CN114276429A

CN114276429A - 兼抗纹枯病与茎基腐病的转TaLRK-R基因小麦的培育方法及其相关生物材料

Info

Publication number: CN114276429A
Application number: CN202111622333.4A
Authority: CN
Inventors: 张增艳; 齐海军; 熊峰; 郭飞龙; 祝秀亮; 魏学宁
Original assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2021-12-28
Filing date: 2021-12-28
Publication date: 2022-04-05
Anticipated expiration: 2041-12-28
Also published as: CN114276429B

Abstract

本发明公开了兼抗纹枯病与茎基腐病的转TaLRK‑R基因小麦的培育方法及其相关生物材料与应用。TaLRK‑R是如下任一蛋白质：A1)氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的蛋白质；A2)将A1)所限定的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且来源于小麦的与植物抗病性相关的蛋白质；A3)在A1)或A2)的N末端或/和C末端连接标签得到的融合蛋白质。本发明所提供的兼抗纹枯病与茎基腐病的转TaLRK‑R基因小麦的培育方法、TaLRK‑R及其编码基因可用于提高植物抗病性，对于培育抗病的植物新品种具有重要意义。

Description

兼抗纹枯病与茎基腐病的转TaLRK-R基因小麦的培育方法及其相关生物材料

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及兼抗纹枯病与茎基腐病的转TaLRK-R基因小麦的培育方法及其相关生物材料与应用。

背景技术

小麦是世界上最重要的主粮作物，全球约35％人口以小麦作为主粮作物。保证小麦的稳产、高产和品质，对于保障全球人民的粮食安全和生活质量十分重要。随着全球气候的变化和免耕法的推广，小麦纹枯病、茎基腐病等土传真菌病害，发展成为我国及全球多个国家地区小麦产区的主要根茎部病害，严重影响着小麦产量和籽粒品质，已成为小麦生产中亟待解决的重要问题之一。

小麦纹枯病，也称为小麦尖眼斑病(wheat sharp eyespot)。小麦纹枯病，主要由腐生营养型病原真菌禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)引起的。纹枯病可使小麦减产10％～50％以上。据全国农技推广站报道，2005年至今，我国小麦纹枯病每年发生面积1.0-1.4亿亩，每年造成的经济损失达数十亿元以上。小麦茎基腐病(wheat Fusarium crownrot)，主要由假禾谷镰刀菌(Fusarium pseudograminearum)、禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)引起，据全国农技推广站报道，2020年全国小麦茎基腐病发生面积达4000万亩，导致小麦大面积减产，严重影响我国粮食安全。茎基腐病可造成小麦严重减产，产量损失可高达30％～75％。而且病原菌镰刀菌类产生DON等真菌毒素，能残留在小麦籽粒中，严重影响小麦的食用和饲用价值。近3年来，我国小麦主产区的小麦经常遭受纹枯病和茎基腐病的为害。选育和种植兼抗上述2种病害的小麦新品种，是防治上述土传真菌病害流行的最经济有效和安全的途径，对于保障小麦稳产、高产和籽粒品质也非常重要。

然而，由于缺乏易于利用的高抗上述土传真菌病的小麦种质资源，田间鉴定困难，使得常规育种方法培育小麦抗病品种的育种进展缓慢。分子生物学技术和基因工程,特别是抗病重要基因的分离克隆及功能研究的发展与应用，为培育抗纹枯病、茎基腐病的小麦新品种提供了一条新途径。

发明内容

基于此，有必要提供了兼抗纹枯病与茎基腐病的转TaLRK-R基因小麦的培育方法、小麦抗病基因TaLRK-R及其相关生物材料与应用。

为实现上述目的，本发明具体技术方案如下：

第一方面，本发明要求保护一种蛋白质。

本发明所要求保护的蛋白质名称为TaLRK-R，来源于抗纹枯病与茎基腐病的小麦品系CI12633，是如下任一蛋白质：

A1)氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的蛋白质；

A2)将A1)所限定的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且来源于小麦的与植物抗病性相关的蛋白质；

A3)在A1)或A2)的N末端或/和C末端连接标签得到的融合蛋白质。

上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述蛋白质中，所述标签(tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。

上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)，检索一对氨基酸序列的同一性，进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

上述蛋白质中，所述90％以上的同一性可为至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。

第二方面，本发明要求保护与TaLRK-R相关的生物材料。

本发明所要求保护的与TaLRK-R相关的生物材料，为下述B1)至B9)中的任一种：

B1)编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；

B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；

B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官；

B8)降低权利要求1所述蛋白质表达的核酸分子；

B9)含有B8)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

编码TaLRK-R蛋白的基因命名为TaLRK-R基因。

上述生物材料中，B1)所述核酸分子可为如下1)或2)：

1)编码链的编码序列是SEQ ID No.1的1-2790位核苷酸的cDNA分子或DNA分子；

2)编码链的核苷酸是SEQ ID No.1的cDNA分子或DNA分子。

下文中，所述蛋白质编码基因也均可为此处1)或2)。

上述生物材料中，B8)所述核酸分子具体可为与SEQ ID No.1所示的DNA分子中任一片段反向互补的DNA分子，如与SEQ ID No.1的第443-691位核苷酸所示的DNA片段(即SEQID No.3)反向互补的DNA分子。

