CN1768575A - 一种通过多基因转化提高甜菜耐盐耐旱性和抗除草剂绿黄隆特性的方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种通过多基因转化提高甜菜耐盐耐旱性和抗除草剂绿黄隆特性的方法及应用，是将来自植物的液泡膜钠氢反向转运蛋白基因NHX1和液泡膜焦磷酸酶基因PPase、来自大肠杆菌的胆碱脱氢酶基因betA和来自拟南芥的抗除草剂绿黄隆的突变的乙酰乳酸合成酶基因als重组到植物表达载体中，转入甜菜细胞并高效表达，获得转基因植株；从转基因植株及其后代中筛选出耐盐耐旱性明显提高兼有绿黄隆抗性的转基因植株；通过对转基因植株细胞进行二次转化或使带有不同转基因的植株相互交配获得带有3－4个目标基因的转基因植株；从多基因转化植株后代中选择耐盐耐旱性优异兼抗除草剂绿黄隆的的个体，进而创建出耐盐耐旱兼抗除草剂绿黄隆的甜菜育种新材料。

Description

一种通过多基因转化提高甜菜耐盐耐旱性和抗除草剂绿黄隆特性的方法及应用

技术领域

本发明属农作物的生物工程育种领域，具体说，涉及一种通过多基因转化提高甜菜耐盐耐旱性和抗除草剂绿黄隆特性的方法及应用。

背景技术

诸自然逆境中，干旱对世界作物产量的影响占居首位，其危害相当于其它自然灾害之和。盐渍化也是影响作物产量的主要环境因素。我国约二分之一国土面积处干旱、半干旱区。即使在非干旱地区的主要农业区，也不时受到旱灾侵袭。在我国16亿亩耕地中，盐碱地有1亿多亩，中低产田约10亿亩。其中大部分中低产田也是由于干旱和盐碱所致。此外有3亿亩盐碱荒地有待开发利用；灌溉地区次生盐渍化田地还在逐年增加。土壤盐渍化造成甜菜播种面积减小和产量锐减，农民急需耐盐高产甜菜品种。随着我国淡水资源的逐年匮乏和气候变暖，采用转基因技术培育耐盐耐旱甜菜具有重要的战略意义。

干旱和盐碱构成了对植物的渗透胁迫，导致植物缺水和脂质过氧化，引起细胞结构严重受损和正常代谢活动不能进行。盐胁迫还引起离子毒害效应。植物的耐盐性和耐旱性既相互关联又存在差异，分别是由多基因控制的复杂性状，涉及到多条代谢途径，其中部分基因在进化上高度保守。近年来植物耐盐机理的研究取得了突破性进展，已从不同生物中克隆出一批耐盐相关基因，其中一些基因转入植物后能明显提高植株耐盐性。植物耐旱基因鉴定及定位研究也取得较大进展。

采用基因工程技术提高作物耐盐耐旱性的研究目前集中在四个方面：1)渗透保护与渗透调节，2)氧自由基的消除，3)离子均衡的调控，4)胞内信号传递通道的调节。离子均衡的调控机制又可分为：抑制Na⁺的吸收；向胞外排出Na⁺；维持细胞K⁺营养；将胞质中有害Na⁺泵入并储存在液泡中，实现区域化分布。

作物一般都具有或大或小的渗透调节功能，以适应环境中渗透压的变化。这种功能包括细胞中的渗透调节物(脯氨酸、甜菜碱、多羟基醇类等)的积累、膜通透性的变化等。在干旱和盐胁迫下，一些植物细胞内积累甘氨酸甜菜碱类物质以维持细胞的正常膨压和减轻离子毒害。甘氨酸甜菜碱合成酶基因的高强度表达及甜菜碱积累可大幅度提高植物的耐盐耐旱性。近年的一些研究表明，一些编码渗透调节剂合成酶的基因导入到植物后能使细胞内的渗透调节剂浓度提高，使植株对胁迫表现出更好的抗性。但渗透调节剂提高的浓度均很小，不会产生明显的渗透调节作用，推测是渗透调节剂保护了细胞结构和酶活性所致。将betA基因转入烟草(Lilius等)、将BADH(甜菜醛脱氢酶)基因转入草莓和烟草(陈受宜等)，植株的耐盐性均明显提高。糖类合成酶如甘露醇合成酶基因转入烟草等植物提高了植株的耐盐性(Tarczynski等，Liu等，Shen等)，海藻糖合成酶基因转入烟草提高了植株的耐旱性(Pilon-Smits等)。

