CN103993039B - 一种利用pmi筛选标记将外源基因导入闭颖授粉粳稻的方法 - Google Patents
一种利用pmi筛选标记将外源基因导入闭颖授粉粳稻的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103993039B CN103993039B CN201410245505.4A CN201410245505A CN103993039B CN 103993039 B CN103993039 B CN 103993039B CN 201410245505 A CN201410245505 A CN 201410245505A CN 103993039 B CN103993039 B CN 103993039B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- callus
- rice
- pmi
- blending ratio
- great number
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Landscapes
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
本发明提供一种利用PMI(phosphomannose isomerase，磷酸甘露糖异构酶)筛选标记将外源基因导入闭颖授粉粳稻的方法。具体而言，本发明通过含有pCAMBIA1381‑PMI载体的农杆菌菌株EHA105介导，以甘露糖为筛选剂，将外源基因导入到闭颖授粉的粳稻品种8m30中。通过PCR检测鉴定，表明外源基因已导入8m30中。该方法成功实现了闭颖授粉的粳稻品种的遗传转化，且无需使用抗生素或除草剂筛选，在加快性状改良过程同时，避免花粉外传导致的基因漂移，提高了环境友好程度。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术和植物基因工程技术领域。具体而言，本发明涉及一种利用PMI筛选标记，将外源基因导入到闭颖授粉粳稻品种8m30的遗传转化方法。
背景技术
水稻(Oryza sativa L.)是我国乃至世界上最重要的粮食作物，世界上60％以上的人口以稻米为主食。近年来面对日益频繁的干旱、极端温度等非生物胁迫的影响，人口增长和生态环境的压力，现代生物技术手段，特别是转基因技术在作物遗传改良方面的重要性日渐凸显。转基因技术为农作物的产量提升、品质改良和抗性增强提供了新路径、开拓了新空间。
随着转基因作物的种植范围迅速扩大，转基因作物及其产品的安全性，引起了广泛关注。例如转基因品种花粉外传会带来基因漂移，可能产生“超级杂草”等风险，但目前由于缺乏实用有效的技术手段加以克服，比如物理隔离需要一定的空间阻止花粉传播(水稻需在100m以上)，只适于小面积实验，在大面积生产中是不切实际的。而闭颖授粉品种在整个授粉过程中，颖花不张开，花药不外露，花粉不会向外传播，可以有效抑制花粉外传，避免基因污染。通过闭颖受体来解决基因污染问题，是目前被认为最可行的技术手段，但目前生产还缺乏实用化的闭颖水稻品种。本实验室创制的8m30等闭颖授粉粳稻品种，不仅完全闭颖授粉，而且结实率、株高等重要农艺性状较好，可作为理想的转基因受体应用于品种快速遗传改良，减少生态风险。
现有转基因作物的转化方法，主要使用抗生素抗性基因作为筛选标记，该类基因可能随食物进入肠道,存在与肠道微生物基因交换产生耐药菌株的潜在风险，以致影响抗生素的医用效果。为了替代抗生素抗性基因，其他类型筛选标记基因被陆续研究开发，如除草剂抗性基因、氨基酸代谢筛选基因、可视标记基因，但这些筛选标记基因要么存在类似问题，要么筛选效率和成本不适于规模化应用。而PMI是一种糖代谢基因，广泛存在于藻类和一些豆科植物中。水稻等高等植物细胞虽能将甘露糖转化为6-磷酸甘露糖，但由于细胞自身缺乏PMI，不能进一步将6-磷酸甘露糖转化为6-磷酸果糖，从而进入糖酵解途径而被利用，因此PMI可以作为筛选标记基因。与抗生素、除草剂等负选择不同，甘露糖是进行正选择，转化的细胞表达PMI基因，可以利用甘露糖为碳源而正常生长，筛选效率高。同时，甘露糖是广泛存在于海藻、蕨类等植物中的己糖，且PMI的催化产物为6-磷酸果糖，是蜂蜜和果浆的主要成份，二者都是环境友好的天然物质。
但目前还没有以PMI作为筛选标记，高效、简便的闭颖授粉水稻品种的遗传转化方法的报道。
发明内容
为充分利用具有闭颖授粉性状的独特遗传资源，同时降低使用抗生素或除草剂抗性基因作为筛选标记的潜在风险，本发明旨在建立一种以PMI作为筛选标记，适用于闭颖授粉粳稻品种的遗传转化方法。
