CN104372000A - 拟南芥抗逆相关基因AtZAT6及制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种拟南芥抗逆相关基因 AtZAT6 及制备方法和应用，从拟南芥中获得一种分离的基因，其序列为SEQIDNo．1所示核苷酸序列。拟南芥 AtZAT6 基因的克隆：在液氮中将植物幼嫩叶片样品研磨，利用Trirol提取试剂盒进行RNA的提取。提取的总RNA溶于双蒸水中。去除残留的DNA。获得的RNA为模板进行逆转录。一种 AtZAT6 基因在增强植物干旱和盐抗性中的应用。通过该基因的过表达，可以人工创造抗性增强材料，通过构建该基因的超表达载体，转化拟南芥，获得有效的超表达转基因植株，为研究基因功能提供了一个有效的方法。通过比较OX- AtZAT6 超表达株与野生型拟南芥的抗性，发现OX- AtZAT6 超表达株在干旱和盐胁迫处理条件下的存活率是野生型拟南芥的两倍以上。

Description

拟南芥抗逆相关基因AtZAT6及制备方法和应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程和生物技术领域。更具体涉及一种增强植物对干旱和盐胁迫抗性的AtZAT6基因，同时还涉及一种拟南芥抗逆相关基因AtZAT6的制备方法，还涉及一种拟南芥抗逆相关基因AtZAT6在增强植物对干旱和盐胁迫抗性中的用途。 

背景技术

再全球气候变化条件下，温度的升高和降水格局的变化，各种环境因子胁迫单独或联合的作用将导致作物大幅度减产，并引发自然生态系统退化。在我国约有1/3的土地处于干旱区。干旱的威胁不只发生在北方干旱半干旱地区，年降水量大的南方湿润半湿润地区也会因雨量时空分布不均而经常发生强季节性干旱。土壤干旱严重影响了农作物的产量，带来了很大的危害，所以研究植物耐干旱机制，从而提供能提高植物耐干旱的各种措施或者直接培育耐干旱品种，显然意义重大。 

非生物胁迫（包括干旱、盐和冷害等）是植物生活史中不可避免的不利因素，这些逆境胁迫因子单独或者共同作用从而制约着农作物的生产。然而，植物由于自身不能移动，当遭受逆境环境时只能应答外界胁迫，从而进化出一系列复杂而精密的调控机制，来感受外部胁迫并传递信号，最终在分子、细胞和整个植株水平形成应激性反应。各种逆境胁迫首先被植物细胞膜上的感应器所感受，然后信号被传导到下游并且造成第二信使的产生，进而引起下游的一系列生理反应与基因表达调控，形成保护性反应。 

而在植物胁迫反应过程中，众多的转录因子承上启下，起着至关重要的作用。鉴定和利用关键的转录因子，对于改造农作物，提高抗性是非常重要的，其中一个被利用的转录因子家族就是锌指蛋白家族。锌指蛋白是真核生物中一类重要的转录因子，广泛参与到基因的转录、翻译、mRNA的运输、细胞骨架构建、细胞支持、蛋白折叠、染色质修饰等过程中。自从在矮牵牛中分离了植物中第一个锌指蛋白基因EPF1（ZPT2-1）以来，已经在拟南芥、矮牵牛、水稻、大豆、小盐芥和棉花等高等植物中陆续分离了近百个此类基因,这类基因广泛参与调控植物的生长发育和胁迫应答反应。因此，探究植物对各种胁迫的抗性机制，发现新的抗性基因具有深远意义。 

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种增强植物对干旱和盐抗性的拟南芥AtZAT6基因，该基因的组成型表达可以增强植物对干旱和盐胁迫的抗性，应用于抗性育种。 

本发明的另一个目的是在于提供了一种拟南芥AtZAT6基因的制备方法，方法易行，操作简便，根据SEQ ID No．1所示核苷酸序列，获得AtZAT6基因全长序列的电子克隆后，应用简单的PCR方法即可以获得该基因的序列。 

