CN101457235A - 一种真空渗透辅助农杆菌介导转化苜蓿的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种真空渗透辅助农杆菌介导转化苜蓿的方法，包括(1)种子灭菌和试管苗培育，(2)含有目标基因的根癌农杆菌培养，(3)真空渗透辅助农杆菌侵染，(4)抑菌和抗性植株选育培养，(5)抗性植株的生根选育，(6)转化植株炼苗及大田移栽等步骤；本发明以农杆菌介导转化苜蓿幼嫩真叶的转化方式，在侵染过程中采用真空渗透的方法，从而大大提高转化效率，通过抗性植株的二次抗性生根选育减少了后期检测工作量，得到大量的转化植株；本发明的方法克服了现有苜蓿遗传转化效率低及转化周期长的难点，提高了苜蓿的转化效率95％以上，缩短转化周期2～3个月，对于苜蓿基因工程方面的理论研究以及遗传育种实践均具有重要意义。

Description

一种真空渗透辅助农杆菌介导转化苜蓿的方法

技术领域

本发明涉及一种农杆菌介导转化苜蓿的方法，尤其涉及一种真空渗透辅助农杆菌介导转化苜蓿的方法，属于生物技术和现代农业技术领域。

背景技术

低温、干旱和盐碱严重影响我国乃至世界的农业生产，我国是干旱频繁发生的国家之一，根据统计，我国从1991年至2005年干旱发生面积平均每年为2602万公顷，其中1998年干旱面积最小，为1424万公顷，而2000年干旱面积最大，达4054万公顷，并且有逐年加大的趋势。水资源短缺以及土壤盐碱化是目前制约农业生产的一个全球性问题，到目前为止，全球20％的耕地受到盐碱化危害，43％的耕地处于干旱、半干旱地区。因此，如何提高植物对低温、干旱和盐碱等逆境的抵抗能力，是目前科学研究和生产上亟待解决的关键问题。

苜蓿素有“牧草之王”的美称，是世界上栽培面积最广、应用最广泛的多年生豆科牧草，它不但具有抗旱、抗寒、高产、优质、营养丰富等特点，还具有改良土壤结构、理化性质、保持水土和保护环境等方面的重要作用。在我国实施农业三元结构调整中，苜蓿是发展可持续农业的首选饲料作物，但当今中外现有的苜蓿品种，抗旱、耐盐能力仍然有限，限制了在干旱和盐碱土壤中的种植。建立农杆菌介导的苜蓿高效再生体系和基因转化体系，将抗逆基因导入苜蓿中，培育抗低温、干旱、耐盐碱等综合性状优良的苜蓿新品系，对扩大苜蓿种植面积、恢复草场和充分利用我国盐碱地都有重要意义。而且可以实现苜蓿育种理论和关键技术的新突破，大幅度提高农牧业可持续发展能力、增加盐碱干旱地区植被覆盖率、促进生态工程建设。因此，抗旱耐盐转基因苜蓿新品种在我国推广应用具有巨大的潜力，并具有良好的经济和社会效益。

多年来，传统有性杂交育种技术在苜蓿品种改良中发挥了重要作用，由于周期长、效率低以及基因资源匮乏等不利因素的影响，未能取得理想的效果。近年来，随着分子生物学的快速发展，借助植物基因工程手段改良苜蓿性状已成为现代育种的重要途径。1986年，Reich等用显微注射法将Ti质粒导入紫花苜蓿原生质体，得到转化的愈伤组织。1990年，Kuchuke等用直接基因转移法将外源基因导入苜蓿属另一个物种Medicago borealis的叶肉原生质体获得转基因植株。2001年，徐恒等用电击法将GUS基因导入苜蓿愈伤组织粉碎后的小细胞团，并检测了GUS基因的瞬时表达。其中，农杆菌介导法是获得转基因植物最常用最可靠的方法，相关的进展报道也较多。1989年，Bowler把烟草的Mn-SOD cDNA导入苜蓿中，发现转基因植物SOD活性增强。Hightower等也将Mn-SOD cDNA导入苜蓿，获得了耐旱的苜蓿。Winicov(2000)等将Alfinl转录因子导入苜蓿基因组中，获得了耐盐碱苜蓿。吕德扬(2000)等用高含硫氨基酸蛋白(HNP)基因转化苜蓿，黎万奎(2003)等用肝片吸虫抗原基因转化苜蓿，并获得转基因植株。此外如抗除草剂基因(Halluin D等，1990)、抗病毒基因(K Hill K等，1991)、和抗虫基因(E A Shahin等，1986)也导入苜蓿中。2003年王涛等发明了“一种快速获得大量转基因植物新品种的分子育种方法”的专利(专利号：200310102540.2)，抗性愈伤最高仅达到50％，转化周期长达12个月。2007年刘立侠等发明了“农杆菌介导的苜蓿遗传转化方法”的专利(专利号：200710055569.8)，缩短转化周期为5～6个月，但转化效率较低，仅为13.5％。尽管科研人员先后在苜蓿转基因方面做了不少的研究工作，但由于苜蓿生长周期长、该属种类繁多、基因组大、转化率普遍较低，人们一直未能建立一个可重复的、转化频率高的苜蓿再生遗传转化体系。Bechtold(1993)等曾用真空渗入技术将农杆菌接种拟南芥植株得到了大量突变体。赵向前等(2002)用农杆菌真空渗透法转化花粉获得棉花转acsB基因植株。但此项技术在苜蓿上应用未见报导，高效稳定的苜蓿遗传转化技术，仍为目前组培中的难点。

