CN101157927A - 水稻抗病相关基因OsDR10和它在水稻抗病中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及植物基因工程技术领域。具体涉及包含水稻抗病相关基因OsDR10的DNA片段的分离克隆和功能验证。利用基于RNA干扰(RNA interference，RNAi)原理的转基因技术，将OsDR10基因的部分DNA片段与能够表达双链RNA的载体连接并转入水稻品种，抑制水稻品种中OsDR10基因的表达。OsDR10基因表达量显著降低的遗传转化水稻对白叶枯病菌的抗性明显增强，证明OsDR10基因在水稻抗白叶枯病反应中是负调控因子。

Description

水稻抗病相关基因OsDR10和它在水稻抗病中的应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域。具体涉及一个水稻抗病相关基因OsDR10的分离克隆、功能验证和应用。被命名为OsDR10基因是水稻抗病反应中的负调控因子。抑制OsDR10基因表达的转基因植株的抗病能力显著提高。

背景技术

植物在生长的过程中，受到多种病原物的侵害。植物病原物的种类繁多，包括病毒、细菌、真菌和线虫等。病原物侵入植物导致两种结果：(1)病原体成功的在寄主植物内繁殖，引起相关的病症；(2)寄主植物产生抗病反应，杀死病原物或阻止其生长。利用抗性基因资源改良植物的抗病性，是预防病害同时又保护环境的根本出路。

植物的抗病反应是多基因参于调控的复杂过程。参于植物抗病反应的基因分为两类：

(1)抗病基因，又称R(resistance)基因和(2)抗病相关基因。

根据目前人们对抗病基因功能的认识，R基因的产物主要是作为受体，直接或间接与病原蛋白相互作用，启动植物体内的抗病信号传导路径(Tang等，1996；Baker等，1997；Jia等，2000；Dangl和Jones，2001；Nimchuk等，2001)。R基因介导的抗病反应抗性强，是很好的基因资源。但由于下述原因，使利用抗病基因改良植物抗性受到限制：(1)R基因的资源有限，如目前知道的抵抗水稻重要病害白叶枯病的抗病基因少于30个，抵抗另一水稻重要病害一稻瘟病的R基因也只有大约40个；(2)R基因具有病原种类和病原生理小种特异性，抗病范围有限；(3)因为病原的快速突变，一个R基因的作用往往几年或者十几年后就丧失了。

抗病相关基因是指除抗病基因外所有参于抗病反应的基因，它们的编码产物参于合成植物体内抗病信号分子、参于信号传导、阻止信号传导或参于防卫反应等。这类基因的共同特点是病原诱导后它们的表达量升高或减少，因此人们可以根据病原诱导前后基因的表达量的差异大规模地鉴定植物抗病相关基因(Schenk等，2000；Zhou等，2002；Chu等，2004)。目前，人们对抗病相关基因的认识有限。根据已有报道，绝大多数抗病相关基因单独作用时的抗性能力可能比R基因小。但根据下述原因，它们是值得大力开发的基因资源.(1)自于绝大多数抗病相关基因的产物不需要直接与病原物相互作用，这类基因是具有持久抗性的基因资源；(2)大多数抗病相关基因参于的抗病反应没有病原特异性，因此它们是具有广谱抗性的基因资源；(3)这类基因的资源丰富。但是，水稻中虽然鉴定了很多抗病相关基因(Zhou等，2002；Chu等，2004)，这些基因在水稻抗病反应中的作用机理、以及单个抗病相关基因是否会引起水稻抗病表型的改变都不清楚。

水稻是世界上重要的粮食作物，但病害的影响常常造成其产量和品质的下降。因此，了解病害的发病机制，有助于利用高效途径改良水稻品种的抗性，控制病害的发生，减少或避免植物病害所带来的损失。

分离克隆抗病相关基因是对水稻抗病机理研究的前提。同时，与R基因的应用相比，抗病相关基因的应用能提供植物更为广谱及长效的抗性。通过抑制作为抗病反应负调控因子的抗病相关基因的功能进行水稻品种的改良，将进一步增强植物的抗病性，拓宽植物的抗谱。这些方面是采用常规植物育种和改良技术所不能达到的。

发明内容

本发明的目的是分离克隆水稻中携带的一个抗病相关基因完整DNA片段，并利用RNA干扰技术(RNA interference，RNAi)通过使目标基因沉默鉴定该基因在抗病反应过程中所起作用，为利用这个基因改良水稻品种或其它植物抵御病害的能力奠定基础。这个基因被命名为OsDR10(Oryza sativa defense responsive 10)。