本发明的再一个目的是在于提供了一种拟南芥AtZAT6基因在增强植物对干旱和盐胁迫抗性中的应用。拟南芥AtZAT6基因的超表达显著增强了植物对干旱和盐胁迫的抗性。 

为了完成上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种拟南芥AtZAT6基因的制备方法，其步骤是：

1、拟南芥AtZAT6基因的克隆：

在液氮中将植物幼嫩叶片样品研磨至粉状，利用Trirol提取试剂盒（购自Invitrogen公司，以下相同）的要求进行RNA的提取。提取的总RNA溶于无RNase的双蒸水中。DNaseⅠ（购自Promega公司，以下相同）去除可能残留的DNA。用蛋白检测仪（DΜ 650 BECKMAN，ΜSA）分别检测RNA在260纳米和280纳米光吸收值，结合1%（质量体积比）琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的纯度及浓度。以获得的RNA为模板进行逆转录，得到的cDNA 分装后于-20℃保存备用。

根据拟南芥公共数据库TAIR（http://www.arabidopsis.org/）中拟南芥AtZAT6基因序列（At5g043400）,在该基因基因CDS（Coding seqμence，编码序列，以下相同）起始密码子和终止密码子同源区域设计引物（序列为F-5’-TCCCCCGGGATGGCACTTGAAACTCTTAC-3’，R-5’-CCGCTCGAGTTAGGGTTTCTCCGGGAAGT-3’），从而确保扩增产物为全长序列。以拟南芥的叶片的cDNA为模版，进行PCR扩增。回收并纯化扩增的PCR产物，连接到pEASY-T载体 （购自武汉群骏生物科技有限公司，详见遗传资源表） 上，用冻融法转化大肠杆菌DH5a（本实验室保存，详见遗传资源表），涂布于含有氨苄青霉素 50 μg/mL的LB固体（配方如下：分别称取10克胰蛋白胨，5克酵母提取物和10克氯化钠，8克琼脂依次溶解于蒸馏水中，定容于1000毫升。分装于500毫升三角瓶中， 121℃，6.859×104 Pa下高压消毒15分钟。4℃冷藏备用）平板上，37℃培养过夜，各挑选白斑三个，做菌落PCR检测：所用引物序列为：M13F 5′-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3; M13R  5’-GTAAAACGACGGCCAGT-3，以下相同），反应体系为：10×Taq酶反应缓冲液2 μl、25 mM MgCL₂ 1.2 μl、2 mM dNTP 1.5 μl、10 μM引物 0.2 μl、0.3单位Taq酶，加无菌水至20 μl。反应程序为：94℃变性5 min，94℃ 45 s、55℃ 45 s、72℃ 2 min 32循环，72℃延伸 5 min（以下相同）。以M13F/ M13R为引物（前面已述），将连接过的pEASY-T载体（购自武汉群骏生物科技有限公司，详见遗传资源表）进行序列测定，分析结果，获得了一种分离的基因，其序列为SEQ ID No．1 所示的核苷酸序列。 

