述方法中，其中所述TaOCS基因可先进行如下修饰，再导入受体小麦中，以达到更好的表达效果：

1)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；

2)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；

3)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接；

4)引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV,MCMV和AMV)。

所述TaOCS可通过使用Ti质粒，植物病毒栽体，直接DNA转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(Weissbach,1998，Method for Plant Molecular BiologyVIII,Academy Press,New York,pp.411-463；Geiserson and Corey,1998,PlantMolecular Biology(2nd Edition)。

上述方法中，所述转基因植物理解为不仅包含将所述TaOCS转化受体植物得到的第一代到第二代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

上文中，所述纹枯病可由禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)引起，所述禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)具体可为禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)R0301。所述根腐病可由平脐蠕孢菌Bipolaris sorokiniana(有性态为禾旋孢腔菌Cochliobolussativus)引起。所述植物既可以是单子叶植物也可以是双子叶植物。所述单子叶植物具体可为小麦(如小麦品种周麦18)。

将TaOCS导入小麦的转基因实验证明，TaOCS过表达的转基因小麦与受体小麦相比，对纹枯病和根腐病的抗性显著提高，说明TaOCS是与植物纹枯病和根腐病相关的蛋白，TaOCS及其编码基因可用于提高植物对纹枯病和/或根腐病的抗性。

附图说明

图1为荧光定量PCR分析TaOCS基因的相对表达量。

图2为TaOCS基因的PCR检测。

图3为荧光定量分析TaOCS基因的转录水平。

图4为qRT-qPCR检测TaOCS基因的沉默情况。

图5为实施例3中小麦的纹枯病表型。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的小麦种质资源：CI12633和山红麦，表现抗纹枯病；小麦品种温麦6高感纹枯病，小麦品种周麦18感纹枯病。

小麦品系山红麦和温麦6为来自国家植物种质资源共享平台(中国农业科学院种质资源库)的种质；抗病小麦材料—小麦CI12633为来自江苏省农业种质资源保护与利用平台(江苏农业科学院种质资源库)的种质；小麦品种周麦18为来自周口农业科学研究院的种质。

下述实施例中的小麦纹枯病致病菌-禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)R0301(江苏省农业科学院)(冷苏凤,张爱香,李伟,陈怀谷.江苏省小麦新品种(系)对纹枯病的抗性分析.江苏农业学报,2010，26(6)：1176-1180)；小麦纹枯病致病菌WK207(Lei Ji·Chunju Liu,·Li Zhang,Aixin Liu,Jinfeng Yu.2017.Variation of rDNA InternalTranscribed Spacer Sequences in Rhizoctonia cerealis,Curr Microbiol74:877–884；郝宇，2016，小麦纹枯病菌效应因子的分离及功能研究，硕士学位论文),引自山东农业大学于金凤教授。公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的小麦根腐病致病菌-脐蠕孢菌(Bipolaris sorokiniana)分离于河北藁城试验站小麦根腐病的茎部(Na Dong,Xin Liu,Yan Lu,Li-pu DU，Hui-jun XU，Zhiyong Xin，Zengyan Zhang*(通讯作者)，2010，Overexpression of TaPIEP1,apathogen-induced ERF of wheat,confers host-enhanced resistance to fungalpathogen Bipolaris sorokiniana，Functional and Integrative Genomics，10：215-226)，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

单子叶植物表达载体pWMB123：由中国农业科学院作物科学研究所王珂等构建(Ke,Huiyun,Lipu Du and Xingguo Ye*,2016Generation of marker-freetransgenic hexaploid wheat via an Agrobacterium-mediated co-transformationstrategy incommercial Chinese wheat varieties,Plant Biotechnology Journal,pp.1–10doi:10.1111/pbi.12660)。公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。

BSMV-γ载体(Holzberg S,Brosio P,Gross C,Pogue GP.2002.Barley stripemosaic virus-induced gene silencing in a monocot plant.The Plant Journal 30,315-327)从美国引入，本实验室保存。公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

pMD18-T为宝生物工程(大连)有限公司产品。

下述实施例中，长满禾谷丝核菌的菌麦粒的制备方法：将浸泡5-6小时麦粒煮熟20分钟，塞满250-500毫升三角瓶，配制MS液体培养基，灭菌后，将新培养的禾谷丝核菌R0301的菌丝块接种到三角瓶中，25℃恒温培养至菌丝密集地布满麦粒。

