CN110819606B

CN110819606B - 水稻受体胞质激酶OsRLCK22及其编码基因和应用

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Publication number: CN110819606B
Application number: CN201911021074.2A
Authority: CN
Inventors: 周永力; 李全林; 史晓荣
Original assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2019-10-24
Filing date: 2019-10-24
Publication date: 2021-08-17
Anticipated expiration: 2039-10-24
Also published as: CN110819606A

Abstract

本发明公开了水稻受体胞质激酶OsRLCK22及其编码基因和应用。本发明首先公开了如下任一所示的蛋白质在调控植物白叶枯病抗性中的应用：A1)氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；A2)在SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；A3)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且功能相同的蛋白质。进一步公开了培育白叶枯病抗性增强的转基因植物的方法。本发明为创造基于受体胞质激酶OsRLCK22的白叶枯病抗性材料提供一种高效的育种方式，在农业生产上具有重要应用价值。

Description

水稻受体胞质激酶OsRLCK22及其编码基因和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域。具体地，涉及水稻受体胞质激酶OsRLCK22及其编码基因和应用。

背景技术

由黄单胞杆菌水稻致病变种(Xanthomonas orayze pv.Oryzae，即X.oryzaepv.oryzae)引起的白叶枯病是制约水稻生产的一种重要细菌性病害，一般可致水稻减产20％-30％左右，严重可达50％。培育含抗性基因的抗病品种是目前防治水稻白叶枯病最经济有效的措施，然而，目前已报道的42个水稻白叶枯病抗性基因/位点(http:// www.shigen.nig.ac.jp/rice/oryzabase/gene/list)大部分表现出抗谱较窄或者难以利用，仅Xa3、Xa4、Xa21和Xa23等基因在生产中得以广泛应用。

水稻与X.oryzae pv.oryzae存在特异性的互作。X.oryzae pv.oryzae易于变异，水稻X.oryzae pv.oryzae的协同进化导致品种抗性极易丧失，鉴定并敲除白叶枯病易感性基因提高水稻品种的抗病性，对于水稻抗病育种具有重要的应用价值。

发明内容

本发明要解决的技术问题是如何提高水稻的白叶枯病抗性。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种蛋白质，所述蛋白质命名为受体胞质激酶OsRLCK22，来源于水稻(Oryza sativa L.)，是如下任一所示的蛋白质：

A1)氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；

A2)在SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；

A3)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且功能相同的蛋白质。

其中，SEQ ID No.1由626个氨基酸残基组成。

上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述蛋白质中，蛋白标签(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。

上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

上述蛋白质中，所述90％以上的同一性可为至少91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。

本发明还提供上述蛋白质OsRLCK22在调控植物白叶枯病抗性中的应用。

上述蛋白质OsRLCK22相关生物材料也属于本发明的保护范围，本发明还提供了蛋白质OsRLCK22相关生物材料的新用途。

本发明蛋白质OsRLCK22相关生物材料在调控植物白叶枯病抗性中的应用，所述相关生物材料为如下任一所示：

C1)编码蛋白质OsRLCK22的核酸分子；

C2)含有C1)所述核酸分子的表达盒；

C3)含有C1)所述核酸分子的重组载体、或含有C2)所述表达盒的重组载体；

C4)含有C1)所述核酸分子的重组微生物、或含有C2)所述表达盒的重组微生物、或含有C3)所述重组载体的重组微生物；

C5)含有C1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有C2)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有C3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

C6)含有C1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有C2)所述表达盒的转基因植物组织、或含有C3)所述重组载体的转基因植物组织；

C7)含有C1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有C2)所述表达盒的转基因植物器官、或含有C3)所述重组载体的转基因植物器官；

C8)含有C1)所述核酸分子的转基因植株、或含有C2)所述表达盒的转基因植株、或含有C3)所述重组载体的转基因植株；

C9)由C8)所述转基因植株的可再生细胞产生的组织培养物；

C10)由C9)所述组织培养物产生的原生质体；

C11)抑制上述蛋白质OsRLCK22的编码基因的表达量和/或蛋白质OsRLCK22的活性的核酸分子；

C12)含有C11)所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

上述相关生物材料中，C1)所述核酸分子为如下任一所示：

B1)SEQ ID No.2所示的DNA分子；

B2)编码序列是SEQ ID No.3所示的DNA分子；

B3)在严格条件下与B1)或B2)限定的DNA分子杂交，且编码蛋白质OsRLCK22的DNA分子。

其中，SEQ ID No.2由3290个核苷酸组成，编码序列为SEQ ID No.3所示，由1881个核苷酸组成，编码SEQ ID No.1所示的蛋白质。

所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min。

上述相关生物材料中，C2)所述的表达盒是指能够在宿主细胞中表达蛋白质OsRLCK22的DNA，该DNA不但可包括启动OsRLCK22基因转录的启动子，还可包括终止OSRLCK22转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：OsRLCK22基因自身的启动子，组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S；来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶(″LAP″，Chao等人(1999)Plant Physiol120：979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸甲酯诱导)；热休克启动子(美国专利5,187,267)；四环素诱导型启动子(美国专利5,057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利2007 10099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin，oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4：3047-3053)。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：OsRLCK22基因自身的终止子、农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I⁹⁸⁵)Nature 313：810；Rosenberg等人(1987)Gene，56：125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet，262：141；Proudfoot(1991)Cell，64：671；Sanfacon等人Genes Dev.，5：141；Mogen等人(1990)Plant Cell，2：1261；Munroe等人(1990)Gene，91：151；Ballad等人(1989)Nucleic Acids Res.17：7891；Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.，15：9627)。

