CN109369790B

CN109369790B - 水稻白枯病抗性相关蛋白OsBBR1及其编码基因与应用

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Publication number: CN109369790B
Application number: CN201811472166.8A
Authority: CN
Inventors: 周永力; 卢家玲; 张帆; 黎志康
Original assignee: Shenzhen Biology Breeding And Innovation Institute Chinese Academy Of Agricultural Sciences; Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Shenzhen Biology Breeding And Innovation Institute Chinese Academy Of Agricultural Sciences; Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2018-12-04
Filing date: 2018-12-04
Publication date: 2020-11-24
Anticipated expiration: 2038-12-04
Also published as: CN109369790A

Abstract

本发明公开了水稻白枯病抗性相关蛋白OsBBR1及其编码基因与应用。本发明公开的水稻白枯病抗性相关蛋白OsBBR1为如下A1)、A2)或A3)：A1)氨基酸序列是序列3的第240‑438位的蛋白质；A2)将序列表中序列3的第240‑438位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。实验证明，转OsBBR1基因的植株能显著提高植物的抗病性，经基因编辑后OsBBR1蛋白质功能缺失的植株抗病性降低，表明OsBBR1蛋白质及其编码基因可以用于改良植物的抗病性，对于培育抗病植物具有重要的意义。

Description

水稻白枯病抗性相关蛋白OsBBR1及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域中，水稻白枯病抗性相关蛋白OsBBR1及其编码基因与应用。

背景技术

水稻白叶枯病是全球稻作栽培中一种重要的细菌性病害，在我国华南和东南亚稻区危害严重。一般年份可导致水稻减产10％左右，严重时减产50％-60％。利用抗性基因培育抗病品种是目前防治水稻白叶枯病最经济有效的措施迄今，国内外已报道42个水稻白叶枯病抗性基因(http://www.shigen.nig.ac.jp/rice/oryzabase/gene/list)。然而，来源于野生稻的抗病基因难以利用；部分抗性基因仅具有成株期抗性；大多抗性基因的抗谱较窄。在已鉴定的水稻白叶枯病抗性基因中，仅Xa3、Xa4、Xa21和Xa23等基因在生产中得以广泛应用。水稻白叶枯病菌具有复杂的多样性和高度的变异性，生产实践表明携带单一主效基因的抗病品种大面积推广种植后，潜在的毒性小种上升为优势小种或病菌变异出现新的毒性小种，极易导致品种抗性丧失。

超量表达作为正调控水稻抗病性的抗病相关基因，可以增强植株的抗病性。因此，鉴定水稻抗病相关基因，对于水稻抗病育种具有重要价值。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何调控植物白叶枯病抗性。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种来源于水稻的蛋白质(其名称为OsBBR1)，OsBBR1为如下A1)、A2)或A3)：

A1)氨基酸序列是序列3的第240-438位的蛋白质；

A2)将序列表中序列3的第240-438位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

为了使A1)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列3的第240-438位所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。

表：标签的序列

上述A2)中的OsBBR1蛋白质，为与序列3的第240-438位所示蛋白质的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。所述具有75％或75％以上同一性为具有75％、具有80％、具有85％、具有90％、具有95％、具有96％、具有97％、具有98％或具有99％的同一性。

上述A2)中的OsBBR1蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述A2)中的OsBBR1蛋白质的编码基因可通过将序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上上表所示的标签的编码序列得到。其中，序列2所示的DNA分子编码序列3的第240-438位所示的蛋白质。

A3)所述蛋白质具体可为序列表中序列3所示的蛋白质。

本发明还提供了与OsBBR1相关的生物材料，所述生物材料为下述B1)至B9)中的任一种：

B1)编码OsBBR1的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；

B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；

B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官；

B8)降低OsBBR1表达量的核酸分子；

B9)含有B8)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物、转基因植物细胞系、转基因植物组织或转基因植物器官。

上述生物材料中，B1)所述核酸分子可为如下b11)或b12)或b13)或b14)或b15)：

b11)编码序列是序列表中序列2的cDNA分子或DNA分子；

b12)序列表中序列2所示的cDNA分子或DNA分子；

b13)序列表中序列1的所示的DNA分子；

b14)与b11)或b12)或b13)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码OsBBR1的cDNA分子或DNA分子；

b15)在严格条件下与b11)或b12)或b13)或b14)限定的核苷酸序列杂交，且编码OsBBR1的cDNA分子或DNA分子；

B8)所述核酸分子为靶向B1)所述核酸分子的sgRNA。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码OsBBR1蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的OsBBR1蛋白质的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码OsBBR1蛋白质且具有OsBBR1蛋白质功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列3的第240-438位所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述生物材料中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交,然后用2×SSC,0.1％SDS和1×SSC,0.1％SDS各洗膜一次；也可为：2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；也可为：0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述生物材料中，B2)所述的含有编码OsBBR1蛋白质的核酸分子的表达盒(OsBBR1基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达OsBBR1蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动OsBBR1基因转录的启动子，还可包括终止OsBBR1基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S；来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)Plant Physiol 120：979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸甲酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4：3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I⁹⁸⁵)Nature 313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人Genes Dev.,5:141；Mogen等人(1990)Plant Cell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic AcidRes.,15:9627)。