本发明涉及分离一种包含OsDR10基因的DNA片段并鉴定其功能，该片段赋予植物对由白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)所引起的病害产生感病反应。其中，所述片段如序列表SEQ ID NO：1所示，或者基本上相当于SEQ ID NO：1所示的DNA序列，或者其功能相当于SEQ ID NO：1所示序列的亚片段。对其序列进行分析表明它是一个编码功能未知蛋白的水稻新基因。抑制序列表SEQ ID NO：1所示序列的表达可以增强水稻对白叶枯病的抗性。

可以采用已经克隆的OsDR10基因作探针，从cDNA和基因组文库中筛选到本发明的基因或同源基因。同样，采用PCR(polymerase chain reaction)技术，也可以从基因组、mRNA和cDNA中扩增得到本发明的OsDR10基因以及任何感兴趣的一段DNA或与其同源的一段DNA。采用以上技术，可以分离得到包含OsDR10基因的序列或者包含一段OsDR10基因的序列，将这一序列与合适的载体连接，可以转入植物细胞抑制其自身的OsDR10基因的表达，产生抗病转基因植物。采用这种转基因技术创造抗病植物是传统育种技术所不能达到的。

本发明为增强水稻对白叶枯病菌的抗性提供了一种新的方法。这种方法包括将OsDR10基因的部分片段和与能够表达双链RNA(double strand RNA，dsRNA)的载体连接、转入水稻，通过抑制其自身OsDR10基因的表达改良水稻对白叶枯病的抗性。

在本发明的实施例部分，申请人阐述了OsDR10基因的分离、功能验证和应用过程以及该基因的特点。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是本发明分离克隆的OsDR10基因的序列和它编码的蛋白质的氨基酸序列。

图1.本发明鉴定和分离克隆水稻抗病相关基因OsDR10以及验证OsDR10基因功能的流程图。

图2.(A)OsDR10基因的全长cDNA克隆EI87G08的结构。黑色箭头代表插入的cDNA序列，横细线代表cDNA克隆载体pSPORT1的序列，数字表示该处对应于序列表SEQ ID NO：1所示OsDR10基因序列的碱基位置。(B)OsDR10基因的嵌合cDNA片段克隆BI71N2的结构。白色箭头代表BI71N2插入序列的前半部分，对应于序列表SEQ IDNO：1所示OsDR10基因序列的364-611bp处；黑色箭头代表BI71N2插入序列的后半部分，对应于序列表SEQID NO：1所示OsDR10基因序列的171-614 bp处。

图3用实时定量RT-PCR技术检测接种白叶枯病菌PXO61后不同水稻品种或品系中OsDR10基因的表达量。ck表示没有任何处理的样品(对照)，2h、4h、8h、12h、24h、24h、48h、72h为接种2小时、4小时、8小时、12小时、24小时、48小时、72小时后的样品。

图4.OsDR10基因的结构。图中长粗横线条代表从水稻品种明恢63中获得的包含OsDR10基因、长990bp的DNA片段。横柱条表示外显子，其中黑色部分代表编码序列，白色部分代表5’和3’非翻译区；数字表示各个结构的碱基数或位置。“ATG”和“TAG”分别是翻译起始密码和终止密码。箭头代表进行基因结构分析中所用PCR引物位置。

图5.遗传转化载体pU1391的外源片段克隆位点处的结构。RB和LB代表T-DNA右和左边界；Ubi代表玉米泛素启动子；GFP代表绿色荧光蛋白基因；NOS代表胭脂碱合成酶基因终止子；Hpt代表潮霉素磷酸转移酶基因(筛选基因)。

图6.融合蛋白OsDR10-GFP位于洋葱表皮细胞的细胞核中，对照GFP位于细胞质中。标尺(线条)示100μm。

图7.D72R遗传转化质粒基本结构。它是在pDS1301载体的多克隆位点插入了OsDR10基因的cDNA片段BI71N2的反向重复序列。RB和LB代表T-DNA右和左边界；Hpt代表潮霉素磷酸转移酶基因(筛选基因)；35S代表花椰菜花叶病毒启动子；AdhI代表玉米乙醇脱氢酶基因内含子I；Waxy-a代表水稻Waxy基因内含子；OCS代表章鱼碱合成酸基因终止子；GUS代表β-葡萄糖苷酸酶基因(标记基因)。

