CN103012570B - 植物抗逆性相关蛋白PpLEA3-21及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种植物抗旱性相关蛋白及其编码基因与应用。本发明所提供的植物抗旱性相关蛋白是如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗旱性相关的由序列2衍生的蛋白质。干旱胁迫实验结果表明，稳定遗传的转PpLEA3-21基因植株Line3在干旱处理20天后复水，复水10天后其成活率恢复到71%，而空载体对照植株成活率为0，说明本发明提供的PpLEA3-21基因与其编码的蛋白能够显著提高水稻的耐旱性。本发明对培育抗旱植物新品种，特别是培育抗旱水稻具有重要的理论及实际意义。

Description

植物抗逆性相关蛋白PpLEA3-21及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种植物抗逆性相关蛋白及其编码基因与应用，特别涉及一种来源于苔藓植物的植物抗旱性相关蛋白PpLEA3-21及其编码基因与应用。

背景技术

苔藓植物是5亿年前古奥陶纪出现的陆地先锋植物，其生活史中以“茎叶体”的配子体为主要营养生长阶段。“茎叶体”叶片由单层细胞组成，仅在其“中肋”处由少数几层细胞组成，无输导组织和气孔等调控水分代谢的组织结构，保留着明显的水生植物的特征。由于缺乏水分输导和调控系统，因此，当原始“苔藓植物”离水登陆时，必然首先面对两大胁迫：水分亏损、温度骤变。巨大的选择压力迫使苔藓植物进化出不同于“维管植物”（蕨类、种子植物）的逆境应对机制。

自然环境中的干旱、盐碱、低温等胁迫因素对植物的生长发育有重要影响，严重时会造成农作物大规模减产，培育耐逆性作物是种植业的主要目标之一。当前，通过基因工程育种获得具有耐逆性的作物品种是一种行之有效的方法。而该方法中最关键的技术瓶颈问题是有效抗逆基因的筛选与功能发现。

发明内容

本发明的目的是提供一种与植物抗旱性相关的蛋白及其编码基因与应用。

本发明所提供的与植物抗旱性相关的蛋白，名称为PpLEA3-21，来源于小立碗藓（Physcomitrella patens），是如下（a）或（b）的蛋白质：

（a）由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（b）将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗旱性相关的由序列2衍生的蛋白质。

序列表中序列2由233个氨基酸残基组成。

为了便于PpLEA3-21蛋白的纯化，可在由序列表中序列2的氨基酸残基序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。

表：标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6（通常为5个）	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个）	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK

c-myc

10

EQKLISEEDL

上述（a）中的PpLEA3-21蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述（b）中的PpLEA3-21蛋白的编码基因可通过将序列表中序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上上表所示的标签的编码序列得到。上述（b）中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

编码所述PpLEA3-21蛋白的核酸分子也属于本发明的保护范围。

所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA、hnRNA或tRNA等。

在本发明的一个实施例中，所述核酸分子具体为编码所述PpLEA3-21蛋白的基因（命名为PpLEA3-21）；所述PpLEA3-21基因是如下1）至4）中任一所述的DNA分子：

1）编码序列为序列表中序列1所示的DNA分子；

2）序列表中序列1所示的DNA分子；

3）在严格条件下与1）或2）限定的DNA分子杂交且编码所述PpLEA3-21蛋白的DNA分子；

4）与1）或2）或3）限定的DNA分子具有90%以上同源性且编码所述PpLEA3-21蛋白的DNA分子。

上述严格条件可为用6×SSC，0.5%SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1%SDS和1×SSC，0.1%SDS各洗膜一次。

其中，序列表中的序列1由702个核苷酸组成，其开放阅读框架（ORF）为自5′末端第1-702位核苷酸，编码序列表中序列2所示的蛋白质（PpLEA3-21蛋白）。

含有上述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。

所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。

所述重组表达载体可用现有的表达载体构建。所述表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，它们可单独使用或与其它的启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入在植物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因（GUS基因、GFP基因、萤光素酶基因等）、具有抗性的抗生素标记物（庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等）或是抗化学试剂标记基因（如抗除莠剂基因）等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

在本发明中，所述重组表达载体中启动所述PpLEA3-21基因转录的启动子具体为玉米Ubiquitin启动子。

更为具体的，所述重组表达载体为在插有所述玉米Ubiquitin启动子的质粒pCambia1390的多克隆位点间插入所述PpLEA3-21基因得到的，由所述玉米Ubiquitin启动子启动所述PpLEA3-21基因转录的重组质粒。