发明内容

针对上述不足，本发明的目的在于克服现有苜蓿遗传转化效率低及转化周期长的难点，在常规农杆菌介导转化的基础上，提供一种真空渗透辅助农杆菌转化苜蓿的方法，以提高苜蓿的转化效率。

本发明所述的真空渗透辅助农杆菌介导转化苜蓿的方法，步骤包括：(1)种子灭菌和试管苗培育，(2)含有目标基因的根癌农杆菌培养，(3)真空渗透辅助农杆菌侵染，(4)抑菌和抗性植株选育培养，(5)抗性植株的生根选育，(6)转化植株炼苗及大田移栽；其中：

步骤(1)所述种子灭菌和试管苗培育的方法是：挑选饱满无病虫害的种子，放入1.5ml的离心管内，自来水冲洗干净后，用70％乙醇浸泡30～60秒，再用0.1％氯化汞浸泡6～8分钟，然后用无菌水洗涤4～6次，灭菌期间不断晃动种子，以保证表面灭菌彻底，灭菌后的种子接种到MSB培养基上，7～10d后切取小苗继续转接到MSB培养基上分化培养12～20d，待长出幼嫩真叶备用；

步骤(2)所述含有目标基因的根癌农杆菌培养的方法是：挑取农杆菌菌株LBA4404、GV3101或EHA105(购于中国普通微生物菌种保藏中心)的单菌落接种到5ml含有50mg/L Kan(kanamycin，卡那霉素)的YEB液体培养基中，在温度25～30℃、震荡转速160～200rpm的条件下，培养24～48小时，然后取1ml转接于50ml含有50mg/L Kan的YEB液体培养基中，在温度25～30℃、转速160～200rpm的条件下，培养12～24小时后，再取10～25ml菌液加入到50ml培养基I中，在温度25～30℃、震荡转速200～220rpm条件下培养2～4小时至OD₆₀₀ 0.3～0.7备用；

步骤(3)所述真空渗透辅助农杆菌侵染的方法是：将步骤(1)培育的幼嫩叶片从叶柄处剪取，放于加有步骤(2)制备好的农杆菌菌液的培养皿中，农杆菌菌液量以刚好浸没叶片为准，用刀片切去叶缘，再沿叶脉横切1～4个伤口，然后将其转移到装有步骤(2)制备好的农杆菌菌液的无菌三角瓶中，用透气膜封住瓶口，给以0.02～0.06MPa真空压力条件辅助农杆菌侵染2～8分钟，然后取出三角瓶无菌放置2.5～3.5小时；

步骤(4)所述抑菌和抗性植株选育培养的方法是：将步骤(3)侵染过的叶片平放在胚性愈伤组织诱导培养基II+10～20mg/L AS(acetosyringone，乙酰丁香酮)上，培养2～3d，之后转接到胚性愈伤组织诱导培养基II+200～400mg/L cef(cefotaxime，头孢霉素)+50～80mg/L Kan或2～5mg/L PPT(phosphinothricin，抗草丁膦)上培养2～3周，再转接到培养基II+200～400mg/L cef+50～80mg/L Kan或2～5mg/L PPT+10～30mg/L谷氨酰胺培养2～3周，然后转接到MSB+200～400mg/L cef+50～80mg/L Kan或2～5mg/L PPT分化培养基上培养，每隔2～3周换一次培养基，继代3～4代，获得抗性植株；

其中，从真空渗透辅助农杆菌侵染后开始一直到转接到MSB培养基的4～6周时间是放置在黑暗条件下培养，培养温度为22℃～24℃；之后进行昼夜光照周期培养，光照强度为38～42μmol·m^-2·s^-1，光照时间13～15h·d^-1，昼温度25±1℃，夜温度18±1℃；

步骤(5)所述抗性植株的生根选育的方法是：待步骤(4)获得的抗性植株长到3～4cm，将其切成单株，放在MSB+200mg/L cef+60mg/L Kan或3mg/L PPT抗性筛选培养基上进行诱导生根，培养20～25d发育成健壮的生根幼苗，培养条件为昼夜光照周期培养，即光照强度38～42μmol·m^-2·s^-1，光照时间13～15h·d^-1，昼温度25±1℃，夜温度18±1℃；

步骤(6)所述转化植株炼苗及大田移栽的方法是：当转化生根植株的根长达0.5～1.0cm时移入遮光度为70％～80％遮荫网塑料大棚温室适应1d后，逐渐打开封口膜降低湿度，2～3d后，用镊子将苗夹出，用清水洗去基部残留的培养基，移栽到混合基质育苗盘中，利用间歇喷雾装置或人工喷水保持其相对湿度在80％以上，经驯化炼苗5～6d后，栽入盆栽基质中继续培养3～4d后，然后转移到遮光度为40％～50％遮荫网通风棚内培养8～12d后，移栽到大田；

其中所述混合基质育苗盘的成分以体积比计为：细沙:沙壤土:育苗基质＝4:1:1，混合基质育苗盘上面再放置细沙1～2cm；所述盆栽基质的成分以体积比计为：沙壤土:炉灰:育苗基质＝5:1:1；所述育苗基质购于寿光市恒先育苗基质加工厂。

