CN112979775B - 抗穗发芽转基因小麦的培育方法及其相关生物材料 - Google Patents

Abstract

本发明公开了抗穗发芽转基因小麦的培育方法及其相关生物材料。本发明具体地公开了氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质TaKPHS及其编码基因在提高植物穗发芽抗性中的应用。本发明通过在受体植物中导入过表达的TaKPHS基因，来获得穗发芽抗性显著提高的转基因小麦，从而为小麦的穗发芽抗性育种提供一个良好的基因资源，为TaKPHS基因的应用开拓一个新的领域。本发明所得TaKPHS转基因小麦株系的穗发芽率最低可达7.42％，比大多数生产上的小麦品种具有更强的穗发芽抗性，具有潜在的育种价值。

Description

抗穗发芽转基因小麦的培育方法及其相关生物材料

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及抗穗发芽转基因小麦的培育方法及其相关生物材料。

背景技术

小麦(Triticum aestivum L.)是世界上最重要的粮食作物之一，对于保障粮食安全起着举足轻重的作用。当小麦生理成熟，但还没有收获或收获后尚未脱粒时，在田间或堆放期间遇到连续阴雨天气或十分潮湿的环境，小麦籽粒在麦穗上萌动、发芽的现象称为穗发芽(Pre-harvest Sprouting，PHS)。小麦穗发芽在世界范围内均有发生。穗发芽会导致小麦籽粒中相关水解酶活性迅速升高，降解籽粒中的储存物质，改变籽粒内部储存物质的化学特性，使容重(testing weight)、出粉率和面粉降落值(Falling number)下降、并且面筋含量、沉降值和面团流变学特性显著降低，对小麦各种食品的加工品质造成负面影响，如加工后的面条韧性和弹性下降，口感变劣，严重影响面粉加工产品的品质等，这些都会对小麦的生产加工造成严重的经济损失。

培育抗穗发芽的小麦品种，是解决小麦穗发芽问题的最经济和有效的途径，对于保证小麦的品质和高产稳产非常重要。然而，目前大多数生产上利用的小麦品种都不具有较强的穗发芽抗性，因此，利用分子生物学和基因工程手段培育具有较强的穗发芽抗性的小麦品种，可为小麦抗穗发芽育种开辟了一条新途径，对小麦育种具有重要的意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何提高植物的穗发芽抗性。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了穗发芽抗性相关蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质的应用，所述应用为下述任一种：

D1)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在调控植物穗发芽抗性或提高植物穗发芽抗性中的应用；

D2)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在制备调控植物穗发芽抗性或提高植物穗发芽抗性的产品中的应用；

D3)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在培育抗穗发芽植物中的应用；

D4)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在制备培育抗穗发芽植物的产品中的应用；

D5)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在植物育种中的应用；

所述蛋白质名称为TaKPHS，为如下A1)、A2)或A3)：

A1)氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质；

A2)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过一个以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有抗穗发芽功能的蛋白质；

A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

为了使A1)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1：标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述A2)中的TaKPHS蛋白质，为与SEQ ID No.1所示蛋白质的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。所述具有75％或75％以上同一性为具有75％、具有80％、具有85％、具有90％、具有95％、具有96％、具有97％、具有98％或具有99％的同一性。

上述A2)中的TaKPHS蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述A2)中的TaKPHS蛋白质的编码基因可通过将SEQ ID No.2的第201-704位所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