可用现有的表达载体构建含有所述OsBBR1基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa、PSN1301或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒具体可为载体pMDC43。

B3)所述重组载体具体可为pMDC43-BBR1。所述pMDC43-BBR1含有序列表中序列2所示的DNA分子，能表达序列表中序列3所示的OsBBR1与GFP的融合蛋白质。

B8)所述sgRNA的靶序列可为序列表中序列2的第242-261位(靶序列1)和/或序列2的第254-272位(靶序列2)。

B8)所述sgRNA可为序列表中序列5或7所示的RNA，也可为由序列表中序列5和序列7所示的两条RNA组成的组合物。

B9)所述重组载体可为利用CRISPR/Cas9系统制备的可以降低OsBBR1含量的重组载体。所述重组载体可含有表达B8)所述sgRNA的表达盒。

B9)所述重组载体具体可为CRISPR/Cas9-BBR1。所述CRISPR/Cas9-BBR1含有表达序列5所示sgRNA的表达盒以及表达序列7所示sgRNA的表达盒。

上述应用中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可为农杆菌，如根癌农杆菌EHA105。

上述应用中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。

本发明还提供了OsBBR1或调控OsBBR1活性或含量的物质或所述生物材料的下述任一应用：

D1)调控植物抗病性；

D2)制备调控植物抗病性产品；

D3)培育抗病植物；

D4)制备培育抗病植物产品；

D5)培育抗病性降低植物；

D6)制备培育抗病性降低植物产品。

上述应用中，所述抗病可为抗白叶枯病。

本发明还提供了下述任一方法：

X1)培育抗病性增强植物的方法，包括使受体植物中表达OsBBR1，或提高受体植物中OsBBR1的含量，或提高受体植物中OsBBR1的活性，得到与所述受体植物相比抗病性增强的目的植物；

X2)培育抗病性降低植物的方法，包括降低受体植物中OsBBR1的含量，或降低受体植物中OsBBR1的活性，得到与所述受体植物相比抗病性降低的目的植物；

X3)提高植物抗病性的方法，包括使受体植物中表达OsBBR1，或提高受体植物中OsBBR1的含量，或提高受体植物中OsBBR1的活性，得到与所述受体植物相比抗病性降低的目的植物实现植物抗病性的提高；

X4)降低植物抗病性的方法，包括降低受体植物中OsBBR1的含量，或降低受体植物中OsBBR1的活性，得到与所述受体植物相比抗病性增强的目的植物实现植物抗病性的降低。

上述方法中，X1)和X3)所述方法可通过向所述受体植物中导入OsBBR1的编码基因并使所述编码基因得到表达实现。

X2)和X4)所述方法可通过敲除所述受体植物中OsBBR1的编码基因实现。

X2)和X4)中所述受体植物含有OsBBR1的编码基因。

所述编码基因可为B1)所述核酸分子。

敲除所述受体植物中OsBBR1的编码基因可利用CRISPR/Cas9方法进行。

利用CRISPR/Cas9方法敲除所述受体植物中OsBBR1的编码基因可通过将编码靶向所述编码基因的所述sgRNA的表达盒和编码Cas9的表达盒导入所述受体植物中实现。

利用CRISPR/Cas9方法敲除所述受体植物中OsBBR1的编码基因具体可通过将B9)所述重组载体导入所述受体植物中实现。

利用CRISPR/Cas9方法敲除所述受体植物中OsBBR1的编码基因所用靶序列可为序列2的第242-261位(靶序列1)和/或序列2的第254-272位(靶序列2)。

在本发明的一个实施例中，与所述受体植物相比抗病性增强的目的植物为在所述受体植物中序列表中序列2的第258和第259位间插入了核苷酸T得到的植物。

在本发明的一个实施例中，与所述受体植物相比抗病性增强的目的植物为在所述受体植物中缺失序列表中序列2的第258位核苷酸A得到的植物。

在本发明的一个实施例中，与所述受体植物相比抗病性增强的目的植物为在所述受体植物中缺失序列表中序列2的第222-258位得到的植物。

上述方法中，所述OsBBR1的编码基因可先进行如下修饰，再导入受体植物中，以达到更好的表达效果：

1)根据实际需要进行修饰和优化，以使基因高效表达；例如，可根据受体植物所偏爱的密码子，在保持本发明所述OsBBR1的编码基因的氨基酸序列的同时改变其密码子以符合植物偏爱性；优化过程中，最好能使优化后的编码序列中保持一定的GC含量，以最好地实现植物中导入基因的高水平表达，其中GC含量可为35％、多于45％、多于50％或多于约60％；

2)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；

3)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；

4)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接；

5)引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV,MCMV和AMV)。

所述OsBBR1的编码基因可利用含有所述OsBBR1的编码基因的重组表达载体导入受体植物。所述重组表达载体具体可为所述pMDC43-BBR1。

所述重组表达载体和所述重组载体均可通过使用Ti质粒，植物病毒载体，直接DNA转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(Weissbach,1998，Method forPlant Molecular Biology VIII,Academy Press,New York,pp.411-463；Geiserson andCorey,1998,Plant Molecular Biology(2nd Edition).)。

所述目的植物理解为不仅包含OsBBR1蛋白或其编码基因被改变的第一代植物，也包括其子代。对于所述目的植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述目的植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