其中，SEQ ID No.1由2790个核苷酸组成，其ORF序列是SEQ ID No.1的第1-2790位，编码SEQ ID No.2所示的蛋白质。

上述生物材料中，B2)所述的表达盒，是指能够在宿主细胞中表达前文第一方面中所述蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动目的基因转录的启动子，还可包括终止目的基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，以及诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S；来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶启动子("LAP",Chao等人(1999)Plant Physiology120:979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1启动子(PR1，由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸甲酯诱导)；热休克启动子(美国专利5187267)；四环素诱导型启动子(美国专利5057422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B，中国专利200710099169.7)，种子贮存蛋白质特异的启动子，例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4:3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcSE9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I985)Nature313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人Genes Dev.,5:141；Mogen等人(1990)Plant Cell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)Nucleic AcidsRes.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.,15:9627)。

可用现有的植物表达载体构建含有所述表达盒的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pWMB123、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对methatrexate抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

上述生物材料中，所述重组微生物具体可为酵母，细菌，藻和真菌。

第三方面，本发明要求保护一种植物抗病剂。

本发明所要求保护的植物抗病剂具有增强植物抗病性功能，含有前文所述蛋白质(TaLRK-R)和/或前文所述的生物材料。

第四方面，本发明要求保护前文所述蛋白质或所述的生物材料的下述P1-P5中的任一种应用：

P1、前文所述蛋白质(TaLRK-R)或所述生物材料在调控植物抗病性中的应用；

P2、前文所述蛋白质(TaLRK-R)或所述生物材料在制备提高植物抗病性的产品中的应用；

P3、前文所述蛋白质(TaLRK-R)或所述生物材料在培育抗病植物中的应用；

P4、前文所述蛋白质(TaLRK-R)或所述生物材料在制备植物抗病产品中的应用；

P5、前文所述蛋白质(TaLRK-R)或所述生物材料在植物育种中的应用；

在所述应用中，在所述植物中，前文所述蛋白质(TaLRK-R)的含量和/或活性降低，所述植物的抗病性降低，或前文所述蛋白质(TaLRK-R)编码基因的表达量降低，所述植物的抗病性降低。

第五方面，本发明要求保护如下任一方法：

方法A：一种培育抗病植物的方法，可包括如下步骤：提高目的植物中前文所述蛋白质(TaLRK-R)的含量和/或活性或其编码基因的表达量，得到抗病植物；所述抗病植物的抗病性高于所述目的植物的抗病性；

上述方法中，所述提高目的植物中所述蛋白质(TaLRK-R)的含量可通过提高所述目的植物中所述蛋白质(TaLRK-R)编码基因的表达量来实现，进一步可通过将所述蛋白质(TaLRK-R)的编码基因导入所述目的植物实现。

上述方法中，其中所述蛋白质(TaLRK-R)的编码基因可先进行如下修饰，再导入目的植物中，以达到更好的表达效果：

1)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；

2)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；

3)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接；

4)引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV、MCMV和AMV)。

所述蛋白质(TaLRK-R)的编码基因可通过使用Ti质粒，植物病毒栽体，直接DNA转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(Weissbach,1998,Method forPlant Molecular Biology VIII,Academy Press,New York,pp.411-463；Geiserson andCorey,1998,Plant Molecular Biology(2nd Edition))。

上述方法中，所述抗病植物可为转基因植物，也可为通过杂交等常规育种技术获得的植物。

方法B：一种培育抗病性降低的转基因植物的方法，包括如下步骤：降低目的植物中前文所述蛋白质(TaLRK-R)的编码基因的表达量，得到抗病性低于所述目的植物的转基因植物；

上述方法中，降低所述目的植物中前文所述蛋白质(TaLRK-R)的编码基因的表达量可通过将与SEQ ID No.1的第443-691位核苷酸所示的DNA片段(即SEQ ID No.3)反向互补的DNA分子导入所述目的植物实现。

上述方法中，所述转基因植物理解为不仅包含第一代到第二代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

在上述各方面中，所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。

进一步地，所述单子叶植物具体可为小麦。

在上述各方面中，所述抗病可为抗纹枯病和/或抗茎基腐病。

进一步地，所述纹枯病可由禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)引起。所述茎基腐病可由假禾谷镰孢菌(Fusarium pseudograminearum)引起。

基于上述技术方案，本发明具有以下有益效果：

实验证明：转基因过表达TaLRK-R使植物中的TaLRK-R转录水平显著增高，可以显著增强植物的抗病性；采用病毒介导的基因沉默技术沉默小麦CI12633中的TaLRK-R基因，结果显示TaLRK-R基因沉默降低了小麦CI12633对纹枯病菌和茎基腐病的防御能力，说明TaLRK-R是小麦抗纹枯病和茎基腐病反应所必需的基因，也从反向证明TaLRK-R是小麦抗纹枯病和茎基腐病的基因。本发明的培育抗病性提高的转基因植物的方法具有重要的理论及实际意义，在植物的遗传改良中将发挥重要作用。