其中，SEQ ID No.2的第201-704位所示的DNA分子编码SEQ ID No.1所示的TaKPHS蛋白质。

上述应用中，所述蛋白质来源于小麦。

上述应用中，所述植物为F1)或F2)或F3)：

F1)单子叶植物；

F2)禾本科植物；

F3)小麦。

本发明还提供了与TaKPHS蛋白质相关的生物材料的应用，所述应用为下述任一种：

D1)与TaKPHS蛋白质相关的生物材料在调控植物穗发芽抗性或提高植物穗发芽抗性中的应用；

D2)与TaKPHS蛋白质相关的生物材料在制备调控植物穗发芽抗性或提高植物穗发芽抗性的产品中的应用；

D3)与TaKPHS蛋白质相关的生物材料在培育抗穗发芽植物中的应用；

D4)与TaKPHS蛋白质相关的生物材料在制备培育抗穗发芽植物的产品中的应用；

D5)与TaKPHS蛋白质相关的生物材料在植物育种中的应用；

所述生物材料为下述B1)至B7)中的任一种：

B1)编码TaKPHS蛋白质的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；

B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；

B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官。

上述应用中，B1)所述核酸分子可为如下b1)或b2)或b3)或b4)所示的DNA分子：

b1)编码序列(CDS)是SEQ ID No.2的第201-704位核苷酸的DNA分子或cDNA分子；

b2)核苷酸序列是SEQ ID No.2或SEQ ID No.2的第201-704位核苷酸的DNA分子或cDNA分子；

b3)与b1)或b2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码TaKPHS蛋白质的DNA分子或cDNA分子；

b4)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码TaKPHS蛋白质的DNA分子或cDNA分子。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码TaKPHS蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的TaKPHS蛋白质的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码TaKPHS蛋白质且具有TaKPHS蛋白质功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述应用中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambdaratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

上述应用中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、98％或99％的同一性。

上述应用中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA、siRNA、shRNA、sgRNA、miRNA或反义RNA。

本文中，调控所述蛋白质活性或含量的物质可为调控基因表达的物质，所述基因编码所述蛋白质TaKPHS。

上文中，所述调控基因表达的物质可为进行如下6种调控中至少一种调控的物质：1)在所述基因转录水平上进行的调控；2)在所述基因转录后进行的调控(也就是对所述基因的初级转录物的剪接或加工进行的调控)；3)对所述基因的RNA转运进行的调控(也就是对所述基因的mRNA由细胞核向细胞质转运进行的调控)；4)对所述基因的翻译进行的调控；5)对所述基因的mRNA降解进行的调控；6)对所述基因的翻译后的调控(也就是对所述基因翻译的蛋白质的活性进行调控)。

所述调控基因表达的物质具体可为B1)-B3)中任一所述的生物材料。

上述应用中，B2)所述表达盒(TaKPHS基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达TaKPHS的DNA，该DNA不但可包括启动TaKPHS基因转录的启动子，还可包括终止TaKPHS基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S：来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)Plant Physiol120：979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸甲酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4：3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I985)Nature 313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人Genes Dev.,5:141；Mogen等人(1990)PlantCell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.,15:9627)。

可用现有的表达载体构建含有所述TaKPHS基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

上述应用中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒具体可为pAHC25，也可为将pAHC25改造后得到的载体。

B3)所述重组载体可含有SEQ ID No.2的第201-704位所示的用于编码TaKPHS的DNA序列；进一步B3)所述重组载体具体可为pAHC25-TaKPHS。所述pAHC25-TaKPHS为将pAHC25载体的Sma I和Sac I识别位点间的DNA序列替换为SEQ ID No.2的第201-704位所示的DNA序列，保持其它DNA序列不变，得到表达SEQ ID No.1所示的TaKPHS蛋白质的重组载体。

上述应用中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可来自埃希氏菌属(Escherichia),欧文氏菌(Erwinia),根癌农杆菌属(Agrobacterium)、黄杆菌属(Flavobacterium),产碱菌属(Alcaligenes),假单胞菌属(Pseudomonas),芽胞杆菌属(Bacillus)等。所述细菌具体可为大肠杆菌。

本发明还提供了一种培育抗穗发芽植物的方法，包括提高目的植物中TaKPHS蛋白质的含量和/或活性，得到穗发芽抗性高于所述目的植物的抗穗发芽植物。

上述方法中，所述提高目的植物中TaKPHS蛋白质的含量和/或活性通过提高目的植物中所述蛋白质的编码基因的表达量实现。

上述方法中，所述蛋白质的编码基因为如下b1)或b2)或b3)或b4)所示的DNA分子：

b1)编码序列是SEQ ID No.2的第201-704位核苷酸的DNA分子或cDNA分子；

b2)核苷酸序列是SEQ ID No.2或SEQ ID No.2的第201-704位核苷酸的DNA分子或cDNA分子；

b3)与b1)或b2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码TaKPHS蛋白质的DNA分子或cDNA分子；

b4)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码TaKPHS蛋白质的DNA分子或cDNA分子。

上述方法中，所述植物为F1)或F2)或F3)：

F1)单子叶植物；

F2)禾本科植物；

F3)小麦。

本发明中，所述抗穗发芽植物理解为不仅包含将所述TaKPHS基因转化目的植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述抗穗发芽植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

