CN102220277B - 一种水稻中花11高效再生及转化体系建立的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物基因工程领域，公开发明了一种水稻中花11(Oryza sativa L.subsp.japonica)高效再生及转化体系建立的方法，其工艺过程包括诱导胚性愈伤组织的培养、胚性愈伤组织的继代增殖、根癌农杆菌介导的转化、胚性愈伤组织与根癌农杆菌的共培养、筛选培养抗性愈伤组织、抗性愈伤组织的分化成苗。本发明工艺流程简单，生产成本低，可以显著提高中花11胚性愈伤组织的诱导率、继代增殖率和分化再生率，同时缩短获得再生水稻植株的周期；在此基础上，利用改进的根癌农杆菌介导法，可显著提高获得转基因水稻植株的效率，缩短获得转基因水稻植株的周期。

Description

一种水稻中花11高效再生及转化体系建立的方法

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及到一种水稻中花11高效再生和转化体系建立的方法。

背景技术

水稻(Oryza sativa)是世界上分布最广，也是最重要的的粮食作物之一，其遗传转化一直受到广泛重视。籼稻(ssp.indca)和粳稻(ssp.japonica)是水稻栽培稻两个主要的亚种，在遗传转化方面差异明显。总的来说，籼稻胚性愈伤组织诱导系统较难建立，细胞分裂能力弱，转入选择培养基后愈伤组织生长缓慢，不易分化成苗。粳稻品种容易转化成功，转化频率高。中花11属粳稻品种，是近年来遗传转化常用的水稻品种之一。自1994年miniei等利用土壤杆菌介导转化粳稻成熟胚获得可育的转基因水稻植株后，农杆菌介导的水稻转化即成为了开展水稻研究的一项基本技术。

建立高效的组织培养再生体系是获得高效遗传转化效率的必备条件之一。在完善水稻再生体系研究中，对培养基种类、外植体选择、基因型、光照条件等研究报道较多。但是水稻作为一种喜温作物，温度对其组织培养再生也是一个非常重要的因素。人们在利用水稻成熟胚进行再生研究时常将培养条件设定为26～28℃，暗培养。2006年，Seiichi Toki等人发现，32℃，光照条件下培养1天的日本晴成熟种子即可用于农杆菌浸染，培养2天的种子即可从盾片处长出愈伤组织，3天便可见明显的愈伤组织，在此基础上，他们建立了一套适合于日本晴的农杆菌早期浸染水稻成熟胚快速转化体系，一个月内就可获得转基因植株，转化效率为28.6％。这一研究极大缩短了常规水稻转化需要3～4个月的周期，但转化效率还有待提高。苏益等为验证Seiichi Toki等人的快速浸染转化法是否适用于中花11成熟胚转化，在愈伤组织预培养时间、浸染时间和凝固剂等方面做了改进，最终在40天内就获得了水稻转基因植株，转化效率和再生效率分别达到了71.3％和57％。相比Seiichi Toki等人转化效率提高42.7％，但再生率还有待提高。且直接浸染带有愈伤组织的成熟胚，在愈伤组织和种子相连处的间隙里容易包裹农杆菌，导致在共培养后的清洗过程中，农杆菌除去不彻底，筛选培养时极易染菌。于洋等为了探索在较高温度诱导和继代环境中能否提高水稻再生效率，以“超2-10”和“中花11”两种粳型水稻成熟胚为材料，设置了26℃和36℃的温度环境，结果表明，36℃培养更有利于成熟胚诱导的愈伤组织早期生长，再生率明显比26℃培养时高。众多研究表明，适当提高温度不仅有利于水稻愈伤组织的快速分裂生长，加快转化速度；而且可有效抑制共培养时农杆菌的过度生长，从而提高转化效率。

影响农杆菌转化效率的因素颇多，如菌株和载体、水稻基因型、转化受体、共培养条件(酚类化合物添加、菌液浓度、共培养时间等)等，其中研究主要集中在对于共培养条件的优化。在菌液浓度方面，目前的文献研究使用的农杆菌菌液OD₆₀₀常为0.1～1.5，转化率约为50％～80％(粳稻)。但本发明中使用的菌液OD₆₀₀为0.05～0.1，转化效率高达90％以上，且再生植株经过检测，阳性率为100％；共培养方面，在共培养基上添加一张无菌滤纸，水稻愈伤组织周围农杆菌的生长速度可以被有效地控制，使得共培养后除菌可以温和地进行，从而提高抗性愈伤组织得率；在共培养温度方面，农杆菌具有最强浸染力的生长温度并不是其最适生长温度，而是在较缓慢生长温度条件下，因而，多控制在19～25℃之间。