在复杂机制控制下的多条途径参与了细胞质中Na⁺浓度的调节。多数盐生植物消除Na⁺毒害的主要机制是将吸收的Na⁺定位于液泡来降低胞质中Na⁺的浓度，即离子区域化机制尤为重要。在甜土植物中，部分物种缺乏Na⁺/H⁺反向转运蛋白活性，部分物种Na⁺/H⁺反向转运蛋白活性低。因此，通过遗传改良使甜土植物在液泡中积累大量Na⁺已成为植物耐盐基因工程的策略。NHX1基因编码拟南芥等植物液泡膜上的Na⁺/H⁺反向转运蛋白。该蛋白是细胞内离子区域化的关键酶。将带有强启动子的AtNHX1基因转入拟南芥(Apes等)和番茄(Zhang等)中实现过量表达，获得了耐盐性大幅度提高的植株。

采用转基因技术提高植物耐盐耐旱性是国内外研究的热点课题，已有大量的工作。将维持细胞内离子平衡的基因、合成渗透保护物质的基因、能减轻细胞内自由基危害的基因等导入植物，提高了植物的耐盐耐旱性，为培育耐盐耐旱作物新品种开辟了一条有效途径。但多数工作是以模式植物为材料进行的，只有转AtNHX1基因的耐盐番茄和油菜具有良好的应用价值。从策略和技术上讲，采用转基因技术提高作物耐盐耐旱性已具有成熟的技术路线和必要的实施条件。

喷施除草剂已成为降低甜菜生产成本的重要措施，但适合甜菜田使用的选择性除草剂种类少。单一品种长期使用导致抗性杂草产生。因此，培育出抗除草剂的甜菜品种可增加甜菜地使用的高效无毒除草剂品种。als基因来源于拟南芥菜，根据已报道序列(Muzar BJ et al，1987；Haughn GW et al，1988)通过PCR扩增及定点突变技术获得197位脯氨酸改变为缬氨酸的突变基因。als基因是结构基因，编码乙酰乳酸合成酶(acetolactate synthase)。该酶是分支氨基酸合成途径中的第一个关键酶，除草剂绿黄隆能有效的抑制该酶活性，使植物因缺乏分支氨基酸而死亡。人类和哺乳类动物因缺乏乙酰乳酸合成酶而不受绿黄隆影响。本发明所用的基因为突变型(197位脯氨酸改变为缬氨酸)，编码的乙酰乳酸合成酶对绿黄隆抑制作用不敏感，因此，赋予转基因植物绿黄隆抗性。该基因长3250bp，编码399个氨基酸。由于绿黄隆是一种低(无)毒高效广谱性除草剂，不污染环境，抗绿黄隆甜菜品种的培育成功，可使绿黄隆在甜菜地安全使用，产生巨大的经济效益和社会效益。抗绿黄隆甜菜的推广，还可通过不同除草剂的交替使用来防止抗除草剂杂草的产生。

