CN104531656B - 一种来自小球藻的磷酸甘露糖异构酶基因及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种来自小球藻(Chlorella variabilis)的磷酸甘露糖异构酶基因，本文将其命名为ChloPMI。本发明还提供一种含有ChloPMI的原核表达载体，其可以用于鉴定ChloPMI蛋白代谢甘露糖活性。并且本发明提供一种含有ChloPMI的表达盒和一种植物表达载体，以及该表达盒和表达载体在植物遗传转化方面的应用。本发明利用ChloPMI基因构建的植物表达载体，以甘露糖为筛选剂，成功实现了转化水稻细胞。本发明从小球藻中成功分离和克隆出了植物来源的磷酸甘露糖异构酶基因，由于该磷酸甘露糖异构酶基因来源于小球藻，环境友好，对人类没有潜在危险，更加有利于转基因产品的推广利用，消除人们对转基因的疑虑。

Description

一种来自小球藻的磷酸甘露糖异构酶基因及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术和植物基因工程技术领域。具体而言，本发明涉及一种来自小球藻(Chlorella variabilis)的磷酸甘露糖异构酶基因ChloPMI 的分离和克隆；含有ChloPMI的原核表达载体的构建及其在ChloPMI蛋白代谢甘露糖活性鉴定方面的应用；含有ChloPMI的植物表达载体的构建，以及以ChloPMI为筛选标记，在植物遗传转化方面的应用。
背景技术
转基因技术，是20世纪80年代初发展起来的一种有效的植物定向改良方法。该技术主要通过农杆菌介导、基因枪转化等方法将目的基因导入受体，经过标记筛选和分子检测，获得稳定表达的转化体，实现目标性状的快速定向改良，具有可用基因资源广、改良效率高等优点。转基因技术为农作物的产量提升、品质改良和抗性增强提供了新路径、开拓了新空间。
转基因食品对人类健康所引起的一个主要安全问题是抗生素标记基因。现有转基因技术，主要使用抗生素抗性基因作为筛选标记。抗生素标记基因与插入的目的基因一起转入目标作物中，用于帮助在植物遗传转化筛选和鉴定转化的细胞、组织和再生植株。标记基因本身并无安全性问题。但该类基因可能随食物进入肠道,存在与肠道微生物基因交换产生耐药菌株的潜在风险，以致影响抗生素的医用效果。为了替代抗生素抗性基因，其他类型筛选标记基因被陆续研究开发，如除草剂抗性基因、氨基酸代谢筛选基因、可视标记基因等，但这些筛选标记基因要么存在类似问题，要么筛选效率和成本不适于规模化应用。
而磷酸甘露糖异构酶是一种糖代谢基因。水稻等高等植物细胞虽能将甘露糖转化为6-磷酸甘露糖，但由于细胞自身缺乏磷酸甘露糖异构酶，不能进一步将6-磷酸甘露糖转化为6-磷酸果糖，从而进入糖酵解途径而被利用，因此磷酸甘露糖异构酶可以作为筛选标记基因。与抗生素、除草剂等负选择不同，甘露糖是进行正选择，转化的细胞表达磷酸甘露糖异构酶，可以利用甘露糖为碳源而正常生长，筛选效率高。同时，磷酸甘露糖异构酶的催化产物6-磷酸果糖，是蜂蜜和果浆的主要成份，二者都是环境友好的天然物质。
但现在广泛使用的磷酸甘露糖异构酶是从原核生物大肠杆菌中分离而来的，可能对转化受体基因组造成不利影响，还可能引发对其安全性的担忧。
发明内容
针对上述问题，本发明希望分离植物来源的磷酸甘露糖异构酶基因。更具体而言，本申请的发明人通过不断尝试，终于从小球藻(Chlorella variabilis)中分离和克隆除了磷酸甘露糖异构酶基因ChloPMI。另外，本发明还构建了含有ChloPMI的原核表达载体，应用于鉴定ChloPMI蛋白代谢甘露糖活性；构建了含有ChloPMI的植物表达载体，并以ChloPMI作为筛选标记，应用于植物遗传转化。
具体而言，在第一个方面，本发明提供一种来自小球藻的磷酸甘露糖异构酶基因，该基因具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。为了便于表示，本发明将其命名为ChloPMI。
在第二个方面，本发明提供一种ChloPMI蛋白代谢甘露糖活性的鉴定方法，通过设计ChloPMI原核表达引物，经亚克隆获得融合GST(谷胱甘肽巯基转移酶，glutathione-S-transferase)片段的原核表达载体，并转入大肠杆菌表达菌株BL21，通过苯酚红颜色反应鉴定ChloPMI的活性。