上述方法各步中采用的培养基及其配方是：

MSB培养基的基本组分包括MS盐分及B₅有机，其组分为：KNO₃ 1900mg·L^-1，NH₄NO₃ 1650mg·L^-1，MgSO₄·7H₂O 370mg·L^-1，KH₂PO₄ 170mg·L^-1，CaCl₂·2H₂0 440mg·L^-1，MnSO₄·4H₂O 22.3mg·L^-1，ZnSO₄·7H₂O 8.6mg·L^-1，H₃BO₃ 6.2mg·L^-1，KI 0.83mg·L^-1，NaMoO₄·2H₂O 0.25mg·L^-1，CuSO₄·5H₂O 0.025mg·L^-1，CoCl₂·6H₂O 0.025mg·L^-1，Na₂-EDTA 37.3mg·L^-1，FeSO₄·7H₂O 27.8mg·L^-1，盐酸硫胺素10mg·L^-1，盐酸比哆醇1.0mg·L^-1，烟酸1.0mg·L^-1，肌醇100mg·L^-1，5g/L琼脂和20g/L蔗糖，pH值5.8～6.0；

液体培养基YEB是指：细菌蛋白胨5g·L^-1，酵母浸膏1g·L^-1，牛肉浸膏5g·L^-1，MgSO₄·7H₂O 0.493g·L^-1，pH值7.0；

培养基I是指：NSH+3.0％蔗糖+10～20mg/LAS，pH值5.0～54；

胚性愈伤组织诱导培养基II是指：NSH+4～6mg/L 2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)+0.4～0.6mg/L 6-BA(6-苄基氨基嘌呤)+3.0％蔗糖+0.5％琼脂，pH值5.8～6.0；

其中NSH培养基组成为：(NH₄)₂SO₄ 463mg·L^-1，KNO₃ 2830mg·L^-1，CaCl₂·2H₂O166mg·L^-1，MgSO₄·7H₂O 185mg·L^-1，KH₂PO₄ 400mg·L^-1，MnSO₄·4H₂O 10mg·L^-1，ZnSO₄·7H₂O 1.0mg·L^-1，H₃BO₃ 5.0mg·L^-1，KI 1.0mg·L^-1，NaMoO₄·2H₂O 0.1mg·L^-1，CuSO₄·5H₂O 0.2mg·L^-1，CoCl₂·6H₂O 0.1mg·L^-1，EDTA-Fe 1.4mg·L^-1，盐酸硫胺素5.0mg·L^-1，盐酸比哆醇5.0mg·L^-1，烟酸5.0mg·L^-1，肌醇100mg·L^-1。

上述真空渗透辅助农杆菌介导转化苜蓿的方法中：步骤(2)所述农杆菌菌株LBA4404是含有CaMV35s启动子、山波菜的甜菜碱醛脱氢酶基因、选择标记基因NosNpt-II和报告基因35sGUS的双元载体pBin438的根癌农杆菌LBA4404菌株；所述农杆菌菌株GV3101是含有CaMV35s启动子、拟南芥的rd29A基因、选择标记基因bar和报告基因35sGUS的双元载体pCAMBIA3301的根癌农杆菌GV3101菌株；所述农杆菌菌株EHA105是含有CaMV35s启动子、拟南芥的SOS₂₊₃基因、选择标记基因bar和报告基因35sGUS的双元载体pCAMBIA3301的根癌农杆菌EHA105菌株。

上述真空渗透辅助农杆菌介导转化苜蓿的方法中：

步骤(2)制备好的用于侵染的农杆菌菌液浓度OD₆₀₀优选为0.5。

步骤(3)所述真空压力优选为0.04MPa，农杆菌侵染时间优选4分钟，放置时间优选3小时。

步骤(4)所述AS的浓度优选10mg/L，cef的浓度优选400mg/L，Kan的浓度优选50mg/L，PPT的浓度优选2mg/L，谷氨酰胺的浓度优选30mg/L。

步骤(4)或(5)所述昼夜光照周期培养的光照强度优选为40μmol·m^-2·s^-1，光照时间优选14h·d^-1，昼温度优选25℃，夜温度优选18℃。

为实现发明目的，本发明采用农杆菌转化的方式并在转化过程中辅助真空渗透法来达到提高转化率的效果，抗性愈伤获得率达到85％以上。

本发明以培养15～20d的幼嫩真叶为转化受体，通过在0.02～0.06MPa真空压力下条件下农杆菌侵染2～8分钟，放在愈伤组织诱导培养基上诱导出愈伤组织，然后放在含有谷氨酰胺的胚性愈伤组织培养基中分化培养，缩短了体胚发生的诱导周期，缩短转化周期2～3个月，并且再通过抗性生根植株的二次筛选，减少了后期检测工作量，抗性再生苗的阳性率达到95％以上。

本发明的方法简单易行，具有突破性特点和显著进步，完善了苜蓿的再生体系和遗传转化体系。与显微注射法、电击法、直接基因转移法和普通农杆菌介导的方法相比，重复性好，转化效率大幅度提高。对于苜蓿基因工程方面的理论研究以及遗传育种实践均具有重要意义。