本发明的目的是提供一种以PMI作为筛选标记，将外源基因导入到闭颖授粉粳稻品种8m30的遗传转化方法以及相应制备转基因水稻植株的方法。本发明提供了下列技术方案来实现该目的。
在一个方面，本发明提供一种利用PMI筛选标记将外源基因导入闭颖授粉粳稻的方法，其特征在于，所述方法包括下述步骤：
步骤1：分离出水稻种子的胚，置于愈伤组织诱导培养基上以产生次级愈伤组织；
步骤2：将所述次级愈伤组织转移至新的愈伤组织诱导培养基进行预培养；
步骤3：将所述步骤2中获得的愈伤组织与携带磷酸甘露糖异构酶PMI筛选标记基因的农杆菌接触第一预定时间段；
步骤4：将步骤3处理后的愈伤组织转移到农杆菌悬浮培养基，培养第二预定时间段；
步骤5将步骤4处理后的愈伤组织置于前筛选培养基上培养第三预定时间段；
步骤6将步骤5处理后的愈伤组织转移至筛选培养基上，以获得抗性愈伤组织；
步骤7将所述抗性愈伤组织转移到分化再生培养基中分化成苗；和
步骤8将所述苗转移到生根培养基中生根。
在步骤1中，可以先对水稻种子去壳、灭菌后再将胚分离出来。
在一种实现方式中，所述PMI标记基因的核苷酸序列为：SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
在一种实现方式中，所述步骤4中采用垫有若干无菌滤纸的培养皿，所述无菌滤纸中加入2.5-3.5mL农杆菌悬浮培养基，[NO3 -]/[NH4 +]＝40mM/10mM。优选地，垫上三张无菌滤纸在21-23℃条件下培养48小时。
所述筛选培养基中[NO3 -]/[NH4 +]＝40mM/10mM，并且所述筛选培养基含有5g/L蔗糖和10g/L甘露糖；
所述分化再生培养基中[NO3 -]/[NH4 +]＝40mM/10mM，并且含有1.5mg/L NAA和1mg/L6-BA；
所述生根培养基中含0.4mg/L的NAA。
在一种优选实现方式中，所述诱导培养基包括预定配比的N6大量元素、B5微量元素、MS铁盐、B5维生素、500mg/L脯氨酸、500mg/L谷氨酰胺、300mg/L酪蛋白酶水解物、30g/L蔗糖、2mg/L2,4-D、3g/L植物凝胶；和/或
所述步骤3中的与农杆菌接触是将愈伤组织浸泡在农杆菌悬浮液中；和/或
所述农杆菌悬浮培养基包括：预定配比的N6大量元素([NO3 -]/[NH4 +]＝40mM/10mM)、B5微量元素、MS铁盐、B5维生素、500mg/L脯氨酸、500mg/L酪蛋白酶水解物、2mg/L2,4-D、20g/L蔗糖、10g/L葡萄糖、100μmol/L乙酰丁香酮；和/或
所述前筛选培养基包括：预定配比的N6大量元素([NO3 -]/[NH4 +]＝40mM/10mM)、B5微量元素、MS铁盐、B5维生素、500mg/L脯氨酸、500mg/L谷氨酰胺、300mg/L酪蛋白酶水解物、30g/L蔗糖、2mg/L2,4-D、3g/L植物凝胶、250mg/L羧苄青霉素；和/或
所述筛选培养基包括：预定配比的N6大量元素([NO3 -]/[NH4 +]＝40mM/10mM)、B5微量元素、MS铁盐、B5维生素、500mg/L脯氨酸、500mg/L谷氨酰胺、300mg/L酪蛋白酶水解物、5g/L蔗糖、10g/L甘露糖、2mg/L2,4-D、250mg/L羧苄青霉素、3g/L植物凝胶；和/或
所述分化再生培养基包括预定配比的N6大量元素([NO3 -]/[NH4 +]＝40mM/10mM)、B5微量元素、MS铁盐、B5维生素、1g/L CH、30g/L蔗糖、30g/L山梨醇、500mg/L MES、2.5mg/LCuSO4、1.5mg/L NAA、1mg/L6-BA、AA氨基酸、125mg/L羧苄青霉素、2.5g/L植物凝胶；和/或
所述生根培养基包括1/2MS基础盐(2.l65g/L)、MS维生素、20g/L蔗糖、0.4mg/LNAA、125mg/L羧苄青霉素、3.5g/L植物凝胶。
在一种优选实现方式中，本发明所提到的预定配比的N6大量元素指的是培养基中[NO3 -]/[NH4 +]＝40mM/10mM。
在一种优选实现方式中，所述水稻是闭颖授粉粳稻，水稻品种为8m30。
在一种优选实现方式中，所述第一预定时间段为13-17分钟；所述第二预定时间段为40-60小时；所述第三预定时间段为5-7天。
另一方面，本发明提供一种生产转基因水稻的方法，包括：
1)通过上述的方法将外源基因导入水稻细胞；和
2)利用所获得的水稻细胞培育水稻植株。
在另一个方面，本发明提供一种用于转化水稻的培养基套组，包括如下所述的组分：
(1)愈伤组织诱导培养基；
(2)农杆菌悬浮培养基；
