MX2015005466A - Identificacion de un gen resistente a xantomonas euvesicatoria del pimiento (capsicum annuum) y metodo para generar plantas con resistencia. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a la identificación del gen xcv-1, que es responsable de una resistencia recesiva a Xanthomonas euvesicatoria, mediante la donación a base de mapeo genético de Capsicum annuum. Además, la invención se refiere a métodos para generar plantas resistentes a un factor abiótico o biótico, en particular para Xanthomonas euvesicatoria, y las plantas mismas, en particular plantas de tomate.

Description

IDENTIFICACIÓN DE UN GEN RESISTENTE A XANTOMONAS EUVESICATORIA DEL PIMIENTO ( CAPSICÜM ANNUUM) Y MÉTODO PARA GENERAR PLANTAS CON RESISTENCIA Campo de la Invención La presente invención se refiere a la identificación del gen xcv-1, que es responsable de una resistencia recesiva a Xanthomonas euvesicatoria, mediante la clonación a base de mapeo genético de Capsicum annuum. Además, la invención se refiere a métodos para generar plantas resistentes, en particular plantas resistentes a Xanthomonas euvesicatoria .

Antecedentes de la Invención Es bien conocido que en la producción de plantas cultivables, las cosechas sensibles se infestan por varios patógenos (virus, bacterias, hongos, etc.) las serias consecuencias de lo cual incluyen la reducción de la producción o la pérdida de la producción. Por lo tanto, un requerimiento fundamental para variedades de plantas avanzadas y competitivas es mostrar la resistencia a plagas y de las variedades de plantas competitivas, es mostrar resistencia a plagas y patógenos que causan las mayores pérdidas de producción. Las plantas resistentes permiten una producción más barata y ambientalmente más amigable porque no se liberan en la naturaleza líquidos en aspersión que contienen sustancias dañinas y toxinas. La teenología para la producción Ref.: 256396 ambientalmente amigable de plantas resistentes también aumenta la seguridad en la producción; producciones de más alta calidad y la calidad puede cosecharse a menores costos.

La identificación, aislamiento y caracterización de los genes que proveen resistencia son de vital importancia para ambas, teoría y práctica: el proceso puede entenderse mediante la exploración de los genes involucrados en el proceso de infección, sus productos y sus funciones, y esto forma las bases indispensables para desarrollar estrategias de control.

Con respecto a los procesos moleculares de la protección de la planta, se pueden distinguir dos mecanismos básicos. El primero es la resistencia dominante y el segundo es la resistencia recesiva. En el caso de un mecanismo de protección dominante, una molécula de señal (típicamente, una proteína) del patógeno inicia un proceso de auto-destrucción (apoptosis) que da como resultado la muerte de las células infectadas y sus vecinos por lo tanto deteniendo la diseminación del patógeno (Pontier D. et al., C R Acad Sci III.321:721-34, 1998.). El resultado de la destrucción celular, es decir la muerte de la célula programada, es un parche seco y necrótico descolorido, que es la manifestación de la denominada reacción hipersensible (HR, por sus siglas en inglés) (Klement Z. et al., Phytopathology 54: 474-477, 1964). La resistencia dominante es específica de la raza y puede abolirse fácilmente como las nuevas razas rompen la resistencia.

En el caso de resistencia recesiva, una mutación causas la pérdida de una función que es indispensable para el desarrollo de la virulencia. Hasta ahora, los pasos del desarrollo de la resistencia recesiva, así como sus funciones, y los genes de la planta de tales funciones son en su mayor parte desconocidos, sin embargo, se encontró que más de un gen está involucrado en el desarrollo de la resistencia sobre la parte de ambos, la bacteria y el hospedero de la planta. Los genes de resistencia recesiva pueden identificarse cuando existe una diferencia entre los genes involucrados en el proceso inducidos por el patógeno y que causan la enfermedad (virulencia) y los genes de tipo silvestre. Los genes que proveen resistencia recesiva se han identificado de unas cuantas plantas, incluyendo entre otras, el gen RRS1-R de Arabidopsis thaliana (Deslandes L. et al., PNAS 99: 2404-2409, 2002) y un gen contra Xanthomonas oryzae del arroz (lyer-Pacuzzi A.S., Pathosystem. Mol. Plant Microb. Interaction 20:731-739, 2007). Un número de genes proveen resistencia dominantes ha sido identificado del pimiento sobre las bases de fenotipos imitantes, pero ningún gen provee resistencia recesiva. En general, resistencia recesiva no específica de la raza y es más difícil; por lo tanto, es más estable.

En el campo del cultivo de pimiento comestible y como condimento, la bacteria Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (Xcv), recientemente renombrada como Xanthomonas euvesicatoria ( Xe) causa el daño más significativo (Jones J.B. et al., System. Appl. Microbiol.27: 755-762, 2004). La bacteria Xe está mediada en gran parte por agua y entra a la planta a través de lesiones y huecos en las hojas. Bajo condiciones climáticas calientes y húmedas, la bacteria se dispersa rápidamente. Los síntomas de la enfermedad en su mayor parte aparecen en las hojas. Los parches de tipo cicatriz se desarrollan en la parte posterior de las hojas y después se convierten en áreas necróticas en la parte frontal de las hojas. Las hojas infectadas de las plantas sensibles mueren y se caen dentro de una a dos semanas, y la producción se quema con el sol.

Similar a un grupo de bacterias de plantas y animales, la Xanthomonas euvesicatoria también es capaz de cultivar el denominado pelo a través del Sistema de Secreción de Tipo Tres (TTSS, por sus siglas en inglés), y los extremos de este pelo se extienden hasta la membrana de la célula eucariota. El pelo es permeable para las moléculas efectoras de la bacteria. Una o más de las células efectoras crean el denominado translocón en la membrana de la célula a través del cual las moléculas efectoras entran en el citoplasma eucariota; en varios casos, también entran en el núcleo del citoplasma si comprenden una Señal de Localización Nuclear (NLS). Para su cultivo, la bacteria utiliza las moléculas nutrientes presentes en las células de la planta, que se liberan después de la pérdida de la integridad de las células de la planta. La desintegración de las células se induce por las moléculas efectoras introducidas a través del Sistema de Secreción de Tipo Tres de Xe vía un mecanismo de infección los detalles del cual aún no son claros. La proliferación de la bacteria daña los tejidos de la planta a tal grado como para causar que la mayor parte de las hojas se caigan y la planta se seque tarde que temprano.

El genoma completo de Xanthomonas euvesicatoria ( cepa X. campestris pv. vesicatoria 85-10) se ha determinado (Thieme F. et al . , J. Bacteriol.187:7254-7266, 2005), y los genes de las proteínas efectoras involucrados en la inducción de una reacción hipersensible dominante del pimiento se han identificado. Los genes para la resistencia recesiva a Xanthomonas euvesicatoria no se han identificado del pimiento aún.

La literatura describe unas cuantas variedades de pimiento resistentes a Xe. Estas plantas llevan genes resistentes incluyendo, pero no limitándose a Bsl (Cook A.A. and Stall R.E., Plant Dis. 53:1060-1062, 1963), Bs2 (Cook A.A. and Guevara Y.G., Plant Dis.68:329-330, 1984), Bs3 (Kim B.S. and Hartmann R.W., Plant Dis. 69:233-235, 1985), Bs4 (Hibberd et al . , Phytopathology 77:1304-1307, 1987), hs5 (Jones J.B. et al . , System.Appl.Microbiol.27:755-762, 2004) y hs6 (Vallejos C.E. et al . , Theor. Appl. Genet.121:37-46, 2010). Los bs5 y bs6 anteriores son tipos recesivos de genes resistentes.

A pesar de las variedades de pimiento resistentes existentes, aún existe una extrema necesidad de variedades de pimiento resistentes a las especies Xanthomonas y a otras variedades de plantas que son resistentes a factores bióticos y abióticos.

El objetivo del presente estudio es identificar y aislar un gen del pimiento ( Capsicum annuum) que provee resistencia recesiva a Xanthomonas euvesicatoria, que se puede usar para desarrollar variedades resistentes individuales o dobles (en pirámide), en su mayor parte a Xanthomonas sp., pero presumiblemente a otros factores bióticos o abióticos también, en especies de pimiento sensibles y otras especies de plantas tales como tomate, papa, arroz, cítricos, banana, etc.

Breve Descripción de la Invención El objetivo anterior podría lograrse por la presente invención. De un Capsicum annuum que lleva una resistencia recesiva, se aisló un gen designado como xcv-1 utilizando clonación a base de mapa genético. La secuencia del gen aislado se determinó (SEC ID NO:37) y se encontró que la proteína xcv-1 (SEC ID NO:38) codificada por el gen comprende una eliminación Leu doble en las ubicaciones correspondientes a las posiciones positions 87 y 88 de la proteína Xcv-1 de tipo silvestre (SEC ID NO:42). La proteína xcv-1 mutante es una proteína de transmembrana (TM, por sus siglas en inglés) anclada en la cola (TA, por sus siglas en inglés), más específicamente a la proteína CYSTM, que lleva la eliminación de leucina doble en sus región de transmembrana rica en cisteína (en lo sucesivo referida como 'región CYSTM1). Esta región CYSTM muestra relevancia estructural con la región CYSTM de las otras proteínas de transmembrana conocidas (Venancio T.M. and Aravind L, Bioinformatics 26:149-152, 2010) en que es una característica común que son ricas en cisteína (comprendiendo al menos tres cisteínas), que están ampliadas por un aminoácido con carga negativa (ácido aspártico o ácido glutámico) o un aminoácido polar (asparagina) en la posición 3 del extremo C-terminal de la proteína, y que Asp, Glu o Asn son precedidos por dos aminoácido hidrófobos (aquí: leucina), y menos frecuentemente, estas posiciones contienen isoleucina, metionina, triptófano, glicina, alanina, treonina, fenilalanina, valina y cisteína.

Es interesante notar que ciertos hongos (por ejemplo, Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae ) que son resistentes a ciertos factores abióticos tales como radiación UV, y ciertos fármacos (por ejemplo, canavanina), pierden tal resistencia y su capacidad de esporulación si una proteína de tipo CYSTM pierde su función como un resultado de una mutación génica (Lee J.K. et al . , Biochem. Biophys, Res. Com .202:1113-1119, 1994; Lee, J.K. et al., Mol. Gen. Genet.246:663-670, 1995; Venancio T.M. et al . , Mol Biosyst. 6:175-181, 2010; Venancio, T.M. y Aravind, L. Bioinformatics 26:149-152, 2010).

Similar a los hongos, las plantas Arabidopsis thaliana también sufren de severas alteraciones en megasporogénesis en el caso de una pérdida de la función en sus genes homólogos a las proteínas CYSTM anteriores (W1H1, W1H2 mutación doble) (Lieber, D. et al . , Current Biology 21:1009-1017, 2011).

Se encontró que mediante la remoción de dos aminoácidos de la región CYSTM C-terminal, preferiblemente de los de las posiciones 5 y 6 del extremo C-terminal, de una proteína homologa a la proteína Xcv-1 de tipos silvestre pero derivados de un organismo de planta diferente al pimiento (por ejemplo, tomate), propiedades ventajosas, principalmente resistencia recesiva pueden ser inducidas en el organismo de la planta. La eliminación de los dos codones, es decir, 6 pares base, que codifican estos dos aminoácidos en la región CYSTM, que incluyen pero no se limitan a, leucina, isoleucina, metionina, triptófano y cisterna - se refiere como 'la eliminación 6-bp deseada1.

Sin limitarse a ninguna teoría con respecto al desarrollo de la resistencia, es probable que una eliminación Leu doble en la región CYSTM (los últimos 13 aminoácidos en el extremo C-terminal de la proteína) de la proteína xcv-1 mutante codificada por el gen xcv-1 previene o reduce la entrada de las moléculas efectoras de la bacteria con el sistema de secreciones de tipo tres en las células de planta.

Esta hipótesis está preliminarmente sostenida por el resultado de líneas de pimiento doblemente resistentes que llevan Bs2 y xcv-1 en la configuración homocigota. Estas plantas después de la infección con AvrBs2 que contiene Xe no muestran el fenotipo HR característico del efector AvrBs2 de Xe infectado más probablemente debido a que AvrBs2 no está entrando en las células de plantas, por el otro lado el fenotipo de esta infección muy similar al causado por plantas que contienen xcv-1/ xcv-1. El resultado anterior indica que xcv-1 es epistático sobre Bs2.

La identificación y caracterización de la resistencia a la enfermedad del punto bacteriano xcvl ha revelado que este gen contiene un nucleótido seis en la eliminación en marco que remueve dos aminoácidos leucina de la porción carboxi terminal de la proteína. Los análisis computacionales sugieren que esta proteína es una proteína de membrana con una función desconocida. Debido a que esta mutación confiere resistencia a varias cepas de Xanthomonas que causa una enfermedad en el pimiento y el tomate, sería informativo para ensayar si esta mutación afecta el suministro de secreciones de tipo tres de proteínas efectoras de tipo tres dentro de las células de planta. Se podría utilizar un ensayo de gen reportero para examinar la actividad bioquímica de las proteínas de fusión de traslación entre los dominios N-terminal de varios proteínas efectoras de tipo tres y el gen reportero de adenilato cielasa (Evidencia bioquímica directa para la translocación dependiente de la secreción de tipo III de la proteína efectora AvrBs2 en las células de planta. Casper-Lindlcy C. et al . , PNAS 99:8336-8341, 2002).Usando este ensayo, xcv-1 y otras plantas, inculyendo pimientos de tipo silvestre, tomate, cítricos, nueces, lechuga, mostaza, soja, arroz, etc., pueden ensayarse para su habilidad para recibir proteínas efectoras secretadas de tipo tres de cepas de Xanthomonas euvesicatoria, X. perforans , X. gardneri y otras bacterias dependientes del sistema de secreción de tipo tres. El ensayo de adenilato cielasa permitirá medios para monitorear el mecanismo de resistencia en plantas xcv-1 o con combinaciones de genes resistentes.

Por consiguiente, se asume que una planta transgénica que tiene resistencia recesiva puede generarse por la remoción del gen que codifica la región CYSTM original a través de la aniquilación de genes residentes homólogos de una planta, y por el reemplazo simultáneo con una región CYSTM mutante que comprende una eliminación 6-bp deseada a través de transformación. Similarmente, se asume que si se genera un derivado o derivados que llevan la eliminación 6-bp deseada en una planta por mutación espontánea o inducida del segmento del gen que codifica la región CYSTM de proteínas CYSTM solitarias (una copia) o múltiples copias (doble, triple copia, etc.), o por métodos de "edición del genoma" a base de nucleasa tales como, por ejemplo, Dedo de Zinc Nucleasa (ZFN, por sus siglas en inglés), Nucleasa Efectora de tipo Activador de Transcripción (TALEN, por sus siglas en inglés) y téenica de nucleasa asociada con Repeticiones Palindrómicas Cortas Regularmente Interespaciadas Agrupadas/CRISPR - o la técnica CRISPR/Cas nucleasa en corto, o en cualquier otra forma, entonces las plantas con resistencia recesiva pueden generarse. Presumiblemente, los homólogos mutantes mostrarán una propiedad ventajosa, es decir, harán a la planta resistente.

Esta hipótesis se probó por la técnicas transgénica utilizando tomate sensible a ( Solanum lycopersicum) como sigue: la resistencia recesiva a Xe se generó en tomate inactivando dos genes residentes ( SlXcv-lA, SEC ID NO.-49 y SIXcv-IB, SEC ID NO:51) homólogos al gen Xcv-1 de tipo silvestre y por medio de la creación in vitro de las eliminaciones 6-pb en los genes homólogos en las posiciones correspondientes al gen xcv-1 {SlXcv-lA, SEC ID NO:59 y SlXcv-lB, SEC ID NO:66), seguido por la introducción de los genes mutantes en las células de la planta.

Adicionalmente, sin limitar el alcance de la invención, se describen tres métodos utilizando las técnicas de edición del genoma (TALEN, CRISPR/Cas nucleasa y ZFN) para la creación de la eliminación 6-bp deseada y por lo tanto generando la resistencia recesiva a las especies Xanthomonas en el tomate.

SlXcv-lA y SlXcv-lB, los genes mutantes responsables de la resistencia, podrían aislarse de las plantas de tomate transgénicas, sus secuencias se determinaron (SEC ID NO:59 y SEC ID NO:66, respectivamente), y éstas codifican las proteínas SlXcv-lA y S1XC -1B (SEC ID NO:60 y SEC ID NO:67, respectivamente). Las secuencias de lo anterior se compararon con las secuencias proteicas de tipo silvestre (SEC ID NO:50 y SEC ID NO:52), y las eliminaciones se confirmaron en los lugares correspondientes a las posiciones 86 a 87 y 88 a 89.

Por consiguiente, un objeto de la presente invención es el gen xcv-1 aislado de Capsicum annuum, que es responsable de una resistencia recesiva a Xanthomonas euvesicatoria y tiene la secuencia de nucleótidos de SEC ID NO:37. La presente invención también se refiere al ADNc de gen xcv-1, que tiene la secuencia de nucleótidos de SEC ID NO:90.

Otro objeto de la presente invención es la proteína CYSTM xcv-1 que provee resistencia, que se codifica por el gen xcv-1 y su secuencia ADNc, y tienen la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:38, en donde la región CYSTM de la proteína lleva un eliminación Leu doble en las ubicaciones correspondientes a las posiciones 87 y 88 de la proteína de tipo silvestre de SEC ID NO:42.

Otro objeto de la presente invención es una proteína homologa a la proteína CYSTM xcv-1, que comprende una eliminación de dos aminoácidos en la región CYSTM en comparación con la región CYSTM de la proteína homologa de tipo silvestre, y provee resistencia. Preferiblemente, la proteína homologa mutante lleva la eliminación de dos aminoácidos en la región CYSTM, en las posiciones 5 y 6 del extremo C-terminal de la proteína de tipo silvestre. Los ejemplos preferidos de tales proteínas mutantes incluye las proteínas SlXcv-lA o SlXcv-lB, que tienen la secuencias de aminoácidos de SEC ID NO:60 o SEC ID NO:67, respectivamente.

Además, la invención se refiere a los homólogos den gen xcv-1 que codifica las proteínas CYSTM mutantes homologas anteriores. Los ejemplos preferidos incluyen el gen SlXcv-lA que tiene la secuencia de nucleótidos de SEC ID NO:59 o sus variantes de ADNc que tienen la secuencia de nucleótidos de SEC ID NO:88, que codifican la proteína homologa mutante SlXcv-lA (SEC ID NO:60), o el gen SlXcv-lB que tiene la secuencia de nucleótidos de SEC ID NO:66 o sus variantes de ADNc que tienen la secuencia de nucleótidos de SEC ID NO:89, que codifican la proteína mutante SlXcv-lB (SEC ID NO:67).

Además, la presente invención se refiere a nucleasa proteínas modificadas específicas para la secuencia de ADN de un gen homólogo al gen Xcv-1 de tipo silvestre (SEC ID N0:41), que selectivamente reconoce el segmento de ADN que codifica la región CYSTM del gen homólogo al gen Xcv-1 de tipo silvestre, o ciertas de sus secuencias parciales. Las nucleasa proteínas modificadas preferidas incluyen aquellas específicas para las secuencias de ADN de los genes SlXcv-lA y SlXcv-lB. Las nucleasa proteínas modificadas preferidas incluyen un par de ZFN nucleasa que selectivamente reconoce los segmentos génicos representados por SEC ID NO:86 y 87, o un par de TALEN nucleasa que selectivamente reconoce los segmentos génicos representados por SEC ID NO:78 y 79 o 78 y 80, o una sgRNS-CRISPR/Cas nucleasa que selectivamente reconoce los segmentos génicos representados por SEC ID NO:81.

La presente invención también se refiere a genes que codifican tales nucleasa proteínas modificadas.

La presente invención también se refiere a moléculas de ácido nucleico artificiales (ARNmi) para silenciar SlXcv-lA y SlXcv-lB que son complementarias a la región CYSTM del ARNm de las células de planta. Estas moléculas de ácido nucleico comprenden secuencias de nucleótidos adicionales para la expresión. Es importante notar, que estas moléculas de ácido nucleico no silencian aquellos genes que llevan la eliminación 6 bp deseada.

Otro objeto de la presente invención es un vector que comprende el gen xcv-1 (SEC ID NO:37), uno o más de sus homólogos, preferiblemente los genes SlXcv-lA (SEC ID NO:59) y/o SlXcv-lB (SEC ID NO:66), o los genes de TALEN, CRISPR/Cas y ZFN nucleasas específicos para los genes Xcv-1 adecuados para la edición genómica y otras moléculas de ácido nucleico descritas en esta invención.

Otro objeto de la invención es una célula hospedera transformada con tal vector.

Otro objeto de la presente invención es un método para la preparación in vitro de un gen mutante homólogo al gen xcv-1 o sus variantes de ADNc, que comprende los pasos de: a) identificar un gen homólogo al gen Xcv-1 de tipo silvestre (SEC ID NO:41) en una planta; b) preparar in vitro las secuencias genómicas y de ADNc del gen identificado en el paso a) en la forma de un ADN; y c) crear in vitro una eliminación de 6 bp deseado en el ADN preparado en el paso b) en la porción del gen que codifica la región CYSTM. Usando el método de la invención, la eliminación 6-bp se crea preferiblemente en aquellos nucleótidos de la región CYSTM del gen que codifica el quinto y sexto aminoácidos del extremo C-terminal.

La presente invención también se refiere a plantas mutantes que muestran resistencia a un factor biótico o abiótico, los genomas de los cuales se modifican para contener una eliminación 6-bp en el segmento que codifica la región CYSTM de uno o más genes homólogos al gen Xcv-1 de tipo silvestre (SEC ID NO:41) o su secuencia de ADNc (SEC ID NO:91).

Otro objeto de la presente invención es un método para generar una planta transgénica resistente a factores bióticos o abióticos mediante transformación, que comprende los pasos de: a) transformar las células de una planta sensible por medio de uno o más genes homólogos al gen xcv-1 de la invención en una forma que asegura su expresión funcional, b) inactivar uno o más genes resistentes homólogos al gen Xcv-1 de tipo silvestre, o el ARNm o uno de sus productos proteicos, en las células transformantes sensibles obtenidas en el paso a); y c) regenerar la planta de los transformantes y seleccionar los individuos resistentes.

Otro objeto de la invención es un método basado en la edición genómica, que comprende un paso de crear la eliminación 6-bp deseada en el gen homólogo de tipo silvestre usando ZFN, TALEN o CRISPR/Cas nucleasas específicas para la secuencia del gen Xcv-1 de tipo silvestre.