甜菜是二年生异花授粉作物。在其生活的第一年，主要是进行营养生长，生长繁茂的叶丛和肥大的块根，并在根中积累营养物质。在生活的第二年，以生殖生长为主，由根头上生出花枝，在花枝上形成花器官，经过异花授粉和受精形成聚花果，即种球。甜菜具有耐旱、耐寒、耐盐碱等特点，适应性广，抗逆性强。它的一些野生种起源于海滨，抗逆性强。甜菜是重要的制糖原料，世界上约40％的糖来源于甜菜。除制糖外，甜菜还有很高的经济价值。甜菜制糖的副产品可以搞综合加工。甜菜的茎叶、青头、根尾、甜菜制糖废丝，都含有丰富的营养物质，可酿酒，也是牲畜的好饲料。畜牧业的发展和盐碱地的开发利用需要耐盐耐旱的甜菜品种。由于育种周期长和抗性检测较复杂等原因，采用常规育种技术至今未培育出适合滨海盐碱地种植或用淡海水灌溉的品种。如果能培育出耐盐性强的饲用甜菜新品种，不仅可充分开发利用滨海盐碱地，推动养殖业的发展，而且能有效改善生态环境。迄今国内外未报道获得耐盐或/和耐旱性显著提高且抗除草剂绿黄隆的具有实用价值的转基因甜菜。

甜菜转基因研究工作在国内外均受到重视，已经有一些成功的报道。用于甜菜遗传转化的方法主要有农杆菌介导法和基因枪轰击法。与其它许多双子叶植物相比，甜菜的遗传转化相对较难，主要是转化细胞再生植株的频率很低。尽管甜菜细胞对农杆菌感染敏感，易于被农杆菌所转化，但转化后植株再生率低，且受基因型限制，因而主要工作集中在转化方法的改进、抗病、抗除草剂]等方面。1991年，Fry等以甜菜子叶为外植体，利用根瘤农杆菌介导法，将抗除草剂基因转入甜菜，以草甘膦为选择剂进行筛选，最终获得抗草甘膦的转基因甜菜，但频率很低。1992年，Halluin等以胚产生的愈伤组织为受体，将抗除草剂基因转入甜菜，获得了抗除草剂的转基因植株。1997年，Marie等将epsps gos nptII导入甜菜，结果证实不同转化株间对草甘膦抗性存在差异。2000年，Dewar等论述了抗除草剂转基因甜菜的种植情况。他们将抗除草剂的转基因甜菜植株栽入大田，开花后收集花粉与其它遗传性状好的株系回交几代，得到了抗除草剂的遗传性状好的甜菜品系，并对其安全性进行了试验。

在已报道的甜菜转基因工作中，多数是以愈伤组织为材料，但由于愈伤组织再生植株困难，获得的转基因植株无法满足育种需要。本实验室已发展起以离体培养的丛生芽芽尖为受体、采用农杆菌中介法规模化获得转基因甜菜的技术体系。

在作物育种中，急待解决的难题之一是大幅度提高优良育种材料的耐盐耐旱性，从而选育出具有重大突破的品种。要达到此目标，有赖于将多个目标基因导入到优良材料中，充分利用细胞抗御逆境的不同代谢活动及调节机制。这方面的研究在国内外尚处在起步阶段，尚未确定最佳的技术路线和方法。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种通过多基因转化提高甜菜耐盐耐旱性的方法。在本发明中，采用多基因转化的策略，将3-4个具有重要农艺价值的异源基因导入甜菜细胞，培育出耐盐耐旱性提高和抗除草剂绿黄隆特性的育种材料。本发明的通过多基因转化提高甜菜耐盐耐旱性和抗除草剂绿黄隆特性的方法是，将来自植物的液泡膜钠氢反向转运蛋白基因NHX1和液泡膜焦磷酸酶基因PPase、来自大肠杆菌的胆碱脱氢酶基因betA和来自拟南芥的抗除草剂绿黄隆的突变的乙酰乳酸合成酶基因als分别重组到植物表达载体中，通过农杆菌介导的方法转入离体培养的甜菜丛生芽芽尖分生组织细胞并高效表达，获得转基因植株；从转基因植株及其后代中筛选耐盐耐旱性明显提高的转基因植株；通过对转基因植株进行二次转化或使带有不同转基因的植株相互杂交获得带有3-4个目标基因的转基因植株；或以含双T-DNA区的植物表达载载体(含有3-4个目标基因)直接转化甜菜细胞，获得带有3-4个目标基因的转基因植株；检测多基因转化植株后代的耐盐性、除草剂抗性和农艺性状，选出耐盐耐旱兼抗除草剂绿黄隆的新种质。