(3)前筛选培养基；
(4)筛选培养基；
(5)分化再生培养基；
(6)生根培养基。
其中上述培养基(1)-(6)的成分分别如说明书表1所示。
本方面还涉及这样的培养基套组用于将外源基因导入水稻细胞的程序的用途。所述的水稻优选粳稻，包括但不限于8m30等闭颖授粉粳稻品种。
表1 培养基的示例性配方
在一种实现方式中，所采用的PMI标记基因的核苷酸序列为：
ATGCAAAAACTCATTAACTCAGTGCAAAACTATGCCTGGGGCAGCAAAACGGCGTTGACTGAACTTTATGGTATGGAAAATCCGTCCAGCCAGCCGATGGCCGAGCTGTGGATGGGCGCACATCCGAAAAGCAGTTCACGAGTGCAGAATGCCGCCGGAGATATCGTTTCACTGCGTGATGTGATTGAGAGTGATAAATCGACTCTGCTCGGAGAGGCCGTTGCCAAACGCTTTGGCGAACTGCCTTTCCTGTTCAAAGTATTATGCGCAGCACAGCCACTCTCCATTCAGGTTCATCCAAACAAACACAATTCTGAAATCGGTTTTGCCAAAGAAAATGCCGCAGGTATCCCGATGGATGCCGCCGAGCGTAACTATAAAGATCCTAACCACAAGCCGGAGCTGGTTTTTGCGCTGACGCCTTTCCTTGCGATGAACGCGTTTCGTGAATTTTCCGAGATTGTCTCCCTACTCCAGCCGGTCGCAGGTGCACATCCGGCGATTGCTCACTTTTTACAACAGCCTGATGCCGAACGTTTAAGCGAACTGTTCGCCAGCCTGTTGAATATGCAGGGTGAAGAAAAATCCCGCGCGCTGGCGATTTTAAAATCGGCCCTCGATAGCCAGCAGGGTGAACCGTGGCAAACGATTCGTTTAATTTCTGAATTTTACCCGGAAGACAGCGGTCTGTTCTCCCCGCTATTGCTGAATGTGGTGAAATTGAACCCTGGCGAAGCGATGTTCCTGTTCGCTGAAACACCGCACGCTTACCTGCAAGGCGTGGCGCTGGAAGTGATGGCAAACTCCGATAACGTGCTGCGTGCGGGTCTGACGCCTAAATACATTGATATTCCGGAACTGGTTGCCAATGTGAAATTCGAAGCCAAACCGGCTAACCAGTTGTTGACCCAGCCGGTGAAACAAGGTGCAGAACTGGACTTCCCGATTCCAGTGGATGATTTTGCCTTCTCGCTGCATGACCTTAGTGATAAAGAAACCACCATTAGCCAGCAGAGTGCCGCCATTTTGTTCTGCGTCGAAGGCGATGCAACGTTGTGGAAAGGTTCTCAGCAGTTACAGCTTAAACCGGGTGAATCAGCGTTTATTGCCGCCAACGAATCACCGGTGACTGTCAAAGGCCACGGCCGTTTAGCGCGTGTTTACAACAAGCTGTAA
技术效果
本发明的方法成功实现了闭颖授粉粳稻品种的遗传转化，且无需使用抗生素或除草剂筛选，在加快性状改良过程同时，避免花粉外传导致的基因漂移，提高环境友好程度。
目前，转基因筛选标记主要以抗生素抗性基因为主，如抗潮霉素基因HPT、抗卡那霉素基因NPTII等，虽然这类基因具有较好的筛选效果，但可能转移至微生物中，从而影响抗生素治疗的有效性。研究人员也开发了一些其他类型的筛选标记基因，如抗除草剂草铵膦基因Bar、氨基酸代谢调控基因DHDPS和可视标记基因GFP等，但也或多或少存在一定的安全性问题，或筛选效率不能满足大规模应用需求。
本发明建立的基于PMI标记基因的水稻遗传转化方法，不仅转化效率不亚于抗生素抗性基因，而且筛选剂甘露糖以及PMI催化产物6-磷酸果糖均为环境友好的天然物质，避免了使用抗生素抗性基因等可能带来的潜在风险；同时甘露糖筛选是对阳性细胞进行正选择，筛选周期短，比使用其他筛选剂更加节约成本。虽然已有PMI作为筛选标记应用于作物遗传转化的报道，但操作流程繁琐(通常需90天以上)，转化效率也较低(6％左右)，不适于规模化生产。本发明建立的遗传转化方法，步骤简单(可在60天内完成)，转化效率高(平均可达45％以上)，完全可以满足规模化遗传改良需要。因而本项目建立的遗传转化方法实现了安全性、高效率和节约性的统一。