图8.用实时定量RT-PCR技术检测OsDR10基因在对照材料(明恢63)和T0代遗传转化植株(D27RMH)中的表达量以及它们与植株病斑面积大小的关系。星号(*)示与对照材料相比，OsDR10基因的表达量显著降低(P＜0.01)。

图9.T₁代遗传转化家系D27RMH17植株接种白叶枯病菌PXO61两周后的表型。“+”符号示阳性遗传转化植株，“-”符号示阴性遗传转化植株，明恢63是遗传转化的受体(对照)。图10.T₂代阳性遗传转化植株(D27RMH3-5)家系与遗传转化受体材料明恢63(对照)接种白叶枯菌PXO61和PXO99后的细菌生长曲线。每个时间点的细菌数是来自3片叶的细菌生长数(colony-forming units，CFUs)的平均数。“0天”代表接种后立即取材。

具体实施方式

以下实施例中进一步定义本发明，图1描叙了鉴定和分离克隆OsDR10基因以及验证OsDR10基因功能的流程。根据以上的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明作出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。

实施例一：OsDR10基因在不同水稻品种中的表达模式分析

在本发明的前期研究工作中，本申请人的作物遗传改良国家重点实验室采用cDNA芯片技术分析发现来源于水稻品种明恢63的cDNA克隆BI71N2在水稻品种IRBB10接种白叶枯菌株PXO86后表达量比对照降低了2.4倍(Zhou等，2002)。本发明的申请人对BI71N2克隆的插入片段进行测序，获得一条长690 bp的cDNA序列。申请人用BLASTN分析方法(Altschul等，1997)，以BI71N2克隆的cDNA序列检索水稻品种明恢63的表达标签(expressedsequence tag，EST)序列数据库(Zhang等，2005)，发现其两段长短不一的序列与cDNA克隆EI87G08的3’端序列完全一致；即克隆BI71N2携带的水稻序列是克隆EI87G08的3’序列的反向嵌合序列(图2)。申请人将cDNA EI87G08所代表的基因命名为OsDR10(Orvza sativadefense responsive 10)。

为了进一步证实OsDR10基因参于抗病反应的调控，申请人采用实时定量反转录-PCR(quantitative reverse transcription-PCR，qRT-PCR)技术(Qiu等，2007)分析了OsDR10基因在不同水稻品种中接种白叶枯病菌株PXO61(Sun等，2004)后的表达模式。白叶枯病菌接种采用剪叶法对成株期的水稻进行接种(Sun等，2004)。白叶枯病菌菌株PXO61由菲律宾国际水稻研究所惠赠(Sun等，2004)。白叶枯病菌的培养遵循已经公开发表的方法(Sun等，2004)。接种后分不同时间点取接种叶片抽提总RNA(Zhou等，2002)。取1～5μg总RNA用DNaseI(美国Invitrogen公司)处理30分钟以去除基因组DNA污染，然后参照Zhou等(2002)的方法，使用oligo(dT)₁₅寡聚引物和SuperScript II反转录酶(美国Invitrogen公司)进行反转录。采用实时定量PCR分析试剂盒SYBRGreen PCR Master Mix(大连Tokara公司)、并根据试剂盒使用说明书，在ABI7500 Real-Time PCR system(美国Applied Biosystems公司)仪器上进行实时定量PCR反应。用水稻内源肌动蛋白(actin)基因的表达量衡量、并均一化样品RNA含量(Qiu等，2007)。qRT-PCR分析中的OsDR10基因特异PCR引物是71N2-2F(5′-TCATCAAGCTGATTTCATCAGACA-3′)和71N2-2R(5′-CGTACTTGTAGAACGCCATGGA-3′)。肌动蛋白基因PCR引物是actinF(5′-TGCTATGTACGTCGCCATCCAG-3′)和actinR(5′-AATGAGTAACCACGCTCCGTCA-3′)。

分析结果显示在未接种时携带抗白叶枯病主效基因Xa25(t)和Xa26的抗病水稻品种明恢63(Chen等，2002；Sun等，2004)中OsDR10基因的表达量显著低于感病水稻品种珍汕97(图3)。在携带抗白叶枯病主效基因Xa4的抗病品系IRBB4(Sun等，2003)中OsDR10基因的表达量显著低于其感病轮回亲本IR24(图3)。而在超量表达抗白叶枯病主效基因Xa26的转基因水稻MRkbf(Cao等，2007)中OsDR10基因的表达量显著低于转基因的感病受体水稻品种中花11(图3)。在抗病和感病水稻品种或品系上接种白叶枯病菌PXO61都可以诱导OsDR10基因的表达，但在抗病水稻品种中该基因的总体表达水平仍显著低于感病水稻品种(图3)。这些结果证实OsDR10基因可能作为负调控因子参于水稻抗白叶枯病反应的调控。

