CN106749580A

CN106749580A - 植物耐盐相关蛋白TaPUB15‑D及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN106749580A
Application number: CN201710078705.9A
Authority: CN
Inventors: 景蕊莲; 李巧茹; 毛新国; 王景; 王景一
Original assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2017-02-14
Filing date: 2017-02-14
Publication date: 2017-05-31
Anticipated expiration: 2037-02-14
Also published as: CN106749580B

Abstract

本发明公开了一种植物耐盐相关蛋白TaPUB15‑D及其编码基因与应用。本发明所提供的蛋白质，是如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且与植物耐盐相关的由序列1衍生的蛋白质。本发明所提供的TaPUB15‑D蛋白及其编码基因在提高植物耐盐性方面具有重要意义，将在培育耐盐植物新品种中发挥重要作用。

Description

植物耐盐相关蛋白TaPUB15-D及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，涉及一种植物耐盐相关蛋白TaPUB15-D及其编码基因与应用。

背景技术

粮食是人类生存和生活的必需品，粮食状况关系到农业的全面发展和整个国民经济的持续健康发展。但是土壤盐渍化的快速加剧、全球水资源的短缺、以及极端天气的频繁出现，严重限制了作物的生长和产量的提高。所以粮食问题是全球农业面临的巨大挑战。

土壤盐渍化是现代农业所面临的主要问题之一，为了抵御盐分胁迫，适应生存环境，植物产生了一系列生理生化的改变以调节水分及离子平衡，维持正常的生长。作物除了通过调节胁迫相关基因的表达来应对干旱胁迫以外，泛素化作为一种重要的翻译后的修饰方式在植物应对盐胁迫这一过程中也起到了关键作用。根系作为感受盐胁迫最直接的器官，对植物耐盐研究有着重要的意义。因此，深入认识植物的盐胁迫适应机理并通过基因工程手段提高作物的耐盐性具有重要的现实意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种植物耐盐相关蛋白TaPUB15-D及其编码基因与应用。

本发明所提供的TaPUB15-D蛋白来源于小麦(Triticum aestivum L.)品种旱选10号，具体可为如下(a)或(b)：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且与植物耐盐相关的由序列1衍生的蛋白质。

为了便于上述(a)中所示蛋白质的纯化，可在由序列表中序列1的氨基酸残基序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。

表：标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述(b)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变。

编码所述蛋白质的核酸分子也属于本发明的保护范围。

所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA、hnRNA或tRNA等。

在本发明的一个实施例中，所述核酸分子具体为编码所述蛋白质的基因，所述基因具体可为如下1)或2)或3)或4)的DNA分子：

1)序列表中序列2的第12-2507所示的DNA分子；

2)序列表中序列2所示的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA分子杂交且编码耐盐相关蛋白的DNA分子；

4)与1)或2)或3)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码耐盐相关蛋白的DNA分子。

上述严格条件可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

其中，序列2由2517个核苷酸组成，第12-2507位为ORF，编码序列表中序列1所示的蛋白质。

含上述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。

所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。

所述重组表达载体可用现有的植物表达载体构建。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pCUbi1390、pCHF3、pGreen0029、pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pBI121、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表达载体。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，例如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛素基因Ubiquitin启动子(pUbi)、胁迫诱导型启动子rd29A等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用重组表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。也可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

在本发明中，所述重组表达载体中启动所述基因转录的启动子具体为pUbi启动子或35S启动子。

更为具体的，在本发明的一个实施例中，所述重组表达载体为在pCUbi1390载体的多克隆位点处(具体如BamHⅠ)插入所述基因后得到的重组质粒。该重组表达载体中启动所述基因转录的启动子为pUbi启动子。在本发明的另一个实施例中，所述重组表达载体为在pCHF3载体的多克隆位点处(具体如SmaⅠ和SalⅠ)插入所述基因后得到的重组质粒。该重组表达载体中启动所述基因转录的启动子为35S启动子。

所述表达盒由能够启动所述基因表达的启动子，所述基因，以及转录终止序列组成。

所述蛋白质或所述核酸分子或所述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在如下任一中的应用也属于本发明的保护范围：

(a)提高植物耐盐性；(b)选育耐盐性提高的植物品种；(c)提高植物耐盐相关基因的表达；(d)调控植物体内Na⁺、K⁺平衡；(e)改善植物根系形态。

其中，所述选育耐盐性提高的植物品种的方法，具体可包括将所述基因表达量较高的植株作为亲本进行杂交的步骤。

其中，所述改善植物根系形态具体可体现为如下中的任一种或多种：根数目增加、根长增加、根干重增加。

其中，所述提高植物耐盐性具体可体现为如下中的任一种或多种：在盐胁迫条件下，植物的存活率提高、细胞膜稳定性提高、叶绿素含量提高、渗透势降低。

本发明还提供了一种培育转基因植物的方法。

本发明所提供的培育转基因植物的方法，具体可包括如下(a1)和(a2)的步骤：

(a1)向受体植物中导入所述蛋白质的编码基因，得到表达所述编码基因的转基因植物；

(a2)从步骤(a1)所得转基因植物中得到与所述受体植物相比，具有如下(b1)-(b4)所示性状中至少一种的转基因植物：(b1)耐盐性提高；(b2)耐盐相关基因表达量提高；(b3)体内Na⁺/K⁺降低；(b4)根系更加发达。

所述蛋白质在所述转基因植物中的表达量高于所述受体植物；编码所述蛋白质的基因是如下1)至4)中任一所述的DNA分子：

1)序列表中序列2的第12-2507所示的DNA分子；

2)序列表中序列2所示的DNA分子；

所述基因具体可通过上述任一所述重组表达载体导入所述受体植物中，得到所述转基因植物。具体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导、基因枪等常规生物学方法将所述重组表达载体转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。

在本发明中，所述耐盐性提高具体体现在：在盐处理条件下，转入所述基因的转基因水稻在水培和土壤培养条件下，均比未转基因的野生型水稻更耐盐胁迫；转入所述基因的转基因拟南芥在萌发期和苗期均比未转基因的野生型拟南芥表现出更强的耐盐性。

在本发明中，所述耐盐相关基因表达量提高具体体现在：在不同盐浓度处理条件下，转入所述基因的转基因水稻和转入所述基因的转基因拟南芥中耐盐相关基因的表达均受到上调，且均显著高于野生型。其中，所述耐盐相关基因包括OsSOS1、OsNHX1、OsNHX2、OsP5CS1、OsAKT1、OsHKT1；1；或者AtSOS1、AtNHX1、AtP5CS1、AtCBF3、AtRD29A、AtKIN1。

在本发明中，所述体内Na⁺/K⁺降低具体体现在：在盐处理条件下，转入所述基因的转基因水稻体内Na⁺含量显著低于未转基因的野生型水稻，而K⁺含量与野生型无差异；转入所述基因的转基因拟南芥体内Na⁺外流显著大于野生型，K⁺外流显著小于野生型。

在本发明中，所述根系更加发达具体体现在：转入所述基因的转基因水稻在苗期和抽穗期其根系均比未转基因的野生型水稻更加发达。

在上述应用或方法中，所述植物可为单子叶植物，也可为双子叶植物。如：水稻、小麦、拟南芥、烟草等。

在本发明中，所述植物为水稻或拟南芥，具体为拟南芥哥伦比亚3型(Col-3)和野生型水稻Kitaake。

实验证明，将可表达序列表中序列2所示DNA分子的重组表达载体转化水稻或拟南芥得到的T₃代纯合转基因植株，与相同条件下的野生型和转空载体植株相比，转基因植物的耐盐性更强。本发明所提供的TaPUB15-D蛋白及其编码基因在提高植物耐盐性方面具有重要意义，将在培育耐性植物新品种中发挥重要作用。