在第三个方面，本发明提供一种含有所述ChloPMI基因的植物表达载体。构建方法是利用Xho I酶切位点，用Xho I酶切pCAMBIA1381载体并回收，由于合成的ChloPMI序列两端加有Xho I酶切位点，可以利用T4连接酶将ChloPMI连接到pCAMBIA1381载体，得到植物表达载体 pCAMBIA1381-ChloPMI。
另一方面，本发明提供一种表达盒，其特征在于，所述表达盒中包含上述的ChloPMI基因。
在另一个方面，本发明提供一种利用pCAMBIA1381-ChloPMI表达载体，获得可以甘露糖为碳源的水稻转化细胞的方法，包括下述步骤：
(1)将水稻种子去壳、灭菌后将胚分离，置于愈伤组织诱导培养基上以产生次级愈伤组织；
(2)将次级愈伤组织转移至新的愈伤组织诱导培养基预培养；
(3)将步骤(2)中获得的愈伤组织与携带ChloPMI筛选标记基因的农杆菌接触15分钟；
(4)将步骤(3)的愈伤组织转移到上垫上三张无菌滤纸(加入2.5-3.5mL 农杆菌悬浮培养基)的培养皿中，21-23℃培养48小时；
(5)将步骤(4)的愈伤组织置于前筛选培养基上培养5-7天；
(6)将步骤(5)的愈伤组织转移至含有甘露糖的筛选培养基上，以获得可利用甘露糖为碳源的水稻抗性愈伤组织(水稻细胞)。
其中所述步骤(1)中的种子是成熟种子；所述步骤(1)、(2)中的诱导培养基是说明书表1所列出的诱导培养基；所述步骤(3)中的与农杆菌接触是将愈伤组织浸泡在所述农杆菌悬浮液中；所述步骤(4)中的农杆菌悬浮培养基是说明书表1所列出的悬浮培养基；所述步骤(5)中的前筛选培养基是说明书表1所列出的前筛选培养基；所述步骤(6)中的筛选培养基是说明书表1所列出的筛选培养基。
在优选的实施方案中，其中所述水稻是粳稻，更优选地，所述水稻是粳稻品种日本晴。
另一方面，本发明提供一种上述基因、表达盒或载体的应用，其特征在于，所述应用包括利用所述ChloPMI基因作为筛选标记，参照上述方法获得植物转基因细胞，进而通过植物转基因细胞获得转基因植物或植物部分。
优选地，所述植物包括：粮食作物、蔬菜作物、花卉作物、能源作物。
优选地，所述植物部分包括：细胞、原生质体、细胞组织培养物、愈伤组织、细胞块、胚芽、花粉、胚珠、花瓣、花柱、雄蕊、叶、根、根尖、花药和种子。
下面的表1中给出了在一种优选实现方式中，本发明所采用的培养基的示例性配方。本领域技术人员应该理解，各培养基除了采用本发明的特殊配方之外，还可以采用普通的培养基，其也能够实现本发明的目的，只是效果上存在一定差异。
表1培养基的示例性配方
表格中所提到的“优化的N6大量元素”指的是，该N6大量元素中 [NO3 -]/[NH4 +]＝40mM/10mM。
在优选的实施方案中，所述ChloPMI基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1 所示的核苷酸序列。
本发明成功地从小球藻中分离出了磷酸甘露糖异构酶基因，从而首次实现了植物来源磷酸甘露糖异构酶基因的获得。由于小球藻是环境友好的天然物质，对人类没有潜在危险，这非常有利于转基因植物的推广应用，消除人们关于转基因食品安全方面的疑虑，解决抗生素标记基因可能带来的潜在威胁。
此外，本发明还提供了含有ChloPMI的原核表达载体，应用于鉴定 ChloPMI蛋白代谢甘露糖活性；构建含有ChloPMI的植物表达载体，并以 ChloPMI作为筛选标记，应用于植物遗传转化。
附图说明
图1为pCAMBIA1381-ChloPMI载体质粒示意图。
图2为通过染色反应鉴定ChloPMI的活性的图片，NC(negative control) 为转入pGEX-6P-1空载体的大肠杆菌表达菌株BL21；1为含有小球藻 ChloPMI表达载体pGEX-ChloPMI的BL21菌株，2为含有大肠杆菌PMI 表达载体pGEX-PMI的BL21菌株。
图3为经过含pCAMBIA1381-ChloPMI质粒的农杆菌转化后，在甘露糖筛选压下，产生的水稻抗性愈伤组织。
具体实施方式
