CN106520827A - 一种通过增加甜菜碱合成能力提高棉花耐盐抗旱性的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种通过增加甜菜碱合成能力提高棉花耐盐抗旱性的方法，是将胆碱脱氢酶基因betA和磷酸乙醇胺甲基转移酶基因GhPEAMT利用表达载体pCAMBIA1300‑GhPEAMT‑EPSP和pCAMBIA1300‑betA‑als重组构建植物表达载体pCAMBIA1300‑GhPEAMT‑betA‑EPSP，并将其转入棉花细胞中让其高效表达，进而再生出转基因植株；利用苗期喷洒除草剂草甘膦获得抗性小苗，结合常规分子检测技术，从抗性植株及其后代中筛选出转基因纯合体；再在盐碱池或干旱棚中筛选鉴定出耐盐耐旱性显著提高的转基因纯合体，即获得通过增加甜菜碱合成能力创建出的棉花耐盐抗旱育种新种质。本发明方法建立了以磷酸乙醇胺为原料合成甘氨酸甜菜碱的代谢途径，实验证实转基因后的棉花耐盐抗旱特性显著提高。

Description

一种通过增加甜菜碱合成能力提高棉花耐盐抗旱性的方法
技术领域
本发明涉及一种通过增加甜菜碱合成能力提高棉花耐盐抗旱性的方法，属植物基因工程领域。
背景技术
土壤盐渍化、干旱是农业粮食生产中的主要威胁因素之一。由于植物固着生长在环境中而不能自主移动，为了应对诸如温度、盐碱、干旱、重金属等胁迫，植物存在着多种应对机制来适应多样性的非生物胁迫。在众多应对干旱、高盐胁迫的机制中，一个重要的策略就是细胞合成相容性化合物以帮助植物自身在干旱、高盐胁迫下生存。合成的这些物质由于它们易溶于水、甚至在较高浓度下对植物也不会造成不良的影响而被称为相容的化合物(Rhodes D&Hanson AD.Ann.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.,1993,44:357-384)。甜菜碱是生物相容性物质中较为优秀的一种(Raza et al.Plant Biotechnol Rep,2013,7:49-57)。甘氨酸甜菜碱(甜菜碱)是一种两性化合物，它在很宽的生理pH范围内保持电中性，极易溶于水，并具有三个甲基组成的非极性部分。甜菜碱在植物处于非生物逆境胁迫下在渗透调节作用、稳定和保护生物大分子的结构和功能、保护膜的完整性、对光合系统的保护作用、诱导特定基因的表达等诸多方面对植物保护发挥作用(Raza et al.PlantBiotechnol Rep,2013,7:49-57)。
许多植物能够在细胞内积累高水平甜菜碱来响应非生物胁迫，甜菜碱的积累水平通常与植物的胁迫抗性程度一致(Rhodes et al.Annu Rev Plant Physiol Plant MolBiol.1993,44:357–384.)。此外，外施甜菜碱也能够提高多种植物对各种非生物胁迫的耐受性，还能使长势增强和增加产量(Chen et al.Trends Plant Sci.2008,13(9):499-505；Ahmet et al.Sci Hortic,2012,(148):197-205；Shan et al.Postharvest Biol Tech,2016,114:104-110.)。
自然界中已发现的甜菜碱合成途径按底物的不同可分两大类：一类是以胆碱为底物合成甜菜碱，另一类以甘氨酸为底物连续甲基化合成甜菜碱(Mohammad,et al.PlantBiotechnology,2009,26,125-134)。以胆碱为底物的甜菜碱合成途径根据参与合成途径的酶系统不同又可分为3种类型：一是在黎科和苋科等高等植物中，甜菜碱由胆碱经两步氧化反应合成，先由胆碱单加氧酶(CMO)催化胆碱转化为甜菜碱醛，然后在甜菜碱醛脱氢酶(BADH)催化的作用下将甜菜碱醛转化为甜菜碱(Weretilnyk et al,Planta,2009,178:342-352)；二是在微生物球形节杆菌(Arthrobacter globiformis)和滋养节杆菌(A.pascens)中甜菜碱的合成仅需要一种酶即胆碱氧化酶(choline oxidase,COD)催化胆碱转化甜菜碱，同时伴有H2O2产生(Ikuta et al.J.Biochem.