实施例1、兼抗纹枯病和根腐病的小麦蛋白TaOCS及其编码基因的克隆

1、TaOCS基因的克隆

本发明的发明人从抗纹枯病小麦种质CI 12633中分离克隆出一个小麦抗病相关的蛋白，其氨基酸序列如序列表的序列2所示，将其命名为TaOCS蛋白。将编码TaOCS蛋白的基因命名为TaOCS基因，如序列表的序列1所示，具体克隆方法如下：

提取接种纹枯菌的小麦CI12633茎部总RNA，根据天根生化公司第一链cDNA合成试剂盒的程序，将提取的RNA样品反转录合成第一链cDNA，作为基因克隆的模板，以TaOCS-OF1：5'-GCGCGGATGAAACCCTAGC-3'和TaOCS-OR1：5'-GTATGGGTTACTGTTAGTCTTACG-3'为引物，进行第一轮PCR扩增，扩增程序为：先94℃预变性5分钟；然后94℃变性45秒，56℃复性45秒，72℃延伸2.5分钟，共35个循环；72℃延伸10分钟；以稀释50倍的第一轮PCR扩增产物作为模板，利用TaOCS-OF2：5'-ATGGCCGCCGCCGCGACGAC-3'和TaOCS-OR2：5'-TGGGTTACTGTTAGTCTTACGAAAA-3'为引物，进行第二轮PCR扩增，扩增程序为：先94℃预变性5分钟；然后94℃变性45秒，58℃复性45秒，72℃延伸2.5分钟，共35个循环；72℃延伸10分钟；第二轮PCR反应结束后，经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，回收目的PCR条带。将该第二轮PCR产物连接到pMD18-T载体上并测序。测序结果表明，该PCR扩增产物的核苷酸序列如序列表的序列1(第1-2295位核苷酸)，其编码序列是序列表中序列1的第1-2172位核苷酸；编码序列2所示的蛋白质TaOCS(第1-723位氨基酸)。

2、TaOCS基因受纹枯病菌诱导的表达分析

为了研究TaOCS基因表达量与小麦纹枯病抗性是否相关，利用RT-qPCR分析在禾谷丝核菌接种不同天数的抗纹枯病和感纹枯病小麦中TaOCS基因的表达情况。

用小麦纹枯病致病菌-禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)R0301菌丝牙签、麦粒接种于抗病小麦CI12633及感纹枯病小麦温麦6号分蘖期幼苗的叶鞘与茎间；于接种前(0d)和接种后4,7,10,14,21天，分别取各个小麦材料接种茎部组织，液氮速冻后储存于－80℃超低温冰箱备用。

分别提取各小麦材料茎的总RNA(每个样品约5μg总RNA)，根据天根生化公司第一链cDNA合成试剂盒的程序，反转录成cDNA。利用组成性表达的actin基因作为内参，将样品cDNA浓度均一化。然后用TaOCS基因的特异引物进行实时定量PCR(RT-qPCR)分析，用2^-△△CT法(Livak KJ,Schmittgen TD.2001.Analysis of relative gene expression datausing real-time quantitative PCR and the 2^-△△CT method.Methods.25:402-408)分析TaOCS基因在小麦纹枯病菌处理下的表达情况，每组样品重复3次。

内参基因TaActin的引物对：

TaActin-F：5’-CACTGGAATGGTCAAGGCTG-3’；

TaActin-R：5’-CTCCATGTCATCCCAGTTG-3’。

TaOCS基因的特异引物对：TaOCS-Q-F：5’-ATCCGACCTATGCGAAAGA-3’和TaOCS-Q-R：5’-GAAGTAAAGCAACAGCCACATT-3’

结果如图1所示。对TaOCS基因表达量分析结果表明，TaOCS基因受纹枯菌诱导表达，其表达量在接种纹枯菌后10d达到高峰(图1中A)。而且该基因在抗纹枯病小麦山红麦(Shanhongmai)和CI12633中的表达量都显著高于在感或高感纹枯病材料扬麦158((Yang158))、周麦16(Zhou16)和温麦6号(Wen6)中的表达量(图1中B)。暗示TaOCS基因表达量和小麦对纹枯病的抗性呈正相关。

实施例2、兼抗纹枯病和根腐病的转TaOCS基因小麦的获得和抗病性鉴定

一、重组表达载体的构建

将TaOCS基因完整的ORF序列构建到pWMB123，具体操作如下：

1、采用TaOCS-O-F和TaOCS-O-R组成的引物对，在高保真扩增酶PRIMERSTAR(TAKARA公司)的作用下进行PCR扩增，得到PCR扩增产物并回收。