Aún otro objeto de la invención es un método basado en la edición genómica, en donde las ZFN y TALEN nucleasa proteínas que reconocen las secuencias de ADN homologas y específicas para el gen Xcv-1 se introducen en las células hospederas derivadas de la plana utilizando bacteria que tiene el sistema de secreción de tipo tres pero no causan enfermedades (bacteria no patogénica) (ver, por ejemplo, WO/2005/085417).

Aún otro objeto de la presente invención es una planta y su progenie resistente a factores bióticos o abióticos, que puede generarse por los métodos de la invención y lleva una eliminación de dos aminoácidos en la región CYSTM de una o más de sus proteínas de transmembrana en comparación con la proteína de tipo silvestre. Preferiblemente, la planta es una planta de tomate (Solanum lycopersium) , en la cual la resistencia recesiva a Xanthomonas euvesicatoria se ha creado.

Además, la invención se refiere a un método para generar una planta resistente mediante la combinación (apilamiento) de al me nos dos genes resistentes frente al mismo patógeno (por ejemplo, Xanthomonas sp.). Por consiguiente, la presente invención se refiere a una planta de tomate que contiene más de un gen resistente que confiere resistencia frente a Xanthomonas euvesicatoria que se genera mediante uno de los procedimientos descritos en la invención en los cuales el gen resistente se basa en la creación de la eliminación 6 bp deseada en un gen homólogo a xcv-1 y el otro gen o genes resistentes incluyen, pero no se limitan a por ejemplo Bs2, Bs2, Bs3, Bs4, bs5, bs6 o sus combinaciones.

La presente invención también se refiere a una planta de arroz que contiene más de un gen resistente que confiere resistencia frente a Xanthomonas oryzae pv. oryzae que se genera mediante uno de los procedimientos descritos en la invención en donde tal planta de arroz lleva en combinación otro gen o genes resistentes frente a Xanthomonas oryzae pv. oryzae que incluyen pero no se limitan a por ejemplo, a los genes Xa-4 + xa-5 + Xa-7 + xa-13 + Xa-21.

La presente invención también se refiere a una planta cítrica que contiene más de un gen resistente que confiere resistencia frente a Xanthomonas citri pv. citri , Xanthomonas axonopodis pv. citri que se genera mediante uno de los procedimientos descritos en la invención en donde la planta cítrica lleva en combinación otro gen o genes resistentes frente a las cepas Xanthomonas citri, Xanthomonas axonopodis .

Además, la invención se refiere anticuerpos frente a proteínas de la invención, que son específicas a la región CYSTM mutante de la proteína y se unen a la proteína mutante resistente pero no a la proteína de tipo silvestre, y son útiles como sondas en métodos in vitro para determinar si la planta lleva tales proteínas mutantes resistentes o no.

La presente invención también se refiere a sondas genéticas, que son específicas para la región mutante del gen xcv-1 y o sus homólogos, y son útiles para la identificación de los genes resistentes en un método in vitro .

Breve Descripción de las Figuras Figura 1: El contigo xcv físicamente cubre el gen xcv-1 con un traslape de los clones BAC. Esquema de los clones BAC identificados y traslapados (líneas horizontales). La numeración de los clones BAC se indica arriba de las líneas. Los dos extremos de los clones BAC se indican por "-40" y "op", respectivamente. El marcador inicial se indica con una flecha.

CaCY (sus cebadores: CaCY F1 (SEC ID NO:l), CaCY R1 (SEC ID NO:2). Marcadores de cada término BAC: BAC 279 op F1 (SEC ID NO:3), BAC 279 op R1 (SEC ID NO:4), BAC 279 (SEC ID N0:S), BAC 279 (SEC ID N0:6), BAC 1248 op F1 (SEC ID N0:7), BAC 1248 op R1 (SEC ID NO:8), BAC 1248 -40 F1 (SEC ID NO:9), BAC 1248 -40 R1 (SEC ID NO:10), BAC 1191 -40 F1 (SEC ID NO:ll), BAC1191 -40 R1 (SEC ID NO:12), BAC 1191 op F1 (SEC ID NO:13), BAC 1191 op R1 (SEC ID NO:14)# BAC 877 -40 F1 (SEC ID NO:15), BAC 877 -40 R1 (SEC ID NO:16), BAC 632 op F1 (SEC ID NO:17), BAC 632 op R1 (SEC ID NO:18), BAC 632 -40 F1 (SEC ID NO:19), BAC 632 -40 R1 (SEC ID NO:20), BAC 66 op F1 (SEC ID NO:21), BAC 66 op R1 (SEC ID NO:22), BAC 66 -40 F1 (SEC ID NO:23), BAC 66 -40 R1 (SEC ID NO:24), BAC 50 op F1 (SEC ID NO:25), BAC 50 op R1 (SEC ID NO:26), BAG 50 -40 F1 (SEC ID NO:27), BAC 50 -40 R1 (SEC ID NO:28), BAC 472 -40 F1 (SEC ID NO:29), BAC 472 -40 R1 (SEC ID N030:), BAC op F1 (SEC ID NO:31), BAC op R1 (SEC ID NO:32).

Figura 2: Curva de hidrofobicidad de la proteína Xcv-1.

La parte de arriba de la línea marcada con "0" es la parte de la proteína que presumiblemente se localiza en la membrana. TM = transmembrana, DAS: algoritmo "Superficie de Alineación Densa".

Figura 3: El punto de ataque (línea media) del ARNm objetivo (genes SlXcvlAl / SlXcvlB) , la secuencia de aminoácido deducible de éste (línea superior), y la secuencia designada 21 -bp SIXel-ARNmi (línea inferior).

Figura 4: Autoradiograma "Northern" de la hibridación de ARN de SIXel-ARNmi. Northern blot de la maduración de SlXel-ARNmis de varias longitudes (21, 22 y 24 bp) se híbrido en una sonda marcada con alfa-32ATP que codifica SIXel-ARNmi. Muestras: 1. = Muestra de ARN preparada de una planta de control (transformada). 2-3= Muestra de ARN preparada de una planta que contiene el constructo de expresión SlXell-ARNmi, M = marcador de peso molecular de ARNpequeño (20 bp, 21 bp, 30 bp).

Figuras 5A-5B. Secuencias objetivo TALEN, ZFN y CRISPR y RVD específicos para los genes SlXcv-lA y SlXcv-lB . Figura 5A. Porción de la región CYSTM de los genes SlXcv-lA y SlXcv-lB. Las líneas verticales y los números seriales arriba de las secuencias indican las posiciones de los nucleótidos de acuerdo con SEC ID NO:49 y SEC ID NO:51. Las secuencias de aminoácido de las proteínas SlXcv-lA y SlXcv-1 B se muestran debajo de las secuencias de ADN bicatenarias. Las dos leucinas faltantes de las proteínas mutantes (SlXcv-lA y SlXcv-lB) están subrayadas. Los aminoácidos se indican por los códigos de una letra internacionalmente aceptados. El * indica el codón de detención. Las secuencias ob etico a ser reconocidas por los pares de TALEN-L y TALEN-R nucleasa se indican por cabezas de flecha que apuntan hacia la derecha e izquierda arriba de las secuencias objetivo y por las líneas debajo de las secuencias objetivo, y las secuencias objetivo a ser reconocidas por los pares de ZFN-L y ZFN-R nucleasa se indican por puntas de flecha que apuntan hacia la derecha e izquierda debajo de las secuencias objetivos y por líneas punteadas debajo de las secuencias objetivo. Las flechas están en la dirección 51>3'. Las secuencias a ser reconocidas por el complejo CRISPR/Cas se indican con letras con fondo gris y en negrillas. Los seis nucleótidos presentes en la estructura su superior del ADN en los genes mutantes {SlXcv-lA, SlXcv-lB, SlXcv-lA y SlXcv-lA) están subrayados. Figura 5B. Dobletes de aminoácido (RVD) de las proteínas SlXcv-lAB TALEN-L, SiXcv-1A TALEN-R1 y SlXcv- IB TALEN-R2. Los números arriba de los dobletes de aminoácido de la proteína SlXcv-lAB TALEN-L son los números de serie de los RVD.

Figura 6. Mapa funcional de los vectores que contiene los pares TALEN específicos para los genes SlXcv-lA y SlXcv-1B . Abreviaturas: 35S per = promotor 35S, TAL-N' = secuencia del extremo N-terminal del efector TAL, TAL-C = secuencia del extremo C-terminal del efector TAL, NLS = Señal de Localización Nuclear, SlXcv-1A_TAL-R, SlXcv-1AB_TAL-L = secuencias de repetición que contienen 17 RVD específicos para el gen SlXcv- 1A, SlXcv-1B_TAL-R, SlXcv-1AB_TAL-L = secuencias de repetición que contienen 17 RVD específicos para el gen SIXcv-lB gene, N = Nogalina sintasa poliA, pA = 35S poliA, RB = secuencia del borde derechos de t-ADN, LB = secuencia del borde izquierdo de t-ADN, HYG R = gen resistente a higromicina, KAN R = gen resistente a kanamicina, B = BamHI, S = Sacl, las flechas (- >) indican la dirección de la transcripción .

Figuras 7A-7C. Posibles variantes de los genes SlXcv-lA y SlXcv- IB en plantas tratadas con TALEN. Figura 7 A. Derivados de los genes SlXcv-lA y SIXcv-lB en Variante 1. Figura 7B. Derivado del gen SIXcv-lB en Variante 2. Figura 7C. Derivado del gen SlXcv-lA en Variante 3.

Descripción Detallada de la Invención Definiciones Como se utiliza en la presente, el término "resistente a factores bióticos o abióticos" significa que la planta es resistente a varios factores bióticos tales como bacterias, hongos y virus patogénicos para la plana, o factores abióticos tales como estrés salino, estrés de sequía, etc.

Como se utiliza en la presente, el término "resistencia recesiva a Xanthomonas sp." significa que la planta es resistente a al menos una especie Xanthomonas incluyendo, pero no limitándose a, Xanthomonas euvesicatoria, Xanthomonas gardneri, Xanthomonas perforans , Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xanthomonas citri pv. citri , Xanthomonas axonopodis pv. citri, Xanthomonas campestris pv. mu sacearum. En una modalidad preferida de la invención, la planta es resistente a al menos Xanthomonas euvesicatoria . En algunas modalidades de la invención, la planta es resistente a dos, tres, cuatro o más especies Xanthomonas y preferiblemente, una de las especies es Xanthomonas euvesicatoria .

Como se utiliza en la presente, el término "planta" significa un organismo capaz de fotosintetizarse, las partes de la cual, por ejemplo, raíz, tallo, hojas, flor, fruto, etc., la progenie de la cual después de la reproducción sexual, por ejemplo, la generación de Fl, F2, F3 etc., después del cruce o auto-polinización, y la progenie después de la reproducción vegetativa, por ejemplo, clonación de las cortezas de raíz o cortezas de tallo, injerto, germinación, micro-propagación, etc.

Como se utiliza en la presente, el término "gen residente" significa genes de existencia natural en organismos vivos no modificados por humanos.

Como se utiliza en la presente una "proteína anclada a la cola" (proteína TA) se refiere a la porción NH2-terminal de una proteína (dominio) que está anclada a la membrana de fosfolípido doble a través de una sola porción hidrófoba localizada cerca de su término COOH, como se describe por Borgese N. et al . (J. Cell Biol.161: 1013-1019, 2003).

Como se utiliza en la presente, el término "transmembrana" (TM abreviado) significa una porción proteica hidrófoba que abarca la membrana de fosfolípido doble.

Como se utiliza en la presente, el término "transmembrana proteína" (proteína TM) significa una proteína que comprende un dominio proteico de transmembrana.

Como se utiliza en la presente, el término " proteína CYSTM " significa una proteína TA que tiene una región TM rica en cisteína cerca del término COOH (región CYSTM) en el sentido descrito por Venancio T.M.y Aravind L. (Bioinformatics 26:149-152, 2010).

Como se utiliza en la presente, el término "región CYSTM" con relación a las proteínas significa un segmento de proteína TM rico en cisteína en el sentido descrito por Venancio T.M. y Aravind L. (Bioinformatics 26:149-152, 2010).

Como se utiliza en la presente, el término "homólogo" se refiere a la situación en donde las secuencias de ácido nucleico o proteina son similares porque tienen un origen de evolución común.

Como se utiliza en la presente, el término "proteínas homologas a la proteína Xcv de tipo silvestre" se refiere a proteínas CYSTM en el sentido descrito por Venancio T.M. y Aravind L. (Bioinformatics 26:149-152, 2010 Como se utiliza en la presente, el término "proteínas homologas a la proteína xcv-1 mutante" significa variantes de proteína CYSTM en donde la región CYSTM contiene una eliminación de 2 aminoácidos comparada con su proteína de tipo silvestre y que provee resistencia.

Como se utiliza en la presente, el término "genes homólogos al gen Xcv-1 gene" significa genes variantes o su secuencia de ADNc sin intrón(s) que codifican las "proteínas homólogos a la proteína Xcv-1 " anteriores.

Como se utiliza en la presente, el término "genes homólogos al gen xcv-1" significa genes variantes o su secuencia de ADNc sin intrón(s) que codifican las "proteínas homólogos a la proteína xcv-1" anterior.

Los fragmentos y variantes de los polinucleótidos proteínas descritos codificados por lo tanto también abarcados por la presente invención. Por "fragmento" se prevé una porción del polinucleótido o una porción de la secuencia de aminoácidos y por lo tanto la proteína codificada en consecuencia. Los fragmentos de polinucleótidos que comprenden secuencias de codificación pueden codificar fragmentos proteicos que retienen la actividad biológica de la proteína de longitud completa o nativa y por lo tanto retienen la habilidad para iniciar en una planta una respuesta hipersensible en la presencia de una proteína efectora de un patógeno de planta. Alternativamente, los fragmentos de un polinucleótido que son útiles como sondas de hibridación generalmente no codifican proteínas que retienen la actividad biológica o no retienen la actividad promotora. De esta forma, los fragmentos de la secuencia de nucleótidos pueden estar en el intervalo de al menos aproximadamente 20 nucleótidos, aproximadamente 50 nucleótidos, aproximadamente 100 nucleótidos, y hasta el polinucleótido de longitud completa de la invención.

Los polinucleótidos que son fragmentos de un polinucleótido nativo de la presente invención comprenden al menos 16, 20, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 2000, 2500, 3000, o 3500 nucleótidos contiguos, o hasta el número de nucleótidos presentes en un polinucleótido de longitud completa descrito en la presente (por ejemplo, 3859 nucleótidos para SEC ID NOS: 79, 80 y 81, respectivamente).

"Variantes" se prevé que signifiquen secuencias sustancialmente similares. Para los polinucleótidos, una variante comprende un polinucleótido con eliminaciones (es decir, truncamientos) en el extremo 5' y/o 3'; eliminación y/o adición de uno o más nucleótidos en uno o más sitios internos en el polinucleótido nativo; y/o sustitución de uno o más nucleótidos en uno o más sitios en el polinucleótido nativo. Como se utiliza en la presente, un polinucleótido o polipéptido "nativo" comprende una secuencia de nucleótidos o secuencia de aminoácidos de existencia natural, respectivamente. Para polinucleótidos, las variantes conservadoras incluyen aquellas secuencias que, debido a la degeneración del código genético, codifican la secuencia de aminoácidos de uno de los polinucleótidos de la invención. Las variantes alélicas de existencia natural tales como las que se pueden identificar con el uso de téenicas de biología molecular bien conocidas, como, por ejemplo, con reacción de cadena de polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) y técnicas de hibridación como se detalla más adelante. Los polinucleótidos variantes también incluyen polinucleótidos sintéticamente derivados, tales como aquellos generados, por ejemplo, mediante el uso de mutagénesis dirigida al sitio pero que aún codifican un polinucleótido de la invención o pueden usarse en la reducción del nivel de Xcv- 1 o una proteína homóloga a Xcv-1 en una planta por los métodos descritos en la presente. Los polinucleótidos variantes además incluyen polinucleótidos homólogos aislados de otras especies. Generalmente, las variantes de un polinucleótido particular de la invención (por ejemplo, SEC ID NO:37 o 39 o 41 o 49 o 51 o 59 O 66 o 69 o 72 o 73 O 74 O 75 O 76 O 77 o 78 o 79 O 80 o 81 o 86 o 87 o 88 o 89 o 90 o 92), tendrán al menos aproximadamente 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más identidad de secuencia a la del polinucleótido particular como se determina por los programas y parámetros de alineación de secuencias como se describe en cualquier lugar en la presente.

Las variantes de un polinucleótido particular de la invención (es decir, el polinucleótido de referencia) también se pueden evaluar mediante la comparación del porcentaje de identidad de secuencia entre el polipéptido codificado por un polinucleótido variante y el polipéptido codificado por el polinucleótido de referencia. De esta forma, por ejemplo, un polinucleótido que codifica un polipéptido con un porcentaje de identidad de secuencia dado con el polipéptido d SEC ID NO: 38 o 40 o 42 o 50 o 52 o 60 o 67 se describe. El porcentaje de identidad de secuencia entre cualquiera de dos polipéptidos puede calcularse utilizando programas y parámetros de alineación de secuencia descritos en cualquier lugar en la presente. Cuando un par dado de polinucleótidos de la invención se evalúa por la comparación con el porcentaje de identidad de secuencia compartido por los dos polipéptidos que codifican, el porcentaje de identidad de secuencia entre los dos polipéptidos codificados es al menos aproximadamente 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia.

Proteína "variante" pretende significar una proteína derivada de la proteína nativa por la eliminación (denominada truncamiento) de uno o más aminoácidos en el extremo N-terminal y/o C-terminal de la proteína nativa; eliminación y/o adición de uno o más aminoácidos en uno o más sitios internos en la proteína nativa; o sustitución de uno o más aminoácidos en uno o más sitios en la proteína nativa. Tales variantes pueden resultar de, por ejemplo, polimorfismo genético o de manipulación humana. Tales variantes también incluyen proteínas homologas en otras especies. Las variantes biológicamente activas de una proteína de la presente invención tendrán al menos aproximadamente 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la proteína nativa como se determina por programas y parámetros de alineación de secuencia descritos en cualquier lugar en la presente. Tales variantes biológicamente activas incluyen, por ejemplo, las proteínas de tipo silvestre Xcv-1 y homologas así como sus versiones mutantes (por ejemplo, xcv-D que confieren a una planta resistencia a por lo menos una especie patogénica de Xanthomonas a la planta. Una variante biológicamente activa de una proteína de la invención puede diferir de esa proteína en tan pocos como 1-15 residuos de aminoácido, tan pocos como 1-10, tales como 6-10, tan pocos como 5, tan pocos como 4, 3, 2, o aún 1 residuo de aminoácido.

Los polinucleótidos de la invención pueden usarse para aislar secuencias correspondientes de otros organismos, particularmente otras plantas. En esta forma, los métodos tales como PCR, hibridación, y similares pueden usarse para identificar tales secuencias con base en su homología de secuencia con las secuencias determinadas en la presente. Las secuencias aisladas con base en su identidad de secuencia con la secuencias completas (es decir, de longitud completa) determinadas en la presente o con sus variantes y fragmentos están abarcadas por la presente invención. Tales secuencias incluyen secuencias que son ortólogas a las secuencias deseadas. "Ortólogos" se prevé significar genes derivados de un gen ancestral común y que se encuentran en diferentes especies como un resultado de la especiación. Los genes encontrados en diferentes especies se consideran ortólogos cuando sus secuencias de nucleótidos y/o sus secuencias proteicas codificadas comparten al menos 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o mayor identidad de secuencia. Las funciones de los ortólogos por lo general están altamente conservadas entre las especies.

Los siguientes términos se utilizan para describir las relaciones de secuencias entre dos o más polinucleótidos o polipéptidos: (a) "secuencia de referencia", (b) "ventana de comparación", (c) "identidad de secuencia", y, (d) "porcentaje de identidad de secuencia". (a) Como se utiliza en la presente, "secuencia de referencia" es una secuencia definida usada como la base para la comparación de secuencias.Una secuencia de referencia puede ser un subgrupo o la totalidad de una secuencia especificada; por ejemplo, como un segmento de un ADNc de longitud completa o secuencia génica, o el ADNc completo o secuencia génica. (b) Como se utiliza en la presente, "ventana de comparación" hace referencia a un segmento contiguo y especificado de una secuencia de polinucleótidos, en donde la secuencia de polinucleótidos en la ventana de comparación puede comprender adiciones o eliminaciones (es decir, gaps) comparada con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o eliminaciones) para la alineación óptima de los dos polinucleótidos. Generalmente, la ventana de comparación es de al menos 20 nucleótidos contiguos en longitud, y opcionalmente puede ser de 30, 40, 50, 100, o más larga. Los expertos en la téenica entienden que para evitar una alta similitud con una secuencia de referencia debido a la inclusión de huecos en la secuencia de polinucleótidos, típicamente se introduce una penalización de hueco y se sustrae del número de coincidencias.

Los métodos para alineación de secuencias para comparación son bien conocidos en la téenica. De esta forma, la determinación del porcentaje de identidad de secuencia entre cualquiera de dos secuencias puede lograrse usando un algoritmo matemático. Los ejemplos no limitante de tales algoritmos matemáticos son el algoritmo de Myers, E. W. y Miller, W. CABIOS 4:11-17, 1988; el algoritmo de alineación local de Smith, T.F. et al., Adv. Appl. Math.2:482, 1981; el algoritmo de alineación global de Needleman, S.B. y Wunsch, CD. J. Mol. Biol. 48:443-453, 1970; el método de búsqueda-para-alineación local de Pearson, W. R. y Lipman, D. J. Proc. Nati. Acad. Sci. 85:2444-2448, 1988; el algoritmo de Karlin, S. y Altschul, S. F. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 872264, 1990, modificado como en Karlin, S.y Altschul, S. F. Proc.Nati.Acad. Sci.USA 90:5873-5877, 1993.