(Tokyo),1977,82(6):1741-1749.)；三是在在大肠杆菌中，从胆碱到甜菜碱的转变由胆碱脱氢酶(cholinedehydrogenase，CDH)和甜菜碱醛脱氢酶(betaine aldehyde dehydrogenase，BADH)催化完成，即由胆碱脱氢酶催化胆碱转化为甜菜碱醛，甜菜碱醛然后在甜菜碱醛脱氢酶催化的作用下生成甜菜碱。胆碱脱氢酶是一种依赖氧的膜结合黄素蛋白，不但能催化胆碱氧化为甜菜碱醛，而且能以几乎相同的速率催化甜菜碱醛的氧化。甜菜碱醛脱氢酶是一种依赖于NAD的可溶性蛋白，对甜菜碱醛具有很高的亲合性。betA基因编码CDH，betB基因编码BADH(Landfald et al,J.Bacteriol.,1986,165(3):849-855)。Quan等将来自于大肠杆菌的betA基因转入了玉米植株，在转基因植株中甜菜碱的积累量相对于非转基因对照增加了1.1-2.3倍，并且转基因玉米植株对低温和干旱胁迫的抗性比对照增强(Quan et al.PlantSci,2014,166:141-149；Quan et al.Plant Biotechnol J,2014,2:477-486.)。将betA基因转入棉花，也提高了棉花的耐盐抗旱性(Lv et al.Mol Breed,2007,20(3):233-248.Zhang et al.Euphytica,2011,181:1-16.)。
胆碱作为甜菜碱合成的必要前体物质，在高等植物中可通过磷酸乙醇胺甲基转移酶(phosphoethanolamine N-methyltransferase,PEAMT)催化磷酸乙醇胺连续甲基化途径而合成。磷酸乙醇胺甲基转移酶其功能是催化磷酸乙醇胺三次甲基化生成磷酸胆碱，其后磷酸胆碱在磷酸胆碱磷酸酶的水解作用下可生成胆碱和磷脂酸。胆碱在一些植物叶绿体基质中可通过胆碱单加氧酶(CMO)和甜菜碱脱氢酶(BADH)两步氧化催化最终生成甘氨酸甜菜碱。磷酸乙醇胺-N-甲基转移酶参与的步骤是在胆碱生物合成的关键步骤一个控制点，是催化磷酸乙醇胺三次甲基化生成胆碱的限速酶(Scott et al,PNAS,2001,98:10001-1005)。
将胆碱单加氧酶(CMO)基因转入烟草(Nicotiana tabacum)、拟南芥、油菜(Brassica napus)等植株中以期提高其抗盐性,但抗逆效果不明显。但加入外源的胆碱后转基因植株的甜菜碱含量明显增加,植物的抗性也显著的增强(Huang et al,PlantPhysiol,2000,122(3):747-756)。推测这可能是因为甜菜碱合成的前体物质胆碱的含量不足引起的，需要增加内源性胆碱供应以增强细胞中甜菜碱的积累(McNeil et al,PlantPhysiol,2000,123(1):371-380；Takaba.J Plant Bioch Biot,2012,21(S1):58-62.)。而Mou等研究表明,拟南芥peamt突变体t365的胆碱生物合成量减少约64％,从而导致突变体植株对盐渍高度敏感，PEAMT基因具有促进甜菜碱的合成从而有助于提高植物抗盐的能力(Plant Cell,2002,14(9):2031～2043)。在转基因烟草中甜菜碱没有大量积累的原因推测可能是外源基因的表达水平低，也可能是由于甜菜碱合成所需底物胆碱的供应受限所致。但在转基因烟草、拟南芥和油菜中发现，如果转基因植株能够获取外源胆碱，转基因植株中甜菜碱的积累量就会增加(Huang,et al..Plant Physiol.,2000,122(3):747-756；Nuccio,et al.Plant J.1998,16(4):487-496.)