CN105755021A - 一种水稻耐镉基因OsGSTU37及其应用 - Google Patents

一种水稻耐镉基因OsGSTU37及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN105755021A
CN105755021A CN201610249072.9A CN201610249072A CN105755021A CN 105755021 A CN105755021 A CN 105755021A CN 201610249072 A CN201610249072 A CN 201610249072A CN 105755021 A CN105755021 A CN 105755021A
Authority
CN
China
Prior art keywords
osgstu37
cadmium
resistance
seq
rice
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201610249072.9A
Other languages
English (en)
Inventor
秦瑞英
杨剑波
李莉
杨亚春
魏鹏程
李�浩
李娟�
许蓉芳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Rice Research Institute of Anhui Academy of Agricultural Sciences
Anhui Academy of Agricultural Sciences
Original Assignee
Rice Research Institute of Anhui Academy of Agricultural Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Rice Research Institute of Anhui Academy of Agricultural Sciences filed Critical Rice Research Institute of Anhui Academy of Agricultural Sciences
Priority to CN201610249072.9A priority Critical patent/CN105755021A/zh
Publication of CN105755021A publication Critical patent/CN105755021A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1085—Transferases (2.) transferring alkyl or aryl groups other than methyl groups (2.5)
    • C12N9/1088—Glutathione transferase (2.5.1.18)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y205/00—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5)
    • C12Y205/01—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5) transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5.1)
    • C12Y205/01018—Glutathione transferase (2.5.1.18)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

本发明公开了一种水稻耐镉基因OsGSTU37及其应用。该水稻耐镉基因OsGSTU37序列如序列表中SEQ ID NO:1中所示，其编码的蛋白质谷胱甘肽S?转移酶(glutathione S?transferase,GSTs)氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示。本发明通过酵母异位表达证明OsGSTU37基因具有对镉毒害耐受的特性。本发明通过构建水稻耐镉基因OsGSTU37的敲除系和过表达系，与野生型水稻做种子萌发对比实验，发现在镉胁迫下OsGSTU37的敲除系发芽较差，而OsGSTU37的过表达系和野生型均能发芽，且OsGSTU37的过表达系发芽生长优于野生型。同样说明OsGSTU37在耐镉机制中具有重要作用。本发明构建耐镉基因OsGSTU37过表达载体，并将其转化植物，获得耐镉的植物品种，提高植物对镉胁迫的抗性，为耐镉的作物新品种的培育提供了理论基础。

Description

一种水稻耐镉基因OsGSTU37及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术和作物基因工程技术领域。具体地，本发明涉及一种水稻耐镉基因OsGSTU37及其编码蛋白与应用。
背景技术
