CN102776229B

CN102776229B - 苔藓PpDHN-31蛋白及其编码基因在提高植物抗旱性中的应用

Info

Publication number: CN102776229B
Application number: CN 201210263008
Authority: CN
Inventors: 崔素霞; 何奕騉; 路铁刚; 李利; 张治国; 陈希; 李幼英; 蔺平亮
Original assignee: Capital Normal University
Current assignee: Capital Normal University
Priority date: 2012-07-26
Filing date: 2012-07-26
Publication date: 2013-09-04
Anticipated expiration: 2032-07-26
Also published as: CN102776229A

Abstract

本发明公开了一种苔藓PpDHN-31蛋白及其编码基因在提高植物抗旱性中的应用。实验证明，转PpDHN-31基因株系与转空载体对照株系和野生型水稻日本晴（WT）植株相比，具有抗渗透胁迫能力，且在开花灌浆期停止浇水15天至土壤严重干旱，复水30天后的植株存活率达92.9%-100%，明显高于转空载体对照株系植株和野生型水稻日本晴（WT）的27.3%；经上述开花灌浆期干旱处理后转PpDHN-31基因各株系主茎单穗总粒重为9.7-20.5克，而野生型对照平均为1.1克。本发明为培育抗旱植物提供了一种新的途径，在农业领域具有广阔的应用空间和市场前景。

Description

苔藓PpDHN-31蛋白及其编码基因在提高植物抗旱性中的应用

技术领域

本发明涉及一种苔藓PpDHN-31蛋白及其编码基因在提高植物抗旱性中的应用。

背景技术

干旱严重制约植物的生长发育,常常造成各类农作物的大规模减产。在有限的水资源供给下，选择种植高耐逆性作物非常必要。分子育种是培育高耐逆性作物的一种行之有效的方法。该方法中最关键的技术瓶颈问题是有效抗旱基因的筛选与功能发现。

苔藓植物是5亿年前出现的陆地先锋植物，生活史中配子体阶段较长，为主要营养组织。在配子体阶段，以具有假根、茎、叶的“茎叶体”为主。“茎叶体”叶片由单层细胞组成，仅在其“中肋”处由少数几层细胞组成，无输导组织和气孔等调控水分代谢的组织结构，保留着明显的水生植物的特征。由于缺乏水分输导和调控系统，因此，当原始“苔藓植物”离水登陆时，必然首先面对两大胁迫：水分亏缺、温度骤变。巨大的选择压力迫使苔藓植物进化出不同于维管植物（蕨类、种子植物）的干旱应对机制。事实表明：苔藓植物的抗旱性远远高于维管植物，其细胞内的一些基因承担着应对严重干旱的责任。实验已经证明，这些基因可以保护细胞在脱水80%时免于干旱伤害。因此，这些苔藓基因是抗旱作物分子育种的重要“候选分子”。

发明内容

本发明的一个目的是提供苔藓PpDHN-31蛋白的新用途，该蛋白质的氨基酸序列如序列表序列1所示，所述新用途为序列表序列1所示蛋白可用于提高植物耐旱性，或提高序列表序列1所示蛋白表达量的物质或方法可用于提高植物耐旱性。

本发明的另一个目的是提供一种提高植物耐旱性的方法，是将序列表序列1所示蛋白的编码基因导入目的植物中，得到耐旱性高于所述目的植物的转基因植物。

在上述方法中，所述序列表序列1所示蛋白的编码基因为如下1）或2）或3）或4）的基因：

1）其核苷酸序列是序列表序列2所示的DNA分子；

2）其核苷酸序列是序列表序列2中第62-934位所示的DNA分子；

3）与1）或2）限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同一性且编码序列表序列1所示蛋白的DNA分子；

4）在严格条件下与1）或2）或3）限定的DNA序列杂交且编码序列表序列1所示蛋白的DNA分子。

序列表序列2的核苷酸序列长1008bp，是苔藓PpDHN-31蛋白的部分cDNA序列，序列表序列2中第62-934位为开放阅读框，编码序列表序列1所示的苔藓PpDHN-31蛋白。