实施例二：分离克隆OsDR10基因和基因结构分析

1.OsDR10基因结构的预测

以OsDR10基因的cDNA序列EI87G08作模板，用BLAST方法检索核苷酸数据库(Altschul等，1997)，发现数据库中来自水稻品种日本晴的一条位于水稻8号染色体、长148626 bp序列(核苷酸数据库GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)注册号：AP004460)的一段序列(第14046至14662 bp处)与EI87G08序列的同源性达到100％(E值＝0)，提示AP004460中包含与OsDR10同源的基因，即OsDR10的等位基因。

利用GENSCAN(http://genes.mit.edu/GENSCAN.html)、GeneFinder(http://genomic.sanger.ac.uk/gf/gf.shtml)、Gene Feature Searches(http://dot.imgen.bem.tmc.edu：9331/)、GeneMark(http://genemark.biology.gatech.edu/GeneMark/hmmchoice.html)等多个基因结构的预测软件分析预测AP004460序列中与cDNA EI87G08同源基因的结构，同时比较分析EI87G08序列，分析判断EI87G08是OsDR10基因的全长cDNA序列。

2.从水稻品种明恢63中分离克隆OsDR10基因

申请人根据OsDR10基因在水稻品种日本晴中的等位基因(序列AP004460第14046至14662bp处的基因)的序列设计了两条PCR引物87G8-F28(5′-CAGAATTCAACTTTTATCACACGTTTAACG-3′)(下划线代表EcoRI限制性内切酶消化位点)和7G8-R3(5′-TTAACAACAGAGATGTATATATATT-3′)，从水稻品种明恢63中扩增包含OsDR10基因的DNA片段(图4)。直接利用PCR引物87G8-F2、87G8-R1(5′-ACGGATCCTTCATCATCGTCATCCTC-3′)(下划线代表BamHI限制性内切酶消化位点)、87G8-R3、以及美国Applied Biosystems公司的测序试剂盒，以双脱氧核苷酸末端终止法(美国Applied Biosystems公司)分别从PCR扩增片段两端测序(图4)。序列拼接后得到一长990bp的DNA序列，它包括完整的OsDR10基因序列。

3.OsDR10基因结构分析

比较分析OsDR10基因的基因组序列和cDNA序列，确定OsDR10基因由617个核苷酸组成，仅包含一个外显子(位于序列表SEQ ID NO：1的1-617bp处)，而没有内含子。OsDR10基因的5’端非翻译区(untranslated region，UTR)由136个核苷酸组成(位于序列表SEQ ID NO：1的1-136 bp处)，3’端UTR由181个核苷酸组成(位于序列表SEQ ID NO：1的437-617bp)。OsDR10基因的编码区由300个核苷酸组成(位于序列表SEQ ID NO：1的137-436bp处)，编码100个氨基酸。

实施例三：OsDR10基因编码产物的分析

OsDR10基因的编码区位于序列表SEQ ID NO：1所示序列的137-436 bp处)，编码-个长度为100个氨基酸蛋白质。用BLASTP(Altschul等，1997)和SMART(Simple Modul arArchitecture Research Tool，Letunic等，2006)方法分析，该蛋白质不包含任何已知的结构域(domain)和模体(motif)，说明它是一种新类型蛋白质。

实施例四：OsDR10基因编码产物亚细胞定位分析

1.遗传转化载体的构建

所用载体是申请人的作物遗传改良国家重点实验室构建的pU1391。pU1391是在国际上常用的植物遗传转化载体pCAMBIA1391(Sun等，2004)基础上改建的，携带玉米泛素组成型、超量表达启动子和绿色荧光蛋白基因(green fluorescence protein，GFP)(Qiu等，2007)的农杆菌介导的遗传转化载体(图5)。pCAMBIA1391载体由澳大利亚CAMBIA实验室(Center for the Application of Molecular Biology to International Agriculture)惠赠。