2 、AtZAT6基因超表达载体（OX-AtZAT6）的构建和根癌农杆菌菌株GV3101转化： 

构建的重组载体是将已构建的质粒pBIM （本实验室保存，Yang LX, Wang RY, Ren F, Liu J, Cheng J, Lu YT （2005） AtGLB1 enhances the tolerance of Arabidopsis to hydrogen peroxide stress. Plant Cell Physiol 46: 1309-1316. 详见遗传资源表） 上的目的基因用前期克隆得到的AtZAT6基因替换而来。为完成此目的，首先用SmaI/XhoI双酶切克隆的AtZAT6基因片段，同时用SmaI/XhoI酶切pBIM质粒（本实验室保存，Yang LX, Wang RY, Ren F, Liu J, Cheng J, Lu YT （2005） AtGLB1 enhances the tolerance of Arabidopsis to hydrogen peroxide stress. Plant Cell Physiol 46: 1309-1316. 详见遗传资源表）。酶切反应在30度培养箱中进行，约4-6个小时之后，用1%（质量体积比）琼脂糖胶电泳检测。将酶切后的AtZAT6基因片段和pBIM质粒（本实验室保存，Yang LX, Wang RY, Ren F, Liu J, Cheng J, Lu YT （2005） AtGLB1 enhances the tolerance of Arabidopsis to hydrogen peroxide stress. Plant Cell Physiol 46: 1309-1316. 详见遗传资源表）上切下的大片段用DNA凝胶回收试剂盒（前面已述）回收。把AtZAT6基因片段比pBIM质粒（本实验室保存，Yang LX, Wang RY, Ren F, Liu J, Cheng J, Lu YT （2005） AtGLB1 enhances the tolerance of Arabidopsis to hydrogen peroxide stress. Plant Cell Physiol 46: 1309-1316. 详见遗传资源表）载体片段按3:1（摩尔浓度比）的比例混合样品，加入T4 DNA连接酶5个单位，10×反应缓冲液，无菌水补充体积至20 μL，16℃连接过夜。转化后，在含有卡那霉素（50 μg/mL）固体LB平板上筛选，挑斑做菌落PCR，以及提质粒，酶切验证正确的重组质粒命名为OX-AtZAT6,并对获得的载体进行测序以验证准确性。载体结构如图1所示。

然后利用冻融法（前面已述）将OX-AtZAT6转入根癌农杆菌GV3101（本实验室保存，Yang LX, Wang RY, Ren F, Liu J, Cheng J, Lu YT （2005） AtGLB1 enhances the tolerance of Arabidopsis to hydrogen peroxide stress. Plant Cell Physiol 46: 1309-1316. 详见遗传资源表），涂布于含有50 μg/mL卡那霉素和利福平（50 μg/mL）的LB固体（配方如下：分别称取10克胰蛋白胨，5克酵母提取物和10克氯化钠，8克琼脂依次溶解于蒸馏水中，定容于1000毫升。分装于500毫升三角瓶中， 121℃，6.859×104 Pa下高压消毒15分钟。4℃冷藏备用）平板上，37℃培养过夜，各挑选白斑三个，做菌落PCR检测（前面已述）。 

本发明所使用的研究AtZAT6基因功能的重组植物表达载体，含有所述AtZAT6基因的编码区核苷酸序列，组成型35S启动子（CaMV35S）可以增强AtZAT6基因的表达水平。该载体大小适合，在植物中易与转化，所带有的卡那霉素抗性标容易检测。通过这个载体转化拟南芥可以获得菌核病抗性增强的拟南芥转基因植株。 

3、AtZAT6基因超表达载体（OX-AtZAT6）的遗传转化： 

参照文献中的方法进行拟南芥转化（Zhang X.R. et al. Agrobacteriμm-mediated  transformation of Arabidopsis thaliana μsing the floral dip method. Natμre, 2006，1:1-6）。制备含有构建好载体的根癌农杆菌GV3101（本实验室保存，Yang LX, Wang RY, Ren F, Liu J, Cheng J, Lu YT （2005） AtGLB1 enhances the tolerance of Arabidopsis to hydrogen peroxide stress. Plant Cell Physiol 46: 1309-1316. 详见遗传资源表）菌液，在转化前一天转入含有卡那霉素50 μg/ml、利福平50 μg/ml的LB液体培养基中，28℃过夜培养。第二天，用紫外分光光度计（SPEKOL 1300）于276 nm纳米波长下检测的吸光值，当菌液的吸光值达到在1.6-2.0之间时取出。室温（20-25℃，以下相同）以4000 g离心10 min，弃上清，将沉淀悬浮于等体积的5%蔗糖（质量体积比）中。将浑浊的蔗糖溶液倒入一大培养皿中，转化前加入终浓度为0.02%（体积比）的Silwet L-77（购自北京五洲元业科贸中心，以下相同）。混匀后把待转化的拟南芥整个花序轻轻的浸没在蔗糖中，默数15s，取出植株。转化后的植株用一个黑色塑料袋包好，放在生长箱培养。第二天将塑料袋揭开，放在光强的地方培养。培养一个月左右收获种子，种子在培养箱或者日光下干燥3-5天。将转化收获的 T0代种子播在混有营养液的蛭石中（营养液成份为：每升含5ml 1 M KNO₃，2 ml 1 M Ca（NO₃）_2˙4H₂O，2 ml 1 M MgSO_4˙7 H₂O，2.5 ml 20 mM  Fe_˙EDTA， 2.5 ml 1 M磷酸缓冲液（pH5.5），1 ml MS 微量元素）；4℃春化一星期，在21-22℃的生长间中自然生长两星期左右，待到达四叶期的早期进行卡那霉素（50 μg/ml）的喷洒第一次，一星期之后进行第二次喷洒。两次喷洒后对存活的绿苗进行PCR阳性检测，获得拟南芥转基因阳性苗。