本发明还提供了培育抗穗发芽植物的方法在创制抗穗发芽的植物和/或植物育种中的应用。

上述蛋白质及其相关生物材料也属于本发明保护的范围。

实验证明，本发明与现有技术相比，具有以下优点：

1、本发明首次将TaKPHS基因用于小麦穗发芽抗性的育种，为小麦的穗发芽抗性育种提供了一个良好的基因资源，为TaKPHS基因的应用开拓了一个新的领域；

2、本发明所得的TaKPHS过表达的小麦株系的穗发芽抗性显著提高，转基因受体扬麦16的穗发芽百分比是33.28％，而TaKPHS过表达的转基因株系L160、L163和L165的穗发芽百分比分别是10.12％、8.66％和7.42％，比大多数生产上的品种具有更强的穗发芽抗性，为小麦抗穗发芽育种开辟了一条新途径。

附图说明

图1为pAHC25的部分区段示意图。

图2为T₄代单株分子鉴定的部分结果。其中，M为DNA分子量标准，P为载体pAHC25-TaKPHS，Y16为扬麦16，L160,L163和L165分别为T₄代的部分单株。

图3为T₄代扬麦16/pAHC25-TaKPHS PCR阳性转基因植株TaKPHS基因在萌发后2天的胚中的转录水平检测结果。其中，Y16为扬麦16；L160,L163和L165分别为T₄代植株。

图4为收获2天后，高湿环境处理7天的T₄代扬麦16/pAHC25-TaKPHS转基因植株和野生型植株扬麦16的穗发芽表型。其中，Y16为扬麦16；L160,L163和L165分别为T₄代植株。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

植物表达载体pAHC25(Christensen and Quail.Ubiquitin promoter-basedvectors for high-level expression of selectable and/or screenable markergenes in monocotyledonous plants.Transgenic Research，1996 5,213–218)公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得，以重复本申请实验。

小麦CI12633来自江苏农业科学院种质资源库。小麦品种扬麦16来自江苏里下河地区农业科学研究所，公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得，以重复本申请实验。

实施例1、抗穗发芽转基因小麦的获得和穗发芽抗性鉴定

本申请的发明人，从小麦CI12633中分离克隆出一个小麦蛋白，将其命名为TaKPHS。TaKPHS的cDNA基因的编码链的核苷酸序列是SEQ ID No.2，SEQ ID No.2的第201-704位核苷酸是编码序列(CDS)，编码氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质TaKPHS。

一、过表达的转基因载体的构建

将TaKPHS基因完整的ORF序列构建到单子叶植物表达载体pAHC25(图1)上，构建过程如图1所示，具体步骤如下：

1、线性化质粒的制备：用Sma I和Sac I酶切植物表达载体pAHC25，1％琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖凝胶DNA纯化回收试剂盒回收线性化pAHC25载体骨架。

2、含酶切位点的目标基因TaKPHS的获得：根据TaKPHS基因的ORF序列设计一对引物TaKPHS-F:5′-TAACCCGGGATGTCGCCGGCGGAGATGGA-3′(下划线序列为限制性内切酶Sma I位点)和TaKPHS-R:5′-GGAGAGCTCTCAGGCGTATATTACGCCT-3′(下划线序列为限制性内切酶Sac I位点)，提取小麦CI 12633叶鞘的总RNA，将提取的RNA样品反转录合成第一链cDNA，作为基因克隆的模板，通过PrimeSTAR HS DNA Polymerase高保真酶扩增基因的ORF片段，并在ORF的5′端和3′端分别添加Sma I和Sac I限制性内切酶的酶切位点，扩增片段用1％琼脂糖凝胶电泳检测并进行回收纯化,备用。

3、目标基因TaKPHS与线性化载体连接：配制如下反应体系(10μl)：

连接反应于16℃恒温过夜得到连接产物。

4、将连接产物热激转化到大肠杆菌Top10菌株感受态细胞中，37℃培养8h后挑取单克隆，通过菌落PCR筛选阳性克隆，并进一步测序验证。选取序列正确的单克隆，提取质粒，将序列正确的质粒命名为pAHC25-TaKPHS。测序结果表明，pAHC25-TaKPHS为用序列表中SEQ ID No.2的第201-704位所示的DNA分子替换pAHC25的Sma I和Sac I识别位点间的DNA片段，保持pAHC25的其他序列均不变,得到的重组表达载体。

pAHC25-TaKPHS的结构：骨架载体为pAHC25，在Sma I和Sac I酶切位点之间插入了序列表中SEQ ID No.2的第201位至第704核苷酸所示的TaKPHS基因；TaKPHS基因受玉米Ubiquitin启动子控制；质粒还具有1个受Ubiquitin启动子控制的Bar基因表达盒，可为后续工作中利用除草剂双丙氨膦(Bialaphos)筛选转化再生植株提供抗性标记。

