CN103483438A - 一种用于植物土壤镉污染修复的基因及其编码蛋白与应用 - Google Patents

一种用于植物土壤镉污染修复的基因及其编码蛋白与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于植物土壤镉污染修复的基因及其编码蛋白与应用，其特征在于：该蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID No：2所示；核苷酸序列如SEQ ID No：1所示，本发明通过诱导或转入植物中上述耐镉蛋白编码基因的表达以增强植物对镉的耐受性，因此可以利用转基因技术克隆重组有上述基因的植株种植在镉污染的环境中以修复土壤环境。

Description

一种用于植物土壤镉污染修复的基因及其编码蛋白与应用
技术领域
本发明涉及生物工程领域，具体地说一种用于植物土壤镉污染修复的基因及其编码蛋白与应用，特别涉及利用该基因增加植物对镉毒害耐受及积累的方法。
背景技术
拟南芥作为一种模式植物，广泛用于植物遗传学、发育生物学和分子生物学等研究领域。拟南芥的大多数基因在其它植物中都能找到，有关拟南芥的任何发现都能应用于其它植物研究。因此，对拟南芥抗重金属毒害分子生物学机制的研究对特定区域提高作物的产量和增加食品安全性具有重要的理论与经济意义。拟南芥基因组已完全测序，根据拟南芥测序数据库（www.arabidopsis.org）寻找和发现新的具有自主知识产权的功能基因是国际植物学研究领域的热点之一，也是不同国家之间科技竞争的焦点。拟南芥共有约1.3亿个碱基对，2.9万个基因，其中大部分基因的功能还不清楚。
面对日益严重的重金属污染尤其是土壤污染问题，寻找耐受重金属的植物修复基因并阐明其功能具有重要的理论及实践意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的植物编码基因具有耐镉及增加植物镉吸收的新功能，该基因的过量表达可明显增强转基因植物对镉的耐受性。本发明所提供的植物耐镉及增加植物镉吸收相关蛋白的编码基因，命名为XCD2（AT5G04340），来源于哥伦比亚野生型的拟南芥，其蛋白是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：
（1）序列表中的SEQ ID No：2；
（2）将序列表中SEQ ID No：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐镉相关的蛋白质。
序列表中的SEQ ID No：2由238个氨基酸残基组成。
所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
所述植物耐镉蛋白的编码基因（XCD2）也属于本发明的保护范围。
XCD2基因，选自下述核甘酸序列之一；
（1）序列表中SEQ ID No：1的DNA序列；
（2）编码序列表中SEQ ID No：2蛋白质序列的多核苷酸；
（3）在严谨条件下可与序列表中SEQ ID No：1限定的DNA序列杂交的核甘酸序列；
（4）与序列表中SEQ ID No：l限定的DNA序列具有90%以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
序列表中的SEQ ID No：l由976个碱基组成，其开放阅读框架（ORF）为自5'端第70位至786位碱基，编码序列SEQ ID NO：2的蛋白质。
含有本发明XCD2的表达载体、细胞系和宿主菌均属于本发明的保护范围。扩增XCD2中任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。
本发明的第二个目的是提供一种利用该基因提高植物耐镉及将土壤中的镉富集到植物中的方法达到修复土壤镉污染的目的。
本发明所提供的提高植物耐镉及增加植物中镉含量的方法，该方法是将所述序列表SEQID No：1所示的植物耐镉蛋白编码基因转入植物中。
本发明提供一种土壤镉污染修复方法，其特点在于，将序列表SEQ ID No：1所示的植物耐镉蛋白编码基因转入植物中获得转基因植物，然后将所述转基因植物种植于镉污染土壤中，通过植物对镉污染土壤中镉元素的吸收进行土壤镉污染修复。
