CN103981214B - 一种将外源基因导入粳稻品种8m30的水稻细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种将外源基因导入粳稻品种8m30的水稻细胞的方法。具体地讲，本发明是通过农杆菌介导，将外源基因导入到闭颖授粉的粳稻品种8m30中。在遗传转化过程中，本发明采用了特制的培养基以及比常规介导方法更好地转化方式。通过PCR检测鉴定，表明外源基因已导入8m30中。该方法成功实现了闭颖授粉的粳稻品种的遗传转化，在加快性状改良过程同时，可避免花粉外传导致的基因漂移。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术和植物基因工程技术领域。具体而言，本发明涉及一种将外源基因导入到闭颖授粉的粳稻品种8m30的遗传转化方法。
背景技术
水稻(Oryza sativa L.)是我国乃至世界上最重要的粮食作物，世界上60％以上的人口以稻米为主食。近年来面对日益频繁的干旱、极端温度等非生物胁迫的影响，人口增长和生态环境的压力，现代生物技术手段，特别是转基因技术在作物遗传改良方面的重要性日渐凸显。转基因技术为农作物的产量提升、品质改良和抗性增强提供了新路径、开拓了新空间。
但随着转基因作物的种植范围迅速扩大，转基因作物及其产品的安全性，引起了广泛关注。例如转基因品种花粉外传会带来基因漂移，可能产生“超级杂草”等风险，但目前缺乏实用有效的技术手段加以克服，比如物理隔离需要一定的空间阻止花粉传播(水稻需在100m以上)，只适于小面积实验，在大面积生产中是不切实际的。
而闭颖授粉品种在整个授粉过程中，颖花不张开，花药不外露，花粉不会向外传播，可以有效抑制花粉外传，避免基因污染。通过闭颖受体来解决基因污染问题，是目前被认为最可行的技术手段，但目前生产还缺乏实用化的闭颖水稻品种。本实验室创制的8m30等闭颖授粉粳稻品种，不仅完全闭颖授粉，而且结实率、株高等重要农艺性状较好，可作为理想的转基因受体应用于品种快速遗传改良，减少生态风险。
但目前还没有闭颖授粉水稻品种的遗传转化方法的报道。
发明内容
为充分利用具有闭颖授粉性状的独特遗传资源，本发明旨在建立一种适用于闭颖授粉粳稻品种的遗传转化方法。
本发明的目的是提供一种通过农杆菌介导，将外源基因导入到闭颖授粉的粳稻品种8m30的遗传转化方法，以及基于该方法来制备转基因水稻植株的方法。本发明提供了下列技术方案来实现该目的。
具体而言，在一个方面，本发明提供一种将外源基因导入粳稻品种8m30的水稻细胞的方法，包括下述步骤：
步骤1、将粳稻品种8m30的种子去壳、灭菌后将胚分离出来，置于愈伤组织诱导培养基上以产生次级愈伤组织；
步骤2、将所述次级愈伤组织转移至新的愈伤组织诱导培养基进行预培养；
步骤3、将步骤2中获得的愈伤组织与携带外源基因的农杆菌接触持续第一预定时间段；
步骤4、将步骤3所获得的愈伤组织转移到垫有无菌滤纸的培养皿中，21-23℃培养第二预定时间段，所述无菌滤纸中加入2.5-3.5mL农杆菌悬浮培养基；
步骤5、将步骤4处理后的愈伤组织置于前筛选培养基上培养5-7天；
步骤6、将步骤5处理后的愈伤组织转移到筛选培养基上，以获得抗性愈伤组织；
步骤7、将所述抗性愈伤组织转移到分化再生培养基中分化成苗；和
步骤8、将步骤7所获得的苗转移到生根培养基中生根。
在一种优选实现方式中，所述组织诱导培养基中[NO3 -]/[NH4 +]＝40mM/10mM；