二、转基因植物的获得

1、将2000块扬麦16的幼胚愈伤组织作为基因枪轰击的受体，用基因枪将pAHC25-TaKPHS轰击到愈伤组织。

2、将被基因枪轰击后的愈伤组织在渗透压培养基上后处理16h。

3、然后将愈伤组织转移到SD2培养基(MS培养基的无机盐成分中添加VB₁ 1mg/L，天冬门酰胺150mg/L,2,4-D 2mg/L得到的培养基)上，恢复培养2周(26℃，暗培养)。

4、将恢复培养后的愈伤组织转移到分化筛选培养基中(1/2MS培养基+萘乙酸1mg/L+激动素1mg/L+双丙氨膦2-5mg/L)，24-26℃光照培养14d；将愈伤组织分化小苗后转移到生长筛选培养基中(1/2MS培养基+双丙氨膦2-3mg/L)，24-26℃光照培养；获得了200株再生植株。

5、将再生植株转移到壮苗培养基(1/2MS培养基+0.5mg/L萘乙酸)上，将苗高7-8cm且根系发达的转化苗移栽到花盆,在移栽到温室3周以后，得到100株成活植株，以下将转pAHC25-TaKPHS的植株称为扬麦16/pAHC25-TaKPHS。

6、分子鉴定

在4叶期，每株扬麦16/pAHC25-TaKPHS取1个叶片提取基因组DNA，将基因组DNA作为模板，利用TaKPHS上跨内含子区域TaKPHS序列作为上下游引物TaKPHS-12F：5′-GGAGATGGAGTCCGACAAGA-3′和TaKPHS-308R：5′-TCCTCCTTGGTAGTAGAAGCCT-3′进行PCR扩增，以重组表达质粒pAHC25-TaKPHS为阳性对照，扬麦16的基因组DNA为阴性对照，预期扩增产物片段为297bp(目的片段)。

其中，PCR反应体系如下：

PCR反应程序如下：

先94℃5min；(94℃40s，57℃40s，72℃50s)，35个循环；再72℃10min；16℃保存。

PCR扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳检测，紫外拍照，记录结果。

结果表明再生植株中，有PCR检测阳性的T₀代扬麦16/pAHC25-TaKPHS植株15株(即PCR产物有目的片段的扬麦16/pAHC25-TaKPHS)。

7、T₄代单株及其分子鉴定

将步骤6的15株PCR阳性植株自交后,连续繁殖得到若干独立T₄代转基因株系(T₄代扬麦16/pAHC25-TaKPHS转基因小麦)，采用步骤6的方法进行分子鉴定，取PCR检测阳性转基因株系L160、L163和L165(PCR产物含有297bp的目的片段，检测实验结果如图2所示，以下简称T₄代扬麦16/pAHC25-TaKPHS PCR阳性转基因小麦)进行穗发芽抗性实验。

三、转基因小麦TaKPHS的表达量分析

利用引物TaKPHS-QF:5’-ATCAAGACCAAGACGACTACT-3’和引物TaKPHS-QR:5’-GCATCCGCATCCTGCGCCGTT-3’，荧光定量Q-RT-PCR分析T₄代扬麦16/pAHC25-TaKPHS PCR阳性转基因植株中TaKPHS基因的表达水平。荧光定量实验的mRNA取自萌发2天的籽粒的胚。结果如图3所示，编号为L160,L163和L165的T₄代扬麦16/pAHC25-TaKPHS PCR阳性转基因植株TaKPHS基因的转录水平均显著高于未转基因小麦受体扬麦16。

