CN108265077B - 一种降低水稻籽粒镉含量的育种方法 - Google Patents
一种降低水稻籽粒镉含量的育种方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种降低水稻籽粒镉含量的育种方法，采用CRISPER/Cas9技术定向敲除水稻OsNCX8基因，获得OsNCX8基因敲除的转基因植株，从中选择OsNCX8蛋白完全失活的纯合体植株，最终获得不带转基因成分、稻米镉含量降低的植株。OsNCX8蛋白是在水稻中鉴定到的第一个钠‑钙交换蛋白家族成员，使OsNCX8蛋白失活以后导致籽粒镉含量降低45％左右。而且OsNCX8蛋白失活的植株农艺学性状和正常植株相比没有明显改变。在T0代植株中就可以得到OsNCX8蛋白完全失活的纯合体植株，大大缩短育种时间，并且在其后代中可以筛选到不含转基因成分的植株，规避了转基因带来的安全隐患。
Description
技术领域
本发明涉及植物生态学和农业技术领域，特别是指一种降低水稻籽粒镉含量的育种方法。
背景技术
水稻是我国主要的粮食作物之一，随着工农业的发展，环境和土壤中的重金属，特别是重金属镉，在水稻各个组织积累，影响水稻的产量和品质。镉在环境中不能降解，可通过食物链严重危害人类的健康。目前，湖南省水稻重金属污染严重，尤其是籽粒(大米)中重金属镉含量超标威胁人类健康，降低籽粒中的镉含量非常重要。通过换土、优化水肥或者全生育期淹水等措施都可以缓解镉对水稻的毒害，降低稻米中的镉含量，但这会大大增加种植成本。因此，从遗传上改良水稻品种的耐镉性，选育镉积累量低的品种，是减少稻米镉污染的一个经济且有效的途径。
水稻自然突变为水稻育种提供了重要材料，如掀起第二次绿色革命的水稻半矮杆基因sd-1，但是自然突变的突变效率极低，且需要常规的杂交、回交进行分离鉴定，工作量大且不足。随着技术的发展，出现了化学方法和物理方法诱导人工突变，大大提高了突变效率，但是产生的多位点突变增加了表型鉴定的难度。随后出现的基因工程方法诱导突变成了最主要的获得水稻突变体的方法。但是这些方法获得的突变体是随机的，不可控的，不能对特定基因进行沉默，不能对特定的位点进行突变，而且不能实现基因敲除的突变体，因此基因编辑技术对水稻生产实践意义重大。
从生物学原理上讲，基因编辑技术的基因定点突变与传统的基因随机突变(自然突变或人工诱变)的性质具有实质等同性，但是基因编辑定点突变更具有针对性和效率性。基因编辑技术可以在后代突变株系中筛选出包含靶基因突变，并且无选择标记基因的突变株系。因此基因编辑技术应当比传统的诱变育种方法具有更高的安全性，使得改造后的作物更为稳定、安全。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提出一种降低水稻籽粒镉含量的育种方法，本发明的育种方法通过CRISPER-Cas9基因敲除技术定向敲除水稻OsNCX8，彻底失活钙离子转运蛋白OsNCX8，定向育成不带转基因成分，稻米镉含量显著降低，综合性状无显著变异的水稻材料。
基于上述目的，本发明提供的一种降低水稻籽粒镉含量的育种方法，采用CRISPER/Cas9技术定向敲除水稻OsNCX8基因，获得OsNCX8基因敲除的转基因植株，从中选择OsNCX8蛋白完全失活的纯合体植株，最终获得不带转基因成分、稻米镉含量降低的水稻植株。
目前并没有发现钙离子转运蛋白参与镉的运输，OsNCX8是水稻中鉴定到的第一个钠-钙交换蛋白家族成员，推测编码一个Na/Ca交换运输蛋白，参与水稻中镉的运输和积累，使OsNCX8蛋白失活以后导致稻米镉含量降低。
在本发明的一些实施例中，降低水稻籽粒镉含量的育种方法包括如下步骤：
(1)克隆水稻受体材料的OsNCX8的外显子全长，测序；
(2)利用CRISPER/Cas9系统，根据OsNCX8的外显子序列选择靶标序列；
(3)构建含所述靶标序列片段的pCRISPER/Cas9重组载体；
(4)将所获得的pCRISPER/Cas9重组载体导入水稻愈伤组织中得到转基因苗；
(5)筛选所述转基因苗中的转基因阳性植株；
(6)利用所述转基因阳性植株获得突变植株；
(7)将所述突变体植株进行繁种，于后代植株中分离不含转基因成分的功能缺失的突变体，即为稻米镉含量降低的水稻。