TaOCS-O-F:5’-GACGGATCCATGGCCGCCGCCGCGACGAC-3’(下划线指示的序列为酶切位点序列)；

TaOCS-O-R:5’-TCAGAGCTCTTAGGATCTATTCTTTGGAGGTTTGAC-3’(下划线指示的序列为酶切位点序列)。

PCR反应程序：98℃预变性1min；98℃10s、56℃15s、72℃2min，35个循环；72℃10min。

2、回收并纯化步骤1得到的PCR扩增产物。

3、用限制性内切酶BamHⅠ和SacⅠ酶切单子叶植物表达载体pWMB123，回收载体骨架。

4、将步骤2回收的酶切产物和步骤3回收的载体骨架进行连接，得到重组表达载体pWMB123-TaOCS。

根据测序结果，对重组表达载体pWMB123-TaOCS进行结构描述如下：在单子叶植物表达载体pWMB123的BamHⅠ和SacⅠ识别位点之间插入了序列表中序列1第1-2172位核苷酸所示的DNA分子，即pWMB123-TaOCS为将pWMB123载体的BamHⅠ和SacⅠ识别位点间的DNA序列替换为SEQ ID No.1的第1-2172位核苷酸所示的DNA序列，保持其它DNA序列不变，得到表达SEQ ID No.2所示的TaOCS的重组载体。重组表达载体pWMB123-TaOCS中，TaOCS基因受Ubiquitin启动子控制。重组表达载体pWMB123-TaOCS中还具有1个受35S启动子控制的Bar基因表达盒，可为后续工作中利用除草剂双丙氨膦(Bialaphos)筛选转化再生植株提供抗性标记。

二、转基因植物的获得

1、将重组表达载体pWMB123-TaOCS导入农杆菌C58C1的感受态细胞，得到重组农杆菌。

2、将步骤1得到的重组农杆菌转化周麦18的幼胚愈伤组织，然后在渗透压培养基上后处理16h。

3、完成步骤2后，将愈伤组织转移到SD2培养基(MS培养基的无机盐成分中添加VB11mg/L，天冬门酰胺150mg/L,2,4-D 2mg/L)上，恢复培养2周(26℃，暗培养)。

4、完成步骤3后，将愈伤组织转移到分化筛选培养基(1/2MS培养基+萘乙酸1mg/L+激动素1mg/L+双丙氨膦2-5mg/L)中，24-26℃光照培养14d。

5、完成步骤4后，将愈伤组织分化的小苗转移到生长筛选培养基中(1/2MS培养基+双丙氨膦2-3mg/L)，24-26℃光照培养。获得了41株再生小麦植株。

6、将步骤5得到的再生植株转移到壮苗培养基(1/2MS培养基+0.5mg/L萘乙酸)上，将苗高7-8cm且根系发达的转化苗移栽到花盆。移栽3周以后，有32株再生小麦植株(T0代)成活。

7、转基因小麦的分子鉴定

在4叶期，每株成活的再生小麦植株取1个叶片提取基因组DNA，将基因组DNA作为模板，利用TaOCS基因特异的一段序列作为上游引物(TaOCS-F:5’-TATGGATGGTCCGTATTGG-3’)和载体Tnos序列特异的一段序列作为下游引物(tNOS-R:5'-AAACCCATCTCATAAATAACG-3')进行PCR扩增，以重组表达质粒pWMB123-TaOCS为阳性对照，周麦18的基因组DNA为阴性对照，预期扩增产物片段约为521bp。

PCR反应体系如下：

PCR反应程序如下：

先94℃5min；(94℃45s，54℃45s，72℃30s)，35个循环；再72℃10min；16℃保存。

PCR扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳检测，紫外拍照，记录结果。

PCR检测结果表明，在32株再生小麦植株(T₀代)中，PCR阳性植株(即为PCR产物有约521bp片段的转pWMB123-TaOCS植株，以下简称T₀代转pWMB123-TaOCS阳性植株)8株。

其中，5株T₀代转pWMB123-TaOCS阳性植株收获种子并被种植，得到T₁代单株。将T₁代单株进行PCR鉴定，方法同以上步骤。

在96株T₁代单株中，阳性植株69株，分属5个株系(记为OC1、OC2、OC3、OC4和OC5)，阳性率71.88％。

部分T₁代单株植株及其相应的T₀代植株的PCR检测结果见图2。图2中，P代表pWMB123-TaOCS重组表达载体质粒DNA，WT代表周麦18，OC1、OC2、OC3、OC4和OC5分别代表5个转基因小麦株系。