通过本发明，可以实现对水稻尤其是闭颖授粉粳稻的高转化频率、高重复性的农杆菌介导转化；另一方面，本发明步骤简单(如不需洗菌和预分化，只需一轮筛选)，缩短周期；本发明无需使用抗生素或除草剂选择，节约成本，适合高通量操作，便于规模化应用。从而为开发工业规模的、环境友好的、无基因漂移的转基因水稻制备工艺提供了可能。
附图说明
图1为pCAMBIA1381-PMI载体质粒示意图。
图2为闭颖授粉水稻品种8m30的愈伤组织，经过农杆菌介导转化后，在甘露糖筛选压下，抗性愈伤生长情况。
图3为闭颖授粉水稻品种8m30的愈伤组织，经过农杆菌介导转化后，在分化再生培养基中，再生成苗。
图4为转基因植株的PCR检测电泳图。扩增片段为PMI基因，片段大小为490bp。M为DL2kb marker；PC为阳性对照；NC为阴性对照；1-11为随机挑选的转基因植株。
具体实施方式
在没有其他具体说明的情况下，下述具体实施方式中所涉及的操作均采用本领域通用的常规操作来进行。本领域技术人员可以很容易地从现有技术中获得关于这样的常规操作的教导，例如可以参照教科书Sambrook and David Russell，Molecular Cloning:ALaboratory Manual,3rd ed.,Vols 1,2；Charles Neal Stewart,Alisher Touraev,Vitaly Citovsky and Tzvi Tzfira,Plant Transformation Technologies等。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
实施例1——以甘露糖为筛选剂的闭颖授粉粳稻8m30遗传转化方法
1、成熟胚愈伤组织的诱导和预培养
将闭颖授粉粳稻8m30(安徽省农业科学院水稻研究所保存，遗传背景为粳稻品种H02)的成熟种子去壳，选取外观正常、洁净无霉斑的种子，用70％酒精，摇晃90sec，倒掉酒精；再用含Tween20的50％次氯酸钠(原液有效氯浓度大于4％，每100毫升加入1滴Tween20)溶液清洗种子，在摇床上晃动45min(180r/min)。倒掉次氯酸钠，无菌水洗5-10遍至无次氯酸钠气味，最后加入无菌水，30℃浸泡过夜。用手术刀片沿糊粉层分离胚，盾片朝上放置在诱导培养基(成分见表1)上，12粒/皿，30℃暗培养以诱导愈伤组织。
两周后出现球形、粗糙、浅黄色的次级愈伤组织，可以进行预培养操作，即将次级愈伤转至新的诱导培养基上，30℃暗培养预培养5天。预培养结束后，将状态良好、分裂旺盛的小颗粒用勺收集至50mL的无菌离心管中，用于农杆菌侵染。
2、农杆菌菌株的培养和悬浮液准备
将含有pCAMBIA1381-PMI载体的农杆菌菌株EHA105(安徽省农业科学院水稻研究所保存)在含有50mg/L卡那霉素的LB平板上划线(成分见表1)，28℃黑暗培养，24h后用无菌接种环将活化的农杆菌接种至新鲜的50mg/L卡那霉素的LB平板上，进行第二次活化，28℃黑暗培养过夜。在50mL的无菌离心管中加入20-30mL农杆菌悬浮培养基(成分见表1)，用接种环将活化2次的农杆菌刮下，调整OD660(Optical density 660nm，660nm吸光值)至约0.10-0.25，室温静置30min以上。
3、侵染和共培养
向准备好的愈伤组织中(见步骤1)，加农杆菌悬浮液，浸泡15min,其间不时轻轻晃动。浸泡结束后倒掉液体(尽量将液体滴净)，用无菌滤纸吸去愈伤组织表面的多余的农杆菌菌液，并在超净台中用无菌风吹干。在100×25mm的一次性无菌培养皿垫上三张无菌滤纸，加入2.5mL农杆菌悬浮培养基，将吸干后的愈伤组织均匀分散在滤纸上，23℃黑暗培养48h。
4、前筛选和筛选培养
共培养结束后，将经共培养的愈伤组织均匀散布于前筛选培养基(成分见表1)中，30℃黑暗培养5天。前筛选培养结束后，将愈伤组织转至筛选培养基上(成分见表1)，每个培养皿接25粒愈伤组织，30℃黑暗培养，2-3周后，抗性愈伤组织生长明显，可进行分化再生操作。
5、分化再生
经过筛选培养后，每个独立转化体挑选2-3颗生长状态良好、新鲜的小颗粒，转至分化再生培养基上(成分见表1)。每培养皿接5个独立转化体。28℃光照培养，光照周期为16h光照8h黑暗，光强度为3000-6000lx。
6、生根与移栽
当抗性愈伤组织分化的芽长至约2cm时，每个独立转化体只取一株生长良好的苗，移至生根培养基上(成分见表1)，28℃光照培养，光照周期为16h光照8h黑暗，光强度为3000-6000lx。两周后，选择根系发达的小苗，用水洗去培养基，移栽入土。
7、分子鉴定
