CN104313034B - 雄性不育基因OsLAP5的应用及恢复水稻雄性不育的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种水稻育种技术领域的雄性不育基因OsLAP5的应用及恢复水稻雄性不育的方法；所述的雄性不育基因OsLAP5的碱基序列如SEQ ID N0.2所示，所述的应用是：通过基因敲除或者抑制OsLAP5基因使得水稻孢粉素合成酶活性丧失或者表达水平降低，获得新的水稻雄性不育系可以用来生产杂交种子；本发明还涉及水稻雄性不育株系创制的方法，水稻不育株系在水稻制种中的用途，恢复雄性不育性状的方法。本发明获得的水稻突变体营养生长阶段没有任何异常，但纯合体植株完全不育。如果应用于杂交育种中，可以免除母本去雄的工作，大大提高生产效率，降低人工成本，在农业生产上具有重要的应用。

Description

雄性不育基因OsLAP5的应用及恢复水稻雄性不育的方法

技术领域

本发明属于水稻育种技术领域，具体涉及一种雄性不育基因OsLAP5的应用及恢复水稻雄性不育的方法。

背景技术

水稻是世界上主要的粮食作物之一，更是我国最重要的粮食作物。中国是世界上最大的稻米生产国和消费国，约有60％以上的国人以稻米为主食。我国水稻年播种面积超过3000万公顷，占世界的20％，占全国粮食作物播种面积的30％；2011年，水稻总产量1.987亿吨，占粮食总产量的42％，单位面积产量比所有粮食作物平均单产高出45％以上；单位面积产量6.35吨/公顷，比全球平均产量3.85吨/公顷高65％。其中一个重要因素就是杂交水稻的广泛种植。

雄性不育系：是指一种雄性退化(主要是花粉退化)但雌蕊正常的母水稻，由于花粉无力生活，不能自花授粉结实，只有依靠外来花粉才能受精结实，因此借助这种母水稻作为遗传工具，通过人工辅助授粉的方法，就能产生大量杂交种子。从育种战略上看，杂交水稻的发展可以分为三系法、两系法和一系法三个发展阶段。每进入一个新阶段，都是育种上的一次突破，从而会把水稻的产量提高到一个新台阶。现在生产上用的杂交水稻属于三系法品种间杂交优势利用的范畴，这种三系杂交稻一般要比常规水稻增产20％左右，当前仍处于方兴未艾时期。但是，三系法杂交水稻种子优势表现复杂，受恢复系和保持系关系限制，使优良组合的筛选比较困难。因此，科学家一直在筛选和培育新的不育系，以期扩展细胞质背景，为远缘杂交和杂种优势的利用奠定基础。

发明内容

本发明针对现有技术存在的上述不足，提供一种雄性不育基因OsLAP5的应用及恢复水稻雄性不育的方法，利用OsLAP5基因及其蛋白参与调控水稻雄性生殖的特点，及其利用转基因技术控制水稻雄性生殖发育，通过突变该蛋白序列或抑制该蛋白的表达产生新的水稻雄性不育株系，在农业生产上具有十分重要的应用。

第一方面，本发明涉及一种雄性不育基因OsLAP5的应用，所述的雄性不育基因OsLAP5的碱基序列如SEQ ID NO.2所示，所述的应用是：通过基因敲除或者抑制OsLAP5基因使得其表达水平降低，获得新的水稻雄性不育系可以用来生产杂交种子。

第二方面，本发明还涉及一种水稻雄性不育株系创制的方法，包括如下步骤：选择常规水稻品种，处理，培育，即得所述水稻雄性不育株系，所述处理为，

(a)采用常规基因工程方法，敲除或者改变编码如SEQ ID NO.3所示氨基酸的核苷酸序列，使所示氨基酸序列发生缺失或者变异，进而使得所述氨基酸序列对应多肽的活性丧失；

或者(b)采用常规基因工程方法，抑制或者降低编码如SEQ ID NO.3所示氨基酸序列的核苷酸序列的表达，降低所述氨基酸序列对应多肽的表达水平。

优选地，所述水稻品种为粳稻品种9522、籼稻品种广陆矮4号、龙特甫或籼稻品种9311。

优选地，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

优选地，所述水稻雄性不育株系创制的方法包括如下步骤：采用常规基因工程方法，使常规水稻品种中如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列突变为SEQ ID NO.4，进而获得所述水稻雄性不育株系，即oslap5突变体。

优选地，所述水稻雄性不育株系创制的方法包括如下步骤：采用常规基因工程方法，使常规水稻品种中如SEQ ID NO.3所示氨基酸序列突变为SEQ ID NO.5，进而获得所述水稻雄性不育株系，即oslap5突变体。