上述相关生物材料中，C3)所述重组载体可含有SEQ ID No.3所示的用于编码蛋白质OsRLCK22的DNA分子。

可用现有的植物表达载体构建含有所述蛋白质OsRLCK22编码基因或所述蛋白质OsRLCK22编码基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体可为Gateway系统载体或双元农杆菌载体等，如pGWB411、pGWB412、pGWB405、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2300、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb。使用OsRLCK22构建重组载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛生素基因Ubiqutin启动子(pUbi)等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。

上述相关生物材料中，C11)所述核酸分子为靶向C1)所述核酸分子的核苷酸序列，即靶序列。具体的，所述靶序列为OsRLCK22基因序列中任一包括TTNXXX的核苷酸序列；其中，XXX为22-24bp的核酸序列，N为A、T、G、C中的任意一个核苷酸。更具体的，所述靶序列为SEQ ID NO.2的第2486位至第2507位。

上述相关生物材料中，C12)所述重组载体可为利用CRISPR/Cpf1技术制备的可以抑制蛋白质OsRLCK22的编码基因的表达量和/或蛋白质OsRLCK22的活性的重组载体。所述重组载体可含有表达C11)所述核酸分子的表达盒。具体的，所述重组载体为重组表达载体Fn-OsRLCK22-1，即在Fn-CRISPR/Cpf1载体(以pCAMBIA1300为骨架的Fn-CRISPR/Cpf1载体构建)的水稻U6启动子下游插入SEQ ID NO.2第2486-2507位得到的重组表达载体。所述重组表达载体Fn-OsRLCK22-1含有C11)所述核酸分子的表达盒。

上述相关生物材料中，所述重组微生物具体可为酵母、细菌、藻和真菌；如所述细菌可以为农杆菌EH105。

上述相关生物材料中，所述转基因植物器官可为转基因植物的根、茎、叶、花、果实和种子。

上述相关生物材料中，所述组织培养物可来源于根、茎、叶、花、果实、种子、花粉、胚和花药。

上述相关生物材料中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。

本发明进一步提供了调控植物白叶枯病抗性的产品，含有上述蛋白质OsRLCK22或其相关生物材料。

上述蛋白质OsRLCK22或其相关生物材料在如下任一中的应用也在本发明的保护范围之内；

D1)在培育白叶枯病抗性增强的基因突变植物中的应用；

D2)在制备培育白叶枯病抗性增强的基因突变植物产品中的应用；

D3)在培育白叶枯病抗性降低的基因突变植物中的应用；

D4)在制备培育白叶枯病抗性降低的基因突变植物产品中的应用；

D5)在植物育种中的应用。

上述应用中，植物育种中的应用具体可为将含有所述蛋白质OsRLCK22或所述相关生物材料(如蛋白质OsRLCK22编码基因OsRLCK22)的植物与其它植物进行杂交以进行植物育种。

本发明还提供了培育白叶枯病抗性增强的基因突变植物的方法。

本发明培育白叶枯病抗性增强的基因突变植物的方法，包括抑制目的植物中上述蛋白质OsRLCK22编码基因的表达量和/或抑制目的植物中上述蛋白质OsRLCK22的活性，得到基因突变植物；所述基因突变植物比所述目的植物的白叶枯病抗性增强。

上述方法中，所述抑制目的植物中上述蛋白质OsRLCK22编码基因的表达量和/或抑制目的植物中上述蛋白质OsRLCK22的活性的方法为通过对所述目的植物中上述蛋白质OsRLCK22的编码基因进行敲除或抑制或改变来实现的。

上述方法中，所述抑制目的植物中上述蛋白质OsRLCK22编码基因的表达量和/或抑制目的植物中上述蛋白质OsRLCK22的活性的方法是利用CRISPR/Cpf1技术对所述受体植物中上述蛋白质OsRLCK22的编码基因进行敲除来实现的。

上述方法中，所述蛋白质OsRLCK22的编码基因为SEQ ID NO.3所示的DNA分子。

上述方法中，所述CRISPR/Cpf1为II类V型CRISPR/Cas载体系统。

上述方法中，所述CRISPR/Cpf1技术中的靶序列为OsRLCK22基因序列中任一包括TTNXXX的核苷酸序列；其中，XXX为22-24bp的核酸序列，N为A、T、G、C中的任意一个核苷酸。

在本发明具体的实施方式中，所述CRISPR/Cpf1技术中的靶序列位于SEQ ID NO.2的第2486位至第2507位。

上述方法中，所述CRISPR/Cpf1技术具体为在Fn-CRISPR/Cpf1载体(以pCAMBIA1300为骨架的Fn-CRISPR/Cpf1载体构建)的水稻U6启动子下游插入位于SEQ IDNO.2第2486位至第2507位所示序列获得重组表达载体Fn-OsRLCK22-1；将含重组表达载体Fn-OsRLCK22-1的根癌农杆菌转入水稻中，实现水稻中SEQ ID NO.2所示序列第2486位至第2507位发生插入或缺失，使得水稻的OsRLCK22基因失去原有的功能，获得白叶枯病抗性增强的基因突变水稻材料。