更进一步，在本发明的一个实施例中，所述重组表达载体按照包括如下步骤的方法制备得到：

（1）将所述玉米Ubiquitin启动子（其核苷酸序列可如序列表中序列3所示）序列插入到质粒pCambia1390的多克隆位点HindIII和KpnⅠ之间，得到中间载体；

（2）将所述PpLEA3-21基因插入到所述中间载体的多克隆位点BglⅡ和SpeⅠ之间，得到所述重组表达载体。

所述表达盒由能够启动所述PpLEA3-21基因表达的启动子，所述PpLEA3-21基因，以及转录终止序列组成。

所述PpLEA3-21蛋白，或所述核酸分子，或所述重组表达载体、表达盒或重组菌在如下a1）或a2）中的应用也属于本发明的保护范围：

a1）调控植物抗旱性；

a2）选育抗旱性提高的植物品种。

在本发明的一个实施例中，所述调控植物抗旱性具体为提高植物抗旱性。所述选育抗旱性提高的植物品种的方法，具体可包括将所述PpLEA3-21蛋白表达量较高的植物作为亲本进行繁殖的步骤。

本发明的另一个目的是提供一种培育抗旱性提高的转基因植物的方法。

本发明所提供的培育抗旱性提高的转基因植物的方法，具体可包括将编码所述PpLEA3-21蛋白的基因导入目的植物中得到转基因植物的步骤；所述转基因植物与所述目的植物相比，抗旱性提高。

在上述方法中，所述PpLEA3-21蛋白在所述转基因植物中的表达量高于所述目的植物中的表达量。编码所述PpLEA3-21蛋白的基因（PpLEA3-21基因）具体可是如下1）至4）中任一所述的DNA分子：

1）编码序列为序列表中序列1所示的DNA分子；

2）序列表中序列1所示的DNA分子；

3）在严格条件下与1）或2）限定的DNA分子杂交且编码所述PpLEA3-21蛋白的DNA分子；

4）与1）或2）或3）限定的DNA分子具有90%以上同源性且编码所述PpLEA3-21蛋白的DNA分子。

上述严格条件可为用6×SSC，0.5%SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1%SDS和1×SSC，0.1%SDS各洗膜一次。

所述PpLEA3-21基因具体可通过上述任一所述重组表达载体导入所述目的植物中，得到所述转基因生物。

在上述方法中，所述植物可为单子叶植物，也可分为双子叶植物。

在本发明的一个实施例中，所述植物为单子叶植物，为水稻，具体为水稻（Oryzasativa L.）品种日本晴。

扩增所述PpLEA3-21基因全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

实验证明，将本发明所提供的PpLEA3-21基因导入野生型水稻日本晴中，获得转基因水稻，稳定遗传的4个转PpLEA3-21基因植株（Line1，2，3，4），在干旱胁迫实验中，转PpLEA3-21基因植株生长状态都要明显好于空载体对照植株，干旱处理20天后复水，Line3成活率能恢复到70%，而空载体对照植株成活率为0，说明本发明提供的PpLEA3-21基因与其编码的蛋白能够显著提高水稻的耐旱性。本发明对培育抗旱植物新品种，特别是培育抗旱水稻具有重要的理论及实际意义。

附图说明

图1为小立碗藓（Physcomitrella patens）茎叶体蛋白质的双向凝胶电泳图谱。其中，A为未经干旱处理的对照；B为干旱处理3天的植株。箭头指示处为PpLEA3-21蛋白，该蛋白在干旱处理的植株中丰度显著增加。

图2为重组表达载体PpLEA3-21-pCUBI1390的结构图。其中，Gene表示PpLEA3-21基因。

图3为转PpLEA3-21基因水稻T₁代部分植株DNA的PCR分子检测的电泳图。其中，泳道M为DNA分子量标准；泳道1、3、4、5、6、7、9、11为转PpLEA3-21基因水稻阳性株系；泳道2为野生水稻日本晴（野生型对照）；泳道8和10为转入空载体pCUBI1390的株系（空载体对照）。

图4为转PpLEA3-21基因T₂代阳性株系的RT-PCR表达分析。其中Actin基因为内参，1为转入空载体pCUBI1390的株系（空载体对照），2-5为4个转PpLEA3-21基因株系。

图5为转PpLEA3-21基因植株在耐旱性实验中的生长状况。其中，A为干旱处理前；B为干旱处理15天后；C为干旱复水10天后。A-C中，株系Line1-4均为4个经筛选遗传稳定的转PpLEA3-21基因水稻株系；CK均为转入空载体pCUBI1390的株系（空载体对照）。