附图说明

图1为TaPUB15-D属于植物PUB蛋白家族。其中，A为PUB蛋白中PUB结构域比对结果。B为根据TaPUB15-D及其直系同源基因建立的进化树。

图2为TaPUB15-D在小麦原生质体中的亚细胞定位示意图。

图3为TaPUB15在小麦中的表达模式。其中，A为TaPUB15在小麦不同发育时期不同组织下的表达模式，L表示叶，R表示根，RB表示根基，S表示穗，N表示节，FL表示旗叶，St表示茎，R30表示0-30cm的根，R50表示30-50cm的根，R70表示50-70cm的根，R90表示70-90cm的根，R100表示90-100cm的根。B为TaPUB15在不同胁迫处理(NaCl、ABA、4℃和PEG)下小麦根系中的表达模式。

图4为过表达TaPUB15-D水稻苗期根系表型。其中，A为野生型(WT)和转基因水稻株系(L1-L3)的根系形态。B为野生型和转基因水稻株系侧根数的统计结果。C为野生型和转基因水稻株系根长的统计结果。D为野生型和转基因水稻株系根干重的统计结果。

图5为过表达TaPUB15-D水稻抽穗期根系表型。其中，A为野生型(WT)和转基因水稻株系(L1-L3)的根系形态。B为野生型和转基因水稻株系根干重的统计结果。C为野生型和转基因水稻株系地上部分干重的统计结果。

图6为过表达TaPUB15-D水稻水培条件下盐胁迫表型。其中，A为野生型(WT)和转基因水稻株系(L1-L3)在100mM NaCl处理前后的植株形态。B为转基因水稻株系中TaPUB15-D的表达量。C为野生型和转基因水稻株系在100mM NaCl处理后存活率的统计结果。D为野生型和转基因水稻株系在100mM NaCl处理后细胞膜稳定性的统计结果。E为野生型和转基因水稻株系在100mM NaCl处理后叶绿素含量的统计结果。

图7为过表达TaPUB15-D水稻土壤中盐胁迫表型。其中，A为野生型(WT)和转基因水稻株系(L1-L3)在175mM NaCl处理前后的植株形态。B为野生型和转基因水稻株系在175mMNaCl处理后存活率的统计结果。C为野生型和转基因水稻株系在175mM NaCl处理前后渗透势的统计结果。

图8为水培条件下盐胁迫后野生型(WT)和转基因水稻株系植株(L1-L3)体内钠钾离子含量。其中，A为野生型和转基因水稻株系植株体内钠离子含量的测定结果。B为野生型和转基因水稻株系植株体内钾离子含量的测定结果。C为野生型和转基因水稻株系植株体内钠钾离子比的统计结果。

图9为盐胁迫相关基因在转基因水稻(L1-L3)中的表达模式。盐胁迫相关基因包括：OsSOS1、OsNHX1、OsNHX2、OsP5CS1、OsAKT1、OsHKT1；1。

图10为过表达TaPUB15-D拟南芥萌发期盐胁迫表型。其中，A为转基因拟南芥株系中TaPUB15-D的表达量。B为野生型(WT)和转基因拟南芥株系(L1-L3)在不同盐浓度下(0、150和200mM)萌发率的统计结果。C为野生型和转基因拟南芥株系在不同盐浓度下的萌发情况。

图11为过表达TaPUB15-D拟南芥苗期盐胁迫表型。其中，A为野生型(WT)和转基因拟南芥株系(L1-L3)在250mM NaCl处理后的植株形态。B为野生型和转基因拟南芥株系在250mM NaCl处理后存活率的统计结果。C为野生型和转基因拟南芥株系在250mM NaCl处理前后细胞膜稳定性的测定结果。

图12为盐胁迫相关基因在转基因拟南芥中的表达模式。盐胁迫相关基因包括：AtSOS1、AtNHX1、AtP5CS1、AtCBF3、AtRD29A、AtKIN1。

图13为野生型(WT)和转基因拟南芥株系(L1-L3)在100mM NaCl处理下拟南芥体外的钠钾离子流。其中，A为野生型和转基因拟南芥株系在100mM NaCl处理下的钠离子流情况。B为野生型和转基因拟南芥株系在100mM NaCl处理下的钾离子流情况。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

小麦(Triticum aestivum L.)品种旱选10号：耐旱品种，来源于国家种质库(编号：ZM009279)。记载于“王正航,武仙山,昌小平等.小麦旗叶叶绿素含量及荧光动力学参数与产量的灰色关联度分析.作物学报,2010年02期”一文，公众可从申请人处获得，仅限于用于重复本发明。

根癌农杆菌GV3101(Agrobacterium tumefaciens Strain GV3101)：BiovectorScience Lab,Inc产品。

根癌农杆菌EHA105(Agrobacterium tumefaciens Strain EHA105)：北京华越生物公司产品。

pJIT163-GFP载体：记载于“小麦盐胁迫相关基因TabHLH13的克隆与分析.植物遗传资源学报，2014年05期1006-1011.”一文，公众可从申请人处获得，仅限于复制本发明。

pCHF3载体：记载于“辣椒WRKY转录因子基因CaRKNIF1植物表达载体构建及番茄转化.分子植物育种，2010年04期713-718.”一文，公众可从申请人处获得，仅限于复制本发明。

pCUbi1390载体：记载于“水稻基因OsASIE1抗逆功能分析.作物学报，2011年37(10)1771-1778.”一文，公众可从申请人处获得，仅限于复制本发明。

拟南芥哥伦比亚3型(Col-3)：记载于“刘丹.小麦抗逆相关基因TaPP2AbB″-α/γ的克隆及功能分析.中国农业科学院，2014年硕士论文”一文，公众可从申请人处获得，仅限于复制本发明。

野生型水稻Kitaake：记载于“水稻高光效育种研究进展.生物技术进展，2014年4(3)153-157.”一文，公众可从申请人处获得，仅限于复制本发明。

实施例1、TaPUB15-D蛋白及其编码基因的获得

挑选籽粒饱满、均匀一致的小麦(Triticum aestivum L.)品种旱选10号小麦种子于直径9cm培养皿中，加入去离子水置于室温下培养7天，剪取小麦幼苗的新鲜叶片置于离心管中，用液氮迅速冷冻处理，将样品置于﹣80℃保存以提取小麦DNA及RNA。

用RNA提取试剂盒(TIANGEN，Beijing)提取总RNA，用反转录试剂盒合成第一链cDNA(TIANGEN，Beijing)，以cDNA为模板，引物F1和R1进行PCR扩增，对扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳，回收纯化2500bp左右的条带并测序，得到一个全长为2517bp的序列片段，如序列表2所示。

F1：5'-TCACAGGGTTGATGGAAGATTT-3'(序列2的第1-22位)

R1：5'-GCTAACATCATCATCTCCTCGC-3'(序列2的第2496-2517位的反向互补序列)

将序列表序列2所示基因命名为TaPUB15-D，其中序列2的第12-2507位为开放阅读框。序列表序列2所示基因编码的蛋白TaPUB15-D由831个氨基酸残基组成，如序列1所示。