在移栽之前，采取水稻叶片样品，用CTAB法进行DNA小提。将所得到的基因组DNA样品用于PCR分析。用于扩增PMI的PCR引物为5’-CCGCCGGAGATATCGTTTCACTG-3’及5’-CACGGTTCACCCTGCTGGCTATC-3’，产生长度为490bp的片段。将PCR组分首先在95℃保持5分钟，然后进行32个循环：94℃45秒、56℃45秒、72℃45秒，最后在72℃延伸10分钟。随机挑选11棵转基因植株，经鉴定，均为阳性，阳性率达到100％。
实施效果与转化效率
成熟胚由于来源方便，无季节限制，广泛用于水稻遗传转化。通过分离胚诱导愈伤组织，相比用完整种子诱导愈伤，不仅愈伤组织生长的较快、状态较好，而且能有效减少细菌、真菌污染，减少浪费，节约成本。此外种子清洗后，用无菌水30℃浸泡过夜，能使种子充分吸胀，促进种胚的新陈代谢，提高愈伤组织诱导率，改善愈伤组织状态。
通过LB固体平板两次活化培养，再制备悬浮液，而不是挑单菌落再用液体培养和扩大培养，可以简化操作，便于批量应用，同时减少污染的可能，节约成本。农杆菌菌液浓度对转化效率影响较大。过高的农杆菌菌液浓度，不仅无必要，而且会使农杆菌过度繁殖，增加农杆菌对愈伤组织的伤害，降低转化效率。
选择50mL离心管，而不是培养皿进行侵染，既方便操作，同时有利于愈伤组织和农杆菌的充分接触，从而提高转化效率。选择在三张无菌滤纸上加入悬浮培养基的方式，而不是固体培养基方式共培养；选择23℃黑暗培养，而不是更高的温度如28℃；可以避免农杆菌过度生长，明显改善愈伤组织状态，从而显著提高转化效率。
由于侵染时菌液浓度较低，共培养温度较低，滤纸共培养方式，共培养结束后几乎没有农杆菌过度生长的情况，因而不需要对愈伤组织进行洗菌操作。不仅节约了成本，减少了污染可能，还避免了洗菌过程对愈伤组织的伤害，提高了转化效率，也便于规模化操作。采取一轮筛选，而不是两轮筛选，可以缩短实验周期，节约成本。
在以PMI作为筛选标记基因，通过甘露糖筛选阳性转化细胞时，合适筛选压的选择对转化效率影响较大。如果甘露糖浓度过高，既增加了成本，也使细胞生长缓慢，显著影响转化效率；如果甘露糖浓度较低，则会增加假阳性的可能。本发明针对8m30品种，系统比较了不同蔗糖-甘露糖的配比的影响，最终确定5g/L蔗糖和10g/L甘露糖的配比，最适合对8m30阳性转化细胞进行有效筛选。其中5g/L蔗糖能保证阳性转化细胞的生长速率，而10g/L甘露糖既能有效区分阳性转化细胞，又显著降低了成本。
采取直接分化，而不是先预分化，可以减轻工作量，同时有效节约成本。选择培养皿作为分化再生的组培容器，而不是三角瓶，便于操作，同时最大程度利用光照培养架的空间，便于规模化应用。
在生根培养基中加入适量的NAA(0.4mg/L)，能够促进根系生长，从而提高移栽成活率。
通过上述发明，结合发明人对诱导、农杆菌悬浮、前筛选、筛选和分化再生培养基中的氮源优化([NO3 -]/[NH4 +]＝40mM/10mM)，筛选培养基中蔗糖和甘露糖配比(5g/L蔗糖和10g/L甘露糖)，分化再生培养基中的激素配比(1.5mg/L NAA、1mg/L6-BA)，本发明实现了对闭颖授粉水稻品种8m30的高效遗传转化，具体结果见表2。
表2 以甘露糖为筛选剂的闭颖授粉粳稻品种8m30的转化效率
应当理解这里描述的具体实施方式只是作为示例来帮助本领域技术人员更好地理解本发明，而不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。
Claims (6)
1.一种利用PMI筛选标记将外源基因导入闭颖授粉粳稻的方法，其特征在于，所述方法包括下述步骤：
步骤1：分离出水稻种子的胚，并置于愈伤组织诱导培养基上以产生次级愈伤组织；
步骤2：将所述次级愈伤组织转移至新的愈伤组织诱导培养基进行预培养；
步骤3：将所述步骤2中获得的愈伤组织与携带磷酸甘露糖异构酶PMI(phosphomannoseisomerase)筛选标记基因的农杆菌接触第一预定时间段；
步骤4：将步骤3处理后的愈伤组织转移到农杆菌悬浮培养基，培养第二预定时间段；
步骤5将步骤4处理后的愈伤组织置于前筛选培养基上培养第三预定时间段；
步骤6将步骤5处理后的愈伤组织转移至筛选培养基上，以获得抗性愈伤组织；
步骤7将所述抗性愈伤组织转移到分化再生培养基中分化成苗；和
步骤8将所述苗转移到生根培养基中生根，
所述步骤4中采用垫有若干无菌滤纸的培养皿，所述无菌滤纸中加入2.5-3.5mL农杆菌悬浮培养基，选择23℃黑暗培养；
其中，所述诱导培养基包括预定配比的N6大量元素、B5微量元素、MS铁盐、B5维生素、500mg/L脯氨酸、500mg/L谷氨酰胺、300mg/L酪蛋白酶水解物、30g/L蔗糖、2mg/L 2,4-D、3g/L植物凝胶，该预定配比的N6大量元素中[NO3 -]/[NH4 +]＝40mM/10mM；