根据2014年4月17日首次发布的“全国土壤污染状况调查公报”，我国耕地土壤环境质量堪忧，土壤污染点位超标率为19.4％，主要污染物为镉、镍、铜、砷、汞、铅、锑和多环芳烃，其中镉点位超标率为7.0％，居污染之首。镉作为植物生长的非必需元素，严重影响植物的正常生长，植物受镉毒害，导致根系活力降低，光合作用降低，生长被抑制直至死亡。植株受Cd2+危害时，还会激活逆境胁迫途径，产生活性氧物质(Reactive OxygenSpecies，ROS)，间接地给植物生长带来毒害(Mithofer et al.，2004)。镉在植物中富集后还可通过食物链危及人类和动物的健康。
水稻是我国主要的粮食作物之一，水稻对镉有一定的耐受性，水稻较其他作物易吸收和富集镉，我国约有十分之一的市售大米镉含量超标。研究发现较低浓度的镉可以促进水稻的生长，镉含量超过一定量会抑制水稻的正常生长，镉离子能抑制蛋白酶和肽酶活性，从而抑制水稻种子的萌发和生长，严重影响水稻的产量和品质。镉在环境中不能降解，降低和消除镉污染成为一个亟待解决的问题。通过换土、优化水肥或者全生育期淹水等措施都可以缓解镉对水稻的毒害，降低稻米中的镉含量，但这会大大增加种植成本。因此，用基因工程的方法改良农作物的耐镉性，培育镉积累量低的品种，是减少稻米镉污染的一个经济且有效的途径。
研究表明，同样的镉污染，不同品种的水稻耐镉能力和镉积累能力存在很大差异。在耐镉水稻品种中获取耐镉基因。研究水稻对镉吸收、转运及对镉胁迫的抗性机理，对耐镉基因的生理特性及调控机制进行研究，应用耐镉基因增强植物对镉的耐受性和清除能力，培育耐镉作物，降低镉污染对作物及人畜的健康威胁。水稻作为单子叶植物的模式生物，从中分离获得的耐镉基因具有重要的推广价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种水稻耐镉基因OsGSTU37及其编码蛋白OsGSTU37及耐镉基因OsGSTU37在培育耐镉植物中的应用。
首先，本发明提供一种水稻耐镉基因，将其命名为水稻耐镉基因OsGSTU37或基因OsGSTU37，其来源于水稻品种日本晴(Oryza sativa L cv.Nipponbare)。其编码蛋白是OsGSTU37，该编码蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示或者由序列表中SEQ ID NO:2经取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基后与SEQ ID NO:2限定的蛋白质具有相同功能的序列。需要说明的是，上面的表述中，根据生物科学语言的表述规则，大写斜体的英语名称OsGSTU5表示为基因；而大写正体的英语名称OsGSTU5则表示为蛋白。
在另一种实现方式中，水稻耐镉基因OsGSTU37的核苷酸序列选自下列核苷酸序列之一：
(a)序列表中SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列；或者
(b)序列表中在SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列中添加一个或多个核苷酸后所获得的核苷酸序列；或者
(c)在序列表中SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列中取代一个或多个核苷酸后所获得的核苷酸序列；或者
(d)在序列表中SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列中缺失一个或多个核苷酸后所获得的核苷酸序列；或者
(e)在严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列杂交的核甘酸序列；或者
(f)与序列表中SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列具有90％以上同源性，且编码相同蛋白质的核苷酸序列。
另一方面，本发明提供一种水稻耐镉基因OsGSTU37的酵母异位表达方法。具体而言，在该方法中，依据水稻耐镉基因OsGSTU37的编码区(CDS)序列设计扩增引物，以水稻cDNA为模板，利用引物扩增基因OsGSTU37，用NcoI和BamHI对基因OsGSTU37和酵母表达载体pART1进行双酶切，将基因酶切片段与大载体片段用T4DNA连接酶进行连接，构建基因OsGSTU37的酵母表达载体，并转化酵母细胞。酵母体内耐镉试验显示：非镉胁迫下空载体及该基因的酵母长势一致；而在50μM CdCl2胁迫下对照载体酵母生长受到严重抑制，而表达OsGSTU37的酵母仍然可以部分生长。酵母体内试验证明OsGSTU37具有耐镉特性。
另一方面，本发明提供获得一种耐镉基因OsGSTU37过表达株系的方法。具体而言，本发明依据水稻耐镉基因OsGSTU37的CDS序列设计扩增引物，并根据选用的载体，设计引物的酶切位点。以基因OsGSTU37的cDNA为模板利用引物扩增获得基因OsGSTU37，将基因OsGSTU37克隆入植物双元表达载体pCAMBIA1300中，获得耐镉基因OsGSTU37的过表达载体，利用冻融法将过表达载体转入根癌农杆菌，通过农杆菌介导转化植物，获得耐镉基因OsGSTU37的过表达植株。
本发明所用植物双元表达载体pCAMBIA1300，经过本实验室改造，利用玉米Ubiquitin启动子驱动目的基因表达，并融合FLAG标签。
