CN101006768B - 农杆菌介导的国槐转基因及组培快繁方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种农杆菌介导的国槐转基因及组培快繁方法，包括(1)种子选择与消毒，(2)根癌农杆菌的选择与培养，(3)组培苗培育，(4)农杆菌侵染，(5)抗性植株选育，(6)转化植株鉴定，(7)转化植株培育，(8)幼苗移栽等步骤；本发明通过选择国槐的特定叶片(大叶片)建立了适宜遗传转化的高频再生体系以及一个可重复的、转化效率高的林木基因转化技术体系，获得了抗盐性提高的转化植株，并建立了配套的组培快繁育苗技术体系；本发明的方法为农杆菌介导的目的基因在木本植物上的转化及包括丛生芽分化、生根和移栽等组培快繁技术提供了依据。

Description

农杆菌介导的国槐转基因及组培快繁方法

技术领域

本发明涉及国槐(又名槐树)的繁育方法，尤其涉及一种利用农杆菌介导的国槐转基因方法及转基因国槐组培快繁方法，属于植物基因工程领域或农业生物技术领域。

背景技术

干旱、盐碱和低温等非生物逆境是自然界普遍存在的影响植物生长的因素，这些胁迫能引起植物发生一系列的生理变化，植物必须适应这些条件才能够生存。由于抗盐耐旱植物材料的缺乏，特别是乔木树种的缺乏，严重制约了我国北方盐碱干旱地区生态工程建设和农村经济发展。目前我国林业生产迫切需要解决适合这些地区植树造林和植被恢复的具有较高经济效益和生态效益的种苗。但由于林木树种生长周期长、个体大，采用常规育种技术改良林木的抗逆性工作量大、年限长，导致林木优良品种的培育工作进展缓慢，难以满足生态建设和经济发展的需求。

国槐(Sophora japonical L.)是豆科槐属的落叶乔木，属温带树种，原产朝鲜和我国北方，是一个优良的多用途树种，我国各地均有栽植，具有重要的生态和经济利用价值。槐花(又称槐米)，不仅可供观赏，而且开花时发出清馥气息，是一种优良的蜜源植物，槐花富含芦丁和黄碱素，芦丁是黄酮类化合物，属贵重药品；黄碱素是上等的天然色素；果实能止血、降压，根、皮、枝叶可用于治疮毒，种子性清凉，是一种收敛止血的药；国槐种子的淀粉和油的含量丰富，可提炼芳香油、酿酒、制肥皂、做油漆等。国槐对空气中的二氧化硫、氯气、氯化氢及烟尘等环境污染有较强的抗性和适应性，在城市绿化中长势旺、枝叶多、树冠大、遮荫效果好，作为行道树、片林、公园绿化等能构成面积较大的植被群体，在吸收污染物和空气净化等方面能发挥很大的作用；利用国槐树体内含污染物的量还可以检测环境污染物的量，起到生物检测的作用。国槐的根系具有根瘤，可以利用游离氮，与一般植物相比可以节约氮肥、改良土壤和提高土壤肥力等。但国槐喜湿润、肥沃的酸性或微碱性土壤，对土壤的盐碱和干旱等逆境条件的适应能力不强，限制了国槐种植和利用的范围。如能提高其抗盐耐旱性，对于盐碱干旱地区生态和经济建设具有重要意义。

rd29A基因是首先从拟南芥中克隆的能够受干旱和低温诱导表达的基因。Yamaguchi等研究了rd29A基因及其启动子区的结构和功能，表明其启动子区包含了可以受到低温、干旱、高盐等因素诱导的调控序列，rd29A基因的上游调控元件能够受到干旱、低温等逆境胁迫因子的诱导，表达产生的反式作用因子可以调节rd29A基因的表达，从而对逆境胁迫产生耐受性。rd29A基因转化烟草获得的转基因植株的干旱高盐及低温耐性得到增强，在其它植物转化的报道很少。

自1981年从菠菜分离和部分纯化获得甜菜碱醛脱氢酶基因(BADH)后，BADH基因工程日益受到重视。Manabu等将来源于大麦的BADH基因转入烟草，在渗透胁迫下，BADH量增加，酶活性也成倍增加。刘风华等利用农杆菌方法转入到草莓和烟草中、郭北海等和李银心等将BADH基因分别转入小麦、豆瓣菜上，得到的转基因植株的耐盐性也有一定提高。但至今尚未见到BADH基因在木本植物上的转化报道。

有关国槐的离体培养研究已经取得一些进展。张晓英等研究了抗生素对国槐愈伤组织诱导和生长的影响；陈维伦(1982)将种子消毒后接种在无激素的MS培养基上，在长出第一片真叶时切取下胚轴和子叶，在附加0.5mg·L^-1 6-BA的MS培养基上形成愈伤组织，并分化出正常丛生芽；王喆之(1997)等对国槐的再生和组培体系建立中IAA和NAA等不同激素种类及含量对试管苗的影响进行了研究，并成功的利用子叶诱导胚状体、进而形成了再生植株。王关林、刘秀梅(2005)对8种(亚种)蝶形花亚科植物组织培养再生能力的研究结果表明：国槐叶片芽分化率仅为22.7％，愈伤组织诱导率、芽分化率及试管苗的生根率也同样较低；同时他们还进行了金叶槐OsNHX1基因转化研究。但是，上述有关国槐的离体培养研究以及相关检索的结果表明，国内外尚未见到有关通过选择国槐的特定叶片(大叶片)建立适宜遗传转化的高频再生体系及其相应的转基因方面的研究报道。