所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠（SDS）、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1% SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1% SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％ SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1% SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％ SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1% SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％ SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1%SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5%SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1% SDS和1×SSC，0.1% SDS各洗膜一次。

在上述方法中，所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物。

在上述方法中，所述单子叶植物为水稻。

实验证明，3个转PpDHN-31基因株系L11-6,L14-7和L14-10的水稻幼苗在含15%PEG-8000的1/2 Hogland液体培养基中(模拟轻度干旱)处理2天，再转移至含25%PEG-8000的1/2 Hogland液体培养基中(增加干旱强度)继续处理3天，复水5天后可以恢复正常生长，而转空载体对照株系和野生型水稻日本晴（WT）植株大部分不能恢复生长；在开花灌浆期停止浇水15天至土壤严重干旱，复水30天后的植株存活数分别为92.9%、100%和100%，而转空载体对照株系植株和野生型水稻日本晴（WT）的存活率均为27.3%；经上述开花灌浆期的干旱处理后转PpDHN-31基因株系L11-6,L14-7和L14-10的主茎单穗总粒重分别为9.7、12.6和20.5克，而野生型对照平均为1.1克。本发明为培育抗旱植物提供了一种新的途径，在农业领域具有广阔的应用空间和市场前景。

附图说明

图1为小立碗藓（Physcomitrella patens）茎叶体的荧光差异凝胶电泳（DIGE）图谱。其中，图A为对照未经干旱处理，图B为经过干旱处理。

图2为重组载体pCU-PpDHN-31的T-DNA片段结构示意图。其中，LB和RB分别代表左边界和右边界，Hygromycin为潮霉素磷酸转移酶基因，35S为花椰菜病毒的启动子，Ubiquitin为玉米泛素启动子，PpDHN-31为插入的目的基因。

图3为转PpDHN-31株系的PCR电泳图。其中，M为Marker，从上到下的片段依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp和250bp。

图4为转PpDHN-31株系幼苗期的株高统计结果。

图5为转PpDHN-31株系幼苗期的耐渗透胁迫结果。其中，图A为未经PEG-8000处理的对照结果，图B为经过PEG-8000处理结果。

图6为转PpDHN-31株系成熟期的株高统计结果。

图7为转PpDHN-31株系成熟期的植株生长状态。

图8为成熟期的转PpDHN-31株系耐旱性的存活率统计结果。

图9为成熟期的转PpDHN-31株系耐旱性的主茎单株总粒重统计结果。

图3—9中，WT为野生型水稻日本晴，L11-6、L14-7、L14-10分别代表3个转PpDHN-31的株系。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

小立碗藓（Physcomitrella patens）：Cui et al.Proteome analysis ofPhyscomitrella patens exposed to progressive dehydration andrehydration.Journal of Experimental Botany,2012,63(2):711-726；公众可从首都师范大学获得。

水稻品种日本晴（Oryza sativa L.spp．japonica，cv.Nipponbare）：Goff etal.A Draft Sequence of the Rice Genome(Oryza sativa L.ssp.japonica).Science.2002,296:92-100；公众可从首都师范大学获得。

根癌农杆菌LBA4404（Agrobacterium tumefaciens strain LBA4404）：中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心（Biovector Scicnce Lab Inc.）.

实施例1、苔藓抗旱相关蛋白PpDHN-31及其编码基因的获得

将生长在BCD培养基上的小立碗藓（Physcomitrella patens）茎叶体转移至浸湿的滤纸上，放入500ml烧杯中，用吸水纸封口。在温度24±1℃，相对湿度30±5%的培养室内进行干旱处理，3天后，取出干旱的茎叶体利用酚抽提法进行蛋白质提取，以未经干旱处理在正常条件下生长的茎叶体为对照。来自正常条件下和干旱条件下的蛋白质通过荧光差异凝胶电泳（DIGE）分离（具体步骤按照Amersham Bioscience提供的实验操作指南进行），获得的蛋白质图谱用DeCyder 2D Software，Version 6.5（Amersham Bioscience）进行分析。