再一方面，本发明提供一种获得耐镉基因OsGSTU37敲除株系的方法，该方法包括：利用CRISPR/Cas9系统对耐镉基因OsGSTU37的1个位点(KO)进行靶向敲除，利用pHUN411构建打靶载体，利用冻融法将打靶载体转入根癌农杆菌，通过农杆菌介导转化植物，获得缺失耐镉性能的基因OsGSTU37的无义突变植株。
为了验证本发明的耐镉基因的性状，本发明对野生型，耐镉基因OsGSTU37敲除系及过表达系种子进行萌发实验。在非镉胁迫下野生型、OsGSTU37敲除系及过表达系均能正常生长；而在100μM浓度Cd2+胁迫下进行发芽试验，10天后观察发现OsGSTU37的敲除系发芽较差，而OsGSTU37的过表达系和野生型均能发芽，且OsGSTU37的过表达系发芽生长优于野生型(图7)。说明OsGSTU37在耐镉机制中具有重要作用。
本发明所用的转化方法为农杆菌介导转化方法。
本发明被转化的植物宿主包括粮食作物、蔬菜作物、花卉作物、能源作物，优选为水稻。
本发明还提供一种耐镉基因OsGSTU37在提高植物对镉胁迫的抗性，培育耐镉植物中的应用。该应用包括：(1)、构建耐镉基因OsGSTU37过表达载体，(2)、利用该耐镉基因OsGSTU37过表达载体转化植物细胞、组织或器官，培育获得耐镉的转基因植物。为耐镉的作物新品种的培育提供了理论基础。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1中A为非镉胁迫下酵母长势图，图中OsGSTU37与空载体的酵母长势一致；B为50μM CdCl2胁迫下酵母长势图，图中空载体酵母生长受到严重抑制，OsGSTU37的酵母仍然可以部分生长。
图2为水稻耐镉基因OsGSTU37过表达载体酶切验证图。
图3为水稻耐镉基因OsGSTU37的过表达载体示意图。
图4为水稻耐镉基因OsGSTU37的T2代过表达植株相对表达量。
图5为部分敲除系转基因植株PCR检测结果图。
图6为T0代单拷贝敲除株系中OsGSTU37靶向突变。下划线“＿”标记为靶向位点；浅色标记为NGG结构；短线“-”标记为碱基缺失；圆圈“○”标记为插入或替换碱基；右侧标记表示突变情况，i为碱基插入，d缺失，s替换，其后数字表示突变碱基数目和出现次形式。
图7为野生型水稻与基因OsGSTU37过表达系、敲除系水稻种子萌发试验结果。在非镉胁迫下野生型、OsGSTU37敲除系和过表达系均能正常发芽生长；而在100μM浓度Cd2+胁迫下进行发芽试验，10天后观察发现相比于野生型植株，OsGSTU37敲除系萌发和生长受到严重抑制(图5)；OsGSTU37的过表达系发芽生长优于野生型。
具体实施方式
以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的生化试剂，载体耗材等，如无特殊说明，均为市售购买产品。下述实施例中的培养基配置参照《分子克隆实验指南》。
实施例1水稻耐镉基因OsGSTU37的酵母异位表达
步骤1、引物的设计
根据NCBI中提供的水稻品种日本晴(Oryza sativa L cv.Nipponbare)全基因组序列，依据水稻耐镉基因OsGSTU37的编码区(CDS)序列(SEQID NO:3)设计扩增引物，并在引物上加上酶切位点。
具体设计的引物为：正向引物(SEQ ID NO:4)5’端带NcoI，酶切位点(CCATGG)，反向引物(SEQ ID NO:5)5’端带BamHI，酶切位点(GGATCC)，引物序列如下：
正向引物：CCATGGATGGCCGATCCGGTTAAGCTCA NcoI
反向引物：GGATCCCTGATGCACCATCGCCCTGAAC BamHI
步骤2基因OsGSTU37的获得
以水稻cDNA为模板，利用上述正向引物、反向引物扩增基因OsGSTU37，克隆所用的酶为HIFI高保真聚合酶(购自tranGen公司)，采用如下扩增程序：
95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；最后72℃延伸10min。
回收PCR扩增的目的片段，目的片段长度690bp，将其连接到pEASY-BluntSimple T载体(购自transGen公司，按载体说明书中的比例混合)上，按照热激法转化大肠杆菌XL-Blue感受态细胞后，使感受态细胞激活，进而将目的片段转入到激活的感受态细胞中，然后，经菌落PCR筛选获得阳性克隆，挑取单克隆摇菌液提质粒，用NcoI和BamHI进行双酶切验证，将经过鉴定的阳性克隆送交铂尚公司测序。验证正确的克隆即为所要获得的基因OsGSTU37。
步骤3酵母表达载体的构建
提取基因OsGSTU37阳性克隆质粒，用NcoI和BamHI双酶切，回收基因OsGSTU37片段。同时利用NcoI和BamHI对酵母表达载体pART1(购自addgene公司)进行线性化处理、回收，将上述的基因OsGSTU37片段和pART1大载体片段用T4DNA连接酶(购于TaKaRa公司)进行连接，按照热激法转化大肠杆菌XL-Blue感受态细胞后，使感受态细胞激活，进而将目的片段转入到激活的感受态细胞中，然后，经菌落PCR筛选获得阳性克隆，挑取单克隆摇菌液提质粒，用NcoI和BamHI进行双酶切验证，将经过鉴定的阳性克隆送交铂尚公司测序。验证正确的克隆即基因OsGSTU37的酵母表达载体，命名为pART1-OsGSTU37。
步骤4酵母转化