在愈伤组织再生阶段，分化率低一直是制约水稻遗传转化的一个主要因素。粳稻品种直接分化率低于10％，且耗时长。郝文媛等实验结果表明，通过10～30天的预分化培养不但可以改变愈伤组织的生长状态，而且可以显著提高愈伤组织的分化频率。

AtCPR5基因是一个多效性基因，在拟南芥抗病性、细胞增殖、细胞衰老、细胞死亡、蔗糖的感受、茉莉酸途径、脱落酸途径、膜蛋白的编辑、细胞壁形成等方面发挥重要的作用。AtCPR5基因最初是在筛选抗病性的拟南芥突变体中发现的，主要对两种致命病原体——梨枯病原体和寄生性病原菌卵菌产生组成性的抗病性。此外AtCPR5基因还影响细胞壁的形成及表皮毛的发生，这种隐性突变体植株矮小、叶片光滑、表皮毛分叉减少、细胞壁纤维素结晶区减少，内源SA含量高。目前对AtCPR5基因功能的研究主要集中在抗病性方面。而最近的研究发现AtCPR5与拟南芥的抗热性有密切关系，过量表达AtCPR5能提高拟南芥的耐热性，并阐明了其调节机制可能是通过上调热激蛋白minsp17.6的表达而间接提高了拟南芥的耐热性。

发明内容

本发明克服了在获得转基因水稻过程中，因诱导率低、成苗率低，以及周期长等技术难题，提供一种水稻中花11高效的再生及转化的方法，是一种以水稻中花11种子为材料，进行胚性愈伤组织的高效诱导、继代增殖和根癌农杆菌介导外源基因转化以快速大量获得转基因水稻植株的方法。其首先要利用中花11种子诱导胚性愈伤组织，再进一步继代胚性愈伤组织，通过改进的根癌农杆菌介导法将外源目的基因转化胚性愈伤组织，再通过胚性愈伤组织与根癌农杆菌的共培养、筛选培养抗性愈伤组织、抗性愈伤组织的预分化以及分化成苗，最终可以大规模快速地获得转基因水稻植株。该方法具有诱导率高、转化率高、再生率高、速度快、周期短等特点，在生产和实验上都能发挥重要的作用。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种水稻中花11高效再生及转化体系建立的方法，具体步骤如下：

(1)诱导胚性愈伤组织的培养：选取大小一致、成熟饱满、无病斑的中花11种子，去壳，消毒后，接种于含2～3mg/L 2，4-D的诱导培养基上，30～34℃、持续光照培养，直至种子盾片处长出颗粒状胚性愈伤组织。结果表明：诱导培养基中，2，4-D浓度为1～1.5mg/L时，胚性愈伤组织诱导率低；2，4-D浓度为2mg/L时，胚性愈伤组织诱导率最高，可达90％以上；2，4-D浓度高于3mg/L时，种子长根多，而长出胚性愈伤组织少。相比传统的27℃、暗培养诱导愈伤组织，30～34℃、持续光照培养种子出愈时间提早1～2天，诱导率提高约40％，且诱导的胚性愈伤组织生长速度快、干爽松散、颗粒较大，是胚性愈伤组织诱导较优的培养条件。

(2)胚性愈伤组织的继代增殖：剥下由上述种子盾片处长出的颗粒状胚性愈伤组织，置于继代培养基上，继代培养基同诱导培养基，继代培养条件同诱导培养条件，进行继代培养，5～7天继代一次，继代培养的次数不宜过多，1～2次即可。结果表明：继代次数越多，胚性愈伤组织的胚性变弱，易死亡，不适于进行基因转化和再生培养；光照条件下生长的胚性愈伤组织颜色淡黄，较暗培养的胚性愈伤组织颜色深；27℃继代培养的胚性愈伤组织较湿润、质地较松散，而30～34℃培养的胚性愈伤组织体积增长明显，干爽、较紧凑，颗粒较大而不易破碎，这样的胚性愈伤组织胚性好，更有利于浸染和分化再生。