在本发明的一些实施例中，在步骤(1)中，OsNCX8的外显子序列如SEQ ID NO:1所示，用于克隆水稻受体材料的OsNCX8的外显子序列的上游引物序列为：F1：5’-ATGGCGCTCCTGCGCAGGCGG-3’，其为SEQ ID NO:2所示；用于克隆水稻受体材料的OsNCX8的外显子序列的下游引物序列为：R1：5’-CTATGCTGGCCACCAGGAGT-3’，其为SEQ ID NO:3所示。
在本发明的一些实施例中，在步骤(2)中，所述的靶标序列如SEQ ID NO:4所示。
CRISPER/Cas9基因编辑系统的靶序列决定了sgRNA的特异性，sgRNA较高的特异性才能降低系统的脱靶频率，因此靶序列特异性是降低脱靶率的关键。CRISPER/Cas9的结合特异性仅由约19-21bp的靶序列决定，若选择的靶位点序列本身在基因组中并不特异，则会出现脱靶现象。在设计植物基因的靶序列时，除了考虑PAM序列，GC含量，靶序列的二级结构等因素，还应将选定序列进行全基因组Blast核查，排除脱靶位点。本发明的发明人经过大量的试验研究最终筛选到本申请的靶标序列，靶标序列：GTTTTATGGCGCTCCTGCGCAGG，其为SEQ ID NO:4所示，该靶标序列包含蛋白质翻译的起始密码子ATG，产生突变后将导致OsNCX8蛋白的翻译不能起始，或起始后马上终止，不再产生活性蛋白或多肽链，提高蛋白失活的机率；靶标序列第一个碱基为G，后三个碱基为AGG，AGG前面长度为20个碱基，完全符合CRISPER/Cas9系统对靶序列的要求。AGG前面15个碱基具有较高的特异性，能大幅度的降低脱靶概率。
在本发明的一些实施例中，所述步骤(3)具体包括以下步骤：
a.根据靶标序列，设计带粘性末端的接头引物；
b.将带粘性末端的接头引物退火互补形成带粘性末端的双链小片段；
c.酶切包含sg-RNA的原始载体；
d.将带粘性末端的双链小片段连接到酶切过的sg-RNA载体上，形成包含靶标序列和sg-RNA的重组载体；
e.用LRmix将包含靶标序列和sg-RNA的重组载体和包含Cas9的载体进行LR反应重组，形成包含靶标序列-sg-RNA+Cas9的完整的重组载体。
在本发明的一些实施例中，在步骤a中，所述接头引物包括F2引物和R2引物，所述F2引物的序列如SEQ ID NO:5所示，所述R2引物的序列如SEQ ID NO:6所示。
在本发明的一些实施例中，在步骤c中，采用BsaⅠ酶酶切包含sg-RNA的原始载体。
在本发明的一些实施例中，在步骤(6)中，利用所述转基因阳性植株获得突变植株的具体步骤为：提取转基因阳性植株的DNA，设计特异性引物，扩增含靶标位点的DNA片段，对PCR扩增产物进行测序，选取OsNCX8开放阅读框发生移码突变提前终止或缺失起始密码子的纯合突变株系作为突变植株。
在本发明的一些实施例中，所述特异性引物包括F3引物和R3引物，所述F3引物的序列如SEQ ID NO:7所示，所述R3引物的序列如SEQ ID NO:8所示。
从上面所述可以看出，本发明具有以下有益效果：
(1)目前并没有发现钙离子转运蛋白参与镉的运输，OsNCX8是在水稻中鉴定到的第一个钠-钙交换蛋白家族成员，推测编码一个Na/Ca交换运输蛋白，参与水稻中镉的运输和积累，使OsNCX8蛋白失活以后导致日本晴(粳稻)、D100(籼稻)籽粒镉含量降低45％左右。
(2)本发明OsNCX8蛋白失活的植株农艺学性状和正常植株相比没有明显改变。在T0代植株中就可以得到OsNCX8蛋白完全失活的纯合体植株，大大缩短育种时间，并且在其后代中可以筛选到不含转基因成分的植株，规避了转基因可能带来的安全隐患。可以快速定向改良水稻的籽粒镉积累性状，获得镉含量显著降低的不带转基因成分水稻材料。
(3)该方法为靶向定点突变，不改变受体材料的遗传背景，因此可不影响受体材料的背景，保留受体材料的优良特性。
(4)本发明的靶序列包含蛋白质翻译的起始密码子ATG，产生突变后将导致NCX8蛋白的翻译不能起始，或起始后马上终止，不再产生活性蛋白或多肽链，提高蛋白失活的机率。靶序列第一个碱基为G，后三个碱基为AGG，AGG前面长度为20个碱基，完全符合CRISPER/Cas9系统对靶序列的要求。AGG前面15个碱基具有较高的特异性，能大幅度的降低脱靶概率。