上述方法中，所述抗病可为抗白叶枯病。

本发明还提供了调控植物抗病性的产品，所述产品含有OsBBR1或所述生物材料。

所述产品可以OsBBR1或所述生物材料为其活性成分，也可将OsBBR1或所述生物材料与其他具有相同功能的物质组合在一起作为其活性成分。

上文中，所述植物可为M1)或M2)或M3)：

M1)单子叶植物或双子叶植物；

M2)禾本科植物；

M3)水稻。

所述白叶枯病可为白叶枯病菌所致病害。所述白叶枯病菌具体可为水稻白叶枯病菌。所述白叶枯病菌进一步可为中国白叶枯病菌株GD1358。

本发明公开了OsBBR1基因完整的基因序列、编码区序列及编码蛋白的序列，利用转基因和CRISPR/Cas9基因编辑技术进行了功能验证，转OsBBR1基因的植株能显著提高植物的抗病性，经基因编辑后OsBBR1蛋白质功能缺失的植株抗病性降低。OsBBR1蛋白质及其编码基因可以用于改良植物的抗病性，对于培育抗病植物具有重要的意义，适合于推广应用。

附图说明

图1为OsBBR1转基因植株的PCR鉴定结果。M为DNA分子量标准(DL5000DNAmarker)，1为阳性对照,2为阴性对照，3为OsBBR1转基因植株OE-15，4为OsBBR1转基因植株OE-22，5为OsBBR1转基因植株OE-40。

图2为阳性OsBBR1转基因植株中OsBBR1基因表达水平。

图3为CRISPR/Cas9敲除株系KO-10、KO-16和KO-28的测序峰图。

图4为CRISPR/Cas9敲除株系KO-10、KO-16和KO-28的序列变化情况。

图5为野生型植株和阳性OsBBR1转基因植株叶片的病斑长度。

图6为野生型植株和阳性OsBBR1基因敲除植株叶片的病斑长度。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA的3′末端核苷酸。

载体pGWC：来自BioVector NTCC典型培养物保藏中心。

载体pMDC43：来自BioVector NTCC典型培养物保藏中心。

根癌农杆菌EHA105：来自BioVector NTCC典型培养物保藏中心。

pYLsgRNA-OsU6a/LacZ载体(Ma X,Zhang Q,Zhu Q.et al.A Robust CRISPR/Cas9System for Convenient,High-Efficiency Multiplex Genome Editing in Monocotand Dicot Plants，Mol Plant.2015，8(8):1274-84)经华南农业大学刘耀光老师同意后公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

pYLsgRNA-OsU6b载体(Ma X,Zhang Q,Zhu Q.et al.A Robust CRISPR/Cas9System for Convenient,High-Efficiency Multiplex Genome Editing in Monocotand Dicot Plants,Mol Plant.2015,8(8):1274-84)经华南农业大学刘耀光老师同意后公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

pYLCRISPR/Cas9Pubi-H载体(Ma X,Zhang Q,Zhu Q.et al.A Robust CRISPR/Cas9System for Convenient,High-Efficiency Multiplex Genome Editing in Monocotand Dicot Plants,Mol Plant.2015,8(8):1274-84)经华南农业大学刘耀光老师同意后公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

白叶枯病菌菌株GD1358，记载在“方中达，许志刚，过崇俭，殷尚智，伍尚忠，徐羡明，章琦.中国水稻白叶枯病菌致病型的研究.植物病理学报，1990,20(2):81-88”一文中，公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得。

水稻品种武育粳20(Wang W,Mauleon R,Hu Z,et al.,Genomic variationin3010diverse accessions of Asian cultivated rice,Nature,2018,557(7703):43-49.)公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

实施例1、OsBBR1可以调控水稻白叶枯病抗性

本实施例提供了一种来源于水稻品种武育粳20的名称为OsBBR1的蛋白质，其序列为序列表中序列3的第240-438位，水稻品种武育粳20中OsBBR1基因的CDS序列为序列表的序列2，基因组序列为序列表中序列1。

一、重组载体的构建

1、OsBBR1基因表达载体pMDC43-BBR1

将OsBBR1的CDS序列通过Gateway系统构建到表达载体pMDC43上，得到含有OsBBR1基因的表达载体pMDC43-BBR1。操作步骤如下：

(1)提取水稻品种武育粳20的总RNA，反转录得到cDNA，以该cDNA为模板，利用正向引物OsBBR1-CDS-F:5’-ATGCGAGCTTCTCTCTCCCACA-3’和反向引物OsBBR1-CDS-R:5’-ATCCAGAAGCCACTGCCGG-3’，进行PCR扩增，得到扩增产物(即OsBBR1的CDS序列)，并进行切胶回收。

(2)将步骤(1)得到的扩增产物进行加A处理，具体步骤为：将20μL回收产物和20μL

PCR SuperMix(Code：AS111-11，TRANSGEN BIOTECH)进行混合，进行PCR反应。反应程序：95℃5min,72℃20min，4℃保存。

随后对PCR产物用普通DNA产物纯化试剂盒(Code:DP204-02,TIANGEN)纯化回收。

(3)将步骤(2)得到的回收产物与入门载体pGWC经Eam105酶切得到的载体骨架进行TA克隆连接，得到含有序列1所示的DNA片段的序列正确的重组载体命名为阳性入门克隆质粒pGWC-BBR1。