所述前筛选培养基中[NO3 -]/[NH4 +]＝40mM/10mM；在所述分化再生培养基中[NO3 -]/[NH4+]＝40mM/10mM，并且含1.5mg/L萘乙酸(NAA)和1mg/L6-苄氨基嘌呤(6-BA)；所述生根培养基中含0.4mg/L的萘乙酸。
在一种优选实现方式中，所述步骤1中的种子是成熟种子；和/或
所述步骤1、2中的诱导培养基包括：(优化的或预定配比的N6)大量元素、B5微量元素、MS铁盐、B5维生素、500mg/L脯氨酸、500mg/L谷氨酰胺、300mg/L酪蛋白酶水解物、30g/L蔗糖、2mg/L2，4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、3g/L植物凝胶，该诱导培养基的pH为5.80；和/或
所述步骤3中的与农杆菌接触是将愈伤组织浸泡在农杆菌悬浮液中，农杆菌中携带有外源基因；和/或
所述步骤4中的农杆菌悬浮培养基包括：(优化的或预定配比的N6)大量元素、B5微量元素、MS铁盐、B5维生素、500mg/L脯氨酸、500mg/L酪蛋白酶水解物、2mg/L2,4-D、20g/L蔗糖、10g/L葡萄糖、100μmol/L乙酰丁香酮，该农杆菌悬浮培养基的pH为5.20；和/或
所述步骤5中的前筛选培养基包括所述愈伤组织诱导培养基以及250mg/L羧苄青霉素；和/或
所述步骤6中的筛选培养基包括所述愈伤组织诱导培养基以及50mg/L潮霉素和250mg/L羧苄青霉素；和/或
所述步骤7中的分化再生培养基包括大量元素、B5微量元素、MS铁盐、B5维生素、1g/L酪蛋白酶水解物、30g/L蔗糖、30g/L山梨醇、500mg/LMES、2.5mg/L CuSO4、1.5mg/L萘乙酸、1mg/L6-BA、AA氨基酸、25mg/L潮霉素、125mg/L羧苄青霉素、2.5g/L植物凝胶，该分化再生培养基pH值为5.80；和/或
所述步骤8中的生根培养基包括1/2MS(Murashige&Skoog)基础盐2.l65g/L、MS维生素、20g/L蔗糖、25mg/L潮霉素、0.4mg/L萘乙酸、125mg/L羧苄青霉素、3.5g/L植物凝胶，该生根培养基pH值为5.80。
在一种优选实现方式中，所述大量元素中[NO3 -]/[NH4 +]＝40mM/10mM，包括KNO340mM,(NH4)2SO45mM，MgSO4·7H2O0.75mM，KH2PO42.93mM CaCl2·2H2O1.13mM。
在一种优选实现方式中，所述第一预定时间段为15分钟；所述第二预定时间段为48小时。
在一种优选实现方式中，所述步骤3包括选取分裂旺盛的愈伤组织收集至50mL的无菌离心管中与农杆菌接触。
另一方面，本发明提供一种生产转基因水稻的方法，包括：
1)通过上述方法将预定外源基因导入水稻细胞；和
2)利用导入了所述外源基因的水稻细胞培育水稻植株。
在另一个方面，本发明提供一种用于转化水稻的培养基套组，包括如下所述的组分：
(1)愈伤组织诱导培养基；
(2)农杆菌悬浮培养基；
(3)前筛选培养基；
(4)筛选培养基；
(5)分化再生培养基；
(6)生根培养基。
其中所述(1)-(6)分别包含如说明书表1所示的成分。
表1培养基的示例性配方
本方面还涉及这样的培养基套组用于将外源基因导入水稻细胞的程序的用途。所述的水稻优选粳稻，包括但不限于8m30等闭颖授粉粳稻品种。
在一个方面中，本发明提供一种生产转基因水稻的方法，包括使用前述的任一方法将外源基因导入水稻细胞，并从获得的水稻细胞培育出水稻植株。
技术效果
通过本发明，可以实现对水稻尤其是闭颖授粉粳稻的高转化频率、高重复性的农杆菌介导转化；另一方面，本发明步骤简单(如不需洗菌和预分化，只需一轮筛选)，缩短周期，节约成本，适合高通量操作，便于规模化应用。从而为开发工业规模的、无基因漂移的转基因水稻制备工艺提供了可能。