图6为复水10天后各水稻株系的成活率统计结果。其中，株系Line1-4为4个经筛选遗传稳定的转PpLEA3-21基因水稻株系；CK为转入空载体pCUBI1390的株系（空载体对照）。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。

小立碗藓（Physcomitrella patens）：记载于“耿旭珂等，2008植物基因打靶——模式植物小立碗藓的应用.生物学通报，43（4）：13-15”一文中，公众可从中国农业科学院生物技术研究所获得。

水稻（Oryza sativa L.）品种日本晴：记载于“A draft sequence of the rice genome(Oryza sativa L.ssp.Japonica.Science.2002 Apr 5;296(5565):92-100”一文中，公众可从中国农业科学院生物技术研究所获得。

pCambia 1390载体：可购自Cambia,Queensland.Australia。

农杆菌AGL1：购自北京鼎国生物技术有限责任公司。

所用培养基配方如下表：

实施例1、与植物抗旱性相关蛋白PpLEA3-21及其编码基因的获得

一、与植物抗旱性相关蛋白PpLEA3-21的获得

正常培养组：将生长在BCD培养基上的小立碗藓（Physcomitrella patens）茎叶体转移至浸湿的滤纸上，放入500ml烧杯中，用吸水纸封口。在温度24±1℃，相对湿度30±5%的培养室内进行培养。培养3天后的小立碗藓材料用于之后的实验。

干旱处理组：：在经过灭菌处理的结晶皿中铺10张滤纸。选取长势比较好的小立碗藓原丝体材料，将玻璃纸连同小立碗藓材料一起转移到铺有滤纸的结晶皿中，用封口膜封口，放到培养架（温度24±1℃，相对湿度30±5%）培养。处理大约3天的时候，小立碗藓材料脱水程度可达到90%以上。将处理过的材料保存，用于之后的实验。

以正常培养组和干旱处理组的小立碗藓茎叶体为实验材料，采用酚抽提法分别提取蛋白质。将两组提取的蛋白质分别通过经典的IEF/SDS-PAGE双向电泳（2DE）和荧光差异凝胶电泳（DIGE）进行分离。具体步骤按照Amersham Bioscience提供的实验操作指南进行。

获得的蛋白质图谱分别经过ImageMaster 2D Platinum（Amersham Bioscience）和DeCyder 2D Software，Version 6.5（Amersham Bioscience）分析。与正常培养组相比，干旱处理组丰度变化超过2倍的蛋白质点被分离获得。将所有的差异蛋白点分别用胰蛋白酶处理，所获多肽用质谱仪（MALDI TOF/TOF MS）和数据库（NCBI，小立碗藓基因组）鉴定。

结果显示，与正常培养组相比，干旱处理组有一个蛋白在经典的双向电泳（2DE）上调了6倍（图1）。通过质谱分析，获得它的氨基酸序列（如序列表中序列2所示），将该蛋白质命名为PpLEA3-21。

二、与植物抗旱性相关蛋白PpLEA3-21编码基因的获得

首先提取步骤一中干旱处理组的小立碗藓茎叶体总RNA，将RNA反转录得到cDNA。以该cDNA为模板，采用引物1和引物2进行PCR扩增，对PCR产物进行0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，得到分子量约为0.7Kbp的条带。用琼脂糖凝胶回收试剂盒（TIANGEN）回收该片段。将该回收片段与pMD19-T Simple（Takara）连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，根据pMD19-T Simple载体上的羧卞青霉素抗性标记筛选阳性克隆，得到含有回收片段的重组质粒。以该重组质粒上的通用引物M13对其进行核苷酸序列测定，测序结果表明扩增到的基因由702个脱氧核糖核苷酸组成，如序列1所示，其开放阅读框（ORF）为序列表中序列1的自5＇末端第1至702位脱氧核糖核苷酸，将该基因命名PpLEA3-21。PpLEA3-21基因编码氨基酸序列如序列表中序列2所示的蛋白质。连接了序列1的重组克隆载体命名为PpLEA3-21-pMD19。

引物1：5’-GGAAGATCTatggctgggtacatgggt-3’（下划线部分为酶切位点Bgl II的识别序列，其后的序列为序列1的第1-18位）

引物2：5’-GGACTAGTTTACACGTCAGCGCTGC-3’（下划线部分为酶切位点SpeI的识别序列，其后的序列为序列1的第686-702位的反向互补序列）