(1)从-80℃冰箱中取出酵母空菌株JS23(安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存)，在YPD固体培养基上划线生长，30℃培养2～3天；
(2)从YPD固体培养平板上分别挑取单个直径约为2mm的克隆至20mLYPD液体培养基中，30℃，250rpm振荡过夜(16-18小时)，至OD600为0.6～0.8；
(3)4000×g离心5分钟，将上述培养基中的酵母菌收集在1.5mL离心管中；
(4)弃上清，加入1mL的ddH2O，震荡重悬，6000×g离心5分钟；
(5)弃上清，并用枪头将剩余液体吸尽，依次加入160μL ddH2O、20μL10×TE buffer(pH 7.5)、20μL 10×LiAc(pH 7.5)，加完一种试剂混匀，再加入另一种试剂。
(6)加入20μL煮沸10min后速冷的鲑鱼精DNA和2μL pART1-OsGSTU37载体质粒，pART1空载体做对照。
(7)按序加入1.2mL PEG溶液(包括960μL 50％PEG，120μL 10×TEbuffer，120μL 10mM LiAc)；
(8)混匀后于30℃温育30min(100r/min)；
(9)42℃热击15min(其间不时混匀)；
(10)6,000g室温离心15s；
(11)弃上清，加入150μL ddH2O重悬，涂布于Leu固体培养基上；
(12)30℃培养2～3d后观察菌落生长情况。
步骤5OsGSTU37酵母体内耐镉试验
将pART1-OsGSTU37酵母表达载体质粒验证正确的单克隆及pART1空载体单克隆酵母菌，溶于0.9％的NaCl中，调OD600值为0.2、0.02、0.002、0.0002、0.00002，吸取各个浓度的菌液6μL分别滴于leu固体培养基和含浓度50、100和200μM浓度Cd2+leu固体培养基上，30℃恒温培养箱倒置培养3-5天。
结果显示：非镉胁迫下空载体及该基因的酵母长势一致(图1-A)；而在50μM CdCl2胁迫下对照载体酵母生长受到严重抑制，而表达基因OsGSTU37的酵母仍然可以部分生长(图1-B)。酵母体内试验证明基因OsGSTU37具有耐镉特性。
实施例2水稻耐镉基因OsGSTU37过表达系的获得
1.1、基因OsGSTU37的过表达载体的构建
步骤1、引物的设计
根据NCBI中提供的水稻品种日本晴(Oryza sativa L cv.Nipponbare)全基因组序列，依据水稻耐镉基因OsGSTU37的CDS(SEQ ID NO:3)序列设计扩增引物，并根据选用的载体，设计引物的酶切位点。
构建过表达载体用pCAMBIA1300，该载体的整个编码框由玉米Ubiquitin基因启动子驱动，并融合FLAG标签。具体设计的引物为：正向引物(SEQ ID NO:6)5’端带HindIII，酶切位点(AAGCTT)，反向引物(SEQID NO:7)5’端带KpnI，酶切位点(GGTACC)，引物序列如下：
正向引物：AAGCTTATGGCCGATCCGGTTAAGCTCA HindIII
反向引物：GGTACCCTGATGCACCATCGCCCTGAAC KpnI
步骤2基因OsGSTU37的获得
以基因OsGSTU37的cDNA为模板，利用上述正向引物、反向引物扩增基因OsGSTU37，克隆所用的酶为HIFI高保真聚合酶，采用如下扩增程序：
95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；最后72℃延伸10min。
回收PCR扩增的目的片段，目的片段长度690bp，将其连接到pEASY-BluntSimple T载体(购自trans公司，按载体说明书中的比例混合)上，按照热激法转化大肠杆菌XL-Blue感受态细胞后，使感受态细胞激活，进而将目的片段转入到激活的感受态细胞中，然后，经菌落PCR筛选获得阳性克隆，挑取单克隆摇菌液提质粒，用HindIII和KpnI进行双酶切验证，将经过鉴定的阳性克隆送交铂尚公司测序。验证正确的克隆即为所要获得的基因OsGSTU37。
步骤3基因OsGSTU37过表达载体的构建和农杆菌的转化
提取基因OsGSTU37阳性克隆质粒，用HindIII和KpnI双酶切，回收基因OsGSTU37片段。同时利用HindIII和KpnI对pCAMBIA1300进行线性化处理、回收pCAMBIA1300，将上述的基因OsGSTU37片段和pCAMBIA1300片段用T4DNA连接酶(购于TaKaRa公司)进行连接，按照热激法转化大肠杆菌XL-Blue感受态细胞后，使感受态细胞激活，进而将目的片段转入到激活的感受态细胞中，然后，经菌落PCR筛选获得阳性克隆，挑取单克隆摇菌液提质粒，用HindIII和KpnI进行双酶切验证(图2)，将经过鉴定的阳性克隆送交铂尚公司测序。验证正确的即基因OsGSTU37的过表达载体克隆(图3)。
利用冻融法将基因OsGSTU37过表达载体转入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105(安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存)。
1.2基因OsGSTU37过表达株系的获得
步骤1：农杆菌介导的水稻遗传转化