在没有其他具体说明的情况下，下述具体实施方式中的操作均采用本领域通用的常规操作来进行。本领域技术人员可以很容易地从现有技术中获得关于这样的常规操作的教导，例如可以参照教科书Sambrook and David Russell，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，3rd ed.，Vols 1，2； Charles Neal Stewart，Alisher Touraev，Vitaly CitovSky and Tzvi Tzfira，Plant Transformation Technologies等。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
下面结合附图对本发明的具体实施方式进行详细描述。需要说明的是附图中所表示的实验结果视图，本应为彩图，但考虑到专利法的规定，申请人将其转换为灰度图像，但是即便转为灰度图像，从图中的深浅度依然能够分辨出不同条件下实验结果的区别。
实施例1——ChloPMI基因的获得和克隆
该序列是以细菌的磷酸甘露糖异构酶蛋白序列，在可利用甘露糖的小球藻的基因组序列(genome.jgi-psf.org)中比对同源序列，获得同源性最高的即为ChloPMI蛋白序列。细菌的磷酸甘露糖异构酶蛋白序列如下：
MQKLINSVQNYAWGSKTALTELYGMENPSSQPMAELWMGAHPKSSSRVQNAAGDIVSLRDVIESDKSTLLGEAVAKRFGELPFLFKVLCAAQPLSIQVHPNKHNSEIGFAKENAAGIPMDAAERNYKDPNHKPELVFALTPFLAMNAFREFSEIVSLLQPVAGAHPAIAHFLQQPDAERLSELFASLLNMQGEEKSRALAILKSALDSQQGEPWQTIRLISEFYPEDSGLFSPLLLNVVKLNPGEAMFLFAETPHAYLQGVALEVMANSDNVLRAGLTPKYIDIPELVANVKFEAKPANQLLTQPVKQGAELDFPIPVDDFAFSLHDLSDKETTISQQSAAILFCVEGDATLWKGSQQLQLKPGESAFIAANESPVTVKGHGRLARVYNKL
然后，再提取小球藻(Chlorella variabilis)的RNA，并反转录为cDNA；按照ChloPMI的CDS(coding sequence)序列，设计基因特异性克隆引物，正向引物5’-ATGGCTGGAACGGCGACAGAGA-3’，反向引物 5’-TCACTCAAAGGCCATTCCGTTG-3’；再以cDNA为模板，进行PCR扩增。
回收PCR扩增的目的片段，目的片段长度1278bp，将其连接到 PGEM-T-Easy载体(购自Promega公司，按载体说明书操作)，按照热激法转化大肠杆菌XL-Blue感受态细胞后；然后，经菌落PCR筛选获得阳性克隆。将经过鉴定的阳性克隆，交Invitrogen公司测序。验证正确的克隆即为含有ChloPMI的重组质粒，命名为PGEM-T-ChloPMI。其中ChloPMI核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。
实施例2——ChloPMI基因的原核表达载体的构建
通过设计ChloPMI原核表达引物，正向引物5’-GGATCC ATGGCTGGAACGGCGACAGAGA-3’(下划线为BamHI酶切位点)，反向引物5’-CTCGAGCTCAAAGGCCATTCCGTTG-3’(下划线为XhoI酶切位点)，以PGEM-T-ChloPMI重组质粒为模板，进行PCR扩增，回收PCR 扩增的目的片段与用BamHI和XhoI酶切pGEX-6P-1表达载体(购自GE 公司)连接，得到融合GST(谷胱甘肽巯基转移酶，glutathione-S-transferase) 片段的原核表达载体pGEX-ChloPMI，并转入大肠杆菌表达菌株BL21。同时将pGEX-6P-1空载体，含有大肠杆菌磷酸甘露糖异构酶表达载体的 pGEX-PMI也转入大肠杆菌表达菌株BL21。
实施例3——ChloPMI活性分析