其中，上述目标基因NHX1和PPase基因可以融合基因形式串联插在植物表达载体上，在甜菜细胞内能高效表达；betA和als基因重组在另一植物表达载体上，由在植物细胞内能启动基因高效表达的启动子驱动。

本发明中，可将含双T-DNA区的植物表达载载体(含有3-4个目标基因)直接转化甜菜细胞，获得带有3-4个目标基因的转基因植株；含双T-DNA区的植物表达载载体的T-DNA区可有左边界序列，也可无左边界序列。

其中，上述NHX1和PPase基因可来自盐生植物和非盐生植物。

其中，上述甜菜是糖甜菜品种、饲用甜菜品种和兼用型品种以及特用型品种之一。

其中，上述对转基因植株进行耐盐耐旱性和抗除草剂绿黄隆特性检测以筛选出优异材料，获得甜菜耐盐耐旱兼抗除草剂绿黄隆的新种质。

本发明的基本思路为，依据植物抗逆生理和植物抗逆基因工程研究的新进展，利用植物细胞中与抗逆性相关的代谢途径的调控知识，采用多基因转化技术，将能够显著提高细胞中甘氨酸甜菜碱含量并明显提高植物耐盐耐旱性的betA基因、能够大幅度增强细胞Na⁺区隔化的液泡膜上的钠氢反向转运蛋白基因NHX1和能够提高液泡膜质子梯度增加Na⁺向液泡储蓄从而增加细胞吸水能力的焦磷酸酶基因PPase基因导入甜菜丛生芽芽尖分生组织细胞中，实现这些基因的过表达，从而大幅度提高转基因植株的耐盐耐旱性。由于在转基因操作中选用了对人、畜安全的除草剂抗性基因als(来自于拟南芥，编码乙酰乳酸合成酶，后者是分支氨基酸合成途径中的关键酶)作为选择标记，因此，赋予转基因植物抗除草剂特性。

本发明所用的目标基因为来自大肠杆菌的胆碱脱氢酶基因betA，来自盐芥和拟南芥的编码液泡膜上的钠氢反向转运蛋白基因NHX1、来自盐芥的编码液泡膜上焦磷酸酶基因PPase；所用的植物转基因载体有pCAMBIA1300派生的载体和pROKII派生的载体。在这些派生的载体中分别重组进betA基因、NHX1基因和PPase基因，或重组进betA基因和NHX1基因、NHX1基因和PPase基因、betA基因和PPase基因。转基因植物细胞选择标记基因为抗除草剂绿黄隆(有效成分Chlorsulfuron)的突变基因als。目标基因和转基因植物选择标记基因采用常规分子生物学方法通过多步骤重组插入到植物转基因表达载体中，并通过转基因植物的检测确定了这些基因能在植物中活跃表达，提高了转基因植物的抗逆性(耐盐耐旱性、耐冷性和除草剂抗性等)。

转基因甜菜采用农杆菌介导法产生，转基因植株用PCR检测、Southern blotting验证，外源基因表达研究采用Northern blotting。转基因植株耐盐耐旱性测定采用盆栽试验-生理指标测定、盐碱地和干旱池栽培实验和田间多点实验法。转基因遗传稳定性测定采用经典的遗传学方法。

在甜菜遗传转化中，以我国生产上常用的优良糖用甜菜和以色列的饲用甜菜为材料，取大田植株的幼嫩花序离体培养产生的丛生芽为受体，采用农杆菌介导法进行转化。转基因植株经选择基本保持原品种特性，一般通过二次转化实现多基因转化，也可将携带数个目的基因的转基因植株进行人工套袋姊妹交，实现目的基因聚合，或以含双T-DNA区的植物表达载载体(含有3-4个目标基因)直接转化甜菜细胞，获得带有3-4个目标基因的转基因植株。