利用TaOCS基因特异的定量引物(TaOCS-QF:5’-ATCCGACCTATGCGAAAGA-3',TaOCS-QR:5’-GAAGTAAAGCAACAGCCACATT-3’和qRT-qPCR技术分析5个转基因株系T₁代植株中TaOCS基因的相对表达量。利用小麦内源actin基因作为内参。结果见图3。图3中，WT代表周麦18，OC1、OC2、OC3、OC4和OC5分别代表5个转基因小麦株系。OC1、OC2、OC3、OC4和OC5株系的转基因植株中TaOCS基因的相对表达量明显高于周麦18。

三、转空载体植物的获得

用载体pWMB123代替重组质粒pWMB123-TaOCS，其它同步骤二，得到转空载体周麦18植株，作为转基因植株的对照。

四、转基因植物的纹枯病和根腐病抗性鉴定

1、纹枯病抗性鉴定

用于鉴定的实验材料为步骤二的T₁代阳性转基因植株(OC1、OC2、OC3、OC4和OC5株系)、步骤三的转空载体周麦18植株和野生型周麦18。

在小麦拔节期，将3-8粒布满小麦禾谷丝核菌R0301的菌麦粒埋到小麦茎基部周围，接种后喷水保湿5-7天；于小麦收获时调查纹枯病病情。

小麦纹枯病病级按照小麦纹枯病病级标准(李斯深,李安飞,李宪彬等.1997,小麦种质对纹枯病抗性鉴定初报.作物品种资源.(4):31-33)进行划分，具体见表1。

表1.小麦纹枯病病级标准

其中，0级代表免疫、1级代表抗、2级代表中抗、3级-4级代表中感、5级代表高感。

病情指数(DI)＝[(Σ各级病株数×各级代表值)/(总株数×最高级代表值)]×100。

结果表明，接种小麦禾谷丝核菌R0301 50-60天，未转基因周麦18出现典型的纹枯病病症，纹枯病病情指数为76.96；而5个转TaOCS基因株系OC1、OC2、OC3、OC4和OC5的纹枯病病情指数分别为38.50、43.33、48.30、48.85和46.30，均与未转基因受体周麦18的达到显著(P<0.05)或极显著差异(P<0.01)(表2)，5个转TaOCS基因小麦株系与对照周麦18相比，小麦纹枯病抗病效果提高了36.53％-49.98％之间，说明TaOCS基因过表达显著增强了转基因小麦对纹枯病的抗性。

2、根腐病抗性鉴定

参考文献(Na Dong,Xin Liu,Yan Lu,Li-pu DU，Hui-jun XU，Zhiyong Xin，Zengyan Zhang*((通讯作者))，2010，Overexpression of TaPIEP1,a pathogen-inducedERF of wheat,confers host-enhanced resistance to fungal pathogen Bipolarissorokiniana，Functional and Integrative Genomics，10：215-226，在小麦拔节期，将3-7粒布满平脐蠕孢菌的菌麦粒埋到小麦茎基部周围，接种后喷水保湿5-7天，60天左右，成熟期进行根腐病病情调查并拍照。

其中，布满平脐蠕孢菌的菌麦粒的制备方法如下：将浸泡5-6小时麦粒煮熟20分钟，塞满250-500毫升三角瓶，配制MS液体培养基，灭菌后，将新培养的脐蠕孢菌(Bipolarissorokiniana)的菌丝块接种到三角瓶中，25℃恒温培养至菌丝密集地布满麦粒。

其中，小麦根腐病的病级(IT)参考文献(Na Dong,Xin Liu,Yan Lu,Li-pu DU，Hui-jun XU，Zhiyong Xin，Zengyan Zhang*((通讯作者))，2010，Overexpression ofTaPIEP1,a pathogen-induced ERF of wheat,confers host-enhanced resistance tofungal pathogen Bipolaris sorokiniana，Functional and Integrative Genomics，10：215-226)按照0-4级标准划分小麦根腐病的病级：