，因此这些转基因植物没有高浓度积累可能是由于甜菜碱合成所需底物胆碱的供应受限所致。将控制胆碱合成的关键酶磷酸乙醇胺N-甲基转移酶基因(PEAMT)导入表达CMO和BADH的转基因烟草后，PEAMT基因的过表达使转基因烟草的磷酸胆碱和胆碱分别的含量分别增加了5倍和50倍，使甜菜碱的合成增加了约30倍，有效地提高了植株耐盐性,且不影响转基因株的正常生长。这表明了PEAMT基因可显著提高转基因植株体内胆碱的含量,解除内源胆碱含量不足对甜菜碱合成的限制((McNeilSD,et al.PNAS,2001,98(17):10001-10005.)。
胆碱供应不足是甜菜碱积累植物中甜菜碱合成的限制因素，一些工程植物的低水平甜菜碱的积累很大程度上也是由于胆碱合成能力不足所致(Takabe.J Plant BiochBiot,2012,21(S1):58-62.)。已有的工作还表明，甜菜碱前体供应对于甜菜碱的积累是重要的，甚至在甜菜碱积累的苋属植物中也是如此(Bhuiyan et al.J exp bot,2007,58(15-16):4203-4212.)。这些信息提示我们在棉花中有可能通过引入提高胆碱的合成途径来进一步提高棉花细胞进一步合成甘氨酸甜菜碱能力。因此，开展以乙醇胺为原料合成的胆碱合成途径与以胆碱为底物合成甜菜碱的途径相结合的基因工程，可望解决棉花细胞中因胆碱含量不足而影响甜菜碱合成的难题，并有望在转基因植株中积累更高浓度的甘氨酸甜菜碱，从而赋予转基因植株更高耐盐抗旱能力。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种通过增加甜菜碱合成能力提高棉花耐盐抗旱性的方法。
本发明的技术方案是：通过转基因聚合甜菜碱合成途径的相关基因，在棉花细胞中引入以乙醇胺为原料合成的胆碱合成途径和以胆碱为底物合成甜菜碱的途径并使之相结合，以解决细胞中因胆碱含量不足而影响甜菜碱合成的难题，并有望在转基因植株中积累高浓度的甘氨酸甜菜碱，进而进一步提高棉花的抗逆性，即耐盐抗旱性。
详细的，本发明所述通过增加甜菜碱合成能力提高棉花耐盐抗旱性的方法是将来自大肠杆菌的胆碱脱氢酶基因betA和来自植物的磷酸乙醇胺甲基转移酶基因GhPEAMT利用植物表达载体pCAMBIA1300-GhPEAMT-EPSP和植物表达载体pCAMBIA1300-betA-als重组构建重组植物表达载体pCAMBIA1300-GhPEAMT-betA-EPSP，并将其转入棉花细胞中让其高效表达，进而再生出转基因植株；利用苗期喷洒除草剂草甘膦获得抗性小苗，结合常规分子检测技术，从抗性植株及其后代中筛选出转基因纯合体；再在盐碱池或干旱棚中筛选鉴定出耐盐抗旱性显著提高的转基因纯合体，即获得通过增加甜菜碱合成能力创建出的棉花耐盐抗旱育种新种质；
其特征在于：
所述构建重组植物表达载体pCAMBIA1300-GhPEAMT-betA-EPSP的方法是：
(1)BamHI和KpnI双酶切植物表达载体pCAMBIA1300-EPSP，回收载体；BamHI和KpnI双酶切克隆载体pUC57-GhPEAMT回收GhPEAMT片段；将回收的植物表达载体pCAMBIA1300-EPSP的载体部分与回收的克隆载体pUC57-GhPEAMT中的目的基因GhPEAMT连接，获得中间植物表达载体，命名为pCAMBIA1300-GhPEAMT-EPSP；
其中所述植物表达载体pCAMBIA1300-EPSP为全人工合成EPSP基因(两端分别加BamHⅠ、KpnI酶切位点)链接到pCAMBIA1300的多克隆位点上获得的重组质粒。EPSP基因的注册号为AY573186.1。
其中所述克隆载体pUC57-GhPEAMT为全人工合成GhPEAMT基因(两端分别加BamHⅠ、KpnI酶切位点)链接到pUC57的多克隆位点上获得的重组质粒。GhPEAMT基因的注册号为EF688569。