附图说明

图1：筛选的抗性胚状体。

图2：正在旺盛生长中的抗性胚状体苗。

图3：转BADH基因植株PCR检测。P-以质粒为模版的阳性对照(1.6kb)；0：H₂O为模板的空白对照CK-以未转化植株为阴性对照；1-10-Kan抗性植株。

图4：转BADH基因植株PCR-Southern检测。P-以质粒为模版的阳性对照(1.6kb)；CK-以未转化植株为阴性对照；1-6-转基因植株。

图5：5‰～13‰ NaCL对转BADH基因植株生长的影响。转化植株(上)和未转化植株(下)

图6：抗性生根的转BADH基因植株。

图7：营养钵中移栽成活的转BADH基因植株。

图8：移栽到花盆中的转BADH基因植株。

图9：盐碱地定植转BADH基因植株。

图10：转BADH基因优株人工辅助自交授粉。

图11：15％ PEG6000浓度处理T1代转BADH基因种子发芽率。

图12：T1代转BADH基因种子在育苗盘中发芽。

图13：东营盐碱地耐盐筛选的T1代转BADH基因植株。

图14：转rd29A基因植株的PCR检测。P：以质粒为模板的阳性对照(2.1kb)；M：DL2000；CK：未转化植株；0：H₂O为模板的空白对照；1～11：PPT抗性植株

图15：转SOS2+3基因植株的PCR检测。P：以质粒为模板的阳性对照(780bp)；M：DL2000；CK：未转化植株；0：H₂O为模板的空白对照；1～11：PPT抗性植株。

具体实施方式

下面结合实施案例对本发明作进一步说明：

实施例1：

植物材料为紫花苜蓿中苜1号种子(购于中国科学院畜牧所)，装入1.5ml的离心管内，用自来水洗涤2分钟后，用70％乙醇灭菌60秒，再用0.1％氯化汞灭菌6分钟，然后用无菌水洗涤6次，灭菌后种子接种到MSB+2.0％蔗糖+0.45％琼脂，pH值5.8培养基上，7d后切取小苗继续转接到上述培养基上分化培养18d后，切下幼嫩真叶。

其中种子萌发和分化培养条件为：昼夜光照周期培养，光照强度40μmol·m^-2·s^-1，光照时间14h·d^-1，昼温度25℃，夜温度18℃。

挑选携带双元载体pBin438的根癌农杆菌LBA4404菌种(其载体含有CaMV35s启动子、山波菜的甜菜碱醛脱氢酶基因BADH、选择标记基因NosNpt-II和报告基因35sGUS)的单菌落接种于5ml含有Kan50mg·L^-1的YEB液体培养基中，培养30小时(28℃，180rpm)，取1ml转接于50ml无抗菌素的YEB液体培养基中以上述条件培养12小时后，再取25ml菌液加入到50ml培养基I中，在震荡转速220rpm条件下培养3小时至OD₆₀₀0.6备用。

将苜蓿组培苗的幼嫩真叶放于制备好的农杆菌菌液的培养皿中，其中农杆菌菌液量以刚好浸没叶片为准，用刀片切取叶缘，再沿叶脉横切2个伤口，将其转移到制备好的农杆菌菌液的三角瓶中，用透气膜封口，放在0.04MPa真空压力下条件下农杆菌侵染4分钟，然后取出三角瓶在超净工作台上放置3小时，在此其间用手慢慢摇动。

将侵染过的叶片平放在胚性愈伤组织诱导培养基II+10mg/L AS中暗培养2d后，转接到胚性愈伤组织诱导培养基II+400mg/L cef+50mg/L Kan上暗培养2周，再转接到胚性愈伤组织诱导培养基II+300mg/L cef+60mg/L Kan+30mg/L谷氨酰胺暗培养3周，然后转入到MSB+400mg/L cef+50mg/L Kan分化培养基上进行昼夜光照周期培养(培养条件与上述分化培养相同)，之后每隔2周换一次培养基，继代4代获得Kan抗性植株。

将获得的抗性植株生长到3—5cm切成单株，放在MSB+2.0％蔗糖+0.5％琼脂+200mg/L cef+50mg/L Kan抗性筛选培养基上进行诱导生根25d，90％以上植株生根。

将获得的抗性生根的转基因植株采用CTAB法提取总DNA，随机选取上述含有BADH基因的质粒pBin438所转的植株50株，用BADH基因的引物进行PCR扩增，有48株为PCR阳性，扩增出与质粒阳性对照同样大小的片段(大约1.6kb)，而未转化植株没有扩增出相应的片段，部分植株的PCR结果如图3所示。

根据Genebank上已发表的山菠菜BADH基因序列(Gene Accession NumberDQ497233)，PCR扩增所设计的引物是：

P1：5′-AGAATGGCGTTCCCAATTCCTGCTC-3′，

P2：5′-TTCAAGGAGACTTGATCCATCCCCA-3′；

PCR反应体系：

10×反应缓冲液                    2.5μl

脱氧核苷酸混合物(dNTP)            2μl

引物P1(5uM)                       2μl

引物P1(5uM)                       2μl

模板DNA                           2μl

Taq DNA聚合酶                     0.25μl

ddH₂O                             14.25μl

总体积                            25μl

PCR反应程序：95℃预变性10min，93.5℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1.5min，循环30次，72℃再延伸10min。1.0％的琼脂糖凝胶电泳，GeneGenius全自动凝胶成像分析系统观察结果并照相。