附图说明
图1是pOs-sgRNA载体的图谱；
图2是pH-Ubi-cas9-7载体的图谱；
图3是突变体和野生型水稻种植在镉污染的土壤中，成熟时籽粒镉含量图；
图4是突变体和野生型水稻种植在镉污染的土壤中，成熟时籽粒相关矿质元素含量图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并结合附图，对本发明进一步详细说明。
本发明的一种降低水稻籽粒镉含量的育种方法，包括：克隆水稻受体材料的OsNCX8的外显子；利用CRISPER/Cas9系统，根据CRISPER/Cas9系统所要求的靶序列原则进行选择，设计特异的针对OsNCX8外显子序列23个碱基，构建pCRISPER/Cas9重组载体；将pCRISPER/Cas9重组载体导入水稻愈伤组织中得到转基因苗；筛选转基因阳性植株；获得突变植株；将突变植株进行繁种，于后代植株中分离不含转基因成分的功能缺失突变体。
以下实施例中所涉及到的培养基的配制如下所示：
(1)LB液体培养基：分别称取10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g NaCl溶于1000mL蒸馏水中，用1N NaOH调pH值到7.0，121℃高温高压灭菌15min。
(2)N6D培养基配方如下表所示：
(3)AB培养基配方(mg/L)：MgSO4·7H2O 296mg/L，CaCl2·2H2O 10mg/L，NaH2PO4·2H2O 1300mg/L，NH4Cl 1000mg/L，K2HPO4 2950mg/L，KCl 150mg/L。
(4)AAM培养基配方：AA盐分氨基酸、MS维生素、酪蛋白水解物0.5g/L、葡萄糖36g/L、蔗糖68.5g/L、乙酰丁香酮100μmol/L。
(5)N6-AS培养基配方：在N6培养基中添加甘氨酸2.00mg/L，维生素B1 1.00mg/L，盐酸吡哆辛0.50mg/L，烟酸0.50mg/L。
(6)分化培养基配方：以N6培养基为基本培养基，辅加300mg/L水解酪蛋白，500mg/L脯氨酸，500mg/L谷氨酰胺，0.02mg/L NAA，2mg/L Kinetin，12g/L吉兰糖胶，30g/L蔗糖。
(7)生根培养基配方：以分化培养基为基本培养基不添加植物激素吉兰糖胶。
实施例1
在本实施例中，一种降低水稻籽粒镉含量的育种方法，具体包括以下步骤：
(1)克隆水稻受体材料的OsNCX8的外显子全长，测序；
设计特异性的引物序列克隆水稻受体材料的OsNCX8的外显子全长、测序；引物序列为：F1：5’-ATGGCGCTCCTGCGCAGGCGG-3’，其为SEQ ID NO:2所示；R1：5’-CTATGCTGGCCACCAGGAGT-3’，其为SEQ ID NO:3所示。克隆、测序得到日本晴、9311、Takata等不同水稻品种的NCX8基因的序列全长，测序发现该基因序列没有碱基差异，说明该基因在进化过程中保守性较强，基因全长序列如下，其为SEQ ID NO:1所示：
ATGGCGCTCCTGCGCAGGCGGGGGTACAGTGCCGCCGTCCCCAGCGCCTGCTGCTTCCTCCTCCTGCTGCTCGTCCTCTCCGCCTCCCACCTCCTGCCCACTCGCCGAGGCCATGGCGGCGTCCTAGAAGGGTTGGCCCTTAGGGGGAGCGCCTCTCGTTCTCGTTCTGGTTCGTCGTCGTCCTCTTCCGCCGGCGAGGAGCAGGGAAGTTGCCAGGAGCTGCAGTCCATCGAGGGCGGGGAGGCCAGGTGCCTGTACCTCCGGACGCACCCGCCGTGCGCGCCCGCGGGGTACGTGGACTACCTCAGGCTGTTCTACTGCGGGTTCGCCCACGCGCCGGCGGCGGGGTACGCCGCGGCCGTGCTCTGGCTGGCGGTGCTCTTCTACCTGCTCGGCGACACCGCGTCCGAGTACTTCTGCGCGTCCCTCGAGGGGCTCTCGGCGGAGCTGCGCCTGCCGCCGGCCATCGCTGGCGTCACGCTGCTCTCGCTCGGGAACGGCGCGCCGGATGTCTTCGCCAGCGTCGTCTCCTTCGCGGCCGGCGACGGCGGGGGCGTCGGGCTCAACAGCGCGCTCGGTGGCGCGCTGTTCGTGTCCACCGTTGTTGCTGGGGTGGTCGCGCTCGCCGCCGCCTCGCGTGCCGGCCGAGGCGGGGTTGTGGTGGAGCTGCGGGGATTCGTGCGCGACATCTGCTTCCTCCTCCTCGCGCTCTGCTCACTCCTCGCCATACTGGTGACCGGCACGGTCACCGTCTGGGTGTCCGCGTCCTTCGTCTCGCTCTATGTCGCGTATGTCCTCCTCGTCTGGACCTCCCACTGCTGCTCTGAACCGGGGAAGCCGCCGCAGGCCGACCTCGCCGCGCCGCTCCTCCTCGACGACGACGGCGGCGTCACGCCACTGCCGTCCTACTCCAAGAACTCGGCGCCCTCGAAAAAAAGAGCCTACCTTCATTGCCTCCTATCCGCGATCCTCATCCCGCTGTACCTCCCTCGCCGCCTGACAATCCCGGACATCGCCGGGCACCGCTGGTCCCGGCCCTGCGCCGTGGCGTCCCTCGCTCTGGCGCCGGTCCTCCTCGCCGCCACCTGGGCATCGTCGTGCCGGCATGCCCTCGCCGTCCTCCTCGGCGGCGCCCTCCTCGGCCTCCTCCTCGCCGCGCTCGCCGCGGCCACCACGGAGGCGGCCTCCCCACCCCGCGGGCGGTGGCGGCGCGTGCCGTGGCTGGCGGCGGGGTTCCTGATGAGCGTGCTGTGGGCGTACACCCTGGCGCGCGAGCTGGTGGCGCTGCTGGTGGCGATCGGGTACATGGTGGGCGTGAGGGCGAGCGTGCTGGGCGTGACGGTGCTGGCGTGGGGGGACTCGCTGGGCGACCTGGTGTCGAACGTCGCCATGGCGCTGCACGGCGGCGCCGGCGGCGCGCAGACGGCGGTGTCGGGCTGCTACGCGGGCCCGCTGTTCAACACGGTGGTGGGGCTGGGCCTCTCGCTGACGCTGGCGGCGGGGTCCCAGTACCCGGCGCCGTTCGCGATCCCGGCGGGCGGGGCGGTGTACGAGGCGGTGGGGTTCCTCGGCGCCGGGCTGGCATGGGCGCTGCTGGTGGTGCCGGCGAGGGGGATGCGGCTGGACCGGGTGTACGGCATGGGCCTCATCGCCATCTACCTCGCCTTCGTCACCATCCGCGTCTTCGACAGCCTCGGCCTCTGGACACACTCCTGGTGGCCAGCATAG
(2)利用CRISPER/Cas9系统，根据OsNCX8的外显子序列选择靶标序列；
利用简单、高效的CRISPER/Cas9系统，根据OsNCX8外显子序列选择特异的靶标序列，靶标序列：GTTTTATGGCGCTCCTGCGCAGG，其为SEQ ID NO:4所示。靶标序列针对OsNCX8基因，特异的使OsNCX8蛋白失活。
(3)构建含所述靶标序列片段的pCRISPER/Cas9重组载体；
3.1根据靶标序列，设计带粘性末端的接头引物；
将设计的靶序列添加pCRISPER/Cas9系统的特异粘性末端接头(F-GGCA；R-AAAC)，并合成完整的靶序列。
F2：5’-GGCA-GTTTTATGGCGCTCCTGCGC-3’，其为SEQ ID NO:5所示，
R2：5’-AAAC-GCGCAGGAGCGCCATAAAAC-3’，其为SEQ ID NO:6所示。
3.2将带粘性末端的接头引物退火互补形成带粘性末端的双链小片段；
将F2引物和R2引物稀释成浓度为10μM的溶液，各取10μl混匀，在PCR仪中进行退火反应，从98℃降至22℃。使F2引物和R2引物互补形成带粘性末端的双链小片段。
3.3酶切包含sg-RNA的原始载体pOs-sgRNA
用限制性内切酶BsaⅠ酶切包含sg-RNA的原始载体，酶切后将产生可以和靶标序列粘性末端互补的粘性末端。