实施例2、TaPUB15-D蛋白及其编码基因序列遗传特征和高度保守性

一、TaPUB15-D蛋白属于植物PUB蛋白家族

用序列2作为查询序列在NCBI上进行BLAST，得到TaPUB15的直系同源蛋白序列，其登录号如表1。

表1TaPUB15-D蛋白直系同源蛋白及其登录号

利用生物学软件DNAMAN软件对TaPUB15和直系同源蛋白序列进行多序列比对，结果如图1中A所示。利用生物学软件MEGA5.1中Clustal W方法建立TaPUB15和直系同源蛋白序列进化树，结果如图1中B所示。结果表明TaPUB15蛋白序列包含一个保守的U-box结构域和一个ARM重复结构域。属于植物PUB蛋白家族。而且TaPUB15与单子叶植物中二穗短柄草、水稻、玉米、粟中的PUB蛋白亲缘关系相对较近，与双子叶植物拟南芥、烟草和辣椒中的PUB蛋白亲缘关系较远。

二、TaPUB15蛋白编码基因的遗传特征及其序列保守性

利用引物对F1和R1在32份多态性较高的小麦材料中扩增TaPUB15基因序列，测序并比对序列间的差异性。32份多态性较高的小麦材料清单如表2。

表2 32份多态性较高小麦材料清单

通过对32份多态性较高小麦材料中TaPUB15测序，结果表明在六倍体小麦的基因组中TaPUB15的序列保持高度保守。

实施例3、TaPUB15-D蛋白的亚细胞定位

利用HindⅢ和SalI将TaPUB15-D连接到瞬时表达载体pJIT163-GFP上，利用PEG介导的方法将重组载体pJIT163-TaPUB15-D-GFP和pJIT163-GFP载体分别转入小麦原生质体中，观察GFP表达情况。

小麦原生质体瞬间表达步骤：

(1)取黑暗条件下培养7天的小麦黄化苗叶片，去掉黄化叶片的顶端部分和茎部组织，将剩余的黄化叶片切碎。

(2)将切碎的黄化叶片放置于装有30ml酶解液的锥形瓶中，25℃，60rpm，黑暗条件下酶解4h。

(3)用等体积(30ml)W5溶液稀释酶解物，用200目的不锈钢网筛过滤稀释后的酶解物除去未溶解的叶片，可以边过滤边稀释，以获得小麦原生质体。

(4)将过滤所得的原生质体溶液离心，100×g离心2min。

(5)除去上清液，用30ml W5溶液重悬原生质体，100×g离心2min。

(6)除去上清液，用30ml W5溶液再次重悬原生质体，并将其放置于冰上30min，之后用显微镜检测提取的小麦原生质体的数目及状态。

(7)若镜检合格，将冰上放置的原生质体离心，100×g离心2min，尽量将上清液除尽，用适量(2ml)的MMG溶液重悬原生质体。

(8)将10μg高浓度质粒加入到提前烘干的5ml优化离心管中。

(9)吸取220μl制备好的原生质体于含有质粒的5ml优化离心管中。

(10)逐渐加入等量(230μl)的PEG4000，在室温下转化30min。

(11)逐渐加入1ml W5溶液，并混匀以终止反应。

(12)100×g离心2min，除去上清液，并用1ml W5溶液重悬原生质体。

(13)100×g离心2min，除去上清液，并用500μl W5溶液重悬原生质体。

(14)把细胞转移到细胞培养板中，用锡箔纸包好，黑暗过夜培养原生质体。

(15)在激光扫描共聚焦显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达情况。

小麦原生质体瞬间表达所需缓冲液配置：

A.酶解液(现用现配)

B.PEG4000溶液(现用现配)

C.W5溶液

D.MMG溶液

亚细胞定位结果如图2所示。结果表明TaPUB15-D在小麦原生质体中的细胞核、细胞膜、细胞质中均有所表达。

实施例4、TaPUB15基因的表达特性

一、TaPUB15基因在小麦不同组织中的表达情况

在小麦旱选10号的不同生长时期对不同组织部位进行取样，包括：萌发期的根、叶、根基，幼苗期的根、叶、根基，和抽穗期的穗、节、旗叶、茎、根基、根(0-30cm)、根(30-50cm)、根(50-70cm)、根(70-90cm)、根(90-100cm)，将样品经液氮迅速冷冻处理后置于﹣80℃保存以提取小麦RNA。用RNA提取试剂盒(TIANGEN，Beijing)提取总RNA，用反转录试剂盒合成第一链cDNA(TIANGEN，Beijing)，采用实时定量方法检测TaPUB15在不同生长时期不同组织中的表达差异。以组成型表达的TaActin基因为内参，设计的引物序列如下：

检测基因TaPUB15表达的引物序列如下：

TaPUB15-RT-F：5'-TTCTCACCGAGGACTCTGCT-3'；

TaPUB15-RT-R：5'-GAGAGGGCTCACAATGCT-3'。

检测基因TaActin表达的引物序列如下：

TaActin-RT-F：5'-CTCCCTCACAACAACAACCGC-3'；

TaActin-RT-R：5'-TACCAGGAACTTCCATACCAAC-3'。

实时定量实验结果如图3中A所示，TaPUB15在苗期的根中表达量最高，其次是苗期的叶、萌发期和苗期的根基、抽穗期的根(30-50cm)，而TaPUB15-D在抽穗期的穗、节、旗叶和茎中的表达量均比较低。

二、TaPUB15基因响应非生物胁迫的表达情况

挑选籽粒饱满、均匀一致的小麦旱选10号种子于9cm培养皿中，加入去离子水置于光照培养箱中培养。光照培养箱的条件为温度22℃，湿度70％，光照强度150μmol·m^-2·s^-1，光周期12h光照/12h黑暗。在光照培养箱中培养9天至小麦幼苗一叶一心时，对小麦幼苗分别进行16.1％PEG、250mM NaCl、50μM ABA和4℃处理。分别在处理后的0、0.5、1、1.5、2、3、6、12、24、48和72h对小麦幼苗的根部组织进行取样，样品用液氮迅速冷冻处理，置于﹣80℃保存以提取小麦RNA。用RNA提取试剂盒(TIANGEN,Beijing)提取总RNA，用反转录试剂盒合成第一链cDNA(TIANGEN,Beijing)，采用实时定量方法检测TaPUB15在不同非生物胁迫下的表达情况。

实时定量实验结果如图3中B所示，在NaCl处理条件下，TaPUB15的表达量逐渐升高，在24h时达到峰值，约为0h的7倍，随后该基因的表达量逐渐下降。在外源ABA处理条件下，TaPUB15的表达量逐渐升高，在1h时达到峰值，约为0h的5.5倍，随后该基因的表达量在1.5-24h逐渐下降，在48h时再次达到一个小高峰，随后又降低。在4℃处理条件下，在1h时达到峰值，约为0h的5.5倍，在3h再次达到小高峰，3-72h该基因的表达量逐渐降低。PEG处理条件下，在1h时达到峰值，约为0h的3.25倍，随后TaPUB15的表达量有所变化，但一直保持在1.5倍左右。TaPUB15可以响应非生物胁迫NaCl、ABA、4℃，但是对非生物胁迫PEG不敏感。

实施例5、TaPUB15-D基因在正常生长条件下显著改善转基因水稻的根系形态

一、转化水稻重组表达载体的构建

根据TaPUB15-D基因的序列(序列2)设计引物对(F2和R2)，引物5′末端分别引入线性载体正向和反向16bp的重叠序列，并且在R2的终止密码子前加入Myc标签序列。以小麦品种旱选10号的cDNA为模板，PCR扩增TaPUB15-D基因；将PCR扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳，回收纯化2500bp左右的条带。