(3)根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的转化：将含有目的基因(该目的基因可根据需要进行选择)重组质粒的根癌农杆菌菌种(由广东省微生物研究所提供菌种)，划线于细菌固体培养基上，28±1℃，进行2～3天的活化培养。挑取上述根癌农杆菌单克隆菌落，加至含100～300μM AS的AAI液体培养基中，培养温度28±1℃，摇菌，使菌液OD₆₀₀＝0.05～0.1，选取结构致密的胚性愈伤组织颗粒，在上述根癌农杆菌菌液中浸染4～7分钟，摇晃均匀。将浸染后的胚性愈伤组织在无菌条件下进行表面风干1～2小时。结果表明：根癌农杆菌菌液浓度OD₆₀₀在0.05～0.1，浸染时间在4～7分钟，既可以保证较高的转化效率、又可以有效抑制因根癌农杆菌过度生长导致胚性愈伤组织死亡，转化后的胚性愈伤组织在共培养阶段染菌死亡率为8～15％，筛选培养后获得抗性愈伤组织率可达90％以上。

(4)胚性愈伤组织与根癌农杆菌的共培养：在共培养基上添加一张用AAI培养液浸湿的无菌滤纸，然后将上述浸染后表面已风干的胚性愈伤组织转移至共培养基上，26℃，暗培养2～3天。结果表明：在共培养基上添加一张用AAI培养液浸湿的无菌滤纸，不仅可有效抑制农杆菌的过量增殖，且胚性愈伤组织状态较未添加滤纸的胚性愈伤组织状态好。共培养2天的胚性愈伤组织转化效率较共培养3天的低。

(5)筛选培养抗性愈伤组织：将上述共培养后的胚性愈伤组织表面的根癌农杆菌漂洗干净后，在无菌条件下进行表面风干(1～2小时)，再转接至含20～30mg/L抗生素(抗生素种类的选择依据表达载体上所携带的筛选标记基因)的选择培养基上，培养10～14天后转移至40～50mg/L含同种抗生素的选择培养基上培养20～30天后，即可获得新鲜的抗性愈伤组织。培养温度为30～34℃、持续光照培养。结果表明：本发明中先进行低浓度温和的抗性筛选，有助于促进浸染后胚性愈伤组织细胞恢复生长，使得抗性愈伤组织获得率高达90.58％，且30～34℃、持续光照培养有助于除去共培养后的农杆菌，降低染菌率，促进细胞生长。

(6)抗性愈伤组织的预分化：将上述筛选培养后获得的抗性愈伤组织接入含2～3mg/l2，4-D的预分化培养基上，25～28℃、暗培养5～6天，然后25～28℃、16小时光照/8小时黑暗交替培养7～8天。结果表明：50％～70％的抗性愈伤组织在进行完预分化后即可出现绿点；若未进行预分化培养，而直接进行分化培养，20～30天抗性愈伤组织才出现绿点。

(7)抗性愈伤组织的分化成苗：将预分化后的抗性愈伤组织接至含6-BA浓度为4～5mg/L、NAA浓度为0.2～1mg/L的分化培养基上，25～28℃、16小时光照/8小时黑暗交替培养直至分化出绿苗。待苗长至2～4cm时移至生根培养基培养6～8天后移栽到大田。结果表明：当分化培养基中6-BA和NAA分别以4～5mg/L和0.2～1mg/L浓度组合时可使愈伤组织达到较优的再生效果。

优选地，所述诱导培养基是以N₆大量元素、B₅微量元素、B₅有机成分为基础培养基，激素选用2～3mg/L 2，4-D，并添加0.4～0.6g/L脯氨酸、0.2～0.4g/l水解酪蛋白、25～35g/l蔗糖，PH 5.7～6.0；

所述AAI培养液是以AAI培养基为基础培养基，激素为2～3mg/L 2，4-D，并添加100～300μMAS、25～35g/l蔗糖、60～80g/L葡萄糖，PH 5.0～5.5，过滤灭菌；

所述共培养基是在诱导培养基中再添加100～300μMAS、8～12g/L葡萄糖，PH 5.3～5.8；

所述选择培养基是以N₆大量元素、B₅微量元素、B₅有机成分为基础培养基，激素为2～3mg/L 2，4-D，并添加0.8～1.2g/L水解酪蛋白、0.8～1.2g/L脯氨酸、25～35g/l蔗糖、20～50mg/L抗生素，PH 5.7～6.0；

所述分化培养基是以N₆大量元素、MS微量元素、B₅有机成分为基础培养基，激素为4～5mg/L 6-BA、0.2～1mg/LNAA，并添加12～17g/L蔗糖，PH 5.7～6.0；