发明内容

针对上述不足，本发明要解决的问题是提供一种利用农杆菌介导的国槐转基因以及对转化植株进行组培快繁的方法。

为实现上述目的，本发明的技术方案采用如下步骤：

(1)种子选择与消毒：选用田间生长高大、健壮、无病虫害的成龄大树作为采种树，收集个大、饱满的荚果，取出种子后在室内晾干，阴凉干燥处放置30天后备用；

接种前对种子进行消毒，种子消毒方法为：将国槐种子用自来水浸泡12～13小时，之后用98％的浓硫酸再浸泡20分钟，在超净工作台上，以70％酒精消毒30分钟，无菌水冲洗5～7次，再用0.1％升汞消毒12分钟，无菌水冲洗5～7次，用灭菌滤纸吸干后接种；

(2)根癌农杆菌的选择与培养：选用含有不同双元载体的根癌农杆菌菌株LBA4404或GV3101；挑选根癌农杆菌单菌落接种于含有卡那霉素50mg·L^-1的YEB液体培养基中，25～30℃，振荡转速160～220rpm条件下，培养24～36小时，然后转接于无抗菌素的YEB培养基中以相同条件培养12～24小时，离心，收集菌体，再用pH 5.4～5.8的无菌MS液体培养基将菌体稀释至OD₆₀₀ 0.3～0.7，即得可用于侵染的农杆菌菌液，备用；

(3)组培苗培育：将消毒后的国槐种子接种于琼脂培养基中常规培养，7天后取种子长成的小苗的茎段转接到愈伤组织诱导及丛生芽分化和生长培养基中继代培养，20天后组培苗即可使用；

(4)农杆菌侵染：取大而肥厚的组培苗大叶片放于加有步骤(2)制备好的农杆菌菌液的培育皿中，其中农杆菌菌液量以刚浸没叶片为准，用刀片划伤大叶片，然后将其转移至步骤(2)制备好的农杆菌菌液中侵染10～15min；

(5)抗性植株选育：将上述侵染后的大叶片在愈伤组织诱导及丛生芽分化和生长培养基上培养2～3天，之后继代转入加有400～500mg·L^-1的头孢霉素的愈伤组织诱导及丛生芽分化和生长培养基中培养15～20天，然后转入选择培养基I中选择培养25～30天，再转入选择培养基II中培养80～100天，继代4～5代得Kan抗性植株；

其中，上述大叶片从农杆菌侵染后开始一直到转入选择培养基I中的15～20天内是放置在黑暗条件下培养，之后进行正常的昼夜光照周期培养，光照时间14h·d^-1；

(6)转化植株鉴定：用PCR和PCR-Southern方法对上述获得的Kan抗性植株进行检测，确定外源基因已经整合到植株基因组DNA中的转化植株；

(7)转化植株培育：将确定的转化植株继代培养20～25天后，取健壮丛生芽小苗直接转入生根培养基生根；幼苗在生根培养基中生长15～20天，90％以上发育成健壮的生根幼苗；

(8)幼苗移栽：将上述生根幼苗在温室条件下适应1～2天后，逐渐松开瓶口封膜以降低湿度，直至取掉封口膜，4～5天后洗净培养基，移入营养钵中，利用间歇喷雾装置或人工喷水保持环境湿度，经过驯化炼苗20～30天后，栽入花盆或大田；

幼苗刚开始转入温室时，利用遮荫网遮荫，4～5天后仅在中午强光时遮荫5～7小时，并随天数增加而逐步减少遮荫时间，以增强光照，13～15天后全部去掉遮荫网；

上述步骤中，步骤(2)所述YEB培养基的配方为：细菌蛋白胨5g·L^-1，酵母浸膏1g·L^-1，牛肉浸膏5g·L^-1，MgSO₄.7H₂O 0.493g·L^-1，pH7.0；步骤(3)所述琼脂培养基配方为：琼脂6～8g·L^-1，pH值5.8～6.0；步骤(3)或(5)所述愈伤组织诱导及丛生芽分化和生长培养基配方为：MS培养基、6-BA 2.0～4.0mg·L^-1、IBA 0.3～0.5mg·L^-1、蔗糖25～35g·L^-1、琼脂6～8g·L^-1，pH值5.8～6.0；所述培养的条件为：昼温度25℃，夜温度18℃，光照强度40umol.m^-2.s^-1，光照时间14h·d^-1；步骤(5)所述选择培养基I的组成为：愈伤组织诱导及丛生芽分化和生长培养基、卡那霉素20～30mg·L^-1；所述选择培养基II的组成为：愈伤组织诱导及丛生芽分化和生长培养基、卡那霉素40～60mg·L^-1；步骤(7)所述继代培养用培养基是愈伤组织诱导及丛生芽分化和生长培养基，所述生根培养基的组成为：1/2 MS培养基、IAA 0.4～0.6mg·L^-1、蔗糖18～22g·L^-1、琼脂6～7g·L^-1，pH值5.8～6.0；所述培养的条件为：昼温度25℃，夜温度18℃，光照强度40umol.m^-2.s^-1，光照时间14h·d^-1。