所述步骤3中的与农杆菌接触是将愈伤组织浸泡在农杆菌悬浮液中；
所述农杆菌悬浮培养基包括：预定配比的N6大量元素、B5微量元素、 MS铁盐、B5维生素、500mg/L脯氨酸、500mg/L酪蛋白酶水解物、2mg/L2，4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、20g/L蔗糖、10g/L葡萄糖、100μmol/L乙酰丁香酮，该预定配比的N6大量元素中[NO3 -]/[NH4 +]＝40mM/10mM；
所述前筛选培养基包括：预定配比的N6大量元素、B5微量元素、MS铁盐、B5维生素、500mg/L脯氨酸、500mg/L谷氨酰胺、300mg/L酪蛋白酶水解物、30g/L蔗糖、2mg/L 2,4-D、3g/L植物凝胶、250mg/L羧苄青霉素，该预定配比的N6大量元素中[NO3 -]/[NH4 +]＝40mM/10mM；
所述筛选培养基包括：预定配比的N6大量元素、B5微量元素、MS铁盐、B5维生素、500mg/L脯氨酸、500mg/L谷氨酰胺、300mg/L酪蛋白酶水解物、5g/L蔗糖、10g/L甘露糖、2mg/L 2,4-D、250mg/L羧苄青霉素、3g/L植物凝胶，该预定配比的N6大量元素中[NO3 -]/[NH4 +]＝40mM/10mM；
所述分化再生培养基包括预定配比的N6大量元素、B5微量元素、MS铁盐、B5维生素、1g/L CH、30g/L蔗糖、30g/L山梨醇、500mg/L 2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)、2.5mg/L CuSO4、1.5mg/L NAA、1mg/L 6-BA、AA氨基酸、125mg/L羧苄青霉素、2.5g/L植物凝胶，该预定配比的N6大量元素中[NO3 -]/[NH4 +]＝40mM/10mM；
所述生根培养基包括1/2MS(Murashige&Skoog)基础盐2.l65g/L、MS维生素、20g/L蔗糖、0.4mg/L NAA、125mg/L羧苄青霉素、3.5g/L植物凝胶。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PMI标记基因的核苷酸序列为：SEQ IDNO:1所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，水稻品种为8m30。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一预定时间段为13-17分钟；所述第二预定时间段为40-60小时；所述第三预定时间段为5-7天。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，用于水稻遗传转化的农杆菌双元载体中，含有PMI基因，作为转化的阳性植物细胞的筛选标记基因。
6.一种生产转基因水稻的方法，包括：
1)通过权利要求1-5中任一项所述的方法将外源基因导入水稻细胞；和
2)利用所获得的水稻细胞培育水稻植株。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410245505.4A CN103993039B (zh) | 2014-06-04 | 2014-06-04 | 一种利用pmi筛选标记将外源基因导入闭颖授粉粳稻的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410245505.4A CN103993039B (zh) | 2014-06-04 | 2014-06-04 | 一种利用pmi筛选标记将外源基因导入闭颖授粉粳稻的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103993039A CN103993039A (zh) | 2014-08-20 |
| CN103993039B true CN103993039B (zh) | 2017-01-18 |
Family
ID=51307370
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410245505.4A Expired - Fee Related CN103993039B (zh) | 2014-06-04 | 2014-06-04 | 一种利用pmi筛选标记将外源基因导入闭颖授粉粳稻的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103993039B (zh) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104928252A (zh) * | 2015-04-21 | 2015-09-23 | 安徽省农业科学院水稻研究所 | 拟南芥磷酸甘露糖异构酶基因在植物遗传转化中的应用 |