实施例2、转PpLEA3-21基因水稻的获得及其抗旱性检测

一、转PpLEA3-21基因水稻的获得及鉴定

1、重组表达载体PpLEA3-21-pCUBI1390的构建

（1）中间载体pCUBI1390的构建

以玉米基因组DNA为模板，以引物3和引物4进行PCR扩增，获得两端分别带有酶切位点Kpn Ⅰ和Hind III的玉米Ubiquitin启动子（GENBANK：AY572837.1的第879-2864位）。

引物3：5’-GGTACCCCTCTAGTGCAGAAGTAACACCA-3’（下划线部分为KpnⅠ的识别位点，其后的序列为GENBANK：AY572837.1的第868-890位）

引物4：5’-AAGCTTTCTAGTGCAGTGCAGCGTGAC-3’（下划线部分为HindIII的识别位点，其后的序列为GENBANK：AY572837.1的第2849-2869位的反向互补序列）

将上述PCR扩增得到的两端分别带有酶切位点KpnⅠ和Hind III的玉米Ubiquitin启动子序列用限制性内切酶KpnⅠ和Hind III进行双酶切，将酶切产物与经过同样双酶切的植物双元表达载体pCambia 1390的骨架大片段相连，获得重组质粒。经测序表明在pCambia 1390的酶切位点KpnⅠ和Hind III之间插入GENBANK：AY572837.1的第868-2869位的重组质粒为阳性，将其命名为中间载体pCUBI1390。

（2）重组表达载体PpLEA3-21-pCUBI1390的构建

用限制性内切酶BglⅡ和SpeⅠ双酶切实施例1获得的重组克隆载体PpLEA3-21-pMD19，回收目的片段PpLEA3-21基因，并将其与经过同样双酶切的步骤（1）所述中间载体pCUBI1390的骨架大片段相连，获得重组质粒。将测序表明在所述中间载体的酶切位点BglⅡ和Spe Ⅰ之间插入了序列表中序列1所示的PpLEA3-21基因的重组质粒为阳性，将其命名为PpLEA3-21-pCUBI1390（质粒结构图如图2所示）。在重组表达载体PpLEA3-21-pCUBI1390中，PpLEA3-21基因位于玉米Ubiquitin启动子下游，所述玉米Ubiquitin启动子启动所述PpLEA3-21基因的转录。该重组表达载体具有卡纳霉素和潮霉素两个筛选标记（pCambia 1390载体自带）。

2、转PpLEA3-21基因水稻的获得及鉴定

（1）转PpLEA3-21基因水稻的获得

将步骤1获得的重组表达载体PpLEA3-21-pCUBI1390用电击的方式转入农杆菌AGL1中。对转化后的重组农杆菌用引物1和引物2扩增PpLEA3-21基因，用引物3和引物4扩增玉米Ubiquitin启动子序列。将经鉴定表明同时含有PpLEA3-21基因（序列表中序列1，目的条带大小约为700bp）和玉米Ubiquitin启动子（GENBANK：AY572837.1的第879-2864位，目的条带大小约为2000bp）的重组农杆菌命名为AGL1/PpLEA3-21-pCUBI1390。同时设置转入中间载体pCUBI1390的对照（空载体对照），所得重组农杆菌命名为AGL1/pCUBI1390。

将重组农杆菌AGL1/PpLEA3-21-pCUBI1390或AGL1/pCUBI1390置于28℃培养，待其浓度达到OD600值为0.120～0.140之间时，用农杆菌菌液侵染水稻品种日本晴的愈伤组织，侵染30分钟，期间不时用手轻摇。将愈伤组织转移到共培养培养基上，避光共培养3～4天。共培养结束后，将愈伤组织转移到选择培养基上培养10～15天后继代一次。挑取从原愈伤组织表面生长出来的新的抗性愈伤组织，转移到预分化培养基上，28℃黑暗下预分化培养7天。选择奶白色，表面光滑的愈伤组织转移到分化培养基上，28℃分化培养：先在黑暗下培养3天，然后在持续冷光照下培养15～20天。将从抗性愈伤组织再生出的幼苗转移到生根培养基上，持续光照培养15天，生长状况良好的幼苗直接转移到大田种植。当年秋季收获转基因水稻种子，为T₁代。

收获T₁代种子后，播于含潮霉素（30mg/L）的MS基本培养基上筛选。待T₁代植株长至4-6叶时移到大田中生长。将T₁代单株收获后，各单株种子分别播种，用潮霉素继续筛选以观察T₂代的分离情况，获得稳定遗传的转PpLEA3-21基因株系（T₂代）以及转入空载体pCUBI1390的株系（T₂代）。