Las implementaciones por computadora de estos algoritmos matemáticos pueden usarse para comparación de secuencias para determinar la identidad de secuencia. Tales implementaciones incluyen, pero no se limitan a: CLUSTAL en el programa PC/Gene (disponible de Intelligenetics, Mountain View, California); el programa ALIGN (Versión 2.0) y GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, y TFASTA en el Paquee de Software GCG Wisconsin Genetics, Versión 10 (disponible de Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, California, USA). Las alineaciones que utilizan estos programas pueden realizarse utilizando parámetros por omisión. El programa CLUSTAL se describe bien por Higgins et al ., Gene 73:237-244, 1988; Higgins, D. G. et al., CABIOS 5:151-153, 1989; Corpet, F. et al., Nucleic Acids Res.16:10881-90, 1988; Huang, X. et al., CABIOS 8:155-65, 1992; y Pearson, W. R. et al., Meth. Mol. Biol. 24:307-331, 1994. El programa ALIGN se basa en el algoritmo de Myers y Miller (1988) supra. Una tabla de residuo de ponderación PAM120, una penalización de longitud de hueco de 12, y una penalización de hueco de 4 puede usarse con el programa ALIGN cuando se comparan secuencias de aminoácido. Los programas BLAST de Altschul, S. F. et al., J. Mol. Biol.215:403, 1990 se basan en el algoritmo de Karlin, S. y Altschul, S. F. (1990) supra . Las búsquedas de secuencias BLAST pueden realizarse con el programa BLASTN, puntuación = 100, longitud de palabra = 12, para obtener secuencias de nucleótidos homologas a una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de la invención. Las búsquedas de secuencias BLAST pueden realizarse con el programa BLASTX, puntuación = 50, longitud de palabra = 3, para obtener secuencias de aminoácidos homologas a una proteína o polipéptido de la invención. Para obtener alineaciones con huecos para propósitos de comparación, puede usarse Gapped BLAST (en BLAST 2.0) como se describe en Altschul, S. F. et al . , Nucleic Acids Res.25:3389, 1997. Alternativamente, puede usarse PSI-BLAST (in BLAST 2.0) para llevar a cabo una búsqueda repetitiva que detecte relaciones distantes entre las moléculas. Ver Altschul, S. F. et al . , (1997) supra. Cuando se utiliza BLAST, Gapped BLAST, PSI-BLAST, los parámetros por omisión de los programas respectivos (por ejemplo, BLASTN para secuencias de nucleótidos, BLASTX para proteínas) pueden usarse. Ver www.ncbi.nlm.nih.gov. La alineación también puede hacerse manualmente por inspección.

A menos que se indique lo contrario, los valores de la secuencia/similitud provistos en la presente se refieren al valor obtenido usando GAP Versión 10 utilizando los siguientes parámetros: % de identidad y % de similitud para una secuencia de nucleótidos usando Peso GAP de 50 y Ponderación de Longitud de 3, y la matriz de puntuación nwsgapdna.cmp; % de identidad y % de similitud para una secuencia de aminoácidos utilizando Peso GAP de 8 y Ponderación de Longitud de 2, y la matriz de puntuación BLOSUM62; o cualquiera de sus programas equivalentes. Por "programa equivalente" se prevé cualquier programa de comparación de secuencia que, para cualquiera de dos secuencias en cuestión, genera una alineación que tiene coincidencias de residuos de nucleótido o aminoácido idénticas y un porcentaje de identidad de secuencia idéntico cuando se compara con la alineación correspondiente generada por GAP Versión 10.

GAP usa el algoritmo de Needleman, S. B. y Wunsch, C. D. J. Mol. Biol.48:443-453, 1970 para encontrar la alineación de dos secuencias completas que maximiza el número de coincidencias y minimiza el número de huecos. GAP considera todas las alineaciones posibles y posiciones de hueco y crea la alineación con el mayor número de bases coincidentes y los menores huecos. Esto permite la provisión de una penalización por creación de hueco y una penalización por extensión de hueco en unidades de bases coincidentes. GAP debe obtener beneficios del número de penalidades por creación de huecos de coincidencias para cada hueco que inserta. Si una penalización por extensión de huecos mayor de cero se selecciona, GAP debe, además, obtener un beneficio por cada hueco insertado de la longitud de los tiempos de hueco de la penalización de extensión de hueco. Los valores de penalización por creación de huecos por omisión y los valores de penalización por extensión de hueco en la Versión 10 del Paquete de Software GCG Wisconsin Genetics para las secuencias de proteína son 8 y 2, respectivamente. Para secuencias de nucleótidos el valor de la penalización por creación de hueco por omisión es 50 mientras la penalización por creación de hueco por omisión es 3. Las penalizaciones por creación de hueco y extensión de hueco pueden expresarse como un número entero seleccionado del grupo de números enteros que consiste de 0 a 200. De esta forma, por ejemplo, las penalizaciones por creación de hueco y extensión de hueco pueden ser 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 o mayor.

GAP presente un miembro de la familia de mejores alienaciones. Puede haber muchos miembros de esta familia, pero ningún otro miembro tiene una mejor calidad. GAP despliega cuatro números de mérito para alineaciones: Calidad, Proporción, Identidad y Similitud. La Calidad es la métrica maximizada con el fin de alinear las secuencias. La Proporción es la calidad dividida por el número de bases en el segmento más corto. El Porcentaje de Identidad es el porcentaje de los símbolos que realmente coinciden. El Porcentaje de Similitud es el porcentaje de los símbolos que son similares. Los Símbolos que están a través de los huecos se ignoran. Una similitud se califica cuando el valor de la matriz de puntuación para un par de símbolos es mayor que o igual a 0.50, el umbral de similitud. La matriz de puntuación utilizada en la Versión 10 del Paquete de Software GCG Wisconsin Genetics es BLOSUM62 (ver, Henikoff, S. y Henikoff, J. G. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:10915, 1989). (c) Como se utiliza en la presente, "identidad de secuencia" o "identidad" en el contexto de dos secuencias de polinucleótidos o polipéptidos hace referencia a los residuos en las dos secuencias que son iguales cuando se alinean para una correspondencia máxima sobre una ventana de comparación especificada. Cuando el porcentaje de identidad de secuencia se utiliza con referencia a proteínas, se reconoce que las posiciones del residuo que no son idénticas por lo general difieren por las sustituciones de aminoácido conservadoras, en donde los residuos de aminoácido están sustituidos por otros residuos de aminoácido con similares propiedades químicas (por ejemplo, carga o hidrofobicidad) y por lo tanto no cambian las propiedades funcionales de la molécula. Cuando las secuencias difieren en sustituciones conservadoras, el porcentaje de identidad de secuencia puede ajustarse ascendentemente para corregir la naturaleza conservadora de la sustitución. Las secuencias que difieren por tales sustituciones conservadoras se dice que tienen "similitud de secuencia" o "similitud". Los medios para hacer este ajuste son bien conocidos por el experto en la téenica. Típicamente estos involucran la puntuación de una sustitución conservadora como una incompatibilidad parcial en lugar de completa, por lo tanto aumentando el porcentaje de identidad de secuencia. De esta forma, por ejemplo, cuando a un aminoácido idéntico se le da una puntuación de 1 y a una sustitución con conservadora se le da una puntuación de cero, a una sustitución conservadora se le da una puntuación entre cero y 1. La puntuación de las sustituciones conservadoras se calcula, por ejemplo, como se implementa en el programa PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, California). (d) Como se utiliza en la presente, "porcentaje de identidad de secuencia" significa el valor determinado mediante la comparación de dos secuencias óptimamente alineadas sobre una ventana de comparación, en donde la porción de la secuencia de polinucleótidos en la ventana de comparación puede comprender adiciones o eliminaciones (es decir, huecos) como se compara con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o eliminaciones) para la alineación óptima de las dos secuencias. El porcentaje se calcula mediante la determinación del número de posiciones en las cuales la base de ácido nucleico o residuo de aminoácido idéntico aparecen en ambas secuencias para producir el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes por el número total de posiciones en la ventana de comparación, y multiplicando el resultado por 100 para producir el porcentaje de identidad de secuencia.

Como se utiliza en la presente, el término "región CYSTM" con relación a ácidos nucleicos (ADN, ARN) es un segmento de nucleótido que se extiende a 52 y 52 nucleótidos en ambas direcciones (51 y 3'), respectivamente, a partir del segundo nucleótido del codón de detención de los "genes homólogos al gen Xcv-1 " o "genes homólogos al gen xcv-1".

Como se utiliza en la presente, el término "la eliminación 6-bp deseada" significa una eliminación de 6 pares base en el segmento de ADN que codifica la región CYSTM de genes homólogos al gen Xcv-1 , que resultan en resistencia.

Como se utiliza en la presente, el término "6 nucleótidos a ser eliminados del gen de tipo silvestre y los nucleótidos circundantes" significa un segmento de nucleótido que se extiende a 52 y 52 nucleótidos en ambas direcciones a partir de la eliminación 6-bp creada en la región CYSTM. La eliminación 6-bp se crea en cualquier lugar en la región CYSTM del gen o en aquellos nucleótidos que codifican el quinto y sexto aminoácido del extremo C-terminal.

Como se utiliza en la presente, el término "Sistema de Secreción de Tipo Tres" (TTSS abreviado) es un sistema a través del cual la bacteria patogénica (por ejemplo, Xanthomonas sp., Pseudomonas sp., Erwinia sp., Ralstonia sp., Escheríchia sp., Yersinía sp., etc.) introduce moléculas efectoras a través del pelo específico TTSS en organismos hospederos eucariotas como se describe por Galan J.E. et al . (Nature 444:567-573, 2006).

Como se utiliza en la presente, el término "edición genómica" significa un método en el cual una nucleasa modificada o par de nucleasa modificada lleva a cabo rupturas bicatenarias (DSB, por sus siglas en inglés) en un segmento de ADN específico en donde un mecanismo de reparación de ADN referido como una Unión Terminal No Homologa (NHEJ, por sus siglas en inglés) crea eliminaciones o inserciones cortas como se describe por Gaj T. et al . (Trends Biotechnol.31:397-405, 2013).

Como se utiliza en la presente el término "Ruptura Bicatenaria" (DSB abreviado) significa que una secuencia de ADN se escinde por una nucleasa específica o un par de nucleasas en ambas estructuras de cadena de ADN como un par molecular de tijeras. Las nucleasas que llevan a cabo las rupturas bicatenarias del ADN incluyen, entre otras, ZFN, TALEN y CRISPR/Cas.

Como se utiliza en la presente, el término "Unión Terminal No Homologa" (NHEJ, por sus siglas en inglés) significa un método en el cual el mecanismo de reparación del ADN de las células une (liga) los dos extremos de ADN bicatenarios.

Como se utiliza en la presente, el término "ZFN" significa una nucleasa modificada artificial que reconoce secuencias de ADN y escinde ambas de sus estructuras de cadena (ver más adelante).

Como se utiliza en la presente, el término "TALEN" significa una nucleasa modificada artificial que reconocer secuencias de ADN y escinde ambas de sus estructuras de cadena (ver más adelante).

Como se utiliza en la presente, "CRISPR Cas" reconoce secuencias de ADN complementarias y escinde ambas de sus estructuras de cadena con la ayuda de ARNsg y Cas nucleasa (ver más adelante).

Como se utiliza en la presente, el término "una molécula de ácido nucleico artificial" es una molécula de ácido nucleico que no es de existencia natural.

Como se utiliza en la presente, el término "un gen" es una secuencia de nucleótidos que comprende el promotor, exón(es), intrón(es) además de las regiones sin traducir 5'- y 3'-.

Como se utiliza en la presente, el término "ADNc" es una secuencia de nucleótidos de la copia del ARNm de un gen.

Como se utiliza en la presente, el término "una nucleasa artificial" es una nucleasa modificada.

Como se utiliza en la presente, el término "nucleasas modificadas" son enzimas de restricción artificiales que pueden programarse para cortar una secuencia de ácido nucleico predeterminada.

The Dedo de Zinc Nucleasa (ZFN abreviado) es una proteína de fusión de la parte de la proteína de la endonucleasa de restricción Fokl responsable de la escisión del ADN y una proteína de dedo se zinc que reconoce secuencias genómicas designadas, específicas, y escinde los DNS bicaternarios en esas secuencias, por lo tanto produciendo extremos ADN libres (Urnov F.D. et al., Nat Rev Genet. 11:636-46, 2010; Carroll D., Genetics.188:773-82, 2011).

La Nucleasa Efectora de Tipo Activador de Transcripción (TALEN abreviado) es una proteína de fusión que consiste de la parte de la proteína de endonucleasa de restricción Fokl responsable del a escisión del ADN la parte de la proteína efectora de tipo activador de transcripción (TALE) responsables de la unión del ADN, y un segmento de aminoácido responsable de la transferencia dentro del núcleo (Señal de Localización Nuclear, NLS abreviado). La porción de unión del ADN de la proteína puede diseñarse para ser específica de la secuencia (Christian M. et al., Genetics 189:757-761, 2010; Mussolino C. et al., Nucleic Acids Res.39:9283-9293, 2011; Miller J.C. et al., Nat. Biotechnol.29:143-148, 2011; Cermak T. et al . , Nucí. Acids Res.39:e 82, 2011).

La nucleasa asociada con las Repeticiones Palindrómicas Cortas Regularmente Intercaladas Agrupadas /CRISPR (CRISPR/Cas abreviado) es un sistema de endonucleasa de ADN guiada por ARN (ARN guiado simple, ARNsg abreviado) que lleva a cabo las rupturas bicatenarias específicas de secuencia en un segmento de ADN homólogo al ARN designado. Es posible diseñar la especificidad de la secuencia (Cho S.W. et al., Nat. Biotechnol. 31:230-232, 2013; Cong L. et al., Science 339:819-823, 2013; Mali P. et al., Science 339:823-826, 2013; Feng Z. et al., Cell Research: 1-4, 2013).

Una ventaja de las téenicas anteriores es que los transgenes que contienen TALEN o ZFN o CRISPR Cas nucleasa pueden removerse por segregación genética, es decir, las plantas no transgénicas pueden generarse de éstos.

Las variantes mutantes de la región CYSTM de la proteína xcv-1 pueden diseñarse utilizando programas de computadora, y las características comunes de éstas incluyen su localización en el extremo C-terminal de la proteína, la presencia de la menos dos cisteínas generalmente seguido por un residuo de ácido aspártico (D), ácido glutámico (E) o asparagina (N), y se representan por las siguientes secuencias: CXXXXCCCCD, XXXXXCCCCD, CXXXXXCCCD, CXXXXCXCCD, CXXXXCCXCD, CXXXXCCCXD, XXXXXXCCCD, XXXXXCXCCD, CXXXXXXCCD, CXXXXCXCXD, CXXXXCCXXD, CXXXXCCCCE, XXXXXCCCCE, CXXXXXCCCE, CXXXXCXCCE, CXXXXCCXCE, CXXXXCCCXE, XXXXXXCCCE, XXXXXCXCCE, CXXXXXXCCE, CXXXXCXCXE, CXXXXCCXXE, CXXXXCCCCN, XXXXXCCCCN, CXXXXXCCCN, CXXXXCXCCN, CXXXXCCXCN, CXXXXCCCXN, XXXXXXCCCN, XXXXXCXCCN, CXXXXXXCCN, CXXXXCXCXN, CXXXXCCXXN en donde D = ácido aspártico, E = ácido glutámico, N = asparagina, X = un residuo de aminoácido compatible con el carácter de transmembrana, principalmente un residuo de aminoácido hidrófobo o no polar, por ejemplo, glicina (G), cisteína (C), leucina (L), isoleucina (I), alanina (A), triptófano (W), treonina (T), metionina (M), fenilalanina (F) o valina (V).

El gen xcv-1 que provee resistencia recesiva se aisló del pimiento utilizando Capsicum annuum Acceso a Gene Bank No. PI163192. El aislamiento del gen xcv-1 permite la designación de los marcadores genéticos utilizando la información de secuencia del gen y la región ADN enlazada, y la facilitación del cultivo de pimiento tradicional utilizando estos marcadores para la Selección Asistida por Marcador, así como la generación del pimiento resistente y otras variedades de planta con base en la información de secuencia del gen por método bioteenológicos que activan la modificación o la transformación de las células con un gen homólogo xcv-1 antes de aniquilar el gen residente .

De acuerdo con la invención, el gen xcv-1 se aisló de Capsicum annuum utilizando el siguiente método. 1. Mapeo genético del gen xcv-1 en el pimiento 1.1. Generación de la población de segregación F2.

Para el mapeo, se creó una nueva población por la cruza de interespecies ( Capsicum annuum x Capsicum annuum) seguido por la auto-polinización de las plantas Fl. Para el cruce, Feherozon (FO), una variedad cultivada húngara comercialmente disponible sensible a Xanthomonas se utilizó como el progenitor padre y una planta resistente a Xe, Acceso a Gene Bank No. PI163192 (TI), se utilizó como el progenitor madre. Después del cruce, se sembraron 45 semillas de la fruta de una de las plantas madre y el carácter híbrido de las plantas resultantes se confirmó por los apropiados marcadores de ADN moleculares. Después, los 45 individuos Fl se cultivaron, y las semillas F12 de la auto-polinización se recolectaron. Los individuos F2 de las auto-polinización de los Individuos Fl después se usaron para el mapeo genético del gen xcv-1. El objetivo fue cultivar tantos individuos F2 como fuera posible para permitir la identificación de individuos que llevan eventos de recombinación tan cercanos al gen xcv-1 como fuera posible, y por lo tanto para estrechar la región genética y al mismo tiempo la física que comprende el gen xcv-1. Hasta la identificación del gen xcv-1, se generaron, cultivaron y sometieron a la clasificación fenotípica de xcv-1 más de 3000 individuos F2. 1.2. Prueba de resistencia a Xanthomonas La clasificación fenotípica de los individuos que se segregaron como sensibles o resistentes a Xanthomonas es indispensable e importancia claves para la localización del gen xcv-1 en el mapa genético. Una clasificación fenotípica incorrecta hace imposible o extremadamente difícil el mapeo genético. Como un resultado de las pruebas biológicas, finalmente 765 y 2354 plantas F2 probaron ser resistentes y sensible, respectivamente. 1.3. Mapeo del locus xcv-1 Sobre las bases de genotipos disponibles y fenotipos xcv-1 , el locus del gen xcv-1 se mapeó en el tercer cromosoma del pimiento. Para esto, la secuencias disponibles en bancos y marcadores de genes usados por otros se aplicaron al mapeo del gen xcv-1. Los pares de cebadores específicos se diseñaron, y el los pares de iniciadores se utilizaron para la amplificación PCR; la ubicación del mapa de los marcadores se determinó sobre las bases del genotipo de los marcadores utilizando los datos de polimorfismo obtenidos después de la electroforesis. El mapeo identificó un marcador genético (CaCY), que mapeó la distancia más corta del locus xcv-1. El marcador CaCY puede clasificarse genotípicamente utilizando los cebadores Pr_CaCYFl (SEC ID NO:l) y Pr_CaCYRl (SEC ID NO:2). 1.4. Tránsito del cromosoma El marcador identificado, CaCY, que está cercanamente enlazado al gen xcv-1 (localizado a una distancia de 0.22 centimorgan de xcv-1) permitió la iniciación del tránsito del cromosoma. En el primer paso, el clon BAC de pimiento primario (Clon No. 279) se identificó con la ayuda del marcador CaCY utilizando PCR múltiple. Las secuencias terminales del clon BAC primario (No.279) se determinaron y los pares de cebadores específicos de éstos se diseñaron. Con la ayuda de los pares de cebadores específicos, los clones BAC se traslapan el Clon BAC No.279 se identificaron (Clones No.632 y 1248), y otro grupo de cebadores específicos se diseñó para sus secuencias terminales y clones traslapados adicionales se identificaron, después se aislaron clones adicionales en una forma similar. Utilizando los pares de cebadores específicos diseñados para los Clones BAC No.66, 1191, 50, 877 y 472, los extremos BAC se volvieron a mapear para el mapa genético por lo tanto verificando la dirección correcta del extremo -40 del Clon BAC No. 50, se manejó el pase a una recombinación hacia el gen xcv-1, por consiguiente, la construcción del contigo solamente se continuó en esta dirección. Del Clon BAC No.50, el contigo se extendió por otro Clon BAC traslapado en la forma anterior, y después de retro-mapear el marcador 472_op, podrían identificarse individuos recombinantes adicionales que delimitan el contigo que comprende el gen xcv-1. 1.5. Secuenciación de los clones BAC que se traslapan en la región xcv-1 : subclonación, secuenciación de los subclones secuenciación Sólida.

En el siguiente paso, se secuenciaron dos clones BAC que traslapan la región xcv-1 (No.50 y 472). La secuenciación del ADN se llevó a cabo en dos formas: por subclonación y secuenciación de los subclones de ambos lados, y por el método de secuenciación Sólida de la nueva generación desarrollado por ABI. 2. Identificación del gen xcv-1 2.1. Determinación del contenido del gen de los clones BAC.

Los datos de la secuencia de ADN resultante se manejaron y ensamblaron en cóntigos dando segmentos traslapados por varios programas de computadora. Este "ensamble" no produce una secuencia de longitud completa de BAC sino más de diez cóntigos, que se cerraron por la denominada téenica de tránsito del cebador. Las secuencias de los clones BAC parciales resultantes (No.50 y 472) se determinaron.

El contenido del gen de los dos clones BAC se determinó por los programas BLAST (principalmente los programas blastn, blastx y blastp) de NCBI (http://ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) y DFCI (http://compbio.dfci.harvard.edu/tgi/planta.html). Sobre las bases del contenido del gen y la información del orden del gen, se prepararon marcadores polimorfos utilizando pares de cebadores específicos, y después los genes se retro-mapearon. Hasta ahora, un total de 13 genes que codifican a la proteína se identificaron en los dos clones BAC. Sobre las bases de los datos del mapeo, se encontró que el gen xcv-1 se localiza entre los marcadores Pr6 y Pr4b como un solo gen que codifica más de 50 aminoácidos. Las secuencias cebadoras de los marcadores son como sigue: Pr6Fl: SEC ID NO:33, Pr6Rl : SEC ID NO:34, Pr4bFl: SEC ID NO:35 y Pr4bRl: SEC ID NO:36.

Después, la secuencia de ADN de ambos, el gen xcv-1 y su contraparte de tipo silvestre (gen Xcv-D se determinaron en ambos progenitores utilizando pares de cebadores específicos; ver SEC ID NO:37 y SEC ID NO:41, respectivamente.

De esta forma, la presente invención se refiere al gen xcv-1 aislado por el método anterior, que tiene la secuencia de ADN presentada en SEC ID NO:37. La secuencia de ADNc del gen xcv-1 - que es la secuencia de nucleótidos de SEC ID NO:90-se generó, y también está cubierta por el alcance de la invención.