| CN106591335A (zh) * | 2016-11-08 | 2017-04-26 | 安徽省农业科学院水稻研究所 | 一种密码子植物化改造的LbCpf1基因及其应用 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1711831A (zh) * | 2004-06-24 | 2005-12-28 | 华中农业大学 | 一种籼稻的离体培养方法 |
| WO2007134234A2 (en) * | 2006-05-12 | 2007-11-22 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for obtaining marker-free transgenic plants |
| CN102337294A (zh) * | 2011-10-09 | 2012-02-01 | 先正达生物科技（中国）有限公司 | 水稻细胞转化方法 |
| CN102337293A (zh) * | 2011-10-09 | 2012-02-01 | 安徽省农业科学院水稻研究所 | 水稻细胞转化方法 |
| CN102787133A (zh) * | 2011-05-19 | 2012-11-21 | 华中农业大学 | 利用酵母甘露糖异构酶基因筛选水稻转基因植株的方法 |
| CN103710381A (zh) * | 2013-12-23 | 2014-04-09 | 中国农业大学 | 利用农杆菌获得转基因籼稻的方法及其专用培养基 |
-
2014
- 2014-06-04 CN CN201410245505.4A patent/CN103993039B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1711831A (zh) * | 2004-06-24 | 2005-12-28 | 华中农业大学 | 一种籼稻的离体培养方法 |
| WO2007134234A2 (en) * | 2006-05-12 | 2007-11-22 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for obtaining marker-free transgenic plants |
| CN102787133A (zh) * | 2011-05-19 | 2012-11-21 | 华中农业大学 | 利用酵母甘露糖异构酶基因筛选水稻转基因植株的方法 |
| CN102337294A (zh) * | 2011-10-09 | 2012-02-01 | 先正达生物科技（中国）有限公司 | 水稻细胞转化方法 |
| CN102337293A (zh) * | 2011-10-09 | 2012-02-01 | 安徽省农业科学院水稻研究所 | 水稻细胞转化方法 |
| CN103710381A (zh) * | 2013-12-23 | 2014-04-09 | 中国农业大学 | 利用农杆菌获得转基因籼稻的方法及其专用培养基 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| 以pmi为筛选标记的水稻转基因研究;梁永亚 等;《安徽农业科学》;20111231;第39卷(第17期);第10143-10146页 * |
| 新型筛选标记磷酸甘露糖异构酶基因在转基因植物中的应用;郭倩倩 等;《中国农业科技导报》;20111231;第13卷(第6期);第12-19页 * |
| 氮源和碳源对冬凌草愈伤组织生长及迷迭香酸的积累的影响;李汉伟 等;《时珍国医国药》;20101231;第21卷(第6期);第1348-1350页，尤其是摘要 * |