4、AtZAT6基因超表达载体（OX-AtZAT6）转化苗的筛选及抗性鉴定： 

根据以上卡那霉素（50 μg/ml）喷洒筛选，转基因T1代 （第一代）植株在苗期（播种后10天），得到成活植株。采用CTAB法（M.G. Mμrray and W.F. Thompson, Rapid isolation of high molecμlar weight plant DNA, Nμcleic Acids Research, 1980, Vol. 8, No. 19 4321-4326，以下相同）提取筛选后存活的拟南芥以及野生型拟南芥叶片DNA。根据表达载体上外源AtZAT6基因序列，设计引物进行PCR检测（序列为F-5’-TCCCCCGGGATGGCACTTGAAACTCTTAC-3’，R-5’-CCGCTCGAGTTAGGGTTTCTCCGGGAAGT-3’），预期扩增长度为717bp。将经过PCR检测的阳性植株编号并标记。

根据获得的上述核苷酸序列（SEQ ID No．1），通过构建AtZAT6超表达植物重组载体（OX-AtZAT6），转化拟南芥，申请人获得AtZAT6基因显著升高的转基因拟南芥（请见图2）。进一步通过分析过表达植株（OX-AtZAT6）与野生型拟南芥在正常情况下（23℃光照培养室内保湿培养，每天16 h 光照，8 h 黑暗），干旱和盐胁迫处理情况下的生长状况，发现过表达植株（OX-AtZAT6）相对于野生型表现为明显的抗旱和抗盐性（请见图3）。从而证明了AtZAT6在拟南芥应对干旱和盐胁迫条件下起着重要作用。 

一种拟南芥AtZAT6基因在增强植物（拟南芥）对干旱和盐胁迫抗性中的应用，其步骤是：

具体操作步骤和实验效果如下所述：

A、将拟南芥OX-AtZAT6超表达株和野生型种子4℃春化一星期，然后播种于23℃光照培养室内保湿培养（每天16 h 光照，8 h 黑暗）14天，14天内每3天浇一次营养液（营养液成份为：每升含5ml 1 M KNO₃，2 ml 1 M Ca（NO₃）_2˙4H₂O，2 ml 1 M MgSO_4˙7 H₂O，2.5 ml 20 mM  Fe_˙EDTA， 2.5 ml 1 M磷酸缓冲液（pH5.5），1 ml MS 微量元素）；

B、选取14天的拟南芥苗（包括OX-AtZAT6超表达株和野生型）平均分成三组进行实验21天，具体实验如下：

1）、第一组拟南芥苗（包括OX-AtZAT6超表达株和野生型）按照正常情况浇水21天（即每三天浇水一次，保持土壤湿润）；

2）、第二组拟南芥苗（包括OX-AtZAT6超表达株和野生型）浇盐水21天（即每三天浇150 mmol/L 氯化钠一次）；

3）、第三组拟南芥苗（包括OX-AtZAT6超表达株和野生型）停止浇水21天。

以上胁迫处理21天后，观察植株生长情况和存活率。如图3所示，OX-AtZAT6超表达株在干旱和盐胁迫处理情况下的生长状况和存活率都要明显好于野生型。具体表现为野生型拟南芥在以上干旱和盐胁迫处理21天，只有30%左右的植株可以存活，而OX-AtZAT6超表达株在干旱和盐胁迫处理21天还有60%-90%的植株可以存活，即OX-AtZAT6超表达株在干旱和盐胁迫处理条件下的存活率是野生型拟南芥的两倍以上。 