本发明中，所述植物为M1)或M2)或M3)或M4)：

M1)单子叶植物或双子叶植物；

M2)禾本科植物；

M3)稻属植物；

M4)水稻。

本发明中，所述水稻具体可为日本晴以及OsRLCK22等位基因与日本晴相同的其它水稻品种。

本发明中，所述白叶枯病抗性为对白叶枯病菌IV和/或白叶枯病菌GD1358的抗性。

本发明利用OsRLCK22及其编码的蛋白参与调控水稻对白叶枯病菌免疫响应的特点及CRISPR/Cpf1技术的基因组靶向修饰作用，将含有靶序列的重组表达载体Fn-OsRLCK22-1导入到水稻品种中获得的OsRLCK22基因突变植株的突变率为50％，同时在所述水稻品种中定点敲除诱导产生的纯合突变体植株表现出对白叶枯病菌IV、GD1358的抗性水平增强的特征，即通过定点敲除创制水稻白叶枯抗病材料，为创造基于受体胞质激酶OsRLCK22的白叶枯病抗性材料提供一种高效的育种方式，在农业生产上具有十分重要的应用价值。

附图说明

图1为基于CRISPR/Cpf1技术水稻受体胞质激酶编码基因OsRLCK22定点敲除方法的载体活性检测测序峰图。

图2水稻日本晴背景下3种不同纯合突变体cpf1-osrlck22中OsRLCK22基因核苷酸序列的突变类型；其中，3种不同纯合突变体cpf1-rlck22分别为cpf1-osrlck22-1、cpf1-osrlck22-2和cpf1-osrlck22-3，黑色框内核苷酸序列为发生插入或缺失的核苷酸序列。

图3水稻日本晴背景下3种不同纯合突变体cpf1-osrlck22中OsRLCK22基因氨基酸序列的改变类型；其中，3种不同纯合突变体cpf1-osrlck22分别为cpf1-osrlck22-1、cpf1-osrlck22-2和cpf1-osrlck22-3。

图4水稻日本晴背景下3种不同纯合突变体cpf1-osrlck22植株接种白叶枯病菌IV后病斑表型及长度统计；其中，A为3种不同纯合突变体cpf1-osrlck22植株接种白叶枯病菌IV后病斑表型；B为3种不同纯合突变体cpf1-osrlck22植株接种白叶枯病菌IV后病斑长度统计；3种不同纯合突变体cpf1-osrlck22分别为cpf1-osrlck22-1、cpf1-osrlck22-2和cpf1-osrlck22-3，标尺＝2厘米，***表示P＜0.01。

图5为水稻日本晴背景下3种不同纯合突变体cpf1os-rlck22植株接种白叶枯病菌GD1358后病斑表型及长度统计；其中，A为3种不同纯合突变体cpf1-osrlck22植株接种白叶枯病菌GD1358后病斑表型；B为3种不同纯合突变体cpf1-osrlck22植株接种白叶枯病菌GD1358后病斑长度统计，3种不同纯合突变体cpf1-osrlck22分别为cpf1-osrlck22-1、cpf1-osrlck22-2和cpf1-osrlck22-3，标尺＝2厘米，***表示P＜0.01。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所用到的生物材料的获得途径如下：

Fn-CRISPR/Cpf1载体：记载于非专利文献“Mugui Wang，Yanfei Mao，Yuming Lu，Xiaoping Tao and Jian-kang Zhu.Multiplex Gene Editing in Rice Using theCRISPR-Cpf1 System.Molecular Plant，2017，10，1011-1013”。公众经中国科学院上海植物逆境生物学研究中心朱健康老师同意后，可从中国农业科学院作物科学研究所处获得该载体，该载体只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

日本晴(Nipponbare，Oryza sativa ssp.Japonica)：记载于非专利文献“Yongqing Jiao，Yonghong Wang，Dawei Xue，Jing Wang，Meixian Yan，Guifu Liu，GuojunDong，DaliZeng，Zefu Lu，Xudong Zhu，Qian Qian and Jiayang Li.Regulation ofOsSPL14 by OsmiR156defines ideal plant architecture in rice.Nature Genetics，2010，42，541-544.”中。公众可从中国农业科学作物科学研究所获得，该材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

水稻白叶枯病菌菌株IV：记载于非专利文献“曾列先，黄少华，伍尚忠.IRBB21(Xa21)对广东稻白叶枯病菌5个小种的抗性反应.植物保护学报，2002，29(2)：97-100”中，公众经广东省农业科学院曾列先老师同意后，可以从中国农业科学院作物科学研究所获得，该材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

水稻白叶枯病菌菌株GD1358：记载于非专利文献“方中达，许志刚，过崇俭，殷尚智，伍尚忠，徐羡明，章琦.中国水稻白叶枯病菌致病型的研究.植物病理学报，1990，20(2)：81-88”中，公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得，该材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