本发明的方法成功实现了闭颖授粉的粳稻品种的遗传转化，从而在加快性状改良过程同时，避免花粉外传导致的基因漂移，降低可能的生态风险。
附图说明
图1为闭颖授粉水稻品种8m30的愈伤组织，经过农杆菌介导转化后，在含有潮霉素的分化再生培养基中，再生所形成的苗。
图2为转基因植株的PCR检测电泳图。扩增片段为潮霉素乙酰转移酶基因(hygromycin phosphotransferase，HPT)，片段大小为827bp。M为DL2kb marker；PC为阳性对照；NC为阴性对照；1-14为随机挑选的转基因植株。
具体实施方式
在没有其他具体说明的情况下，下述具体实施方式中的操作均采用本领域通用的常规操作来进行。本领域技术人员可以很容易地从现有技术中获得关于这样的常规操作的教导，例如可以参照教科书Sambrook andDavid Russell，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd ed.,Vols1,2；Charles Neal Stewart,Alisher Touraev,Vitaly Citovsky and Tzvi Tzfira,PlantTransformation Technologies等。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
实施例——闭颖授粉粳稻8m30的遗传转化方法
1、成熟胚愈伤组织的诱导和预培养
将闭颖授粉粳稻8m30(安徽省农业科学院水稻研究所保存，遗传背景为粳稻品种H02)的成熟种子去壳，选取外观正常、洁净无霉斑的种子，用70％酒精，摇晃90sec，倒掉酒精；再用含Tween20的50％次氯酸钠(原液有效氯浓度大于4％，每100毫升加入1滴Tween20)溶液清洗种子，在摇床上晃动45min(180r/min)。倒掉次氯酸钠，无菌水洗5-10遍至无次氯酸钠气味，最后加入无菌水，30℃浸泡过夜。用手术刀片沿糊粉层分离胚，盾片朝上放置在诱导培养基(成分见表1)上，12粒/皿，30℃暗培养以诱导愈伤组织。
两周后出现球形、粗糙、浅黄色的次级愈伤组织，可以进行预培养操作，即将次级愈伤转至新的诱导培养基上，30℃暗培养预培养5天。预培养结束后，将状态良好、分裂旺盛的小颗粒用勺收集至50mL的无菌离心管中，用于农杆菌侵染。
2、农杆菌菌株的培养和悬浮液准备
将含有pCAMBIA1301载体的农杆菌菌株EHA105(安徽省农业科学院水稻研究所保存)在含有50mg/L卡那霉素的LB平板上划线(成分见表1)，28℃黑暗培养，24h后用无菌接种环将活化的农杆菌接种至新鲜的含50mg/L卡那霉素的LB平板上，进行第二次活化，28℃黑暗培养过夜。在50mL的无菌离心管中加入20-30mL农杆菌悬浮培养基(成分见表1)，用接种环将活化2次的农杆菌刮下，调整OD660(Optical density660nm，660nm吸光值)至0.15，室温静置30min以上。
3、侵染和共培养
向准备好的愈伤组织中(见步骤1)，加农杆菌悬浮液，浸泡15min,其间不时轻轻晃动。浸泡结束后倒掉液体(尽量将液体滴净)，用无菌滤纸吸去愈伤组织表面的多余的农杆菌菌液，并在超净台中用无菌风吹干。在100×25mm的一次性无菌培养皿垫上三张无菌滤纸，加入2.5mL农杆菌悬浮培养基，将吸干后的愈伤组织均匀分散在滤纸上，23℃黑暗培养48h。
4、前筛选和筛选培养