| 水稻闭花授粉基因c/7(t)的遗传分析与基因定位;倪大虎 等;《中国农业科学》;20121231;第45卷(第13期);第2561-2567页，尤其是摘要，第2561页左栏第1-6行，第2565-2566页讨论、结论 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103993039A (zh) | 2014-08-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Yang et al. | Efficient embryogenic suspension culturing and rapid transformation of a range of elite genotypes of sweet potato (Ipomoea batatas [L.] Lam.) | |
| CN104046636B (zh) | 一种密码子植物化改造的pmi基因及其应用 | |
| CN104004781A (zh) | 一种抗草甘膦转基因水稻的制备方法 | |
| CN103993038B (zh) | 一种利用pmi筛选标记将外源基因导入闭颖授粉籼稻的方法 | |
| Ntui et al. | An efficient Agrobacterium tumefaciens-mediated genetic transformation of “Egusi” melon (Colocynthis citrullus L.) | |
| Chadipiralla et al. | Plant tissue culture and crop improvement | |
| CN108588120A (zh) | 一种玉米农杆菌转化受体的制备方法及农杆菌介导的玉米转化方法 | |
| CN101096703B (zh) | 一种非抗生素筛选小麦转基因植物的方法 | |
| CN104531656B (zh) | 一种来自小球藻的磷酸甘露糖异构酶基因及其应用 | |
| CN107406844A (zh) | 改良的转基因稻植物 | |
| CN103993039B (zh) | 一种利用pmi筛选标记将外源基因导入闭颖授粉粳稻的方法 | |
| Bandupriya et al. | Overexpression of coconut AINTEGUMENTA-like gene, CnANT, promotes in vitro regeneration in transgenic Arabidopsis | |
| CN105524933B (zh) | OsJMJ714影响水稻籽粒大小以及盐胁迫耐性的功能及其应用 | |
| CN108588002B (zh) | 获得谷子用于遗传转化的胚性愈伤组织和遗传转化的方法 | |
| CN104087605B (zh) | 培育分蘖数增加的转基因禾本科植物的方法及其相关生物材料 | |
| CN103789325A (zh) | 棉花细胞壁伸展蛋白基因GbEXPATR及应用 | |
| CN101233824B (zh) | 马铃薯微型薯的遗传转化方法 | |
| CN104031938B (zh) | 一种将外源基因导入闭颖授粉籼稻品种的遗传转化方法 | |
| CN103981214B (zh) | 一种将外源基因导入粳稻品种8m30的水稻细胞的方法 | |
| CN107760708A (zh) | 通过过表达JcARF19基因来提高小桐子果实产量的方法 | |
| Xu et al. | High-efficiency agrobacterium-mediated transformation of chrysanthemum via vacuum infiltration of internode | |
| JPH04505553A (ja) | 雄性発生を受けるトウモロコシの能力を高めるための方法及びそれから生成される生成物 | |
| Mangena | The role of plant genotype, culture medium and Agrobacterium on soybean plantlets regeneration during genetic transformation | |
| Gniech-Karasawa | Gametic embryogenesis, somatic embryogenesis, plant cell cultures, and protoplast fusion: Progress and Opportunities in Biofuel Production | |
| CN103320463A (zh) | 用RNAi技术控制水稻育性基因获得水稻不育系的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20170118 |