水稻成熟种子去掉颖壳后，用70％酒精浸泡种子1min，倒掉酒精。用含有1滴Tween 20的50％次氯酸钠(原液有效氯浓度大于4％)溶液浸泡种子30min(150r/min)。倒掉次氯酸钠，无菌水洗5遍至溶液澄清，无次氯酸钠味道。无菌水浸泡种子过夜。用解剖刀沿种子的糊粉层将胚剥下，将胚接种于愈伤诱导培养基上。30℃下暗培养11天后将愈伤组织与胚乳及胚芽分离，将去芽的状态良好、分裂旺盛的初级愈伤组织进行预培养3～5天后用于农杆菌转化。
采用上述“基因OsGSTU37过表达载体的构建和农杆菌的转化”过程中转入了重组表达载体的根癌农杆菌进行农杆菌介导的遗传转化，该遗传转化、转化子筛选及转基因植株再生等参照Yongbo Duan(Yongbo Duan，Chenguang Zhai，et al.An efficient and high-throughput protocol forAgrobacterium mediated transformation based on phosphomannose isomerasepositive selection in Japonica rice(Oryza sativa L.)[J].Plant Cell Report，2012.DOI 10.1007/s00299-012-1275-3.)等提出的方法。
1.3过表达植株的相对表达量的鉴定
提取各转基因苗的总RNA，并反转录成cDNA，用Real-Time-PCR的方法检测其表达量，RT-PCR采用天根公司SuperReal PreMix Plus(SYBRGreen)试剂盒。以水稻Actin基因作为内标对所用RNA模板量进行定量。
反应体系：
采用两步法PCR进行扩增，反应条件：95℃30s，95℃5s，60℃34s，40个循环，进入溶解曲线分析程序。
引物序列如下(SEQ ID NO:8-11)：
RT GSTU37 FP：5'-CAAGGGAGTTGCCTACGAGC-3'
RT GSTU37 RP：5'-TGTGGACAGGGTTGCTAGCG-3'
Actin FP：5'-CCTGACGGAGCGTGGTTAC-3'
Actin RP：5'-CCAGGGCGATGTAGGAAAGC-3'
本实验对过表达T1代植株用RT-PCR进行拷贝数的鉴定，同时也做了在潮霉素筛选压上分离比的筛选以及阳性转基因植株的鉴定，最终选择低拷贝而且在潮霉素筛选压的分离比接近3：1的阳性植株进行水稻正季繁代。然后用RT-PCR的方法对过表达T2代植株的基因表达量进行检测，定量引物为水稻OsGSTU37基因特异探针并以Actin为内参，以同时期日本晴(WT)为对照。结果显示，基因OsGSTU37在两株T2代基因OsGSTU37过表达转基因株系中的相对表达量约为日本晴(WT)的100倍(图4)。
实施例3水稻耐镉基因OsGSTU37敲除系的获得
1.1水稻耐镉基因OsGSTU37敲除载体的构建
根据NCBI中提供的水稻品种日本晴(Oryza sativa L cv.Nipponbare)全基因组序列，依据水稻耐镉基因OsGSTU37的序列，在该基因的外显子上设计1个靶位点KO(SEQ ID NO:12)引物，靶位点的设计时注意最后位点的PAM序列要求为NGG即可，引物序列如下(SEQ ID NO:13-14)：
KO FP:TGTGTACTGGAGGCACAGCTCGAG
KO RP:AAACCTCGAGCTGTGCCTCCAGTA
引物充分溶解后，按表1的体系将引物退火。
表1引物退火体系
反应条件：37℃，1h。
加入2.5ul 1M NaCl，95℃，5s。将孵育器关掉，让其自然退火2～3h。加入450uL的超纯水，使得探针终浓度为10mM。
所用的表达载体是pHUN411(自addgene公司公开获取),对表达载体酶切。将打靶基因ko的退火片段溶于用BsaI单切的pHUN411表达载体中，按照热激法转化大肠杆菌XL-Blue感受态细胞后，使感受态细胞激活，进而将目的片段转入到激活的感受态细胞中，然后，我们采取负筛选的方式获得阳性克隆(Kana板长，Spec不长)，挑取单克隆摇菌液提质粒，送交铂尚公司测序。验证正确的克隆即为所要的打靶载体，命名为pHUN411-GSTU37ko。
1.2敲除载体转化EHA105/pSOUP农杆菌感受态细胞
利用冻融法将打靶载体pHUN411-GSTU37ko转入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105/pSOUP(安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存)。
1.3水稻遗传转化和T0代转化植株PCR鉴定
水稻遗传转化步骤如前所述。水稻转化获得pHUN411-GSTU37ko植株20株。对这些转化植株进行了叶片基因组DNA的提取后，根据筛选标记潮霉素中编码潮霉素磷酸转移酶的基因hpt序列，设计引物，对基因组DNA进行了PCR扩增。引物序列为(SEQ ID NO:15-16)：
Hpt FP:5’-CGCCGATGGTTTCTACAA-3’
Hpt RP:5’-CGCCGATGGTTTCTACAA-3’
扩增片段长度为827bp。绝大部分的PCR扩增结果为阳性(如图5)，由此证明我们已经成功的获得了融合打靶载体的水稻转化植株。
1.4基因OsGSTU37突变检测
首先提取单拷贝转化植株基因组DNA，根据NCBI分析结果，设计OsGSTU37的特异引物(SEQ ID NO:17-18)：