上述的农杆菌介导的国槐转基因及组培快繁方法中，步骤(2)所述的含有不同双元载体的根癌农杆菌菌株优选含有CaMV35s启动子、山波菜的甜菜碱醛脱氢酶基因、选择标记基因NosNpt-II和报告基因35sGUS的双元载体pBin438的根癌农杆菌LBA4404菌株；或者是含有CaMV35s启动子、拟南芥的rd29A基因、选择标记基因bar和报告基因35sGUS的双元载体pCAMBIA3301的根癌农杆菌GV3101菌株。

上述的农杆菌介导的国槐转基因及组培快繁方法中，步骤(2)所述的培养条件优选是：温度28～30℃，振荡转速180～200rpm。

上述的农杆菌介导的国槐转基因及组培快繁方法中，步骤(4)和(5)所述的大叶片是指组培苗下部的、接触或接近培养基的、大而肥厚的叶片。

上述的农杆菌介导的国槐转基因及组培快繁方法中，所述培养基优选的配方是：

琼脂培养基的组成为：琼脂6.5g·L^-1，pH值5.8；

MS培养基的组成为：KNO₃1900mg·L^-1，NH₄NO₃1650mg·L^-1，MgSO₄370mg·L^-1，KH₂PO₄ 170mg·L^-1，CaCl₂·2H₂O 440mg·L^-1，MnSO₄·4H₂O 22.3mg·L^-1，ZnSO₄·7H₂O8.6mg·L^-1，H₃BO₃ 6.2mg·L^-1，KI 0.83mg·L^-1，NaMoO₄·2H₂O 0.25mg·L^-1，CuSO₄·5H₂O 0.025mg·L^-1，CoCl₂·6H₂O 0.025mg·L^-1，Na₂-EDTA 37.3mg·L^-1，FeSO₄·7H₂O 27.8mg·L^-1，甘氨酸2.0mg·L^-1，盐酸噻胺0.1mg·L^-1，盐酸比哆醇0.5mg·L^-1，烟酸0.5mg·L^-1，肌醇100mg；

愈伤组织诱导及丛生芽分化和生长培养基的配方为：MS培养基、6-BA 4.0mg·L^-1、IBA 0.4mg·L^-1、蔗糖30g·L^-1、琼脂6.5g·L^-1，pH值5.8；

选择培养基I的组成为：愈伤组织诱导及丛生芽分化和生长培养基、卡那霉素25mg·L^-1；

选择培养基II的组成为：愈伤组织诱导及丛生芽分化和生长培养基、卡那霉素50mg·L^-1；

生根培养基的组成为：1/2 MS培养基、IAA 0.5mg·L^-1、蔗糖20g·L^-1、琼脂6.5g·L^-1，pH值5.8。

上述的农杆菌介导的国槐转基因及组培快繁方法中，步骤(2)和(4)所述稀释的用于侵染的农杆菌菌液OD₆₀₀优选0.5。

上述的农杆菌介导的国槐转基因及组培快繁方法中，步骤(4)所述划伤后的大叶片在农杆菌菌液中侵染时间优选12min。

上述的农杆菌介导的国槐转基因及组培快繁方法中，步骤(5)所述头孢霉素的浓度优选450mg·L^-1。

本发明通过选择国槐的特定叶片(大叶片)建立了适宜遗传转化的高频再生体系以及一个可重复的、转化效率高的林木基因转化技术体系，获得了抗盐性提高的转化植株，并建立了配套的组培快繁育苗技术体系。

利用本发明所述的方法可在8～12月之内获得转基因的植株。

实验显示：应用本发明建立的农杆菌介导的高效、可重复的林木基因转化方法，已成功的将甜菜碱醛脱氢酶基因(BADH)和rd29A基因整合到国槐基因组中，获得了抗盐性提高的转化植株，目前已经获得移栽成功的转化植株。

附图说明

图1为国槐组培苗大叶片。

图2为农杆菌侵染后大叶片的再生情况。

图3为kan筛选中的转BADH基因丛生芽。

图4为转BADH基因植株PCR检测(P-以质粒为模板的阳性对照(1.6kp)；1～12-Kan抗性植株；M-DNA marker；CK-以未转化植株为阴性对照)。

图5为转BADH基因植株PCR-Southern检测(P-以质粒为模板的阳性对照(1.6kb)，CK-以未转化植株为阴性对照，O-不加任何模板DNA的空白对照，1～5-转化株系)。