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

AtZAT6基因可以增强植物（拟南芥，下同）对干旱和盐胁迫的抗性。通过基因工程技术升高AtZAT6基因的表达能够增强植物对干旱和盐胁迫的抗性，作为基因工程的候选基因用于分子育种。

1 、通过克隆该基因，研究该基因在植物抗干旱和盐胁迫中的作用，明确了该基因具有增强植株对干旱和盐胁迫抗性的功能。通过该基因的过表达，申请人可以人工创造抗性增强材料，为实现抗性分子育种提供新的抗性基因。 

2 、通过构建该基因的超表达载体（OX-AtZAT6），转化拟南芥，获得有效的的超表达（OX-AtZAT6）转基因植株，为研究基因功能提供了一个有效的方法。 

3 、通过比较OX-AtZAT6超表达株与野生型拟南芥的抗性，发现OX-AtZAT6超表达株在干旱和盐胁迫处理条件下的存活率是野生型拟南芥的两倍以上。 

附图说明

图1为一种AtZAT6基因超表达载体OX-AtZAT6的构建示意图。 

图2为一种AtZAT6基因超表达转化株中，AtZAT6基因的表达水平图。 

四个植株图表示21天大小的野生型植株和三个AtZAT6基因超表达转化植株的生长图，图下数字表示这些植株中AtZAT6基因的相对表达水平。结果显示三个AtZAT6基因超表达转化植株中AtZAT6基因的相对表达水平显著高于野生型植株。 

图3 为一种AtZAT6基因超表达转化株和野生型植株的干旱和盐胁迫抗性鉴定图。 

左图表示14天的野生型植株和三个AtZAT6基因超表达转化植株在正常情况浇水21天（即每三天浇水一次，保持土壤湿润），浇盐水21天（即每三天浇150 mmol/L 氯化钠一次）和不浇水21天后的植株生长情况。右表表示14天的野生型植株和三个AtZAT6基因超表达转化植株在正常情况浇水21天，浇盐水21天和不浇水21天后的植株的存活率统计。 

具体实施方式

根据以下实施例，可以更好的理解本发明，但所述的实施例是为了更好的解释本发明，而不是对本发明的限制。 

实施例1： 

一种拟南芥AtZAT6基因的制备方法，其步骤是：

A、在液氮中将植物幼嫩叶片样品研磨至粉状，利用Trirol提取试剂盒（购自Invitrogen公司，以下相同）的要求进行RNA的提取。提取的总RNA溶于无RNase的双蒸水中。DNaseⅠ（购自Promega公司，以下相同）去除可能残留的DNA。用蛋白检测仪（DΜ 650 BECKMAN，ΜSA）分别检测RNA在260纳米和280纳米光吸收值，结合1%（质量体积比）琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的纯度及浓度。以获得的RNA为模板进行逆转录，得到的cDNA 分装后于-20℃保存备用。