F2：5'-GCAGGTCGAC ATGGAAGATTTCTCACCGAGGA-3'(下划线部分为线性载体正向重叠序列；斜体部分为BamHI的酶切位点的识别序列；其后为序列表中序列2的第12-33位)；

R2：5'-GAATTCCCGG TCA TCTCCTCGCCGAGTTCCC-3'(下划线部分为线性载体反向重叠序列；斜体部分为BamHI的酶切位点的识别序列；加粗部分为Myc标签序列；其后为序列表中序列2的第2487-2504位的反向互补序列)。

按照如下步骤构建转化水稻重组表达载体：

(1)用BamH I酶切pCUbi1390载体，回收载体骨架；

(2)将以上回收纯化的PCR产物和步骤(1)的载体骨架进行连接；

(3)将步骤(2)的连接产物电击转化大肠杆菌DH5α菌株，37℃培养过夜，挑取阳性克隆进行测序，验证正确的重组载体命名为pCUbi1390-TaPUB15-D。

重组载体pCUbi1390-TaPUB15-D的结构描述如下：在pCUbi1390载体的酶切位点BamH I处插入“序列表中序列2的第12-2504位+GAGCAGAAACTCATCTCTGAAGAGGATCTG+TGA”所示DNA片段后得到的重组质粒。

二、转基因水稻的获得

以水稻品种Kitaake为受体，通过农杆菌介导转化的方法转化水稻，获得T₀代阳性植株。T₀代阳性植株经过3次自交获得T₃代阳性植株。

提取T₃代转TaPUB15-D水稻株系的基因组DNA，用上述F2和R2进行PCR扩增，得到2500bp左右为阳性T₃代转TaPUB15-D水稻株系，经过检测，T₃代转TaPUB15-D水稻株系全部为阳性。

从鉴定阳性的转基因水稻T₃代纯合株系中随机选择3个，分别编号为L1、L2和L3。

按照同样的方法，将pCUbi1390空载体也转入水稻品种Kitaake中，获得纯合转空载体对照株系。

三、转基因水稻正常生长条件下的根系表型鉴定

1、苗期根系表型鉴定

选取转基因水稻T₃代纯合株系(L1、L2和L3)、空载对照株系和野生型种子，置于37℃培养箱中萌发。挑选萌发情况一致的水稻种子分别放进96孔板(去除底部)中，将96孔板漂浮于水中培养两天，随后换为水稻营养液培养。两周后利用根系扫描仪对转基因株系、空载对照株系和野生型水稻幼苗根系进行扫描。同时统计根数、根长、根干重等性状。处理重复三次。

2、抽穗期根系表型鉴定

选取转基因水稻T₃代纯合株系(L1、L2和L3)、空载对照株系和野生型种子，置于37℃培养箱中萌发。挑选正常生长的幼苗移栽于草碳土中进行育秧，随后挑选长势较好的秧苗移栽于中国农业科学院作物科学研究所院内培养盆中。水稻抽穗时，用水将培养用土全部冲洗干净，中途尽量不要损伤水稻根系。随后考察水稻的各性状，包括根干重、地上干重。处理重复三次。

转基因水稻正常生长条件下的表型鉴定结果如图4和图5。通过对转基因水稻苗期根系扫描，显示转基因水稻苗期根系显著比野生型苗期根系更加发达，拥有更多的根数目，以及更长的根长，同时根干重也显著高于野生型。通过对转基因水稻抽穗期的根系进行表型鉴定，显示转基因水稻抽穗期根系显著比野生型根系要发达，拥有更大的根干重和地上部干重。无论是苗期还是抽穗期，空载对照株系的根系表型与野生型对照相比基本一致，无统计学差异。以上实验结果表明过表达TaPUB15-D能显著改良水稻根系形态。

实施例6、TaPUB15-D基因能显著提高转基因水稻的耐盐性

1、水培条件

选取转基因水稻T₃代纯合株系(L1、L2和L3)、空载对照株系和野生型种子，置于37℃培养箱中萌发。挑选萌发情况一致的水稻种子分别放进96孔板(去除底部)中，将96孔板漂浮于水中培养两天，随后换为水稻营养液培养。水稻营养液培养两周后，对转基因水稻和野生型照相。随后将水稻营养液换为含100mM NaCl的水稻营养液处理水稻，两周后待野生型出现植株变黄萎蔫甚至死亡时，对转基因水稻、空载对照株系和野生型照相。同时统计水稻的存活率、细胞膜稳定性、叶绿素含量和钠钾离子含量。处理重复三次。

(1)细胞膜稳定性的测定方法如下：

取100mM NaCl处理两周后的水稻植株，每个株系分别取3株转移到ddH₂O中漂洗，用DDS-1型电导仪测定其电导率(a)，然后煮30min，放置室温后测定其电导率(b)。利用公式细胞膜稳定性(CMS)(％)＝(1-a/b)×100％计算各株系的细胞膜稳定性。

(2)叶绿素含量的测定方法如下：

取100mM NaCl处理两周后的水稻植株，每个株系分别选取10株相同部位叶片的相同位置，用叶绿素仪(SPAD-502)测定各株系的叶片SPAD值，SPAD值可以转换为单位面积的叶绿素含量。叶绿素含量＝SPAD值×0.003-0.048。

(3)钠钾离子含量的测定方法如下：

钠、钾离子含量的测定采用中华人民共和国国家标准“食品中钾、钠的测定”(GB/T5009.91-2003)方法，用ATC-006原子吸收分光光度计检测离子含量。

2、土壤条件

选取转基因水稻T₃代纯合株系(L1、L2和L3)、空载对照株系和野生型种子，置于37℃培养箱中萌发。挑选萌发情况一致的水稻种子移栽于草碳土中种植。正常培养两周后，将培养盒中的水溶液抽净，换为含175mM NaCl的水溶液对水稻幼苗进行胁迫处理。处理过程中每天观察水稻幼苗的变化情况，并照相记录。胁迫处理三天后，水稻幼苗开始出现叶片萎蔫卷曲的现象，此时，对水稻取样，利用渗压计(Model 210,Associates)测定各株系的渗透势。待胁迫处理一周后，将含175mM NaCl的水溶液换为纯水溶液，两天后统计转基因株系、空载对照株系和野生型的存活率。

其中，水稻渗透势的测定方法如下：

(1)将水稻样品挤压出汁。

(2)将待测的流体样品吸到20μl试样管中。

(3)将吸液管的头完全插入到试样管底部。释放样品，无任何喷溅或喷射。

(4)目测样品。如果样品中有任何空隙和气泡，或如果样品挂到试样管侧壁，轻弹试样管，直至样品处于移液管底部。

(5)小心地将盛有样品的试样管放置到样品井中。

(6)完全将测试头插入试样管。

(7)按用户界面的指示，按下[TEST]测试键，开始测试。

(8)测试过程需约90秒，屏幕显示测定结果数值，记录数值后，抬升测试头，测试完毕。

然后根据公式便可计算出植株的渗透势：ψ_s＝-iCRT。式中ψ_s代表渗透势，以MPa为单位；R代表气体常数，为0.008314MPa·L·mol^-1·K^-1；T代表开氏温度，即273+t℃(实验当时的温度，本实验中为25℃)；iC为测试过程中屏幕显示的测定结果数值。