(2)EcoRI酶切回收植物表达载体pCAMBIA1300-GhPEAMT-EPSP的载体部分，通过引物用高保真DNA聚合酶从植物表达载体pCAMBIA1300-betA-als中扩增得到两端引入EcoRI酶切位点的片段35S-betA-nos并用EcoRI酶切后回收；将回收的中间植物表达载体pCAMBIA1300-GhPEAMT-EPSP的载体部分与回收的35S-betA-nos片段连接，得到重组植物表达载体，命名为pCAMBIA1300-GhPEAMT-betA-EPSP；其中所述引物的核苷酸序列为：
NOS-B 5'CGAATTCCCGATCTAGTAACATAG 3'；
35S-B 5'GGAATTCGTCCCCAGATTAGCCTTTTC 3'；
其中所述植物表达载体pCAMBIA1300-betA-als的构建过程见文献：王先艳，植物双抗表达载体的构建及其功能鉴定，[学位论文]，2003，山东大学。betA基因的GenBank注册号为AY436553；als基因的GenBank注册号为X51514.1。
所述棉花细胞是茎尖分生组织细胞、离体培养的幼胚细胞、成熟胚细胞、胚性愈伤组织细胞或原生质体；
所述利用苗期喷洒除草剂草甘膦获得抗性小苗，结合常规分子检测技术，从抗性植株及其后代中筛选出转基因纯合体的方法是：通过对3～4叶期转基因棉花小苗喷洒1.6～1.8‰草甘膦检测转基因植株的抗性，用除草剂筛选获得抗性植株，然后对抗性植株利用PCR、southern杂交技术检测获得转基因纯合植株。
上述通过增加甜菜碱合成能力提高棉花耐盐抗旱性的方法中：所述棉花的品种是春棉、夏棉、常规棉或杂交棉。
本发明所述通过增加甜菜碱合成能力提高棉花耐盐抗旱性的方法的具体应用方式：
1)将2个目的基因和1个选择标记基因通过常规分子生物学方法通过多步骤重组插入到植物转基因表达载体中，并导入到大肠杆菌或/和农杆菌中。
2)通过农杆菌介导的转基因方法，以棉花的茎尖分生组织细胞为受体将目标基因转入棉花细胞中，获得转基因植株。通过分子检测和植株抗逆性测定选出目的基因稳定表达且植株抗性明显提高的转基因植株。
3)转基因聚合材料的抗逆性鉴定和利用。根据目的基因表达产物的生理作用，进行相应的生理生化指标检测，并通过盆栽试验和大田抗逆性测定试验，筛选出耐盐抗旱性明显提高的转基因育种材料。获得的优异材料用于棉花育种或生产实践。
本发明的有益效果是：
本发明公开的通过增加甜菜碱合成能力提高棉花耐盐抗旱性的方法，建立了以磷酸乙醇胺为原料合成胆碱，进一步以胆碱为原料合成甘氨酸甜菜碱的技术路线，克服了棉花细胞内内源胆碱含量不足对甜菜碱合成的限制，在转基因植株中能积累更高浓度的甘氨酸甜菜碱，进而赋予转基因植株更高的耐盐抗旱能力。
本发明成功构建了来自大肠杆菌的胆碱脱氢酶基因(betA基因)和来自陆地棉的磷酸乙醇胺-N-甲基转移酶基因(GhPEAMT基因)的双子叶植物三价表达载体pCAMBIA1300-GhPEAMT-betA-EPSP，其中GhPEAMT和betA基因受35S启动子控制。实验证实将该重组质粒转化到棉花中，可以显著提高转基因棉花的耐盐抗旱特性。
附图说明
图1：植物表达载体构建流程图。
图2、质粒pCAMBIA1300-GhPEAMT-betA-EPSP的结构示意图。
图3、为重组质粒pCAMBIA1300-GhPEAMT-betA-EPSP的酶切鉴定电泳图
其中：泳道1-1到4-1号为EcoRI酶切得到2813bp和11751bp大小条带，2-1号正确；泳道1-2到4-2号为PstI酶切得到2469bp，4386bp，7709bp大小条带，2-2号正确。
图4、转基因植株中部分植株betA基因的PCR鉴定结果
其中：泳道M：DNA Marker DL2000；P：质粒DNA；WT：野生型对照株系；泳道L1、L2、L3：转betA基因株系；泳道H2O：dH2O。