0级(IT 0)：全株无病；

1级(IT 1)：叶鞘有少量病斑，M1<1/4；M1＝叶鞘上的病斑面积/叶鞘的表面积；

2级(IT 2)：病菌侵入茎秆，1/4≦M2<1/2；M2＝茎杆上的病斑面积/茎秆的表面积；

3级(IT 3)：病菌侵入茎秆，1/2≦M2<3/4；M2＝茎杆上的病斑面积/茎秆的表面积；

4级(IT 4)：病菌侵入茎秆，M2≧3/4，茎秆已软腐；M2＝茎杆上的病斑面积/茎秆的表面积。

病情指数DI(％)＝(0×X₀+1×X₁+2×X₂+3×X₃+4×X₄)/[(X₀+X₁+X₂+X₃+X₄)]×4}×100；

式中，X₀、X₁、X₂、X₃、X₄分别表示根腐病0级、1级、2级、3级、4级的茎秆数。结果表明，接种脐蠕孢菌60天，未转基因周麦18出现典型的根腐病病症，根腐病病情指数为45.40；而5个转TaOCS基因株系OC1、OC2、OC3、OC4和OC5的根腐病病情指数分别为31.76、29.06、31.43、31.56和31.14，均与未转基因受体周麦18的达到显著(P<0.05)或极显著差异(P<0.01)(表2)，5个转TaOCS基因小麦株系与对照周麦18相比，小麦根腐病抗病效果提高了30.05％-35.99％之间，说明TaOCS基因过表达显著增强了转基因小麦对根腐病的抗性。

表2.转基因小麦与对照的纹枯病和根腐病病情的调查结果

注：*表示在P<0.05水平上各转基因株系与周麦18有显著差异；**表示在P<0.01水平上各转基因株系与周麦18有显著差异。

实施例3、沉默小麦CI12633中的TaOCS基因进行TaOCS反向功能分析

一、采用病毒介导的基因沉默技术沉默小麦CI12633中的TaOCS基因

1、将序列表中序列1的第2055-2246位核苷酸所示的DNA分子的两末端分别加上NheI识别序列，得到两末端带有NheI识别序列的DNA片段，将该DNA片段经NheI酶切后，以反向插入法插入到NheI酶线性化后的BSMV-γ(BMSV病毒的γ载体)上，使与序列表中序列1的第2055-2246反向互补的DNA分子(antiTaOCS)被γ载体的T7启动子驱动，得到用于沉默TaOCS的重组载体BSMV-γ：antiTaOCS。

2、于三叶一心期，用重组载体BSMV-γ：antiTaOCS转染抗小麦纹枯病材料——小麦CI12633的第二、三片叶，接种完成后，向小麦幼苗喷施DEPC水，保鲜膜覆盖保湿24h，之后移去保鲜膜，每隔6h喷施一次DEPC水。

3、接种第12天取第四片叶片，提取RNA，采用qRT-qPCR检测TaOCS基因沉默情况(TaOCS-QF:5’-ATCCGACCTATGCGAAAGA-3',TaOCS-QR:5’-GAAGTAAAGCAACAGCCACATT-3’)。结果如图4所示：导入BSMV-γ：antiTaOCS的CI12633植株中TaOCS基因被沉默，得到TaOCS基因沉默的CI12633植株，分别命名为BSMV-γ：antiTaOCS-1、BSMV-γ：antiTaOCS-2、BSMV-γ：antiTaOCS-3和BSMV-γ：antiTaOCS-4；而导入BSMV-γ的CI12633(图4中记为BMSV-γ，作为空载体对照)与野生型小麦CI12633中TaOCS基因的表达量没有显著变化。

二、被沉默植株的抗病性鉴定

步骤一的小麦转染BSMV病毒20天后，采用牙签接种法对其接种禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)WK207：将长满禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)WK207菌丝的牙签嵌入到基部第1-2叶鞘之间，菌麦粒置于植株的茎基部，用湿润的脱脂棉将其轻轻包围，保湿7天，以后每天喷施2次DEPC水。禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)WK207接种28天后，进行纹枯病病级鉴定(方法同实施例2)。结果表明TaOCS基因表达沉默后的BSMV-γ：anti TaOCS-CI12633植株茎部位的纹枯病病斑(平均病级3.16)明显大于对照(BMSV-γ-CI12633)植株的病斑(平均病级1.83)(图5)，表明TaOCS基因沉默降低了小麦CI12633对纹枯病菌的防御能力，上述结果说明TaOCS是CI12633抗纹枯病反应所需的基因。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