附图说明

图1定量PCR分析在CI12633与温麦6号中TaLRK-R基因应答纹枯病菌胁迫的转录表达；

图2TaLRK-R基因在接种纹枯病菌4天的不同小麦品种的表达特性；

图3定量PCR分析在CI12633中TaLRK-R基因应答茎基腐病菌胁迫的转录表达；

图4定量PCR检测BSMV:TaLRK-R感染小麦中TaLRK-R基因的沉默情况；

图5对照小麦与TaLRK-R基因沉默小麦的纹枯病病级鉴定结果；

图6对照小麦与TaLRK-R基因沉默小麦的茎基腐病表型；

图7TaLRK-R过表达转基因小麦与受体小麦(对照)的PCR分析结果；

图8TaLRK-R过表达转基因小麦与受体小麦(对照)中TaLRK-R基因表达的定量PCR分析；

各图中，*表示在p<0.05水平上差异显著，**表示在p<0.01水平上差异极显著。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

下述实施例所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所有的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

下述实施例中小麦CI12633为来自江苏省农业种质资源保护与利用平台(江苏农业科学院种质资源库)的种质，小麦CI12633表现为抗纹枯病和抗茎基腐病。温麦6号为来自国家植物种质资源共享平台(中国农业科学院种质资源库)的种质，温麦6号表现为高感纹枯病。小麦品种山红麦为来自中国农业科学院种质资源库的种质，小麦品种山红麦表现为抗纹枯病和抗茎基腐病(参考文献：Xiuliang Zhu,Chungui Lu,Lipu Du,Xingguo Ye,，XinLiu,Anne Coules,Zengyan Zhang,2017，The wheat NB-LRR gene TaRCR1 is requiredfor host defence response to the necrotrophic fungal pathogen Rhizoctoniacerealis，Plant Biotechnology Journal，15,674-687；Tianci Wu,Feilong Guo,Xiuliang Zhu,Gangbiao Xu,JinfengYu,Li Zhang,Zengyan Zhang*.The Receptor-LikeKinase TaCRK-7A Inhibits Fusarium pseudograminearum Growth and MediatesResistance to Fusarium Crown Rot in Wheat.Biology.2021,10:1122)。扬麦9号和扬麦30来源于江苏里下河地区农业科学研究所，均表现为感纹枯病和茎基腐病(参考文献：Xujiang Wu,Kai Cheng,Renhui Zhao,Shujiang Zang,Tongde Bie,Zhengning Jiang,Ronglin Wu,Derong Gao,Boqiao Zhang.2017,Quantitative trait loci responsiblefor sharp eyespot resistance in common wheat CI12633，Scientific Reports,7:11799；Tianci Wu,Feilong Guo,Xiuliang Zhu,Gangbiao Xu,JinfengYu,Li Zhang,Zengyan Zhang*.The Receptor-Like Kinase TaCRK-7A Inhibits Fusariumpseudograminearum Growth and Mediates Resistance to Fusarium Crown Rot inWheat.Biology.2021,10,1122)。

下述实施例中的小麦纹枯病致病菌-禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)WK207(参考文献：Ji L,Liu C,Zhang L,Liu A,Yu J.Variation of rDNA internaltranscribed spacer sequences in Rhizoctonia cerealis.CurrentMicrobiology.2017,74,877–884)，引自山东农农业大学植物保护学院于金凤教授。公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中假禾谷镰孢菌(Fusarium pseudograminearum)(参考文献：TianciWu,Feilong Guo,Xiuliang Zhu,Gangbiao Xu,JinfengYu,Li Zhang,Zengyan Zhang*.TheReceptor-Like Kinase TaCRK-7A Inhibits Fusarium pseudograminearum Growth andMediates Resistance to Fusarium Crown Rot in Wheat.Biology.2021,10,1122)，公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。

下述实施例中BSMV病毒载体的3个组分BSMV-α、BSMV-β和BSMV-γ质粒(参考文献：赵丹,赵继荣,黄茜,李宁,刘艳,黄占景,张增艳.利用BSMV-VIGS技术快速分析小麦TNBL1基因的抗黄矮病功能.作物学报,2011,37(11):2106-2110；Xiuliang Zhu,Chungui Lu,LipuDu,Xingguo Ye,，Xin Liu,Anne Coules,Zengyan Zhang,2017，The wheat NB-LRR geneTaRCR1 is required for host defence response to the necrotrophic fungalpathogen Rhizoctonia cerealis，Plant Biotechnology Journal，15,674-687)，公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。

单子叶植物表达载体pWMB123(简称载体pWMB123)：参考文献：Ke

Huiyun

Lipu Du and Xingguo Ye*,Generation of marker-free transgenic hexaploidwheat via an Agrobacterium-mediated co-transformation strategy in commercialChinese wheat varieties,Plant Biotechnology Journal，2017，15：614–623。公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。

下述实施例中BSMV-γ：GFP质粒，从美国引入，参考文献：Holzberg S,Brosio P,Gross C,Pogue GP.2002.Barley stripe mosaic virus-induced gene silencing in amonocot plant.The Plant Journal 30,315-327。本实验室保存。

小麦纹枯病病级标准(参考文献：李斯深,李安飞,李宪彬等.1997,小麦种质对纹枯病抗性鉴定初报.作物品种资源.(4):31-33)，具体见表1。

表1、小麦纹枯病病级标准

其中，0级代表免疫、1级代表抗、2级代表中抗、3级-4级代表中感、5级代表高感。

小麦茎基腐病分级标准，按照周淼平等方法(参考文献：周淼平,姚金保,张鹏,余桂红,马鸿翔.小麦抗茎腐病种质筛选及鉴定新方法的建立.植物遗传资源学报2016,17(2):377-382)，具体见表2。