所述生根培养基是以1/2MS培养基为基础培养基，激素为0.8～1.2mg/L IBA，并添加25～35g/l蔗糖，PH 5.7～6.0；

所述预分化培养基是以MS培养基为基础培养基，激素选用2～3mg/L 2，4-D，并添加0.8～1.2g/L水解酪蛋白、25～35g/l蔗糖、PH 5.7～6.0。

除AAI培养液需过滤灭菌外，其余培养基均需高温高压灭菌。优选地，所述光照培养的光强为80±20umol/m².s；所述诱导培养愈伤组织、继代培养愈伤组织及筛选培养抗性愈伤组织的温度均为32℃；所述2，4-D的浓度为2mg/L。

优选地，所述AAI培养液和共培养基中AS的浓度均为200μM，胚性愈伤组织颗粒在根癌农杆菌菌液中浸染的时间为5分钟。

优选地，步骤(5)中，所述胚性愈伤组织表面的根癌农杆菌漂洗是用含0.01％吐温的无菌水震荡漂洗至少5次，每次5～8分钟，然后在含500mg/L头孢霉素的无菌水中振荡漂洗至少10分钟。

优选地，步骤(6)所述6-BA的浓度为5mg/L，NAA的浓度为1mg/L。

优选地，所述诱导培养基、继代培养基、共培养基、选择培养基、预分化培养基、分化培养基、生根培养基中均加入3.0～4.0g/L植物凝胶。

优选地，步骤(3)中构建含有目的基因重组质粒的根癌农杆菌，选用适合于单子叶植物转化的双元表达载体，表达载体上具备细菌抗生素抗性基因和植物抗生素抗性基因。

步骤(3)中活化根癌农杆菌的细菌培养基可选用LB、AB或YEB培养基，优选地，活化时细菌培养基中还加入50～100mg/L利福平和10～100mg/L抗生素，所述抗生素为表达载体上携带的细菌抗生素抗性基因所编码的抗生素。

本发明相对于现有技术具有如下有益效果：

1、诱导率高，出愈时间早：30～34℃、持续光照培养，种子第2天开始萌动，第4天即可见明显的胚性愈伤组织，诱导第7天统计诱导率达100％，用少量种子即可获得足够的转化材料。

2、周期短：该体系从诱导胚性愈伤组织到获得转基因水稻植株耗时约2个月，相比传统的3～4个月的水稻转化周期，可以节省1～2个月；相比Seiichi Toki等人的早期浸染水稻成熟胚快速转化法，虽然周期多1个月，但转化效率有了极大的提高。

3、胚性愈伤组织状态佳：30～34℃、光照诱导和继代培养的胚性愈伤组织，呈淡黄色，较暗培养的胚性愈伤组织颜色略深，表面干爽，结构较致密，颗粒大而不易破碎，胚性好，适于转化，分化频率高。

4、染菌率低：在30～34℃条件下进行胚性愈伤组织诱导和继代，培养基基本不会长菌；浸染时使用的农杆菌菌液浓度相比传统的浓度低，该浓度既可保证转化效率，又可避免因农杆菌浓度过高，导致胚性愈伤组织褐化死亡；在共培养基上添加一张用AAI培养液浸湿的无菌滤纸，可以有效抑制农杆菌的过度生长；筛选培养时，30～34℃的高温，一方面有助于除去共培养后的农杆菌，另一方面有利于细胞生长，整个过程中因农杆菌导致的染菌率低于10％。

5、转化率高：筛选培养一个月后统计抗性愈伤组织获得率为90.58％。

6、分化率、再生率高：愈伤组织分化率可达100％，再生率可达90.50％。

同时采用本方法，还进行了其他基因转化中花11的研究，用于某些基因的过量表达和RNAi干扰实验。结果均表明，该方法具有可行性、稳定性、高效性，确实适合于水稻中花11的遗传转化研究和大规模快速微型繁殖水稻植株。

附图说明

图1：植物双元表达载体pHQSN1示意图。

图2：转基因T₀代植株的PCR检测。M：Maker DL2000，CK+：阳性对照(质粒)，CK-：阴性对照(非转基因植株)，空：空白对照，1～10：转基因植株。a图为目的基因AtCPR5，b图为潮霉素基因HPT。

图3：转基因T₀植株的Southern blot检测。CK+：阳性对照(质粒)，CK-：阴性对照(非转基因植株)，1～11：转基因植株a图为目的基因AtCPR5探针杂交，b图为潮霉素基因HPT探针杂交。