根癌农杆菌EHA105购自BioVector NTCC典型培养物保藏中心。

本发明通过对1440份水稻材料接种白叶枯病菌IV和GD1358后病斑长度的全基因组关联分析(Genome-wide associated study，GWAS)鉴定到与水稻白叶枯抗病性相关的受体胞质激酶基因OsRLCK22，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，由3290个核苷酸组成，其编码序列如SEQ ID No.3所示，编码SEQ ID No.1所示的蛋白质，由626个氨基酸残基组成，将所述蛋白命名为OsRLCK22。

实施例1、基于Fn-CRISPR/Cpf1系统的水稻OsRLCK22基因的定点敲除

1、水稻受体胞质激酶基因OsRLCK22的序列及分析

水稻受体胞质激酶基因OsRLCK22的序列SEQ ID No.2所示，序列分析显示，该基因共包括5个外显子，分别为SEQ ID No.2序列的第1-351位(第一外显子)、第458-851位(第二外显子)、第1338-1469位(第三外显子)、第1927-1968位(第四外显子)、第2276-3237位(第五外显子)。

本发明以水稻受体胞质激酶基因OsRLCK22第五外显子上的序列为基于CRISPR/Cpf1技术的水稻受体胞质激酶基因OsRLCK22定点敲除方法的靶序列。

2、Fn-CRISPR/Cpf1载体引物设计及其重组表达载体的构建

2.1 Fn-CRISPR/Cpf1技术靶序列的选择

Fn-CRISPR/Cpf1技术靶向OsRLCK22基因的第五外显子的正义链，选择如SEQ IDNo.2第2486-2507位所示的OsRLCK22-T1靶序列。

2.2 Fn-CRISPR/Cpf1技术靶序列引物的设计与合成

基于Fn-CRISPR/Cpf1技术设计并合成靶向OsRLCK22基因的靶序列引物，OsRLCK22-T1靶序列引物为OsRLCK22-T1F(如SEQ ID No.4所示)和OsRLCK22-T1R(如SEQ IDNo.5所示)。

2.3 Fn-CRISPR/Cpf1技术重组表达载体的构建

将OsRLCK22-T1靶序列引物OsRLCK22-T1F和OsRLCK22-T1R通过引物退火方法合成双链靶序列，并通过BsaI-HF酶切、连接方法插入到Fn-CRISPR/Cpf1载体的水稻U6启动子下游，获得重组表达载体Fn-OsRLCK22-1；经测序证实，重组表达载体Fn-OsRLCK22-1的水稻U6启动子下游插入如SEQ ID No.4所示序列。

3、Fn-OsRLCK22-1重组表达载体的活性检测

将步骤2.3中的重组表达载体Fn-OsRLCK22-1通过PEG介导导入水稻原生质体，获得重组表达载体Fn-OsRLCK22-1的瞬时表达结果；经测序验证，获得重组表达载体Fn-OsRLCK22-1在水稻原生质体中诱导生成的定点突变峰图(图1)。

4、重组根癌农杆菌的获得

将步骤2.32.3中重组表达载体Fn-OsRLCK22-1热激转化农杆菌EH105，获得含有重组表达载体Fn-OsRLCK22-1的重组农杆菌，命名为EH105-Fn-OsRLCK22-1。

实施例2、基于Fn-CRISPR/Cpf1技术定点敲除方法在水稻品种的应用

将重组农杆菌EH105-Fn-OsRLCK22-1侵染水稻品种日本晴成熟胚诱导的愈伤组织，将获得的水稻阳性转化植株命名为NIP-Fn-OsRLCK22-1。

具体方法如下：

1、将重组农杆菌EH105-Fn-OsRLCK22-1接种于YEB液体培养基(含50μg/ml卡那霉素和20μg/ml利福平)中，28℃、200rpm条件下振荡培养至OD600为0.6-0.8；以5000rpm、4℃离心5min，用AAM液体培养基(乙酰丁香酮浓度为200μM/L，pH5.2)重悬菌体沉淀浓度至OD600为0.6-0.8，得到重组农杆菌重悬液。

2、将水稻品种日本晴的成熟种子除去颖壳，在75％乙醇中浸泡1min，然后在NaClO溶液中(与水1∶2混合，加1滴吐温20)振荡消毒20min，重复2次。经无菌水冲洗数次至无异味，将消毒后的水稻日本晴种子接种于NBD2培养基上诱导愈伤组织，26℃黑暗培养8-10天，切除根和残留胚乳，继代培养10天，获得成熟胚愈伤组织。

3、将步骤2获得的成熟胚愈伤组织分别浸于步骤1获得的重组农杆菌重悬液中，30min后移出水稻材料，放置于铺有两层滤纸的无菌培养皿内，26℃黑暗条件下共培养2天。

4、将经过步骤3共培养的愈伤组织接种于筛选培养基(潮霉素浓度为50mg/L，pH5.8)中，28℃黑暗条件下筛选培养12天，转移抗性愈伤组织至含有50mg/L Hyg的选择培养基上继续筛选。

5、重复筛选2次后，转移抗性愈伤组织至分化培养基上(24小时光照/天)诱导分化；待新的无根幼苗生成，转移再生幼苗至1/2MS培养基上诱导生根；待小苗茁壮后移入人工气候室进行营养液栽培，栽成活后得到再生植株。