表2、小麦茎基腐病分级标准

小麦茎基腐病病级(IT)	小麦茎基腐病的病症
		0级	植株的叶鞘与茎部均无病斑
1级	植株的第一叶鞘病斑长度小于1.0cm
		2级	植株的叶鞘第一叶鞘病斑长度在1.0～2.0cm(含端点)
3级	植株的叶鞘病斑长度大于2.0cm，幼苗未萎蔫
		4级	幼苗出现萎蔫病症
5级	幼苗死亡

实施例1抗纹枯病、抗茎基腐病的小麦抗病蛋白TaLRK-R及其编码基因的克隆

本发明的发明人从抗病的小麦种质CI12633中分离克隆出一个兼抗纹枯病和茎基腐病的小麦蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，将其命名为TaLRK-R蛋白。将编码TaLRK-R蛋白的基因命名为TaLRK-R基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，具体克隆方法如下：

提取接种纹枯菌的小麦CI12633茎部总RNA，根据天根生化公司第一链cDNA合成试剂盒的程序，将提取的RNA样品反转录合成第一链cDNA，作为基因克隆的模板，以TaLRK-R-F1：5'-TGCTGCCTCTCCTTAATTC-3'和TaLRK-R-OR1：5'-GCACTCTAGTTTGACGAATC-3'为引物，进行第一轮PCR扩增，扩增程序为：先95℃预变性3分钟；然后98℃10秒，58℃30秒，68℃3.5分钟，共35个循环；68℃延伸7分钟；以稀释50倍的第一轮PCR扩增产物(如SEQ ID No.1所示)作为模板，利用TaLRK-R-F2：5'-ATGTACCCGTGCAACTGG-3'和TaLRK-R-R2：5'-TCAGTTTGACGAATCAGGTTTT-3'为引物，进行第二轮PCR扩增，扩增程序为：先95℃预变性3分钟；然后98℃10秒，58℃30秒，68℃3分钟，共35个循环；68℃延伸7分钟；第二轮PCR反应结束后，经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，回收目的PCR条带。将该第二轮PCR产物连接到pMD18-T载体上并测序。测序结果表明，该PCR扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID No.1的第1-2790位所示(即为整个ORF序列)，编码SEQ ID No.2所示的蛋白质TaLRK-R。

实施例2TaLRK-R基因的表达量与小麦对纹枯病、茎基腐病抗性正相关

1、TaLRK-R基因受纹枯病菌诱导的表达分析

在抗病小麦品系CI12633和感病的小麦品种温麦6号分蘖期的基部叶鞘与茎间，接种小麦纹枯病致病菌-禾谷丝核菌WK207的菌丝牙签，在接种前(未接菌，None)以及接种纹枯病菌WK207菌丝2d、4d、7d、10d、14d和21d，取接种部位的小麦叶鞘与茎组织，液氮速冻。用TRIZOL提取上述小麦材料的RNA，纯化。

将每个样品约5μg总RNA，根据天根生化公司第一链cDNA合成试剂盒的程序，反转录成cDNA。利用组成性表达的小麦TaActin基因作为内参，将样品cDNA浓度均一化。然后用TaLRK-R基因序列设计特异定量引物TaLRK-R-QF/TaLRK-R-QR，进行实时定量PCR(RT-qPCR)分析，用2^-△△CT法(Livak KJ,Schmittgen TD.2001.Analysis of relative geneexpression data using real-time quantitative PCR and the 2^-△△CTmethod.Methods.25:402-408)分析未接菌(MOCK)以及接纹枯病菌WK207菌丝2d、4d、7d、10d、14d和21d，抗病小麦品系CI12633和感病的小麦品系温麦6号中TaLRK-R的表达情况，每组样品重复3次。

内参基因TaActin的引物对：

TaActin-F：5'-GGAATCCATGAGACCACCTAC-3'；

TaActin-R：5'-GACCCAGACAACTCGCAAC-3'。

TaLRK-R基因的特异引物对：

TaLRK-R-QF：5'-CTGGAAACCCTTGCCCTCTC-3'；

TaLRK-R-QR：5'-CAAACTCGGTCGGCAATTCC-3'。

分析结果如图1所示。对TaLRK-R基因表达量分析结果表明，TaLRK-R在抗病小麦CI12633中的表达量始终高于在温麦6号中的表达量；接种后第4天CI12633中TaLRK-R表达量为温麦6号中的1.54倍，接种后第7天CI12633中表达量为温麦6号中的7.47倍，第10天为7.79倍，第14天为7.19倍，第21天回落至4.61倍。这些结果表明，TaLRK-R基因可能与小麦纹枯病的抗病性有关。