图6为转BADH基因的抗性小苗的分化情况。

图7为转BADH基因的抗性小苗的生长情况。

图8为4‰、6‰和8‰NaCl胁迫下转BADH基因(下)和对照(上)小苗生长情况。

图9为转BADH基因小苗的生根情况。

图10为移栽成活的转BADH基因植株。

图11为转rd29A基因植株PCR检测(P-以质粒为模板的阳性对照(2.1kp)；O-不加任何模板DNA的空白对照；CK-以未转化植株为阴性对照；1～11-转化株系；M-DNAmarker)。

图12为4‰、6‰和8‰NaCl胁迫下转rd29A基因(下)和对照(上)小苗生长情况。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明：

实施例1：

植物材料为普通国槐，从田间采集的种子用自来水浸泡12小时左右，之后用98％的浓硫酸再浸泡20分钟，在超净工作台中，以70％酒精消毒30分钟，无菌水冲洗6次，再用0.1％升汞消毒12分钟，无菌水冲洗6次，用灭菌滤纸吸干后接种在琼脂培养基中，7天后将种子长成的小苗的茎段转接到愈伤组织诱导及丛生芽分化和生长培养基中，经20天继代培养后，得到组培苗。

其中，

琼脂培养基时组成为：琼脂7.0g·L^-1，pH值5.8；

MS培养基的组成为：KNO₃1900mg·L^-1，NH₄NO₃1650mg·L^-1，MgSO₄370mg·L^-1，KH₂PO₄ 170mg·L^-1，CaCl₂·2H₂O 440mg·L^-1，MnSO₄·4H₂O 22.3mg·L^-1，ZnSO₄·7H₂O8.6mg·L^-1，H₃BO₃ 6.2mg·L^-1，KI 0.83mg·L^-1，NaMoO₄·2H₂O 0.25mg·L^-1，CuSO₄·5H₂O 0.025mg·L^-1，CoCl₂·6H₂O 0.025mg·L^-1，Na₂-EDTA  37.3mg·L^-1，FeSO₄·7H₂O 27.8mg·L^-1，甘氨酸2.0mg·L^-1，盐酸噻胺0.1mg·L^-1，盐酸比哆醇0.5mg·L^-1，烟酸0.5mg·L^-1，肌醇100mg；

愈伤组织诱导及丛生芽分化和生长培养基组成为：MS培养基+6-BA 3.0mg·L^-1+IBA 0.4mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1+琼脂6.0g·L^-1；

各培养基pH值5.8。

挑选携带双元载体pBin438的根癌农杆菌LBA4404菌株(其载体含有CaMV35s启动子、山波菜的甜菜碱醛脱氢酶基因(BADH)、选择标记基因NosNpt-II和报告基因35sGUS)(菌种购自上海坤肯生物化工有限公司)的单菌落接种于含有Kan 50mg·L^-1的YEB液体培养基中，培养30小时(28℃，200rpm)，转接于无抗菌素的YEB培养基中以相同条件培养20小时，离心后收集菌体，再用pH5.6的无菌MS液体培养基稀释至OD₆₀₀0.4，得可用于侵染的农杆菌菌液，备用。

〖上述植物表达载体pBin438-BADH的构建方法是：山菠菜(Atriplex hoetensis)生长至10cm时，加入0.8％NaCL胁迫5～10d，提取总RNA，以mRNA为模板反转录合成第一链cDNA^[1、2]。

根据GenBank已公布的山菠菜mRNA序列(Gene Accession Number DQ497233)设计引物：

上游引物：5′-AGAATGGCGTTCCCAATTCCTGCTC-3′，

下游引物：5′-TTCAAGGAGACTTGTACCATCCCCA-3′；

以合成的第一链为模板，加入上游引物和下游引物，进行PCR扩增，回收扩增的双链cDNA与pMD18-T连接，转化大肠杆菌DH5α感受态，经PCR检测、酶切和测序验证后，用BamH I和Kpn I将BADH基因片段从克隆质粒中切出来，定向插入含35S启动子、选择标记基因NPT-II和报告基因GUS的双元载体pBin438中^[3，4]，酶切验证后，所获得的重组质粒pBin438-BADH即植物双元表达载体，再用三亲交配法导入农杆菌LBA4404^[5]。

上述构建方法涉及的参照文献如下：

1、肖岗，张耕耘，刘风华，王军，陈受宜。山菠菜甜菜碱醛脱氢酶基因研究。科学通报，1995，40(8)，471-475。

2、马德钦，唐岚等。甜菜碱醛脱氢酶基因的cDNA克隆。植物学报，1995，12(1)：47-48。

3、刘风华，郭岩，谷冬梅，肖岗，陈正华，陈受宜。转甜菜碱醛脱氢酶基因植物的耐盐性研究。遗传学报，1997，24(1)：54-58。

4、孙仲序，陈受宜，王建设，李桂芬，管雪强。农杆菌介导BADH基因转化葡萄的研究。果树学报，2003，20(2)：89-92。

5、梁峥，马德钦，汤岚，洪益国，骆爱玲，戴秀玉。菠菜甜菜碱醛脱氢酶基因在烟草中的表达。生物工程学报，1997，13(3)：236-240。〗

将国槐组培苗大叶片(组培苗下部接触培养基、大而肥厚的叶片)(见图1)放于制备好的农杆菌菌液的培育皿中，其中农杆菌菌液量以刚浸没叶片为准，用刀片划伤大叶片，然后将其转移到制备好的农杆菌菌液中侵染12min；