图4：转基因T₀植株的半定量RT-PCR分析。wt：中花11野生型(非转基因植株)，1～8：转基因植株。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

实例所用培养基：

①愈伤组织诱导/继代培养基

NBB培养基：N₆大量元素+B₅微量元素+B₅有机成分+2mg/L 2，4-D+0.3g/l水解酪蛋白+0.5g/l脯氨酸+30g/l蔗糖+3.5g/l植物凝胶，PH 5.8。

②农杆菌活化培养基

AB固体培养基：AB培养基+5g/L葡萄糖+15g/L琼脂+50mg/L利福平+75mg/L卡那霉素，用AB缓冲液调节PH到7.2。

③AAI液体培养基：AAI培养基+30g/l蔗糖+70g/L葡萄糖+2mg/L 2，4-D+200μMAS，PH 5.2。

④共培养基

NBB培养基+0.3g/L水解酪蛋白+0.5g/L脯氨酸+2mg/L 2，4-D+200μM AS+10g/L葡萄糖+30g/L蔗糖+3.5g/L植物凝胶，PH 5.5。

⑤选择培养基

NBB+1g/L水解酪蛋白+1g/L脯氨酸+2mg/L 2，4-D+蔗糖+30mg/L潮霉素+500mg/L头孢霉素+3.5g/l植物凝胶，PH 5.8。

⑥预分化培养基

MS培养基+1g/L水解酪蛋白+2mg/L 2，4-D+50mg/L潮霉素+2蔗糖+3.5g/l植物凝胶，PH 5.8。

⑦分化培养基

N₆大量元素+MS微量元素+B₅有机成分+5mg/L 6-BA+1mg/L NAA+50mg/L潮霉素+15g/L蔗糖+3.5g/l植物凝胶，PH 5.8。

⑧生根培养基

1/2MS培养基+30g/L蔗糖+1mg/L IBA+植物凝胶，PH 5.8。

2、药品和试剂缩写

AS：乙酰丁香酮             6-BA：6-卞基腺嘌呤

bp：碱基对                 Cef：头孢霉素

2，4-D：2，4-二氯苯氧乙酸  DIG：地高辛

hyg：潮霉素                Kan：卡那霉素

KT：激动素                 NAA：萘乙酸

SDS：十二烷基磺酸钠

1、诱导胚性愈伤组织的培养

选取籽粒饱满、大小一致成熟的中花11种子，去壳，先用70％醇浸泡1分钟，然后用0.1％升汞浸泡并来回摇晃20分钟，无菌水冲洗5次，再将种子置于无菌滤纸上吸干水分后，接种于含2mg/L 2，4-D的诱导培养基上，每个平板接种约30个种子。设计表1中的对照实验，每种处理做15个重复。诱导第7天，随机各取10个平板统计胚性愈伤组织诱导率(表1)

表1：温度和光照对中花11胚性愈伤组织诱导的影响

注：诱导率＝出愈胚数/接种胚数×100％；愈伤组织大小：“++++”最大，“+”最小；干爽程度：“++++”干爽，“+”湿润；颜色鲜艳：“++++”淡黄色，“+”乳白色。

结果表明：在诱导培养基上培养，10种处理条件下的种子在第2天开始萌动，其中32～36℃培养第3天长出胚性愈伤组织，同时可看到胚芽形成，而27℃培养出愈时间延迟1～2天。诱导第7天统计诱导率，32～36℃培养相比27℃培养诱导率提高约40％，其中32℃、光照培养诱导率最高。且32℃培养的胚性愈伤组织生长速度快，体积增长明显，用少量的种子即可获得足够多的材料进行转化。32℃、持续光照培养胚性愈伤组织干爽，出愈时间提早，诱导率高，是胚性愈伤组织诱导较优的培养条件。

在32℃、持续光照培养条件下，在诱导培养基中分别添加1mg/L、1.5mg/L、2mg/L、2.5mg/L、3mg/L、4mg/L2，4-D时，观察种子出愈情况。结果表明：诱导培养基中，2，4-D浓度为1～1.5mg/L时，胚性愈伤组织诱导率低；2，4-D浓度为2mg/L时，胚性愈伤组织诱导率最高，可达90％以上；2，4-D浓度高于3mg/L时，种子长根多，而长出胚性愈伤组织少。2，4-D浓度为2～3mg/L时适合诱导种子长出愈伤组织。