<110> 中国农业科学院作物科学研究所

<120> 兼抗纹枯病和根腐病的转基因小麦的培育方法及其相关生物材料

<130> GNCFH181880

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2295

<212> DNA

<213> 小麦（Triticum aestivum）

<400> 1

atggccgccg ccgcgacgac gatgctggac tccctcccgg cgccgttgct gcgggcgctg 60

cggctcaaga cgaagcagca ggagctgctc ctccgggtct ccgcgctggc gctcgtctac 120

gtgctcgcct tcgccgtgcg cctcttctcc gtgctccgct acgagtccat gatccacgag 180

ttcgacccct acttcaacta ccgcaccacg ctctacctca cggagcacgg ctactccgag 240

ttctggaact ggttcgacca cgagagctgg tacccgctcg gccgcgtcgt cgggggcacg 300

ctcttccccg ggctgatggt caccgccgcg ctgctccacc gcctcctccg cgcgctctcc 360

ctcgccgtcc acatccggga ggtctgcgtc ctcaccgccc ccttcttcgc cgccaacacc 420

acgctcgtcg cctacgcctt cggccgcgag atctgggact ccggggccgg cctcgtcgcc 480

gccgcgctca tcgccgtctg ccccggctac atctcccgct ccgtcgcggg ctcctacgac 540

aacgagggcg tcgccatctt cgcgctgctg ctcaccttct acctcttcgt ccgcgccgtc 600

aacaccgggt ccctcgcctg gtcgctcgcc gccgcgttcg gctacttcta catggtctcc 660

gcctggggag gctacgtctt catcatcaac ctcctcccgc tctacgtgct cgtcctgctc 720

gtcaccggga ggtactcgca gaggctctat gtcgcctaca actgtaccta tgtgctggga 780

atgctgctcg ggatgcagat ccgcttcgtc ggcttccagc atgttcagtc tggggaacac 840

atggccgcca tgggagtctt cttcctgttg caggttttct tcttcctgga ttgggtgaaa 900

tacatgctga atgatgtcaa actattcaag tcattcttga gaattaccct gacctgtgtg 960

ataagtgtcg gcaccctggc tcttgggatt ggtactgcgt caggttacat ctccccttgg 1020

acagggcggt tttattccct gcttgatccg acctatgcga aagaccatat accaatcatt 1080

gcatctgttt ctgagcatca gcccacagcc tggtcttctt ttatgtttga tttccacatc 1140

cttcttttcc tgttcccagc gggcctctat ttctgcttca agcgtctgtc agatgccaca 1200

atattcatag ttatgtatgg cctcacaagt atgtactttg ctggtgtgat ggtgaggttg 1260

attcttgttg cagcacctgc cgtttgcctt attagtgcca ttgctgtatc tgctacaata 1320

aagaatctga caacattgat ccggtcaaaa agcaaaagtc cacagactac aggaaaaaca 1380

acaggctcga aggcagctgc aaagggagca gttgatcaac cgttgccttt ccaacataat 1440

gtggctgttg ctttacttct gggcgctttc tacttgctca gtagatatgc catacactgc 1500

acttgggtaa cttctgaggc ttactcttct ccttccatcg ttctgtccgc aaggggtcac 1560

aatggaggaa gggttatatt cgatgattat cgtgaggcat actactggct tcgtcagaac 1620

actcctactg atgccaagat tatgtcatgg tgggactatg gctaccaaat tacagccatg 1680

ggtaacagaa ctgttattgt tgataataac acgtggaata atacacacat agcaactgtt 1740

gggcgggcaa tgtcatctta tgaagacgag gcatatgaga taatgcagtc actggatgtg 1800

aattatgtgc ttgtcgtatt tggaggtgtt actgggtact cctctgatga catcaataag 1860

ttcttatgga tggtccgtat tggtggagga gtttttcctg tgatcaaaga gcctgattac 1920

cttgtcaatg gggaatatcg tgttgacaag ggggcatcac caaaaatgtt gaactgtcta 1980

atgtacaagc tctgttatta tcgatttgga gaactgacca cggaatatgg aaaacctcca 2040

ggatacgata gagtgcgagg agtggagata ggcaacaaag acataaagct tgagtatttg 2100

gaggaggcat tcacaacatc aaactggata gtgcgcatat acaaggtcaa acctccaaag 2160

aatagatcct aaggtttcgt accaggaggg gagcggcaaa gcgagacggt ttggggtgat 2220