诱导植物中的上述植物耐镉相关蛋白编码基因XCD2的表达可通过植物转基因技术的过量表达实现。本发明激活基因表达的方法并不限于此种方法,只要能激活XCD2基因表达均可。
利用任何一种可引导外源基因的在植物中表达带有强启动子的载体，将本发明所提供的XCD2转入植物中，植物表现为耐镉。
本发明利用正向遗传学手段从化学诱导型激活标签子系统构建的XVE突变体库中筛选并通过表型鉴定得到功能获得型耐镉突变体xcd2－D，通过Tail-PCR技术获得其基因序列，经上海生工测序并在NCBI数据库中Blast比对，最后进行基因定位，获得一个新的耐镉基因XCD2。通过转基因技术，构建XCD2基因的过量表达载体，导入根癌农杆菌GV3101菌株中，用花絮浸渍法进行拟南芥植株的遗传转化，并用抗生素筛选出3株转化株，该转基因植株在镉胁迫下表现出明显的耐镉性状。
本发明的XCD2基因或其反义核酸在构建到植物表达载体中时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入植物可选择性标记(GUS基因、萤光素酶基因等)或具有抗性的抗生素标记物（庆大霉素，卡那霉素等）。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物或双子叶植物，如水稻、小麦、油菜、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草或苜宿等。携带有本发明XCD2基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导，农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物经组织培育成植株。
本发明XCD2（At5g04340）基因编码一个乙炔型锌指蛋白转录因子，诱导表达XCD2基因后xcd2－D突变体植株特异性对镉耐受。在BSO处理下xcd2－D突变体耐镉性状消失，说明该基因介导植株耐镉是依赖于GSH途径的。检测xcd2突变体中其他耐镉关键基因表达水平发现，GSH1基因表达量明显增加，说明XCD2基因可能激活GSH1基因表达参与植株抗镉过程。在野生型植株中过量表达该基因，植株表现出对镉耐受。敲除该基因，植株对镉胁迫敏感。检测xcd2－D突变体植株镉含量显示，突变体大量积累镉。因此，利用转基因技术克隆并过量表达XCD2基因的植株不但可提高农作物类耐镉生长，而且是土壤镉污染修复的良好材料。
本发明的植物耐镉相关蛋白及其编码基可为农作物耐镉育种及土壤镉污染修复材料提供基因与技术的支持（保障)。
附图说明
图1A-图1C是突变体xcd1和野生型（WT，下同）植株对镉耐受性比较（其中图1A 1/2MS,1/2MS+10μM β-estradiol,1/2MS+75μM CdCl2,1/2MS+10 μM-estradiol+75 μMCdCl2四种培养条件下表型；图1B根长比较；图1C鲜重比较）。
图2A-图2D是XCD2基因克隆（其中图2A是三轮PCR产物鉴定；图2B是T－DNA插入位点；图2C是T－DNA插入位点附近基因表达RT-PCR检测；图2D是T－DNA插入位点附近基因表达qRT-PCR检测）。
图3A-图3D是敲除XCD2基因的突变体的鉴定（其中图3A是分子水平鉴定；图3B是对镉的表型分析；图3C是根长比较；图3D是鲜重比较）
图4A-图4D是XCD2基因的35S过量表达（其中图4A是分子水平鉴定；图4B是表型分析；图4C是根长比较；图4D是鲜重比较）。
图5A-图5B是XCD2基因的表达导致植株体内的镉含量变化（其中，图5A是xcd2-D突变体与WT比较；图5B是过量表达、敲除突变体与WT比较）
图6A-图6D是xcd2和WT在1/2MS和10μM β-estradiol+75μM CdCl2条件下相关基因的表达水平（图中，图6A是AtPDR8基因；图6B是AtATM3基因；图6C是AtPCR1基因；图6D是GSH1基因）。
下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步的说明。
具体实施方式
下述实施例中的实验方法如无特别说明，均为常规方法。
实施例1、XCD2及其编码基因的获得