以OsDR10基因的全长cDNA克隆EI87G08为模板，采用PCR技术扩增OsDR10基因的编码区段DNA。PCR引物为87G8-R1(实施例二)和87G8-R2(5′-AAGGTACCATGGCGTTCTACAAGTACGG-3′)(下划线代表KpnI限制性内切酶消化位点)，引物上分别携带了BamHI和KpnI限制性内切酶消化位点。将PCR产物与T-A克隆载体pGEM-T(美国Promega公司)连接，将连接好的载体利用电转化的方法(Wilson和Gough，1988)转入大肠杆菌菌株DH10B(Sun等，2004)。所用电转化仪为Electroporator 2510(德国eppendorf公司)，操作参照Electroporator 2510工作手册进行，转化的电压为1800V，电容为10μF，2500V脉冲放电，时间参数为5毫秒/样品。通过酶切筛选阳性克隆，再经测序验证有无碱基突变。用限制性内切酶BamHI和KpnI消化带有OsDR10基因的编码区段的阳性克隆和pU1391载体；酶切完毕，用氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提，纯化酶切产物。然后用去磷酸化酶Alk对纯化的载体进行去磷酸化处理。用酶切纯化好的包含OsDR10基因编码区片段和去磷酸化的载体做连接反应，用上述电转化方法将连接好的载体转入大肠杆菌菌株DH10B，通过BamHI和KpnI酶切筛选外源片段正向插入的阳性克隆(图5)。

2.OsDR10蛋白的亚细胞定位分析

将携带OsDR10-GFP融合基因的pU1391载体通过上述电转化的方法转入农杆菌菌株EH105A(Qiu等，2007)。通过农杆菌介导的遗传转化方法(Lin和Zhang，2005)在洋葱表皮细胞中瞬时表达OsDR10-GFP蛋白。具体方法是将洋葱切成1平方厘米的小块，撕下内层表皮细胞层，用灭菌水洗净后平铺在MS固体培养基上28℃暗培养24小时(Lin和Zhang，2005)；然后用携带上述遗传转化载体的农杆菌菌株侵染洋葱表皮细胞，浸泡半小时后吸干洋葱表皮细胞表面的菌液，将其转入MS固体培养基上25℃培养一天(Lin和Zhang，2005)。用莱卡共聚焦显微镜Leica TCS SP2 AOBS confocal microscope(德国Leica MicrosystemsHeidelberg GmbH公司)观察绿色荧光蛋白在洋葱表皮细胞中的分布(Qiu等，2007)。观察结果显示OsDR10-GFP位于洋葱表皮细胞的细胞核中，而对照GFP位于洋葱表皮细胞的细胞质中(图6)。由此证实OsDR10是细胞核蛋白质，它可能在细胞核中发挥功能。

实施例五：OsDR10基因的功能验证

1.遗传转化载体的构建

本发明采用RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术(Smith等，2000)、通过抑制水稻品种明恢63中OsDR10基因的表达，验证该基因的功能。这个技术途径的主要机理：将目标基因的部分片段以反向重复的形式与能够表达双链RNA(double strand RNA，dsRNA)的载体连接，通过遗传转化将该载体导入植物中。获得的转化植株大量表达与目标基因部分片段同源的dsRNA。这些dsRNA迅速形成短干扰RNA(short interfering RNA，siRNA)。这些siRNA与目标基因的转录子(mRNA)互补配对，在细胞内特殊酶的作用下使目标基因的转录子降解，从而在mRNA水平上抑制目标基因的功能。研究者可以通过转基因植株表型的改变，验证目标基因的功能。RNA干扰技术已被广泛用于基因功能的验证(Smith等，2000)。

本发明利用能够表达dsRNA的农杆菌介导的遗传转化载体是pDS1301(Chu等，2006，图7)，通过上述农杆菌介导的遗传转化方法将OsDR10基因的DNA片段转入水稻品种明恢63，抑制明恢63中OsDR10基因的表达。具体操作步骤如下：

用限制性内切酶BamHI和KpnI消化OsDR10基因的cDNA克隆BI71N2(图2)、中间载体pGEM-G(美国Promega公司)和遗传转化载体pDS1301，酶切完全后在65℃水浴10min灭活限制性内切酶。将酶切片段在0.8％琼脂糖凝胶电泳后切胶回收目的条带。用T₄-DNA连接酶将cDNA克隆BI71N2的外源片段分别与中间载体pGEM GZ和遗传转化载体pDS1301进行连接。将连接好的载体通过上述电转化的方法转入大肠杆菌菌株DH10B，电转化后获得的克隆质粒经BamHI和KpnI酶切筛选验证阳性克隆。