转基因水稻的耐盐性表型鉴定如图6和图7。在盐处理之前，野生型与转基因株系生长状况基本一致，无显著差异。盐处理之后，所有植株的老叶片发生变黄甚至枯萎，新叶片的叶尖也出现不同程度的变黄、萎蔫，但是转基因水稻株系的整体生长状况显著好于野生型。通过统计存活率，发现转基因水稻不同株系的存活率均极其显著高于野生型。同时，还测定了野生型和转基因株系的细胞膜稳定性(CMS)、叶绿素含量和渗透势。结果显示，三个转基因水稻株系的细胞膜稳定性和叶绿素含量均显著高于野生型，渗透势显著低于野生型。转基因水稻体内Na⁺、K⁺含量测定结果如图8。测定结果表明，经过100mM NaCl处理两周后，转基因植物体内Na⁺含量低于野生型，但K⁺含量与野生型无差异，导致在转基因水稻体内保持较低的Na⁺/K⁺。

无论是水培条件还是土壤条件下，空载对照株系的耐盐参数与野生型对照的相应耐盐参数相比基本一致，无统计学差异。

以上结果说明，在盐处理条件下转基因水稻株系的生理反应受到的影响要小于野生型和空载对照株系，也说明了转基因水稻株系对于盐胁迫有着更好的适应性。

实施例7、TaPUB15-D基因调控水稻盐胁迫相关基因的表达

选取转基因水稻T₃代纯合株系(L1、L2和L3)、空载对照株系和野生型种子，置于37℃培养箱中萌发。挑选萌发情况均匀一致的水稻种子移栽于草碳土中种植。对正常培养两周的水稻幼苗进行175mM NaCl处理，分别在处理前和处理后5天对转基因株系、空载对照株系和野生型水稻取样，样品用液氮迅速冷冻处理，置于﹣80℃保存以提取小麦RNA。用RNA提取试剂盒(TIANGEN，Beijing)提取总RNA，用反转录试剂盒合成第一链cDNA(TIANGEN，Beijing)，采用实时定量方法测定转基因株系中其它盐胁迫相关基因的表达情况。以组成型表达的OsUBQ基因为内参，设计的引物序列如下：

检测盐胁迫相关基因表达的引物序列如下：

OsSOS1-RT-F：5'-CTCCGTGCTCATAGAATCGC-3'；

OsSOS1-RT-F：5'-ATACTCACTCAAGTGGGTCAATACC-3'。

OsNHX1-RT-F：5'-GTTCAAGAGTTACAACAAAGCACG-3'；

OsNHX1-RT-R：5'-CAGCGGGAATACAAAAGCAG-3'。

OsNHX2-RT-F：5'-ACCAAGACGAAACACCCCTAC-3'；

OsNHX2-RT-R：5'-AACCCAGCAACTACTCCAAGAA-3'。

OsP5CS1-RT-F：5'-TCTGCTCAGTGATGTGGATG-3'；

OsP5CS1-RT-R：5'-CCTACACGAGATTTGTCTCC-3'。

OsAKT1-RT-F：5'-TTGCGTTTGAATCGTACAGC-3'；

OsAKT1-RT-R：5'-CCTTTACGACACCAGCCATT-3'。

OsHKT1；1-RT-F：5'-ATTAGCAGAGCACTGTGGAGGAA-3'；

OsHKT1；1-RT-R：5'-CCGACGAACCCGTAGGAAG-3'。

检测基因OsUBQ表达的引物序列如下：

OsUBQ-RT-F：5'-ACCACTTCGACCGCCACTACT-3'

OsUBQ-RT-R：5'-ACGCCTAAGCCTGCTGGTT-3'

实时定量实验结果如图9所示，在无盐胁迫条件下，转基因株系中的SOS1、NHX2、P5CS1的表达量显著低于野生型，HKT1；1的表达量无显著变化。在175mM NaCl处理条件下，野生型和转基因株系中所有盐胁迫应答基因的表达量都有显著的上升。这些结果表明TaPUB15-D影响了盐胁迫响应基因的表达，也暗示着TaPUB15-D在盐胁迫调控网络中起到了一定的作用。通过对这些基因进行分析，发现SOS1、NHX1、NHX2编码Na⁺/H⁺泵，可以将Na⁺泵出体外或泵进液泡，AKT1和HKT1；1编码K⁺吸收相关基因，可以促进植物吸收K⁺。这些结果表明TaPUB15-D很有可能是通过调控Na⁺、K⁺平衡来增强转基因水稻耐盐性的。

无论是在无盐胁迫条件下还是在175mM NaCl处理条件下，空载对照株系的盐胁迫相关基因与野生型对照的相应盐胁迫相关基因的表达量相比基本一致，无统计学差异。

实施例8、TaPUB15-D基因能显著提高转基因拟南芥的耐盐性

一、转化拟南芥重组表达载体的构建

根据TaPUB15-D基因的序列(序列2)设计引物对(F3和R3)，引物5'端分别引入SmaI和SalI酶切识别位点。以小麦品种旱选10号的cDNA为模板，PCR扩增TaPUB15-D基因，并将PCR产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳，回收纯化2500bp左右的条带。

F3：5'-CCCCCGGGATGGAAGATTTCTCACCGAG-3'(下划线部分为SmaI的酶切位点，其后的序列为序列表中序列2的第12-31位)；

R3：5'-ACGCGTCGACTCATCTCCTCGCCGAGT-3'(下划线部分为SalI的酶切位点，其后的序列为序列表中序列2的第2491-2507位的反向互补序列)。

按照下述步骤构建转化拟南芥重组表达载体：

(1)用限制性内切酶SmaI和SalI酶切以上回收纯化的PCR产物，回收酶切产物；

(2)用限制性内切酶SmaI和SalI酶切pCHF3载体，回收载体骨架；

(3)将步骤(1)的酶切产物和步骤(2)的载体骨架连接；

(4)将步骤(3)的连接产物电击转化大肠杆菌DH5α菌株，37℃培养过夜，挑取阳性克隆进行测序，验证正确的重组载体命名为pCHF3-TaPUB15-D。

重组载体pCHF3-TaPUB15-D的结构描述如下：将pCHF3载体的酶切位点SmaI和SalI之间的小片段替换为序列表中序列2的第12-2507位所示DNA片段的重组质粒。

二、转基因拟南芥的获得

1、将1μl构建好的重组载体pCHF3-TaPUB15-D加入至20μl根癌农杆菌GV3101感受态细胞中，350V电压电击转化。

2、转化的农杆菌进行菌落PCR鉴定，将鉴定正确的单菌落接入5ml YEB液体培养基(含50mg/L壮观霉素，50mg/L利福平)中，28℃、250rpm振荡培养过夜。

3、将步骤2的5ml菌液转接至100ml YEB液体培养基(含50mg/L壮观霉素，50mg/L利福平)中，28℃、250rpm振荡培养至菌液OD₆₀₀达到0.8-1.0。

4、4℃、7000-7500rpm离心10min，弃上清。

5、将步骤4收集的菌体重悬于1倍体积的转化渗透液中。转化渗透液配方：1/2MS100ml，加5g蔗糖、80μl Silwet-77。

6、选取刚开花的拟南芥哥伦比亚3型(Col-3)植株，将花序浸泡在转化渗透液中大约30sec，套上保鲜袋保湿，黑暗培养24h，然后去掉保鲜袋，正常培养，收获种子为T₀代。T₀代自交获得T₁代种子。

7、将T₁代种子消毒后，平铺于MS培养基上(含50mg/L卡那霉素)，4℃春化2天，22℃、16h光照/8h黑暗培养14天，挑选抗卡那霉素的转基因拟南芥植株，将转基因株系繁种、加代，得到多个T₃代纯合转TaPUB15-D株系(所有后代均具有卡那霉素抗性的亲代为纯合系)。