OsGSTU37 ko genome FP：CAGCTCAAGGGAGTTGCCTA
OsGSTU37 ko genome RP：TGCAGCGAAGGATACTCGTC
以转化植株的基因组DNA做模板进行目的片段的克隆，克隆所用的酶为HIFI高保真聚合酶，采用如下扩增程序：
95℃预变性3min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；最后72℃延伸10min。
克隆、回收目的片段，连接T载体，单菌落经测序看OsGSTU37突变情况，结果(见图6)表明已成功获得了2个无义突变株系。选取其中低拷贝植株(#1)进行了自交得到T1代种子，对T1代苗进行鉴定，得到一株纯和无T-DNA插入的稳定遗传的株系(#1-1)，突变形式为i1bi1b(在编码区出现纯合的1碱基插入)，收获T2代种子(#1-1-1)用于萌发试验。
实施例4镉胁迫下水稻耐镉基因OsGSTU37过表达系、敲除系与野生型种子萌发试验
对获得的OsGSTU37过表达系、敲除系T2种子与野生型种子去颖壳，70％乙醇浸泡，剧烈摇晃90s后，进行表面消毒，倒掉乙醇，加入50％的次氯酸钠(有效氯4％)和几滴Tween20浸泡20min(28℃，150r/min)，后用无菌水清洗干净。将洗好的种子分别接种于1/2MS培养基和含100μM浓度Cd2+的1/2MS培养基，于30℃、16h光照和8h黑暗条件下培养7-10d。结果显示，在非镉胁迫下野生型、OsGSTU37敲除系和过表达株系均能正常发芽生长；而在100μM浓度Cd2+胁迫下进行发芽试验，10天后观察发现相比于野生型植株，OsGSTU37敲除株系萌发和生长受到严重抑制；OsGSTU37的过表达系发芽生长优于野生型(图7)，说明OsGSTU37在耐镉机制中具有重要作用。
以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

Claims (10)

1.一种水稻耐镉基因OsGSTU37，其特征在于，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。
2.根据权利要求1所述的水稻耐镉基因OsGSTU37，其特征在于，所述水稻耐镉基因OsGSTU37的核苷酸序列选自下列核苷酸序列之一
(a)序列表中SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列；或者
(b)序列表中在SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列中添加一个或多个核苷酸后所获得的核苷酸序列；或者
(c)在序列表中SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列中取代一个或多个核苷酸后所获得的核苷酸序列；或者
(d)在序列表中SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列中缺失一个或多个核苷酸后所获得的核苷酸序列；或者
(e)在严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列杂交的核甘酸序列；或者
(f)与序列表中SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列具有90％以上同源性，且编码相同蛋白质的核苷酸序列。
3.一种水稻耐镉基因OsGSTU37的编码蛋白OsGSTU37，其特征在于，其蛋白质氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，或者是将序列表中SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸的取代、缺失或添加且具有与序列表中SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列相同的活性的由SEQ ID NO:2衍生的蛋白质，编码所述蛋白氨基酸序列的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。
4.一种水稻耐镉基因OsGSTU37的酵母异位表达方法，其特征在于，所述方法如下：构建水稻耐镉基因OsGSTU37的酵母表达载体，将其转化酵母细胞进行异位表达，优选地，所述酵母表达载体为pART1。
5.一种权利要求1或2所述的水稻耐镉基因OsGSTU37在提高植物对镉胁迫的抗性、培育耐镉植物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用包括：
(1)、构建水稻耐镉基因OsGSTU37的过量表达载体，
(2)、将所述过量表达载体转化到植物细胞、组织或器官中进行培育获得转基因植株，
(3)、从培育所得植株中筛选获得耐镉的植株。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述过量表达载体为植物双元表达载体pCAMBIA1300，由玉米Ubiquitin基因启动子驱动基因表达。
8.一种获得水稻耐镉基因OsGSTU37的敲除系的方法，其特征在于，所述方法包括：利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，针对OsGSTU37基因的1个位点构建了靶向敲除载体，并将其转化到植物细胞、组织或器官中进行培育，获得无义突变植株。