tgctttgaca tttatctcat caggagggtg cctagacatg aacttttttg ttttcgtaag 2280

actaacagta accca 2295

<210> 2

<211> 723

<212> PRT

<213> 小麦（Triticum aestivum）

<400> 2

Met Ala Ala Ala Ala Thr Thr Met Leu Asp Ser Leu Pro Ala Pro Leu

1 5 10 15

Leu Arg Ala Leu Arg Leu Lys Thr Lys Gln Gln Glu Leu Leu Leu Arg

20 25 30

Val Ser Ala Leu Ala Leu Val Tyr Val Leu Ala Phe Ala Val Arg Leu

35 40 45

Phe Ser Val Leu Arg Tyr Glu Ser Met Ile His Glu Phe Asp Pro Tyr

50 55 60

Phe Asn Tyr Arg Thr Thr Leu Tyr Leu Thr Glu His Gly Tyr Ser Glu

65 70 75 80

Phe Trp Asn Trp Phe Asp His Glu Ser Trp Tyr Pro Leu Gly Arg Val

85 90 95

Val Gly Gly Thr Leu Phe Pro Gly Leu Met Val Thr Ala Ala Leu Leu

100 105 110

His Arg Leu Leu Arg Ala Leu Ser Leu Ala Val His Ile Arg Glu Val

115 120 125

Cys Val Leu Thr Ala Pro Phe Phe Ala Ala Asn Thr Thr Leu Val Ala

130 135 140

Tyr Ala Phe Gly Arg Glu Ile Trp Asp Ser Gly Ala Gly Leu Val Ala

145 150 155 160

Ala Ala Leu Ile Ala Val Cys Pro Gly Tyr Ile Ser Arg Ser Val Ala

165 170 175

Gly Ser Tyr Asp Asn Glu Gly Val Ala Ile Phe Ala Leu Leu Leu Thr

180 185 190

Phe Tyr Leu Phe Val Arg Ala Val Asn Thr Gly Ser Leu Ala Trp Ser

195 200 205

Leu Ala Ala Ala Phe Gly Tyr Phe Tyr Met Val Ser Ala Trp Gly Gly

210 215 220

Tyr Val Phe Ile Ile Asn Leu Leu Pro Leu Tyr Val Leu Val Leu Leu

225 230 235 240

Val Thr Gly Arg Tyr Ser Gln Arg Leu Tyr Val Ala Tyr Asn Cys Thr

245 250 255

Tyr Val Leu Gly Met Leu Leu Gly Met Gln Ile Arg Phe Val Gly Phe

260 265 270

Gln His Val Gln Ser Gly Glu His Met Ala Ala Met Gly Val Phe Phe

275 280 285

Leu Leu Gln Val Phe Phe Phe Leu Asp Trp Val Lys Tyr Met Leu Asn

290 295 300

Asp Val Lys Leu Phe Lys Ser Phe Leu Arg Ile Thr Leu Thr Cys Val

305 310 315 320

Ile Ser Val Gly Thr Leu Ala Leu Gly Ile Gly Thr Ala Ser Gly Tyr

325 330 335

Ile Ser Pro Trp Thr Gly Arg Phe Tyr Ser Leu Leu Asp Pro Thr Tyr

340 345 350

Ala Lys Asp His Ile Pro Ile Ile Ala Ser Val Ser Glu His Gln Pro

355 360 365

Thr Ala Trp Ser Ser Phe Met Phe Asp Phe His Ile Leu Leu Phe Leu

370 375 380

Phe Pro Ala Gly Leu Tyr Phe Cys Phe Lys Arg Leu Ser Asp Ala Thr

385 390 395 400

Ile Phe Ile Val Met Tyr Gly Leu Thr Ser Met Tyr Phe Ala Gly Val

405 410 415

Met Val Arg Leu Ile Leu Val Ala Ala Pro Ala Val Cys Leu Ile Ser

420 425 430

Ala Ile Ala Val Ser Ala Thr Ile Lys Asn Leu Thr Thr Leu Ile Arg

435 440 445

Ser Lys Ser Lys Ser Pro Gln Thr Thr Gly Lys Thr Thr Gly Ser Lys

450 455 460

Ala Ala Ala Lys Gly Ala Val Asp Gln Pro Leu Pro Phe Gln His Asn

465 470 475 480

Val Ala Val Ala Leu Leu Leu Gly Ala Phe Tyr Leu Leu Ser Arg Tyr

485 490 495

Ala Ile His Cys Thr Trp Val Thr Ser Glu Ala Tyr Ser Ser Pro Ser

500 505 510

Ile Val Leu Ser Ala Arg Gly His Asn Gly Gly Arg Val Ile Phe Asp

515 520 525