2、胚性愈伤组织的继代增殖

种子分别在表1所列举的十种处理条件下诱导培养第7天，剥下由种子盾片处长出的颗粒状胚性愈伤组织分别在十种处理条件下进行继代培养。7天继代一次，继代2次，继代培养基同诱导培养基。

结果表明：光照条件下生长的胚性愈伤组织颜色淡黄，较暗培养的胚性愈伤组织颜色深；27℃培养的胚性愈伤组织较湿润、质地较松散，而32℃培养的胚性愈伤组织体积增长明显，干爽、较紧凑，颗粒较大而不易破碎，这样的胚性愈伤组织胚性好，更有利于浸染和分化再生。

3、AtCPR5基因的扩增和重组质粒的构建

提取野生型拟南芥叶片RNA，设计带有BamH I酶切位点的两个引物(CPR5-F：5′-GG ATCCCATGGAAGCCCTCCTCCT-3′；CPR5-R：5′GGATCCTCAAGCATAGTCAGACCCACCAT-3′)，进行AtCPR5基因(1695bp)的扩增。将AtCPR5目的片段与pHQSN1表达载体连接，形成重组质粒pHQSN1-AtCPR5，为下一步将AtCPR5基因转化到水稻中奠定基础。

pHQSN1(图1)是目前广泛使用的，用于单子叶植物转化的一种植物双元表达载体，带有花椰菜花叶病毒35S RNA启动子(CaMV35S启动子)、卡那霉素抗性标记(细菌)和潮霉素抗性标记(植物)。

4、利用根癌农杆菌介导法将重组质粒pHQSN1-AtCPR5转化水稻胚性愈伤组织及抗性水稻植株的获得

1)根癌农杆菌介导的转化

①将含有重组质粒pHQSN1-AtCPR5的根癌农杆菌菌种划线于含50mg/L利福平和75mg/L卡那霉素的AB固体培养基上，28±1℃进行活化培养。

②挑取第①步活化培养得到的根癌农杆菌单克隆菌落，加至含200μM AS的AAI培养液中，28±1℃振荡培养，使根癌农杆菌菌液OD₆₀₀＝0.08，以备转化之用。

③选取上述32℃、持续光照继代培养14天，结构致密的胚性愈伤组织颗粒，在第②步中所制得的根癌农杆菌菌液中浸染5分钟，摇晃均匀。

⑤倒去菌液，用无菌纱布滤去多余菌液，将胚性愈伤组织于无菌滤纸上表面风干1.5小时，直至胚性愈伤组织表面干爽。

结果表明：根癌农杆菌菌液浓度OD₆₀₀＝0.08，浸染时间5分钟可获得较好的转化效果，转化后的愈伤组织在共培养阶段染菌死亡率约为10％，筛选培养后获得抗性愈伤组织率可达90％以上。

2)胚性愈伤组织与根癌农杆菌的共培养

在共培养基上添加一张用AAI培养液浸湿的无菌滤纸，将1)步骤中经根癌农杆菌浸染后表面已风干的胚性愈伤组织转移至共培养基上，26℃，暗培养2～3天，以胚性愈伤组织表面刚刚可见农杆菌为度。表2为共培养时添加一张用AAI培养液浸湿的无菌滤纸对胚性愈伤组织生长的影响。

表2：共培养时添加滤纸对胚性愈伤组织生长的影响

结果表明：在共培养基上添加一张用AAI培养液浸湿的无菌滤纸，不仅可有效抑制农杆菌的过量增殖，且胚性愈伤组织状态较未添加滤纸的胚性愈伤组织状态好。共培养2天的胚性愈伤组织转化效率较共培养3天的低。

3)筛选培养抗性愈伤组织

将上述共培养后的胚性愈伤组织用含0.01％吐温的无菌水震荡漂洗5次，每次8分钟，然后在含500mg/L头孢霉素的无菌水中振荡漂洗10分钟，将胚性愈伤组织置于无菌滤纸上，在超净工作台上吹至表面风干，再转接至含30mg/L潮霉素的选择培养基上进行第一次筛选培养，培养10天后转移至50mg/L潮霉素的选择培养基上进行第二次25天的筛选培养。筛选培养条件为32℃、持续光照培养。

结果表明：本发明中先进行低浓度温和的抗性筛选，有助于促进浸染后胚性愈伤组织细胞恢复生长，使得抗性愈伤组织获得率高达90.58％，且32℃、持续光照培养有助于除去共培养后的根癌农杆菌，降低染菌率，促进细胞生长。