(4)步骤(3)得到的阳性入门克隆质粒pGWC-BBR1，与目的载体pMDC43进行LR反应，得到含有序列1所示的DNA片段的序列正确的重组载体命名pMDC43-BBR1。

LR反应体系：pGWC-BBR1 1μL(50-100ng)，载体pMDC43 1μL(50-100ng)，LR enzymemix 0.5μL。

LR反应条件：25℃孵育6h，反应体系转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆，得到正确的含有OsBBR1基因的表达载体pMDC43-BBR1。pMDC43-BBR1含有序列表中序列2所示的OsBBR1基因CDS序列以及35S启动子，能表达序列3所示的OsBBR1蛋白质与GFP的融合蛋白质，该蛋白质的表达由35S启动子驱动。

2、OsBBR1基因敲除载体CRISPR/Cas9-BBR1

构建利用CRISPR/Cas9方法编辑OsBBR1基因的重组载体，所用靶序列为靶序列1和靶序列2。

靶序列1：ACGGTAGTCTTGGACAATGG(即序列表中序列2的第242-261位)；将CRISPR/Cas9方法中靶向靶序列1的sgRNA记为sgRNA1；

靶序列2：GACAATGGCGGCATCAGCG(即序列表中序列2的第254-272位)；将CRISPR/Cas9方法中靶向靶序列2的sgRNA记为sgRNA2。

sgRNA表达盒构建：

以pYLsgRNA-OsU6a/LacZ载体为模板，使用引物U-F(5’-CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG-3’)和U6a-BBR1-R(5’-CCATTGTCCAAGACTACCGTCGGCAGCCAAGCCAGCA-3’)进行PCR扩增，将序列正确的DNA片段命名为U6a-BBR1；以pYLsgRNA-OsU6a/LacZ载体为模板，使用引物gR-BBR1-1F(5’-ACGGTAGTCTTGGACAATGGGTTTTAGAGCTAGAAAT-3’)和gR-R(5’-CGGAGGAAAATTCCATCCAC-3’)进行PCR扩增，将序列正确的DNA片段命名为sgRNA-BBR1-1。采用overlapping PCR方法将U6a-BBR1和sgRNA-BBR1-1连在一起，随后用V-F(5’-GCGCCGTAGTGCTCGTGGAATCGGCAGCAAAGGAC-3’)和1-R(5’-TTTGCTGCCGATTCCCCATCCACTCCAAGCTCTTG-3’)进行PCR扩增加上infusion接头，将得到的序列正确的DNA片段命名为LacZ-U6a-sgRNA-BBR1，LacZ-U6a-sgRNA-BBR1即为sgRNA1表达盒。LacZ-U6a-sgRNA-BBR1的序列为序列表中序列4，序列4的第237-683位为U6a启动子，第684-786位为sgRNA1的编码序列，第81-236位为LacZ alpha的编码序列。LacZ-U6a-sgRNA-BBR1能编码sgRNA1，sgRNA1的序列为序列表中序列5。

以pYLsgRNA-OsU6b载体为模板，使用引物U-F(5’-CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG-3’)和U6b-BBR1-R(5’-CGCTGATGCCGCCATTGTCCAACACAAGCGGCAGC-3’)进行PCR扩增，将序列正确的DNA片段命名为U6b-BBR1；以pYLsgRNA-OsU6b载体为模板，使用引物gR-BBR1-2F(5’-GACAATGGCGGCATCAGCGGTTTTAGAGCTAGAAAT-3’)和gR-R(5’-CGGAGGAAAATTCCATCCAC-3’)进行PCR扩增，将序列正确的DNA片段命名为sgRNA-BBR1-2。采用overlapping PCR方法将U6b-BBR1和sgRNA-BBR1-2连在一起，随后用2-F(5’-GCTTGGAGTGGATGGGGAATCGGCAGCAAAGGATGC-3’)和V-R(5’-GCGCCAATGATACCGTCCATCCACTCCAAGCTCT-3’)扩增加上infusion接头，将得到的序列正确的DNA片段命名为U6b-sgRNA-BBR1，U6b-sgRNA-BBR1即为即为sgRNA2表达盒。U6b-sgRNA-BBR1的序列为序列表中序列6，序列6的第34-366位为U6b启动子，第367-468位为sgRNA2的编码序列。U6b-sgRNA-BBR1能编码sgRNA2，sgRNA2的序列为序列表中序列7。

重组载体的构建：

将上述LacZ-U6a-sgRNA-BBR1和U6b-sgRNA-BBR1分别与pYLCRISPR/Cas9Pubi-H载体经BsaI酶切得到的载体骨架进行同源重组连接反应，得到OsBBR1基因敲除载体CRISPR/Cas9-BBR1。

同源重组反应体系：LacZ-U6a-sgRNA-BBR1(50-100ng)，U6b-sgRNA-BBR1(50-100ng)，已被BsaI酶切的pYLCRISPR/Cas9Pubi-H载体(50-100ng)，5×In-fusion HDEnzyme Premix 1μL，加ddH₂O补充至5μL。

同源重组反应体程序：50℃孵育15min，反应体系转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆，将得到的序列正确的重组载体命名为CRISPR/Cas9-BBR1，CRISPR/Cas9-BBR1含有sgRNA1表达盒和sgRNA2表达盒，能表达sgRNA1和sgRNA2以及Cas9。