优选地，包括如下步骤：采用RNA干扰技术，抑制或者降低编码如SEQ ID NO.3所示氨基酸序列的核苷酸序列的表达，降低所述氨基酸序列对应多肽的表达水平。

优选地，所述RNA干扰技术中RNAi的构建方法包括如下步骤：

从水稻全长cDNA中用两对引物

Ms16RiXF:5’AAATCTAGATATTGCGAGCAAGCAGGCGT 3’和

Ms16RiBR:5’AAAGGATCCCTTCATCGTCGGCTGGCCCT 3’

Ms16RiHF：5’AAAAAGCTTTATTGCGAGCAAGCAGGCGT 3’和

Ms16RiER：5’AAAGAATTCCTTCATCGTCGGCTGGCCCT 3’

分别扩增出OsLAP5基因编码区序列的第23位至第294位共271bp的特异性片段；将这两个片段分别通过XbaI/BamHI和HindIII/EcoRI正反向插入连入含有水稻Intron序列的pBluescript SK载体；测序验证正确，再用XbaI和HindIII酶切切下含有OsLAP5正反向特异性片段和Intron和片段，连入经同样酶切的pHB载体中；再次测序检验核苷酸序列是否正确，成功构建pHB-OsLAP5-RNAi质粒。

第三方面，本发明还涉及一种水稻不育株系在水稻制种中的用途，以如前述所述应用获得的水稻雄性不育株系作为母本，进行杂交育种。

第四方面，本发明还涉及一种恢复水稻雄性不育株系的雄性不育性状的方法，包括如下步骤：采用常规遗传手段将所述OsLAP5基因，转入如前述所述应用获得的水稻雄性不育株系，进而使得突变体恢复野生型表型。

优选地，所述方法包括如下步骤：将含OsLAP5互补构建的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105转入所述水稻雄性不育株系，培育，即得；其中OsLAP5互补构建含有编码如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

优选地，所述方法具体包括如下步骤：

(a)从水稻日本晴BAC克隆中用引物：

OsMS16hb-F:5’AATCTAGAGGTAGGCACAAGGATGGCAA 3’，

OsMS16hb-R:5’AAGGTAACCGTTGAACTTTGTTTGTGGAGTGA 3’，

扩增出OsLAP5基因的如SEQ ID NO.1所示的3575bp的基因组序列片段；

(b)提供携带表达OsLAP5互补构建载体的根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105(zhang et al.2010.Carbon starved anther encodes a MYBdomain protein that regulates sugar partitiong required for rice pollendevelopment.Plant Cell,22:672-689.)；

(c)将水稻细胞或组织或器官与步骤(a)中的农杆菌接触，从而使编码如SEQ IDNO.3所示氨基酸的核苷酸转入水稻细胞，并且整合到水稻细胞的染色体上；

(d)选择转入所述核苷酸的水稻细胞或组织，再生，获得水稻植株。

优选地，所述编码如SEQ ID NO.3所示氨基酸的核苷酸如SEQ ID NO.2所示。

本发明具有如下的有益效果：本发明通过控制水稻孢粉素合成酶OsLAP5基因及其编码蛋白获得水稻雄性生殖发育的变异株，实现控制水稻生殖过程；本发明获得的水稻突变体在营养期与来源亲本无明显差异，进入生殖生长阶段后雄性生殖发育异常，花粉败育，得到完全不育的植株，在杂交水稻构建和农业生产上具有十分重要的应用。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为8株阳性转基因植株中OsLAP5的表达水平示意图。

图2为OsLAP5干扰植株的表型示意图。

图3为oslap5突变体植株的形态学观察示意图。

图4为OsLAP5表达模式示意图。

图5为互补突变体得到野生型表型示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。所述OsLAP5基因为编码如SEQ IDNO.3所示氨基酸序列的核苷酸序列。

实施例1、水稻雄性不育株系创制的方法

1.1通过基因工程或其他手段创制oslap5水稻雄性不育株系

本实施例中OsLAP5基因的编码区序列如SEQ ID NO.2所示。本实施例的osalp5突变材料是由常规粳稻品种武育粳7号(又名9522)经过对OsLAP5基因的RNA干扰或者序列变异获得。

1.2水稻育性控制蛋白基因的克隆

利用发明人构建的包含育性控制蛋白基因OsLAP5及其突变基因oslap5组成的、本领域内技术人员清楚的水稻基因定位克隆(map-based cloning或position cloning)群体，按分子标记定位于1个小的基因组片段内，例如100Kb内。在此基础上，用常规方法分离包含该片段的基因组DNA克隆。经测序和进一步的杂交鉴定确定其中一个含完整水稻雄性生殖发育控制蛋白OsLAP5。