图5、转基因植株中部分植株GhPEAMT基因的PCR鉴定结果
其中：泳道M：DNA Marker DL2000；P：质粒DNA；WT：野生型对照株系；泳道L1、L2、L3：转GhPEAMT基因株系；泳道H2O：dH2O。
图6、转GhPEAMT-betA基因植株中在200mMNaCl浇灌下的出苗的表型(播种7d)
其中：WT：野生型对照株系；L1、L2、L3为转GhPEAMT基因株系。
图7、转GhPEAMT-betA基因二叶期小苗干旱胁迫四周的植株生物量(g/DW·3plant)。
具体实施方式
以下叙述本发明的实施例。需说明的是，本发明的实施例只对本发明起说明作用而没有限制作用。
实施例1：创制耐盐抗旱的优异棉花育种材料
1、植物表达载体的构建
目标基因和转基因植物选择标记基因采用常规分子生物学方法通过多步骤重组插入到植物转基因表达载体中，其中所述植物表达载体pCAMBIA1300-GhPEAMT-betA-EPSP的构建过程流程图参见图1。
本实施例中目的基因betA基因为来自大肠杆菌的胆碱脱氢酶基因。GhPEAMT基因为来自棉花的磷酸乙醇胺-N-甲基转移酶基因。选择标记基因为除草剂抗性基因EPSP(EPSP：烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶)
具体的，上述植物表达载体pCAMBIA1300-GhPEAMT-betA-EPSP重组步骤是：
BamHI和KpnI双酶切载体pCAMBIA1300-EPSP，回收载体(其中：植物表达载体pCAMBIA1300-EPSP中的pCAMBIA1300载体为CAMBIA公司产品，GenBank注册号AF134296；EPSP基因注册号为AY573186.1)；
BamHI和KpnI双酶切克隆载体pUC57-GhPEAMT回收GhPEAMT片段(其中：pUC57克隆载体Thermo Scientific公司有售，产品货号为SD0171，说明书中有详细碱基序列；GhPEAMT基因注册号为EF688569)；
将植物表达载体pCAMBIA1300-EPSP的载体部分与克隆载体pUC57-GhPEAMT中的目的基因GhPEAMT连接，获得中间植物表达载体，体命名为pCAMBIA1300-GhPEAMT-EPSP。
EcoRI酶切回收中间植物表达载体pCAMBIA1300-GhPEAMT-EPSP的载体部分，通过引物用高保真DNA聚合酶从植物表达载体pCAMBIA1300-betA-als中扩增得到两端引入EcoRI酶切位点的片段35S-betA-nos(betA基因的GenBank注册号AY436553；als基因的GenBank注册号X51514.1)并用EcoRI酶切后回收；将回收的中间植物表达载体pCAMBIA1300-GhPEAMT-EPSP的载体部分与回收的35S-betA-nos片段连接，得到重组植物表达载体，命名为pCAMBIA1300-GhPEAMT-betA-EPSP(结构见图2)；其中所述引物的核苷酸序列为：
NOS-B 5'CGAATTCCCGATCTAGTAACATAG 3'；
35S-B 5'GGAATTCGTCCCCAGATTAGCCTTTTC 3'
上述重组质粒pCAMBIA1300-GhPEAMT-betA-EPSP可用于遗传转化。
其中植物表达载体pCAMBIA1300-betA-als的构建过程见文献：王先艳，植物双抗表达载体的构建及其功能鉴定，[学位论文]，2003，山东大学。
其中植物表达载体pCAMBIA1300-EPSP为全人工合成EPSP基因(两端分别加BamHⅠ、KpnI酶切位点)链接到pCAMBIA1300的多克隆位点上获得。
其中克隆载体pUC57-GhPEAMT为全人工合成GhPEAMT基因(两端分别加BamHⅠ、KpnI酶切位点)链接到pUC57的多克隆位点上获得。
重组子的鉴定：