El gen xcv-1 codifica una proteína CYSTM, la proteína xcv-1 , la secuencia de aminoácidos de la cual es la de SEC ID NO:38, en donde la región de transmembrana rica en cisteína (región CYSTM) de la proteína lleva un doble eliminación Leu en las ubicaciones correspondientes a las posiciones 87 y 88 de la proteína Xcv-1 de tipo silvestre de SEC ID NO:42. Sin embargo, la invención también abarca todas aquellas secuencias proteicas que son homólogos de proteínas de la proteína xcv-1 y representan variantes de proteína que contienen al menos 53%, preferiblemente de 60% a 73%, más preferiblemente de 80% a 93% aminoácidos idénticos con respecto a los últimos 13 aminoácidos del extremo C-terminal de la proteína xcv-1.

Además, la presente invención se refiere a vectores, preferiblemente vectores de expresión, que comprenden los genes aislados y preparados de acuerdo con la invención en una forma funcional. Los vectores preferidos útiles para el propósito de la invención incluyen vectores binarios de Agrobacterium turne faciens, tal como la familia de vectores pCAMBIA (http://www.cambia.org/daisy/cambia/585).

Además, la presente invención se refiere a ZFN, TALEN y CRISPR/Cas nucleasas específicas para la secuencia de interés del gen Xcv-1 , que se utiliza para generar la eliminación 6-bp o para inactivar (por aniquilación) los genes homólogos al ADN Xcv-1 de tipo silvestre.

Además, la presente invención se refiere a células hospederas en donde los vectores de la invención se introducen, por ejemplo, mediante transformación o por téenicas de edición genómica (ZFN, TALEN y CRISPR Cas nucleasa), y por medio de lo cual la eliminación 6-bp deseada se genera en los genes homólogos Xcv-1.

Las células hospederas preferidas para el propósito de la invención incluyen las especies Solanaceae, Oryzae, Citroidieae, etc.

La presente invención también se refiere a un método de transformación para generar una planta transgénica resistente a un factor biótico o abiótico, que comprende los pasos de: a) identificar uno o más genes homólogos al gen Xcv-1 de tipo silvestre (SEC ID N0:41) en tal planta, preparar in vitro las secuencias genómicas y de ADNc del gen identificado en una forma de ADN, generar in vitro una mutación 6-bp correspondiente a la eliminación de dos aminoácidos en los segmentos que codifican la región CYSTM de uno o más de los genes identificados y transformar las células de una planta sensible con uno o más genes mutantes de esta forma obtenidos en una forma que asegura su expresión funcional, b) inactivar el uno o más genes residentes identificados en el paso a) o el ARNm o una de sus proteínas en las células de planta transformantes, y c) regenerar la planta de los transíormantes y seleccionar los individuos resistentes.

En el paso a) del método anterior, los métodos de modificación genética bien conocidos por los expertos en la téenica se utilizaron para identificar el (los) gen(es), para prepararlos en una forma de ADN, para generar las mutaciones y para transformar las células de planta.

En el paso b) del método anterior, los genes resistentes homólogos al gen Xcv-1 se inactivaron (silenciaron). La inactivación (silenciación) de los genes residentes es necesaria porque la función de la proteína de tipo silvestre (pi. Xcv-D es dominante sobre la función de la proteína mutante (por ejemplo, xcv-1) , es decir, la anterior función es recesiva. Los métodos bien conocidos también están disponibles para la inactivación del gen, es decir, para eliminar la función del gen. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a los siguientes: inhibir la expresión de los productos proteicos de los genes residentes utilizando mutagénesis natural, química o se inserción, ARNmi (ARNmi artificial), iARN (ARN de interferencia) u otras téenicas; inactivar el (los) gen(es) residente(s) utilizando métodos de eliminación de nucleasa generando mutantes aniquilados. Preferiblemente, la técnicas TALEN, ZFN o CRISPR/Cas nucleasa antes descritas se utilizan. Mediante la expresión del gen de un anticuerpo monoclonal específico para la proteína, se puede inactivar Xcv-1 , o las proteínas homologas.

Es importante notar que la técnica de ARNmi se ha utilizado exitosamente para crear la resistencia a los virus en plantas (Niu et al . , Nat. Biotechnol.24:1420-1428, 2006), sin embargo, la resistencia a la bacteria patogénica tal como Xe no se ha creado en plantas con la téenica ARNmi aún.

En el paso b) de una modalidad preferida del método de la invención, los productos ARNm del (de los) gen(s) residente(s) se inactivan funcionalmente (silencian) por la técnica de ARNmi como sigue: bl) preparar un constructo de gen ARNmi para la secuencia de ribonucleótidos complementaria a la región CYSTM del ARNm de uno o más genes homólogos al gen Xcv-1 de tipo silvestre e identificar en las células de planta transformantes obtenidos en el paso a); b2) clonar el constructo obtenido en el paso bl) en un vector apropiado; b3) transformar las células de planta transformantes con el vector obtenido en el paso b2) en una forma que asegura la expresión funcional del ARNmi y la inactivación de los productos ARNm del (de los) gen(es) CYSTM de tipo silvestre); y c) regenerar los transformantes obtenidos en el paso b3) y seleccionar la planta resistente.

Las nucleasas de la invención (nucleasas modificadas) se utilizan para dos funciones de edición genómica en la presente invención: por un lado, para la inactivación de los genes residentes en las células de planta transformantes; por el otro lado, para crear la eliminación 6-bp deseada en los genes homólogos al gen Xcv-1 en el genoma de una célula de planta sensible. Las dos funciones también se pueden combinar, por ejemplo, en el tomate, en donde la eliminación 6-bp deseada aparece en uno de los dos genes homólogos de tipo silvestre ( SlXcv-lA, SEC ID NO:49 y SlXcv-lB, SEC ID N0:51), y el gen se inactiva después de una eliminación o inserción en el otro.

En una forma obvia para el experto en la téenica, las secuencias objetivos de las nucleasas anteriores se seleccionan en una forma que asegura que cubren la secuencia 6-bp a ser eliminada con el fin de prevenir el reconocimiento y escisión del segmento de ADN que ya comprende la eliminación, y que la eliminación 6-bp deseada puede crearse.

En otra modalidad preferida del método de la invención, el (los) gen(es) residente(s) se inactivan por un método de eliminación de nucleasa (edición genómica) como sigue: bl) preparar constructos de ADN que codifican proteínas TALEN-L y TALEN-R o ZFN-L y ZFN-R específicas para la(s) secuencia(s) génica(s) que codifican la región CYSTM de uno o más genes homólogos al gen Xcv-1 de tipo silvestre e identificados en las células de planta transformantes obtenidos en el paso a), más específicamente aquellos específicos para los segmentos de ADN correspondientes a los 6 nucleótidos a ser eliminados y los nucleótidos circundantes como la secuencia objetivo en una forma que asegura que los 6 nucleótidos a ser eliminados del gen de tipo silvestre se coloque en la parte media del segmento separador de los pares TALEN-L más TALEN-R o ZFN-L más ZFN-R, o mediante la preparación de un constructo CRISPR/Cas que comprende la secuencia génica ARNsg específica para los 6 nucleótidos a ser eliminados del gen de tipo silvestre y los nucleótidos circundantes como secuencia objetivo; b2) clonación de los constructos obtenidos en el paso bl) en un vector apropiado; b3) transformar las células de planta con un vector que comprende los constructos obtenidos en el paso bl) en una forma que asegura la expresión funcional de los transgenes; c) identificar las mutaciones de eliminación o inserción aniquiladas en los genes homólogos al gen Xcv-1 de tipo silvestre (SEC ID N0:41); d) seleccionar las células de planta que contienen las mutaciones identificados en el paso c); e) regenerar la células de planta identificadas en el paso d) y seleccionar las plantas resistentes, y f) remover los transgenes que comprenden los constructos TALEN o ZFN o los constructos CRISPR/Cas que contienen el gen de la proteína sgRNS por segregación genética.

La presente invención también se refiere a un método para generar una planta mutante que muestra resistencia abiótica o biótica utilizando un método de edición genómica, que comprende los pasos de: a) identificar uno o más genes homólogos al gen Xcv-1 de tipo silvestre (SEC ID NO:41) en una planta sensible; b) preparar constructos de ADN que codifican proteínas TALEN-L y TALEN-R o ZFN-L y ZFN-R específicas para la secuencia génica que codifica la región CYSTM de uno o más genes homólogos al gen Xcv-1 de tipo silvestre e identificados en el paso a), más específicamente aquellos específicos para los 6 nucleótidos a ser eliminados y los nucleótidos circundantes como la secuencia objetivo en una forma que asegura que los 6 nucleótidos a ser eliminados del gen de tipo silvestre se coloquen en la parte media del segmento separador de los pares TALEN-L más TALEN-R o ZFN-L más ZFN-R, o mediante la preparación de un constructo CRISPR/Cas que comprende la secuencia génica ARNsg específica para los 6 nucleótidos a ser eliminados del gen de tipo silvestre y los nucleótidos circundantes como la secuencia objetivo; c) clonación del constructo obtenido en el paso b) en un vector apropiado; d) transformación de las células de planta sensibles con un vector que comprende el constructo obtenido en el paso b) en una forma que asegura la expresión funcional de los transgenes y la generación de la eliminación 6-bp en la región CYSTM por la nucleasa; e) identificar los transformantes que llevan las mutaciones que muestran la eliminación 6-bp en la región CYSTM del genes homólogos al gen Xcv-1 de tipo silvestre (SEC ID NO:41); f) regenerar la células de planta que tienen la mutación identificada en el paso e) y seleccionar las plantas resistentes; y g)remover los transgenes que comprenden los constructos TALEN o ZFN o constructos CRISPR/Cas que contienen el gen de la proteína sgRNS por segregación genética.

Además, las planas mutantes que muestran resistencia biótica o abiótica de acuerdo con la invención pueden generarse mediante la introducción se proteínas TALEN o ZFN específicas para los región CYSTM en la planta utilizando bacterias no patogénicas, tal método, que comprende los pasos de: a) identificar uno o más genes homólogos al gen Xcv-l de tipo silvestre (SEC ID NO:41) en una planta sensible; b) preparar constructos de ADN que codifican proteínas TALEN-L más TALEN-R o ZFN-L más ZFN-R específicas para el segmento de ADN que codifica la región CYSTM del gen identificado en el paso a) en una forma que asegura que los 6 nucleótidos a ser eliminados del gen de tipo silvestre se coloquen en la parte media del segmento separador de los pares TALEN-L más TALEN-R o ZFN-L más ZFN-R; c) clonación del constructos obtenido en el paso b) en un vector bacteriano apropiado e introduciéndolos en las bacterias no patogénicas con el sistema de secreción de tipo tres activo utilizando tal vector; d) infectar la planta sensible con la bacteria obtenida en el paso c); y e) regenerar una planta resistente del tejido de la planta infectada.

En los métodos de la invención, no solamente las secuencias genómicas sino también las secuencias de ADNc de los genes homólogos al gen de tipo silvestre Xcv-l o el gen mutante xcv-l pueden usarse con resultados idénticos debido a que la misma proteína se expresa de ambos.

Usando el método de la invención, la resistencia puede crearse en planas que son sensibles a las especies Xanthomonas , tales como Xanthomonas euvesicatoria, Xanthomonas perforans , Xanthomonas gardneri , Xanthomonas vesicatoria pv. oryzae, y otras especies Xanthomonas . Una de tales plantas preferidas es el tomate.

Uno de los patógenos más peligrosos del tomate es Xanthomonas euvesicatoria ( Xe ) , que también causa daños severos en el pimiento. A diferencia del pimiento, el tomate no ha desarrollado resistencia natural, lo que aseguraría una protección suficiente. De esta forma, la producción del tomate aún está muy amenazada por infección Xe (Hutton S.F. et al., Theor. Appl . Genet. 121:1275-87, 2010). El gen xcv-1 identificado en el pimiento también puede proveer resistencia a la infección Xe en el tomate asegurando la introducción y expresión funcional de genes de tomate mutantes SlXcv-lA y/o SlXcv-lB (SEC ID NO:59 y/o SEC ID NO:66), que son homólogos al gen xcv-1 , en el genoma del tomate seguido por la inactivación de los genes residentes dominantes SlXcv-lA y SlXcv-lB (SEC ID NO:49 y SEC ID NO:51) homólogos al gen Xcv-1 de tipo silvestre, es decir, mediante la generación de sus variantes no funcionales.

La planta de tomate resistente a Xanthomonas euvesicatoria puede generarse utilizando los siguientes métodos de la invención: - transformar las células de la planta de tomate con los genes mutantes SlXcv-lA y/o SlXcv-lB que llevan la eliminación Leu doble, seguido por la inhibición de la función de los genes SlXcv-lA y/o SlXcv-lB utilizando la téenica ARNmi; o - transformar las células de la planta de tomate con los genes mutantes SlXcv-lA y/o SlXcv-lB que llevan la eliminación Leu doble, seguido por la inactivación de los genes residentes SlXcv-lA y/o SL Xcv-1B localizados ahí utilizando la téenica de ZFN nucleasa o TALEN nucleasa o CRISPR/Cas nucleasa; o - transformar las células de la planta de tomate con los genes mutantes SlXcv-lA y/o SlXcv-lB que llevan la eliminación Leu doble; seguido por la identificación de las mutaciones que inactivan el gen SlXcv-lA y/o SlXcv-lB utilizando la técnica TILLING o una similar después de o sin mutagénesis,- o - crear la eliminación 6-bp deseada en los genes SlXcv-lA y/o SlXcv-lB en el genoma de la planta de tomate sensible utilizando un método de edición genómica a base de nucleasa, que provee resistencia.

De esta forma, un objeto de la presente invención es un método para generar una planta de tomate resistente a Xanthomonas euvesicatoria, que comprende los pasos de: a) identificar los genes residentes SlXcv-lA y SlXcv-lB (SEC ID NO:49 y 51 , respectivamente), que son homólogos al gen Xcv-1 de tipo silvestre en la planta de tomate b) preparar in vitro las secuencias genómicas y de ADNc del gen identificadas en la forma de un ADN; c) crear in vitro la eliminación 6-bp en las posiciones correspondientes a las eliminaciones en el gen xcv-1 por lo tanto generando constructos que llevan los genes mutantes SlXcv-lA y SlXcv-lB (SEC ID NO:59 y 66, respectivamente) o sus secuencias de ADNc (SEC ID NO:88 y 89, respectivamente); d) clonación del constructos obtenidos en el paso c) en un vector apropiado y transformar las células de la planta de tomate con el vector resultante en una forma que asegura la expresión funcional de los transgenes; e) preparar un constructo de gen ARNmi para silenciar los genes de tipo silvestre SlXcv-lA y SlXcv-lB (SEC ID NO:49 y/o SEC ID NO:51); f) clonación del constructo obtenido en el paso e) en un vector apropiado; g) transformar la células de planta generadas en el paso d) con el vector obtenido en el paso f) en una forma que asegura la expresión del ARNmi y la inactivación de los productos ARNm de los genes CYSTM de tipo silvestre SlXcv-lA y SlXcv-IB; y h) regenerar los transformantes obtenidos en el paso g) y seleccionar la planta resistente.

En una modalidad preferida el constructo del gen amiRNS es específico para las secuencias de ribonucléotidos complementarias correspondientes a la región CYSTM de los genes SlXcv-lA y/o SlXcv-lB de tipo silvestre (SEC ID NO:49 y/o SEC ID NO:51) más específicamente un constructo de gen ARNmi específico para los 6 nucleótidos a ser eliminados y los nucleótidos circundantes (SlXell -ARNmi, SEC ID NO: 74). En una modalidad preferida el constructo del gen ARNmi comprende la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención.

La presente invención también se refiere a otro método para generar una planta de tomate resistente a Xanthomonas euvesicatoria, que comprende los pasos de: repetir los pasos a) a d) anteriores; e) preparar proteínas TALEN-L (SEC ID NO:78) y TALEN-R1 (SEC ID NO:79) y TALEN-R2 (SEC ID NO:80) específicas para las secuencias objetivo (SEC ID NO:75, 76, 77) específicas para los región CYSTM del gen de tipo silvestre SlXcv-lA y SlXcv-lB gene, o constructos de ADN que codifican las proteínas ZFN-L y ZFN-R específicas para SEC ID NO: 86 y 87 en una forma que asegura que los 6 nucleótidos a ser eliminados del gen de tipo silvestre se coloquen en la parte media del segmento separador de los pares TALEN-L más TALEN-R o ZFN-L más ZFN-R, o por la preparación de un constructo CRISPR Cas que comprende la secuencia génica ARNsg específica para los 6 nucleótidos a ser eliminados del gen de tipo silvestre y los nucleótidos circundantes como la secuencia objetivo (SEC ID NO: 81); f) clonación del constructo obtenido en el paso e) en un vector apropiado; g) transformación de las células de planta generadas en el paso d) con el vector obtenido en el paso f) en una forma que asegura la expresión funcional de los transgenes de TALEN o ZFN o CRISPR/Cas nucleasa y la inactivación funcional de los genes SlXcv-lA y SlXcv-lB a través de éstos; h) identificar la mutaciones de aniquilación por eliminación o inserción en las células transformantes; i) regenerar la células de planta que tienen la mutación identificada en el paso h) y seleccionar las plantas resistentes; y f) remover los transgenes de nucleasa TALEN-L más TALEN-R o ZFN-L más ZFN-R o CRISPR/Cas por segregación genética.

La presente invención también se refiere a aún otro método para generar una planta de tomate resistente a Xanthomonas euvesicatoria, que comprende los pasos de: a) identificar los genes residentes SIXcv-lA (SEC ID NO:49) y SIXcv-lB (SEC ID NO:51), que son homólogos al gen Xcv-1 de tipo silvestre en la planta de tomate b) preparar proteínas TALEN-L (SEC ID NO:78) y TALEN-R1 (SEC ID NO:79) y TALEN-R2 (SEC ID NO:80) específicas para las secuencias objetivo (SEC ID NO:75, 76, 77) específicas para los región CYSTM del gen de tipo silvestre SIXcv-lA y SIXcv-lB, o constructos de ADN que codifican las proteínas ZFN-L y ZFN-R específicas para SEC ID NO: 86 y 87 en una forma que asegura que los 6 nucleótidos a ser eliminados del gen de tipo silvestre se coloquen en la parte media del segmento separador de los pares TALEN-L más TALEN-R o ZFN-L más ZFN-R, o mediante la preparación de un constructo CRISPR/Cas que comprende la secuencia génica ARNsg específica para los 6 nucleótidos a ser eliminados del gen de tipo silvestre y los nucleótidos circundantes como la secuencia objetivo (SEC ID NO: 81); c) clonación del constructo obtenido en el paso b) en un vector apropiado; d) transformar las células de la planta de tomate con el vector obtenido en el paso c) en una forma que asegura la expresión funcional de los transgenes TALEN o ZFN o CRISPR/Cas nucleasa anteriores y la creación de la eliminación 6-bp en la región CYSTM de los genes SIXcv-lA y SIXcv-lB a través de los mismos; e) identificar los transformantes que llevan la eliminación 6-bp en la región CYSTM de los genes SlXcv-lA y SlXcv-lB de tipo silvestre; f) regenerar los transformantes que tienen la mutación identificada en el paso e) y seleccionar la planta resistente; y g) remover los transgenes de nucleasa TALEN-L más TALEN-R o ZFN-L más ZFN-R o CRISPR/Cas por segregación genética.

El desarrollo de cultivares resistentes ha sido la estrategia más efectiva, económica y ambientalmente amistosa para controlar enfermedades epidémicas de plantas cultivadas. De las muchas posibilidades, la resistencia piramidal de mucho más durable que la resistencia que se controla por un solo gen R dominante (usualmente causando HR), porque las nuevas especies de patógenos podrían fácilmente evolucionar para superar o escapar de la resistencia, en consecuencia los rasgos resistentes de la planta dejarían de funcionar. El cultivo tradicional combinado con la selección asistida con marcadores a base de marcadores moleculares ha hecho posible identificar y colocar en pirámide los genes valiosos de importancia agronómica en resistencia. Además de esta estrategia, los métodos transgénicos sirven para además posibilitar los genes resistentes piramidales en cultivares de planta. Como se menciona anteriormente, el tomate, un pariente cercano del pimiento es altamente susceptible a Xe . Para luchar contra este patógeno y establecer el tomate resistente a Xe, las plantas de tomate transgénicas que expresan el gen resistente a Bs2 del pimiento se construyeron recientemente (Horvath et al., PLoS One.;7(8):e42036, 2012). En ensayos de campo de múltiples años replicados bajo condiciones de cultivo de tipo comercial, demostraron una mejor resistencia a los puntos bacterianos causados por Xe. Tomando en cuenta el impacto benéfico de la configuración génica piramidal, el tomate que contiene Bs2 antes mencionado puede ser un material de partida para producir derivados resistentes dobles mediante la expresión del gen SlXcv-lA y/o SlXcv-lB que llevan la eliminación 6 bp benéfica como se describe en esta invención. En esta forma pueden cultivarse cultivares altamente resistentes y resistentes a Xe durables del tomate para producción comercial. Un experto en la téenica reconocería que la resistencia basada en la expresión del gen SlXcv-lA y/o SlXcv-lB puede combinarse no solamente con Bs2, sino con otros genes también, que pueden conferir resistencia a Xe en el tomate incluyendo, pero no limitándose a Bsl, Bs3, Bs4, bs5, bs6.

Además del pimiento y el tomate, varias otras plantas se ven severamente afectadas por las especies Xanthomonas que causan enfermedades en el arroz, papa, cítricos, banana, uvas, etc. (Dangle et al. Science 341:746, 2013). El derivado de la eliminación 6 bp deseada también puede generarse en el (los) gen(s) homólogo(s) de estas planas y puede combinarse con otro tipo de genes resistentes frente a Xanthomonas. Por consiguiente, se pueden generar plantas de arroz resistentes contra Xanthomonas oryzae, o plantas cítricas resistentes frente a Xanthomonas citri pv. citri o Xanthomonas axonopodis pv. citri o plantas de bananas resistentes frente a Xanthomonas campestris pv. musacearum.

Además, el método de la invención puede usarse para crear resistencia a un factor abiótico o biótico diferente del de Xanthomonas sp. en las plantas.