6、提取再生植株的叶片总DNA，分别以基于重组表达载体Fn-OsRLCK22-1的自身引物(如SEQ ID No.6所示序列)和OsRLCK22-T1R靶序列引物(如SEQ ID No.5所示序列)进行PCR扩增筛选；若再生植株的基因组中可以扩增出284bp的特异性条带，则表明该再生植株为阳性转化植株。

统计检测的再生植株数、阳性转化植株数及阳性转化植株数占检测的再生植株数的百分比即阳性率(％)，结果如表1所示，阳性率达到100％。

表1.Fn-OsRLCK22-1转化水稻品种的阳性率检测结果

再生植株	再生植株数	阳性转化植株数	阳性率(％)
				NIP-Fn-OsRLCK22-1	16	16	100.0

7、以阳性转化植株的基因组为模板，用水稻受体胞质激酶基因OsRLCK22特异性引物OsRLCK22-F(如SEQ ID No.7所示序列)和OsRLCK22-R(如SEQ ID No.8所示序列)进行PCR扩增，将所获得391bp扩增产物进行测序验证。测序结果显示16株阳性转化植株中共有8株的OsRLCK22基因发生杂合突变，统计检测的阳性转化植株数、发生突变转化植株数及发生突变转化植株数占检测的阳性转化植株数的百分比即突变效率(％)，结果如表2所示。

表2.Fn-OsRLCK22-1诱导水稻受体胞质激酶基因OsRLCK22发生突变的检测结果

再生植株	阳性转化植株数	发生突变转化植株数	突变效率(％)
				NIP-Fn-OsRLCK22-1	16	8	50.0

8、收集突变转化植株的种子，以自主分离的方式筛选纯合突变体cpf1-osrlck22；从突变转化植株的T₂代中得到3种不同纯合突变型，分别命名为cpf1-osrlck22-1、cpf1-osrlck22-2和cpf1-osrlck22-3。如图2和3所示，与野生型日本晴相比，cpf1-osrlck22-1突变体中的OsRLCK22基因靶位点处存在64bp核苷酸序列的缺失，使得编码的蛋白质翻译提前终止；cpf1-osrlck22-2突变体中的OsRLCK22基因靶位点处存在4bp核苷酸序列的缺失，使得编码的蛋白质翻译提前终止；cpf1-osrlck22-3突变体中的OsRLCK22基因靶位点处存在1bp核苷酸序列的缺失和8bp核苷酸序列的替换，使得编码的蛋白质翻译提前终止。

对野生型日本晴、3种不同纯合突变型植株对白叶枯病菌的抗性进行评价，具体步骤如下：采用剪叶法对处于分蘖盛期的日本晴、3种不同纯合突变型植株分别接种白叶枯病菌IV、GD1358，日本晴或不同突变类型植株均接种15个独立植株且每株接种3个叶片；待病情发展稳定(一般为接种白叶枯病菌14天)后，测量每个叶片的病斑长度，并以不同突变类型植株接种特定白叶枯病菌后的平均病斑长度与野生型日本晴进行比较，从而完成突变体的抗病评价。

在接种白叶枯病菌IV的条件下，结果如图4所示，与野生型日本晴相比，3种不同纯合突变体cpf1-osrlck22(即cpf1-osrlck22-1、cpf1-osrlck22-2和cpf1-osrlck22-3)均表现出白叶枯病斑变短的表型，IV病斑长度缩短26.4％～33.1％，这说明利用CRISPR/Cpf1技术创制的突变体cpf1-osrlck22增强了水稻对白叶枯病菌IV的抗性。

在接种白叶枯病菌GD1358的条件下，结果如图5所示，与野生型日本晴相比，3种不同纯合突变体cpf1-osrlck22(即cpf1-osrlck22-1、cpf1-osrlck22-2和cpf1-osrlck22-3)均表现出白叶枯病斑变短的表型，GD1358病斑长度缩短32.6％～54.7％，这说明利用CRISPR/Cpf1技术创制的突变体cpf1-osrlck22增强了水稻对白叶枯病菌GD1358的抗性。

综上所述，OsRLCK22基因被敲除可以提高水稻对水稻对白叶枯病的抗性。

本发明提供一种基于CRISPR/Cpf1技术的水稻受体胞质激酶基因OsRLCK22的定点敲除方法，可以提高水稻对白叶枯病菌IV、GD1358的抗性；本发明筛选的水稻突变体在农业生产上具有十分重要的应用价值。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院作物科学研究所