结果在干旱条件下有5个蛋白点在荧光差异凝胶电泳（DIGE）图谱中分别上调3.75、3.01、2.90、1.94、1.59倍（图1）。将这5个蛋白点分别用胰蛋白酶处理，经质谱仪（MALDI TOF/TOF MS）和数据库（NCBI，小立碗藓基因组）鉴定后确认它们来自于同一个基因。该基因被命名为PpDHN-31，其编码的蛋白质命名为PpDHN-31。

根据基因序列设计引物，以获得全长的cDNA。首先提取经上述干旱处理后的小立碗藓茎叶体总RNA，将RNA用逆转录酶合成cDNA。根据上述检索获得基因的CDS序列设计引物如下：5’-GGGGTACCACCGCATCCTGACATTT-3’（下划线部分碱基为Kpn I识别序列）和5’-CGCGGATCCACAACCGCATACACACA-3’（下划线部分碱基为BamH I识别序列）。以反转录得到的cDNA为模板，进行PCR扩增,对PCR产物进行0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，得到分子量约为1kb的条带，与预期结果相符。用琼脂糖凝胶回收试剂盒（TIANGEN）回收该片段。将该回收片段与pMD19-T Simple（Takara）连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，根据pMD19-T Simple载体上的羧卞青霉素抗性标记筛选阳性克隆，得到含有回收片段的重组质粒。以该重组质粒载体上的通用引物M13对其进行核苷酸序列测定，测序结果表明扩增得到序列表序列2所示的1008bp序列（命名PpDHN-31），其开放阅读框(ORF)为序列表中序列2的自5＇末端第62至934位脱氧核糖核苷酸，编码序列表序列1所示的蛋白质PpDHN-31。

实施例2、转PpDHN-31基因培育耐旱植物

1、表达目的基因的重组载体构建

将序列表中序列3所示的玉米Ubiquitin启动子插入植物双元表达载体pCAMBIA1390（Cambia）的HindⅢ和PstⅠ位点间，构成中间载体pC1390-Ubi。将实施例1 PCR扩增获得约为1kb的DNA片段用Kpn I和BamH1双酶切，正向插入中间载体pC1390-Ubi的Kpn I和BamH Ⅰ位点间（插入的基因刚好位于Ubiquitin启动子后），得到重组载体。将经测序证实含有序列表中序列2的自5＇末端第1-1008位脱氧核糖核苷酸的PpDHN-31基因的重组载体命名为pCU-PpDHN-31（其T-DNA片段的结构示意图如图2所示）。该载体具有卡那霉素和潮霉素两个筛选标记。

2、转PpDHN-31基因植株的获得和鉴定

将pCU-PpDHN-31载体用电击法转入根癌农杆菌LBA4404（Agrobacteriumtumefaciens strain LBA4404）中。挑取阳性克隆28℃培养。待农杆菌浓度达到OD600值为0.120～0.140之间时，用该菌液侵染水稻品种日本晴（Oryza sativa L.spp．japonica，cv.Nipponbare）愈伤组织，侵染30min，期间不时用手轻摇。将愈伤组织转移到共培养培养基上，避光共培养3～4d。共培养结束后，将愈伤组织转移到选择培养基上培养10～15d后继代一次。挑取从原愈伤组织表面生长出来的新的潮霉素抗性愈伤组织，转移到预分化培养基上，28℃黑暗下预分化培养7d。选择奶白色、表面光滑的愈伤组织转移到分化培养基上，28℃分化培养：先在黑暗下培养3d，然后在持续冷光照下培养15～20d。将从抗性愈伤组织再生出的幼苗转移到根诱导培养基上，持续光照培养15d，生长状况良好的幼苗直接转移到大田种植。当年秋季收获转基因水稻种子。

种子收获后，播于含潮霉素（30mg/L）的MS筛选培养基上筛选。待T1代植株长至4-6叶时移到大田中生长。将T1代单株收获后，各单株种子分别播种，用潮霉素继续筛选以观察T2代的分离情况，如此重复数代直至获得稳定的转PpDHN-31株系。

按照获得转PpDHN-31株系的方法将空载体pC1390-Ubi导入水稻品种日本晴（Oryza sativa L.spp．japonica，cv.Nipponbare）中，制备得到稳定的转空载体对照株系。