提取T₃代纯合转TaPUB15-D拟南芥株系的基因组DNA，用上述F3和R3进行PCR扩增，得到2500bp左右为阳性T₃代纯合转TaPUB15-D拟南芥株系，经过检测，T₃代纯合转TaPUB15-D拟南芥株系全部为阳性。

从鉴定阳性的转基因拟南芥T₃代纯合株系中随机选择3个，分别编号为L1、L2和L3。

按照同样的方法，将pCHF3空载体也转入拟南芥哥伦比亚3型(Col-3)中，获得纯合转空载体对照株系。

三、转基因拟南芥的表型鉴定

1、萌发期

选取T₃代纯合株系(L1、L2和L3)、空载对照株系和野生型且大小均匀一致的拟南芥种子，经由NaClO消毒后用枪头均匀点播于含不同浓度NaCl(0mM、150mM、200mM)的MS固体培养基上(每个转基因株系、空载对照株系和野生型均点播60粒种子)。4℃处理48h，随后转移到光照培养箱中水平培养，观察拟南芥种子的萌发情况。以拟南芥胚根完全伸出种皮为标准，统计不同NaCl浓度下野生型、空载对照株系和转基因拟南芥株系间的萌发率。每个处理重复三次。

2、苗期

选取T₃代纯合株系(L1、L2和L3)、空载对照株系和野生型拟南芥种子，经由NaClO消毒后用枪头均匀点播于MS固体培养基上。4℃处理48h，随后转移到光照培养箱中垂直培养7天。挑选地上和地下部分均匀一致的拟南芥幼苗转移至含有250mM NaCl的MS固体培养基上，垂直培养4天，观察地上和地下部分的生长状况，统计存活率并测定细胞膜稳定性。处理重复三次。

其中，细胞膜稳定性的测定方法如下：选取T₃代纯合株系拟南芥种子，经由NaClO消毒后平铺于MS固体培养基上。4℃处理48h，随后转移到光照培养箱中水平培养10天。挑选长势均匀一致的拟南芥幼苗(10棵)转移至H₂O和NaCl(250mM)的过饱和滤纸上，室温处理16h后用ddH₂O对拟南芥幼苗充分冲洗干净，同时选取10棵正常生长且长势均匀一致的拟南芥幼苗，用DDS-1型电导仪测定幼苗电导率。随后用沸水煮30min，放置室温后再次测定其电导率。利用公式CMS(％)＝(1-煮前电导率/煮后电导率)×100％计算各个转基因拟南芥株系和野生型的细胞膜稳定性(CMS)。

转基因拟南芥表型鉴定结果如图10和图11。在萌发期MS条件下，野生型和转基因拟南芥的萌发率无显著差异，但是当在MS中添加不同浓度NaCl(150mM、200mM)时，转基因拟南芥的萌发率显著高于野生型。而且随着NaCl浓度的增加，转基因拟南芥的萌发率也更加显著高于野生型。在苗期，对拟南芥进行250mM NaCl处理4天后，野生型拟南芥的叶片变黄、甚至枯死，转基因拟南芥只有少数叶片有变黄现象。通过统计存活率和细胞膜稳定性，表明转基因拟南芥的存活率和细胞膜稳定性均显著高于野生型。

无论是萌发期还是苗期，空载对照株系的耐盐参数与野生型对照的相应耐盐参数相比基本一致，无统计学差异。

以上结果表明在盐处理条件下转基因拟南芥株系的生理反应受到的影响要小于野生型，也说明了TaPUB15-D可以增强转基因拟南芥株系的耐盐性。

实施例9、TaPUB15-D基因调控拟南芥盐胁迫相关基因的表达

选取转基因拟南芥T₃代纯合株系(L1、L2和L3)、空载对照株系和和野生型种子用NaClO消毒后播种于MS固体培养基上。4℃处理48h，随后转移到光照培养箱中水平培养8天。将拟南芥幼苗移栽到培养盒中培养，四周苗龄时，用250mM NaCl溶液从培养盒底部的小孔渗透土壤，直至土壤饱和。待拟南芥幼苗出现叶片萎蔫、变黄枯萎时取样，样品用液氮迅速冷冻处理，置于﹣80℃保存以提取小麦RNA。用RNA提取试剂盒(TIANGEN，Beijing)提取总RNA，用反转录试剂盒合成第一链cDNA(TIANGEN，Beijing)，采用实时定量方法测定转基因株系中其它盐胁迫相关基因的表达情况。以组成型表达的AtActin基因为内参，设计的引物序列如下：

检测盐胁迫相关基因表达的引物序列如下：

AtSOS1-RT-F：5'-TCGTTTCAGCCAAATCAGAAAGT-3'；

AtSOS1-RT-R：5'-TTTGCCTTGTGCTGCTTTCC-3'。

AtNHX1-RT-F：5'-CCGTGCATTACTACTGGAGACAAT-3'；

AtNHX1-RT-R：5'-GTACAAAGCCACGACCTCCAA-3'。

AtP5CS-RT-F：5'-GAGGGGGTATGACTGCAAAA-3'；

AtP5CS-RT-R：5'-AACAGGAACGCCACCATAAG-3'。

AtCBF3-RT-F：5'-CTAATATGGCAGAAGGGATGC-3'；

AtCBF3-RT-R：5'-AACTCCATAACGATACGTCGTC-3'。

AtRD29A-RT-F：5'-TCGATGCACCAGGCGTAAC-3'；

AtRD29A-RT-R：5'-GTTGACCTTCCGTTGACCAT-3'。

AtKIN1-RT-F：5'-TGGAGCTGGAGCACAACA-3'；

AtKIN1-RT-R：5'-GACCCGAATCGCTACTTGTTC-3'。

检测基因AtActin表达的引物序列如下：

AtActin-RT-F：5'-AGCACTTGCACCAAGCAGCATG-3'；

AtActin-RT-R：5'-ACGATTCCTGGACCTGCCTCATC-3'。

实时定量实验结果如图12所示，在无盐胁迫条件下，转基因株系中的SOS1、KIN1、CBF3、RD29A的表达量显著低于野生型，但是NHX1和P5CS1的表达量无显著变化。在250mMNaCl处理条件下，野生型和转基因株系中所有盐胁迫应答基因的表达量都有明显的上升，但是在转基因株系中KIN1、RD29A、NHX1、P5CS1的表达量显著高于野生型。转基因株系中SOS1、CBF3的表达量与野生型无显著差异。这些结果表明TaPUB15-D影响了盐胁迫响应基因的表达，也暗示着TaPUB15-D在盐胁迫调控网络中起到了一定的作用。其中SOS1、NHX1和NHX2编码Na⁺/H⁺泵，可以将Na⁺泵出体外或泵进液泡中。CBF3、RD29A和KIN1是逆境响应因子，在逆境下过量表达。以上结果表明TaPUB15-D很有可能是通过调控Na⁺、K⁺平衡来增强转基因水稻耐盐性的。

无论是在无盐胁迫条件下还是在250mM NaCl处理条件下，空载对照株系的盐胁迫相关基因与野生型对照的相应盐胁迫相关基因的表达量相比基本一致，无统计学差异。

实施例10、TaPUB15-D基因调控拟南芥Na⁺、K⁺流

将拟南芥T₃代纯合株系(L1、L2和L3)、空载对照株系和野生型种子用NaClO消毒后用枪头均匀点铺于MS固体培养基上。随后将培养皿转移到光照培养箱中垂直培养6天，挑选均匀一致且长势较好的拟南芥幼苗(7棵)转移至含有100mM NaCl的MS培养基上胁迫处理1天，进行非损伤微测。该方法可以利用特异性离子电极，在不接触被测样品的情况下获得进出样品的各种分子和离子浓度、流速及其运动方向的信息。