共培养结束后，将经共培养的愈伤组织均匀散布于前筛选培养基(成分见表1)中，30℃黑暗培养5天。前筛选培养结束后，将愈伤组织转至筛选培养基上(成分见表1)，每个培养皿接25粒愈伤组织，30℃黑暗培养，2-3周后，抗性愈伤组织生长明显，可进行分化再生操作。
5、分化再生
每个独立转化体挑选3颗生长状态良好、新鲜的小颗粒，转至分化再生培养基上(成分见表1)。每培养皿接4个独立转化体。28℃光照培养，光照周期为16h光照8h黑暗，光强度为3000-6000lx。
6、生根与移栽
当抗性愈伤组织分化的芽长至约2cm时，每个独立转化体只取一株生长良好的苗，移至生根培养基上(成分见表1)，28℃光照培养，光照周期为16h光照8h黑暗，光强度为3000-6000lx。两周后，选择根系发达的小苗，用水洗去培养基，移栽入土。
7、分子鉴定
在移栽之前，采取水稻叶片样品，用CTAB法进行DNA小提。将所得到的基因组DNA样品用于PCR分析。用于扩增HPT的PCR引物为5’-CGCCGATGGTTTCTACAA-3’及5’-GGCGTCGGTTTCCACTAT-3’，产生长度为827bp的片段。将PCR组分首先在94℃保持5分钟，然后进行32个循环：94℃30秒、58℃30秒、72℃60秒，最后在72℃延伸10分钟。随机挑选14棵转基因植株，经鉴定，其中13株为阳性，阳性率达到92.8％。
实施效果与转化效率
本发明通过分离胚诱导愈伤组织，相比用完整种子诱导愈伤，不仅愈伤组织生长的较快、状态较好，而且能有效减少细菌、真菌污染，减少浪费，节约成本。此外种子清洗后，用无菌水30℃浸泡过夜，能使种子充分吸胀，促进种胚的新陈代谢，提高愈伤组织诱导率，改善愈伤组织状态。
现有转化方法在制备农杆菌悬浮液时，多采取在固体平板上挑取农杆菌单克隆后，通过两次液体培养，获得菌液后还需离心、重悬，步骤繁琐，而且增加污染风险，此外挑取的单克隆如果出现片段丢失、重组等异常情况，会导致转化失败。而本发明通过LB固体平板两次活化培养，再制备悬浮液，而不是挑单菌落再用液体培养和扩大培养，既简化了操作，便于批量应用，同时减少了污染的可能，节约成本。
农杆菌菌液浓度对转化效率影响较大。现有转化方法多采取较高的菌液浓度(OD660在0.5-1.0)，而过高的农杆菌菌液浓度，不仅无必要，而且在侵染后难以吸干菌液，会使农杆菌在愈伤组织表面过度繁殖，增加农杆菌对愈伤组织的伤害，降低转化效率。而本发明采用较低的菌液浓度((OD660在0.1-0.2，优选的为0.15)，既保证了农杆菌和愈伤组织的充分接触，又避免了过多的农杆菌对愈伤组织可能造成的伤害，从而减少愈伤组织坏死，提高了转化效率。
现有转化方法多选择培养皿进行愈伤组织侵染，既不便于规模化应用，操作也不方便。本发明选择50mL离心管，而不是培养皿进行侵染，既方便操作、避免污染，又有利于愈伤组织和农杆菌的充分接触，从而提高转化效率。
现有转化方法的共培养方式多选择在固体培养基上放置愈伤组织的方法，由于湿度较大，愈伤组织较潮湿，不仅对愈伤组织伤害较大，而且也容易造成农杆菌过度繁殖。而在采取滤纸共培养时，现有方法加入的液体量(悬浮培养基)较多，多在3-5mL，而较多的液体量对愈伤组织生长不利，甚至比固体共培养效果还差。故本发明选择在三张无菌滤纸上加入较少的悬浮培养基(优选的为2.5mL)的方式，来进行共培养，保持了愈伤组织的良好状态，从而提高了转化效率。
现有转化方法的共培养温度多选择28℃，易造成农杆菌过度增殖，共培养结束时在愈伤组织表面形成农杆菌菌膜，对愈伤组织伤害较大，必须进行洗菌操作。本发明选择23℃黑暗培养，而不是更高的温度如28℃，可以避免农杆菌过度生长，明显改善愈伤组织状态，提高转化效率。