二、转基因水稻的获得

分别利用步骤一的pMDC43-BBR1与CRISPR/Cas9-BBR1制备转基因水稻，并分别利用载体pMDC43和pYLCRISPR/Cas9Pubi-H载体作为对照。分别利用日本晴、武育粳20作为出发植物制备转基因水稻，其中水稻品种日本晴对中国白叶枯病菌株GD1358表现中感，水稻品种武育粳20对中国白叶枯病菌株GD1358表现高抗。具体步骤如下：

1、取出植物的成熟种子，去壳，挑取饱满光洁无菌斑的种子进行消毒。

2、将消毒后的种子接种到诱导培养基上，28℃、暗培养14天左右，选取外观良好，生长力好的愈伤组织。

3、取步骤一构建的重组载体pMDC43-BBR1导入根癌农杆菌EHA105，得到重组菌。

4、取步骤3得到的重组菌，用侵染培养基重悬菌体，得到菌悬液。

5、将步骤2的日本晴愈伤组织浸泡于步骤4制备的EHA105/pMDC43-BBR1菌悬液中，将步骤2的武育粳20愈伤组织浸泡于步骤4制备的EHA105/CRISPR/Cas9-BBR1菌悬液中，侵染20min。侵染后将菌悬液倒掉，取愈伤组织，用无菌滤纸吸干水分，然后置于共培养培养基上，培养28℃暗培养50-55h。

6、完成步骤5后，挑选表面没有明显农杆菌的愈伤组织移至抑菌培养基中，28℃暗培养3-4天。

7、完成步骤6后，将愈伤组织移至筛选培养基上28℃暗培养培养30天，每10天继代一次。

8、完成步骤7后，取新鲜潮霉素抗性的愈伤组织，接于预再生培养基中，28℃暗培养7天，然后置于光照培养间(12h光照/12h黑暗)继续培养7天后转入再生培养基上，继续光照培养，直至生长出再生植株，得到转基因植株。

将利用重组载体pMDC43-BBR1得到的转基因植株记为OsBBR1转基因植株，将利用载体pMDC43得到的转基因植株记为转基因空载对照植株。

按照上述方法，将日本晴替换为武育粳20，将pMDC43-BBR1替换为CRISPR/Cas9-BBR1，其他步骤均不变，得到转基因植株。将利用重组载体CRISPR/Cas9-BBR1得到的转基因植株记为OsBBR1基因敲除植株，将利用pYLCRISPR/Cas9Pubi-H载体得到的转基因植株记为基因敲除空载对照植株。

遗传转化所用培养基及配方：

诱导培养基：CaCl₂·2H₂O 440mg，KH₂PO₄ 170mg，MgSO₄·7H₂O 370mg，NH₄NO₃1650mg，KNO₃ 1900mg，KI 0.83mg，CoCl₂·6H₂O 0.025mg，H₃BO₃ 6.2mg，Na₂MoO₄·2H₂O0.25mg，MnSO₄·4H₂O 22.3mg，CuSO₄·5H₂O 0.025mg，ZnSO₄·7H₂O 8.6mg，Na₂-EDTA·2H₂O37.3mg，FeSO₄·7H₂O 27.8mg，VB1 0.1mg，VB6 0.5mg，烟酸0.5mg，肌醇100mg，甘氨酸2mg，2，4-D 2mg，水解酪蛋白2g，麦芽糖30g，琼脂3g，去离子水加至1L。

侵染培养基：配制方法参见参考文献：Hiei Y,Ohta S,Komari T,etal.Efficient transformation of rice(Oryza sativa,L.)mediated byAgrobacterium,and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA[J].PlantJournal,1994,6(2):271–282.。将参考文献中乙酰丁香酮的浓度替换为200μM。

共培养培养基：在诱导培养基中加入乙酰丁香酮和葡萄糖，使乙酰丁香酮在培养基中的终浓度为200μM，葡萄糖在培养基中的终浓度为10g/L。

抑菌培养基：在诱导培养基中头孢霉素，使头孢霉素在培养基中的终浓度为500mg/L。

筛选培养基：在诱导培养基中加入潮霉素和头孢霉素，使潮霉素在培养基中的终浓度为65mg/L，头孢霉素在培养基中的终浓度为500mg/L。

预再生培养基：CaCl₂·2H₂O 440mg，KH₂PO₄ 170mg，MgSO₄·7H₂O 370mg，NH₄NO₃1650mg，KNO₃ 1900mg，KI 0.83mg，CoCl₂·6H₂O 0.025mg，H₃BO₃ 6.2mg，Na₂MoO₄·2H₂O0.25mg，MnSO₄·4H₂O 22.3mg，CuSO₄·5H₂O 0.025mg，ZnSO₄·7H₂O 8.6mg，Na₂-EDTA·2H₂O37.3mg，FeSO₄·7H₂O 27.8mg，VB1 0.1mg，VB6 0.5mg，烟酸0.5mg，肌醇100mg，甘氨酸2mg，水解酪蛋白2g，麦芽糖30g，琼脂3g，激动素2mg，萘乙酸1mg，去离子水加至1L；倒平板之前加入潮霉素并使其浓度为50mg/L。