用BsaⅠ酶切pOs-sgRNA原始载体，体系为：10×buffer BsaⅠ2μL，BsaⅠ酶1μL，pOs-sgRNA载体4μg，ddH2O补足20μL，37℃酶切12h，试剂盒纯化酶切产物。酶切产物用1％琼脂糖凝胶电泳核查条带大小后，过柱子回收纯化酶切产物，加入灭菌的ddH2O溶解测定浓度后待用。
3.4将带粘性末端的双链小片段连接到酶切过的pOs-sgRNA载体上，形成包含靶标序列和sg-RNA的重组载体；
用T4连接酶将步骤3.2中的双链小片段和步骤3.3中酶切过的pOs-sgRNA(图1)载体连接，形成完整的包含针对NCX8蛋白的靶序列和sg-RNA的重组载体。15μL连接体系为：10×T4ligation buffer 1.5μL，双链小片段4μL，酶切过的pOs-sgRNA载体3μL，T4DNA ligase1μL，16℃连接12小时。连接产物转化大肠杆菌DH5α，卡那抗性LB平板过夜培养，挑选阳性菌株进行测序，得到测序正确的包含靶标序列和sg-RNA的重组载体。
3.5用LRmix将包含靶标序列和sg-RNA的重组载体和包含Cas9的载体pH-Ubi-cas9-7进行LR反应重组，形成包含靶标序列-sg-RNA+Cas9的完整的重组载体；
用LRmix将步骤3.4得到的重组载体和包含Cas9的载体pH-Ubi-cas9-7(图2)进行LR反应重组，5μL的LR反应体系：包含靶标序列和sg-RNA的重组载体25-50ng，pH-Ubi-cas9-7载体75ng，5×LR ClonaseTM-buffer 1μL，TE Buffer(pH8.0)到4.5μL，LR ClonaseTM0.51mL；体系放于25℃下温育2h，反应后，加2μL 2μg/μL的Proteinase K在37℃下处理10min，再将2μL反应产物转入大肠杆菌DH5α，壮观霉素抗性LB平板过夜培养，挑选阳性菌株进行测序，得到测序正确的包含NCX8蛋白靶标序列-sg-RNA+Cas9的完整的重组载体。
(4)将所获得的pCRISPER/Cas9重组载体导入水稻愈伤组织中得到转基因苗；
利用农杆菌介导的方法，将步骤3.5所获得的包含NCX8蛋白靶标序列-sg-RNA+Cas9的完整的重组载体导入水稻愈伤组织中得到转基因水稻，在T0代植株中就可以得到NCX8蛋白完全失活的纯合体植株。
将步骤3.5所获得的包含NCX8蛋白靶标序列-sg-RNA+Cas9的完整的重组载体用电转的方法转入农杆菌EHA105中，用粳稻日本晴、籼稻D100的成熟种子在N6D培养基上诱导培养7天产生愈伤组织。将含有重组载体的EHA105菌在AB平板上划线30℃生长3天，将生长的菌挑入AAM液体培养基中悬浮，调OD600到0.1。将愈伤组织挑入OD600为0.1菌液中轻摇90秒，于N6-AS平板上25℃黑暗培养3天，清洗三次后在含有50mg/L潮霉素和400mg/L的羧苄青霉素的N6D培养基筛选两周。将筛选出的新鲜愈伤组织挑到分化培养基上，进行分化培养，两周后将分化出的幼苗转移至生根培养基上进行生根培养，生根一周后移栽至温室田中培养。
(5)筛选所述转基因苗中的转基因阳性植株；
将移栽的小苗(T0代)提取DNA进行靶序列位点检测，共检测到32株阳性植株。
(6)利用所述转基因阳性植株获得突变植株；
①突变位点的鉴定
将移栽的小苗提取DNA，针对含靶标位点的500bp以内的DNA片段，设计特异性引物，扩增含靶标位点的DNA片段、扩增得到的PCR产物经纯化后送公司测序，测序结果与野生型植株序列比对，部分突变分析结果如下表所示。设计的检测引物为F3：5’-TACACGCACGCACTACGCACAC-3’，其为SEQ ID NO:7所示，R3：5’-GCTCCTGGCAACTTCCCTG-3’，其为SEQ ID NO:8所示。扩增片段长度为400bp。
表1.T0代部分阳性植株靶位点变化
| 株系 | 靶位点序列 | 基因型 |
| 野生型 | GTTTTATGGCGCTCCTGCGC | 野生型 |
| 8-1 | GTTTTATGGCGCTCCT-CGC | 缺失1个碱基 |
| 8-4 | GTTTTATGGCGCTCCTTGCGC | 增加1个碱基T |