B、根据拟南芥公共数据库TAIR（http://www.arabidopsis.org/）中拟南芥AtZAT6基因序列（At5g043400）,在该基因基因CDS（Coding seqμence,编码序列，以下相同）起始密码子和终止密码子同源区域设计引物（序列为F-5’-TCCCCCGGGATGGCACTTGAAACTCTTAC-3’，R-5’-CCGCTCGAGTTAGGGTTTCTCCGGGAAGT-3’），从而确保扩增产物为全长序列。以拟南芥的叶片的cDNA为模版，进行PCR扩增。回收并纯化扩增的PCR产物，连接到pEASY-T载体上（购自武汉群骏生物科技有限公司，详见遗传资源表），用冻融法转化大肠杆菌，涂布于含有氨苄青霉素 50 μg/mL的LB固体（配方如下：分别称取10克胰蛋白胨，5克酵母提取物和10克氯化钠，8克琼脂依次溶解于蒸馏水中，定容于1000毫升。分装于500毫升三角瓶中，121℃，6.859×104 Pa下高压消毒15分钟。4℃冷藏备用）平板上，37℃培养过夜，各挑选白斑三个，做菌落PCR检测：所用引物序列为：M13F 5′-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3; M13R  5’-GTAAAACGACGGCCAGT-3，以下相同），反应体系为：10×Taq酶反应缓冲液2 μl、25 mM MgCl₂ 1.2 μl、2 mM dNTP 1.5 μl、10 μM引物 0.2 μl、0.3单位Taq酶，加无菌水至20 μl。反应程序为：94℃变性5 min，94℃ 45 s、55℃ 45 s、72℃ 2 min 32循环，72℃延伸 5 min（以下相同）。以M13F/ M13R为引物（前面已述），将连接过的pEASY-T载体（购自武汉群骏生物科技有限公司，详见遗传资源表）进行序列测定，分析结果，获得了一种分离的基因，其序列为SEQ ID No．1 所示的核苷酸序列。 

实施例2： 

一种拟南芥抗性相关基因 AtZAT6 的过表达植株的获得：

1、AtZAT6基因超表达载体（OX-AtZAT6）的构建和根癌农杆菌菌株GV3101转化：

构建的重组载体是将已构建的质粒pBIM（本实验室保存，Yang LX, Wang RY, Ren F, Liu J, Cheng J, Lu YT （2005） AtGLB1 enhances the tolerance of Arabidopsis to hydrogen peroxide stress. Plant Cell Physiol 46: 1309-1316. 详见遗传资源表）上的目的基因用前期克隆得到的AtZAT6基因替换而来。为完成此目的，首先用SmaI/XhoI双酶切克隆的AtZAT6基因片段，同时用SmaI/XhoI酶切pBIM质粒（本实验室保存，Yang LX, Wang RY, Ren F, Liu J, Cheng J, Lu YT （2005） AtGLB1 enhances the tolerance of Arabidopsis to hydrogen peroxide stress. Plant Cell Physiol 46: 1309-1316. 详见遗传资源表）。酶切反应在30度培养箱中进行，约4-6个小时之后，用1%（质量体积比）琼脂糖胶电泳检测。将酶切后的AtZAT6基因片段和pBIM质粒（本实验室保存，Yang LX, Wang RY, Ren F, Liu J, Cheng J, Lu YT （2005） AtGLB1 enhances the tolerance of Arabidopsis to hydrogen peroxide stress. Plant Cell Physiol 46: 1309-1316. 详见遗传资源表）上切下的大片段用DNA凝胶回收试剂盒（前面已述）回收。把AtZAT6基因片段比pBIM质粒（本实验室保存，Yang LX, Wang RY, Ren F, Liu J, Cheng J, Lu YT （2005） AtGLB1 enhances the tolerance of Arabidopsis to hydrogen peroxide stress. Plant Cell Physiol 46: 1309-1316. 详见遗传资源表）载体片段按3:1（摩尔浓度比）的比例混合样品，加入T4 DNA连接酶5个单位，10×反应缓冲液，无菌水补充体积至20μL，16℃连接过夜。转化后，在含有卡那霉素（50 μg/mL）固体LB平板上筛选，挑斑做菌落PCR，以及提质粒，酶切验证正确的重组质粒命名为OX-AtZAT6,并对获得的载体进行测序以验证准确性。载体结构如图1。

然后利用冻融法（前面已述）将OX-AtZAT6转入根癌农杆菌GV3101（本实验室保存，Yang LX, Wang RY, Ren F, Liu J, Cheng J, Lu YT （2005） AtGLB1 enhances the tolerance of Arabidopsis to hydrogen peroxide stress. Plant Cell Physiol 46: 1309-1316. 详见遗传资源表），涂布于含有50 μg/mL卡那霉素和利福平（50 μg/mL）的LB固体（配方如下：分别称取10克胰蛋白胨，5克酵母提取物和10克氯化钠，8克琼脂依次溶解于蒸馏水中，定容于1000毫升。分装于500毫升三角瓶中， 121℃，6.859×104 Pa下高压消毒15分钟。4℃冷藏备用）平板上，37℃培养过夜，各挑选白斑三个，做菌落PCR检测（前面已述）。 