利用化学诱导激活XVE（LexA-VP16-ER）突变体系统，从含有100μMCdCl2的1/2MS培养基中筛选到的拟南芥幼苗为材料，用经典的CTAB法提取的突变体基因组DNA为模板，进行如下Tail-PCR反应（Yao-Guang Liu et al.,1995）：
Tail-PCR反应程序（共包括三轮反应，表1）：
Primary PCR（20μl反应体系）
Figure BDA00003882314400041
Secondary PCR（20μl反应体系）
Figure BDA00003882314400042
Tertiary PCR（20μl反应体系）
Figure BDA00003882314400043
Figure BDA00003882314400051
表1Tail-PCR的反应程序
Figure BDA00003882314400052
其中，巢式引物：LexA2、LexA3、LexA4、LexA5，LexA6，以及随机引物：AD1、AD2、AD3、AD4见表2。
表2Tail-PCR所用的引物序列
Figure BDA00003882314400061
将获得的Tail-PCR第三轮产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，得到的DNA片段纯化后经TA克隆，测序结果在NCBI数据库Blast后结果显示，vex载体插入在At5g04340基因的起始密码子ATG上游（图2）。在外加激素β-estradiol的诱导作用下，该载体的35S启动子起始转录,致使下游基因At5g04340激活表达。vex载体插入的下游基因片段具有序列表中序列SEQ ID No：1的DNA序列，为XCD2基因，由976个碱基组成，其cDNA序列长度为717bp，编码具有序列表中序列SEQ ID No：2的氨基酸残基序列的蛋白质。
实施例2、培育耐镉的拟南芥
1、耐镉突变体xcd2－D的获得及表型特征分析
利用化学诱导激活XVE（LexA-VP16-ER）突变体系统构建的独立转化株系的拟南芥突变体库（Zuo et al.,2000），在100μM CdCl2的胁迫条件和10μM外加激素β-estradiol的诱导作用下，在1/2MS培养基中分别播种WT和突变体水平培养1w，筛选到多株镉耐受的突变株，选择其中较大幼苗做后续研究，并通过表型鉴定得到功能获得型耐镉突变体xcd2－D（图1A-C）。
2、利用Tail-PCR技术克隆XCD2基因
利用Tail-PCR技术克隆xcd2-D突变体基因（图2A），BLAST及基因表达分析等技术确定了可能的XCD2基因。我们将DNA测序后的结果在Tail网站数据库中进行了比对结果显示最有可能插入在At5g04340上游(图2B)。分别在不同雌激素诱导下检测了与插入位点有关的三个基因在雌激素诱导下的表达量（图2C）。结果显示At5g04330和At5g04347两个基因表达量没有明显差异，而At5g04340在雌激素浓度增大诱导下，表达量也随之增大，在10微摩尔是其最适浓度，这与XVE系统原理符合，证明该基因极有可能是我们寻找的关键基因。为进一步精确结果，我们利用荧光定量在相同处理下进行了检测，结果与RT-PCR一致（图2D）。
3、XCD2敲除突变体的鉴定
我们购买了T-DNA插入使该基因沉默的突变体植株，进过纯合体鉴定后（图3A），进行表型验证（图3B）。表型结果和量化数据（图3C-D）显示，敲除材料对镉胁迫敏感，与激活后耐受的性状相互对应。进而确定AtXCD2就是突变体抗镉的关键基因。
4、XCD1基因的35S过量表达
4.1重组质粒构建及转化
根据XCD2的cDNA序列分别设计引物：
XCD2-KpnI:5'NNNGGTACCATGGCACTTGAAACTCTTACTTCTC3'（KpnI）；
XCD2-XhoI:5'NNNCTCGAGTTAGGGTTTCTCCGGGAAGTCA3'（XhoI）；
按以下程序扩增：95℃3min；94℃30sec，55℃30sec，72℃30sec，22cycle;72℃6min。高保真PCR产物经电泳回收后，用KopnI/XhoI双酶切。取1.5μg的植物表达pXB094质粒，用KopnI/XhoI双酶切后，将XCD2以正向插入到pXB094载体的相应位置构成含有CaMV35S启动子的pXB094-XCD2重组表达载体。该载体经测序并对阅读框进行验证后，通过农杆菌浸染拟南芥野生型植株高效表达。
4.2过量表达植株的鉴定