经全核苷酸序列分析结果表明：水稻雄性育性OsLAP5基因全长为2748bp(SEQ IDNO.6，包含调控区和内含子)。经软件分析和cDNA克隆，其ORF如SEQ ID NO.2所示，编码全长为405个氨基酸的水稻雄性生殖发育控制蛋白，其序列如SEQ ID NO.3所示。

1.3水稻育性控制蛋白基因的点突变

本实施例的oslap5突变材料是由常规粳稻品种武育粳7号(又名9522)经过对OsLAP5基因的序列变异获得，经过对OsLAP5突变基因oslap5的序列比较，水稻雄性生殖发育控制蛋白的移码和提前终止会使得水稻雄性生殖器官不能正常发育，造成植株不育；本实施例OsLAP5突变基因是在编码区的1个碱基对缺失(其序列如SEQ ID NO.4所示)引起水稻雄性生殖发育控制蛋白翻译得提前终止和功能丧失。

1.4通过RNAi手段降低水稻品种中的OsLAP5的表达水平

为了对OsLAP5蛋白进行应用，构建了OsLAP5基因RNAi的载体，并转化野生型9522植株，以期降低OsLAP5的表达，从而达到改变水稻育性的目的。

从水稻全长cDNA中用两对引物

Ms16RiXF:5’AAATCTAGATATTGCGAGCAAGCAGGCGT 3’(XbaI)SEQ ID NO.7和

Ms16RiBR:5’AAAGGATCCCTTCATCGTCGGCTGGCCCT 3’(BamHI)SEQ ID NO.8

Ms16RiHF：5’AAAAAGCTTTATTGCGAGCAAGCAGGCGT3’(HindIII)SEQ ID NO.9和

Ms16RiER：5’AAAGAATTCCTTCATCGTCGGCTGGCCCT3’(EcoRI)SEQ ID NO.10

分别扩增出OsLAP5基因编码区序列的第23位至第294位共271bp的特异性片段；将这两个片段分别通过XbaI/BamHI和HindIII/EcoRI正反向插入连入加入含有水稻Intron序列的pBluescript SK载体；测序验证正确，再用XbaI和HindIII酶切切下含有OsLAP5正反向特异性片段和Intron和片段，连入经同样酶切的pHB载体中。再次测序检验核苷酸序列是否正确，成功构建pHB-OsLAP5-RNAi质粒。

将含有OsLAP5基因RNA干扰构建的农杆菌在含有Kan(50μg/μl)的YEB平板上划线，获的单菌落。挑单菌落接种到3ml含抗生素的YEB液体培养基中于28℃振荡培养过夜，第2天按1％接种量转接入50ml含抗生素的YEB液体培养基中，200rpm继续振荡培养至OD₆₀₀为0.6至0.8左右时，将新鲜的农杆菌菌液于5000rpm、离心5分钟，收集并重悬于1/3体积的AAM液体培养基中，此时即可用于转化水稻各种受体材料。

本实施例采用常规的农杆菌转化方法转化水稻9522的幼胚愈伤。取授粉后12-15天的9522未成熟种子经70％乙醇浸泡1分钟后，于NaClO溶液中(与水1:3混合，加2-3滴吐温20)消毒90分钟以上，用无菌水冲洗4-5次，然后用解剖刀和镊子挑出幼胚并接种月N6D2培养基上诱导愈伤组织，在26±1℃、避光条件下培育，4天后可用于转化。将幼胚愈伤浸泡入新鲜的AAM农杆菌菌液中并不时摇动，20分钟后将水稻材料移出，在无菌滤纸上吸去过多的菌液，随即转移到N6D2C培养基上，于26℃共培养3天。共培养时，在共培养培养基中加入乙酰丁香酮，使用浓度为100μM。3天后，从共培养培养基上取出愈伤组织，切去胚芽并转入含有25mg/L Hyg的选择培养基上进行选择培养。7-12天后将抗性愈伤组织转到含有50mg/LHyg的选择培养基上继续筛选。10-12天后生长旺盛的抗性愈伤组织转移到预分化培养基上培养一周左右，再移至分化培养基上分化(12小时光照/天)。再生的小苗在1/2MS₀H培养基上生根壮苗，随后移入人工气候室营养液栽培。

获得的再生植株移栽成活后以除草剂再次筛选转化植株；阳性植株提取叶片总DNA，经PCR进一步鉴定转化植株。RT-PCR分析阳性植株中OsLAP5基因的表达水平，表达水平降低到野生型20％以下为有效RNA干扰植株。