2、TaLRK-R基因表达量与小麦对纹枯病抗性程度紧密相关

接种小麦纹枯病致病菌-禾谷丝核菌WK207后4天，采取抗纹枯病小麦品系(CI12633、山红麦)、及感病小麦品种(温麦6号以及扬麦9号)接种部位的小麦叶鞘与茎组织，液氮速冻。用TRIZOL提取上述4个小麦材料的RNA，纯化。将每个样品约5μg总RNA，根据天根生化公司第一链cDNA合成试剂盒的程序，反转录成cDNA。利用组成性表达的小麦TaActin基因作为内参，将样品cDNA浓度均一化。然后用TaLRK-R基因序列设计特异定量引物TaLRK-R-QF/TaLRK-R-QR(引物见上文)，进行实时定量PCR(RT-qPCR)分析，用2^-△△CT法(Livak KJ,Schmittgen TD.2001.Analysis of relative gene expression data using real-timequantitative PCR and the 2^-△△CT method.Methods.25:402-408)计算TaLRK-R基因在不同抗纹枯病小麦与感病小麦材料中的相对表达量。结果如图2所示，抗病小麦品系CI12633与山红麦中TaLRK-R的表达量显著高于感病小麦品种温麦6号及扬麦9号中的，说明TaLRK-R基因表达量与抗性正相关，TaLRK-R基因应该是抗纹枯病的重要基因。

上述图1至图2所示结果表明，TaLRK-R基因表达量在抗纹枯病小麦品种中表达量显著高于在感病小麦中，而且在纹枯病菌胁迫情况下，小麦茎部中TaLRK-R基因表达量最多。因此，TaLRK-R可用于制备植物抗病剂，或构建TaLRK-R基因过表达载体用于培育转基因抗病植物。

3、TaLRK-R基因转录丰度受茎基腐病菌诱导

在抗病小麦CI12633分蘖期的基部叶鞘与茎间接种茎基腐菌(Fusariumpseudograminearum)，在接种前(未接菌，None)以及接茎基腐菌1d、2d、3d和4d，取接种部位的小麦叶鞘与茎组织，液氮速冻。用TRIZOL提取上述小麦材料的RNA，纯化。将每个样品约5μg总RNA，根据天根生化公司第一链cDNA合成试剂盒的程序，反转录成cDNA。利用组成性表达的小麦TaActin基因作为内参，将样品cDNA浓度均一化。然后用TaLRK-R基因序列设计特异定量引物TaLRK-R-QF/TaLRK-R-QR(引物见上文)，进行实时定量PCR(RT-qPCR)分析，用2^-△△CT法(Livak KJ,Schmittgen TD.2001.Analysis of relative gene expression datausing real-time quantitative PCR and the 2^-△△CT method.Methods.25:402-408)分析未接菌(None)以及接茎基腐菌1d、2d、3d和4d的小麦品系CI12633中TaLRK-R的表达情况，每组样品重复3次。

定量分析接种不同时间的TaLRK-R表达结果，如图3A所示，茎基腐菌接种1d、2d、3d和4d的小麦中TaLRK-R表达量均显著提高；与未接菌(None)相比，接种1天的小麦中TaLRK-R表达量提高～1.9倍，接种2天TaLRK-R表达量达到最大值(提高4.47倍)，暗示TaLRK-R可能在茎基腐早期抗病反应中发挥作用。

组织特异表达分析结果(图3B)表明，与未接种的相比，接种茎基腐菌2天，小麦品系CI12633茎中TaLRK-R表达量发生显著增加，其他组织中TaLRK-R表达量则变化不明显，这与茎基腐病主要发生在茎基部是一致的。

上述结果表明，TaLRK-R基因是小麦抗茎基腐反应中早期应答基因。

实施例3培育纹枯病抗性降低和茎基腐病抗性降低的小麦进行TaLRK-R基因功能反向验证

一、采用病毒介导的基因沉默技术沉默小麦CI12633中的TaLRK-R基因

1、将SEQ ID No.1的第443-691位核苷酸(SEQ ID No.3)所示的DNA片段的两末端分别带有NheI识别序列。NheI酶切后，将SEQ ID No.1的第443-691位核苷酸(SEQ ID No.3)所示的DNA片段(249bp)以反向插入法插入到NheI酶线性化后的BSMV-γ(BSMV病毒的γ载体)上，得到重组载体BSMV-γ：TaLRK-R，使与SEQ ID No.1的第443-691位核苷酸(SEQ IDNo.3)所示的DNA片段反向互补的DNA分子(TaLRK-R)被γ载体的T7启动子驱动。

2、制备转录反应液

(1)取BSMV-α质粒，用限制性内切酶MluI进行酶切，回收线性化质粒，命名为线性化的BSMV-α。取BSMV-β质粒，用限制性内切酶SpeI进行酶切，回收线性化质粒，命名为线性化的BSMV-β。取重组质粒BSMV-γ：TaLRK-R和BSMV-γ：GFP，用限制性内切酶MluI进行酶切，回收线性化质粒，分别命名为线性化的BSMV-γ：TaLRK-R、线性化的BSMV-γ：GFP。

(2)取线性化质粒，采用RiboMAX Large Scale RNA Production Systems-T7 kit(Promega)，进行体外转录反应，得到转录反应液。

线性化的载体为线性化的BSMV-α时，得到的转录反应液命名为转录反应液BSMV-α。线性化的载体为线性化的BSMV-β时，得到的转录反应液命名为转录反应液BSMV-β。线性化的载体为线性化的BSMV-γ：GFP时，得到的转录反应液命名为转录反应液BSMV-γ：GFP。线性化的载体为线性化的BSMV-γ：TaLRK-R时，得到的转录反应液命名为转录反应液BSMV-γ：TaLRK-R。