将转化植株的T1代二次抗性筛选后，收获T2代认为可能转化成功的植株进行分子水平上的鉴定。随机挑取T2代幼苗多株，分别移栽到外加100μM CdCl2的液体1/2MS培养基中培养48小时，抽提RNA并反转录，用RT-PCR验证XCD2基因表达量，结果获得了3株基因表达量较WT高的多的过量表达植株（图4A）。对该转基因株系进行表型分析，发现XCD2过表达的植株35S:XCD1对镉的耐受性显著增强（图4B），其根长和鲜重都要显著高于WT（图4C-D）。
5、XCD2基因的表达导致植株体内的Cd含量变化
由于XCD2的诱导激活会显著增强植株对重金属Cd的耐受性，那么突变体中的Cd含量是否也发生了变化，为此，我们以WT为对照，分析了突变体植株xcd2－D中Cd含量的变化。实验结果表明，用100μM CdCl2和10μM β-estradiol短期处理后，无论野生型还是突变体，根部的Cd含量均比地上部要高，且在根部，突变体xcd2－D相对于WT对镉的积累尤为明显（图5A）。
将XCD2基因过量表达植株和敲除突变体中的Cd含量与WT的Cd含量进行了比较，发现在根部过量表达植株的Cd含量比WT增高，敲除突变体的Cd含量比WT略低，而这种差异在地上部分的Cd含量中不太明显（图5B）。
以上证明XCD2基因与植株体内的Cd积累有关。
6、镉胁迫下相关基因的表达水平
由于该基因编码一种锌指蛋白转录因子，因此突变体抗重金属的作用是通过其下游调控的基因完成的。我们通过查阅文献找到了一些抗镉重要的基因AtGSH1、AtPDR8、AtATM3、AtPCR1进行qRT-PCR反应。我们应用qPCR检测了与镉胁迫耐受相关基因的表达水平，在1/2MS,1/2MS+10μ M β-estradiol,1/2MS+75μM CdCl2,1/2MS+10 μM-estradiol+75 μMCdCl2的培养条件下培养3w的拟南芥抽提RNA，RT后电泳检测并用定量PCR验证（图6A-D）。结果显示，在镉胁迫和激素诱导的环境下，GSH1基因在突变体中表达量升高，说明AtXCD2基因促进其表达最终体现抗镉性状。
Figure IDA00003882315200011
Figure IDA00003882315200021
Figure IDA00003882315200031
Figure IDA00003882315200041

Claims (6)

1.一种植物耐镉蛋白，其特征在于，所述蛋白是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：
（1）SEQ ID No：2所示的序列；
（2）将序列表中SEQ ID No：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐镉相关的蛋白质。
2.一种编码权利要求1所述植物耐镉蛋白的基因，其特征在于，所述基因选自下述核甘酸序列之一；
（1）序列表中SEQ ID No：1的DNA序列；
（2）编码序列表中SEQ ID No：2蛋白质序列的多核苷酸；
（3）在严谨条件下可与序列表中SEQ ID No：1限定的DNA序列杂交的核甘酸序列；
（4）与序列表中SEQ ID No：l限定的DNA序列具有90%以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；
所述序列SEQ ID No：1的开放阅读框架（ORF）为自5'端第70位至786位碱基，编码序列SEQ ID NO：2的蛋白质。
3.根据权利要求1所述的一种植物耐镉蛋白，其特征在于，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
4.含有权利要求2所述基因的表达载体、细胞系和宿主菌。
5.一种提高植物耐镉及增加植物中镉含量的方法，其特征在于，所述方法是将所述序列表SEQ ID No：1所示的植物耐镉蛋白编码基因转入植物中。
6.一种土壤镉污染修复方法，其特征在于，将序列表SEQ ID No：1所示的植物耐镉蛋白编码基因转入植物中获得转基因植物，然后将所述转基因植物种植于镉污染土壤中，通过植物对镉污染土壤中镉元素的吸收进行土壤镉污染修复。
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