获得的8株阳性转基因植株，分别为R-1、R-2、R-3、R-4、R-5、R-6、R-7、R-8，通过RT-PCR验证得出，8株转基因植株中OsLAP5的表达水平都降低到20％以下(图1)。从表型上来看，OsLAP5-RNAi突变体在成熟时期，对突变体的花粉进行碘染发现，有近50％的花粉不能正常着色(图2)，而野生型95％以上的花粉碘染正常(图2)，这说明OsLAP5的表达下降使花粉的发育受到影响，能够得到获得新的水稻雄性不育系。同样地，如果选用其它合适的片段，构建出RNA干扰表达载体，也能实现将表达水平降低到20％，能够得到获得新的水稻雄性不育系。

1.5OsLAP5蛋白活性丧失或表达水平导致水稻雄性发育异常

对oslap5突变体植株的形态学观察。如图3，野生型和突变型oslap5的表型对比显示野生型9522花药发育正常(C，E)，而oslap5突变型花药变白变小(D，F)；野生型9522碘染正常(E)，突变型oslap5花药碘染，花粉粒没有着色的(F)。

1.6OsLAP5表达特征

利用oslap5突变株的来源亲本9522各个器官组织，提取RNA，进行反转录得到cDNA第一链，利用荧光定量PCR的方法确定OsLAP5基因的表达模式(如图4)，发现OsLAP5基因只在水稻雄性生殖发育时期Stage8b、Stage9和Stage10有着显著的表达；除此之外，营养发育过程中的根、茎和叶中没有表达。

1.7OsLAP5基因在创制其他水稻品系雄性不育株系中的应用

将oslap5突变体与籼稻品种9311、龙特甫或广陆矮4号水稻品系杂交，在F2代中具有籼型特征的植株中均出现了雄性不育株系，符合3:1分离规律，进而证明OsLAP5基因在其他水稻品种中发生核苷酸序列变化时，同样可以产生雄性不育植株。

实施例2 oslap5突变体在水稻制种中的用途

将oslap5突变体作为父本与三系或两系杂交组合中的不育亲本杂交，得到F1代。在F2代中筛选同时具有雄性不育及不育特征的植株，将该植株与原不育亲本对应的保持系杂交。再次在F2代中筛选同时具有雄性不育及不育特征的植株与保持系杂交，经多代杂交筛选后获得新的雄性不育系，适宜作为杂交组合中的母本。

实施例3恢复oslap5突变体雄性不育性状的方法

将编码OsLAP5基因的基因组核苷酸序列转入突变体oslap5植株，能够使突变体恢复到野生型表型。

从水稻日本晴BAC克隆(OSJNba29L07)中用引物：

OsMS16hb-F:5’AATCTAGAGGTAGGCACAAGGATGGCAA 3’(XbaI)SEQ ID NO.11和

OsMS16hb-R:5’AAGGTAACCGTTGAACTTTGTTTGTGGAGTGA3’(BstEII)SEQ ID NO.12

扩增出OsLAP5基因的3575bp(SEQ ID NO.1)的基因组序列片段。

将该片段通过XbaI和BstEII插入到用于转化水稻的双元载体pCAMBIA1301载体中；测序验证正确，该载体通过电击导入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105CGMCC No.4819，得到OsLAP5互补根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105，使用遗传转化手段转化突变体oslap5和野生型9522成熟胚愈伤，从而使编码如SEQID NO.3所示氨基酸的核苷酸转入水稻细胞，并且整合到水稻细胞的染色体上；再生，获得水稻植株；以观察是否会使突变体恢复到野生型表型。

T₀代获得互补植株，图5显示T₀代互补植株可以产生花粉，并被I₂/KI染色，即表现出的野生型表型。SEQ ID NO.1为互补oslap5突变体全长核苷酸序列，SEQ ID NO.2为OsLAP5全长cDNA序列，SEQ ID NO.3为OsLAP5全长氨基酸序列。

综上所述，本发明通过控制水稻孢粉素合成酶OsLAP5基因及其编码蛋白获得水稻雄性生殖发育异常的变异株，实现控制水稻雄性生殖发育和育性；本发明获得的水稻突变体在营养生长时期与来源亲本无明显差异，进入生殖生长阶段后，雄性生殖器官发育异常、花粉败育引起植株不育，在农业生产上具有十分重要的应用。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (11)

1.一种雄性不育基因OsLAP5的应用，所述的应用是：通过基因敲除或者抑制OsLAP5基因，获得新的水稻雄性不育系可以用来生产杂交种子，其特征在于，所述的雄性不育基因OsLAP5的碱基序列如SEQ ID NO.2所示；