用限制性内切酶SacI和SpeI消化携带cDNA克隆BI71N2外源片段的中间载体质粒和已经连入第一链BI71N2外源片段的pDS1301载体质粒。酶切完全后在65℃水浴10min灭活限制性内切酶。用T4-DNA连接酶将cDNA克隆BI71N2的外源片段连接到携带BI71N2片段的pDS1301质粒的SacI/SpeI酶切位点。用SacI和SpeI双酶切反应筛选阳性质粒克隆，并命名阳性克隆为D27R(图7)。

2.分析T₀代遗传转化植株

采用农杆菌介导的遗传转化方法(Lin和Zhang，2005)将D27R导入水稻品种明恢63(一个公知公用的大面积推广的品种)。获得的遗传转化植株被命名为D27RMH(其中D27R为遗传转化载体名称，MH代表水稻品种明恢63)。本发明共获得独立转化植株23株。对全部转化植株在成株期阶段接种白叶枯病菌株PXO61和PXO99(菌株PXO91由菲律宾国际水稻研究所惠赠，Sun等，2004)，与对照明恢63相比及遗传转化阴性植株相比13株阳性遗传转化植株的抗性显著增强(P＜0.01)(表1)。

表1.T₀代遗传转化植株(D27RMH)对白叶枯病菌株PXO61及PXO99的反应

水稻材料	PXO61		PXO99
					病斑面积(％)(1)	P值	病斑面积(％)(1)	P值
	D27RMH2D27RMH3D27RMH4D27RMH6D27RMH7D27RMH8D27RMH9D27RMH10D27RMH11D27RMH12D27RMH13D27RMH14(2)D27RMH15D27RMH17D27RMH18D27RMH19(2)D27RMH20D27RMH21D27RMH22D27RMH23D27RMH24D27RMH25D27RMH26(2)明恢63(对照)	32.0±4.912.3±5.736.6±5.918.3±7.420.1±5.923.6±3.222.6±3.213.6±3.832.5±3.623.2±7.217.4±3.239.4±5.914.4±5.29.8±4.614.7±3.536.3±2.537.8±4.936.3±4.817.6±4.134.4±4.832.0±5.414.5±7.835.1±2.633.8±4.9	0.53130.00000.32870.00120.00170.00690.00300.00000.58170.00890.00000.06490.00000.00000.00000.31550.15460.36130.00000.84360.49480.00000.62770.5313	56.3±6.622.7±3.560.1±6.233.4±8.531.3±6.042.7±3.829.7±9.929.5±8.255.0±8.945.0±4.921.5±8.955.4±7.219.7±6.216.3±3.430.7±10.054.9±5.760.4±5.759.5±10.522.1±5.660.1±7.953.2±10.722.8±6.260.9±7.259.8±7.2					0.35930.00000.93820.00000.00000.00160.00000.00000.25010.00780.00000.25920.00000.00000.00000.19780.87620.94050.00000.95050.15300.00000.77330.3593

(1)每株遗传转化基因植株接种3-5片叶，14天后调查病斑和病叶长度，每个数据来自于多个叶片的平均值。

(2)阴性转化植株，其它植株为阳性转化植株。

为进一步验证遗传转化植株的抗病能力增强是否与OsDR10基因表达量相关，本发明采用上述实时定量RT-PCR方法检测了其中12株T₀代遗传转化植株中OsDR10基因的表达量。实验结果显示转化植株中OsDR10基因的表达量变化与植株的病斑面积呈极显著负相关相关系数为0.88591，α＝0.01，n＝12)(图8)。抗病性增强的遗传转化植株中OsDR10基因的表达量与对照材料明恢63相比显著减少(P＜0.01)。而抗病表型无明显变化的阴性转化植株中OsDR10基因表达量与明恢63相比无显著变化(P＞0.05)。该结果说明遗传转化植株对白叶枯病菌的抗性增强是因为OsDR10基因的表达量降低；OsDR10基因的编码产物在水稻抗白叶枯病反应中发挥负调控因子的作用；抑制水稻中OsDR10基因的表达，可增强水稻对白叶枯病的抗性。