四、转基因植物穗发芽抗性鉴定

小麦穗发芽抗性鉴定参考中华人民共和国农业行业标准NY/T1739-2009(小麦抗穗发芽性检测方法)。试样准备方法如下：在北京地区，扬麦16、编号为L160,L163和L165这三个株系的T₄代扬麦16/pAHC25-TaKPHS PCR阳性转基因小麦正常播种，常规栽培管理。在开花当天，每个株系随机选择30个植株主茎穗挂牌，并注明开花日期。于开花后35天，小麦生理成熟期(穗茎和颖壳转黄时期)，每个株系选择挂牌的正常穗20个，从穗下茎15厘米处剪取整穗、备用。将整穗自来水中侵泡4小时，再用0.1％次氯酸钠溶液消毒5分钟，然后在光照培养箱(22℃,100％RH)中培养96小时，随即在60℃烘箱中烘干。手工剥粒，以籽粒胚部表皮破裂为发芽标准，分别统计整穗的总籽粒数和发芽籽粒数，计算穗发芽百分比。

穗发芽抗性鉴定实验重复两次，平均结果统计如表2所示。扬麦16的穗发芽百分比是33.28％，转基因株系L160、L163和L165的穗发芽百分比分别是10.12％、8.66％和7.42％。总之，相对于转基因受体扬麦16，TaKPHS转基因过表达显著提高了小麦穗发芽抗性。