由于本发明侵染时采取较低的菌液浓度，较低的共培养温度，减少滤纸共培养时的液体体积，因此共培养结束后几乎没有农杆菌过度生长的情况，因而不需要对愈伤组织进行洗菌操作。不仅节约了成本，减少了污染可能，还避免了洗菌过程对愈伤组织的伤害，提高了转化效率，也更便于规模化操作。
现有转化方法筛选时多用两轮甚至三轮筛选，不仅操作繁琐，还容易造成污染。本发明采取一轮筛选，而不是两轮筛选，显著减少了工作量，降低了污染可能性，可以缩短实验周期，节约成本。
此外本发明采取直接分化，而不是先预分化，可以减轻工作量，同时有效节约成本。选择培养皿作为分化再生的组培容器，而不是三角瓶，便于操作，同时最大程度利用光照培养架的空间，便于规模化应用。在生根培养基中加入适量的NAA(0.4mg/L)，能够促进根系生长，从而提高移栽成活率。
现有技术中，人们一般倾向于采用经典的N6大量元素中的氮源比例，因为，人们认为这种氮源比例是最合适的。而且，人们普遍认为，调整氮源比例一般不会对培养结果带来很大影响。然而，本申请的发明人也曾尝试使用非优化的氮源，如采取经典的N6大量元素中的氮源比例([NO3 -]/[NH4 +]＝28mM/7mM)、MS大量元素中的氮源比例([NO3 -]/[NH4 +]＝40mM/20mM)，但是本发明所采取的氮源比例(40mM/10mM)，更有利于8m30品种的愈伤组织生长，从而显著提高了转化效率。例如采取本发明的氮源比例，在愈伤组织阶段，胚性愈伤组织诱导率稳定在95％以上，而其他氮源比例则在75％以下，说明本发明的氮源比例，更有利于8m30品种愈伤组织的生长，并且有利于保持胚性状态，从而提高转化效率。
分化再生培养基中的激素配比，对愈伤组织分化再生成苗影响较大。发明人针对8m30品种，系统比较了数十种不同的分化激素配比，最终选择了适合8m30品种的激素配比为1.5mg/L NAA、1mg/L6-BA。本发明的激素配比，既保证了较高的分化率，同时NAA、6-BA均为较常见的植物激素，避免了使用ZT(玉米素)等价格昂贵的植物激素带来的成本上升。
通过针对愈伤组织诱导方式、农杆菌悬浮液制备、共培养方式等环节的改进，结合发明人对诱导、农杆菌悬浮、前筛选、筛选和分化再生培养基中的氮源优化([NO3 -]/[NH4 +]＝40mM/10mM)和分化再生培养基中的激素配比(1.5mg/L NAA、1mg/L6-BA)的设计，本发明实现了对闭颖授粉水稻品种8m30的高效遗传转化，具体结果见表2。
表2闭颖授粉粳稻品种8m30的转化效率
应当理解这里描述的具体实施方式只是作为示例来帮助本领域技术人员更好地理解本发明，而不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。
Claims (3)
1.一种将外源基因导入粳稻品种8m30的水稻细胞的方法，包括下述步骤：
步骤1、将粳稻品种8m30的成熟种子去壳，选取外观正常、洁净无霉斑的种子，用70％酒精，摇晃90sec，倒掉酒精；再用含Tween20的50％次氯酸钠溶液清洗种子，在摇床上晃动45min，倒掉次氯酸钠，无菌水洗5-10遍至无次氯酸钠气味，最后加入无菌水，30℃浸泡过夜，然后将胚分离出来，置于愈伤组织诱导培养基上以产生次级愈伤组织；
步骤2、将所述次级愈伤组织转移至新的诱导培养基上，30℃以暗培养方式预培养5天，所述步骤1、2中的诱导培养基包括：大量元素、B5微量元素、MS铁盐、B5维生素、500mg/L脯氨酸、500mg/L谷氨酰胺、300mg/L酪蛋白酶水解物、30g/L蔗糖、2mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、3g/L植物凝胶，该诱导培养基的pH为5.80；