将上述侵染后的大叶片在愈伤组织诱导及丛生芽分化和生长培养基上培养3天后，继代转入添加450mg·L^-1 Cef的愈伤组织诱导及丛生芽分化和生长培养基中(从侵染后开始进行暗培养15天)，18天后在培养基添加25mg·L^-1的Kan(见图2)，培养28天后，将Kan浓度提高到50mg·L^-1，培养80天，继代4代得Kan抗性植株(见图3)；

对上述方法获得的转基因植株进行PCR和PCR-Southern检测，植物基因组DNA的提取采用SDS法，根据Genbank上已发表的山菠菜BADH基因序列(Gene Accession NumberDQ497233)，PCR扩增所设计的引物是：

1：5′-AGAATGGCGTTCCCAATTCCTGCTC-3′，

2：5′-TTCAAGGAGACTTGATCCATCCCCA-3′；

25μlPCR反应体系：模板DNA 2μl，2种引物各5pmol，dNTP5nmol，0.5 U Taq酶94℃预变性5分钟，然后依次在94℃变性1分钟、55℃复性1分钟、72℃延伸1.5分钟，循环30次，最后在72℃延伸10分钟。取扩增产物10μl在1.0％的琼脂糖凝胶上进行电泳，GeneGenius全自动凝胶成像分析系统观察结果并照相。在凝胶电泳上，转化植株小苗扩增出了特异条带，与阳性对照扩增出的特异条带一致，阴性对照(未转化植株)没有扩增出任何条带，表明外源基因已经整合到植株的基因组DNA中，Kan抗性小苗的PCR阳性检测率为25％左右(见图4和图5)。

将分子检测得到的转BADH基因国槐株系扩繁后(见图6)的小苗(高2cm左右，见图7)，分别接种到含有不同NaCl浓度(4‰、6‰和8‰)的愈伤组织诱导及丛生芽分化和生长培养基中，每处理重复5次(瓶)，每重复(瓶)3个抗性小苗，经20天时间的培养后，观察到转化植株的NaCl抗性比未转化植株提高2‰～4‰(见图8)。

将获得转化植株分化增殖后，转入生根培养基。幼苗在生根培养基1/2 MS培养基+IAA 0.5mg·L^-1中生长18天以后，90％以上都会发育成健壮的生根幼苗(见图9)。在移栽组培苗时，将生根幼苗在温室条件下适应2天后，逐渐松开瓶口封膜以降低湿度，直至取掉封口膜，4天后洗净培养基，移入营养钵中，利用间歇喷雾装置保持环境湿度，经过驯化炼苗25天后，栽入花盆或大田；

幼苗刚开始转入温室时，利用遮荫网遮荫，5天后仅在中午强光时遮荫5～7小时，并随天数增加而逐步减少遮荫时间，以增强光照，14天后全部去掉遮荫网。

实施例2：

从田间采集的国槐种子消毒后接种在琼脂培养基琼脂6g·L^-1中，7天后将种子长成的小苗的茎段转接到愈伤组织诱导及丛生芽分化和生长培养基(MS培养基+6-BA2.0mg·L^-1+IBA 0.3mg·L^-1)中，经20天继代培养后，得到组培苗。

挑选携带双元载体pCAMBIA3301的根癌农杆菌GV3101菌株(其载体含有CaMV35s启动子、拟南芥的rd29A基因、选择标记基因bar和报告基因35sGUS)(菌种购自上海坤肯生物化工有限公司)的单菌落接种于含有Kan 50mg·L^-1的YEB液体培养基中，培养24小时(30℃，220rpm)，转接于无抗菌素的YEB培养基中以相同条件培养14小时，离心后收集菌体，再用pH5.6的无菌MS液体培养基稀释至OD₆₀₀0.5，得可用于侵染的农杆菌菌液，备用。

〖上述植物表达载体pCAMBIA3301-rd29A的构建方法是：将拟南芥(Arabidopsisthaliana)幼苗置于4℃低温处理2-4h^[1]，取叶片，采用Trizol法提取总RNA，TaKaRa RNAPCR Kit(AMV)Ver 2.0反转录成cDNA，根据GenBank已公布的拟南芥mRNA序列(GeneAccession Number D13044)设计引物，并根据后续构建植物表达载体的需要，在上游引物一端加入一个BamH I位点，在下游引物一端加入了Kpnl位点，所设计的引物为：