结果如图4所示，转基因株系L160、L163和L165的穗发芽抗性显著高于转基因受体小麦扬麦16。表明TaKPHS基因的过表达可显著提高小麦的穗发芽抗性。

表2、转TaKPHS基因小麦T₄代阳性植株和转基因受体扬麦16植株穗发芽率的统计结果

株系编号	穗发芽率(％)
		L160	10.12
L163	8.66
		L165	7.42
扬麦16	33.28

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院作物科学研究所

<120> 抗穗发芽转基因小麦的培育方法及其相关生物材料

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 167

<212> PRT

<213> 小麦（Triticum aestivum）

<400> 1

Met Ser Pro Ala Glu Met Glu Ser His Lys Met Val Glu Val Glu Ala

1 5 10 15

Ala Ala Asp Pro Glu Glu Arg Thr Ala Ser Gly Asp Pro Lys Ala Cys

20 25 30

Asp Asp Cys Asn Thr Thr Lys Thr Pro Leu Trp Arg Gly Gly Pro Asn

35 40 45

Gly Pro Lys Ser Leu Cys Asn Ala Cys Gly Ile Arg Tyr Arg Lys Arg

50 55 60

Arg Trp Val Ala Met Gly Leu Asp Pro Glu Ala Lys Arg Lys Pro Lys

65 70 75 80

Arg Asp Asp Ala Ile Leu Ser Lys Ala Glu Ala Ser Ser Thr Lys Glu

85 90 95

Glu Glu Glu Glu Asp Asn Lys Ala Ser Thr Asn Lys Ile Lys Thr Lys

100 105 110

Thr Thr Thr His Thr Val Glu Leu His Met Val Gly Phe Ala Lys Asp

115 120 125

Ala Val Leu Lys Gln Arg Arg Arg Met Arg Met Arg Arg Arg Lys Pro

130 135 140

Ser Cys Leu Gly Glu Glu Glu Arg Ala Ala Ile Leu Leu Met Ser Leu

145 150 155 160

Ser Ser Gly Val Ile Tyr Ala

165

<210> 2

<211> 987

<212> DNA

<213> 小麦（Triticum aestivum）

<400> 2

ctaaaccctc acccacagcc gcagcagagc agagggataa acccaaaccc ctccccccat 60

tcgaacccaa accaaacccg agccgccgcc cgcggaatcg aatcttcgcc ccctcccgcc 120

ttcctccttc ccttcccttc ccttctcttc ccttccccgc gcgatcaatc aagcgatcgg 180

agccctcctc ctcatacaag atgtcgccgg cggagatgga gtcccacaag atggttgagg 240

tggaggcggc ggcggatcct gaggagcgca ccgcctccgg tgaccccaag gcctgcgacg 300

actgcaacac caccaagacg ccgctctggc gcggcggacc caacggacca aagtcgctgt 360

gcaacgcgtg cgggatccgg taccgcaaga ggcggtgggt ggccatgggg ctcgacccgg 420

aggccaagag gaagcccaag agggacgacg ccatcctatc caaggcggag gcttctagta 480

ccaaggagga ggaggaggag gacaacaagg ccagcaccaa caagatcaag accaagacga 540

ctactcacac cgtggagctc cacatggtgg ggttcgccaa ggacgcggtg ctcaagcaac 600

ggcgcaggat gcggatgcgg cggaggaagc cgtcgtgcct gggcgaggag gagcgggccg 660

ccatcctcct catgtccctc tcctcaggcg taatatacgc ctgatccatc tccttggatc 720

ggtcccagtc ggaacaagat gaacatgaag aggtgttgtt ggcatccatc aaatcaaatc 780

aaataatcat ctatgctatg ctatatgatg atctagtcct agatcagcag cctacctacc 840

tagctgtgtg tgtgttggtt gctgctggct taccgttgct tctttcgttg ctagctagct 900

agtgagtact ttgatcccct gtgctgttaa tgcctgtctg tccgtctgtt tgtttgttcc 960

aagtatgtac cgtctgactt gatctgc 987

Claims (6)

1.蛋白质或上调所述蛋白质活性和/或含量的物质的应用，其特征在于，所述应用为下述任一种：

D1）蛋白质或上调所述蛋白质活性和/或含量的物质在提高小麦穗发芽抗性中的应用；

D2）蛋白质或上调所述蛋白质活性和/或含量的物质在制备提高小麦穗发芽抗性的产品中的应用；

D3）蛋白质或上调所述蛋白质活性和/或含量的物质在培育抗穗发芽小麦中的应用；

D4）蛋白质或上调所述蛋白质活性和/或含量的物质在制备培育抗穗发芽小麦的产品中的应用；

D5）蛋白质或上调所述蛋白质活性和/或含量的物质在小麦育种中的应用；

所述蛋白质为如下A1）或A3）：

A1）氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质；

A3）在A1）的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

2.与权利要求1中所述蛋白质相关的生物材料的应用，其特征在于：所述应用为下述任一种：

D1）与权利要求1中所述蛋白质相关的生物材料在提高小麦穗发芽抗性中的应用；

D2）与权利要求1中所述蛋白质相关的生物材料在制备提高小麦穗发芽抗性的产品中的应用；

D3）与权利要求1中所述蛋白质相关的生物材料在培育抗穗发芽小麦中的应用；

D4）与权利要求1中所述蛋白质相关的生物材料在制备培育抗穗发芽小麦的产品中的应用；

D5）与权利要求1中所述蛋白质相关的生物材料在小麦育种中的应用；

所述生物材料为下述B1）至B7）中的任一种：

B1）编码权利要求1中所述蛋白质的核酸分子；

B2）含有B1）所述核酸分子的表达盒；

B3）含有B1）所述核酸分子的重组载体、或含有B2）所述表达盒的重组载体；

B4）含有B1）所述核酸分子的重组微生物、或含有B2）所述表达盒的重组微生物、或含有B3）所述重组载体的重组微生物；

B5）含有B1）所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2）所述表达盒的转基因植物细胞系；

B6）含有B1）所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2）所述表达盒的转基因植物组织；

B7）含有B1）所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2）所述表达盒的转基因植物器官。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述核酸分子为如下b1）或b2）或b4）所示的DNA分子：

b1）编码序列是SEQ ID No.2的第201-704位核苷酸的DNA分子或cDNA分子；

b2）核苷酸序列是SEQ ID No.2或SEQ ID No.2的第201-704位核苷酸的DNA分子或cDNA分子；

b4）在严格条件下与b1）或b2）限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1中所述蛋白质的DNA分子或cDNA分子。

4.一种培育抗穗发芽小麦的方法，其特征在于，包括提高目的小麦中权利要求1中所述蛋白质的含量和/或活性，得到穗发芽抗性高于所述目的小麦的抗穗发芽小麦。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述提高目的小麦中权利要求1中所述蛋白质的含量和/或活性通过提高目的小麦中所述蛋白质的编码基因的表达量实现。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述蛋白质的编码基因为如下b1）或b2）或b4）所示的DNA分子：

b1）编码序列是SEQ ID No.2的第201-704位核苷酸的DNA分子或cDNA分子；

b2）核苷酸序列是SEQ ID No.2或SEQ ID No.2的第201-704位核苷酸的DNA分子或cDNA分子；

b4）在严格条件下与b1）或b2）限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1中所述蛋白质的DNA分子或cDNA分子。

Images