依据质粒T-DNA区的酶切位点特点选择限制性内切酶EcoRI、Pst I分别进行单酶切鉴定。
提取阳性克隆质粒，对质粒进行EcoRI单酶切。酶切体系为100μl，具体是质粒(载体、目的片段)25μl；10×M buffer 10μl；EcoRI 1μl；H2O 64μl；37℃水浴，酶切过夜。酶切产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳后，2-1泳道检测到已切开的合适大小的目的条带(2813bp和11751bp两条带)，证明2号载体构建正确(图3)
提取阳性克隆质粒，对质粒进行Pst I单酶切。酶切体系为100μl，具体是质粒(载体、目的片段)25μl；10×M buffer 10μl；Pst I1μl；H2O 64μl；37℃水浴，酶切过夜。酶切产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳后，2-2泳道检测到已切开的合适大小的目的条带(2469bp、4386bp、7709bp)，证明2号载体构建正确(图3)。
因此2号为重组正确的质粒，即pCAMBIA1300-GhPEAMT-betA-EPSP。经华大和铂尚两家生物技术公司测序，测序结果表明序列正确，将正确菌液放于-76℃低温冰箱及-40℃低温冰箱保存。
2、棉花转基因植株的获得
棉花种子经硫酸脱绒后，用70％乙醇浸泡1min、0.1％的升汞浸泡15min，然后用无菌水洗涤5遍。消毒后种子放入铺有三层滤纸的无菌瓶中，加入适量无菌水，于30℃温箱中萌发。2～3天后下胚轴长到1～2cm，将萌发种子插到M1固体培养基中继续培养，取株高7～10cm小苗用于茎尖顶端生长锥用于转化。
将带有表达载体(质粒pCAMBIA1300-GhPEAMT-betA-EPSP带有除草剂抗性基因EPSP和目的基因(GhPEAMT、betA)的根瘤农杆菌(AGL1或LBA4404)在附加抗生素的YEP培养基中28℃下分别震荡培养，震荡速率为110r/min，使细菌处于对数生长期。然后在3000r/min下离心10分钟，弃上清液。菌体用1/2改良MS液体培养基洗涤，离心收集。再将菌体用添加100mg/l乙酰丁香酮的1/2MS改良液体培养基悬浮，稀释5～20倍用于转化。在浸染前向此细菌悬液加入100mg/L的乙酰丁香酮(acetosyringone，AS)。在转化试验中，加入1％的表面活性剂Silwet L-77(Lehle Seeds,USA)或Tween80。
当种皮脱落或快脱落时，去掉种皮和一片子叶，裸露出小苗茎尖。若苗端已有小叶出现，则用镊子剥去。轻轻划伤顶端分生组织后，将蘸有农杆菌菌液的棉球(由灭菌脱脂棉制备)放到小苗顶端，持续24h后取下棉团，用无菌滤纸吸去感染部位的残留菌液。小苗浸染时置于真空干燥器中，辅以0.5×105Pa的负压处理。
浸染过的幼苗于21℃左右暗培养3天，然后在光下培养2～3天后移栽入花盆。花盆下部为壤土，上部为6～8cm厚的蛭石，隔天浇灌1/2MS无机盐溶液。
待转化植株长出3片真叶后，喷洒1.6～1.8‰除草剂草甘膦(转基因选择标记基因为EPSP)水溶液，以未转化植株为对照。喷洒量以植株掉液滴为宜。未转化植株在喷洒后3天停止生长，7～10天左右开始死亡。转化处理后的植株，一些个体的变化与对照植株相似，另一些个体则持续生长，无明显变化。植株长到4～5叶期，将其定植到田间。
抗除草剂转化植株生长到7～8叶时，取叶片提取DNA，采用PCR技术检测外源基因，对PCR阳性植株进行Southern检测。结果：约25％的抗除草剂植株为转基因个体。
3、棉花转基因植株的PCR鉴定
利用CTAB法提取棉花叶片DNA。
betA基因的PCR鉴定相关参数:
所用的引物：
引物1：5’-CGCTACAGGGTAAACGCTACAAC-3’
引物2:5’-CCTCACGGCTGCGAATAAATCC-3’