上游引物：5′-CGAG↓GATCCTCTCTTAAAGCTCCTT-3′，

下游引物：5′-TCTAGGGTAC↓CGTGGAAAATGGATC-3′；

通过RT-PCR法克隆的rd29A基因，用Agarose Gel DNA Fragment Recovery KitVer.2.0回收其片段与pMD18-T连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选重组子，测序正确后，用BamH I和Kpn I将rd29A从pMD18-T克隆载体上切下，定向克隆于含有CaMV35S启动子的质粒pRT101的BamH I和Kpn I位点，得到重组质粒pRT101-rd29A^[2]。再用HindIII将重组质粒中的35S promoter-rd29A切下，克隆到含有选择标记基因bar和报告基因GUS的质粒pCAMBIA 3301 HindIII位点，酶切以确定片段大小和方向，筛选出正向连接的重组质粒pCAMBIA 3301-rd29A即表达载体^[3]，用冻融法将上述植物表达载体导入农杆菌菌株GV310^[4]。

上述构建方法涉及的参照文献如下：

1.David P.Horvath，Brett K.Mclarney，and Michael F.Thomashow.Regulation ofArabidopsis thalianaL.(Heyn)cor78 in Response to Low Temperrature[J].PlantPhysiol，1993，103：1047-1053。

2.赵风云，王晓云，赵彦修，张慧。转入盐地碱蓬谷胱甘肽转移酶和过氧化氢酶基因增强水稻幼苗对低温胁迫的抗性。植物生理与分子生物学报，2006，32(2)：231-238。

3.李萍，艾秀莲，王志方，王博。雪莲PBP基因表达载体的构建。生物技术，2006，16(2)：11-13。

4.罗雯，刘阳。根癌农杆菌转化条件优化的研究。生物技术，2006，16(1)：41-43。〗

将国槐组培苗大叶片放于制备好的农杆菌菌液的培育皿中，其中农杆菌菌液量以刚浸没叶片为准，用刀片划伤大叶片，然后将其转移到制备好的农杆菌菌液中侵染12min；在愈伤组织诱导及丛生芽分化和生长培养基上培养3天后，继代转入添加450mg·L^-1Cef的愈伤组织诱导及丛生芽分化和生长培养基中(从侵染后开始进行暗培养17天)，19天后在培养基添加30mg·L^-1的Kan，培养25天后，将Kan浓度提高到60mg·L^-1，继代培养5代(100天)得Kan抗性植株；

对上述方法获得的转基因植株进行PCR和PCR-Southern检测，植物基因组DNA的提取采用SDS法，根据Genbank上已发表的拟南芥rd29A基因序列(Gene Accession NumberD13044)，PCR扩增所设计的引物：

1：5′-TCTAGGGTACCGTGGAAAATGGATC-3′，

2：5′-CGAGGATCCTCTCTTAAAGCTCCTT-3′；

25μl PCR反应体系：模板DNA 2μl，2种引物各5pmol，dNTP 5nmol，0.5UTaq酶94℃预变性5分钟，然后依次在94℃变性1分钟、58℃复性1分钟、72℃延伸1.5分钟，循环30次，最后在72℃延伸10分钟。取扩增产物10μl在1.0％的琼脂糖凝胶上进行电泳，GeneGenius全自动凝胶成像分析系统观察结果并照相。在凝胶电泳上，转化植株小苗扩增出了特异条带，与阳性对照扩增出的特异条带一致，阴性对照(未转化植株)没有扩增出任何条带，表明外源基因已经整合到植株的基因组DNA中，Kan抗性小苗的PCR阳性检测率为25％左右(见图11)。

将分子检测得到的转基因植株的扩繁后的小苗(高2cm左右)分别接种到含有不同NaCl浓度(4‰、6‰和8‰)的愈伤组织诱导及丛生芽分化和生长培养基中，每处理重复5次(瓶)，每重复(瓶)3抗性小苗，经20天时间的培养后，观察到转化植株的NaCl抗性比未转化植株提高2‰～4‰(见图12)。

将获得转化植株分化增殖后，转入生根培养基。幼苗在生根培养基1/2 MS培养基+IAA 0.6mg·L^-1中生长20天以后，90％以上都会发育成健壮的生根幼苗。在移栽组培苗时，将生根幼苗在温室条件下适应1天后，逐渐松开瓶口封膜以降低湿度，直至取掉封口膜，5天后洗净培养基，移入营养钵中，利用人工喷水保持环境湿度，经过驯化炼苗20天后，栽入花盆或大田；

幼苗刚开始转入温室时，利用遮荫网遮荫，5天后仅在中午强光时遮荫5～7小时，并随天数增加而逐步减少遮荫时间，以增强光照，15天后全部去掉遮荫网。

实施例3：

从田间采集的国槐种子消毒后接种在琼脂培养基琼脂7g·L^-1中，7天后将种子长成的小苗的茎段转接到愈伤组织诱导及丛生芽分化和生长培养基(MS培养基+6-BA4.0mg·L^-1+IBA 0.5mg·L^-1)中，经20天继代培养后，得到组培苗。