4)抗性愈伤组织的预分化

将在3)步骤中筛选培养基上长出的新的抗性愈伤组织转接到预分化培养基上，27℃暗培养6天，然后27℃，16小时光照/8小时黑暗交替培养8天。结果表明：50％～70％的抗性愈伤组织在进行完预分化后即可出现绿点；若未进行预分化培养，而直接进行分化培养，20～30天抗性愈伤组织才出现绿点。

5)抗性愈伤组织的分化成苗

将预分化培养后的抗性愈伤组织转接至分化培养基上，27℃、16小时光照/8小时黑暗交替培养直至分化出绿苗。待苗长至2～4cm时移至生根培养基培养8天后，当幼苗长出较多的新根时，移栽到大田。表3为分化培养基中6-BA和NAA以不同配比进行组合使用时对抗性愈伤组织分化和再生的影响。

表3：分化培养基中不同激素配比对抗性愈伤组织分化和再生的影响

(注：分化培养20天统计分化率和再生率)

结果表明，随着6-BA和NAA浓度的提高，水稻抗性愈伤组织分化率和再生成苗率也提高，其中两者组合浓度分别为5mg/L和1mg/L时抗性愈伤组织分化率和再生率达到最高。6-BA是诱导植株再生所必需的外源激素，较高浓度的6-BA可以诱导更多植株再生，但如果6-BA浓度过高，会导致植株发生玻璃化现象，而NAA能加速愈伤组织的生长，增加细胞数量，积累特异蛋白、糖等必要物质，所以当两者分别以4～5mg/L和0.2～1mg/L浓度组合时可使愈伤组织达到较优的再生效果。

4、转基因水稻植株的分子生物学鉴定

1)转基因水稻植株的PCR鉴定

随机选取20株T₀代抗性水稻植株提取DNA，进行PCR扩增，电泳。结果表明，20株T₀代抗性水稻植株均扩增出1695bp和500bp的特异性条带，而未转化的对照则无特异性条带(图2)。扩增出的特异条带与预期相符，可初步确定外源基因AtCPR5已整合到抗性再生水稻植株的基因组中。

2)转基因水稻植株的Southern blot鉴定

大量提取PCR反应呈阳性的抗性水稻植株总DNA，用BamH I酶切，电泳，转膜后分别与地高辛标记的AtCPR5基因(探针长度549bp)、HPT基因探针(探针长度600bp)杂交，具体步骤见Roche公司的试剂盒使用说明书。结果表明，转基因水稻植株显示出特征杂交带，未转基因水稻植株则没有杂交带(图3)。PCR检测呈阳性的样品在Southern杂交中均为阳性，而且是单拷贝插入。

3)转基因水稻植株的半定量RT-PCR检测

使用TaKaRa公司的RNAiso Plus试剂，分别提取WT和鉴定为阳性转基因水稻植株的总RNA，用DNA酶进行酶解以去除基因组DNA。以水稻actin基因做内参，CPR5-F和CPR5-R为扩增引物，对AtCPR5基因在转基因水稻植株中的表达情况做半定量检测。8株转基因水稻植株均能扩增出1695bp的特异性条带，而未转化水稻植株没有扩增出任何条带(图4)，说明AtCPR5在此8株转基因水稻植株中均有不同程度的转录表达，其中在第5和第8号植株中表达较弱。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种水稻中花11高效再生及转化体系建立的方法，其特征在于，具体步骤如下：

（1）诱导胚性愈伤组织的培养：选取中花11种子，去壳，消毒后，接种于含2～3mg/L2,4-D的诱导培养基上，30～34℃、持续光照培养，直至种子盾片处长出颗粒状胚性愈伤组织；

（2）胚性愈伤组织的继代增殖：剥下由上述种子盾片处长出的颗粒状胚性愈伤组织，置于继代培养基上，进行继代培养，5～7天继代一次，继代1~2次；

（3）根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导的转化：将含有目的基因重组质粒的根癌农杆菌菌种，划线于细菌固体培养基上进行活化培养，挑取上述根癌农杆菌单克隆菌落，加至AAI培养液中，培养温度28±1℃，摇菌，使根癌农杆菌菌液OD₆₀₀=0.05～0.1；选取步骤（2）继代培养中结构致密的胚性愈伤组织颗粒，在上述根癌农杆菌菌液中浸染4～7分钟，摇晃均匀；然后将浸染后的胚性愈伤组织在无菌条件下进行表面风干；所述构建含有目的基因重组质粒的根癌农杆菌，选用适合于单子叶植物转化的双元表达载体，表达载体上具备细菌抗生素抗性基因和植物抗生素抗性基因；