<120> 水稻受体胞质激酶OsRLCK22及其编码基因和应用

<130> GNCFY192188

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 626

<212> PRT

<213> 水稻（Oryza sativa L.）

<400> 1

Met Ala Phe Gln Leu Leu Pro Ala Met Ile Ile Ala Ala Ser Leu Leu

1 5 10 15

His Val Ala Ala Ala Val Gly Asn Glu Thr Ser Ser Asn Asn Asn Thr

20 25 30

Ser Cys Ala Pro Ala Arg Cys Gly Asn Leu Thr Ile Thr Tyr Pro Phe

35 40 45

Ser Leu Ser Gly Val Gln Pro Leu Tyr Cys Gly Tyr Pro Val Leu Asp

50 55 60

Leu Thr Cys Asp Asn Arg Thr Gly His Ala Phe Leu Ser Arg Thr Phe

65 70 75 80

Arg Glu His Leu Phe Arg Ile Asp Asn Ile Phe Tyr Glu Asn Ser Ser

85 90 95

Leu Val Ala Ala Val Gln Thr Thr Phe Ala Gly Asp Ala Asp Cys Pro

100 105 110

Ile Pro Asp Phe Asn Thr Thr Met Gly Ala Tyr Ile Ser Asp Arg Trp

115 120 125

Asn Ser Thr Pro Pro Ser Gly Ile Pro Gly Asn Cys Ile Ser Val Ser

130 135 140

Leu Pro Val Arg Gly Gly Asp Gly Met Lys Leu Leu Asp Gln His Tyr

145 150 155 160

Glu Gln Leu Ile Ala Asp Thr Ile Gly Gly Arg Thr Ile Ile His Gly

165 170 175

Asp Gly Gly Gly Ser Ile Gly Gly Asn Gly Asn Gly Ser Ile Gln Gln

180 185 190

Tyr Glu Arg Leu Ile Ser Asp Gly Phe Val Leu Glu Trp Gln Arg Ala

195 200 205

Val Thr Arg Asp Pro Asp Cys Asp Ala Cys Arg Arg Asn Gly Gly Glu

210 215 220

Cys Arg Phe Gln Gln Leu Met Phe Gln Cys Val Ser Cys His Gly Leu

225 230 235 240

Ile Cys Ser Asn Ser Thr Ser Pro Cys Asp Gln Asp Asp Asp Cys Val

245 250 255

Lys Ala Phe Ser Leu Leu Leu Arg Glu Leu Phe Ser Cys Ile His Pro

260 265 270

Pro Val Asp Glu Gly Cys Leu Arg Lys Leu Ala Trp Gln Pro Met Thr

275 280 285

Leu Ser Gln Glu Asp Trp Ser Asn Arg Lys Leu Asn Val Arg Ala Ile

290 295 300

Leu Ile Ala Gly Val Val Phe Met Cys Leu Val Trp Ile Met His Arg

305 310 315 320

Arg Lys Gln Thr Leu Gly Phe Ile Ile His His Lys Tyr Thr Gly Asn

325 330 335

Glu Ser Asn Thr Glu Glu Glu Leu Lys Arg Tyr Gln Ser Leu Ser Pro

340 345 350

Lys Arg Tyr Arg Tyr Ser Asp Leu Lys Lys Ile Thr Lys Cys Phe Lys

355 360 365

Glu Lys Leu Gly Glu Gly Gly Phe Gly Thr Ala Phe Lys Gly Asn Leu

370 375 380

Lys Asp Gly Arg Met Val Ala Val Lys Leu Leu Lys Gly Ala Lys Gly

385 390 395 400

Asn Gly Glu Glu Phe Leu Asn Glu Val Thr Ser Ile Gly Arg Thr Ser

405 410 415

His Val Asn Ile Val Asn Leu Leu Gly Phe Cys Leu Glu Arg Ser Lys

420 425 430

Arg Ala Leu Val Tyr Glu Tyr Met Ala Asn Gly Ser Leu Gly Lys Tyr

435 440 445

Ile Tyr Ser Glu Ser Leu Arg Leu Ala Ile Gly Leu Glu Ser Leu Gln

450 455 460

Lys Ile Ala Ile Gly Val Ala Arg Gly Leu Glu Tyr Leu His Gln Gly

465 470 475 480

Cys Ser Thr Arg Ile Ile His Phe Asp Ile Lys Pro His Asn Val Leu

485 490 495

Leu Asp Glu Asp Leu Cys Pro Lys Ile Ala Asp Phe Gly Leu Ala Lys

500 505 510

Leu Cys His Leu Lys Asp Ser Ala Ile Ser Met Ala Glu Ala Arg Gly

515 520 525

Thr Ile Gly Phe Ile Ala Pro Glu Val Phe Ser Arg Gly Phe Gly Val

530 535 540

Val Ser Thr Lys Ser Asp Val Tyr Ser Tyr Gly Met Met Leu Leu Glu

545 550 555 560

Met Val Glu Gly Arg Lys Asn Val Lys Thr Asn Thr Asp Asn Ser Ser

565 570 575

Ala Tyr Phe Pro Asn Trp Ile Tyr Asp His Leu Ala Lys Asp Leu Gln

580 585 590

Ser His Glu Val Thr Cys Glu Asn Glu Glu Ile Ala Arg Lys Ile Thr

595 600 605

Leu Val Gly Leu Trp Cys Ile Gln Thr Ala Pro Arg Lys Ser Ser Phe

610 615 620

Asn Glu

625

<210> 2

<211> 3237

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa L.）

<400> 2

atggccttcc agttgttacc agccatgatc atagcagctt ccttgctgca tgtcgcagca 60

gcagttggca acgagaccag cagcaacaac aacacaagct gcgcgccggc gagatgcggg 120

aacctgacca tcacgtaccc cttctcgctc agcggcgtgc agccgctcta ctgcggctac 180

ccggtgttgg acctcacctg cgacaaccga accggccacg ccttcctcag caggacgttc 240