La presente invención además se refiere a plantas mutantes resistentes a un factor biótico o abiótico, que lleva una eliminación de dos aminoácidos en su región CYSTM en comparación con la planta de tipo silvestre. Preferiblemente, la planta mutante es una planta de pimiento ( Capsicum annuum) , una planta de tomate ( Solanum lycopersicum) , una planta de la familia de las Solanáceas, por ejemplo, papa, berenjena, etc., un cítrico (Citroideae) , por ejemplo, naranja ( Citrus aurantium) , mandarina (Citrus reticulata) , limón ( Citrus x medica L) , toronja ( Citrus x paradisi) , pomelo (Citrus maxima o granáis) etc., una planta de la familia de las Brasicáceas, por ejemplo, col (Brassica olerácea convar. capitata var. alba) , rábano (Raphanus sativus) , coliflor (Brassica olerácea convar. botrytis var. botrytis) , nabo (Brassica napus) etc., una planta monocotiledónea { Monocotyledonae ) , por ejemplo, arroz (Oryzae sp. ) , maíz (Zea mays) , trigo ( Triticum sp.), centeno (Secale sp.), cebada ( Hordeum vulgare) , mijo (Panicum sp.), etc., una planta de las familias de las Fabáceas o Leguminosas, por ejemplo, alfalfa ( Medicago sp.), frijol ( Phaseolus sp.), chícharo ( Pisum sp.), soja ( Glycine sp.), haba caballar ( Faba sp.), lupino ( Lupinus sp.), trébol ( Trifolium sp.), cacahuate ( Arachis sp.), arveja ( Vicia sp.), lathyrus ( Lathyrus sp.), lenteja ( Lens sp.), garbanzo (Cicer sp.), poroto chino ( Vigna sp.), gandul ( Cajanus cajan) etc., una planta de la familia de las Cucurbitáceas, por ejemplo, calabaza ( Cucúrbita sp.), pepino ( Cucumis sp.), melones ( Citrullus sp.) etc., una planta de la familia de las Rosáceas, por ejemplo, manzana ( Malus sp.), pera ( Pyrus communis) , membrillo ( Cydonia oblonga) , cereza ( Prunus subg. Cerasus) , cereza agria (Prunus cerasus), ciruela ( Prunus domestica subsp. domestica), albaricoque (Prunus armeniaca), durazno (Prunus pérsica) , uva (Vitis vinifera) , etc., en donde la resistencia ha sido creada.

Más preferiblemente, la planta mutante es una planta de tomate mutante (Solanum lycopersicum) resistente a Xe.

Otro objeto de la presente invención son las semillas y los productos de las planas mutantes generados por esta invención, incluyendo, pero no limitándose a frutos, jugo, pasta, etc., preferiblemente las semillas y productos de la planta de tomate mutante y su progenie.

Además, podemos producir anticuerpos contra la proteína xcv-1 de la invención, que pueden usarse como sondas en métodos in vitro realizados en las líneas de células derivadas de la planta con el fin de robar si una planta dada es resistente a Xe o no. Los métodos para producir anticuerpos y tales téenicas son bien conocidos por los expertos en la técnica.

La presente invención además se refiere a sondas génicas, que son específicas para los genes xcv-1 o sus genes homólogos y la hibridación con éstos bajo condiciones estrictas.

Otros objetos de la presente invención son pares de cebadores, que son específicos para los genes xcv-1 o sus genes homólogos, especialmente para SlXcv-lA y/o SlXcv-lB, y pueden usarse para clasificar la constitución genética que lleva la eliminación 6 bp incluyendo, pero no limitándose a la selección asistida por marcador.

La invención se describe con mayor detalle a través de los siguientes ejemplos sin limitar el alcance de la invención.

Ejemplo 1 Cruces y análisis genéticos de la progenie F2 de la planta xcv Para la generación de Individuos Fl, C. annuum var. , comercialmente disponible, se utilizó Feherozon sensible a Xanthomonas euvesicatoria (Xe) como el progenitor paterno (marcado como F0), y Capsicum annuum var. Tl/1 que lleva resistencia a Xe -un individuo de Acceso a Gene Bank No. PI163192 - se utilizó como el progenitor materno (Tl/1). Después del cruce, 45 semillas Fl de la planta materna se sembraron y las plantas F2 se cultivaron de éstas. Cuando las plantas llegaron a la edad de 8 brotes de hojas, se utilizó una prueba de infección con Xanthomonas euvesicatoria para determinar la sensibilidad de las plantas a Xe. Finalmente, 20 individuos F2 - 8 resistentes y 12 individuos sensibles (ver Tabla 1) - se seleccionaron para los experimentos de mapeo generales; por el otro lado, más de 3000 individuos F2 se utilizaron para el mapeo fino del gen resistente a Xe ( xcv-1 ) .

Tabla 1: Fenotipos de 20 individuos F2 de la población segregada.

Ejemplo 2 Identificación de los marcadores enlazados al gen xcv-1 de la planta mutante Tl/1 La identificación por mapeo genético de los marcadores moleculares cercanos al gen xcv mutado, es decir, aquellos enlazados a resistencia a Xcv, se llevó a cabo utilizando las 20 progenies F2 mencionadas en el Ejemplo 1. El ADN total de las hojas frescas se sometió a amplificación PCR utilizando cebadores específicos diseñados sobre las bases de secuencias de pimiento disponibles en bases de datos, y los fragmentos resultantes se sometieron a electroforesis en geles de agarosa o en los denominados geles de acrilamida SSCP. Con el fin de visualizar los fragmentos de ADN, los geles de agarosa y geles de acrilamida se tiñeron utilizando bromuro de etidio y plata, respectivamente. El enlace de los marcadores que mostró polimorfismo en los geles de agarosa o SSCP se determinó por mapeo de color (Kiss et al . , Acta Biológica Hungarica 49:47-64, 1998) con respecto al fenotipo xcv/Xcv después de verificar el estado homocigoto o heterocigoto. Como un resultado del mapeo sistemático, un solo marcador designado como CaCY mostró una distancia de 0.22 centimorgan.

Los identificadores de los cebadores del marcador CaCY (Pr_CACY_Fl y Pr_CACY_Rl) son SEC ID N0:1 y SEC ID NO:2, respectivamente.

Debido a que los otros marcadores mapeados estuvieron ya sea desenlazados al gen xcv-1 o se localizaron a distancias genéticas mucho mayores, por consiguiente se inició el denominado tránsito del cromosoma utilizando el marcador CaCY físicamente del gen xcv-1.

Ejemplo 3 Aislamiento de los clones BAC que se traslapan con la mutación xcv-1, construcción del contigo Un clon BAC primario (No.279) se aisló utilizando el marcador molecular que muestra el enlace más fuente a la mutación xcv-l , es decir, CaCY. Los clones BAC primarios y otros se aislaron utilizando PCR múltiple de una colección BAC que comprende 380,000 BAC, que se prepararon de una planta de pimiento resistente a Xcv ( Capsicum annuum) planta y asegura una cobertura de 22 veces el genoma del pimiento (Bukovinszki et al . , VII. Hungarian Congress on Genetics, Abstract Book, p. 91, 2007).

Ambos extremos del Clon BAC No.279 se secuenciaron y se identificaron dos clones adicionales BAC utilizando pares de cebadores específicos para estas secuencias: Clon BAC No.1248 utilizando los cebadores Pr_279 op F1 (SEC ID NO:3) y Pr_279 op R1 (SEC ID NO:4), y Clon BAC No.632 utilizando el par de cebadores Pr_279 -40 F1 (SEC ID NO:5) más Pr_279 -40 R1 (SEC ID NO:6).

Los pares de cebadores específicos a las secuencias terminales de BAC No.1248 se usaron para identificar el Clon BAC No.1191: el par consistió de los cebadores Pr_1248 op F1 (SEC ID NO:7) y P 248 op R1 (SEC ID NO:8), y como control, el Clon BAC No.279 se reidentificó utilizando el par de cebadores P 248 -40 F1 (SEC ID N0:9) más P 248 -40 R1 (SEC ID NO:10).

Los pares de cebadores específicos para las secuencias terminales de BAC No.1191 se usaron para identificar el Clon BAC No.877: el par consistió de los cebadores Pr_1191 -40 F1 (SEC ID NO:11) y PM 191 -40 R1 (SEC ID NO.-12), y como control, el Clon BAC No. 1248 se reidentificó utilizando el par de cebadores P 191 op F1 (SEC ID NO:13) más P 191 op R1 (SEC ID NO:14).

El par de cebadores Pr_877 -40 F1 (SEC ID NO:15) más Pr_877 -40 R1 (SEC ID NO:16) se diseñó para la secuencia -40 terminal de BAC No. 877, y se utilizó para el retro-mapeo genético.

Los pares de cebadores específicos para las secuencias terminales de BAC No. 632 se usaron para identificar el Clon BAC No. 66: el par consistió de los cebadores Pr_632 -40 F1 (SEC ID NO:17) y Pr_632 -40 R1 (SEC ID NO:18), y como control, el Clon BAC No. 279 se reidentificó utilizando el par de cebadores Pr_632 op F1 (SEC ID NO:19) más Pr_632 op R1 (SEC ID NO:20).

Los pares de cebadores específicos para las secuencias terminales de BAC No.66 se usaron para identificar el Clon BAC No.50: el par consistió de los cebadores Pr_66 -40 F1 (SEC ID NO:21) y Pr_66 -40 R1 (SEC ID NO:22), y como control, el Clon BAC No.632 se reidentificó utilizando el par de cebadores Pr_66 op F1 (SEC ID NO:23) más Pr_66 op R1 (SEC ID NO:24).

Los pares de cebadores específicos para las secuencias terminales de BAC No.50 se usaron para identificar el Clon BAC No.472: el par consistió de los cebadores Pr_50 op F1 (SEC ID NO:25) y Pr_50 op R1 (SEC ID NO:26), y como control, el Clon BAC No.66 se reidentificó utilizando el par de cebadores Pr_50 -40 F1 (SEC ID NO:27) más Pr_50 -40 R1 (SEC ID NO:28).

Por el otro lado, el par de cebadores designado para las secuencias terminales de BAC No. 472 se utilizó para re identificar el Clon BAC No.66 como control: el par consistió de los cebadores Pr_472 -40 F1 (SEC ID NO:29) y Pr_472 -40 R1 (SEC ID NO:30), y el par de cebadores Pr_472 op F1 (SEC ID NO:31) más Pr_472 op R1 (SEC ID NO:32) se utilizó para el retro-mapeo genético.

De esta forma, al clasificar los Clones BAC en grupos de cóntigos, se pudo diseñar el denominado contigo xcv (Figura 1) característico de la región xcv, que físicamente cubre el gen xcv-1.

Ejemplo 4 Determinación más precisa de la ubicación del gen xcv-1 dentro del contigo mediante la identificación de los sitios de recombinación más cercanos a la mutación.

La determinación de la ubicación del gen xcv-1 más precisamente dentro del contigo xcv es de suma importancia debido a que entre más cerca esté el marcador molecular dado, menor es el número de clones BAC a secuenciar, y esto resulta en menos genes candidato. La determinación más precisa de la ubicación del gen xcv-1 dentro de contigo xcv se llevó a cabo como sigue. Por el otro lado, el número de individuos en la población segregada F2 aumentó para permitir el análisis de tantos eventos de recombinación como fuera posible. Finalmente, se incluyeron un total de 3119 individuos en los análisis genéticos. Por el otro lado, los marcadores moleculares se desarrollaron utilizando secuencias terminales de los BAC traslapados, y se retro-mapearon utilizando la población que segrega el gen xcv-1. Sobre las bases de los resultados, se concluyó que la posición del gen xcv-1 está entre el extremo -40 de BAC No.50 y el extremo abierto BAC No.472 separado por tres y cuatro eventos de recombinación, respectivamente.

Ejemplo 5 Subclonación del Clon BAC No.50 y secuenciación de los subclones La subclonación del Clon BAC No.50 se llevó a cabo después de la escisión por enzimas de restricción BamHI, EcoRI y HindIII. Después de la purificación, los subclones se digirieron utilizando BamHI, HindIII y EcoRI, y los fragmentos resultantes se clonaron en vectores digeridos con BamHI, HindIII y EcoRI y transformaron en células Escherichia coli cells. Las secuencias de los amplificados fluorescentemente marcados de los clones recombinantes se determinaron utilizando las secuencias automatizadas ABI 373 y ABI 377 (Perkin Elmer Applied Biosystems; 850 Lincoln Centre Drive Foster City, CA94404 USA).

La secuencia de ADN del Clon BAC No. 50 también se determinó utilizando teenologías de secuenciación de la segunda generación (SOLID y Iontorrent, Applied Biosystems), así como utilizando la técnica del "tránsito del cebador" hasta que se obtuvo la secuencia completa.

Ejemplo 6 Mapeo fino de la región xcv-1 Los datos de secuencia parciales se almacenaron en una computadora y el análisis se inició determinando su orden correcto sobre las bases de sus secuencias de traslape. En una forma obvia para los expertos en la técnica, en la alineación y el análisis de secuencia, la secuencias terminales traslapadas de los clones BAC y sus subclones generados por digestión de restricción proporcionan ayuda para el ensamble de las secuencias y para la determinación de las ubicaciones relativas de los subclones generados por digestión aleatoria y de restricción de los clones BAC. Después del ensamble de las secuencias parciales, fue exitosa la compilación de la secuencia del Clon BAC No. 50, que después se utilizó para desarrollar marcadores genéticos a varias distancias del término BAC. Cuando estos marcadores genéticos se retro-mapearon en la población mapeada, se reveló que el gen xcv-1 se localiza entre los marcadores a base de PCR, Pr6 y Pr4b. Las secuencias cebadoras de los marcadores Pr6 y Pr4b son como sigue: Pr6Fl: SEC ID NO:33, Pr6Rl: SEC ID NO:34, y Pr4bFl: SEC ID NO:35, Pr4bRl: SEC ID NO:36.

Ejemplo 7 Análisis de secuencia de la región Xcvl y evaluación detallada del gen xcv-1 Después de obtener la secuencia de nucleótidos del segmento de ADN entre los marcadores Pr4b y Pr6, las bases de datos de NCBI (National Center for Biotechnology Information http://www.nebí.nlm.nih.gov/BLAST/), DFCI http://compbio.dfci.harvard.edu/tgi/planta.html), Medicago HapMap (http://www.medicagohapmap.org/7genome) y Arabidopsis (http://www.arabidopsis.org) se investigaron exitosamente para genes homólogos. Las secuencias se evaluaron con una visión de la homología entre las secuencias, y las características generales de las estructuras génicas [secuencias de consenso tales como codones de inicio y detención; secuencias de consenso típicas de marcos de lectura abiertos (ORF, por sus siglas en inglés), exones e intrones tales como la GT-AG, el punto de divergencia, etc.]. El análisis de secuencia se facilita por el hecho de que solamente un gen que codifica una proteína de más de 50 aminoácidos - que es el gen xcv-1 mismo - está presente entre dos marcadores genéticos localizados en el lado derecho e izquierdo, respectivamente, del gen xcv-1 responsable del fenotipo, que puede distinguirse por eventos de recombinación individuales. La The secuencia del segmento de ADN que comprende el gen xcv-1 está representada por la secuencia de nucleótidos de SEC ID NO:37.

Las bases de datos se investigaron exitosamente para secuencias de ADN similares al gen xcv-1, y se observó que las secuencias de ADNc homologas aparecen en las denominadas bases de datos EST (Etiquetas de Secuencia Expresadas) en el caso de C. annuum también. Estas secuencias son un resultado de la secuenciación aleatoria de los laboratorios en clones de ADNc clones de colecciones de ADNc de varios órganos, tejidos o células o grupos de células (raíz, tallo, hojas, frutos, flores, pistilos, estambres, polen, etc.) sin tener ninguna información con respecto a sus funciones. Por ejemplo, estos incluyen la secuencia TC17947 (SEC ID NO:39) de C. annuum encontrada en la base de datos DFCI (http://compbio.dfci.harvard.edu/tgi/planta.html), que se presenta en la forma del denominado TC (Consenso tentativo), es decir, el ADN del ARNm de un gen. La composición base de los Ts se edita por alineación de secuencias de ADNc de varias longitudes derivadas de un solo gen y determinando la secuencia de consenso. La proteína codificada por la secuencia TC17947 se muestra por la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:40. La mutación responsable de la resistencia a Xe puede identificarse mediante la investigación de las diferencias en la secuencia de nucleótidos de la región genómica (SEC ID NO:37) que comprende el gen xcv-1 de la planta mutante en comparación con las regiones homologas de la planta de pimiento sensible (SEC ID NO:41). Tales diferencias pueden encontrarse comparando la secuencia de nucleótidos de la región genómica (SEC ID NO:37) que comprende el gen xcv-1 con la secuencia genómica (SEC ID NO:41) secuencia de la planta de pimiento sensible (C. annuum var. Feherozon) . Después de la alineación de SEC ID NO:37 y SEC ID NO:41, se encontró que la secuencia de la planta resistente es más corta por 6 bp en un cierto lugar. Cuando la secuencia TC17947 (SEC ID NO:39) se alinea con la secuencia (SEC ID NO:37) de la planta resistente, entonces los sADNc pueden alinearse con la secuencia genómica en tres diferentes segmentos (estos son los exones) (la alineación de la secuencia genómica de un gen con su secuencia de ADNc permite la determinación de la ubicación exacta de los exones e intrones presentes en los genes). Estos tres segmentos se separan por dos intrones de la secuencia genómica (ver SEC ID NO:37). A pesar de que el primero y el segundo segmento de la secuencia TC17947 muestran 100% de identidad con la secuencia genómica, la secuencia ADNc secuencia del tercer segmento es más larga en 6 bases en la propia ubicación en donde las dos secuencias genómicas también muestran una diferencia de 6 bases. Debido a que una secuencia típica de un gen que codifica una proteína [segmento promotor putativo, 5' UTR, exones, intrones, 31-UTR, codón de inicio(ATG), codón de detención (TGA), límites de exón/intrón e intrón/exón conservados reconocibles sobre las bases de la denominada regla GT-AG y por el punto de divergencia, sitio Poli-A, etc.] que está presente en el segmento de ADN en cuestión, se asume que la variante proteica que lleva la eliminación base 6 en el tercer exón de la secuencia genómica es responsable de la resistencia. De esta forma, como una consecuencia de esta eliminación, la síntesis de la proteína es normal pero la proteína resultante es más corta en 2 aminoácidos (ver aminoácido sequences SEC ID NO:38 y SEC ID NO:42).

El primer codón putativo del gen Xcv-1 de tipo silvestre es el codón de inicio ATG que parte del nucleótido 917 del fragmento genómico, y el codón de detención es el codón de detención TAG que parte del nucleótido 2076. Las secuencias típicas de las regiones promotoras se localizan en la región promotora putativa en el extremo 5'- del gen. Además, un sitio poliA está presente en el extremo 3'- del gen.

La actividad - es decir, la transcripción - de los genes Xcv-1 y xcv-1 en las células también se confirmó por el hecho de que los ARNms correspondientes a las dos secuencias se detectaron: los segmentos de ARNm que carecen de la eliminación de base 6 y los segmentos de ARNm que contienen la eliminación de base 6 se identificaron de la planta sensible y de la planta resistente respectivamente, después de la secuenciación de ARNm de tipo Sólido.

La secuencia de aminoácidos de la proteína del gen Xcv-1 puede deducirse de la secuencia de ADNc pronosticada de Xcv-1 (ver características de SEC ID NO:41). La secuencia de aminoácidos más larga que contiene el marco de lectura abierto (ORF) deducida del ADNc de Xcv-1 ADNc se indica por SEC ID NO:42. La proteína Xcv-1 consiste de 92 aminoácidos. Esta proteína contiene porciones de secuencia características (por ejemplo, la región de transmembrana C-terminal), que puede determinarse utilizando características típicas acumuladas en los bancos de datos y métodos bioinformáticos (por ejemplo, los programas TMpred y MPEx). Como un resultado de los análisis bioinformáticos, puede concluirse que la parte intracelular de la molécula empieza con un extremo N-terminal seguido por una porción rica en GYPQ de 5 a 6 aminoácidos que contiene una secuencia de repetición (GYPPE-GYPKD-SYPPP-GYPQQ-GYPQQ-GYPQQ-GYPPQ-GYPPQ-YAPQY), y un segmento enlazador es acoplado a la porción C-terminal, que es una sección denominada de Anclaje de Cola (TA) que se extiende dentro de la membrana (aminoácidos 72 a 88). La región de transmembrana se termina por los aminoácidos con una carga negativa (ácido aspártico, ácido glutámico) o aminoácidos polares (asparagina). La región de transmembrana de la proteína Xcv-1 puede detectarse sobre las bases de la hidrofobicidad utilizando programas que predicen las regiones de transmembrana. Sin limitación, estas incluyen, por ejemplo, el programa de Predicción de Transmembrana "DAS" (http://www.sbc.su.se/~miklos/DAS/), y el software Tmpred http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html). La Figura 2 muestra la curva TM de la proteína Xcv-1 (SEC ID NO:42) pronosticada por el programa de Predicción de Transmembrana "DAS". La proteína Xcv-1 pertenece a la familia de proteínas CYSTM (Venancio T.M. y Aravind L. Bioinformatics 26:149-152, 2010).

La identificación de las secuencias de ADNc de varios tejidos soporta el hecho de que el gen Xcv-1 gen se expresas en diferentes especies de pimiento, y sus varios tejidos de raíz a la flor [ver que EST constituyen la secuencia TC17497 encontrada en el banco de datos DFCI (SEC ID NO:39); (http://compbio.dfci.harvard.edu/tgi/planta.html)].

En comparación con el gen de tipo silvestre, el producto proteico del gen xcv-1 es más corto en 2 aminoácidos en la región TM. No se encontraron secuencias que muestren 100% de identidad con la proteína xcv-1 en los bancos de datos. En consecuencia, se identificó una nueva proteína a la cual podría asignarse la resistencia a Xe sobre las bases de los datos y resultados experimentales.