| 8-6 | GTTTTATGGCGCTCCTAGCGC | 增加1个碱基A |
| 8-10 | GTTTTA-----------CGC | 缺失11个碱基 |
根据测序比对结果，选取OsNCX8开放阅读框发生移码突变提前终止或缺失起始密码子的T0代纯合突变株系8-1和8-10，繁种。
(7)将所述突变体植株进行繁种，于后代植株中分离不含转基因成分的功能缺失的突变体，即为稻米镉含量降低的水稻。
于T1代转基因分离群体中检测不含潮霉素、Cas9等转基因元件的植株单株收种子，得到不带转基因成分的功能缺失突变体，分别命名为ncx8-1突变体和ncx8-10突变体。
将ncx8-1突变体和ncx8-10突变体和野生型水稻种植在镉污染的土壤中，于水稻成熟期，考察主要农艺性状，并鉴定糙米镉含量及其他相关矿质元素含量，结果见图3和图4。从图3中发现，在3.9mg/kg的土壤中，ncx8-1突变体和ncx8-10突变体的籽粒中镉含量分别为0.13mg/kg和0.12mg/kg，而野生型籽粒的镉含量为0.23mg/kg，突变体籽粒镉含量明显低于野生型，突变体籽粒镉含量降低45％左右。因此，当OsNCX8基因被敲除后，使水稻籽粒中的隔含量明显降低。
从图4中可以看出，ncx8-1突变体和ncx8-10突变体的籽粒中的其他离子含量(Ca、Cu、Mg、Fe、Mn和Zn)与野生型相比，无明显差异。ncx8-1突变体和ncx8-10突变体的籽粒中的镉含量较对照显著降低，而其他相关金属元素并无显著影响，该方法可用于水稻籽粒镉含量的分子改良。
从上面所述可以看出，本发明具有以下有益效果：
(1)目前并没有发现钙离子转运蛋白参与镉的运输，OsNCX8是在水稻中鉴定到的第一个钠-钙交换蛋白家族成员，推测编码一个Na/Ca交换运输蛋白，参与水稻中镉的运输和积累，使OsNCX8蛋白失活以后导致日本晴(粳稻)、D100(籼稻)籽粒镉含量降低45％左右。
(2)本发明OsNCX8蛋白失活的植株农艺学性状和正常植株相比没有明显改变。在T0代植株中就可以得到OsNCX8蛋白完全失活的纯合体植株，大大缩短育种时间，并且在其后代中可以筛选到不含转基因成分的植株，规避了转基因可能带来的安全隐患。可以快速定向改良水稻的籽粒镉积累性状，获得镉含量显著降低的不带转基因成分水稻材料。
(3)该方法为靶向定点突变，不改变受体材料的遗传背景，因此可不影响受体材料的背景，保留受体材料的优良特性。
(4)本发明的靶序列包含蛋白质翻译的起始密码子ATG，产生突变后将导致NCX8蛋白的翻译不能起始，或起始后马上终止，不再产生活性蛋白或多肽链，提高蛋白失活的机率。靶序列第一个碱基为G，后三个碱基为AGG，AGG前面长度为20个碱基，完全符合CRISPER/Cas9系统对靶序列的要求。AGG前面15个碱基具有较高的特异性，能大幅度的降低脱靶概率。
所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。
本发明的实施例旨在涵盖落入所附权利要求的宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和变型。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
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<211> 1728
<212> 人工序列
<223> OsNCX8的外显子
<400> 1
atggcgctcc tgcgcaggcg ggggtacagt gccgccgtcc ccagcgcctg ctgcttcctc 60
ctcctgctgc tcgtcctctc cgcctcccac ctcctgccca ctcgccgagg ccatggcggc 120
gtcctagaag ggttggccct tagggggagc gcctctcgtt ctcgttctgg ttcgtcgtcg 180
tcctcttccg ccggcgagga gcagggaagt tgccaggagc tgcagtccat cgagggcggg 240