3.分析T₁和T₂代遗传转化植株

对在T0代抗性增强的、携带单拷贝遗传转化构件的三株遗传转化植株(D27RMH3、D27RMH15和D27RMH17)的T₁代家系进行分析。在孕穗期时于田间接种白叶枯病菌PXO61，同时用遗传转化载体pDS1301上的特异PCR引物pMCG-f(5′-GGCTCACCAAACCTTAAACAA-3′)和pMCG-r(5′-CTGAGCTACACATGCTCAGGTT-3′)。检测阳性植株。结果显示与对照明恢63相比所有抗性显著增强的植株都携带pDS1301载体序列；而抗性与对照相比无显著变化的植株都不携带pDS1301载体序列(表2、图9)。说明遗传转化植株抗病表型与转入的可以形成双链RNA的OsDR10基因片段共分离，进一步证明抑制OsDR10基因表达可增强水稻抗病性。

表2.T₁代遗传转化植株(D27RMH)对白叶枯病菌株PXO61的反应

水稻材料	PCR检测阳性植株	PXO61
				病斑面积(％)(1)	P值
		D27RMH3家系D27RMH3-1D27RMH3-2D27RMH3-3D27RMH3-4D27RMH3-5D27RMH3-6D27RMH3-7D27RMH3-8D27RMH3-9D27RMH3-10D27RMH3-11D27RMH3-12D27RMH3-14D27RMH3-15D27RMH3-16D27RMH3-17D27RMH3-21D27RMH3-22D27RMH3-23D27RMH3-24D27RMH3-25D27RMH15家系	-+++++++-++-++++-+-++			27.7±2.621.1±5.814.7±4.219.2±3.37.7±1.320.6±4.220.3±3.120.8±6.227.3±3.219.6±3.715.3±3.123.7±7.514.1±4.417.9±2.220.5±4.314.1±4.927.2±4.68.2±2.227.5±5.89.2±2.821.2±2.2	0.16500.00330.00000.00000.00000.00040.00030.00310.12950.00040.00000.09240.03520.00010.05850.00000.40510.00000.44760.00000.0253

D27RMH15-21D27RMH15-22D27RMH15-23D27RMH15-24D27RMH15-25D27RMH15-26D27RMH15-27D27RMH15-28D27RMH17家系D27RMH17-21D27RMH17-22D27RMH17-23D27RMH17-24D27RMH17-25D27RMH17-26D27RMH17-27D27RMH17-28D27RMH17-29D27RMH17-30D27RMH17-31D27RMH17-32D27RMH17-33D27RMH17-34D27RMH17-35D27RMH17-36D27RMH17-37D27RMH17-38D27RMH17-39D27RMH17-40明恢63(对照)

-++++-++-+++++++++-+++++++++

24.7±4.810.4±6.117.2±4.06.9±5.219.7±5.623.1±1.47.4±5.017.3±2.826.1±6.07.9±3.63.7±2.14.2±2.07.1±7.43.0±1.55.8±3.87.3±1.82.5±0.94.3±1.524.5±1.59.0±4.617.2±5.217.1±7.41.9±0.31.5±1.19.7±4.710.5±5.517.5±4.78.0±4.730.6±4.0

0.15570.00010.00330.00030.01480.06700.00000.00320.27990.00000.00010.00010.00000.00000.00000.00000.00000.00000.12820.00020.00380.00480.00000.00000.00120.01910.00420.0000

⁽¹⁾每株遗传转化基因植株接种3-5片叶，14天后调查病斑和病叶长度，每个数据来自于多个叶片的平均值。

对T₂代(D27RMH3-5)阳性遗传转化基因植株家系及对照明恢63进行白叶枯病菌生长分析。在孕穗期时于田间分别接种白叶枯病菌菌株PXO61和PXO99。接种后在不同时间取叶片材料(接种剪口下6cm的叶片)，同一份材料取三片叶(代表三个实验重复)。根据已报道的方法处理叶片材料，分析细菌的生长数量(Sun等，2004)。主要分析步骤如下：用75％酒精消毒叶片表面1分钟，晾干，置于研钵中加1mL灭菌蒸馏水研磨成匀浆，然后加倍灭菌水稀释成不同浓度梯队；根据前人经验(Sun等，2004)取相应的三个连续浓度梯度涂于土豆培养基上，每个浓度梯度重复涂三个皿，22～25℃黑暗下生长2-3天后统计细菌菌落数；以每片叶上细菌菌落数的LOG值绘制细菌生长曲线。细菌生长分析表明，在接种PXO61和PXO99后4天至14天转基因植株中白叶枯病菌的数量低于对照明恢63约40至166倍(图10)。这一结果说明抑制OsDR10基因表达，可抑制白叶枯病菌在水稻中的生长繁殖，从而增强水稻对白叶枯病的抗性。