将上述分子检测得到的转BADH基因的株系扩繁后，挑选生长一致的植株分别接种到含有不同NaCl浓度(5‰、7‰、10‰、13‰)分化培养基上，每处理重复4瓶，每瓶4个植株，经20d的培养后，转化植株的NaCl比未转化植株提高3‰～5‰。

当上述检测转化阳性生根植株的根长达0.5～1.0cm时移到遮光度约70％～80％遮荫网塑料大棚温室条件下适应1d后，逐渐打开封口膜降低湿度，2d后，用镊子将苗轻轻夹出，用清水洗去基部残留的培养基，移栽到混合基质育苗盘中，利用间歇喷雾装置或人工喷水以保持相对湿度在80％以上，经驯化炼苗6d后，栽入盆栽基质中继续培养3d后，转移到遮光度约40％～50％遮荫网通风棚内培养9d后，移栽到大田。

实施例2：

将消毒后的苜蓿种子接种到萌发培养基(MSB+2.0％蔗糖+0.5％琼脂，pH值5.8)上，10d后切取小苗继续转接到上述培养基上培养15d后，切下幼嫩真叶，培养条件同实施例1。

挑选携带双元载体pCAMBIA3301的根癌农杆菌GV3101菌种(其载体含有CaMV35s启动子、拟南芥的rd29A基因、选择标记基因bar和报告基因35sGUS)的单菌落接种于5ml含有Kan 50mg·L^-1的YEB液体培养基中，培养24小时(28℃，180rpm)，取1ml转接于50ml无抗菌素的YEB培养基中以相同条件培养16小时后，再取15ml菌液加入到50ml培养基I中，在震荡转速200rpm条件下培养4小时至OD₆₀₀0.7备用。

将苜蓿组培苗的幼嫩真叶放于制备好的农杆菌菌液的培养皿中，其中农杆菌菌液量以刚好浸没叶片为准，用刀片切取叶缘，再沿叶脉横切3个伤口，后将其转移到制备好的农杆菌菌液的三角瓶中，用透气膜封口，放在在0.02MPa真空压力下条件下农杆菌侵染6分钟，然后取出三角瓶放置在转速为100rpm摇床上振荡2.5小时。

将侵染过的叶片平放在胚性愈伤组织诱导培养基II+10mg/LAS中暗培养3d后，转接到胚性愈伤组织诱导培养基II+400mg/L cef+2mg/L PPT上暗培养3周，再转接到胚性愈伤组织诱导培养基II+300mg/L cef+3mg/L PPT+30mg/L谷氨酰胺暗培养2周，然后转入到MS盐+B₅有机+300mg/L cef+50mg/L Kan分化培养基上进行昼夜光照周期培养，之后每隔3周换一次培养基，继代3代获得PPT抗性植株。

将获得的抗性植株生长到3.5cm切成单株，放在MSB+2.0％蔗糖+0.5％琼脂+300mg/L cef+2mg/L PPT抗性筛选培养基上进行诱导生根25d，95％以上植株生根。

随机选取上述含有rd29A基因的质粒pCAMBIA3301所转的抗性生根植株53株，采用CTAB法提取转基因植株基因组DNA，进行PCR检测，有51株为PCR阳性，扩增出与质粒阳性对照同样大小的片段(大约2.1kb)，而未转化植株没有扩增出相应的片段，部分植株的PCR结果如图14所示。

根据Genebank上已发表的拟南芥rd29A基因序列(Gene Accession NumberD13044)，PCR扩增所设计的引物：

P1：5′-TCTAGGGTACCGTGGAAAATGGATC-3′，

P2：5′-CGAGGATCCTCTCTTAAAGCTCCTT-3′；

PCR反应体系同实施例1，PCR反应程序为95℃预变性10min，94℃变性1min，58℃退火1min，72℃延伸2min，循环30次，72℃再延伸10min。

当上述检测转化阳性生根植株的根长达0.5～1.0cm时移到遮光度约70％～80％遮荫网塑料大棚温室条件下适应1d后，逐渐打开封口膜降低湿度，3d后用镊子将苗轻轻夹出，用清水洗去基部残留的培养基，移栽到混合基质育苗盘中，利用间歇喷雾装置或人工喷水以保持相对湿度在80％以上，经驯化炼苗5d后，栽入盆栽基质中继续培养3d后，转移到遮光度约40％～50％遮荫网通风棚内培养12d后，移栽到大田。

实施例3：

将消毒后的苜蓿种子接种到萌发培养基(MSB+0.1mg/L6-BA+3.0％蔗糖+0.55％琼脂，pH值5.8)上，8d后切取小苗继续转接到上述培养基上分化培养20d，切下幼嫩真叶。

挑选携带双元载体pCAMBIA3301的根癌农杆菌EHA105菌种(其载体含有CaMV35s启动子、拟南芥的SOS2+3基因、选择标记基因bar和报告基因35sGUS)的单菌落接种于5ml含有Kan 50mg·L^-1的YEB液体培养基中，培养28小时(28℃，190rpm)，取1ml转接于50ml无抗菌素的YEB培养基中以相同条件培养10小时后，再取20ml菌液加入到50ml培养基I中，在震荡转速220rpm条件下培养2小时至OD₆₀₀ 0.4备用。