再生培养基：CaCl₂·2H₂O 440mg，KH₂PO₄ 170mg，MgSO₄·7H₂O 370mg，NH₄NO₃1650mg，KNO₃ 1900mg，KI 0.83mg，CoCl₂·6H₂O 0.025mg，H₃BO₃ 6.2mg，Na₂MoO₄·2H₂O0.25mg，MnSO₄·4H₂O 22.3mg，CuSO₄·5H₂O 0.025mg，ZnSO₄·7H₂O 8.6mg，Na₂-EDTA·2H₂O37.3mg，FeSO₄·7H₂O 27.8mg，VB1 0.1mg，VB6 0.5mg，烟酸0.5mg，肌醇100mg，甘氨酸2mg，水解酪蛋白2g，麦芽糖30g，琼脂6g，激动素2mg，萘乙酸1mg，去离子水加至1L；倒平板之前加入潮霉素并使其浓度为50mg/L。

三、转基因水稻的鉴定

1、阳性OsBBR1转基因植株的筛选与鉴定

待测植株：日本晴以及步骤二得到的OsBBR1转基因植株、转基因空载对照植株。

提取待测植株基因组DNA，以基因组DNA为模板，利用pMDC43-TF(5’-TGAACTATACAAAGGCGCGC-3’)和OsBBR1-CDS-R(5’-ATCCAGAAGCCACTGCCGG-3’)组成的引物对进行PCR扩增，用pMDC43-BBR1质粒作为阳性对照，用受体品种日本晴作为阴性对照。

将PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，阳性对照和阳性OsBBR1转基因植株均显示661bp的条带，转基因空载对照植株与阴性对照不能扩增出任何条带。部分样品的电泳图见图1。选取三株阳性OsBBR1转基因植株分别记为OE-15、OE-22、OE-40。

提取阳性OsBBR1转基因植株的总RNA，并进行反转录，利用正向引物：5’-GATCTCAGGTGACAGCCAGA-3’和反向引物：5’-GGAAACTGTTGCTGCCCTC-3’组成的引物对检测OsBBR1的表达量。所用内参为Ubiquitin，内参的引物为：正向引物UbqF:5’-GCTCCGTGGCGGTATCAT-3’和反向引物UbqR：5’-CGGCAGTTGACAGCCCTAG-3’。

结果如图2所示，OE-15、OE-22、OE-40中OsBBR1基因的表达量相对于野生型日本晴(NIP)均显著上调，表达量为野生型的2-3倍。日本晴与转基因空载对照植株中OsBBR1基因的表达量无显著差异。

2、OsBBR1基因敲除植株

待测植株：受体品种武育粳20(WYG)以及步骤一得到的OsBBR1基因敲除植株、基因敲除空载对照植株。

提取待测植株的基因组DNA，以基因组DNA为模板，以OsBBR1-F和OsBBR1-R为引物进行PCR扩增，以受体品种武育粳20作为阴性对照。

将得到的PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，阴性对照显示约600bp的条带。

将PCR扩增产物进行测序，将OsBBR1基因敲除植株的PCR扩增产物序列与阴性对照进行比对，发现，基因敲除空载对照植株中OsBBR1基因未发生改变，3个独立的OsBBR1基因敲除植株(分别为KO-10、KO-16和KO-28)在OsBBR1基因的CDS编码区发生了单碱基的插入、缺失或小片段的缺失突变。其中敲除株系KO-10在序列表中序列2的第258和第259位间插入了核苷酸T，OsBBR1基因其他序列不变；敲除株系KO-16缺失了序列表中序列2的第258位核苷酸A，OsBBR1基因其他序列不变；敲除株系KO-28缺失了序列表中序列2的第222-258位，OsBBR1基因其他序列不变。3个敲除株系的测序峰图如图3所示，序列变化情况如图4所示。

四、转基因株系的抗白叶枯病鉴定

待测植株为：日本晴，阳性OsBBR1转基因植株OE-15、OE-22和OE-40(T1代植株，均为纯合基因型)，转基因空载对照植株；武育粳20，阳性OsBBR1基因敲除植株KO-10、KO-16和KO-28(T1代植株，均为纯合基因型)，基因敲除空载对照植株。

1、将各待测植株在温室中培养约25天后移栽至网室中进行种植，单株种植，每种植株种植20株。

2、在步骤1水稻植株的分蘖盛期，用中国白叶枯病菌株GD1358进行接种，采用剪叶法对水稻植株进行人工接种，每株接种5张叶片(菌液浓度为1×10⁹cfu/mL)，每个叶片的接种量均相等，均为40μL。

3、接菌约14天后测量各植株叶片的病斑长度，每个叶片沿叶脉有一个病斑，每个植株测量3张接种叶片的病斑长度，计算平均值。

由图5可以看出，日本晴(NIP)的病斑长度为6.3cm，阳性OsBBR1转基因植株OE-15、OE-22和OE-40植株的病斑长度分别为1.5cm、1.8cm和1cm，均显著短于日本晴的病斑长度，表明OsBBR1基因能够提高水稻对白叶枯病的抗病性。由图6可以看出，CRISPR/Cas9敲除载体的受体植物武育粳20(WYG)的病斑长度为1.7cm，阳性OsBBR1基因敲除植株KO-10、KO-16和KO-28的病斑长度分别为8.5cm、7.6cm和7.8cm，均显著长于武育粳20的病斑长度，表明敲除OsBBR1基因能够提高水稻对白叶枯病的感病性。