Asp Tyr Arg Glu Ala Tyr Tyr Trp Leu Arg Gln Asn Thr Pro Thr Asp

530 535 540

Ala Lys Ile Met Ser Trp Trp Asp Tyr Gly Tyr Gln Ile Thr Ala Met

545 550 555 560

Gly Asn Arg Thr Val Ile Val Asp Asn Asn Thr Trp Asn Asn Thr His

565 570 575

Ile Ala Thr Val Gly Arg Ala Met Ser Ser Tyr Glu Asp Glu Ala Tyr

580 585 590

Glu Ile Met Gln Ser Leu Asp Val Asn Tyr Val Leu Val Val Phe Gly

595 600 605

Gly Val Thr Gly Tyr Ser Ser Asp Asp Ile Asn Lys Phe Leu Trp Met

610 615 620

Val Arg Ile Gly Gly Gly Val Phe Pro Val Ile Lys Glu Pro Asp Tyr

625 630 635 640

Leu Val Asn Gly Glu Tyr Arg Val Asp Lys Gly Ala Ser Pro Lys Met

645 650 655

Leu Asn Cys Leu Met Tyr Lys Leu Cys Tyr Tyr Arg Phe Gly Glu Leu

660 665 670

Thr Thr Glu Tyr Gly Lys Pro Pro Gly Tyr Asp Arg Val Arg Gly Val

675 680 685

Glu Ile Gly Asn Lys Asp Ile Lys Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Ala Phe

690 695 700

Thr Thr Ser Asn Trp Ile Val Arg Ile Tyr Lys Val Lys Pro Pro Lys

705 710 715 720

Asn Arg Ser

Claims (10)

1.下述1)-6)中任一种应用：

1)蛋白质在调控植物抗病性中的应用；

2)蛋白质在制备提高植物抗病性的产品中的应用；

3)蛋白质在培育抗病植物中的应用；

4)蛋白质相关的生物材料在调控植物抗病性中的应用；

5)蛋白质相关的生物材料在制备提高植物抗病性的产品中的应用；

6)蛋白质相关的生物材料在培育抗病植物中的应用；

1)-6)中，所述蛋白质为下述A1)或A2)或A3)的蛋白质：

A1)氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的蛋白质；

A2)在SEQ ID No.2所示的蛋白质的羧基末端或/和氨基末端连接蛋白标签得到的融合蛋白；

A3)将A1)或A2)所示的蛋白质经过一个以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)或A2)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且与植物抗病性相关的蛋白质；

所述蛋白质相关的生物材料，为下述S1)至S16)中的任一种：

S1)编码所述蛋白质的核酸分子；

S2)含有S1)所述核酸分子的表达盒；

S3)含有S1)所述核酸分子的重组载体；

S4)含有S2)所述表达盒的重组载体；

S5)含有S1)所述核酸分子的重组微生物；

S6)含有S2)所述表达盒的重组微生物；

S7)含有S3)所述重组载体的重组微生物；

S8)含有S4)所述重组载体的重组微生物；

S9)含有S1)所述核酸分子的转基因动物细胞系；

S10)含有S2)所述表达盒的转基因动物细胞系；

S11)含有S3)所述重组载体的转基因动物细胞系；

S12)含有S4)所述重组载体的转基因动物细胞系；

S13)含有S1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；

S14)含有S2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

S15)含有S3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

S16)含有S4)所述重组载体的转基因植物细胞系；

1)-6)中，所述抗病性为对纹枯病的抗性和/或对根腐病的抗性。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述植物为小麦。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：S1)为如下D1)-D3)中任一所述的DNA分子：

D1)编码序列是序列表中序列1的第1-2172位核苷酸的DNA分子；

D2)核苷酸序列是序列表中序列1的DNA分子；

D3)与D1)或D2)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码所述蛋白质的DNA分子。

4.抗植物纹枯病和/或抗植物根腐病的药剂，其特征在于：所述药剂含有权利要求1中所述的蛋白质或/和所述的蛋白质相关的生物材料。

5.根据权利要求4所述的药剂，其特征在于：所述植物为小麦。

6.一种培育抗病的转基因植物的方法，包括向受体植物中导入权利要求1所述蛋白质的编码基因，得到抗病性高于所述受体植物的转基因植物的步骤；所述抗病性为对纹枯病的抗性和/或对根腐病的抗性。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述受体植物为小麦。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述编码基因为如下D1)-D3)中任一所述的DNA分子：

D1)编码序列是序列表中序列1的第1-2172位核苷酸的DNA分子；

D2)核苷酸序列是序列表中序列1的DNA分子；

D3)与D1)或D2)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码所述蛋白质的DNA分子。

9.权利要求1中所述的蛋白质。

10.权利要求1或2中所述的蛋白质相关的生物材料。