将含有原核表达载体pGEX-ChloPMI、pGEX-PMI和pGEX-6P-1空载体的BL21菌株画线，挑单克隆接种LB液体培养基(成分见表一农杆菌培养培养基，不加琼脂)，37℃振荡培养过夜(200r/min)。次日室温下，6000 r/min离心1min，弃上清，沉淀用少量无菌水重悬。取重悬液按1：50接种于无菌的苯酚红显色培养基(1％蛋白胨，0.5％氯化钠，50mg/L苯酚红，30％甘露糖，PH 7.4)，37℃振荡培养(200r/min)，48h后观察培养基颜色变化情况。如菌株有代谢甘露糖能力，会使培养基酸化，PH值下降，培养基颜色由PH7.4时的红色逐渐变为黄色。不同载体的活性分析结果参见图2，从图中可以看出，NC菌株(转入pGEX-6P-1空载体的大肠杆菌表达菌株BL21)不具有代谢甘露糖能力，培养基颜色仍然为红色。而1 (含有小球藻ChloPMI表达载体pGEX-ChloPMI的BL21菌株)和2(含有大肠杆菌PMI表达载体pGEX-PMI的BL21菌株)的大肠杆菌具有代谢甘露糖能力，使培养基酸化，PH值下降，培养基颜色由PH7.4时的红色逐渐变为黄色。
实施例4——ChloPMI植物表达载体的构建
以PGEM-T-ChloPMI重组质粒为模板，通过正向引物5’-CTCGAGATGGCTGGAACGGCGACAGAGA-3’(下划线为XhoI酶切位点)，反向引物5’-CTCGAGTCACTCAAAGGCCATTCCGTTG-3’(下划线为XhoI 酶切位点)，进行PCR扩增，回收PCR扩增的目的片段，用T4连接酶与用 XhoI线性化处理的pCAMBIA1381载体连接，得到植物表达载体 pCAMBIA1381-ChloPMI(图2)，利用冻融法将植物表达载体转入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105菌株中(安徽省农业科学院水稻研究所保存)，用于遗传转化。
实施例5——以ChloPMI为筛选标记基因的水稻遗传转化方法
1、成熟胚愈伤组织的诱导和预培养
将日本晴(安徽省农业科学院水稻研究所保存)的成熟种子去壳，选取外观正常、洁净无霉斑的种子，用70％酒精，摇晃90sec，倒掉酒精；再用含Tween20的50％次氯酸钠(原液有效氯浓度大于4％，每100毫升加入 1滴Tween20)溶液清洗种子，在摇床上晃动45min(180r/min)。倒掉次氯酸钠，无菌水洗5-10遍至无次氯酸钠气味，最后加入无菌水，30℃浸泡过夜。用手术刀片沿糊粉层分离胚，盾片朝上放置在诱导培养基(成分见表1)上，12粒/皿，30℃暗培养以诱导愈伤组织。
两周后出现球形、粗糙、浅黄色的次级愈伤组织，可以进行预培养操作，即将次级愈伤转至新的愈伤组织诱导培养基上，30℃暗培养预培养 5d。预培养结束后，将状态良好、分裂旺盛的小颗粒用勺收集至50mL的无菌离心管中，用于农杆菌侵染。
2、农杆菌菌株的培养和悬浮液准备
将含有pCAMBIA1381-ChloPMI载体的农杆菌菌株EHA105(安徽省农业科学院水稻研究所保存)在含有50mg/L卡那霉素的LB平板上划线(成分见表1)，28℃黑暗培养，24h后用无菌接种环将活化的农杆菌接种至新鲜的50mg/L卡那霉素的LB平板上，进行第二次活化，28℃黑暗培养过夜。在50mL的无菌离心管中加入20-30mL农杆菌悬浮培养基(成分见表 1)，用接种环将活化2次的农杆菌刮下，调整OD660(Optical density 660nm， 660nm吸光值)至约0.10-0.25，室温静置30min以上。
3、侵染和共培养
向准备好的愈伤组织中(见步骤1)，加农杆菌悬浮液，浸泡15min,其间不时轻轻晃动。浸泡结束后倒掉液体(尽量将液体滴净)，用无菌滤纸吸去愈伤组织表面的多余的农杆菌菌液，并在超净台中用无菌风吹干。在 100×25mm的一次性无菌培养皿垫上三张无菌滤纸，加入2.5mL农杆菌悬浮培养基，将吸干后的愈伤组织均匀分散在滤纸上，23℃黑暗培养48h。
4、前筛选和筛选培养
共培养结束后，将经共培养的愈伤组织均匀散布于前筛选培养基(成分见表1)中，30℃黑暗培养5d。前筛选培养结束后，将愈伤组织转至筛选培养基上(成分见表1)，每个培养皿接25粒愈伤组织，30℃黑暗培养，2-3周后，抗性愈伤组织生长明显(如图3所示)，可进行分化再生操作。从图3 中可看出，新生长出的抗性愈伤颜色为淡黄色，质地紧凑，颗粒感较强，说明是状态较好的胚性愈伤组织，适于进行后续的分化再生操作。需要说明的是附图中所表示的实验结果视图，本应为彩图，但考虑到专利法的规定，申请人将其转换为灰度图像，但是即便转为灰度图像，从图中的深浅度依然能够分辨出不同条件下实验结果的区别。