以上结果表明，OsBBR1基因能正向调控水稻对白叶枯病的抗性。

<110> 中国农业科学院作物科学研究所、中国农业科学院深圳生物育种创新研究院

<120> 水稻白枯病抗性相关蛋白OsBBR1及其编码基因与应用

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 600

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa）

<400> 1

atgcgagctt ctctctccca cactggcatc tctccctctt ttctccccac tctatttttt 60

tctccccact acccactcaa tcctcccact ccctctcctc ctctacttac ttctctcatc 120

gcctcaaact ccctctcccc atctacccaa ctcctcacct cccacaccta cccaatcctg 180

gcgacggcgg cggcgatctc aggtgacagc cagagcggca ttggcggtgt cgacgagggc 240

gacggtagtc ttggacaatg gcggcatcag cgagggcagc aacagtttcc tggcaacgac 300

ggtggcggga gcaacgtcga tggcatcgac gagggccagg tctgcaaccg ccagactcca 360

gcgagcggat ccgttgccga caaccgcagc gacgacagca ggacggacaa caacgatgat 420

agtggcggcg gcgagagcaa cgtcggcggc attgacgaag gccggatgca ccaccaccgg 480

gctcgagcaa gtggatccgt tgctgacgac tgcggggacg acggtggcgg cgatgggagg 540

ggcgacgata gcgatggcgg gaggtgcaac gatgatggcc ggcagtggct tctggattag 600

<210> 2

<211> 600

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa）

<400> 2

atgcgagctt ctctctccca cactggcatc tctccctctt ttctccccac tctatttttt 60

tctccccact acccactcaa tcctcccact ccctctcctc ctctacttac ttctctcatc 120

gcctcaaact ccctctcccc atctacccaa ctcctcacct cccacaccta cccaatcctg 180

gcgacggcgg cggcgatctc aggtgacagc cagagcggca ttggcggtgt cgacgagggc 240

gacggtagtc ttggacaatg gcggcatcag cgagggcagc aacagtttcc tggcaacgac 300

ggtggcggga gcaacgtcga tggcatcgac gagggccagg tctgcaaccg ccagactcca 360

gcgagcggat ccgttgccga caaccgcagc gacgacagca ggacggacaa caacgatgat 420

agtggcggcg gcgagagcaa cgtcggcggc attgacgaag gccggatgca ccaccaccgg 480

gctcgagcaa gtggatccgt tgctgacgac tgcggggacg acggtggcgg cgatgggagg 540

ggcgacgata gcgatggcgg gaggtgcaac gatgatggcc ggcagtggct tctggattag 600

<210> 3

<211> 438

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Met Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val

1 5 10 15

Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu

20 25 30

Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys

35 40 45

Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu

50 55 60

Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Arg

65 70 75 80

His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg

85 90 95

Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val

100 105 110

Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile

115 120 125

Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn

130 135 140

Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly

145 150 155 160

Ile Lys Ala Asn Phe Lys Thr Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Gly Val

165 170 175

Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro

180 185 190

Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser

195 200 205

Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val

210 215 220

Thr Ala Ala Gly Ile Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Gly Met

225 230 235 240

Arg Ala Ser Leu Ser His Thr Gly Ile Ser Pro Ser Phe Leu Pro Thr

245 250 255

Leu Phe Phe Ser Pro His Tyr Pro Leu Asn Pro Pro Thr Pro Ser Pro

260 265 270

Pro Leu Leu Thr Ser Leu Ile Ala Ser Asn Ser Leu Ser Pro Ser Thr

275 280 285

Gln Leu Leu Thr Ser His Thr Tyr Pro Ile Leu Ala Thr Ala Ala Ala

290 295 300

Ile Ser Gly Asp Ser Gln Ser Gly Ile Gly Gly Val Asp Glu Gly Asp

305 310 315 320

Gly Ser Leu Gly Gln Trp Arg His Gln Arg Gly Gln Gln Gln Phe Pro

325 330 335

Gly Asn Asp Gly Gly Gly Ser Asn Val Asp Gly Ile Asp Glu Gly Gln

340 345 350

Val Cys Asn Arg Gln Thr Pro Ala Ser Gly Ser Val Ala Asp Asn Arg

355 360 365

Ser Asp Asp Ser Arg Thr Asp Asn Asn Asp Asp Ser Gly Gly Gly Glu

370 375 380

Ser Asn Val Gly Gly Ile Asp Glu Gly Arg Met His His His Arg Ala

385 390 395 400

Arg Ala Ser Gly Ser Val Ala Asp Asp Cys Gly Asp Asp Gly Gly Gly

405 410 415

Asp Gly Arg Gly Asp Asp Ser Asp Gly Gly Arg Cys Asn Asp Asp Gly

420 425 430

Arg Gln Trp Leu Leu Asp

435

<210> 4

<211> 821

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gcgccgtagt gctcgtggaa tcggcagcaa aggacgcgtt gacattgtag gactatattg 60