（2）转PpLEA3-21基因水稻的鉴定

选择步骤（1）获得的转PpLEA3-21基因株系和转入空载体pCUBI1390的株系各20株，分别进行PCR、RT-PCR分子鉴定。同时以未转基因的野生水稻日本晴作为对照。

PCR验证：用CTAB法提取T₁代水稻基因组DNA，使用引物5引物6对PpLEA3-21基因进行PCR扩增，使用引物3和引物4对玉米Ubiquitin启动子进行扩增。

引物5：5′-atggctgggtacatgggt-3′（序列1的第1-18位）

引物6：5′-TTACACGTCAGCGCTGC-3′（序列1的第686-702位的反向互补序列）

结果显示，T₁代转PpLEA3-21基因的株系均扩增出了大小约为700bp的PpLEA3-21基因目的条带，而转入空载体pCUBI1390的株系以及野生水稻日本晴均未扩增出PpLEA3-21基因目的条带。转PpLEA3-21基因株系以及转入空载体pCUBI1390的株系均扩增出了大小约为2000bp的玉米Ubiquitin启动子目的条带，而野生水稻日本晴均未扩增出玉米Ubiquitin启动子目的条带。部分T₁代株系的PpLEA3-21基因扩增结果如图3所示。

RT-PCR验证：用Trizol法提取T₂代水稻RNA。反转录后获得cDNA，用作RT-PCR分析模板，目标基因PpLEA3-21的引物为引物7和引物8。根据已报道的水稻actin序列设计内参引物，actin-F和actin-R。PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s；58℃退火30s；72℃延伸40s；30个循环；72℃延伸5min。

引物7：5′-CAGTTTGGTGTCGGTGGGAA-3′（序列1的第343-362位）

引物8：5′-TGAGTCCGTCCTTCTTGGCA-3′（序列1的第537-556位的反向互补序列）

actin-F：5′-GATACTCCCTCACAACAACCGC-3′

actin-R：5′-TGACCATCAGGCATCTCATAGC-3′

结果显示，T₂代各转PpLEA3-21基因株系中PpLEA3-21基因的表达量较高且彼此相近，而转入空载体pCUBI1390的株系以及野生水稻日本晴均未检测到PpLEA3-21基因的表达。部分T₂代株系的PpLEA3-21基因的RT-PCR检测结果如图4所示。

二、转PpLEA3-21基因水稻的抗旱功能鉴定

以生长状态一致（出芽后生长一个月的植株）的，步骤一中获得的稳定遗传的T₂代的4个转PpLEA3-21基因株系（Line1、Line2、Line3和Line4）为实验材料，浇水至饱和后，停止浇水（图5中A），待盆中土表刚刚变干视为干旱开始，记为第1天，定期观察植株表型。干旱处理第20天时进行复水处理，复水10天后观察各植株表型，并统计植株存活率。同时设置转入空载体pCUBI1390的株系作为空载体对照（CK），设置未转基因的水稻品种日本晴作为野生型对照（WT）。实验重复3次，存活率统计结果取平均值。

结果显示，在干旱第10天时转入空载体pCUBI1390的株系萎蔫，叶片发黄，转PpLEA3-21基因水稻株系缺水状况不明显，第15天时转入空载体pCUBI1390的株系和野生型水稻日本晴的叶片干枯，而转PpLEA3-21基因水稻株系叶片轻微萎蔫（图5中B）。复水10天后，空载体对照组以及野生型对照组水稻植株均不能复活，而转PpLEA3-21基因水稻的大部分植株均能够复活（图5中C），具体的植株成活率统计结果如图6和表1所示，4个转PpLEA3-21基因株系中，Line3的成活率最高，可达71%，转PpLEA3-21基因株系Line4的成活率最低，仍可达30%。上述的结果说明，与空载体对照组以及野生型对照组相比，转PpLEA3-21基因水稻的抗旱性得到了明显提高。

表1各水稻植株存活率的三次重复实验统计结果（单位：%）

Claims (3)

1.由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质，或序列表中序列1所示的DNA分子在如下a1）或a2）中的应用：

a1）调控植物抗旱性；

a2）选育抗旱性提高的植物品种；

所述植物为水稻。

2.一种培育抗旱性提高的转基因植物的方法，包括将编码权利要求1所述蛋白质的基因导入目的植物中得到转基因植物的步骤；所述转基因植物与所述目的植物相比，抗旱性提高；所述植物为水稻。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述编码权利要求1所述蛋白质的基因为序列表中序列1所示的DNA分子。

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