利用所获得的抗性愈伤组织，可以进行水稻植株或植物部分的培养。
应当理解这里描述的具体实施方式只是作为示例来帮助本领域技术人员更好地理解本发明，而不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。
序列表
<110> 安徽省农业科学院水稻研究所
<120> 一种来自小球藻的磷酸甘露糖异构酶基因及其应用
<130> HCI20140112
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1278
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 一种来自小球藻的磷酸甘露糖异构酶基因及其应用
<400> 1:
atggctggaa cggcgacaga gagcctcacc aggtcgcgga gcgcgctgca ccgactggct 60
tgcagcgctc aaaactatgc ctgggggcgc caccacgagg attcggaggt ggcacagctg 120
gtggctgcat ctgggcggca agtggacgag tccaagccct atgccgagct gtggatgggc 180
acccaccccg cggcgccctc cctgctggca gacaacggct acgcggggca gccgctgctg 240
gcgctgctgc gcgaccggcc cgagctgctg ggcgccgcgc tgccgcggtt tggctgcgac 300
ctgcccttcc tcttcaaggt gctctccgtg ggcaccgccc tctccatcca gtcacacccc 360
gacaaggcgc tggcggagcg gctgcacgcg gcaaggccag aggtgtacaa ggacgccaac 420
cacaagccgg agatggcgct ggcgctgagc gagtttgagg cgctgtgcag ctttgtgccg 480
cacgaggagc tggtggcggc gctgcgcgcc gtgcccgagc tggcggcctg ctgcggcgag 540
gcgcgcgtcg ccgcgctggc ggctgccgcc ccctgcggcg cgcagcggcg gcaggcgctc 600
aaggcggcct tccacgccgt catggcctgc cccgccgagc gggcggcgga gtgcgtgcgc 660
gcgctgtgct cgcggctgga gcgcgaggcg gcagcggggc gccagctcag cgcgcgggag 720
cagctgacgc tgcgcctgca gcggcagtac cccggggacg tcggcgtgct ggcctcctgg 780
ttcctcaacc acctgcgcct gcgcccgggc caggcggtgg cgctgcccgc caacgagccc 840
cacgcataca tctcgggaga gattgtggag tgcatggcca cgtcagacaa cgtgatccgc 900
gcggggctga cccccaagct gcgggatgtg gagacgctgt gcgagtcgct gacgtaccgg 960
cagggggtgc ccgaggtgat ggagggcgcc aagtcggcgg cctcgccaca cctggcctgc 1020
taccgcccgc ccttcaggga gtttgagatc tggcgctaca cgccgcccgc cggctcccgc 1080
gaggcgctgc cgccgcccgc gggcccgctg ctcatgctgg tgcagcaggg cgcgatgcac 1140