3、BSMV接种小麦植株

取1.5ml离心管，加入10μl转录反应液BSMV-α、10μl转录反应液BSMV-β和10μl转录反应液BSMV-γ：TaLRK-R或转录反应液BSMV-γ：GFP，混匀，然后加入60μlRNase-freeddH₂O，再加入90μl GKP溶液(溶剂为水，含50mM甘氨酸、30mM K₂HPO₄、1％Bentonite和1％Celite，pH 9.2)，混合，得到BSMV：TaLRK-R病毒混合液或BSMV：GFP病毒混合液。待小麦CI12633的幼苗生长至三叶一心期时，吸取BSMV：TaLRK-R病毒混合液或BSMV：GFP病毒混合液，摩擦接种于幼苗的第二个叶片和第三个叶片上(每个叶片10μl)，然后在叶片表面喷施0.1％DEPC水溶液，覆膜保湿24小时，之后每隔6h在叶片表面喷施0.1％DEPC水溶液。

4、定量RT-PCR检测基因沉默情况

接种第12天取第四片叶片，提取RNA，采用RT-qPCR检测TaLRK-R基因沉默情况，所用引物为TaLRK-R-QF和TaLRK-R-QR(引物序列见上文)。

结果如图4所示：导入BSMV：TaLRK-R的CI12633植株中TaLRK-R基因表达量被显著降低，得到TaLRK-R基因沉默的CI12633(命名为BSMV：TaLRK-R)；而导入BSMV：GFP的CI12633(命名为BMSV：GFP，作为对照)与野生型小麦CI12633中TaLRK-R基因的表达量没有显著变化。

二、TaLRK-R被沉默植株的抗纹枯病性鉴定

步骤一的小麦转染BSMV病毒20天后，采用牙签接种法，在这些小麦的基部叶鞘与茎间接种纹枯病菌(禾谷丝核菌WK207)，将长满禾谷丝核菌WK207菌丝的牙签嵌入到基部第2叶鞘与茎之间，保湿7天。在禾谷丝核菌WK207接种40天后，对小麦接种茎部位进行纹枯病病级鉴定。两批次VIGS与纹枯病菌接种、病级鉴定的实验结果如图5所示，TaLRK-R基因表达沉默后的BSMV：TaLRK-R植株茎部位的纹枯病病斑明显大于对照(BSMV:GFP)植株的病斑。两批次鉴定结果表明，BSMV:TaLRK-R沉默两批次的小麦植株的平均病级分别为2.90和3.15，而对照BSMV:GFP植株两批次的平均病级为1.80和1.85,分别相差1.0级和1.3级，达到统计学的显著/极显著水平，BSMV:TaLRK-R沉默植株病斑长宽也显著大于BSMV:GFP植株，表明TaLRK-R基因沉默降低了小麦CI12633对纹枯病菌的防御能力，上述结果说明TaLRK-R是CI12633抗纹枯病所必需的基因。

三、TaLRK-R被沉默植株对茎基腐病的抗病性鉴定

步骤一的小麦转染BSMV病毒20天后，采用牙签接种法，在这些小麦的基部叶鞘与茎间接种假禾谷镰孢菌：将长满假禾谷镰孢菌菌丝的牙签嵌入到基部第2叶鞘与茎之间，保湿4天。在假禾谷镰孢菌接种28天，TaLRK-R沉默的小麦植株出现了明显的黑褐色病斑，严重的植株甚至萎蔫死亡，而对照植株症状不明显(图6)。对两批次VIGS及接种实验的小麦进行茎基腐病的病级鉴定。结果表明，两批次TaLRK-R基因表达沉默后的BSMV：TaLRK-R植株茎部位的茎基腐病平均病级3.50和4.17，而两批次BSMV：GFP植株相应的茎基腐病平均病级2.30和2.68，TaLRK-R沉默植株比对照植株病级高1.20-1.49，达到了统计学的极显著差异水平。上述结果说明TaLRK-R基因沉默降低了小麦CI12633对茎基腐菌的防御能力，TaLRK-R是CI12633抗小麦茎基腐病所必需的基因。因此，TaLRK-R可用于制备植物抗病剂，或构建TaLRK-R基因过表达载体用于培育转基因抗病植物。

实施例4兼抗纹枯病与茎基腐病的转TaLRK-R基因小麦的获得和抗病性鉴定

一、重组表达载体的构建

1、提取小麦CI12633的茎部的总RNA并反转录得到cDNA。

2、以步骤1得到的cDNA为模板，采用TaLRK-R-ZF1和TaLRK-R-ZR1组成的引物对，在高保真扩增酶PrimeSTAR的作用下进行PCR扩增，回收PCR扩增产物。