gaggccaggt gcctgtacct ccggacgcac ccgccgtgcg cgcccgcggg gtacgtggac 300
tacctcaggc tgttctactg cgggttcgcc cacgcgccgg cggcggggta cgccgcggcc 360
gtgctctggc tggcggtgct cttctacctg ctcggcgaca ccgcgtccga gtacttctgc 420
gcgtccctcg aggggctctc ggcggagctg cgcctgccgc cggccatcgc tggcgtcacg 480
ctgctctcgc tcgggaacgg cgcgccggat gtcttcgcca gcgtcgtctc cttcgcggcc 540
ggcgacggcg ggggcgtcgg gctcaacagc gcgctcggtg gcgcgctgtt cgtgtccacc 600
gttgttgctg gggtggtcgc gctcgccgcc gcctcgcgtg ccggccgagg cggggttgtg 660
gtggagctgc ggggattcgt gcgcgacatc tgcttcctcc tcctcgcgct ctgctcactc 720
ctcgccatac tggtgaccgg cacggtcacc gtctgggtgt ccgcgtcctt cgtctcgctc 780
tatgtcgcgt atgtcctcct cgtctggacc tcccactgct gctctgaacc ggggaagccg 840
ccgcaggccg acctcgccgc gccgctcctc ctcgacgacg acggcggcgt cacgccactg 900
ccgtcctact ccaagaactc ggcgccctcg aaaaaaagag cctaccttca ttgcctccta 960
tccgcgatcc tcatcccgct gtacctccct cgccgcctga caatcccgga catcgccggg 1020
caccgctggt cccggccctg cgccgtggcg tccctcgctc tggcgccggt cctcctcgcc 1080
gccacctggg catcgtcgtg ccggcatgcc ctcgccgtcc tcctcggcgg cgccctcctc 1140
ggcctcctcc tcgccgcgct cgccgcggcc accacggagg cggcctcccc accccgcggg 1200
cggtggcggc gcgtgccgtg gctggcggcg gggttcctga tgagcgtgct gtgggcgtac 1260
accctggcgc gcgagctggt ggcgctgctg gtggcgatcg ggtacatggt gggcgtgagg 1320
gcgagcgtgc tgggcgtgac ggtgctggcg tggggggact cgctgggcga cctggtgtcg 1380
aacgtcgcca tggcgctgca cggcggcgcc ggcggcgcgc agacggcggt gtcgggctgc 1440
tacgcgggcc cgctgttcaa cacggtggtg gggctgggcc tctcgctgac gctggcggcg 1500
gggtcccagt acccggcgcc gttcgcgatc ccggcgggcg gggcggtgta cgaggcggtg 1560
gggttcctcg gcgccgggct ggcatgggcg ctgctggtgg tgccggcgag ggggatgcgg 1620
ctggaccggg tgtacggcat gggcctcatc gccatctacc tcgccttcgt caccatccgc 1680
gtcttcgaca gcctcggcct ctggacacac tcctggtggc cagcatag 1728
<210> 2
<211> 21
<212> 人工序列
<223> F1引物
<400> 2
atggcgctcc tgcgcaggcg g 21