3、转PpDHN-31株系植株的PCR鉴定

选择稳定遗传的转PpDHN-31株系中的3个株系（L11-6,L14-7和L14-10），进行PCR验证。用CTAB法提取水稻基因组DNA，使用正向引物（5′-GAATGAGAACTTCGGTGGGT-3′）和反向引物（5′-ATTGACAGAAGAGTGGAGGAGCCCG-3′）进行PCR扩增。上述3个株系中均可扩增出497bp的目的条带（图3）。

4、转PpDHN-31株系植株的耐旱性鉴定

以转空载体对照株系和野生型水稻品种日本晴（Oryza sativa L.spp．japonica，cv.Nipponbare）（WT）为对照株系，在水稻幼苗期检测转PpDHN-31基因株系（L11-6,L14-7和L14-10）的株高和耐渗透胁迫性，在成熟期检测水稻幼苗期检测转PpDHN-31基因株系（L11-6,L14-7和L14-10）的株高和抗旱性，方法和结果如下：

1）幼苗期植株性状及耐渗透胁迫性鉴定

培养室内，在1/2 Hogland液体培养基中培养水稻幼苗，统计2周龄幼苗株高。结果：在幼苗期，转PpDHN-31株系L11-6,L14-7和L14-10植株表现出的非常好的生长一致性，但株高比转空载体对照株系和野生型对照植株分别下降约3.5%、12.5%、7.3%（图4，空载体对照和野生型对照植株表型一致，省略了空载体对照图）。

培养室内，将2周龄水稻幼苗在含15% PEG-8000的1/2 Hogland液体培养基（即每100ml培养液含15g PEG-8000）中处理2天，再转移至含25% PEG-8000的1/2 Hogland液体培养基（即每100ml培养液含25g PEG-8000）中继续处理3天，观察复水5天后的植株状态，以未经PEG-8000处理在1/2 Hogland液体培养基中生长的处理为对照。结果：在幼苗期，转空载体对照株系和野生型水稻（日本晴）（WT）植株大部分不能恢复生长，而3个转PpDHN-31基因株系L11-6,L14-7和L14-10可以恢复正常生长（图5），表明在幼苗期，转PpDHN-31基因株系植株表现出较好的抗渗透胁迫能力。

2）成熟期植株性状及抗旱性鉴定

在田间大棚中种植水稻于营养土中，于灌浆期统计株高。结果：在灌浆期，2个转PpDHN-31株系植株L11-6和L14-7的株高比野生型对照植株下降约11.3%、15.6%，但另1个转PpDHN-31株系植株（L14-10）的株高却比野生型对照植株增加了7.8%（图6，图7）。

在田间大棚中种植水稻于营养土中，在开花灌浆期停止浇水15天至土壤严重干旱，水稻叶片全部因缺水而卷曲。复水30天后统计植株存活数和主茎的单穗总粒重。实验共设三次重复，每次重复中，所测试的各株系植株分别为15株。结果：转空载体对照株系植株和野生型水稻（日本晴）（WT）的存活率均为27.3%，而转PpDHN-31基因的株系L11-6、L14-7和L14-10的存活率分别为92.9%、100%、100%（图7和图8，转空载体对照株系植株和野生型对照植株表型一致，省略了转空载体对照株系植株图）。统计水稻主茎单穗总粒重，野生型对照平均为1.1克，而上述3个转PpDHN-31基因的株系L11-6、L14-7和L14-10的平均主茎单穗总粒重分别为9.7、12.6和20.5克（图9）。

上述结果表明：转PpDHN-31基因植株的株形、抽穗时期与转空载体对照株系和野生型对照并没有明显差别，但其耐旱性明显优于转空载体对照株系和野生型对照植株。苔藓PpDHN-31蛋白及其编码基因PpDHN-31可明显提高植物的耐旱性。

Claims

1.一种提高植物耐旱性的方法，是将序列表序列1所示蛋白的编码基因导入目的植物中，得到耐旱性高于所述目的植物的转基因植物；

所述目的植物为水稻。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述序列表序列1所示蛋白的编码基因为如下1）或2）的基因：

1）其核苷酸序列是序列表序列2所示的DNA分子；

2）其核苷酸序列是序列表序列2中第62-934位所示的DNA分子。