挑选携带双元载体pBin438的根癌农杆菌LBA4404菌种(其载体含有CaMV35s启动子、山波菜的甜菜碱醛脱氢酶基因(BADH)、选择标记基因NosNpt-II和报告基因35sGUS)的单菌落接种于含有Kan 50mg·L^-1的YEB液体培养基中，培养36小时(25℃，160rpm)，转接于无抗菌素的YEB培养基中以相同条件培养22小时，离心后收集菌体，再用pH5.6的无菌MS液体培养基稀释至OD₆₀₀0.5，得可用于侵染的农杆菌菌液，备用。

将国槐组培苗大叶片放于制备好的农杆菌菌液的培育皿中，其中农杆菌菌液量以刚浸没叶片为准，用刀片划伤大叶片，然后将其转移到制备好的农杆菌菌液中侵染15min；在愈伤组织诱导及丛生芽分化和生长培养基上培养2天后，继代转入添加500mg·L^-1Cef的愈伤组织诱导及丛生芽分化和生长培养基中(从侵染后开始进行暗培养19天)，19天后在培养基添加20mg·L^-1的Kan，培养30天后，将Kan浓度提高到60mg·L^-1，培养100天、继代5代，得Kan抗性植株；

对上述方法获得的转基因植株进行分子检测后，将获得转化植株增殖后，转入生根培养基。幼苗在生根培养基1/2 MS培养基+IAA 0.4mg·L^-1中生长15天以后，发育成健壮的生根幼苗。在炼苗移栽后栽入花盆或大田，获得了转化苗木。

通过上述3个实例，经PCR和PCR-Southern检测，应用本发明所述基因转化方法已分别获得转BADH和rd29A基因的株系各26和15个。

NaCl抗性试验表明，未转化植株的生长在4‰NaCl胁迫下即出现受害症状，表现为生长量减少，并随NaCl浓度的提高，出现嫩枝、叶片的黄化、干枯和死亡现象，生长量明显降低；而转基因植株丛生芽生长在8‰时生长才出现明显受害症状，说明其NaCl的相对抗性提高了2‰～4‰。

转化植株能否稳定遗传是其开发利用的重要前提，本发明试验中对初次kan选择、PCR检测和耐盐性实验的植株，在继代培育6～8代后，又进行了二次Kan选择(80天)、PCR检测和耐盐抗性实验，结果表明70％的株系表现稳定遗传特性(即Kan选择未出现黄化现象、PCR检测有特异条带和耐盐性提高)；20％的株系分化的部分丛生苗有黄化现象(疑为嵌合体)，现正在提纯；10％的株系明显黄化，已被淘汰。

上述结果说明，经过连续选择淘汰，完全可以获得遗传稳定的转化株系。

本发明建立了农杆菌介导的高效、可重复的林木基因转化方法，已成功的将甜菜碱醛脱氢酶基因(BADH)和rd29A基因整合到国槐基因组中，获得了抗盐性提高的转化植株，已经获得移栽成功的转化植株；并且建立了转化植株的组培快繁、温室炼苗、营养钵移栽的全部技术，现正在进行产业化开发，在生产上极有推广利用价值。

Claims (7)

1.一种农杆菌介导的国槐转基因及组培快繁方法，由以下步骤组成：

(1)种子选择与消毒：选用田间生长高大、健壮、无病虫害的成龄大树作为采种树，收集个大、饱满的荚果，取出种子后在室内晾干，阴凉干燥处放置30天后备用；

接种前对种子进行消毒；

(2)根癌农杆菌的选择与培养：选用含有不同双元载体的根癌农杆菌菌株LBA4404或GV3101；其中：所述的LBA4404或GV3101菌株是指：含有CaMV35s启动子、山波菜的甜菜碱醛脱氢酶基因、选择标记基因NosNpt-II和报告基因35sGUS的双元载体pBin438的根癌农杆菌LBA4404菌株或含有CaMV35s启动子、拟南芥的rd29A基因、选择标记基因bar和报告基因35sGUS的双元载体pCAMBIA3301的根癌农杆菌GV3101菌株；

挑选根癌农杆菌单菌落接种于含有卡那霉素50mg·L^-1的YEB液体培养基中，25～30℃，振荡转速160～220rpm条件下，培养24～36小时，然后转接于无抗菌素的YEB培养基中以相同条件培养12～24小时，离心，收集菌体，再用pH 5.4～5.8的无菌MS液体培养基将菌体稀释至OD₆₀₀ 0.3～0.7，即得可用于侵染的农杆菌菌液，备用；

(3)组培苗培育：将消毒后的国槐种子接种于琼脂培养基中常规培养，7天后取种子长成的小苗的茎段转接到愈伤组织诱导及丛生芽分化和生长培养基中继代培养，20天后组培苗即可使用；

(4)农杆菌侵染：取大而肥厚的组培苗大叶片放于加有步骤(2)制备好的农杆菌菌液的培育皿中，其中农杆菌菌液量以刚浸没叶片为准，用刀片划伤大叶片，然后将其转移至步骤(2)制备好的农杆菌菌液中侵染10～15min；