本发明的具体步骤为：

1)将目的基因和植物转化细胞选择标记基因以不同组合(基本组合为1或2个目的基因加1个选择标记基因或以含有3-4个目标基因的双T-DNA区)的方式重组到植物表达载体中，并导入到大肠杆菌或/和农杆菌中。

2)通过农杆菌介导的转基因方法将目标基因转入甜菜细胞中，获得转基因植株。通过分子检测和植株抗逆性测定选出目的基因稳定表达且植株抗性明显提高的转基因植株。

3)利用入选的转基因植株或其自交结实的后代为材料，通过二次转化法或姊妹交结实达到多基因转化。对二次转化产生的植株和通过姊妹交获得的植株进行PCR检测，选出多基因转化的植株。在进行二次转化中，所用的植物转基因表达载体所带的植物细胞选择标记基因必须与初次转化所用的表达载体上的植物细胞选择标记基因不同，以利于选择出二次转化体。若植物转基因表达载体不带有植物选择标记基因，虽通过PCR检测可获得转基因植株，但效率十分低。

4)多基因转化材料的耐盐耐旱性和抗除草剂绿黄隆特性的鉴定和利用。对获得的不同转基因聚合材料，根据目的基因表达产物的生理作用，进行相应的生理生化指标检测，并通过盆栽试验和大田耐盐耐旱性测定实验，筛选出耐盐耐旱性和抗除草剂绿黄隆特性明显提高的转基因育种材料。

附图说明

图1多基因转化材料中目标基因的分子检测图片

其中：betA转化植株PCR结果(左1)与PCR-Southem杂交结果(左2)；NHX1基因转化植株PCR结果(右2)与Southern杂交结果(右1)。

左1图：1，9示Marker；2-6示转基因植株；7示阳性质粒；8示非转基因植株。

左2图：1示非转基因植株；2-6示转基因植株；7示阳性质粒；8示Marker。

右2图：1示Marker；2-5示转基因植株；6示非转基因植株；7示阳性质粒。

右1图：1，3示非转基因植株；2示阳性质粒；4-6示转基因植株；7示Marker。

具体实施方式

以下叙述本发明的实施例。需说明的是，本发明的实施例只对本发明起说明作用而没有限制作用。

实施例1：通过多基因转化创制耐盐耐旱性和抗除草剂绿黄隆特性优异的甜菜转基因株系

1.甜菜转基因植株的获得

取大田花蕾期植株约1cm长的幼嫩花序顶端切段，经70％酒精1min、0.1％HgCl₂5min消毒后，切成0.1-0.5cm小段，接种于MS附加1mg/L 6-BA的培养基上，26±2℃下暗培养，诱导丛生芽发生。丛生芽块切开后继代培养。剥去幼叶的丛生芽块用于遗传转化。

将带有双元载体(Mini-Ti质粒带有除草剂抗性基因als和目的基因betA，或带有除草剂抗性基因bar和目的基因NHX1和PPase基因)的根瘤农杆菌(AGL1或LBA4404)在附加抗生素的YEP培养基中28℃下分别震荡培养，震荡速率为110r/min，使细菌处于对数生长期。然后在4000r/min下离心10分钟，弃上清液。菌体用1/2改良MS液体培养基洗涤，离心收集。再将菌体用添加100mg/L乙酰丁香酮的1/2MS改良液体培养基悬浮，稀释5-20倍用于转化。

将继代后7天的丛生芽块剥成2-3mm大小的小芽，在农杆菌(分别带有betA、NHX1、PPase基因)菌液中浸泡0-20min，然后转到丛生芽发生培养基上共培养1、3、5、7天，再转到含有头孢霉素(100mg/L)的培养基上抑菌培养，2周后转移到加有绿磺隆(0.05mg/L)的培养基上进行筛选。每10天继代培养一次，连续筛选三代，得到了不同比例的转化体。转化芽尖增殖后，待小苗长至2-3cm高时剪成单芽，在附加1mg/LNAA的1/2MS培养基上诱导生根。小苗生根率在50-80％之间。选取健壮的生根植株，移栽到下层壤土、上层蛭石的花盆中，每隔一天浇一次营养液，温度15-23℃，相对湿度85％以上，日光照5000lx左右，成活率可达70-80％。