TaLRK-R-ZF1：5'-CGACTCTAGAGGATCCATGTACCCGTGCAACTGG-3'；

TaLRK-R-ZR1：5'-ATCGGGGAAATTCGAGCTCTCAATGGTGATGGTGATGATGGTTTGACGAATCAGGTTTT-3'。

PCR反应程序：95℃预变性5min；98℃10s、58℃30s、68℃3min，35个循环；68℃10min。

3、取步骤2得到的PCR扩增产物，用限制性内切酶BamHⅠ和SacⅠ进行双酶切，回收酶切产物。

4、取载体pWMB123，用限制性内切酶BamHⅠ和SacⅠ进行双酶切，回收载体骨架。

5、将步骤3得到的酶切产物和步骤4得到的载体骨架连接，得到重组质粒pWMB123-TaLRK-R。

根据测序结果，对重组质粒pWMB123-TaLRK-R进行结构描述如下：在单子叶植物表达载体pWMB123的BamHⅠ和SacⅠ酶切位点之间插入了SEQ ID No.4所示ORF的DNA分子(编码融合有6×His标签的TaLRK-R-His蛋白)。在构建的转基因重组载体pWMB123-TaLRK-R中，TaLRK-R基因受玉米Ubiquitin启动子控制。

二、转基因植物的获得

1、将重组质粒pWMB123-TaLRK-R导入农杆菌EHA105的感受态细胞，得到重组农杆菌。

2、将步骤1得到的重组农杆菌转化小麦品种扬麦30的幼胚愈伤组织，然后在渗透压培养基上后处理16h。

3、完成步骤2后，将愈伤组织转移到SD2培养基(MS培养基的无机盐成分中添加VB11mg/L，天冬门酰胺150mg/L,2,4-D 2mg/L)上，恢复培养2周(26℃，暗培养)。

4、完成步骤3后，将愈伤组织转移到分化筛选培养基(1/2MS培养基+萘乙酸1mg/L+激动素1mg/L+双丙氨膦2-5mg/L)中，24-26℃光照培养14d。

5、完成步骤4后，将愈伤组织分化的小苗转移到生长筛选培养基中(1/2MS培养基+双丙氨膦2-3mg/L)，24-26℃光照培养。

获得了15株再生植株。

6、将步骤5得到的再生植株转移到壮苗培养基(1/2MS培养基+0.5mg/L萘乙酸)上培养，将苗高7-8cm且根系发达的转化苗移栽到花盆。

移栽3周以后，有10株植株(T0代)成活。

7、PCR鉴定

步骤6得到的各个成活植株，分别于分蘖期取一个叶片，提取基因组DNA。将基因组DNA作为模板，采用Ubi-F和RK5R-TR组成的引物对进行PCR扩增，如果得到扩增产物(约1000bp)，该植株为转基因植株。将重组质粒pWMB123-TaLRK-R作为阳性对照。将受体扬麦30的基因组DNA作为阴性对照。

Ubi-F:5'-GTCGATGCTCACCCTGTTGT-3'；

RK5R-TR:5'-CAAACTCGGTCGGCAATTCC-3'。

PCR反应程序：95℃变性5min；95℃30s、55℃30s、72℃1min，35个循环；72℃10min,16℃保存。

PCR鉴定结果表明，10株T0代成活植株中，4株为转基因植株。

8、取步骤7筛选出的4株转基因植株，分别自交并收获种子，得到T1代种子。将T1代种子播种并培养，得到T1代单株。将T1代单株进行PCR鉴定，方法同步骤7。

在160株T1代单株中，74株为转基因植株，分属4个转基因株系，阳性率57.5％。

部分T1代单株的PCR扩增产物的1.5％琼脂糖凝胶电泳结果见图7。图7中，质粒代表阳性对照，扬麦30和水代表阴性对照，OR1、OR2、OR3和OR4分别代表4个转基因小麦株系。

9、取4个转基因株系的T1代单株的总RNA，反转录得到cDNA，检测TaLRK-R基因的相对表达量。采用小麦内源TaActin基因作为内参基因。将小麦扬麦18作为转基因植株的对照植株。

用于检测TaLRK-R基因的特异引物对：

TaLRK-R-QF：5'-CTGGAAACCCTTGCCCTCTC-3'；

TaLRK-R-QR：5'-CAAACTCGGTCGGCAATTCC-3'。

用于检测内参基因TaActin的引物对：

TaActin-F：5'-CACTGGAATGGTCAAGGCTG-3'；

TaActin-R：5'-CTCCATGTCATCCCAGTTG-3'。

TaLRK-R基因的相对表达量见图8。图8中，扬麦30代表未转基因小麦扬麦30，OR1、OR2、OR3和OR4分别代表4个转基因小麦株系。转基因植株中TaLRK-R基因的相对表达量明显高于受体扬麦30。

三、转空载体植物的获得

用载体pWMB123代替重组质粒pWMB123-TaLRK-R，其它同步骤二，得到转空载体植株。

四、T1代转基因小麦植物对纹枯病抗性的鉴定

供试植株：转TaLRK-R基因小麦OR1株系的T1代植株、OR2株系的T1代植株、OR3株系的T1代植株和OR4株系的T1代植株、转空载体株系的T1代植株、受体扬麦30植株。