将苜蓿组培苗的幼嫩真叶放于制备好的农杆菌菌液的培养皿中，其中农杆菌菌液量以刚好浸没叶片为准，用刀片切取叶缘，再沿叶脉横切3个伤口，后将其转移到制备好的农杆菌菌液的三角瓶中，用透气膜封口，放在0.05MPa真空压力下条件下农杆菌侵染3分钟，然后取出三角瓶在超净工作台上放置3.5小时。

将侵染过的叶片平放在胚性愈伤组织诱导培养基II+20mg/L AS中暗培养2d后，转接到胚性愈伤组织诱导培养基II+300mg/L cef+1mg/L PPT上暗培养2.5周，再转接到胚性愈伤组织诱导培养基II+300mg/L cef+3mg/L PPT+20mg/L谷氨酰胺暗培养2.5周，然后转入到MSB+200mg/L cef+2mg/L PPT分化培养基上进行昼夜光照周期培养，之后每隔3周换一次培养基，继代3代获得PPT抗性植株。

将获得的抗性植株生长到3cm切成单株，放在MSB+2.0％蔗糖+0.6％琼脂+200mg/Lcef+2mg/L PPT抗性筛选培养基上进行诱导生根23d，91％以上植株生根。

随机选取上述含有SOS2+3基因的质粒pCAMBIA3301所转的抗性生根植株40株，采用CTAB法提取转基因植株基因组DNA，用SOS2+3基因的引物(P1：5′-ACAAAGGGTAATATCGGGAAAC-3′，P2：5′-CGAAGGACTCGCCAACAC-3′)进行PCR扩增，有36株为PCR阳性，扩增出与质粒阳性对照同样大小的片段(大约0.78kb)，而未转化植株没有扩增出相应的片段，部分植株的PCR结果如图15所示。

当上述检测转化阳性生根植株的根长达0.5～1.0cm时移到遮光度约70％～80％遮荫网塑料大棚温室条件下适应1d后，逐渐打开封口膜降低湿度，2d后用镊子将苗轻轻夹出，用清水洗去基部残留的培养基，移栽到混合基质育苗盘中，利用间歇喷雾装置或人工喷水以保持相对湿度在80％以上，经驯化炼苗5d后，栽入盆栽基质中继续培养2d后，转移到遮光度约40％～50％遮荫网通风棚内培养14d后，移栽到大田。

实施例4：转基因植株的后代检测

1、转化植株后代的分子检测

将转基因植株进行自交授粉，取后代部分种子消毒后接种到萌发培养基(MSB+2.0％蔗糖+0.5％琼脂，pH值5.8)上，随机挑选转含有BADH基因的pBin438质粒的T1代植株149株，提取叶片总DNA进行PCR检测，PCR阳性率为69.4％，符合孟德尔遗传规律，说明转基因能够稳定遗传到后代。

2、转化植株后代的抗性检测

以未转基因的种子做对照(CK)，取转BADH基因植株的T1代种子T1-2、T1-5、T1-12、T1-14灭菌后，在含100mg/L卡那霉素的萌发培养基(MSB+2.0％蔗糖+0.5％琼脂，pH值5.8)中筛选发芽，1周后观察发芽情况，统计发芽粒数，20d统计植株白化率，结果见表1。

表1 转基因后代的卡那霉素抗性

种子代号        总种子数       发芽种子数        发芽率％         白化率％

CK                 30              28              93.3             92.9

T1-2               28              28              100              21.4

T1-5               28              28              100              25

T1-12              13              11              84.6             45.5

T1-14              21              17              80.9             29.4

未转基因植株和转基因植株后代(T1)种子发芽正常，但生长20d后对照植株白化率达到92.9％，转基因植株的后代(T1)大部分白化率为20％多。

3、转化植株后代的抗旱性检测

以未转基因的种子做对照(CK)，取转BADH基因植株的T1代种子灭菌后，接种到含不同浓度的PEG6000的萌发培养基(MSB+2.0％蔗糖+0.5％琼脂，pH值5.8)中发芽，1周后观察发芽情况，统计发芽率，结果见表2。

表2 转基因后代的PEG6000抗性

PEG6000浓度      0       2.5        5      7.5       10       12.5      15

CK发芽率         100     90.4       82.8   45.7      37.9     22.8      2.1

T1-2发芽率       100     95.5       94.9   76        72.8     67.4      51.4

T1-5发芽率       100     97.1       95.6   81.3      76.2     70.3      53.6

T1-12发芽率      100     94.3       95.4   78.9      73.5     68.9      56.2

T1-14发芽率      100     93.7       91.8   77.4      74.3     71.1      57.5

未转基因种子随PEG6000浓度升高，发芽率明显受到抑制，在15％ PEG6000浓度下转基因种子发芽率为50％多，对照种子发芽率仅为2.1％。

本发明方法各步中采用的培养基及其配方是：

MSB培养基的基本组分包括MS盐分及B5有机，其组分为：KNO₃ 1900mg·L^-1，NH₄NO₃ 1650mg·L^-1，MgSO₄·7H₂O 370mg·L^-1，KH₂PO₄ 170mg·L^-1，CaCl₂·2H₂0 440mg·L^-1，MnSO₄·4H₂O 22.3mg·L^-1，ZnSO₄·7H₂O 8.6mg·L^-1，H₃BO₃ 6.2mg·L^-1，KI 0.83mg·L^-1，NaMoO₄·2H₂O 0.25mg·L^-1，CuSO₄·5H₂O 0.025mg·L^-1，CoCl₂·6H₂O 0.025mg·L^-1，Na₂-EDTA 37.3mg·L^-1，FeSO₄·7H₂O 27.8mg·L^-1，盐酸硫胺素10mg·L^-1，盐酸比哆醇1.0mg·L^-1，烟酸1.0mg·L^-1，肌醇100mg·L^-1，5g/L琼脂和20g/L蔗糖，pH值5.8～6.0；