抗除草剂转化植株生长到4-6叶时，取叶片提取DNA，采用PCR技术检测外源基因，对PCR阳性植株进行Southern blotting检测。约30％的植株为转基因个体。

2.转基因植株的管理和抗性检测

转基因植株春化后套袋自交或姊妹交结实。种子播种在大田或温室，植株长到4-6叶期时取叶片提取DNA，采用PCR技术检测是否带有外源基因。取转基因阳性植株进行耐盐耐旱性和绿黄隆抗性测定。

对4-6叶期的PCR阳性植株喷施除草剂绿黄隆(浓度分别为0、0.1、0.3、0.5、1.0、2.0ppm)，15天后统计植株死亡率和受害程度以及杂草存活率，收获时称重甜菜生物量，计算块根产量，得出耐受绿黄隆的最高浓度、适宜剂量绿黄隆使用后对甜菜产量的影响及经济效益。

对于转betA基因的小苗在干旱或高盐处理前后取叶片测定甘氨酸甜菜碱含量，筛选目的基因表达高的植株套袋自交结籽。同时，对同一株系的植株进行耐盐性测定和干旱胁迫处理，以及农艺性状的观测，测定与植株耐盐耐旱性相关的生理生化指标，确定植株耐盐耐旱的最高级别。综合植株农艺性状、甘氨酸甜菜碱含量和其它生理生化测定指标、盆栽干旱和盐胁迫处理等的结果，选择出耐盐耐旱性优良的材料用于多基因转化。

对于转NHX1和PPase基因的小苗用高盐(NaCl)溶液进行胁迫处理，在处理前后取叶片测细胞Na⁺、K⁺和Ca²⁺离子含量，并观测不同NaCl浓度处理下植株的生长势、存活率和受害情况，对苗期表现出优良耐盐性的植株取来自同一转化体的后代种子播种在花盆或盐碱地，进行全生育期耐盐耐旱性测定。综合植株农艺性状、叶片细胞Na⁺、K⁺和Ca²⁺含量测定结果及叶片水势变化和其它生理生化测定指标、盆栽和盐碱地实验结果等，选择出耐盐耐旱性优良的材料用于多基因转化。

3.多基因转化和耐盐耐旱植株的利用

多基因转化可通过三条途径进行：

第一条途径为，以转betA基因和als基因(或NHX1和PPase基因)的植株花序离体培养获得的丛生芽为材料，按照本实例“甜菜转基因植株的获得”部分所介绍的方法将NHX1和PPaae基因(或betA基因和als基因)转入，经自交和耐盐耐旱性检测、除草剂绿黄隆抗性检测和农艺性状选择，获得综合性状好的耐盐耐旱性状优异的株系。

第二条途径为，以来自同一基因型的分别转betA基因和NHX1及Ppase、als基因的植株进行人工辅助授粉，产生具有3-4个目的基因的后代。

第三条途径为，目标基因NHX1和PPase基因以融合基因形式串联插入在一个植物表达载体的一个T-DNA区，betA和als基因插入在同一个植物表达载体的另一个T-DNA区，按照本实例“甜菜转基因植株的获得”部分所介绍的方法，以含双T-DNA区的植物表达载载体(含有3-4个目标基因)直接转化甜菜细胞，获得带有3-4个目标基因的转基因植株及其后代。