其中，Na⁺、K⁺流测定实验的具体测定方法如下：将转基因拟南芥和野生型种子用NaClO消毒后用枪头均匀点铺于MS固体培养基上。随后将培养皿转移到光照培养箱中垂直培养6天，挑选均匀一致且长势较好的拟南芥幼苗(7棵)转移至含有100mM NaCl的MS培养基上胁迫处理1天，进行非损伤微测。离子流测定实验均在美国扬格(旭月北京)测试中心完成，测试所用耗材和试剂都由旭月(北京)科技有限公司提供。利用NMT(NMT100Series,Younger USA LLC,Amherst,MA01002,USA)测定盐胁迫下根系组织Na⁺、K⁺的离子流变化情况。记录后的数据导入EXCEL表格中，利用旭月(北京)科技有限公司开发的Mageflux软件进行离子流速计算。

转基因拟南芥Na⁺、K⁺流测定结果如图13所示，在100mM NaCl处理条件下，转基因拟南芥的Na⁺外流大于野生型，而K⁺外流小于野生型，即在转基因拟南芥体内，拥有较低的Na⁺/K⁺。通常条件下，耐盐植物拥有较低的Na⁺/K⁺。

无论是Na⁺流还是K⁺流，空载对照株系均与野生型对照基本一致，无统计学差异。

<110> 中国农业科学院作物科学研究所

<120> 植物耐盐相关蛋白TaPUB15-D及其编码基因与应用

<130> GNCLN170333

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 831

<212> PRT

<213> 小麦（Triticum aestivum L.）

<400> 1

Met Glu Asp Phe Ser Pro Arg Thr Leu Leu Asp Ser Ile Ser His Leu

1 5 10 15

Ser Ala Leu Thr Ser Asp Gly Ser Thr Ala Arg Pro Lys Pro Ile Gln

20 25 30

Asn Tyr Cys Gln Asn Val Cys Asp Ile Ser Ser Ile Val Ser Pro Leu

35 40 45

Ile Glu Asp Ile Cys Lys Ser Pro Glu Glu Gln Leu Asn Glu Val Leu

50 55 60

Arg Glu Leu Asp Thr Ala Ile Asn Glu Ala Ser Gly Leu Ile Gly Asn

65 70 75 80

Trp His Gln Thr Thr Ser Lys Ile Tyr Phe Val Trp Gln Ile Glu Ser

85 90 95

Val Ile Ser Asp Ile Gln Gly Cys Ser Leu Gln Leu Cys Gln Leu Ala

100 105 110

Asn Ser Leu Leu Pro Ser Leu Thr Gly Cys Ala Cys Ile Cys Ile Gln

115 120 125

Lys Leu Gln Asp Ile Asn Tyr Glu His Met Phe Asp Leu Ala Arg Glu

130 135 140

Val Ala Thr Lys Leu Asn Gly Asn Asp Thr Gln Ser Pro Glu Asn Leu

145 150 155 160

Ser Ile Val Ser Ser Ser Leu Ser Leu Ser Thr Asn Leu Glu Leu Tyr

165 170 175

Met Glu Ala Val Ser Leu Glu Asn Leu Arg Thr Arg Ala Met Arg Ser

180 185 190

Glu Asn Arg Lys Glu Leu Glu Leu Ala Glu Glu Met Ile Pro Met Val

195 200 205

Asn Tyr Met His Glu Arg Leu Leu Arg Glu Thr Gln Leu Leu Asn Ile

210 215 220

Asn Gly Val Pro Ile Pro Ala Asp Phe Cys Cys Pro Leu Ser Leu Glu

225 230 235 240

Leu Met Ser Asp Pro Val Ile Leu Ala Ser Gly Gln Thr Tyr Glu Arg

245 250 255

Val Tyr Ile Lys Leu Trp Leu Asp Glu Gly Phe Thr Ile Cys Pro Lys

260 265 270

Thr Arg Gln Arg Leu Ala His Ser Asn Leu Ile Pro Asn Tyr Thr Val

275 280 285

Lys Ala Leu Ile Ser Asn Trp Cys Glu Ser His Asp Ile Lys Leu Pro

290 295 300

Asp Pro Val Lys Ser Leu Lys Leu Asn Phe Pro Ser Ala Ala Ser Ser

305 310 315 320

Leu Gln Asp Leu Ser Ala Thr Gly Asn Ser Pro Leu His Pro Ser Ala

325 330 335

Gly Arg Gly Asn Ile Pro Gly Ser Pro Glu Ala Asp Leu Tyr Met Lys

340 345 350

Ser Leu Asn Arg Ala Ser Pro Ser His Ser Ala Val His Gln Asn Ser

355 360 365

Asp Ala Leu Val Asn Arg Pro Gly His Glu Ala Ser Thr Asn Gln Ser

370 375 380

Ser Asp Tyr Ala Asn Gly Ser Ala Pro Asp Ile Ser Arg Leu Ser Leu

385 390 395 400

Ala Ser Ser Glu Ala Arg Glu Ser Ser Leu Glu Glu Arg His Ala Gly

405 410 415

Ser Asn Val Gln Thr Ser Glu Gln Ser Thr Asp Glu Ala Phe Gln Ala

420 425 430

Ser Leu Leu Asn Gly Asp Ser Gln Asp His Val Gly Ser Ser Ser Val

435 440 445

Asn Gly Ser Leu Pro Asn Ser Gly Gln Leu Asp Gly Glu Cys Asp Asp

450 455 460

Ala Asn Gly Met Val Arg Val Pro Gly Asp Arg Thr Asn Tyr Ser Ser

465 470 475 480

Asp Ala Ser Gly Glu Val Ala Asp Gly Gly Pro Ser Val Ser Ser Ala

485 490 495

Pro Gln Arg Glu Asn Val Met Leu Pro Arg Leu Gly Asp Leu Arg Met

500 505 510

Arg Gly Gln Phe Val Arg Arg Gln Pro Ser Asp Arg Gly Phe Pro Arg

515 520 525

Ile Thr Ser Pro Ser Ser Met Asp Ala Arg Gly Asp Leu Ser Ala Ile

530 535 540

Glu Asn Gln Val Arg Lys Leu Ile Asp Asp Leu Arg Ser Asp Ser Ile

545 550 555 560

Glu Ala Gln Arg Ser Ala Thr Ser Glu Ile Arg Leu Leu Ala Lys His

565 570 575

Asn Met Glu Asn Arg Ile Val Ile Ala Asn Cys Gly Ala Ile Asn Leu

580 585 590

Leu Val Gly Leu Leu His Ser Thr Asp Ala Lys Ile Gln Glu Asn Ala

595 600 605

Val Thr Ala Leu Leu Asn Leu Ser Ile Asn Asp Asn Asn Lys Ile Ala

610 615 620

Ile Ala Ser Ala Asp Ala Val Asp Pro Leu Ile His Val Leu Glu Thr

625 630 635 640

Gly Asn Pro Glu Ala Lys Glu Asn Ser Ala Ala Thr Leu Phe Ser Leu

645 650 655

Ser Val Ile Glu Glu Asn Lys Val Arg Ile Gly Arg Ser Gly Ala Val

660 665 670

Lys Pro Leu Val Asp Leu Leu Gly Asn Gly Thr Pro Arg Gly Lys Lys

675 680 685

Asp Ala Ala Thr Ala Leu Phe Asn Leu Ser Ile Leu His Glu Asn Lys

690 695 700

Gly Arg Ile Val Gln Ala Asp Ala Val Lys Tyr Leu Val Glu Leu Met

705 710 715 720

Asp Pro Ala Ala Gly Met Val Asp Lys Ala Val Ala Val Leu Ala Asn

725 730 735

Leu Ala Thr Ile Pro Glu Gly Arg Thr Ala Ile Gly Gln Ala Arg Gly

740 745 750