本发明所使用的研究AtZAT6基因功能的重组植物表达载体，含有所述AtZAT6基因的编码区核苷酸序列，组成型35S启动子（CaMV35S）可以增强AtZAT6基因的表达水平。该载体大小适合，在植物中易与转化，所带有的卡那霉素抗性标容易检测。通过这个载体转化拟南芥可以获得菌核病抗性增强的拟南芥转基因植株。 

2、AtZAT6基因超表达载体（OX-AtZAT6）的遗传转化： 

参照文献中的方法进行拟南芥转化（Zhang X.R. et al. Agrobacteriμm-mediated  transformation of Arabidopsis thaliana μsing the floral dip method. Natμre, 2006，1:1-6）。制备含有构建好载体的根癌农杆菌GV3101（本实验室保存，Yang LX, Wang RY, Ren F, Liu J, Cheng J, Lu YT （2005） AtGLB1 enhances the tolerance of Arabidopsis to hydrogen peroxide stress. Plant Cell Physiol 46: 1309-1316. 详见遗传资源表）菌液，在转化前一天转入含有卡那霉素50 μg/ml、利福平50 μg/ml的LB液体培养基中，28℃过夜培养。第二天，用紫外分光光度计（SPEKOL 1300）于276 nm纳米波长下检测的吸光值，当菌液的吸光值达到在1.6-2.0之间时取出。室温（20-25℃，以下相同）以4000 g离心10 min，弃上清，将沉淀悬浮于等体积的5%蔗糖（质量体积比）中。将浑浊的蔗糖溶液倒入一大培养皿中，转化前加入终浓度为0.02%（体积比）的Silwet L-77（购自北京五洲元业科贸中心，以下相同）。混匀后把待转化的拟南芥整个花序轻轻的浸没在蔗糖中，默数15s，取出植株。转化后的植株用一个黑色塑料袋包好，放在生长箱培养。第二天将塑料袋揭开，放在光强的地方培养。培养一个月左右收获种子，种子在培养箱或者日光下干燥3-5天。将转化收获的 T0代种子播在混有营养液的蛭石中（营养液成份为：每升含5ml 1 M KNO₃，2 ml 1 M Ca（NO₃）_2˙4H₂O，2 ml 1 M MgSO_4˙7 H₂O，2.5 ml 20 mM  Fe_˙EDTA， 2.5 ml 1 M磷酸缓冲液（pH5.5），1 ml MS 微量元素）；4℃春化一星期，在21-22℃的生长间中自然生长两星期左右，待到达四叶期的早期进行卡那霉素（50 μg/ml）的喷洒第一次，一星期之后进行第二次喷洒。两次喷洒后对存活的绿苗进行PCR阳性检测，获得拟南芥转基因阳性苗。

3、AtZAT6基因超表达载体（OX-AtZAT6）转化苗的筛选及PCR鉴定： 

根据以上卡那霉素（50 μg/ml）喷洒筛选，转基因T1代 （第一代）植株在苗期（播种后10天），得到成活植株。采用CTAB法（M.G. Mμrray and W.F. Thompson, Rapid isolation of high molecμlar weight plant DNA, Nμcleic Acids Research, 1980, Vol. 8, No. 19 4321-4326，以下相同）提取筛选后存活的拟南芥以及野生型拟南芥叶片DNA。根据表达载体上外源AtZAT6基因序列，设计引物进行PCR检测（序列为F-5’-TCCCCCGGGATGGCACTTGAAACTCTTAC-3’，R-5’-CCGCTCGAGTTAGGGTTTCTCCGGGAAGT-3’），预期扩增长度为717bp。将经过PCR检测的阳性植株编号并标记。