Ejemplo 8 Localización Intracelular de los polipéptidos Xcv-1 y xcv- 1 Para determinar la localización intracelular de los polipéptidos Xcv-1 y xcv-1 , la secuencia de codificación de la Proteína Fluorescente Verde (GFP) (No. de acceso: AF234298, nucleótidos 2 a 757) se clona enfrente de los genes Xcv-1 y xcv-1, y se introduce en la Nicotiana bentamiana, una planta de la familia de las Solanáceas, a través de la transferencia del gen mediado por Agrobacterium turne faciens . La transformación preferiblemente se lleva a cabo en una forma que asegura una denominada expresión temporal (Martin K. et al . , Plant J.59:150-62, 2010), como un resultado de la cual los constructos GFP-Xcv-l/GFP-xcv-1 no se incorporan establemente dentro del genoma de la planta pero el transgen se expresa de un ADN en un estado extracromosómico. El experimento se llevó cabo como sigue: Primero, el gen estructural de GFP se clonó en un vector pGemT-Easy como sigue: la secuencia de codificación de GFP se amplificó utilizando el ADN del plásmido pCambial302 (www.cambia.org, Marker Gene Technologies, Inc. www.markergene.com) como plantilla, y SEC ID NO:43 y SEC ID NO:44 como los cebadores, y el producto PCR resultante se clonó en un vector pGemT-Easy. El plásmido resultante se designó 'pNcoGFPXba'. En el siguiente paso, las muestras de hojas se tomaron de plantas C. annuum var. Tl/l y C. annuum var. Feherozon en la etapa de 6 brotes de hojas, y un kit de aislamiento de ARN QIAGEN (RNeasy Mini Kit, http://www.qiagen.com) se utilizó para aislar ARN, y el Kit de Construcción de la colección de ADNc SMART™ (http://www.clontech.com) se utilizó para sintetizar ADNc bicatenario. El sADNc de Xcv-1 y xcv-1 se amplificó y clonó en la reacción PCR utilizando la preparación de ADNc resultante. Para amplificar el alelo Xcv-1 , el ADNc fro C. annuum var. Feherozon y los cebadores SEC ID NO:45 y SEC ID NO:46 se utilizaron para la amplificación. La reacción PCR se llevó a cabo como se describe en el Ejemplo 2. El fragmento resultante se clonó dentro de un plásmido pGemT-Easy. El plásmido resultante se designó 'pXcv-1 CaFo'. La clonación del alelo xcv-1 se realizó en una forma similar, excepto porque de utilizó el ADNc de C. annuum var. Tl/l y los cebadores representados por SEC ID NO:45 y SEC ID NO:46. El plásmido resultante se designó 'pxcv-l CaTl'. En la tercera fase, los plásmidos 'pXcv-lCaFo' y 'pxcv-lCaTl' se digirieron con las enzimas Xbal y Bcul, y se clonaron dentro de un plásmido 'pNcoGFPXba' digerido con Xbal y Bcul. Los plásmidos resultantes se designaron 1pGFP-Xcv-lCaFo' y 'pGFP-xcv-ICaTl1, respectivamente. En el último paso, los plásmidos 1pGFP-Xcv-lCaFo' y 'pGFP-xcv-ICaTl' se designaron con Salí, y el plásmido pCambia 1302 se digirió con BstEII y después las tres preparaciones se digirieron con Mung Bean Nuclease de acuerdo con las instrucciones del fabricante (New England Biolabs, Inc, www.neb.com). Las moléculas lineales romas 'pGFP-Xcv-lCaFo' y pCambia 1302, y 'pGFP-xcv-lCaTT y pCambia 1302 se mezclaron, y ambas preparaciones se digirieron con la enzima Ncol, ligaron y transformaron en células E. coli . Los transformantes se cultivaron en placas con kanamicina, en donde solamente los derivados pCambial302 se cultivaron pero no los derivados pGemT-Easy. Entre las colonias transformante, las que comprenden los productos de fusión GFP-Xcv-1 y GFP-xcv-1 se identificaron. Los dos productos se designaron "pCambia-GFP-Xcv-lCaFO" y 'pCambia-GFP-xcv-ICaTl1. Las secuencias de los dos productos de fusión se muestran en SEC ID NO: 47 y SEC ID NO:48, respectivamente.

Los plásmidos 'pCambia-GFP-Xcv-ICaFO' y los plásmidos 'pCambia-GFP-xcv-lCaTl1 se transfirieron a. t umefaciens C58 por acoplamiento triparental, seguido por el cultivo de las cepas A. tumef aciens que comprenden los dos constructos ('pCambia-GFP-Xcv-ICaFO' y 'pCambia-GFP-xcv-lCaTl') en medio sólido y la infiltración en hojas de Nicotiana bentamiana de acuerdo con el método descrito en la literatura relevante. Después de 48 horas, se prepararon los protoplastos de las áreas de las hojas dando fluorescencia verde bajo luz UV, y se tomaron fotos seriales de los protoplastos con fluorescencia verde utilizando microscopía confocal. Las fotografías claramente demuestran que el producto de fusión que comprende la proteína de tipo silvestre ('pCambia-GFP-Xcv-ICaFO1) aparece como islas (balsas lipídicas) en la membrana plasmática de las células, pero la proteína mutante que lleva la eliminación de leucina doble ('pCambia-GFP-xcv-I CaTl') no forma tales islas y muestra una distribución homogénea en la membrana plasmática.

Xjemplo 9 Identificación de los genes homólogos al gen Xcv-1 en plantas y animales Las secuencias de nucleótidos completas o parciales de los genomas de varios virus, bacteria, hongos y animales se determinaron en la estructura de varios proyectos genómicos. En la mayor parte de los casos, la determinación de las secuencias de ADN no involucró la identificación de la función de un segmento dado; de esta forma, la función de las secuencias permanece desconocida. Con relación al gen Xcv-1, las búsquedas de bancos de datos revelaron que varias secuencias que codifican proteínas con estructuras similares a la de la proteína xcv-1 pueden encontrarse en los bancos de datos (Feng et al., Mol Biol Rep DOI 10.1007/S11033-010-0419-1, 2010; Lieber et al . , Current Biology 21: 1009-1017, 2011; Liet al . , Biotechnol. Lett 31:905-910, 2009; Venancio T.M. y Aravind L. Bioinformatics 26:149-152, 2010). La alineación de las secuencias de aminoácido de estas proteínas claramente demuestra su similitud estructural. En la mayoría de los casos, la región inmersa en la membrana se delimita por un aminoácido negativamente cargado (ácido aspártico o ácido glutámico) o un aminoácido polar (asparagina). La alineación de una parte de las proteínas CYSTM se muestra en Venancio T. M. y Aravind L, Bioinformatics 26:149-152, 2010. Para los propósitos de la invención, las "proteínas homologas a la proteína Xcv-1" se refieren a proteínas variantes que contienen al menos 53% aminoácidos idénticos en su extremo C-terminal con respecto a los últimos 15 aminoácidos del extremo C-terminal de la proteína Xcv-1 (CLAALCCCCLLDACF).

Ejemplo 10 Inducción de la resistencia a Xanthomonas euvesicatoria en el tomate por la téenica ARNmi Uno de los patógenos bacterianos más dañinos del tomate es Xanthomonas euvesicatoria ( Xe ) , es decir, la misma bacteria que también causa daños severos en el pimiento. A diferencia del pimiento, el tomate no ha desarrollado resistencia natural apropiada, que aseguraría una protección aceptable. El gen bs4 identificado en el tomate no provee suficiente protección, y por lo tanto, la producción el tomate aún está altamente amenazada por infección Xe (Hutton et al., Theor. Appl. Genet. 121:1275-87, 2010). Se asume que el gen xcv-1 identificado en el pimiento también podría proveer resistencia a infección Xe en el tomate si los genes homólogos al gen Xcv-1, es decir, genes SIXcv-lA y SlXcv-lB representados por SEC ID NO:49 y SEC ID NO:51, respectivamente, se inactivan en el genoma del tomate, y la inactivación es precedida por el aseguramiento del funcionamiento de los genes de tomate homólogos al gen xcv-1 , es decir, genes SIXcv-lA y SlXcv-lB representados por SEC ID NO:59 y SEC ID NO:66, respectivamente (ver más adelante).

Esta estrategia puede implementarse en más de una forma incluyendo, pero no limitándose a: 1. El tomate se transforma con los genes funcionales SlXcv-lA y SlXcv-lB seguido por la inactivación de los genes residentes SlXcv-lA y SlXcv-lB utilizando la téenica "ARNmi". 2. El tomate ser transforma con los genes funcionales SlXcv-lA y SlXcv-lB seguido por la inactivación los genes residentes SlXcv-lA y SlXcv-lB utilizando la técnica de ZFN nucleasa. 3. El tomate ser transforma con los genes funcionales SlXcv-lA y SlXcv-lB seguido por la identificación de las mutaciones, que inactivan SlXcv-lA y SlXcv-lB - utilizando la técnica TILLING u otra técnica similar, después o sin mutagénesis. 4. El tomate ser transforma con los genes funcionales SlXcv-lA y/o SlXcv-lB seguido por la inactivación de los genes residentes SlXcv-lA y SlXcv-lB presentes utilizando la técnica TALEN. 5. El tomate ser transforma con los genes funcionales SlXcv- 1A y/o SlXcv-lB seguido por la inactivación de los genes residentes SlXcv-lA y SlXcv-lB presentes utilizando la técnica CRISPR/Cas.

Una característica común de las cinco estrategias anteriores es la preparación in vitro de las secuencias SlXcv-1A y SlXcv-lB y la transformación dentro del tomate en el primer paso. Debido a que el funcionamiento de los genes SlXcv-lA y SlXcv-lB es recesivo en comparación con los genes de tipo silvestre, el segundo paso involucra la inactivación de los genes de tipo silvestre ( SlXcv-lA y SlXcv-lB) con métodos adecuados, incluyendo, pero no limitándose a los tres métodos antes enumerados, con el fin de manifestar las funciones anteriores.

Ejemplo 10A Generación de las secuencias SlXcv-lA y SlXcv-lB con eliminación de leucina doble La preparación de los genes la eliminación de leucina doble ( SlXcv-lA y SIXcv-llB) involucrando amplificación PCR, la clonación de los amplificados en los vectores pGemT-Easy vectores, y digestiones y reclonaciones adicionales, pasos bien conocidos por los expertos en la téenica en ingeniería genética. Para la clonación, las secuencias de dos genes de tomate, es decir, SlXcv-lA y SlXcv-lB, obtenidos de bancos de datos, se utilizaron. Las secuencias de los genes SlXcv-lA y SlXcv-lB son SEC ID NO:49 y SEC ID N0:51, respectivamente.} Preparación del constructo SlXcv-lA : Se llevó a cabo una amplificación PCR en la presencia de la plantilla de ADN genómico del tomate utilizando los cebadores 'SIPromlAF3' (SEC ID NO:53) y 'SIPromlAR3' (SEC ID N0:54), y el fragmento de ADN de 1074-bp se clonó en los vectores pGEM-T Easy. El plásmido resultante ('rIAI') se digirió con la enzima Nsil seguido por ligación y transformación para generar 'plA2'. Se realizó una amplificación PCR en la presencia de una plantilla de ADN genómica del tomate utilizando los cebadores 1SITermlAF3' (SEC ID NO:55) y 'SITermlARS' (SEC ID NO:56), y el fragmento de ADN de 283-bp se clonó en los vectores pGEM-T Easy para generar el plásmido 'plA3'. El plásmido 'plA2' se digirió con Nsil, y el plásmido 'plA3' se digirió con NSil y PstI; enseguida, las dos mezclas se combinaron y ligaron, y después de la transformación, el plásmido 'P1A4', en donde el extremo Nsil de 'plA3' colocado hacia la secuencia genómica en 'plA2', se identificó. Se realizó una amplificación PCR en el ADN genómico del tomate utilizando los cebadores 'SIMidlAFl ' (SEC ID NO:57) y 'SIMidlABRl' (SEC ID NO:58), y el fragmento de ADN de 1137-bp ADN se clonó en los vectores pGEM-T Easy para generar el plásmido 'plA5'. Después del mezclado de 'plA4' y 'plA5', los plásmidos se digirieron con Nsil y ligaron, y - después de la transformación, el plásmido 'plA6', en el cual el fragmento 1094-bp Asil se clonó en el sitio Asil del plásmido 'plA4' en la orientación correcta, se identificó. Finalmente, este resultó en el constructo SlXcv- 1A (SEC ID NO:59), que codifica la proteína SlXcv-lA (SEC ID NO:60), una variante con la eliminación de leucina doble.

Preparación del constructo SIXcv-lB: Se llevó a cabo una amplificación PCR en la presencia de la plantilla de ADN genómico del tomate utilizando los cebadores 'SIPromlBF3' (SEC ID NO:61) y 'SIPromlBRS' (SEC ID NO:62), y el fragmento de ADN de 1450-bp se clonó en los vectores pGEM-T Easy. El plásmido resultante ('rIBI') se digirió con la enzima Nsil seguido por ligación y transformación para generar 'plB2'. Se realizó una amplificación PCR en la presencia de una plantilla de ADN genómica del tomate utilizando los cebadores 1SITermlBF3' (SEC ID NO:63) y 'SITermlBR3' (SEC ID NO:64), y el fragmento de ADN de 787-bp se clonó en los vectores pGEM-T Easy para generar el plásmido 'plB3'. El plásmido 'plB2' se digirió con Nsil, y el plásmido 'P1B31 se digirió con NSil y PstI; enseguida, las dos mezclas se combinaron y ligaron, y después de la transformación, el plásmido 'plB4', en donde el extremo Nsil de 'plb3' colocado hacia la secuencia genómica en 'plB2', se identificó. Se realizó una amplificación PCR en el ADN genómico del tomate utilizando los cebadores 'SIMidlBFl 1 (SEC ID NO:58) y 'SIMidlABRl1 (SEC ID NO:58), y el fragmento de ADN de 1273-bp ADN se clonó en los vectores pGEM-T Easy para generar el plásmido 'plB5'. El plásmido 'plB4'se digirió con Ni pero el plásmido 'plB5' solo se digirió parcialmente con Ni; enseguida, las dos muestras se combinaron y ligaron, y después de la transformación, e plásmido 'rIBb', en el cual el fragmento 1236-bp Asil se clonó en el sitio Asil del plásmido 'plB4' en la orientación correcta, se identificó. Finalmente, este resultó en el constructo SlXcv-lB (SEC ID NO:66), que codifica la proteína SlXcv-lB (SEC ID NO:67), una variante con la eliminación de leucina doble.

Después de la preparación de los dos constructos, las secuencias SlXcv-lA y SlXcv-lB se clonaron de punta a punta en el vector A. turne faciens pCAMBIA2300 cortado por Xbal del vector pGemT-Easy utilizando Notl-Spel, y se transformaron en E. coli . El plásmido resultante se designó 'pDSlXcv-IAB'. A partir del hospedero E. coli , el plásmido se introdujo en la cepa A. tumefaciens utilizando el acoplamiento triparental. Las cepas resultantes se designaron A. tumefaciens (pDSlXcv-1AB).

Ejemplo 10B Transformación de los genes SlXcv-lA y SlXcv-lB en tomate utilizando Agrobac ter ium tumefaciens Se llevó a cabo una transformación de A. turne faciens como sigue: las semillas de tomate se sumergieron en 70% de etanol por 1 minuto, y después se transfirieron en una solución de 5.25% de perclorato sódico (NaClO) y 0.1% de Tween 20 y agitaron por 30 minutos. Después, las semillas se enjuagaron con agua destilada 8 veces y transfirieron a platos Petri conteniendo medio A, y se cultivaron por 8 días a 25°C con un ciclo de luz de 16 horas. Las cotiledóneas de las plantas se cortaron en el ápice y en la base, punzaron, colocaron en medio B y cubrieron con medio líquido MSO conteniendo A. tumefaciens (pDSlXcv-IAB). El medio líquido MSO conteniendo A. tumefaciens (pDSlXcv-IAB) se preparó como sigue: la cepa A. turne faciens (pDSlXcv-IAB) se almacenó a -80°C (preparada como se describe en el Ejemplo 11A) se plaqueó en un medio con YEP +100 g/ml rifampicina e incubó a 30°C. Una de las colonias se inoculó en 3 mi de medio líquido YEP (en un tubo de ensayo de 20-ml) utilizando un ciclo de inoculación, y la bacteria se rotó en un rodillo para asegurar la aeración, y cultivó hasta alcanzar la fase estacionaria (24 horas). La bacteria se recolectó por centrifugación como se describe previamente, los sobrenadantes se descartaron y las células se suspendieron en 12 mi de medio líquido MSO. Las hojas se trataron con la suspensión de Agrobacterium por 20 minutos, después el exceso de suspensión se extrajo y las hojas se co-cultivaron con la bacteria por 48 horas. Después de dos días, las hojas se transfirieron a placas con medio C. Las plantas se transfirieron a placas frescas con medio C a intervalos de dos semanas. Los callos desarrollados podrían cortarse en piezas más pequeñas, y se transfirieron a placas con medio D y después a placas frescas a intervalos de dos semanas. Cuando aparecieron pequeñas floras, se transfirieron de nuevo a placas con medio D. Cuando alcanzaron una longitud de 2 a 4 cm, las floras se transfirieron a placas frescas con medio E, y empezaron a formar raíces. Las plantas de 5 cm ya podrían plantarse en tierra de maceta. Un total de 15 plantas transformantes T0 (T0/xcvl para 15) se cultivaron.

Medio MSO (1000 mi): 4.3 g de sales MS, 100 mg de mio-inositol, 0.4 mi (1 mg/ml) de tiamina-HCl, 20 g de sacarosa Medio YEP (1000 mi): 10 g de extracto de levadura, 10 g de peptona, 5 g de NaCl (pH ajustado a 7 con NaOH) Solución vitamínica (por 1000 mi): 50 mg de tiamina-HCl, 200 mg de glicina, 500 mg auxiliar de nicotina, 50 mg de piridoxina-HCl, 50 mg de ácido fólico, 5 mg de biotina, 10 g de mioinositol Sustancia/medio E (por 1000 mi) MS (Gibco) 4.3 4.3 4.3 4.3 2.15 g Sacarosa 15 30 30 15 15 g Solución 1 1 1 1 1 mi vitamínica NAA 2 mi BAP 2 mi GA 1 mg Km 100 100 50 mg Timentina 300 300 300 mg Agar 5 g (BAP = Bencil-Aminopurina, NAA = Acido Naftalen Acético), IAA = Acido Indol Acético, GA = Acido Giberélico, Km = kanamicina) Cuando los tallos y raíces de las plantas transgénicas T0/xcvl-15 fueron lo suficientemente fuertes, el ADN se aisló de las hojas, y se realizó una reacción PCRE para detectar los eventos de transformación utilizando el siguiente par de cebadores: 1. Cebador Pr_SI SIMidlAFl (SEC ID N0:57); cebador Pr_SITermlAR3 (SEC ID NO:56); longitud del amplificado esperada: 1400 bp; 2. Cebador Pr_SITermlBF3 (SEC ID NO:62); cebador Pr_SITermlBR3 (SEC ID NO:63); longitud del amplificado esperada: 787 bp.

La secuencia del transgen entre los cebadores usados para la amplificación podría detectarse en todos los casos.

Ejemplo 10C Generación del gen que codifica prim-ARN i designado como pri_SlXel-ARNmi Los microRNA (ARNmi) descubiertos en los organismos eucariotas inhiben la eficiente expresión de los genes correspondientes. Esta inactivación del gen permite una forma alternativa de la regulación del gen a través de un mecanismo específico que resulta en la inhibición de la función del gen, que es de gran importancia en términos de desarrollo y diferenciación (Kidner C. A. es Martienssen R. A., Curr. Opin. Plant Biol.8:38-44, 2005). Los ARNmi son moléculas de ácido ribonucleico presentes en las células eucariotas. Los ARNmi son moléculas cortas que consisten de 21 a 24 nucleótidos en contraste con las moléculas de ARN largas que cumplen otras funciones (por ejemplo, ARNm, ARN ribosomal) . Los ARNmi son inhibidores post-transcripción del funcionamiento de los ARNm mediante la inhibición física de la síntesis de la proteína en ARNm complementarios, o causando la degradación de los ARNm complementarios después de unirse a éstos (Bartel D. P., Cell 16:281-297, 2004).

Los estudios de los ARNmi y la exploración de los procesos bioquímicos sobre el nivel molecular hace posible extender este mecanismo de inhibición específico a genes en los cuales no existen ARNmi naturales. Los ARNmi específicos de gen artificialmente preparados se designaron ARNmi (ARNmi artificial) (Ossowski et al., Plant J.53:674-690, 2008; Park et al., Plant Cell Rep. 28:469-480, 2009; Schwab et al., Methods Mol. Biol.592:71, 2010; Sablok et al., Biochem., y Biophys. Res. Comm.406:315-319, 2011). La inactivación del gen a base de ARNmi ha sido generada en un número de sistemas de animal y planta (Schwab et al, Plant Cell 18:1121-1133, 2006), y en términos generales, los ARNm objetivo pueden inactivarse, por lo tanto eliminado la función del gen en cuestión, a través de experimentos cuidadosamente diseñados.

Un gen ARNmi que codifica un ribonucleótido ARNmi consiste de las siguientes secuencias: promotor, extensión madre 5', ARNmi*, región de bucle, the ARNmi y una extensión madre 3' con cola poliA (Schwab et al., Methods Mol. Biol. 592:71, 2010).

Curso estrategico de la inducción de la resistencia en plantas de tomate: Durante la amplificación PCR y la secuenciación del ADN genómico de tomate, se identificaron dos secuencias homologas al gen Xcv-1 del pimiento ( SIXcv-lA y SlXcv-lB) : la secuencias de nucleótidos y las secuencias aminoácido deducidas se muestran en las secuencias de ADN de SEC ID NO:49 y SEC ID NO:51, respectivamente, y las secuencias de aminoácidos de SEC ID NO:50 y SEC ID NO:52, respectivamente.

La secuencia de ARNm objetivo - con la cual el ARNmi designado 1SlXel-amiRNS1 mostrará complementariedad parcial (18 a 21 bases), es el segmento que precede al codón de detención de los genes SlXcv-lA y SlXcv-lB y codifica las dos leucinas correspondientes al gen Xcv-1 (ver Figura 3). El SIXel-ARNami no será complementario a los ARNm de los genes que comprenden la doble eliminación de leucina a ser expresada simultáneamente, y por lo tanto no los inactivará. SIXel-ARNami (SEC ID NO: 74) se expresa con la ayuda de pre-sly-MIR159miRNSpre-ADNmi (SEC ID NO:68), que es responsable de la expresión de sly-MIR159 (No. de acceso MI0009974) en el tomate, y la transcripción genera preSlpre-slyMI159ARN (SEC ID NO:69).