9.根据权利要求8所述方法，其特征在于，所述方法采用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建打靶载体，优选地，打靶载体为pHUN411，优选地，所述1个位点为KO，所述转化方法为农杆菌介导转化方法。
10.根据权利要求8或9所述方法，其特征在于，所述植物为作物，包括粮食作物、蔬菜作物、花卉作物、能源作物，优选为水稻。
CN201610249072.9A 2016-04-19 2016-04-19 一种水稻耐镉基因OsGSTU37及其应用 Pending CN105755021A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610249072.9A CN105755021A (zh) 2016-04-19 2016-04-19 一种水稻耐镉基因OsGSTU37及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610249072.9A CN105755021A (zh) 2016-04-19 2016-04-19 一种水稻耐镉基因OsGSTU37及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105755021A true CN105755021A (zh) 2016-07-13

Family

ID=56324624

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610249072.9A Pending CN105755021A (zh) 2016-04-19 2016-04-19 一种水稻耐镉基因OsGSTU37及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105755021A (zh)

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106544357A (zh) * 2016-08-25 2017-03-29 湖南杂交水稻研究中心 一种培育镉低积累籼稻品种的方法
CN108265077A (zh) * 2018-04-10 2018-07-10 湖南文理学院 一种降低水稻籽粒镉含量的育种方法
CN108517007A (zh) * 2018-03-07 2018-09-11 上海交通大学 VdPHB基因在抗棉花黄萎病菌中的应用
CN110257488A (zh) * 2019-05-13 2019-09-20 江西省超级水稻研究发展中心(江西省农科院海南水稻育种中心) 一种OsNramp5基因特定位点突变的高分辨率溶解曲线检测方法
CN110773562A (zh) * 2019-11-05 2020-02-11 北京高能时代环境技术股份有限公司 一种重金属-多环芳烃复合污染土壤中多环芳烃的微生物修复方法
CN112662701A (zh) * 2020-12-31 2021-04-16 浙江大学 miRNA 408在调控作物镉积累中的应用
CN114045296A (zh) * 2021-09-29 2022-02-15 上海交通大学 一种蛋白质及其相关产品和用途
CN114410658A (zh) * 2022-03-11 2022-04-29 四川农业大学 一种降低水稻糙米镉含量的基因OsWNK9及其编码蛋白和应用
CN114540373A (zh) * 2022-03-11 2022-05-27 四川农业大学 一种降低水稻籽粒中镉含量的基因及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103483438A (zh) * 2013-09-26 2014-01-01 合肥工业大学 一种用于植物土壤镉污染修复的基因及其编码蛋白与应用
CN104928318A (zh) * 2015-07-14 2015-09-23 重庆大学 水稻OsLEA5c-1基因在培育抗重金属水稻品种中的应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103483438A (zh) * 2013-09-26 2014-01-01 合肥工业大学 一种用于植物土壤镉污染修复的基因及其编码蛋白与应用
CN104928318A (zh) * 2015-07-14 2015-09-23 重庆大学 水稻OsLEA5c-1基因在培育抗重金属水稻品种中的应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SONALI DUBEY ET AL: "Transcriptomic and metabolomic shifts in rice roots in response to Cr (VI) stress", 《BMC GENOMICS》 *
UNIPROT: "UniProtKB-B7FAD4(B7FAD4_ORYSJ)", 《UNIPROT》 *