步骤3、将含有pCAMBIA1301载体的农杆菌菌株EHA105在含有50mg/L卡那霉素的LB平板上划线，28℃黑暗培养，24h后用无菌接种环将活化的农杆菌接种至新鲜的含50mg/L卡那霉素的LB平板上，进行第二次活化，28℃黑暗培养过夜，然后，在50mL的无菌离心管中加入20-30mL农杆菌悬浮培养基，用接种环将活化2次的农杆菌刮下，调整OD660至0.15，室温静置30min以上，获得农杆菌菌株菌悬液，将步骤2中获得的愈伤组织与所述农杆菌菌株菌悬液接触15min，用无菌滤纸吸去愈伤组织表面的多余的农杆菌菌液，并在超净台中用无菌风吹干；
步骤4、在100×25mm的一次性无菌培养皿垫上三张无菌滤纸，加入2.5mL农杆菌悬浮培养基，将步骤3所获得的愈伤组织均匀分散在滤纸上，23℃黑暗培养48h，所述步骤4中的农杆菌悬浮培养基包括：大量元素、B5微量元素、MS铁盐、B5维生素、500mg/L脯氨酸、500mg/L酪蛋白酶水解物、2mg/L 2,4-D、20g/L蔗糖、10g/L葡萄糖、100μmol/L乙酰丁香酮，该农杆菌悬浮培养基的pH为5.20；
步骤5、将步骤4处理后的愈伤组织置于前筛选培养基上30℃黑暗培养5-7天，前筛选培养结束后，将愈伤组织转至筛选培养基上，30℃黑暗培养，2-3周，所述步骤5中的前筛选培养基包括步骤2中所述的诱导培养基以及250mg/L羧苄青霉素；
步骤6、将步骤5处理后的愈伤组织转移到筛选培养基上，以获得抗性愈伤组织，所述步骤6中的筛选培养基包括步骤2中所述的诱导培养基以及50mg/L潮霉素和250mg/L羧苄青霉素；
步骤7、将步骤6中获得的抗性愈伤组织转移到分化再生培养基中28℃光照培养，光照周期为16h光照8h黑暗，光强度为3000-6000lx，分化成苗，所述步骤7中的分化再生培养基包括大量元素、B5微量元素、MS铁盐、B5维生素、1g/L酪蛋白酶水解物、30g/L蔗糖、30g/L山梨醇、500mg/L MES、2.5mg/L CuSO4、1.5mg/L萘乙酸、1mg/L 6-BA、AA氨基酸、25mg/L潮霉素、125mg/L羧苄青霉素、2.5g/L植物凝胶，该分化再生培养基pH值为5.80；和
步骤8、将步骤7所获得的苗转移到生根培养基中生根，所述步骤8中的生根培养基包括1/2MS基础盐2.l65g/L、MS维生素、20g/L蔗糖、25mg/L潮霉素、0.4mg/L萘乙酸、125mg/L羧苄青霉素、3.5g/L植物凝胶，该生根培养基pH值为5.80，
所述大量元素中[NO3 -]/[NH4 +]＝40mM/10mM，并且包括KNO3 40mM,(NH4)2SO4 5mM，MgSO4·7H2O 0.75mM，KH2PO4 2.93mM，CaCl2·2H2O 1.13mM；
其中，在所述步骤3中，在将所述愈伤组织与携带所述外源基因的农杆菌接触时，将相应农杆菌悬浮液的660nm吸光值调整至0.15。
2.根据权利要求1所述的方法，所述步骤3包括选取分裂旺盛的愈伤组织收集至50mL的无菌离心管中与农杆菌接触。
3.一种生产转基因水稻的方法，包括：
1)通过权利要求1-2中任一所述的方法将预定外源基因导入水稻细胞；和
2)利用导入了所述外源基因的水稻细胞培育水稻植株。
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