El segmento de codificación de la secuencia pre-SIXel -ARNmi (SEC ID NO:73), es decir, pre-SlXel-ADNami (SEC ID NO:72) se preparó como sigue. La amplificación se llevó a cabo del ADN genómico de tomate utilizando los cebadores 1Prl_SlXel pre-ARNmi' sintetizados (SEC ID NO:70) y 'Pr2_SlXel pre-ARNmi' (SEC ID NO:71), y la secuencia de codificación del pre-SlXel-ADNami bicatenario resultante (SEC ID NO:72) se clonó en vectores pGemT-Easy, y - después de la restricción por medio de los vectores EcoRI-Spel - pKSS y finalmente en los vectores pC61H a través de la escisión Kpnl y Xbal, como se describe en el Ejemplo 3. El fragmento HindIII-EcorRI de pCK61H se generó mediante la clonación del fragmento EcoRI-HindIII de BIN61S (Silhavy D. et al . , EMBO J.21 :3070-3080, 2002) llevando las secuencias promotora, polienlazadora y terminadora 35S en el sitio EcoRI-HindIII de pCAMBIA1300. El plásmido resultante pC61H-pri-SlXel-ARNmi y la cepa que contiene plásmido se designaron A. tumefaciens (pC61H-pri-SlXell-ARNmi). El fragmento HindIII-EcorRI de pCK61H-SlXel-ARNmi que lleva el gen que codifica SlXel-ARNami se muestra en SEC ID NO:92 Ejemplo 10D Transformación de las secuencias pri-SlXel-amiRNS en plantas transgénicas TO/1-15 que contienen los genes SlXcv-lA y SIXcv-lB La transformación con A. tumefaciens se llevó a cabo como se describe en el Ejemplo 10B, pero las plantas a ser transformadas fueron plantas transgénicas TO/1-15, la cepa A. tumefaciens (pC61K-pri-SlXel-ARNmi) se utilizó para la transformación y la selección fue para higromicina. Al final de la transformación, se cultivaron siete plantas independientes (TO/ami 1 a 7).

Prl_SlXel pre-ARNmi (SEC ID NO:70); Pr2_SlXel pre-ARNmi (SEC ID NO:71); longitud del amplificado esperado: 178 bp.

Además del aislamiento del ADN, el ARN total se aisló de las hojas de control y plantas transgénicas utilizando el Mino Kit RNeasy, y el ARN total se corrió en 12% de gel de carbamida/acrilamida transferido a una membrana Hybond NX (GE Healthcare Amersham) e híbrido con una sonda LNA marcada con alfa-32ATP que codifica SlXell -ARNmi. El autoradiograma obtenido después de la hibridación y la imagen del ARN total cargado en el gel se muestran en la Figura 4.

Las plantas transformantes se cultivaron hasta la etapa de 8 brotes de hojas, infectadas con la bacteria Xanthomonas euvesicatoria, y se evaluaron como se describe en el Ejemplo 1. Los resultados de la infección con Xanthomonas ser resumen en la Tabla 2.

Tabla 2: Detección de los transgenes plantas transgénicas de control después de una reacción PCR utilizando pares de cebadores específicos, y fenotipos de planta después de infección con Xanthomonas euvesicatoria .

Ejemplo 11 Inducción de resistencia a Xanthomonas euvesicatoria en el tomate utilizando la téenica de nucleasa modificada En un cierto método genético inverso anterior, una planta primero se mutagenizó, y después la mutación se identificó en los genes buscados. En la mayor parte de los casos, la mutación se identificó utilizando T_ADN y mutagénesis de inserción de transposón, y TILLING (Lesiones Locales Inducidas Dirigidas en Genomas) (Feldman, K.A. The plant Journal 1:71-82, 1991; McCallum, CM. et al., Nat. Biotech. 18455-457, 2000). Sin embargo, este método fue problemático, tardado e incierto. Las técnicas de interferencia de ARN (iARN) y microRNA artificial (ARNmi) mencionadas en el Ejemplo 10 ya son específicas para los genes deseados, sin embargo, la expresión del gen a menudo es imposible de eliminar completamente, es decir, se deberá obtener un fenotipo nulo por todos los medios (Schwab et al , Plant Cell 18:1121-1133, 2006). En consecuencia, los métodos que resultan en genes que se aniquilan completamente y de esta forma garantizan un fenotipo nulo son de vital importancia. Hasta ahora, se han descrito tres métodos que satisfacen el criterio anterior. Estos son las téenicas de ZFN, TALEN y CRISPR/Cas nucleasa antes mencionadas, que generan cortes bicaternarios c específicos del gen en el ADN y siguen la actividad del mecanismo de reparación de las inserciones y eliminaciones de células con el tamaño de una a varias decenas de pares base o más en una forma específica del gen [Urnov F.D. et al . Nat Rev Genet.11:636-46, 2010; Carroll D. Genetics. 188:773-82, 2011; Christian M. et al . , Genetics 189:757-761, 2010; Cermak, T. et al., Nucí. Acids Res. 39: e82, 2011; Mussolino C. et al., Nucleic Acids Res.39:9283-9293, 2011; Miller J.C. et al., Nat. Biotechnol. 29:143-148, 2011; Christian M. et al., G3 (Genes.Genomes.Genetics, Bethesda), doi:10.1534/g3.113.007104, 2013; Cho S.W. et al., Nat Biotechnol. 31:230-232, 2013; Cong L. et al., Science 339:819-823, 2013; Malí P. et al., Science 339:823-826, 2013]. Con el propósito de generar la eliminación 6-bp en los genes de tomate SlXcv-lA g SlXcv-lB, la técnica TALEN, CRISPR/Cas nucleasa y ZFN igualmente pueden usarse. De las células de tomate que solamente producen proteínas de la eliminación doble de leucina SlXcv-lA y/o SlXcv-lB, las plantas de tomate resistentes a Xe pueden generarse en la misma forma como en el Ejemplo 10.

Ejemplo 11 ? Inducción de resistencia a Xanthomonas eu vesicatoria en el tomate utilizando la téenica TALEN La secuencia objetivo TALEN que los pares TALEN reconoce {SlXcv-1AB_TALEN-L, SlXcv-lA_TALEN-R y SlXcv-1 B_TALEN-R) se deberá seleccionar y determinar en vista del hecho de que las eliminaciones 6 bp deberán localizarse en las posiciones 2277 a 2282 y 2640 a 2645, respectivamente. Debido a que las nucleasas TALEN aplicadas generalmente se cortan dentro de las denominadas secuencias "separadoras", es razonable seleccionar un tamaño de 18 pares base para la región separadora, y seleccionar una secuencia objetivo TALEN que se extiende dentro de 17 y 17 pares base tanto hacia la derecha como hacia la izquierda en una forma que asegura de tal forma que las secuencia son precedidas por un par base T/A en todos los casos [Cermak, T. et al., Nucí. Acids Res.39:e82, 2011; Christian M. et al., G3 (Genes,Genomes,Genetics, Bethesda)]. Debido a que las secuencias de los dos genes hacia el lado izquierdo de la mutación son idénticas a lo largo de al menos el segmento 36-bp a partir del extremo izquierdo de la eliminación deseada, la misma secuencia objetivo TALEN izquierda deberá seleccionarse para ambos genes (SlXcv-1AB_TAL-L, ver SEC ID NO:75 y Figura 5). Continuando desde el lado derecho de la eliminación deseada, las diferencias entre los dos genes aparecen ya después de la quinceava base, y por lo tanto, las secuencias objetivo TALEN de la derecha serán diferentes para SlXcv-lA y SlXcv-lB ( SlXcv- 1A TAL-R, ver SEC ID NO:76; y SlXcv-1 B_TAL-R, ver SEC ID NO:77 y Figura 5). Cada base de las secuencias objetivo ser reconoce por "di-residuos variables de repetición" (RVD abreviado) - es decir, dobletes de los aminoácidos adyacentes, presentes en las proteínas efectoras TAL. Los siguientes aminoácidos RVD pueden diseñarse para cada base: A se reconoce por el doblete del aminoácido NI, C es reconocido por el doblete HD, G es reconocido por el doblete NH, y T es reconocido por el doblete NG (A = adenosina, C = citidina, G = guanosina, T = timidina, NI = asparagina-isoleucina, HD = histidina-ácido aspártico, NH = asparagina-histidina, NG = asparagina-glicina; ver Figura 5). Las secuencias RVD y las secuencias de repetición limítrofes pueden sintetizarse y clonarse de acuerdo con la literatura relevante (pNIl-10, pHDl-10, pNHl-10, y pNGl-10, ver Cermak, T. et al . , Nucí. Acids Res.39: e82, 2011, material complementario). Las secuencias de las series pNH son idénticas a la secuencias pNN excepto que el doblete del codón AAC CAT, que codifica asparagina e histidina, deberá usarse en lugar del codón doble de asparagina (AAC AAT). Las repeticiones que contienen RVD pueden clonarse en plásmidos pFUS_A y pFUS_B6 después del corte de Bsal. Los plásmidos pFUS_A, pFUS_B6 y pLR-NG y pLR-NI, respectivamente, pueden cortarse por Esp31 y clonarse en el sitio Esp3I pTAL3. (Cermak, T. efc al., Nucí. Acids Res.39: e82, 2011). Concerniente a los genes SIXcv-lA y the SIXcv-lB, las secuencias específicas TALEN que comprenden secuencias TAL específicas, TAL-N', SIXcv-lA, y SIXcv-lB que contienen 17 repeticiones y RVD [SlXcv- 1AB_TAL-L, SlXcv -1A_TAL-R g SlXcv-1B_TAL-R), el TAL-C en el que está presente la secuencia NLS, y finalmente el dominio catalítico de la Fokl nucleasa. Estas secuencias (TALEN-L es TALEN_R, ver Figura 6) pueden volverse a clonar, primero el dominio Fokl en un fragmento BamHI Sacl (el extremo se hace romo) se clona en el sitio BamHI-MIyl del vector BIN61S (Silhavy D. et al., EMBO J. 21 :3070-3080, 2002), después este derivado se corta por BamHI y las secuencias SlXcv- 1AB_TALEN- , (SEC ID NO:78), SlXcv-1A_TALEN-R (SEC ID NO:79), y SlXcv- 1B_T ALEN- , (SEC ID N0:80), respectivamente se clonan en pares (ver Figura 6) en un fragmento HIndIII-EcoRI en el sitio EcoRI de pCAMBIA1300 y/o pCAMBIA2300- seguido por la introducción de Agrobacterium turne faciens mediante transformación, y finalmente se transforma en plantas de tomate adecuadas como se describe en el Ejemplo 10. Las especies de tomate deberán seleccionarse en una forma que asegura la expresión funcional del gen TALEN. La Figura 6 muestra los mapas funcionales de las secuencias entre el borde izquierdo (LB, por sus siglas en inglés) y el borde derecho (RB, por sus siglas en inglés) en los vectores utilizados para la transformación. La transformación deberá llevarse a cabo con los cuatro vectores mostrados en la Figura 6 {SlXcv-1_TALEN 1AH, SlXcv-l_TALEN 1BH, SlXcv-l_TALEN 1AK, SlXcv- 1_TALEN 1BK), y los callos resistentes a higromicina y kanamicina deberán seleccionarse y regenerarse en la presencia de higromicina (50 mg/ml) y kanamicina (100 pg/ml). Los genes SlXcv- 1? g SlXcv- IB pueden detectarse de los callos utilizando PCR entre las bases 2277 a 2282 y 2640 a 2645, respectivamente (ver Figura 5 y 7). Los genotipos SlXcv-lA y SlXcv-lB que llevan la eliminación 6-bp, así como otros derivados de eliminación/inserción pueden identificarse en ambas selecciones. Las plantas se regeneran de los callos SlXcv-lA y SlXcv-lB, y las plantas resistentes a higromicina, que llevan el gen SlXcv- 1A - se transforman con el vector SlXcv-l_TALEN 1BK vector, y las plantas resistentes a kanamicina, que llevan el gen SlXcv- IB - se transforman con el vector SlXcv-l_TALEN 1AH, y procedemos como se describe anteriormente, es decir, los callos resistentes a kanamicina e higromicina se cultivan, y las téenicas PCR se utilizan para identificar las eliminaciones en los genes SlXcv- IB y SlXcv- 1A. Durante la tipificación genética de los callos resistentes, se buscan las eliminaciones entre los pares base 2277 a 2282 y 2640 a 2645. Tres de las eliminaciones de esta forma identificables se mencionan a continuación.

En la Variante 1, the eliminación 6-bp deseada está presente en ambos genes: de esta forma, estas plantas llevan los genes SlXcv-lA y SlXcv-lB, que codifican las secuencias de aminoácido SlXcv-lA (SEC ID NO:60) y SlXcv-lB (SEC ID NO:67) (ver Figura 7), respectivamente.

En la Variante 2, las plantas llevan el gen SlXcv-lA, que codifica la secuencia de aminoácidos SlXcv-lA (SEC ID NO:60). En la Variante 2, el derivado del gen SlXcv-lB consiste de una eliminación/inserción que cambia el marco de lectura abierto (de la eliminación del marco) (ver Figura 7).

En la Variante 3, las plantas llevan el gen SlXcv-lB, que codifica la secuencia de aminoácidos SlXcv-lB (SEC ID NO:67). En la Variante 3, el derivado del gen SlXcv-lA contiene una eliminación/inserción que cambia el marco de lectura abierto (de la eliminación del marco) (ver Figura 7).

Los tres derivados transformantes anteriores (Variantes 1, 2 y 3) pueden propagarse vegetativamente y cultivarse a la etapa de 8 brotes de hojas, después infectarse con Xanthomonas euvesicatoria, y los productos resistentes a Xanthomonas euvesicatoria pueden seleccionarse. Para un experto en la téenica, es obvio que los transgenes (T-ADN) pueden removerse del genoma de las plantas seleccionadas resistentes a Xanthomonas euvesicatoria mediante el cruce, porque los transgenes se segregarán de una parte de la progenie, es decir, plantas no transgénicas pueden generarse de estas .

Ejemplo IB Inducción de resistencia a Xanthomonas euvesicatoria en el tomate utilizando la téenica de CRISPR/Cas nucleasa La tecnología CRISPR/Cas antes descrita (Cho S.W. et al . , Nat. iotechnol.31:230-232, 2013; Cong L. et al., Science 339:819-823, 2013; Malí P. et al . , Science 339:823-826, 2013; Feng Z. et al . , Cell Research: 1-4, 2013) también es útil para generar la(s) eliminación(es) 6-bp deseada(s), o mutaciones génicas resultando en fenotipos nulos, en el tomate, y otras plantas. En el primer caso, se designaron "ARN de guía individual" (ARNsg abreviado) para la secuencias de tomate de tipo silvestre correspondientes a la eliminación 6-bp deseada (ver Figura 5A) como la secuencia objetivo.El procedimiento es como sigue:primero volver a templar, los oligonucleótidos (ARNsg_S2Xcv-lF, 5 GATTTCTGTGCTGTTGCTGTCTCT, SEC ID NO:82 y ARNsg _SlXcv-lR, 5'-AAACAGACACGACAACGACAGAGA, SEC ID NO:83) designados y sintetizados para la secuencia objetivo 20-bp (CRISPR _SlXcv-l, 5'- TCTGTGCTGTTGCTGTCTCT, ver SEC ID NO:81) se clonaron en un sitio Bsal/Bsal de un vector adecuado después del promotor U6 específico de tomate y antes de la secuencia ARNsg.Este constructo es seguido por un promotor doble 35S, una secuencia NLS, el gen hspCAS9 (Feng Z. et al . , Cell Research: 1-4, 2013), otra secuencia NLS y el terminador NOS (Cong L, et al . Science 339:819-823, 2013). El constructo resultante se clonó en vectores de transformación derivados de planta pCAMBIA que llevan un gen resistente a higromicina y a kanamicina, respectivamente (ver arriba), y se usaron para transformar células de tomate. Es importante notar, que la secuencia CRISPR_SlZcv-l (SEC ID NO:81) puede no activar y cortar las secuencias SlXcv-lA o SlXcv-lB confinando la eliminación 6 bp.

Después de preparar los vectores, las células de tomate se transformaron como se describe en el Ejemplo 10, los callos resistentes a higromicina y kanamicina se seleccionaron como se describe en el Ejemplo 11, y los derivados génicos de SlXcv-lA y SlXcv-lB se evaluaron como se describe en el Ejemplo 1. Como un resultado de los experimentos y pruebas, se esperan resultados similares como en el caso de las tres variantes descritas en el Ejemplo 11, es decir, la eliminación 6-bp deseada está presente en ambos genes SlXcv-1 genes ( SlXcv-lA y SlXcv-lB) , que codifican las secuencias de aminoácido SlXcv-lA (SEC ID NO:60) y SlXcv-lB (SEC ID NO:67), respectivamente; o la eliminación 6-bp deseada solo está presente en SlXcv-lA y SlXcv-lB, y el codón de detención temprano, o una eliminación/inserción fuera de la estructura que da un fenotipo nulo se genera en el otro gen.

Después del tratamiento con la CRISPR/Cas nucleasa, los derivados del transformante con la característica ventajosa (Variantes 1, 2 y 3, ver Ejemplo 11A.) pueden propagarse vegetativamente y cultivarse en la etapa de 8 brotes de hojas, después infectarse con Xanthomonas euvesicatoria, y la progenie resistente a Xanthomonas euvesicatoria puede seleccionarse. Para un experto en la téenica, es obvio que, en este caso también los transgenes (ADN-T) pueden removerse del genoma de las plantas seleccionadas resistentes a Xanthomonas euvesicatoria mediante el cruce, porque los transgenes se segregarán de una parte de la progenie, es decir, plantas no transgénicas pueden generarse de éstos.

Ejemplo 11C Inducción de resistencia a Xanthomonas euvesicatoria en el tomate utilizando la técnica ZFN La tecnología ZFN antes mencionada (Urnov F.D. et al . Nat Rev Genet. 11:636-46, 2010, Carroll D. Genetics.188:773-82, 2011) también es útil para generarla eliminación 6-bp deseada(s), o mutaciones génicas que resultan en fenotipos nulos, en el tomate y en otras plantas. En el caso de generar la eliminación 6-bp deseada, el procedimiento es como sigue: las secuencias objetivo a ser reconocidas por las proteínas de los dos dedos de zinc (ZF) se seleccionan dentro del segmento de las bases 2253 a 2306 (SEC ID NO:84) de la secuencia génica SlXcv-lñ (SEC ID NO:49) y dentro del segmento de las bases 2616 a 2669 (SEC ID NO:85) de la secuencia génica SlXcv-lB (SEC ID NO:51) - como se muestra en la Figura 5 -en una forma que asegura una distancia de 5 a 7 bp entre sí. Es obvio que más de un arreglo puede seleccionarse como la secuencia objetivo junto con los segmentos de ADN anteriores (SEC ID NO:84, SEC ID NO:85) y las proteínas ZF específicas que consisten de los dominios ZF, que son específicas para los lados izquierdo y derecho de las secuencias objetivo. Los posibles ejemplos para el gen SlXcv-lA (SEC ID NO:49) y el gen SlXcv-lB (SEC ID N0:51) incluyen, pero no se limitan a las secuencias objetivo 6-bp que cubren exactamente las secuencias de la eliminación 6-bp deseada en los dos genes anteriores. En ambos, casos la secuencia objetivo es 5 -CTCTTG, que codifica dos leucinas, y las secuencia objetivo de las proteínas ZF específicas izquierda y derecha [51-TGTGCTGTTGCT (SEC ID NO:86) y 5'- TTTCGTACGTAG (SEC ID NO:87), respectivamente] son idénticas en ambos genes porque muestran 100% de identidad en esta región. Los genes de las Proteínas ZF que reconocen las secuencias objetivo izquierda y derecha específicas se clonan en los vectores de transformación derivados de la planta pCAMBIA que llevan un gen resistente a higromicina y a kanamicina, respectivamente (ver arriba), y se usan para transformar células de tomate.

Después de la preparación de los vectores, las células de tomate se transforman como se describe en el Ejemplo 10, y los procedimientos descritos en los Ejemplos 11A y 11B se siguen en lo sucesivo.

El procedimiento de eliminación/inserción utilizando las ZNF, TALEN y CRIPSR/Cas nucleasas pueden llevarse a cabo en plantas de tomate transgénicas que llevan uno de los genes (es decir, ya sea SlXcv-lA o SlXcv-lB) , o ambos {SlXcv-lA y SlXcv-lB) , en donde los derivados de inserción o eliminación aniquilados se buscan en los genes residentes SlXcv-lA y SlXcv-lB entre las plantas tratadas con las ZFN, TALEN o CRIPSR/Cas nucleasas. En casos afortunados, la variante alélica nula doble también puede obtenerse después de realizar la transformación y la segunda transformación es innecesaria.

Para el experto, es obvio y entendible que los mutantes nulos aniquilados en los genes SlXcv-lA y SlXcv-lB solamente pueden generarse dentro del segmento de las bases 2244 a 2318 (SEC ID NO:84) de la secuencia génica SlXcv-lA (SEC ID NO:49) y dentro del segmento de las bases 2607 a 2681 (SEC ID NO:85) de la secuencia génica SlXcv-lB (SEC ID NO:51) - como se muestra en la Figura 5 -con las téenica antes mencionadas (TALEN y CRIPSR/Cas nucleasa y ZFN) y otras técnicas de mutagénesis (mutagénesis, ECOTILLING, Comai L. et al . , Plant J.37:778-786, 2004 etc.), pero también pueden designarse para la secuencia completa de SlXcv-lA (SEC ID NO:49) y SlXcv-lB (SEC ID NO:51), es decir, para todas aquellas secuencias que son responsables de la expresión y manifestación de los genes anteriores y sus productos (proteínas funcionales) (por ejemplo, las secuencias del promotor, UTR 3' y 5', del exón, intrón, etc.).

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (52)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. El gen xcv-1 aislado de Capsicum annuum, caracterizado porque es responsable de una resistencia recesiva a Xanthomonas euvesicatoria y tiene la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID NO:37, o la secuencia de ADNc del gen xcv-1, que es la secuencia de nucleótidos de SEC ID NO:90.

2. Una proteína xcv-1 CYSTM que provee resistencia, caracterizada porque se codifica por los genes de conformidad con la reivindicación 1 y tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:38, en donde la región CYSTM de la proteína lleva una eliminación Leu doble en las ubicaciones correspondientes a las posiciones 87 y 88 de la proteína Xcv-1 de tipo silvestre de SEC ID NO:42.

3. Una proteína homologa a la proteína xcv-1 CYSTM de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque comprende una eliminación de dos aminoácidos en la región CYSTM en comparación con la región CYSTM de la proteína homologa de tipo silvestre, y provee resistencia.

4. Una proteína homologa de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque comprende la eliminación de dos aminoácidos en su región CYSTM en las posiciones 5 y 6 del extremo C-terminal de la proteína de tipo silvestre.

5. Un gen homólogo al gen xcv-1 de conformidad con la reivindicación 1 o a su secuencia de ADNc, caracterizado porque codifica una proteína homologa de conformidad con la reivindicación 3.

6. Una proteína homologa de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque es la proteína homologa mutante Slxcv-1A que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:60 o la proteína homologa mutante SlXcv-lB que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:67.