邱春红: "水稻镉诱导启动子的分离和功能分析", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库》 *

Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106544357B (zh) * 2016-08-25 2018-08-21 湖南杂交水稻研究中心 一种培育镉低积累籼稻品种的方法
CN106544357A (zh) * 2016-08-25 2017-03-29 湖南杂交水稻研究中心 一种培育镉低积累籼稻品种的方法
CN108517007B (zh) * 2018-03-07 2020-11-06 上海交通大学 VdPHB基因在抗棉花黄萎病菌中的应用
CN108517007A (zh) * 2018-03-07 2018-09-11 上海交通大学 VdPHB基因在抗棉花黄萎病菌中的应用
CN108265077A (zh) * 2018-04-10 2018-07-10 湖南文理学院 一种降低水稻籽粒镉含量的育种方法
CN108265077B (zh) * 2018-04-10 2021-07-30 湖南文理学院 一种降低水稻籽粒镉含量的育种方法
CN110257488A (zh) * 2019-05-13 2019-09-20 江西省超级水稻研究发展中心(江西省农科院海南水稻育种中心) 一种OsNramp5基因特定位点突变的高分辨率溶解曲线检测方法
CN110773562A (zh) * 2019-11-05 2020-02-11 北京高能时代环境技术股份有限公司 一种重金属-多环芳烃复合污染土壤中多环芳烃的微生物修复方法
CN112662701A (zh) * 2020-12-31 2021-04-16 浙江大学 miRNA 408在调控作物镉积累中的应用
CN114045296A (zh) * 2021-09-29 2022-02-15 上海交通大学 一种蛋白质及其相关产品和用途
CN114045296B (zh) * 2021-09-29 2024-05-14 上海交通大学 一种蛋白质及其相关产品和用途
CN114410658A (zh) * 2022-03-11 2022-04-29 四川农业大学 一种降低水稻糙米镉含量的基因OsWNK9及其编码蛋白和应用
CN114540373A (zh) * 2022-03-11 2022-05-27 四川农业大学 一种降低水稻籽粒中镉含量的基因及其应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105755021A (zh) 一种水稻耐镉基因OsGSTU37及其应用
CN104093844B (zh) Grf3突变体、方法和植物
CN102634522B (zh) 控制水稻育性的基因及其编码蛋白和应用
Zhai et al. Introduction of a rice blight resistance gene, Xa21, into five Chinese rice varieties through an Agrobacterium-mediated system
CN108642065A (zh) 一种水稻胚乳粉质相关基因OsSecY2及其编码蛋白质和应用
CN116515888A (zh) GmMTAs蛋白在调控大豆株高中的应用
CN107353332A (zh) 一种水稻叶绿体发育调控基因ahs1及其编码的蛋白质与应用
CN109477091A (zh) 用于基因内植物转化的构建体和载体
CN110540582A (zh) 蛋白质OrC1在调控水稻稃尖和芒颜色中的应用
CN110881367A (zh) 一种玉米事件t抗-4及其使用方法
CN104829699B (zh) 一种与植物抗逆性相关蛋白Gshdz4及其编码基因与应用
CN104628839B (zh) 一种水稻胚乳造粉体发育相关蛋白及其编码基因和应用
CN109971766A (zh) 一种与植物耐逆相关蛋白PwRBP1及其编码基因与应用
CN103739686A (zh) 与植物产量提高和品质改良相关的蛋白及编码基因与应用
CN105755022A (zh) 一种水稻耐镉基因OsGSTU5及其编码蛋白与应用
CN107325161B (zh) 一种与耐低氮胁迫和高盐胁迫相关的蛋白及其编码基因与应用
CN104087605B (zh) 培育分蘖数增加的转基因禾本科植物的方法及其相关生物材料
CN108690127B (zh) 抗逆相关蛋白TaMYB85及其编码基因与应用
CN105087589B (zh) 一种启动子元件OsEmb2及利用其培育转基因水稻的方法和应用
CN104073491A (zh) 植物高温诱导表达启动子Posheat2及其应用
CN104650204B (zh) 与水稻atp运输和叶绿体发育相关的蛋白及其编码基因和应用
CN103320463B (zh) 用RNAi技术控制水稻育性基因获得水稻不育系的方法
CN102559676A (zh) 水稻根特异性启动子及其应用
CN102660556B (zh) 小麦生长素合成基因TaYUCCA1序列及其应用和植物表达载体
CN112662687A (zh) 推迟玉米花期的方法、试剂盒、基因

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20160713