（4）胚性愈伤组织与根癌农杆菌的共培养：在共培养基上添加一张用AAI培养液浸湿的无菌滤纸，然后将上述表面已风干的胚性愈伤组织转移至共培养基上，26℃、暗培养2～3天；

（5）筛选培养抗性愈伤组织：将上述共培养后的胚性愈伤组织表面的根癌农杆菌漂洗干净后，在无菌条件下进行表面风干，再转接至含20～30mg/L抗生素的选择培养基上进行第一次筛选培养，培养10～14天后转移至40～50mg/L含同种抗生素的选择培养基上进行第二次筛选培养，培养20～30天后，即获得新鲜的抗性愈伤组织；所述筛选培养温度为30～34℃、持续光照；所述抗生素为表达载体上携带的植物抗生素抗性基因所编码的抗生素；

（6）所述抗性愈伤组织的预分化：将步骤（5）筛选培养后获得的抗性愈伤组织接至预分化培养基上，25～28℃、暗培养5～6天，然后25～28℃、16小时光照/8小时黑暗交替培养7～8天；所述预分化培养基是以MS培养基为基础培养基，激素为2～3mg/L 2,4-D，并添加0.8～1.2g/L水解酪蛋白、25～35g/l蔗糖、PH 5.7～6.0；

（7）抗性愈伤组织的分化成苗：将抗性愈伤组织接至含6-BA浓度为4～5mg/L、NAA浓度为0.2～1mg/L的分化培养基上，25～28℃、16小时光照/8小时黑暗交替，培养直至分化出绿苗；待苗长至2～4cm时移至生根培养基培养6～8天后移栽到大田。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

所述诱导培养基是以N₆大量元素、B₅微量元素、B₅有机成分为基础培养基，激素为2～3mg/L 2,4-D，并添加0.4～0.6g/L脯氨酸、0.2～0.4g/l水解酪蛋白、25～35g/l蔗糖，PH5.7～6.0；

所述继代培养基同诱导培养基；

所述AAI培养液是以AAI培养基为基础培养基，激素为2～3mg/L 2,4-D，并添加100～300μMAS、25～35g/l蔗糖、60～80g/L葡萄糖，PH 5.0～5.5，过滤灭菌；

所述共培养基是在诱导培养基中再添加100～300μMAS、8～12g/L葡萄糖，PH5.3～5.8；

所述选择培养基是以N₆大量元素、B₅微量元素、B₅有机成分为基础培养基，激素为2～3mg/L2,4-D，并添加0.8～1.2g/L水解酪蛋白、0.8～1.2g/L脯氨酸、25～35g/l蔗糖、20～50mg/L抗生素，PH 5.7～6.0；

所述分化培养基是以N₆大量元素、MS微量元素、B₅有机成分为基础培养基，激素为4～5mg/L 6-BA、0.2～1mg/LNAA，并添加12～17g/L蔗糖，PH 5.7～6.0；

所述生根培养基是以1/2MS培养基为基础培养基，激素为0.8～1.2mg/L IBA，并添加25～35g/l蔗糖，PH 5.7～6.0。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述光照培养的光强为80±20umol/m².s；所述2,4-D的浓度为2mg/L；所述诱导培养愈伤组织、继代培养愈伤组织及筛选培养抗性愈伤组织的温度均为32℃；

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述AAI培养液和共培养基中AS的浓度均为200μM，胚性愈伤组织颗粒在根癌农杆菌菌液中浸染的时间为5分钟。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（5）中，所述胚性愈伤组织表面的根癌农杆菌漂洗是用含0.01%吐温的无菌水震荡漂洗至少5次，每次5～8分钟，然后在含500mg/L头孢霉素的无菌水中振荡漂洗至少10分钟。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（7）所述6-BA的浓度为5mg/L，NAA的浓度为1mg/L。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述诱导培养基、继代培养基、共培养基、选择培养基、预分化培养基、分化培养基、生根培养基中均加入3.0～4.0g/L植物凝胶。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中活化根癌农杆菌的细菌培养基选用LB、AB或YEB培养基，活化时细菌培养基中还加入50～100mg/L利福平和10～100mg/L抗生素，所述抗生素为表达载体上携带的细菌抗生素抗性基因所编码的抗生素。

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