7. Un gen homólogo de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el gen SlXcv-lA tienen la secuencia de nucleótidos de SEC ID NO:59 o sus variantes de ADNc que tienen la secuencia de nucleótidos de SEC ID NO:88, ambos codifican la proteína homologa mutante Slxcv-1A (SEC ID NO:60), o SlXcv-lB que tiene la secuencia de nucleótidos de SEC ID NO:66 o sus variantes de ADNc que tienen la secuencia de nucleótidos de SEC ID NO:89 ambos codificando la SlXcv-lB proteína homologa mutante (SEC ID NO:67).

8. Una proteína nucleasa modificada específica para la secuencia de ADN de un gen homólogo al gen Xcv-1 de tipo silvestre (SEC ID NO:41), caracterizada porque selectivamente reconoces y corta el segmento de ADN que codifica la región CYSTM del gen homólogo para el gen Xcv-1 de tipo silvestre, o ciertas de sus secuencias parciales.

9. Una proteína nucleasa modificada de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque selectivamente reconoces y corta el segmento de ADN que codifica la región CYSTM de la SlXcv-lA (SEC ID NO:49) o SlXcv-lB (SEC ID NO:51) de tipo silvestre, o ciertas de sus secuencias parciales.

10. Una proteína nucleasa modificada de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque es el par de ZFN que selectivamente reconoce los segmentos génicos representados por SEC ID NO:86 y 87, o el par de TALEN nucleasa que selectivamente reconoce los segmentos génicos representados por SEC ID NO:78 y 79 o 78 y 80, o sgRNS-CRISPR/Cas nucleasa que selectivamente reconocen el segmento génico representado por SEC ID NO:81.

11. Un gen caracterizado porque codifica una proteína nucleasa modificada de conformidad con las reivindicaciones 8, 9 o 10.

12. Una molécula de ácido nucleico para silenciar la expresión del gen SlXcv-lA y/o el gen SlXcv-lB, caracterizada porque comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de: (a) la secuencia de nucleótidos establecida en SEC ID NO:74; (b) una secuencia de nucleótidos que comprende al menos 60% de identidad con la secuencia de nucleótidos establecida en SEC ID NO:74; (d) la secuencia de nucleótidos establecida en SEC ID NO: 72; (e) la secuencia de nucleótidos establecida en SEC ID NO: 73; (f) la secuencia de nucleótidos establecida en SEC ID NO: 92; y (g) el complemento de longitud completa de cualquiera de los puntos (a)-(f).

13. La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 12(a) o reivindicación 12(b) o reivindicación 12(c), caracterizada porque además comprende una secuencia de nucleótidos adicional en donde la secuencia de nucleótidos adiciona es una secuencia de estructura iARNmi que está operablemente enlazado a la secuencia de nucleótidos de reivindicación 12(a) o reivindicación 12(b) o reivindicación 12(c) para silenciar la expresión del gen SlXcv-lA y/o el gen SlXcv-lB .

14. La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 12 o 13, caracterizada porque es capaz de silenciar al menos uno de los genes SlXcv-lA y SlXcv-lB cuando tal molécula de ácido nucleico se expresa en una planta.

15. La molécula de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11-14, caracterizada porque no silencia la expresión del mutante de la eliminación 6 bp del gen SlXcv-lA que codifica una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEC ID NO: 50 y/o el mutante de la eliminación 6 bp del gen SlXcv-lB que codifica una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEC ID NO: 52.

16. La molécula de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12-15, caracterizada porque molécula de ácido nucleico o una de sus partes se expresan en una planta como un ARN i.

17. La molécula de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12-16, caracterizada porque además comprende un promotor operablemente enlazado que es capaz de impulsar la expresión de la molécula de ácido nucleico en una planta.

18. La molécula de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12-17, caracterizada porque es una molécula de ácido nucleico artificial.

19. Un vector caracterizado porque comprende un gen de conformidad con las reivindicaciones 1, 5, 7 u 11 o una molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 12.

20. Una célula caracterizada porque se transforma con un vector de conformidad con la reivindicación 19.

21. Un método para la preparación in vitro de un gen mutante homólogo al gen xcv-1 o sus variantes de ADNc de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque comprende los pasos de: a) identificar un gen homólogo al gen Xcv-1 de tipo silvestre (SEC ID N0:41) en una planta, b) preparar in vitro las secuencias genómicas y de ADNc del gen identificado en el paso a) en la forma de un ADN, y c) crear in vitro la eliminación de 6 bp deseada en el ADN preparado en el paso b) en el segmento del gen que codifica la región CYSTM.

22. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque en el paso c), la eliminación 6-bp deseada se crea en aquellos nucleótidos de la región CYSTM del gen que codifica el quinto y sexto aminoácidos del extremo C-terminal.

23. Una planta mutante que muestra resistencia a un factor biótico o abiótico, caracterizada porque el genoma de la cual se modifica para contener una eliminación 6-bp en el segmento que codifica la región CYSTM de uno o más genes homólogos al gen Xcv-1 de tipo silvestre (SEC ID NO:41).

24. Un método para generar una planta transgénica resistente a un factor biótico o abiótico de conformidad con la reivindicación 23 mediante transformación, caracterizado porque comprende los pasos de: a) transformar las células de una planta sensible mediante un gen de conformidad con la reivindicación 5 o un gen preparado por el método de conformidad con la reivindicación 14 en una forma que asegura su expresión funcional, b) inactivar uno o más genes resistentes homólogos al gen Xcv-1 de tipo silvestre (SEC ID N0:41), o el ARNm o una de sus proteínas, en las células de planta transformantes sensibles obtenidas en el paso a), y c) regenerar la planta de los transformantes y seleccionar los individuos resistentes.

25. Un método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque en el paso b), los productos ARNm del (de los) gen(s) residente(s) se silencian funcionalmente por la téenica ARNmi como sigue: bl) preparar un constructo de gen ARNmi para la secuencia de ribonucleótidos complementaria a la región CYSTM de la ARNm de uno o más genes homólogos al gen Xcv-1 de tipo silvestre e identificado en las células de planta transformantes obtenida en el paso a), b2) clonación del constructo obtenido en el paso bl) en un vector apropiado, b3) transformación de las células de planta generadas en la reivindicación 17 con el vector obtenido en el paso b2) en una forma que asegura la expresión funcional de la ARNmi y la inactivación de los productos ARNm de la del (de los) gen(s) CYSTM de tipo silvestre, y c) regenerar los transformantes obtenidos en el paso b3) y seleccionar la planta resistente.

26. Un método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque en el paso b), el (los) gen(es) residente(s) se inactiva(n) por un método de eliminación de nucleasa modificada como sigue: bl) preparar constructos de ADN que codifican proteínas TALEN-L y TALEN-R o ZFN-L y ZFN-R nucleasa modificadas específicas para la secuencia génica que codifica la región CYSTM de uno o más genes homólogos al gen Xcv-1 de tipo silvestre e identificados en las células de planta transformantes obtenidas en el paso a), más específicamente aquellos específicos para los segmento de ADN correspondientes a los 6 nucleótidos a ser eliminados y los nucleótidos circundantes como la secuencia objetivo en una forma que asegura que los 6 nucleótidos a ser eliminados del gen de tipo silvestre se coloquen en la parte media del segmento separador de los pares TALEN-L más TALEN-R o ZFN-L más ZFN-R, o mediante la preparación de un constructo CRISPR/Cas nucleasa que comprende la secuencia génica ARNsg específica para los 6 nucleótidos a ser eliminados del gen de tipo silvestre y los nucleótidos circundantes como la secuencia objetivo, b2) clonación del constructos obtenido en el paso bl) en un vector apropiado, b3) transformar las células de planta con un vector que comprende el constructo obtenido en el paso bl) en una forma que asegura la expresión funcional de los transgenes, c) identificar las mutaciones de eliminación o inserción aniquiladas en los genes homólogos al gen Xcv-1 de tipo silvestre (SEC ID N0:41), d) seleccionar las células de planta que contienen las mutaciones identificadas en el paso c), e) regenerar la células de planta identificadas en el paso d) y seleccionar las plantas resistentes, y f) remover los transgenes que comprenden los constructos TALEN o ZFN o los constructos CRISPR/Cas que contienen el gen de la proteína sgRNS por segregación genética.

27. Un método para generar una planta mutante que muestra una resistencia abiótica o biótica de conformidad con la reivindicación 23, utilizando un método de edición genómica, caracterizado porque comprende los pasos de: a) identificar uno o más genes homólogos al gen Xcv-1 de tipo silvestre (SEC ID NO:41) en una planta sensible, b) preparar constructos de ADN que codifican proteínas TALEN-L y TALEN-R o ZFN-L y ZFN-R nucleasa modificadas específicas para la secuencia génica que codifica la región CYSTM de uno o más genes homólogos al gen Xcv-1 de tipo silvestre e identificados en el paso a), más específicamente aquellos específicos para los 6 nucleótidos a ser eliminados y los nucleótidos circundantes como la secuencia objetivo en una forma que asegura que los 6 nucleótidos a ser eliminados del gen de tipo silvestre se coloquen en la parte media del segmento separador de los pares TALEN-L más TALEN-R o ZFN-L más ZFN-R, o preparando un constructo CRISPR/Cas nucleasa que comprende la secuencia génica ARNsg específica para los 6 nucleótidos a ser eliminados del gen de tipo silvestre y los nucleótidos circundantes como la secuencia objetivo, c) clonación del constructo obtenido en el paso b) en un vector apropiado, d) transformación de las células de planta sensibles con un vector que comprende el constructo obtenido en el paso b) en una forma que asegura la expresión funcional de los transgenes y la generación de la eliminación 6-bp en la región CYSTM por la nucleasa, e) identificar los transformantes que llevan las mutaciones que muestran la eliminación 6-bp en la región CYSTM de los genes homólogos al gen Xcv-1 de tipo silvestre (SEC ID NO:41), f) regenerar la células de planta que tienen la mutación identificada en el paso e) y seleccionar las plantas resistentes, y g) remover los transgenes que comprenden los constructos TALEN o ZFN o constructos CRISPR/Cas que contienen el gen de la proteína sgRNS por segregación genética.

28. Un método para generar una planta mutante que muestra resistencia abiótica o biótica de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque las proteínas TALEN o ZFN específicas para la región CYSTM se introducen en la planta por bacterias no patogénicas, que comprende los pasos de: a) identificar uno o más genes homólogos al gen Xcv-1 de tipo Silvestre (SEC ID N0:41) en una planta sensible, b) preparar constructos de ADN que codifican TALEN-L más TALEN-R o ZFN-L más ZFN-R nucleasa proteínas modificadas específicas para el segmento de ADN que codifica la región CYSTM del gen identificado en el paso a) en una forma que asegura que los 6 nucleótidos a ser eliminados del gen de tipo silvestre se coloquen en la parte media del segmento separador de los pares TALEN-L más TALEN-R o ZFN-L más ZFN-R, c) clonación del constructos obtenido en el paso b) en un vector bacteriano apropiado e introduciéndolos en las bacterias no patogénicas con el sistema de secreción de tipo tres activo utilizando tal vector, d) infectar la planta sensible con la bacteria obtenida en el paso c), y e) regenerar una planta resistente del tejido de la planta infectada.

29. Un método para generar una planta de tomate resistente a Xanthomonas eu vesicatoria, caracterizado porque comprende los pasos de: a) identificar los genes residentes SlXcv-lA y SlXcv-lB (SEC ID NO:49 y 51, respectivamente), que son homólogos al gen Xcv-1 de tipo silvestre in the tomato planta, b) preparar in vitro las secuencias genómicas y de ADNc del gen identificados en la forma de un ADN, c) crear in vitro, la eliminación 6-bp en las posiciones correspondientes a las eliminaciones en el gen xcv-l por lo tanto generando constructos que llevan los genes mutantes SlXcv-lA y SlXcv-lB (SEC ID NO:59 y 66, respectivamente) o sus secuencias de ADNc (SEC ID NO:88 y 89, respectivamente), d) clonación del constructos obtenido en el paso c) en un vector apropiado y transformar las células de la planta de tomate con el vector resultante en una forma que asegura la expresión funcional de los transgenes, e) preparar un constructo de gen ARNmi específico para silenciar el gen SlXcv-lA y/o SlXcv-lB, f) clonación del constructo obtenido en el paso e) en un vector apropiado, g) transformar las células de planta generadas en el paso d) con el vector obtenido en el paso f) en una forma que asegura la expresión del ARNmi y la inactivación de los productos ARNm de los genes CYSTM de tipo silvestre SlXcv-lA y SlXcv-lB, y h) regenerar los transformantes obtenidos en el paso g) y seleccionar la planta resistente.

30. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el paso (e) comprende preparar un constructo de gen ARNmi específico para los secuencias de ribonucléotidos complementarias correspondientes a la región CYSTM de los genes SlXcv-lA y/o SlXcv-lB de tipo silvestre (SEC ID NO:49 y 51, respectivamente), más específicamente un constructo de gen ARNmi específico para los 6 nucleótidos a ser eliminados y los nucleótidos circundantes (SlXel -ARNmi, SEC ID NO: 74).

31. El método de conformidad con la reivindicación 29 o 30, caracterizado porque el constructo del gen ARNmi comprende la molécula de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12-18.

32. Un método para generar una planta de tomate resistente a Xanthomonas euvesicatoria, caracterizado porque comprende los pasos de: a) identificar los genes residentes SlXcv-lA y SlXcv-lB (SEC ID NO:49 y 51, respectivamente), que son homólogos al gen Xcv-1 de tipo silvestre in the tomato planta, b) preparar in vitro las secuencias genómicas y de ADNc del gen identificados en la forma de un ADN, c) crear in vitro, la eliminación 6-bp en las posiciones correspondientes a las eliminaciones en el gen xcv-1 por lo tanto generando constructos que llevan los genes mutantes SlXcv-lA y SlXcv-lB (SEC ID NO:59 y 66, respectivamente) o sus secuencias de ADNc (SEC ID NO:88 y 89, respectivamente), d) clonación de los constructos obtenidos en el paso c) en un vector apropiado y transformar las células de la planta de tomate con el vector resultante en una forma que asegura la expresión funcional de los transgenes, e) preparar proteínas nucleasas modificadas TALEN-L (SEC ID NO:78) y TALEN-R (SEC ID N0:79, y 80) específica para las secuencias objetivo (SEC ID N0:75, 76, 77) específica para los región CYSTM del gen SIXcv-lA y SlXcv-lB de tipo silvestre, o constructos de ADN que codifican proteínas nucleasas modificadas ZFN-L y ZFN-R específicas para SEC ID NO: 86 y 87 en una forma que asegura que los 6 nucleótidos a ser eliminados del gen de tipo silvestre se coloquen en la parte media del segmento separador de los pares TALEN-L más TALEN-R o ZFN-L más ZFN-R, o mediante la preparación de un constructo de CRISPR/Cas nucleasa que comprende la secuencia génica ARNsg específica para los 6 nucleótidos a ser eliminados del gen de tipo silvestre y los nucleótidos circundantes como la secuencia objetivo (SEC ID NO: 81), f) clonación del constructo obtenido en el paso e) en un vector apropiado, g) transformar las células de planta generadas en el paso d) con el vector obtenido en el paso f) en una forma que asegura la expresión funcional de los transgenes de TALEN o ZFN o CRISPR/Cas nucleasa anteriores, y la inactivación funcional de los genes SlXcv-lA y SlXcv- IB por esto, h) identificar las mutaciones de aniquilación por eliminación o inserción en las células transformantes, i) regenerar la células de planta que tienen la mutación identificada en el paso h) y seleccionar las plantas resistentes, y j) remover los transgenes de nucleasa TALEN-L más TALEN- R o ZFN-L más ZFN-R o CRISPR/Cas por segregación genética.

33. El método de conformidad con la reivindicación 20, para generar una planta de tomate resistente a Xanthomonas euvesicatoria, caracterizado porque comprende los pasos de: a) identificar los genes residentes SlXcv-lA (SEC ID NO:49) y SIXcv-lB (SEC ID NO:51), que son homólogos al gen Xcv-1 de tipo silvestre en la planta de tomate, b) preparar proteínas nucleasas modificadas TALEN-L (SEC ID NO:78) y TALEN-R (SEC ID N0:79and 80) específica para las secuencias objetivo (SEC ID NO:75, 76, 77) específica para los región CYSTM del gen SlXcv-lA y SlXcv-lB de tipo silvestre, o constructos de ADN que codifican proteínas nucleasas modificadas ZFN-L y ZFN-R específicas para SEC ID NO: 86 y 87 en una forma que asegura que los 6 nucleótidos a ser eliminados del gen de tipo silvestre se coloquen en la parte media del segmento separador de los pares TALEN-L más TALEN-R o ZFN-L más ZFN-R, o mediante la preparación de un constructo CRISPR/Cas nucleasa que comprende la secuencia génica ARNsg específica para los 6 nucleótidos a ser eliminados del gen de tipo silvestre y los nucleótidos circundantes como la secuencia objetivo (SEC ID NO: 81), c) clonación del constructo obtenido en el paso b) en un vector apropiado, d) transformar las células de la planta de tomate con el vector obtenido en el paso c) en una forma que asegura la expresión funcional de los transgenes TALEN o ZFN o CRISPR/Cas nucleasa anteriores, y la creación de la eliminación 6-bp en la región CYSTM de los genes SlXcv-lA y SlXcv-lB por estos, e) identificar los transformantes que llevan la eliminación 6-bp en la región CYSTM de los genes de tipo silvestre SlXcv-lA y SlXcv-lB, f) regenerar los transformantes que tienen la mutación identificada en el paso e) y seleccionar la planta resistente, y g) remover los transgenes de nucleasa TALEN-L más TALEN-R o ZFN-L más ZFN-R o CRISPR/Cas por segregación genética.

34. La planta mutante de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada porque la resistencia es resistencia recesiva a Xanthomonas sp., preferiblemente Xanthomonas euvesicatoria .

35. La planta mutante de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada porque es una planta monocotiledónea ( Monocotyledoneae ) tal como arroz, maíz, trigo, centeno, cebada, mijo, banana y similar.

36. La planta mutante de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada porque es una planta dicotiledónea ( Dicotyledoneae ) .

37. La planta mutante de conformidad con la reivindicación 36, caracterizada porque es una planta del a familia de las Citroideae, tal como naranja, mandarina, limón, toronja, pomelo; una planta de la familia de las Solanáceas, por ejemplo, papa, tomate, pimiento, berenjena, etc., una planta de la familia de las Brasicáceas, por ejemplo, col, rábano, coliflor, nabo; una planta de las familias de las Fabáceas o Leguminosas, por ejemplo, alfalfa, frijol, chícharo; una planta de la familia de las Cucurbitáceas, por ejemplo, calabaza, pepino, melón; una planta de la familia de las malváceas, tal como algodón ( Gossypium sp. ) .

38. Una planta mutante de conformidad con la reivindicación 36, caracterizada porque es la planta de tomate ( Solanum lycopersicum).

39. Planta de tomate mutante de conformidad con la reivindicación 38, caracterizada porque se prepara por los metodos de conformidad con las reivindicaciones 29, 30-32, 33 o 34.

40. Un método para generar una planta mutante que muestra resistencia abiótica o biótica de conformidad con la reivindicación 24, 25, 26, 27 o 28, caracterizado porque la planta resistente anterior lleva en combinación otro tipo de genes resistentes.

41. Un método para generar una planta de tomate resistente a Xanthomonas euvesicatoria de conformidad con las reivindicaciones 29, 30, 31, 32, 33 o 34, caracterizada porque la planta de tomate resistente anterior lleva otro tipo de genes resistentes contra Xanthomonas euvesicatoria incluyendo, pero no limitándose a Bsl, Bs2, Bs3, Bs4, bs5, bs6.

42. Un método para generar una planta de arroz resistente a Xanthomonas oryzae pv. oryzae de conformidad con las reivindicaciones 24, 25, 26, 27 o 28, caracterizado porque la planta de arroz resistente lleva en combinación otros tipos de genes resistentes contra Xanthomonas oryzae pv. oryzae incluyendo, pero no limitándose a Xa-4 + xa-5 + Xa-7 + xa-13 + Xa-21.

43. Un método para generar a planta que pertenece a género Citroidaea resistente a los patógenos cítricos, incluyendo, pero no limitándose a Xanthomonas citri pv. citri, Xanthomonas axonopodis pv. citri de conformidad con las reivindicaciones 24, 25, 26, 27 o 28, caracterizado porque la planta cítrica resistente lleva en combinación otros tipos de genes resistentes frente a las cepas Xanthomonas citri, Xanthomonas axonopodis .

44. Productos incluyendo, pero no limitándose a frutas, jugos, pasta, etc. de la planta mutante de conformidad con la reivindicación 23 o 40, caracterizados porque se preparan por los métodos de conformidad con las reivindicaciones 24, 25, 26, 27 o 28.

45. Productos incluyendo, pero no limitándose a frutas, jugos, pasta, etc. de la planta mutante de tomate de conformidad con la reivindicación 38 o 41, caracterizados porque se preparan por los métodos de conformidad con las reivindicaciones a 29, 30, 31 32, 33 o 34.

46. Semillas de planta mutante de conformidad con la reivindicación 23 o 40, caracterizadas porque se preparan por los métodos de conformidad con las reivindicaciones 24, 25, 26, 27 o 28.

47. Semillas de planta mutante de tomate de conformidad con la reivindicación 38 o 41, caracterizadas porque se preparan por los métodos de conformidad con las reivindicaciones 29, 30, 31, 32, 33 o 34.

48. Un anticuerpo específico para la región CYSTM mutante de una proteína de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque se une a la proteína mutante resistente de la proteína de tipo silvestre.

49. El uso de un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 48, en un método in vitro para determinar si la planta tiene una proteína definida en la reivindicación 3.

50. Una sonda genética caracterizada porque es específica para un gen de conformidad con la reivindicación 1 o 5 y se híbrida con éste bajo condiciones estrictas.

51. Pares de cebadores caracterizados porque son específicos para cualquiera de los genes de conformidad con la reivindicación 1 o 5 o 7 y usando la caracterización genética de las plantas si llevan o no la eliminación de 6 nucleótidos deseada incluyendo, pero no limitándose a una selección asistida con marcador.

52. El uso de la sonda génica de conformidad con la reivindicación 50 o el par de cebadores de conformidad con la reivindicación 51 en un método in vitro para detectar si una planta lleva un gen de conformidad con la reivindicación 1 o 5 o 7, o no.