供试植株进行平行试验。

正常培养供试植株。在分蘖后期，将纹枯病菌丝牙签接种到小麦第二个茎部与叶鞘之间，接种后喷水保湿7天。持续观察发病情况。收获时调查病情指数。

病情指数(DI)＝[(Σ各级病株数×各级代表值)/(总株数×最高级代表值)]×100。

接种小麦纹枯病致病菌WK207约20天，受体扬麦30和转空载体植株出现典型的纹枯病病症，而转基因植株病症不明显。如表3所示，接种小麦纹枯病致病菌WK207约45天，受体扬麦30和转空载体植株的平均病级(病情指数,DI)分别为2.73(DI＝54.6)和2.67(DI＝53.4)，OR1、OR2、OR3和OR4株系的平均病级(病情指数,DI)分别为1.33(DI＝26.6)、1.46(DI＝29.2)、1.31(DI＝26.2)和1.39(DI＝27.8)，相较于受体、转空载体植株，这些过表达的转基因小麦株系对纹枯病抗性显著提高。

表3转基因小麦植株与对照小麦植株的纹枯病病情调查结果

株系	病级	病情指数
			OR1	1.33	26.6**
OR2	1.46	29.2**
			OR3	1.31	26.2**
OR4	1.39	27.8**
			扬麦30	2.73	54.6
转空载体植株	2.67	53.4

上述结果表明，TaLRK-R基因过表达显著增强了转基因小麦对纹枯病的抗病性。

五、T1代转基因小麦植物对茎基腐病抗性的鉴定

供试植株：转TaLRK-R基因小麦：OR1株系的T1代植株、OR2株系的T1代植株、OR3株系的T1代植株和OR4株系的T1代植株、转空载体株系的T1代植株、受体扬麦30植株。供试植株进行平行试验。

正常培养供试植株。在拔节初期，将茎基腐病菌牙签接种到小麦基部叶鞘与茎之间，接种后用湿棉花保湿3天。持续观察发病情况。接种小麦茎基腐病菌约20天，转空载体小麦和受体扬麦30植株出现茎基腐病的明显病症，而转基因植株病症不明显。于接种28天，统计病级IT。如表4所示，结果表明，OR1株系的T1代植株平均病级IT为1.26(病情指数25.2)、OR2株系的T1代植株平均病级IT为1.13(病情指数22.6)、OR3株系的T1代植株平均病级IT为1.15(病情指数23.0)、OR4株系的T1代植株平均病级IT为1.19(病情指数23.8)、转空载体株系的T1代植株平均病级IT为2.99(病情指数59.8)、受体扬麦30植株平均病级IT为3.01(病情指数60.2)，相较于受体、转空载体植株，这些过表达的转基因小麦株系对茎基腐病抗性显著提高。

表4转基因小麦植株与对照小麦植株的茎基腐病病情调查结果

上述结果表明，TaLRK-R基因过表达显著地提高了转基因小麦对茎基腐病的抗病性。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种蛋白质，其特征在于，是如下任一蛋白质：

A1)氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的蛋白质；

A3)在A1)或A2)的N末端或/和C末端连接标签得到的融合蛋白质。

2.与权利要求1所述蛋白质相关的生物材料，为下述B1)至B9)中的任一种：

B1)编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B8)降低权利要求1所述蛋白质表达的核酸分子；

3.根据权利要求2所述的相关生物材料，其特征在于，B1)所述核酸分子为如下1)或2)：

1)编码链的编码序列是SEQ ID No.1的第1-2790位核苷酸的cDNA分子或DNA分子；

2)编码链的核苷酸是SEQ ID No.1的cDNA分子或DNA分子。

4.一种植物抗病剂，其特征在于，所述植物抗病剂含有权利要求1所述的蛋白质或权利要求2所述相关的生物材料，所述抗病为抗纹枯病和/或抗茎基腐病。

5.权利要求1所述蛋白质或权利要求2或3所述生物材料的下述P1-P5中的任一种应用：

P1、权利要求1所述蛋白质或权利要求2或3所述生物材料在调控植物抗病性中的应用；

P2、权利要求1所述蛋白质或权利要求2或3所述生物材料在制备提高植物抗病性的产品中的应用；

P3、权利要求1所述蛋白质或权利要求2或3所述生物材料在培育抗病植物中的应用；

P4、权利要求1所述蛋白质或权利要求2或3所述生物材料在制备植物抗病产品中的应用；

P5、权利要求1所述蛋白质或权利要求2或3所述生物材料在植物育种中的应用；

优选的，所述抗病为抗纹枯病和/或抗茎基腐病。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述纹枯病由禾谷丝核菌引起，所述茎基腐病由假禾谷镰孢菌引起。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，在所述植物中，权利要求1所述蛋白质的含量和/或活性降低，所述植物的抗病性降低。

8.如下任一方法：

方法A：一种培育抗病植物的方法，包括如下步骤：提高目的植物中权利要求1所述蛋白质的含量和/或活性或其编码基因的表达量，得到抗病植物；所述抗病植物的抗病性高于所述目的植物的抗病性；

方法B：一种培育抗病性降低的转基因植物的方法，包括如下步骤：降低目的植物中权利要求1所述蛋白质的编码基因的表达量，得到抗病性低于所述目的植物的转基因植物；

优选的，所述抗病为抗纹枯病和/或抗茎基腐病。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，提高所述目的植物中权利要求1所述蛋白质的含量和/或活性或其编码基因的表达量是通过将权利要求1所述蛋白质的编码基因导入所述目的植物实现的。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，降低所述目的植物中权利要求1所述蛋白质的编码基因的表达量是通过将与SEQ ID No.1的第443-691位核苷酸所示的DNA片段反向互补的DNA分子导入所述目的植物实现的。