对于转多基因材料，一般通过和本实例“转基因植株的管理和抗性检测”部分阐述的方法和程序进行耐旱耐盐性测定及综合性状选择，对获得的优异材料用于甜菜育种或生产实践。

由于甜菜对盐害的敏感期为苗后，在叶丛期后耐盐性较强，为了获得具有应用参考价值的数据，同时又能使筛选出的耐盐植株产生大量的种子以供盐碱地种植实验，将部分T0代植株产生的种子播在沙盆中，每天分别浇灌2.0％、2.5％或3.0％的NaCl溶液，部分株系的种子在播种后4-5天左右萌发，部分株系的种子延迟到播种后15-20天间萌发。小苗早期生长健壮，但随着盐胁迫处理的天数增加，部分小苗逐渐死亡。NaCl溶液浇灌30天后，存活的植株矮小粗壮，子叶和叶片肥厚。通过筛选获得了来自不同基因型的分别耐受2.0％、2.5％或3.0％NaCl的转多基因植株。在去除盐胁迫后小苗迅速恢复正常生长，3-4天后长出新叶，原有叶片也迅速扩展，叶片厚度降低，逐步回复到非盐胁迫状态下的形态特征，表现出比未转基因对照大幅度提高的耐盐特性。由于筛选所用的盐浓度远高于中度盐碱地的含盐量，而甜菜通常只在含盐量0.4％以下的土地中生长正常，故获得的转基因甜菜具有优异的耐盐性，可望获得在中度盐碱地种植的优良品种。

实施例1中涉及的多基因转化材料中目标基因的分子检测图片见图1。

实施例2：采用转不同目标基因植株姊妹交获得多基因转化的耐盐耐旱性优异的抗除草剂绿黄隆的甜菜育种材料

1.甜菜转基因植株的获得  同实施例1。

2.转基因植株的管理和抗性检测  同实施例1。

3.采用转不同目标基因植株姊妹进行多基因聚合

将来自同一受体基因型的转不同目标基因(选择标记基因也不同)的植株块根种在同一隔离区中，开放授粉，产生种子。将收获的种子用2种不同的选择剂(如除草剂绿黄隆和除草剂草丁膦)进行筛选。筛选一般在植株4叶期开始进行，先用一种选择剂(如除草剂绿黄隆，浓度是未转基因对照植株全部死亡)水溶液处理植株，杀死对选择剂敏感的个体。第一次选择处理后一个月左右，用第二种选择剂(如除草剂草丁膦，浓度是未转基因对照植株全部死亡)处理，杀死对选择剂敏感的个体。然后用PCR方法检测存活且生长健壮的植株，确定转基因聚合是否成功。对聚合成功的多基因转化植株进行套袋自交，子代植株也同上代一样经历2次选择剂筛选和PCR检测。获得多基因转化植株纯合体后，采用生理学方法筛选耐盐耐旱性明显提高的转基因株系。

4.多基因转化的耐盐耐旱抗除草剂植株的选择及利用  同实施例1。

实施例3：采用带双T-DNA区的植物表达载体进行转化获得多基因转化的耐盐耐旱性优异的抗除草剂绿黄隆的甜菜育种材料

1.甜菜转基因植株的获得

取大田花蕾期植株约1cm长的幼嫩花序顶端切段，经70％酒精1min、0.1％HgCl₂5min消毒后，切成0.1-0.5cm小段，接种于MS附加1mg/L 6-BA的培养基上，26±2℃下暗培养，诱导丛生芽发生。丛生芽块切开后继代培养。剥去幼叶的丛生芽块用于遗传转化。

将带有双元载体(Mini-Ti质粒带有双T-DNA区，目标基因NHX1和PPase基因可以融合基因形式串联插入其中一个T-DNA区，betA和als基因插入在另一个T-DNA区；含双T-DNA区的植物表达载载体的T-DNA区可有左边界序列，也可无左边界序列)的根瘤农杆菌(AGL1或LBA4404)在附加抗生素的YEP培养基中28℃下分别震荡培养，震荡速率为110r/min，使细菌处于对数生长期。然后在4000r/min下离心10分钟，弃上清液。菌体用1/2改良MS液体培养基洗涤，离心收集。再将菌体用添加100mg/L乙酰丁香酮的1/2MS改良液体培养基悬浮，稀释5-20倍用于转化。