目标片段约为900bp
PCR扩增程序：Step1预变性：94℃，5min；Step2变性：94℃，1min；Step3退火：57.6℃，40s；Step4延伸：72℃，1min；Step2-4循环34次；Step5过度延伸：72℃，7min；Step6 4℃保存。
反应结束后，扩增产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳。
转GhPEAMT-betA基因棉花的betA基因PCR鉴定结果见图4。其中M为DNA ladder；CK为水；P为pCAMBIA1300-GhPEAMT-betA-EPSP质粒(阳性对照)；WT为鲁棉研19号；L1、L2、L3为鉴定阳性的植株。
GhPEAMT基因的PCR鉴定相关参数:
所用的引物：
CaMV-Gh-F2 5’-GGAAGGTGGCTCCTACAAAT-3’
CaMV-Gh-R2 5’-CCAAAGACACGCTCATAACG-3’
目标片段约：1058bp
PCR扩增程序：
Step1预变性：94℃，5min；Step2变性：94℃，1min；Step3退火：52.5℃，40s；Step4延伸：72℃，1min 04sec；Step2-4循环34次；Step5过度延伸：72℃，7min；Step6保存:4℃。
反应结束后，扩增产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳。
转GhPEAMT-betA基因棉花的GhPEAMT基因PCR鉴定结果见图5。其中M为DNAladder；CK为水；P为pCAMBIA1300-GhPEAMT-betA-EPSP质粒(阳性对照)；WT为鲁棉研19号；L1、L2、L3为鉴定阳性的植株。
PCR结果表明L1、L2、L3为转GhPEAMT-betA转基因棉花株系。
4、转基因植株的耐盐性检测
除草剂筛选后存活的植株生长到4～5叶期时移栽到田间，按照常规管理方法进行管理。单株收获种子供遗传稳定性分析和耐盐性鉴定。
具体的，转基因植株的耐盐性测定
转基因植株开花后自交或姊妹交结实。种子播种在大田或温室，植株长到4～6叶期时取叶片提取DNA，采用PCR技术检测是否带有外源基因。取转基因阳性植株进行抗逆性测定。
棉花对盐害的敏感期为苗期，在花蕾期耐盐性较强，因此利用沙培方法测定转基因棉花的耐盐性。将棉花种子播种于洗净的黄沙中与室温下萌发。播种后浇灌含有0、200mMNaCl的Hogland营养液。每株系每盆萌发30粒种子，5次重复。播种7日后统计计算出苗率。
7d后各株系的出苗率表型见图6。从种子出苗率可以发现，野生型对照的出苗率为33.76±5.25％；转betA-GhPEAMT的株系L1、L2、L3的种子出苗率分别为80.26±6.35％、77.52±5.68％、65.56±4.28％，转betA-GhPEAMT基因棉花的种子萌发率显著高于野生型对照，转betA-GhPEAMT基因的棉花耐盐性苗期得以提高。
5、转基因植株的耐旱性检测
除草剂筛选后存活的植株生长到4～5叶期时移栽到田间，按照常规管理方法进行管理。单株收获种子供耐旱性鉴定。
将转基因株系L1、L2、L3和野生型对照鲁棉研19(WT)种子播种于盛有土壤的花盆中，每盆播种3-5粒种子，隔天浇灌Hogland营养液。待小苗生长至2叶期，每株系挑选出9株长势一致、生长良好的PCR阳性植株为试验材料，每盆一株，为一个重复。每天控制浇水量，使土壤含水量保持在12％左右，进行持续干旱胁迫4周后收获期测定植株生物量(图7)。
结果显示：转基因株系植株生物量显著高于野生型对照，株系L1、L2、L3的干物质积累量比野生型对照分别高47.41％、35.42％和18.63％，提示在棉花中过表达betA-GhPEAMT基因能显著提高棉花的耐旱性。

Claims (2)