液体培养基YEB是指：细菌蛋白胨5g·L^-1，酵母浸膏1g·L^-1，牛肉浸膏5g·L^-1，MgSO₄·7H₂O 0.493g·L^-1，pH值7.0；

培养基I是指：NSH+3.0％蔗糖+10～20mg/LAS，pH值5.0～5.4；

胚性愈伤组织诱导培养基II是指：NSH+4～6mg/L 2，4-D+0.4～0.6mg/L 6-BA+3.0％蔗糖+0.5％琼脂，pH值5.8～6.0；

其中NSH培养基组成为：(NH₄)₂SO₄463mg·L^-1，KNO₃ 2830mg·L^-1，CaCl₂·2H₂O166mg·L^-1，MgSO₄·7 H₂O 185mg·L^-1，KH₂PO₄ 400mg·L^-1，MnSO₄·4H₂O 10mg·L^-1，ZnSO₄·7H₂O 1.0mg·L^-1，H₃BO₃ 5.0mg·L^-1，KI 1.0mg·L^-1，NaMoO₄·2H₂O 0.1mg·L^-1，CuSO₄·5H₂O 0.2mg·L^-1，CoCl₂·6H₂O 0.1mg·L^-1，EDTA-Fe 1.4mg·L^-1，盐酸硫胺素5.0mg·L^-1，盐酸比哆醇5.0mg·L^-1，烟酸5.0mg·L^-1，肌醇100mg·L^-1。

所述混合基质育苗盘的成分以体积比计为：细沙:沙壤土:育苗基质＝4:1:1，混合基质育苗盘上面再放置细沙1～2cm；所述盆栽基质的成分以体积比计为：沙壤土:炉灰:育苗基质＝5:1:1；所述育苗基质购于寿光市恒先育苗基质加工厂。

Claims (6)

1、一种真空渗透辅助农杆菌介导转化苜蓿的方法，步骤包括：(1)种子灭菌和试管苗培育，(2)含有目标基因的根癌农杆菌培养，(3)真空渗透辅助农杆菌侵染，(4)抑菌和抗性植株选育培养，(5)抗性植株的生根选育，(6)转化植株炼苗及大田移栽；其特征在于：

步骤(2)所述含有目标基因的根癌农杆菌培养的方法是：挑取农杆菌菌株LBA4404、GV3101或EHA105的单菌落接种到5ml含有50mg/L Kan的YEB液体培养基中，在温度25～30℃、震荡转速160～200rpm的条件下，培养24～48小时，然后取1ml转接于50ml含有50mg/L Kan的YEB液体培养基中，在温度25～30℃、转速160～200rpm的条件下，培养12～24小时后，再取10～25ml菌液加入到50ml培养基I中，在温度25～30℃、震荡转速200～220rpm条件下培养2～4小时至OD₆₀₀ 0.3～0.7备用；

步骤(3)所述真空渗透辅助农杆菌侵染的方法是：将步骤(1)培育的幼嫩叶片从叶柄处剪取，放于加有步骤(2)制备好的农杆菌菌液的培养皿中，农杆菌菌液量以刚好浸没叶片为准，用刀片切去叶缘，再沿叶脉横切1～4个伤口，然后将其转移到装有步骤(2)制备好的农杆菌菌液的无菌三角瓶中，用透气膜封住瓶口，给以0.02～0.06MPa真空压力条件辅助农杆菌侵染2～8分钟，然后取出三角瓶无菌放置2.5～3.5小时；

步骤(4)所述抑菌和抗性植株选育培养的方法是：将步骤(3)侵染过的叶片平放在胚性愈伤组织诱导培养基II+10～20mg/L AS上，培养2～3d，之后转接到胚性愈伤组织诱导培养基II+200～400mg/L cef+50～80mg/L Kan或2～5mg/L PPT上培养2～3周，再转接到培养基II+200～400mg/L cef+50～80mg/L Kan或2～5mg/L PPT+10～30mg/L谷氨酰胺培养2～3周，然后转接到MSB+200～400mg/L cef+50～80mg/L Kan或2～5mg/L PPT分化培养基上培养，每隔2～3周换一次培养基，继代3～4代，获得抗性植株；

其中，从真空渗透辅助农杆菌侵染后开始一直到转接到MSB培养基的4～6周时间是放置在黑暗条件下培养，培养温度为22℃～24℃；之后进行昼夜光照周期培养，光照强度为38～42μmol·m^-2·s^-1，光照时间13～15h·d^-1，昼温度25±1℃，夜温度18±1℃；

步骤(5)所述抗性植株的生根选育的方法是：待步骤(4)获得的抗性植株长到3～4cm，将其切成单株，放在MSB+200mg/L cef+60mg/L Kan或3mg/L PPT抗性筛选培养基上进行诱导生根，培养20～25d发育成健壮的生根幼苗，培养条件为昼夜光照周期培养，即光照强度38～42μmol·m^-2·s^-1，光照时间13～15h·d^-1，昼温度25±1℃，夜温度18±1℃；