将继代后7天的丛生芽块剥成2-3mm大小的小芽，在农杆菌(带有植物表达载体及目标基因)菌液中浸泡0-20min，然后转到丛生芽发生培养基上共培养1、3、5、7天，再转到含有头孢霉素(100mg/L)的培养基上抑菌培养，2周后转移到加有绿磺隆(0.05mg/L)的培养基上进行筛选。每10天继代培养一次，连续筛选三代，得到了不同比例的转化体。转化芽尖增殖后，待小苗长至2-3cm高时剪成单芽，在附加1mg/LNAA的1/2MS培养基上诱导生根。小苗生根率在50-80％之间。选取健壮的生根植株，移栽到下层壤土、上层蛭石的花盆中，每隔一天浇一次营养液，温度15-23℃，相对湿度85％以上，日光照5000lx左右，成活率可达70-80％。

抗除草剂绿黄隆转化植株生长到4-6叶时，取叶片提取DNA，采用PCR技术检测外源基因，对PCR阳性植株进行Southern blotting检测。约5-10％的植株为转如双T-DNA区的个体。

2.转基因植株的管理和抗性检测  同实施例1。

3.多基因转化的耐盐耐旱抗除草剂植株的选择及利用  同实施例1。

Claims (7)

1.一种通过多基因转化提高甜菜耐盐耐旱性和抗除草剂绿黄隆特性的方法及应用，其主要步骤包括：将来自植物的液泡膜钠氢反向转运蛋白基因NHX1和液泡膜焦磷酸酶基因PPase、来自大肠杆菌的胆碱脱氢酶基因betA和来自拟南芥的抗除草剂绿黄隆的突变的乙酰乳酸合成酶基因als分别重组到植物表达载体中，通过农杆菌介导的方法转入离体培养的甜菜丛生芽芽尖分生组织细胞并高效表达，获得转基因植株；从转基因植株及其后代中筛选耐盐耐旱性明显提高的转基因株系；通过对转基因植株进行二次转化或使带有不同转基因的植株相互杂交获得带有3-4个目标基因的转基因植株；或以含双T-DNA区的植物表达载载体(含有3-4个目标基因)直接转化甜菜细胞，获得带有3-4个目标基因的转基因植株；检测多基因转化植株后代的耐盐性、除草剂抗性和农艺性状，选出耐盐耐旱兼抗除草剂绿黄隆的新种质。

2.如权利要求1所述的通过多基因转化提高甜菜耐盐耐旱性和抗除草剂绿黄隆特性的方法及应用，其特征是，目标基因NHX1和PPase基因可以融合基因形式串联插入在植物表达载体上，在甜菜细胞内能高效表达；betA和als基因重组在另一植物表达载体上，由在植物细胞内能启动基因高效表达的启动子驱动。

3.如权利要求1所述的通过多基因转化提高甜菜耐盐耐旱性和抗除草剂绿黄隆特性的方法及应用，其特征是，目标基因NHX1和PPase基因可以融合基因形式串联插入在一个植物表达载体的一个T-DNA区，betA和als基因插入在同一个植物表达载体的另一个T-DNA区。

4.如权利要求2所述的通过多基因转化提高甜菜耐盐耐旱性和抗除草剂绿黄隆特性的方法及应用，其特征是，NHX1和PPase基因可来自盐生植物和非盐生植物。

5.如权利要求3所述的通过多基因转化提高甜菜耐盐耐旱性和抗除草剂绿黄隆特性的方法及应用，其特征是，含双T-DNA区的植物表达载载体的T-DNA区可有左边界序列，也可无左边界序列。

6.如权利要求1所述的通过多基因转化提高甜菜耐盐耐旱性和抗除草剂绿黄隆特性的方法及应用，其特征是，所述的甜菜是糖甜菜品种、饲用甜菜品种和兼用型品种以及特用型品种之一。

7.如权利要求1所述的通过多基因转化提高甜菜耐盐耐旱性和抗除草剂绿黄隆特性的方法及应用，其特征是，对转基因植株及其后代进行耐盐耐旱性和抗除草剂绿黄隆特性的检测，从中选择优异材料培育甜菜耐盐耐旱和抗除草剂绿黄隆的新种质。

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