Ile Pro Ala Leu Val Glu Val Val Glu Leu Gly Ser Ala Arg Gly Lys

755 760 765

Glu Asn Ala Ala Ala Ala Leu Leu Gln Leu Cys Thr Asn Ser Asn Arg

770 775 780

Phe Cys Ser Ile Val Leu Gln Glu Gly Ala Val Pro Pro Leu Val Ala

785 790 795 800

Leu Ser Gln Ser Gly Thr Pro Arg Ala Arg Glu Lys Ala Gln Ala Leu

805 810 815

Leu Ser Tyr Phe Arg Ser Gln Arg His Gly Asn Ser Ala Arg Arg

820 825 830

<210> 2

<211> 2517

<212> DNA

<213> 小麦（Triticum aestivum L.）

<400> 2

tcacagggtt gatggaagat ttctcaccga ggactctgct tgatagtatc tcgcacctta 60

gtgccttgac ttctgatggc tctactgcaa ggcccaagcc tattcagaac tactgccaaa 120

atgtatgcga tatatcaagc attgtgagcc ctctcataga agatatatgc aagtctcctg 180

aagagcaact caatgaggtg ttaagggagc ttgacactgc tataaacgaa gcttcagggc 240

ttattgggaa ctggcaccaa acgaccagca aaatatactt tgtttggcaa attgaatcag 300

tgatctcgga tattcaggga tgctcccttc aattgtgcca gcttgctaat tctttattac 360

cttctctgac tggatgtgct tgcatttgta ttcagaaact ccaggacatc aattatgagc 420

acatgtttga tttggcgagg gaggtcgcaa cgaagctaaa tgggaatgac acacaaagtc 480

ccgagaatct gtcgatagta tcaagttcat taagtctgtc aactaacctt gaattataca 540

tggaagctgt ttccctcgag aatctgagaa caagggcaat gcgaagtgag aaccgtaaag 600

aactcgagct tgctgaggag atgattccaa tggtcaacta tatgcacgag cgccttctca 660

gggaaacaca gttgcttaac atcaacgggg tacccattcc tgctgatttc tgttgcccac 720

tatccctgga gctgatgtct gatcctgtta ttttagcatc tggtcagacc tatgagcggg 780

tttatatcaa gttgtggctc gatgaaggtt ttactatctg cccgaagaca cgccaaagac 840

ttgctcattc taatttaatt cctaactata ctgtgaaagc tttgatatcc aactggtgtg 900

agtcccatga tattaagcta cctgatcctg tgaaatcctt gaagttgaac tttccgtcag 960

cagcctcctc ccttcaggat ttgagcgcca caggcaacag ccctctacat cctagtgctg 1020

gtaggggtaa tattcctggg tcaccagaag ctgacctgta tatgaaaagc ctgaatagag 1080

catctccttc ccacagtgcg gtccaccaga actctgatgc acttgtgaat cgtcctggcc 1140

atgaggcatc caccaatcag tcttcagatt atgcaaatgg ctctgcacca gatatttcaa 1200

ggctatctct tgcgagttct gaagcaagag aatctagttt ggaagaaaga catgctggtt 1260

ccaatgtaca aacctcagaa caatcgacgg atgaagcatt tcaagcatct cttttgaacg 1320

gtgattcaca ggaccatgta ggcagctctt ctgttaatgg gagtcttcct aatagcggtc 1380

agcttgatgg ggaatgtgac gacgccaatg ggatggtacg agttccaggt gataggacaa 1440

attacagtag tgatgcatct ggagaagttg ctgacggtgg gccttctgtc tcttccgccc 1500

ctcaaaggga aaatgtaatg ctcccaagat tgggtgatct ccgcatgaga gggcaatttg 1560

ttcggcggca accatctgac aggggattcc ctagaataac atctccctcg tccatggatg 1620

cccgaggtga tctttctgcc attgagaatc aggtacgcaa gctaattgat gatttgagaa 1680

gcgattccat agaagctcag agatcagcaa catcagagat ccgccttcta gctaagcaca 1740

acatggagaa caggattgtc attgcaaatt gtggggctat aaacttgctg gttggtctcc 1800

ttcattcaac agatgccaaa atccaagaaa atgcagtgac ggccctcctc aatttgtcaa 1860

tcaatgacaa caataagatt gccattgcga gtgcagatgc tgttgatcct ctcatccatg 1920

tcctggaaac agggaaccct gaagctaaag agaattcagc ggctactctg ttcagtctgt 1980

cggttatcga agagaacaag gtgaggattg gacggtctgg tgccgtcaag cctcttgtgg 2040

acttgctggg aaacgggacc ccgcgaggga agaaagatgc agccaccgca ttgttcaatc 2100

tgtcgatact ccatgagaac aagggtcgca tcgtgcaagc tgatgctgtg aagtacctag 2160

ttgagcttat ggatcctgct gctggcatgg tggacaaagc cgtagccgtc ttggcaaacc 2220

ttgccacgat accagaaggg aggaccgcaa tcgggcaggc ccgtggtatc ccagccctcg 2280

tcgaagtcgt cgagttgggt tcggcacggg ggaaagaaaa cgctgccgcg gcgttgcttc 2340

agctatgcac aaacagcaat aggttctgca gcatagttct ccaagagggt gccgtacctc 2400

ctctagtcgc gctgtcacag tcaggaacac ctcgggcaag agaaaaggcg caggctcttc 2460

tcagctattt ccgcagccaa agacatggga actcggcgag gagatgatga tgttagc 2517

Claims

1.蛋白质，是如下(a)或(b)：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2.编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子。

3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子为编码权利要求1所述蛋白质的基因，所述基因为如下1)或2)或3)或4)的DNA分子：

1)序列表中序列2的第12-2507所示的DNA分子；

2)序列表中序列2所示的DNA分子；

4.含有权利要求2或3所述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为重组表达载体或重组克隆载体。

6.权利要求1所述蛋白质或权利要求2或3所述核酸分子或权利要求4或5所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在如下任一中的应用：

(a)提高植物耐盐性；

(b)选育耐盐性提高的植物品种；

(c)提高植物耐盐相关基因的表达；

(d)调控植物体内Na⁺、K⁺平衡；

(e)改善植物根系形态。

7.培育具有如下(b1)-(b4)所示性状中至少一种的转基因植物的方法，包括如下(a1)和(a2)的步骤：

(a1)向受体植物中导入权利要求1所述蛋白质的编码基因，得到表达所述编码基因的转基因植物；

(a2)从步骤(a1)所得转基因植物中得到与所述受体植物相比，具有如下(b1)-(b4)所示性状中至少一种的转基因植物：

(b1)耐盐性提高；

(b2)耐盐相关基因表达量提高；

(b3)体内Na⁺/K⁺降低；

(b4)根系更加发达。

8.根据权利要求6或7所述的应用或方法，其特征在于：所述植物为单子叶植物。

9.根据权利要求6或7所述的应用或方法，其特征在于：所述植物为双子叶植物。

10.根据权利要求8或9所述的应用或方法，其特征在于：所述单子叶植物为水稻；所述双子叶植物为拟南芥。