cgggagcacc tgttccgcat cgacaatata ttctacgaga atagttcgct ggtggcagcc 300

gtgcagacca ccttcgccgg cgacgccgac tgccccatcc cggatttcaa cgtgacatcc 360

agcctcactc cgtacccatt catcatcagc aacatctgtc gtctacaact gcacgcttcc 420

tgatgacact cggctgcaac ggccatatgc aaaccagacg acgatgggag cttacatctc 480

cgatcggtgg aacagcacgc cgccgtcggg gattccaggg aactgcatct ccgtgagctt 540

gccggtgcgt ggtggagatg gaatgaagct gttagatcaa cactacgagc aattgatcgc 600

tgatacgatc ggtggtagaa ctatcattca tggtgatggt ggtgggtcca ttggtggaaa 660

tggtaatggg tcaattcaac agtacgagcg attgatcagt gatgggttcg tcttggagtg 720

gcagagggcg gtaacaagag atccagactg cgacgcatgc agaagaaacg gcggggagtg 780

caggttccaa caacttatgt tccagtgcgt cagctgccac gggttgatct gctcgaattc 840

gacatctcca tgtaagaacg ctctcccaat tttcgttttc aagacaatga aactaatttc 900

agtactctcc cacacttgct tctagtacat gttctgtttg aattcattag tagcagtcca 960

acatctacaa ctcttaccaa tctagtaaca aaatagacca ggcaaaaata tagtgcttca 1020

aagttcaaat tacaaaactg taccgctagg cttaccgaag tcaggaaggt gttttttttt 1080

tcccgagaat gcacaaaagg cttgtgcatc ttttgtatta agatttagag aagtttgaga 1140

taacaacggt caacacttaa aaaaaggaaa atggaaatta acaagaagcc tatctcttgc 1200

gatattactt aaacgaccgc cccggggggg gggggggggg cgcacagcac tcatcaactg 1260

cgtccttggc cacttccctc cacgagcgct gtcgatgttt gaacaccctg ttattgcgct 1320

ctttccaaat tgaccaggcg accaagatga cgactgtgtc aaagcctttt ctctacttct 1380

gagggaacta ttttcttgca ttcatccacc agttgatgaa ggatgtctcc ggaagctggc 1440

ttggcagcca atgacactta gtcaggaagg tgcttcaatt tctccaaaga gatgccctca 1500

aattccttct ctctcttttt catcaatgca aatatgcaat ccagagatcc actactgttc 1560

tgaatttcca atgtcagaca gcttgttgcc ttgttgttgc tgagtttctc tctgtgtcag 1620

atagtagccg ttgttaattt agatgcagtt atgtatataa actgttcgtg gcctttttta 1680

gaaaaaaaaa agtgctttta ttcatgaata agaactgagc ccaacacaca tcaactacac 1740

aacaccacga accgtcagac attagagcag tacggagaac cgttatatat ctcacaatta 1800

agcctagcta gcttacataa aaatcgaatt gatataaaaa agaatgtgag cttttcttca 1860

atcggtattc ctttgcatgt tttaacagct gaaatttttc attgatttaa ccgtaatttg 1920

ttgcagattg gagtaatcgg aagctgaatg tcagggcaat tttgataggt atgtcttttg 1980

ttggtgaata agctatgtga acatacagag aatcacatga ttccgctggc accccagctc 2040

cattccatgc tctattattg tgatactaaa atgactaatt ctagtgctat ttatttttgc 2100

ctcagattgc taaatgtcat attttggaac accgctaact aaattttttg gtgtcctgat 2160

atttttcaag atttttcaca tttacaaagg ataatgtaca taacacaagc acatcttgta 2220

tgacaaggat tcactcattt tttgtataac tctccagctt ccttgtccgc tacagctggc 2280

gtggttttta tgtgtctcgt ttggataatg caccgacgga agcaaacact tggttttatc 2340

attcaccaca agtacactgg aaatgagtca aatacagaag aggaattaaa gagataccag 2400

tctctgtctc ccaaaaggta caggtactca gacctgaaga aaataacgaa atgtttcaag 2460

gaaaaattag gagaaggtgg gtttggtacg gcattcaagg gtaatctaaa agatggccgt 2520

atggttgctg tgaaacttct aaaaggggct aaaggcaatg gagaggaatt cctaaatgag 2580

gttactagta ttggtaggac atctcatgtc aacattgtta atttacttgg cttttgttta 2640

gagagatcta agcgagccct cgtttatgag tacatggcta acggttcttt ggggaagtat 2700

atttattctg agagtttgag gttagctatt ggattggaaa gtttacagaa aatagcaatt 2760

ggcgttgcac gaggattgga gtatttgcat cagggttgca gcacccggat catccatttc 2820

gatatcaagc ctcacaacgt ccttcttgat gaagacttat gtcctaaaat tgcagatttt 2880

ggattggcaa aactttgcca cctcaaggat agtgccatct caatggctga agcaagaggt 2940

accatcggtt tcattgcacc agaagtattt tcaagaggct tcggagttgt gtcaactaag 3000

tcagatgttt acagttatgg aatgatgctg ttagagatgg tagaaggaag gaaaaatgtt 3060

aaaacaaata ctgataattc tagtgcatat ttccccaact ggatttatga tcatttagcg 3120

aaagatttgc aaagccatga agtcacatgc gagaatgaag agattgcgag gaagatcaca 3180

ctagttggcc tgtggtgcat acaaactgcc cccaggaaat cgtccttcaa tgagtaa 3237