(5)抗性植株选育：将上述侵染后的大叶片在愈伤组织诱导及丛生芽分化和生长培养基上培养2～3天，之后继代转入加有400～500mg·L^-1的头孢霉素的愈伤组织诱导及丛生芽分化和生长培养基中培养15～20天，然后转入选择培养基I中选择培养25～30天，再转入选择培养基II中培养80～100天，继代4～5代得Kan抗性植株；

其中，上述大叶片从农杆菌侵染后开始一直到转入选择培养基I中的前15～20天是放置在黑暗条件下培养，之后进行正常的昼夜光照周期培养，光照时间14h·d^-1；

(6)转化植株鉴定：用PCR和PCR-Southern方法对上述获得的Kan抗性植株进行检测，确定外源基因已经整合到植株基因组DNA中的转化植株；

(7)转化植株培育：将确定的转化植株继代培养20～25天后，取健壮丛生芽小苗直接转入生根培养基生根；幼苗在生根培养基中生长15～20天，90％以上发育成健壮的生根幼苗；

(8)幼苗移栽：将上述生根幼苗在温室条件下适应1～2天后，逐渐松开瓶口封膜以降低湿度，直至取掉封口膜，4～5天后洗净培养基，移入营养钵中，利用间歇喷雾装置或人工喷水保持环境湿度，经过驯化炼苗20～30天后，栽入花盆或大田；

幼苗刚开始转入温室时，利用遮荫网遮荫，4～5天后仅在中午强光时遮荫5～7小时，并随天数增加而逐步减少遮荫时间，以增强光照，13～15天后全部去掉遮荫网；

上述步骤中，步骤(2)所述YEB培养基的配方为：细菌蛋白胨5g·L^-1，酵母浸膏1g·L^-1，牛肉浸膏5g·L^-1，MgSO₄.7H₂O 0.493g·L^-1，pH7.0；步骤(3)所述琼脂培养基配方为：琼脂6～8g·L^-1，pH值5.8～6.0；步骤(3)或(5)所述愈伤组织诱导及丛生芽分化和生长培养基配方为：MS培养基、6-BA 2.0～4.0mg·L^-1、IBA 0.3～0.5mg·L^-1、蔗糖25～35g·L^-1、琼脂6～8g·L^-1，pH值5.8～6.0；步骤(5)所述选择培养基I的组成为：愈伤组织诱导及丛生芽分化和生长培养基、卡那霉素20～30mg·L^-1；所述选择培养基II的组成为：愈伤组织诱导及丛生芽分化和生长培养基、卡那霉素40～60mg·L^-1；步骤(7)所述继代培养用培养基是愈伤组织诱导及丛生芽分化和生长培养基，所述生根培养基的组成为：1/2MS培养基、IAA 0.4～0.6mg·L^-1、蔗糖18～22g·L^-1、琼脂6～7g·L^-1，pH值5.8～6.0；步骤(3)、(5)或(7)所述培养的条件为：昼温度25℃，夜温度18℃，光照强度40umol.m^-2.s^-1，光照时间14h·d^-1。

2.如权利要求1所述的农杆菌介导的国槐转基因及组培快繁方法，其特征在于，步骤(2)所述的培养条件是：温度28～30℃，振荡转速180～200rpm。

3.如权利要求1所述的农杆菌介导的国槐转基因及组培快繁方法，其特征在于，步骤(4)和(5)所述的大叶片是指组培苗下部接触或接近培养基的大而肥厚的叶片。

4.如权利要求1所述的农杆菌介导的国槐转基因及组培快繁方法，其特征在于，所述培养基的配方是：

琼脂培养基的组成为：琼脂6.5g·L^-1，pH值5.8；

愈伤组织诱导及丛生芽分化和生长培养基的配方为：MS培养基、6-BA 4.0mg·L^-1、IBA 0.4mg·L^-1、蔗糖30g·L^-1、琼脂6.5g·L^-1，pH值5.8；

选择培养基I的组成为：愈伤组织诱导及丛生芽分化和生长培养基、卡那霉素25mg·L^-1；

选择培养基II的组成为：愈伤组织诱导及丛生芽分化和生长培养基、卡那霉素50mg·L^-1；

生根培养基的组成为：1/2MS培养基、IAA 0.5mg·L^-1、蔗糖20g·L^-1、琼脂6.5g·L^-1，pH值5.8。

5.如权利要求1所述的农杆菌介导的国槐转基因及组培快繁方法，其特征在于，步骤(2)和(4)所述稀释的用于侵染的农杆菌菌液OD₆₀₀为0.5。

6.如权利要求1所述的农杆菌介导的国槐转基因及组培快繁方法，其特征在于，步骤(4)所述划伤后的大叶片在农杆菌菌液中侵染时间为12min。

7.如权利要求1所述的农杆菌介导的国槐转基因及组培快繁方法，其特征在于，步骤(5)所述头孢霉素的浓度为450mg·L^-1。

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