步骤(6)所述转化植株炼苗及大田移栽的方法是：当转化生根植株的根长达0.5～1.0cm时移入遮光度为70％～80％遮荫网塑料大棚温室适应1d后，逐渐打开封口膜降低湿度，2～3d后，用镊子将苗夹出，用清水洗去基部残留的培养基，移栽到混合基质育苗盘中，利用间歇喷雾装置或人工喷水保持其相对湿度在80％以上，经驯化炼苗5～6d后，栽入盆栽基质中继续培养3～4d后，然后转移到遮光度为40％～50％遮荫网通风棚内培养8～12d后，移栽到大田；

其中所述混合基质育苗盘的成分以体积比计为：细沙:沙壤土:育苗基质＝4:1:1，混合基质育苗盘上面再放置细沙1～2cm；所述盆栽基质的成分以体积比计为：沙壤土:炉灰:育苗基质＝5:1:1；

上述方法各步中采用的培养基及其配方是：

培养基I是指：NSH+3.0％蔗糖+10～20mg/LAS，pH值5.0～5.4；

胚性愈伤组织诱导培养基II是指：NSH+4～6mg/L2，4-D+0.4～0.6mg/L6-BA+3.0％蔗糖+0.5％琼脂，pH值5.8～6.0；

其中NSH培养基组成为：(NH₄)₂SO₄ 463mg·L^-1，KNO₃ 2830mg·L^-1，CaCl₂·2H₂O166mg·L^-1，MgSO₄·7H₂O 185mg·L^-1，KH₂PO₄ 400mg·L^-1，MnSO₄·4H₂O 10mg·L^-1，ZnSO₄·7H₂O 1.0mg·L^-1，H₃BO₃ 5.0mg·L^-1，KI 1.0mg·L^-1，NaMoO₄·2H₂O 0.1mg·L^-1，CuSO₄·5H₂O 0.2mg·L^-1，CoCl₂·6H₂O 0.1mg·L^-1，EDTA-Fe 1.4mg·L^-1，盐酸硫胺素5.0mg·L^-1，盐酸比哆醇5.0mg·L^-1，烟酸5.0mg·L^-1，肌醇100mg·L^-1；

MSB培养基的基本组分包括MS盐分及B₅有机，其组分为：KNO₃ 1900mg·L^-1，NH₄NO₃ 1650mg·L^-1，MgSO₄·7H₂O₃ 70mg·L^-1，KH₂PO₄ 170mg·L^-1，CaCl₂·2H₂O 440mg·L^-1，MnSO₄·4H₂O 22.3mg·L^-1，ZnSO₄·7H₂O 8.6mg·L^-1，H₃BO₃ 6.2mg·L^-1，KI 0.83mg·L^-1，NaMoO₄·2H₂O 0.25mg·L^-1，CuSO₄·5H₂O 0.025mg·L^-1，CoCl₂·6H₂O 0.025mg·L^-1，Na₂-EDTA 37.3mg·L^-1，FeSO₄·7H₂O 27.8mg·L^-1，盐酸硫胺素10mg·L^-1，盐酸比哆醇1.0mg·L^-1，烟酸1.0mg·L^-1，肌醇100mg·L^-1，5g/L琼脂和20g/L蔗糖，pH值5.8～6.0。

2、如权利要求1所述真空渗透辅助农杆菌介导转化苜蓿的方法，其特征在于：步骤(2)所述农杆菌菌株LBA4404是含有CaMV35s启动子、山波菜的甜菜碱醛脱氢酶基因、选择标记基因NosNpt-II和报告基因35sGUS的双元载体pBin438的根癌农杆菌LBA4404菌株；所述农杆菌菌株GV3101是含有CaMV35s启动子、拟南芥的rd29A基因、选择标记基因bar和报告基因35sGUS的双元载体pCAMBIA3301的根癌农杆菌GV3101菌株；所述农杆菌菌株EHA105是含有CaMV35s启动子、拟南芥的SOS₂₊₃基因、选择标记基因bar和报告基因35sGUS的双元载体pCAMBIA3301的根癌农杆菌EHA105菌株。

3、如权利要求1所述的真空渗透辅助农杆菌介导转化苜蓿的方法，其特征在于：步骤(2)制备好的用于侵染的农杆菌菌液浓度OD₆₀₀为0.5。

4、如权利要求1所述的真空渗透辅助农杆菌介导转化苜蓿的方法，其特征在于：步骤(3)所述真空压力为0.04MPa，农杆菌侵染时间4分钟，放置3小时。

5、如权利要求1所述的真空渗透辅助农杆菌介导转化苜蓿的方法，其特征在于：步骤(4)所述AS的浓度为10mg/L，cef的浓度为400mg/L，Kan的浓度为50mg/L，PPT的浓度为2mg/L，谷氨酰胺的浓度为30mg/L。

6、如权利要求1所述的真空渗透辅助农杆菌介导转化苜蓿的方法，其特征在于：步骤(4)或(5)所述昼夜光照周期培养的光照强度为40μmol·m^-2·s^-1，光照时间14h·d^-1，昼温度25℃，夜温度18℃。

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