<210> 3

<211> 1881

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa L.）

<400> 3

atggccttcc agttgttacc agccatgatc atagcagctt ccttgctgca tgtcgcagca 60

gcagttggca acgagaccag cagcaacaac aacacaagct gcgcgccggc gagatgcggg 120

aacctgacca tcacgtaccc cttctcgctc agcggcgtgc agccgctcta ctgcggctac 180

ccggtgttgg acctcacctg cgacaaccga accggccacg ccttcctcag caggacgttc 240

cgggagcacc tgttccgcat cgacaatata ttctacgaga atagttcgct ggtggcagcc 300

gtgcagacca ccttcgccgg cgacgccgac tgccccatcc cggatttcaa cacgacgatg 360

ggagcttaca tctccgatcg gtggaacagc acgccgccgt cggggattcc agggaactgc 420

atctccgtga gcttgccggt gcgtggtgga gatggaatga agctgttaga tcaacactac 480

gagcaattga tcgctgatac gatcggtggt agaactatca ttcatggtga tggtggtggg 540

tccattggtg gaaatggtaa tgggtcaatt caacagtacg agcgattgat cagtgatggg 600

ttcgtcttgg agtggcagag ggcggtaaca agagatccag actgcgacgc atgcagaaga 660

aacggcgggg agtgcaggtt ccaacaactt atgttccagt gcgtcagctg ccacgggttg 720

atctgctcga attcgacatc tccatgcgac caagatgacg actgtgtcaa agccttttct 780

ctacttctga gggaactatt ttcttgcatt catccaccag ttgatgaagg atgtctccgg 840

aagctggctt ggcagccaat gacacttagt caggaagatt ggagtaatcg gaagctgaat 900

gtcagggcaa ttttgatagc tggcgtggtt tttatgtgtc tcgtttggat aatgcaccga 960

cggaagcaaa cacttggttt tatcattcac cacaagtaca ctggaaatga gtcaaataca 1020

gaagaggaat taaagagata ccagtctctg tctcccaaaa ggtacaggta ctcagacctg 1080

aagaaaataa cgaaatgttt caaggaaaaa ttaggagaag gtgggtttgg tacggcattc 1140

aagggtaatc taaaagatgg ccgtatggtt gctgtgaaac ttctaaaagg ggctaaaggc 1200

aatggagagg aattcctaaa tgaggttact agtattggta ggacatctca tgtcaacatt 1260

gttaatttac ttggcttttg tttagagaga tctaagcgag ccctcgttta tgagtacatg 1320

gctaacggtt ctttggggaa gtatatttat tctgagagtt tgaggttagc tattggattg 1380

gaaagtttac agaaaatagc aattggcgtt gcacgaggat tggagtattt gcatcagggt 1440

tgcagcaccc ggatcatcca tttcgatatc aagcctcaca acgtccttct tgatgaagac 1500

ttatgtccta aaattgcaga ttttggattg gcaaaacttt gccacctcaa ggatagtgcc 1560

atctcaatgg ctgaagcaag aggtaccatc ggtttcattg caccagaagt attttcaaga 1620

ggcttcggag ttgtgtcaac taagtcagat gtttacagtt atggaatgat gctgttagag 1680

atggtagaag gaaggaaaaa tgttaaaaca aatactgata attctagtgc atatttcccc 1740

aactggattt atgatcattt agcgaaagat ttgcaaagcc atgaagtcac atgcgagaat 1800

gaagagattg cgaggaagat cacactagtt ggcctgtggt gcatacaaac tgcccccagg 1860

aaatcgtcct tcaatgagta a 1881

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agatgtacgg cattcaaggg taatct 26

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aaaaagatta cccttgaatg ccgtac 26

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gatcatgaac caacggcctg 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gataatgcac cgacggaagc 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ccccaaagaa ccgttagcca 20

Claims

1.蛋白质的相关生物材料在增强水稻白叶枯病抗性中的应用；

所述蛋白质为如下A1)或A2)：

A1)氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；

所述相关生物材料为如下任一所示：

C11)抑制所述蛋白质编码基因的表达的核酸分子；

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述C11)中所述编码基因为如下B1)或B2)：

B1)SEQ ID No.2所示的DNA分子；

B2)编码序列是SEQ ID No.3所示的DNA分子。

3.权利要求1或2中所述的相关生物材料在如下任一中的应用：

D1)在培育白叶枯病抗性增强的基因突变水稻中的应用；

D2)在制备培育白叶枯病抗性增强的基因突变水稻产品中的应用。

4.一种培育白叶枯病抗性增强的基因突变水稻的方法，其特征在于：所述方法包括抑制目的水稻中权利要求1中所述的蛋白质编码基因的表达，得到基因突变水稻；所述基因突变水稻比所述目的水稻的白叶枯病抗性增强。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述抑制目的水稻中权利要求1中所述的蛋白质编码基因的表达的方法为通过对所述目的水稻中权利要求1中所述的蛋白质的编码基因进行敲除或抑制或改变来实现的。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述抑制目的水稻中权利要求1中所述的蛋白质编码基因的表达的方法为利用CRISPR/Cpf1技术对所述目的水稻中权利要求1中所述的蛋白质的编码基因进行敲除来实现的。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述CRISPR/Cpf1技术中的靶序列位于SEQID NO.2第2486-2507位。