1.一种通过增加甜菜碱合成能力提高棉花耐盐抗旱性的方法，是将来自大肠杆菌的胆碱脱氢酶基因betA和来自植物的磷酸乙醇胺甲基转移酶基因GhPEAMT利用植物表达载体pCAMBIA1300-GhPEAMT-EPSP和植物表达载体pCAMBIA1300-betA-als重组构建植物表达载体pCAMBIA1300-GhPEAMT-betA-EPSP，并将其转入棉花细胞中让其高效表达，进而再生出转基因植株；利用苗期喷洒除草剂草甘膦获得抗性小苗，结合常规分子检测技术，从抗性植株及其后代中筛选出转基因纯合体；再在盐碱池或干旱棚中筛选鉴定出耐盐抗旱性显著提高的转基因纯合体，即获得通过增加甜菜碱合成能力创建出的棉花耐盐抗旱育种新种质；
其特征在于：
所述构建重组植物表达载体pCAMBIA1300-GhPEAMT-betA-EPSP的方法是：
(1)BamHI和KpnI双酶切植物表达载体pCAMBIA1300-EPSP，回收载体；BamHI和KpnI双酶切克隆载体pUC57-GhPEAMT回收GhPEAMT片段；将回收的植物表达载体pCAMBIA1300-EPSP的载体部分与回收的克隆载体pUC57-GhPEAMT中的目的基因GhPEAMT连接，获得中间植物表达载体，命名为pCAMBIA1300-GhPEAMT-EPSP；
(2)EcoRI酶切回收中间植物表达载体pCAMBIA1300-GhPEAMT-EPSP的载体部分，通过引物用高保真DNA聚合酶从植物表达载体pCAMBIA1300-betA-als中扩增得到两端引入EcoRI酶切位点的片段35S-betA-nos并用EcoRI酶切后回收；将回收的中间植物表达载体pCAMBIA1300-GhPEAMT-EPSP的载体部分与回收的35S-betA-nos片段连接，得到重组植物表达载体，命名为pCAMBIA1300-GhPEAMT-betA-EPSP；其中所述引物的核苷酸序列为：
NOS-B 5'CGAATTCCCGATCTAGTAACATAG 3'；
35S-B 5'GGAATTCGTCCCCAGATTAGCCTTTTC 3'；
所述棉花细胞是茎尖分生组织细胞、离体培养的幼胚细胞、成熟胚细胞、胚性愈伤组织细胞或原生质体；
所述利用苗期喷洒除草剂草甘膦获得抗性小苗，结合常规分子检测技术，从抗性植株及其后代中筛选出转基因纯合体的方法是：通过对3～4叶期转基因棉花小苗喷洒1.6～1.8‰草甘膦检测转基因植株的抗性，用除草剂筛选获得抗性植株，然后对抗性植株利用PCR、southern杂交技术检测获得转基因纯合植株。
2.如权利要求1所述通过增加甜菜碱合成能力提高棉花耐盐抗旱性的方法，其特征在于：所述棉花的品种是春棉、夏棉、常规棉或杂交棉。
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CN1768575A (zh) * 2005-09-22 2006-05-10 山东大学 一种通过多基因转化提高甜菜耐盐耐旱性和抗除草剂绿黄隆特性的方法及应用
CN101624604A (zh) * 2009-08-03 2010-01-13 山东大学 一种利用聚合抗逆基因提高棉花耐盐耐旱性的方法
CN102604988A (zh) * 2009-09-09 2012-07-25 山东大学 一种甜菜碱合成途径中的甲基转移酶基因及其利用

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SCOTT D. MCNEIL 等: "Enhanced synthesis of choline and glycine betaine in transgenic tobacco plants that overexpress phosphoethanolamine N-methyltransferase", 《PNAS》 *

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