ctctaataaa ggaggcagct atgctggccg tcgttttaca acgtcgtgac tgggaaaacc 120

ctggcgttac ccaacttaat cgccttgcag cacatccccc tttcgccagc tggcgtaata 180

gcgaagaggc ccgcaccgat cgcccttccc aacagttgcg cagcctgaat ggctaatttt 240

ttcctgtagt tttcccacaa ccatttttta ccatccgaat gataggatag gaaaaatatc 300

caagtgaaca gtattcctat aaaattcccg taaaaagcct gcaatccgaa tgagccctga 360

agtctgaact agccggtcac ctgtacaggc tatcgagatg ccatacaaga gacggtagta 420

ggaactagga agacgatggt tgattcgtca ggcgaaatcg tcgtcctgca gtcgcatcta 480

tgggcctgga cggaataggg gaaaaagttg gccggatagg agggaaaggc ccaggtgctt 540

acgtgcgagg taggcctggg ctctcagcac ttcgattcgt tggcaccggg gtaggatgca 600

atagagagca acgtttagta ccacctcgct tagctagagc aaactggact gccttatatg 660

cgcgggtgct ggcttggctg ccgacggtag tcttggacaa tgggttttag agctagaaat 720

agcaagttaa aataaggcta gtccgttatc aacttgaaaa agtggcaccg agtcggtgct 780

ttttttcaag agcttggagt ggatggggaa tcggcagcaa a 821

<210> 5

<211> 103

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 5

acgguagucu uggacaaugg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uuu 103

<210> 6

<211> 504

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gcttggagtg gatggggaat cggcagcaaa ggatgcaaga acgaactaag ccggacaaaa 60

aaaaaaggag cacatataca aaccggtttt attcatgaat ggtcacgatg gatgatgggg 120

ctcagacttg agctacgagg ccgcaggcga gagaagccta gtgtgctctc tgcttgtttg 180

ggccgtaacg gaggatacgg cccacgagcg tgtactaccg cgcgggatgc cgctgggcgc 240

tgcgggggcc gttggatggg gatcggtggg tcgcgggagc gttgagggga gacaggttta 300

gtaccacctc gcctaccgaa caatgaagaa cccaccttat aaccccgcgc gctgccgctt 360

gtgttggaca atggcggcat cagcggtttt agagctagaa atagcaagtt aaaataaggc 420

tagtccgtta tcaacttgaa aaagtggcac cgagtcggtg ctttttttca agagcttgga 480

gtggatggac ggtatcattg gcgc 504

<210> 7

<211> 102

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 7

gacaauggcg gcaucagcgg uuuuagagcu agaaauagca aguuaaaaua aggcuagucc 60

guuaucaacu ugaaaaagug gcaccgaguc ggugcuuuuu uu 102

Claims

1.蛋白质，为如下A1）或A2）：

A1）氨基酸序列是序列3的第240-438位的蛋白质；

A2）在A1）的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

2.与权利要求1所述蛋白质相关的生物材料，为下述B1）至B5）中的任一种：

B1）编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子；

B2）含有B1）所述核酸分子的表达盒；

B3）含有B1）所述核酸分子的重组载体、或含有B2）所述表达盒的重组载体；

B4）含有B1）所述核酸分子的重组微生物、或含有B2）所述表达盒的重组微生物、或含有B3）所述重组载体的重组微生物；

B5）降低权利要求1所述蛋白质表达量的核酸分子。

3.根据权利要求2所述的生物材料，其特征在于：B1）所述核酸分子为如下b11）或b12）：

b11）编码序列是序列表中序列2的DNA分子；

b12）序列表中序列2所示的DNA分子；

B5）所述核酸分子为靶向B1）所述核酸分子的sgRNA。

4.调控权利要求1所述蛋白质表达量的物质或权利要求2或3所述生物材料的下述任一应用：

D1）调控水稻白叶枯病抗性；

D2）制备调控水稻白叶枯病抗性产品；

D3）培育抗白叶枯病水稻；

D4）制备培育抗白叶枯病水稻产品；

D5）培育白叶枯病抗性降低水稻；

D6）制备培育白叶枯病抗性降低水稻产品。

5.下述任一方法：

X1）培育白叶枯病抗性增强水稻的方法，包括使受体水稻中过表达权利要求1所述蛋白质，或提高受体水稻中权利要求1所述蛋白质的表达量，得到与所述受体水稻相比白叶枯病抗性增强的目的水稻；

X2）培育白叶枯病抗性降低水稻的方法，包括降低受体水稻中权利要求1所述蛋白质的表达量，得到与所述受体水稻相比白叶枯病抗性降低的目的水稻；

X3）提高水稻白叶枯病抗性的方法，包括使受体水稻中过表达权利要求1所述蛋白质，或提高受体水稻中权利要求1所述蛋白质的表达量，得到与所述受体水稻相比白叶枯病抗性降低的目的水稻实现水稻白叶枯病抗性的提高；

X4）降低水稻白叶枯病抗性的方法，包括降低受体水稻中权利要求1所述蛋白质的表达量，得到与所述受体水稻相比白叶枯病抗性增强的目的水稻实现水稻白叶枯病抗性的降低。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：X1）和X3）所述方法通过向所述受体水稻中导入权利要求1所述蛋白质的编码基因并使所述编码基因得到表达实现；

X2）和X4）所述方法通过敲除所述受体水稻中权利要求1所述蛋白质的编码基因实现。

7.调控水稻白叶枯病抗性的产品，含有权利要求2或3所述生物材料。