<210> 3
<211> 20
<212> 人工序列
<223> R1引物
<400> 3
ctatgctggc caccaggagt 20
<210> 4
<211> 23
<212> 人工序列
<223> 靶标序列
<400> 4
gttttatggc gctcctgcgc agg 23
<210> 5
<211> 24
<212> 人工序列
<223> F2引物
<400> 5
ggcagtttta tggcgctcct gcgc 24
<210> 6
<211> 24
<212> 人工序列
<223> R2引物
<400> 6
aaacgcgcag gagcgccata aaac 24
<210> 7
<211> 22
<212> 人工序列
<223> F3引物
<400> 7
tacacgcacg cactacgcac ac 22
<210> 8
<211> 19
<212> 人工序列
<223> R3引物
<400> 8
gctcctggca acttccctg 19
Claims (6)
1.一种降低水稻籽粒镉含量的育种方法，其特征在于，采用CRISPR/Cas9技术定向敲除水稻OsNCX8基因，获得OsNCX8基因敲除的转基因植株，从中选择OsNCX8蛋白完全失活的纯合体植株，最终获得不带转基因成分、稻米镉含量降低的水稻植株；
包括如下步骤：
（1）克隆水稻受体材料的OsNCX8的外显子全长，测序；
（2）利用CRISPR/Cas9系统，根据OsNCX8的外显子序列选择靶标序列；
（3）构建含所述靶标序列片段的pCRISPR/Cas9重组载体；
（4）将所获得的pCRISPR/Cas9重组载体导入水稻愈伤组织中得到转基因苗；
（5）筛选所述转基因苗中的转基因阳性植株；
（6）利用所述转基因阳性植株获得突变植株；
（7）将所述突变体植株进行繁种，于后代植株中分离不含转基因成分的功能缺失的突变体，即为稻米镉含量降低的水稻；
其中，在步骤（1）中，OsNCX8的外显子序列如SEQ ID NO:1所示，用于克隆水稻受体材料的OsNCX8的外显子序列的上游引物序列为：F1：5’-ATGGCGCTCCTGCGCAGGCGG-3’，其为SEQID NO:2所示；用于克隆水稻受体材料的OsNCX8的外显子序列的下游引物序列为：R1：5’-CTATGCTGGCCACCAGGAGT-3’，其为SEQ ID NO:3所示；
其中，在步骤（2）中，所述的靶标序列如SEQ ID NO:4所示。
2.根据权利要求1所述的降低水稻籽粒镉含量的育种方法，其特征在于，所述步骤（3）具体包括以下步骤：
a. 根据靶标序列，设计带粘性末端的接头引物；
b. 将带粘性末端的接头引物退火互补形成带粘性末端的双链小片段；
c. 酶切包含sg-RNA的原始载体；
d. 将带粘性末端的双链小片段连接到酶切过的sg-RNA载体上，形成包含靶标序列和sg-RNA的重组载体；
e. 用LRmix将包含靶标序列和sg-RNA的重组载体和包含Cas9的载体进行LR反应重组，形成包含靶标序列-sg-RNA+ Cas9的完整的重组载体。
3.根据权利要求2所述的降低水稻籽粒镉含量的育种方法，其特征在于，在步骤a中，所述接头引物包括F2引物和R2引物，所述F2引物的序列如SEQ ID NO:5所示，所述R2引物的序列如SEQ ID NO:6所示。
4.根据权利要求2所述的降低水稻籽粒镉含量的育种方法，其特征在于，在步骤c中，采用BsaⅠ酶酶切包含sg-RNA的原始载体。
5.根据权利要求1所述的降低水稻籽粒镉含量的育种方法，其特征在于，在步骤（6）中，利用所述转基因阳性植株获得突变植株的具体步骤为：提取转基因阳性植株的DNA，设计特异性引物，扩增含靶标位点的DNA片段，对PCR扩增产物进行测序，选取OsNCX8开放阅读框发生移码突变提前终止或缺失起始密码子的纯合突变株系作为突变植株。
6.根据权利要求5所述的降低水稻籽粒镉含量的育种方法，其特征在于，所述特异性引物包括F3引物和R3引物，所述F3引物的序列如SEQ ID NO:7所示，所述R3引物的序列如SEQID NO:8所示。
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