gtgcgcagcg gcgagcagtc gcgcctcctt aagcggggcg acgtctactt tgtggcggcg 1200
ggcgcggagc tgcagctgga ggcgtcggcc gatgtgtcgg cctgggtgac cgcctgcaac 1260
ggaatggcct ttgagtga 1278
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>正向引物
<400> 2:
atggctggaa cggcgacaga ga 22
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物
<400> 3:
tcactcaaag gccattccgt tg 22
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>正向引物
<400> 4:
ggatccatgg ctggaacggc gacagaga 28
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物
<400> 5:
ctcgagctca aaggccattc cgttg 25
<210> 6
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>正向引物
<400> 6:
ctcgagatgg ctggaacggc gacagaga 28
<210> 7
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物
<400> 7:
ctcgagtcac tcaaaggcca ttccgttg 28
<210> 8
<211> 391
<212> Protein
<213> 人工序列
<220>
<223> 磷酸甘露糖异构酶蛋白
<400> 8:
MQKLINSVQN YAWGSKTALT ELYGMENPSS QPMAELWMGA HPKSSSRVQN AAGDIVSLRD 60
VIESDKSTLL GEAVAKRFGE LPFLFKVLCA AQPLSIQVHP NKHNSEIGFA KENAAGIPMD 120
AAERNYKDPN HKPELVFALT PFLAMNAFRE FSEIVSLLQP VAGAHPAIAH FLQQPDAERL 180
SELFASLLNM QGEEKSRALA ILKSALDSQQ GEPWQTIRLI SEFYPEDSGL FSPLLLNVVK 240
LNPGEAMFLF AETPHAYLQG VALEVMANSD NVLRAGLTPK YIDIPELVAN VKFEAKPANQ 300
LLTQPVKQGA ELDFPIPVDD FAFSLHDLSD KETTISQQSA AILFCVEGDA TLWKGSQQLQ 360
LKPGESAFIA ANESPVTVKG HGRLARVYNK L 391

Claims (1)

1.一种获得水稻转化细胞的方法，其中，所述方法利用含有来自小球藻的磷酸甘露糖异构酶基因的植物表达载体pCAMBIA1381-ChloPMI，通过甘露糖筛选获得水稻转化细胞，所述磷酸甘露糖异构酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述方法包括下述步骤：
(1)将水稻种子去壳、灭菌后将胚分离出来，置于愈伤组织诱导培养基上以产生次级愈伤组织；
(2)将所述次级愈伤组织转移至新的愈伤组织诱导培养基进行预培养，获得可用于转化的愈伤组织；
(3)将步骤(2)中获得的愈伤组织与农杆菌接触15分钟，其中，所述农杆菌中转入了所述植物表达载体，所述植物表达载体中携带所述磷酸甘露糖异构酶基因；
(4)将步骤(3)处理后的愈伤组织转移到其上垫有无菌滤纸的培养皿中，21-23℃培养48小时；
(5)将步骤(4)处理后的愈伤组织置于预筛选培养基上培养5-7天；
(6)将步骤(5)处理后的愈伤组织转移至筛选培养基上，以获得抗性愈伤组织，所述抗性愈伤组织包含可代谢甘露糖的水稻转化细胞。
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