所述水稻雄性不育株系创制的方法，包括如下步骤：选择常规水稻品种，处理，培育，即得所述水稻雄性不育株系，所述处理为，

(a)采用常规基因工程方法，敲除编码如SEQ ID NO.3所示氨基酸的核苷酸序列，使所示氨基酸序列发生突变，进而使得所述氨基酸序列对应多肽的活性丧失；

或者(b)采用常规基因工程方法，抑制编码如SEQ ID NO.3所示氨基酸序列的核苷酸序列的表达，降低所述氨基酸序列对应多肽的表达水平；

所述核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.如权利要求1所述的雄性不育基因OsLAP5的应用，其特征是，所述水稻品种为粳稻品种9522、籼稻品种广陆矮4号、龙特甫或籼稻品种9311。

3.如权利要求1所述的雄性不育基因OsLAP5的应用，其特征是，所述水稻雄性不育株系创制的方法具体包括如下步骤：采用常规基因工程方法，使常规水稻品种中如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列突变为SEQ ID NO.4，进而获得所述水稻雄性不育株系，即oslap5突变体。

4.如权利要求1所述的雄性不育基因OsLAP5的应用，其特征是，所述水稻雄性不育株系创制的方法包括如下步骤：采用常规基因工程方法，使常规水稻品种中如SEQ ID NO.3所示氨基酸序列突变为SEQ ID NO.5，进而获得所述水稻雄性不育株系，即oslap5突变体。

5.如权利要求1所述的雄性不育基因OsLAP5的应用，其特征是，包括如下步骤：采用RNA干扰技术，抑制或者降低编码如SEQ ID NO.3所示氨基酸序列的核苷酸序列的表达，降低所述氨基酸序列对应多肽的表达水平。

6.如权利要求5所述的雄性不育基因OsLAP5的应用，其特征是，所述RNA干扰技术中RNAi的构建方法包括如下步骤：

从水稻全长cDNA中用两对引物

Ms16RiXF:5’AAATCTAGATATTGCGAGCAAGCAGGCGT 3’和

Ms16RiBR:5’AAAGGATCCCTTCATCGTCGGCTGGCCCT 3’

Ms16RiHF：5’AAAAAGCTTTATTGCGAGCAAGCAGGCGT 3’和

Ms16RiER：5’AAAGAATTCCTTCATCGTCGGCTGGCCCT 3’

分别扩增出OsLAP5基因编码区序列的第23位至第294位共271bp的特异性片段；将这两个片段分别通过XbaI/BamHI和HindIII/EcoRI正反向插入含有水稻Intron序列的pBluescript SK载体；测序验证正确，再用XbaI和HindIII酶切切下含有OsLAP5正反向特异性片段和Intron和片段，连入经同样酶切的pHB载体中；再次测序检验核苷酸序列是否正确，成功构建pHB-OsLAP5-RNAi质粒。

7.一种水稻不育株系在水稻制种中的用途，其特征是，以如权利要求1所述应用获得的水稻雄性不育株系作为母本，进行杂交育种。

8.一种恢复水稻雄性不育株系的雄性不育性状的方法，其特征在于，包括如下步骤：采用常规遗传手段将OsLAP5基因，转入如权利要求1所述应用获得的水稻雄性不育株系，进而使得突变体恢复野生型表型。

9.如权利要求8所述的恢复雄性不育性状的方法，其特征在于，包括如下步骤：将OsLAP5互补根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105转入所述水稻雄性不育株系，培育，即得；其中OsLAP5互补根癌农杆菌含有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

10.如权利要求9所述的恢复雄性不育性状的方法，其特征在于，所述方法具体包括如下步骤：

(a)从水稻日本晴BAC克隆中用引物：

OsMS16hb-F:5’AATCTAGAGGTAGGCACAAGGATGGCAA 3’，

OsMS16hb-R:5’AAGGTAACCGTTGAACTTTGTTTGTGGAGTGA 3’，

扩增出OsLAP5基因的如SEQ ID NO.1所示的3575bp的基因组序列片段；

(b)提供携带表达OsLAP5互补构建载体的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105；

(c)将水稻细胞或组织或器官与步骤(b)中的农杆菌接触，从而使编码如SEQ ID NO.3所示氨基酸的核苷酸转入水稻细胞，并且整合到水稻细胞的染色体上；

(d)选择转入所述核苷酸的水稻细胞或组织，再生，获得水稻植株。

11.如权利要求10所述的恢复雄性不育性状的方法，其特征在于，所述编码如SEQ IDNO.3所示氨基酸的核苷酸如SEQ ID NO.2所示。