根据获得的上述核苷酸序列（SEQ ID No．1），通过构建AtZAT6超表达植物重组载体（OX-AtZAT6），转化拟南芥，申请人获得AtZAT6基因显著升高的转基因拟南芥（请见图2）。 

实施例3：

一种抗性相关的AtZAT6基因在增强植物（拟南芥）对干旱和盐胁迫抗性中的应用，其步骤是：

A、将拟南芥OX-AtZAT6超表达株和野生型种子4℃春化一星期，然后播种于23℃光照培养室内保湿培养（每天16 h 光照，8 h 黑暗）14天，14天内每3天浇一次营养液（营养液成份为：每升含5ml 1 M KNO₃，2 ml 1 M Ca（NO₃）_2˙4H₂O，2 ml 1 M MgSO_4˙7 H₂O，2.5 ml 20 mM  Fe_˙EDTA， 2.5 ml 1 M磷酸缓冲液（pH5.5），1 ml MS 微量元素）；

B、选取14天的拟南芥苗（包括OX-AtZAT6超表达株和野生型）平均分成三组进行实验21天，具体实验如下：

1）、第一组拟南芥苗（包括OX-AtZAT6超表达株和野生型）按照正常情况浇水21天（即每三天浇水一次，保持土壤湿润）；

2）、第二组拟南芥苗（包括OX-AtZAT6超表达株和野生型）浇盐水21天（即每三天浇150 mmol/L 氯化钠一次）；

3）、第三组拟南芥苗（包括OX-AtZAT6超表达株和野生型）停止浇水21天。

以上胁迫处理21天后，观察植株生长情况和存活率。如图3所示，OX-AtZAT6超表达株在干旱和盐胁迫处理情况下的生长状况和存活率都要明显好于野生型。具体表现为野生型拟南芥在以上干旱和盐胁迫处理21天，只有30%左右的植株可以存活，而OX-AtZAT6超表达株在干旱和盐胁迫处理21天还有60%-90%的植株可以存活，即OX-AtZAT6超表达株在干旱和盐胁迫处理条件下的存活率是野生型拟南芥的两倍以上。从而证明了AtZAT6在拟南芥应对干旱和盐胁迫条件下起着重要作用。 

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院武汉植物园

<120> 拟南芥抗逆相关基因AtZAT6及制备方法和应用

<130> 拟南芥抗逆相关基因AtZAT6及制备方法和应用

<160>  1    

<170>  PatentIn version 3.1

<210>  1

<211>  717

<212>  DNA

<213> 拟南芥

<400>  1

atggcacttgaaactcttac ttctccaaga ttatcttctc cgatgccgac tctgtttcaa     60

gattcagcactagggtttca tggaagcaaa ggcaaacgat ctaagcgatc aagatctgaa    120

ttcgaccgtcagagtctcac ggaggatgaa tatatcgctt tatgtctcat gcttcttgct    180

cgcgacggagatagaaaccg tgaccttgac ctgccttctt cttcgtcttc acctcctctg    240

cttcctcctcttcctactcc gatctacaag tgtagcgtct gtgacaaggc gttttcgtct    300

taccaggctcttggtggaca caaggcaagt caccggaaaa gcttttcgct tactcaatct    360

gccggaggagatgagctgtc gacatcgtcg gcgataacca cgtctggtat atccggtggc    420

gggggaggaagtgtgaagtc gcacgtttgc tctatctgtc ataaatcgtt cgccaccggt    480

caagctctcggcggccacaa acggtgccac tacgaaggaa agaacggagg cggtgtgagt    540

agtagcgtgtcgaattctga agatgtgggg tctacaagcc acgtcagcag tggccaccgt    600

gggtttgacctcaacatacc gccgataccg gaattctcga tggtcaacgg agacgaagag    660

gtgatgagtcctatgccggc gaagaaactc cggtttgact tcccggagaa accctaa       717

 

Claims (2)

1.一种分离的基因，其序列为SEQ ID No．1 所示的核苷酸序列。

2.一种拟南芥AtZAT6基因在增强植物对干旱和盐胁迫抗性中的应用；

所述的植物为拟南芥。