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序列表

<110>华中农业大学

<120>水稻抗病相关基因OsDR10和它在水稻抗病中的应用

<130>

<141>2007-09-12

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>617

<212>DNA

<213>Oryza sativa

<220>

<221>gene

<222>(1)..(617)

<223>

<220>

<221>5’UTR

<222>(1)..(136)

<223>

<220>

<221>CDS

<222>(137)..(436)

<223>

<220>

<221>3’UTR

<222>(437)..(617)

<223>

<400>1

tcatcatcaa caattcacaa gaactccatc acttacagtg caaatcatca agctgatttc     60

atcagacaaa tttcactaat taacaactag ctagctgccg tagagctagc cgtgtgcgat    120

caagatcaga tcatcc atg gcg ttc tac aag tac ggc ttc gcc ttc ttg gcc    172

                  Met Ala Phe Tyr Lys Tyr Gly Phe Ala Phe Leu Ala

                  1               5                   10

ggc acc ggc ttc ggc gcc gcg ctc acc agc ctc cgc cgc gac ggc gac      220

Gly Thr Gly Phe Gly Ala Ala Leu Thr Ser Leu Arg Arg Asp Gly Asp

        15                  20                  25

agc tgc tgc ccc atg cgc cgc cgc cac cgc cgc tgt cgc cgc cgc cac      268

Ser Cys Cys Pro Met Arg Arg Arg His Arg Arg Cys Arg Arg Arg His

    30                  35                  40

gac gac gac gac cag ctg gtc gac ggc gac ggc gag gct gca ggg gaa      316

Asp Asp Asp Asp Gln Leu Val Asp Gly Asp Gly Glu Ala Ala Gly Glu

45                  50                  55                  60

gag cga tac aag gag agc aag agg gcg acg acg acg acg aat ccc aag      364

Glu Arg Tyr Lys Glu Ser Lys Arg Ala Thr Thr Thr Thr Asn Pro Lys

                65                  70                  75

gcc aag aag ggc agc acc aag gag aag gca gct gct agt gtt gct agg      412

Ala Lys Lys Gly Ser Thr Lys Glu Lys Ala Ala Ala Ser Val Ala Arg

            80                  85                  90

gag gag gag gat gac gat gat gaa taggattaat ttgagttgat tattaattaa     466

Glu Glu Glu Asp Asp Asp Asp Glu

        95                  100

gttcagtttg agttcagcta ttattgtaat tagctgcttg attccgttgc tgtgccggtt    526

aattgtgttt gtttagctct gtactcgtta tcctgttgtg tgtattgaca aaataagata    586

atatatatac atctctgttg ttaaaaaata a                                   617

<210>2

<211>100

<212>PRT

<213>Oryza sativa

<400>2

Met Ala Phe Tyr Lys Tyr Gly Phe Ala Phe Leu Ala Gly Thr Gly Phe

1               5                   10                  15

Gly Ala Ala Leu Thr Ser Leu Arg Arg Asp Gly Asp Ser Cys Cys Pro

            20                  25                  30

Met Arg Arg Arg His Arg Arg Cys Arg Arg Arg His Asp Asp Asp Asp

        35                  40                  45

Gln Leu Val Asp Gly Asp Gly Glu Ala Ala Gly Glu Glu Arg Tyr Lys

    50                  55                  60

Glu Ser Lys Arg Ala Thr Thr Thr Thr Asn Pro Lys Ala Lys Lys Gly

65                  70                  75                  80

Ser Thr Lys Glu Lys Ala Ala Ala Ser Val Ala Arg Glu Glu Glu Asp

                85                  90                  95

Asp Asp Asp Glu

            100

Claims (4)

1.影响水稻对白叶枯病产生抗性的DNA序列，它是SEQ ID NO：1中所示的DNA序列，它包括完整的OsDR10基因。

2.OsDR10基因的编码区，它是SEQ ID NO：1中第137-436位所示的DNA序列或者是编码与SEQ ID NO：1编码的蛋白质相同的蛋白质的DNA序列。

3.与合适启动子连接的、能够使水稻产生双链RNA的权利要求1和2包含的DNA序列。

4.权利要求1-2任一项所述的DNA序列在增加水稻对白叶枯病抗性中的应用。

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